JPH06504669A

JPH06504669A - ５−ＨＴ↓１↓ｘ−レセプター

Info

Publication number: JPH06504669A
Application number: JP4502449A
Authority: JP
Inventors: バッハ，　アルフレート; ウンガー，　リリアーネ; ビアロヤン，　ジークフリート; ゼーブルク，　ペーター
Original assignee: ビーエーエスエフ　アクチェンゲゼルシャフト
Priority date: 1990-12-22
Filing date: 1991-12-12
Publication date: 1994-06-02
Also published as: EP0563089A1; DE4041464A1; CA2098706A1; WO1992011362A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】５−ＨＴＩＸ−レセプター本発明はクラス１のセロトニンレセプター（５−ＨＴｌｘ−レセプター）、前記レセプターをコード化するＤＮＡ、ならびに５−ＨＴｌｘ−レセプターに影響を及ぼすことができる物質をスクリーニングするための前記レセプターもしくはＤＮＡの使用に関する。

セロトニンレセプター（＝５−ＨＴ−レセプター）は神経学的および精神医学的疾患、たとえば憂費、片頭痛および１神分裂症において重要な役割がある。それというのも、このレセプターは、このような疾患に対する作用物質についての目標箇所であるためである。

今までに５−ＨＴ−レセプターの一部だけがほぼ純粋な形で明らかになっているにすぎないため、これらの物質に対する作用物質の目標箇所に向けられた調査は不可能であった。この疾患は特に片頭痛が該当する。

セロトニン（５−ＨＴ）に対して高親和性結合箇所を有するレセプターであるポリペプチドが見出され、これは純粋な形で得られた。

本発明の対象は、式Ｉで記載されたアミノ酸配列の場合によりグリコジル化されたポリペプチドならびに活性は変化させずにアミノ酸の欠失、置換、押入、逆転、付加または交換により得られるポリペプチドである。

更に、本発明の対象は、前記したポリペプチドについてコード化するＤＮＡ、このＤＮＡを含有する宿主生物、ならびに５−　ＨＴ　ｌｘ−レセプターに影響を及ぼす物質を見つけ出すためのこのポリペプチドおよびＤＮＡの使用である。

この新規のポリペプチドおよびＤＮＡは遺伝子工学的に公知の方法により製造することができる。ラットの脳からｍＲＮＡを単離し、二本鎖のｃＤＮＡに翻訳することができる。このｃＤＮＡはポリメラーゼ一連鎖反応のための鋳型として使用することができる。特異的プライマーを使用することにより、適当な反応条件下で、相応するｃ　Ｄ　Ｎ　Ａを増幅することができる。

適当なプライマーを使用することにより、増幅されたｃ　Ｄ　Ｎ　Ａは、まえもったクローニングなしで配列させることができる。この場合使用される方法は、たとえばｒＣｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ＢｉｏｌｏｇｙＪ（Ｈｒｓｇ、　Ｆ、　Ｍ、　Ａｕ５ｕｂｅｌ　ｅｔ　ａｌ、）　１９８９．　ｌ５ＢＮ　０−４７１５０３３８−ｘ　（Ｖｏｌ、　ｌ　ｕ、　２５ｅｔ）、ｒポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ−Ｋｅｔｔｅｎ− ｒｅａｋｔｉｏｎＪ　５ａｉｋｉ　ｅｔ　ａｔ、　（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃａ　２３０．１３５０−５４もしくはＭｕｌｌｉ５およびＦａｌｏｏｎａ　（１９８７）　Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　１５５．３３５−３５０が参照される。

このように特性決定されたｃＤＮＡは制限酵素を用いて容易に得ることができる。この場合に生じた断片は、場合により化学的に合成されたオリゴヌクレオチド、アダプターまたは遺伝子断片と結合させて、タンパク質についてコード化する配列をクローニングするために利用することができる。

クローニングベクター、たとえば市販のプラスミドＭ１３ｍｐ１８またはブルースクリプト中への遺伝子断片もしくは合成りＮＡ配列の組み込みは公知の方法で行う。

この遺伝子または遺伝子断片は、タンパク質を発現することができる適当な化学的に合成された制御領域かまたはバクテリア、ファージ、真核細胞またはこれらのウィルスから単離された制御領域を備えていてもよい。

こうして得られたハイブリッドプラスミドを有する形質転換もしくはトランスフェクションに適した宿主生物は同様に公知であり、詳細に記載されている（Ｍ。

Ｗｉｇｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｅ１ｌ　１６　（１９７９）、　７７７−７８５；　Ｆ、　Ｌ、　Ｇｒａｈａｍ　ａｎｄ＾、　Ｊ、　ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ、　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　５３　（１９７３）。

４６５−４５７）　。

鋪乳頚細胞中での発現の場合、発現すべき遺伝子、この場合、ここに記載された５　ＨＴｌｘ−レセプターについてコード化するｃＤＮＡを、マウス−メタロチオネイン−またはウィルス性５Ｖ４０−プロモーターの制御のもとにまたはサイトメガロウィルス−プロモーターの制御のもとに置かれるベクターを使用することができる。発現のために必要なのは、５　ＨＴ１ｘ−レセブターについてコード化する遺伝子のメチオニン開始コドンの存在である。次いで、このベクターのコピーがエビソームとしてまたは遺伝子中に組み込んで含有されているクローンを単離する。特に、サイトメガロウィルスのプロモーターを含むベクターへ断片を組み込むのが有利である。

この他に、こうして導入されたＤＮＡの一時的発現が発現された非相同のポリペプチドの薬理的特性決定のために十分であるように、細胞を適当なベクターで形質転換することができる。この場合でも、サイトメガロウィルスのプロモーターによる発現の制御が特に有利である。

細菌細胞中での複製および抗生物質耐性についてコード化する原核生物の配列と結合させて、シャトルベクターの構成も可能である。プラスミドの組立および増殖は最初に細菌細胞内で行われ、引き続き原核生物細胞中、たとえばヒト胎児腎臓細胞系統ＨＥＫ２９３中への置き換えが行われる。

たとえばＣＨＯ−１ＣＯ８およびＬ−細胞のような酵母およびその他の菌類、昆虫細胞ならびに動物およびヒ、ト細胞のような他の細胞系も、適当な発現ベクターと結合させて、クローニングされるｃＤＮＡの発現のために使用することができる。

この真核性の発現系は、その産生物を有効でかったいていは自然の形で発現できるという利点を有する。

更に、この発現系はその産生物を翻訳後に修飾することができる。

発現されたレセプタータンパク質は、適当な界面活性剤を用いて可溶化され、公知の方法により適当なアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。純粋なポリペプチドは、結晶化およびＸ線構造分析または他の適当な物理的方法により、リガンド結合箇所の立体的構造を解明するために利用される。

遺伝暗号の縮重（Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　）に基づき、他のＤＮＡ配列、たとえば異なるＤＮＡ配列を有する化学的に合成された遺伝子も、前記した５　− ＨＴ　ｌｘ−レセプターを発現するために利用可能である。

本発明により、ここに記載されたレセプターに結合し、かつそこでアゴニスト的またはアンタゴニスト的に作用する物質を同定し、かつ特性決定することが可能である。この作用を調査しかつ定量化する方法は、細胞膜を通過する電流の測定または内部貯蔵物からのＣａ”遊離の検出である。

本発明の他の実施態様は、実施例に詳細に説明されている。

遺伝子工学的方法について、たとえばＭａｎｉａｔｉｓ　ｅｔａｔ、　のハンドブック″Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ＣｌｏｎｉｎｇｌｌＣｏｌｃｌ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　１９８２．　または１ｌＤＮＡ　ｃｌｏｎｉｎｇ″、　Ｖｏｌ　Ｉ−＋１１．　ＩＲＩ　Ｐｒｅｓｓ　１９８５−１９８７．編集者り、Ｍ、　Ｇｌｏｖｅｒが参照される。

例１５　ＨＴｌｘ−レセプターをコード化するｃＤＮＡの単離ラットの大脳０．５ｇを、ＵＬＴＲＡ−ＴＵＲＲＡＸＯ中ノグアニジニウムチオシアネート６Ｍ、クエン酸ナトリウム５ｍＭ　（ｐＨ７，０）、２−メルカプトエタノール０゜１Ｍ、サルコシル０．５％に溶かした。粗製のセルデブリスを３０００ｒｐｍで遠心分離した。ＲＮＡを５゜７−Ｍ−ＣｓＣｌクッションを介して一晩中４５００Ｏｒｐｍでの遠心分離により分離した。引き続き、ポリＡ＋− 含有ＲＮＡフラクションをオリゴ−（ｄＴ）−セルロースのアフィニティークロマトグラフィーにより分離した。

スターターとして逆転写酵素（ＡＭＶ）およびオリゴ（ｄ　Ｔ　）　１２−１８を用いて、このポリＡ”−ＲＮ’Ａ５μｇを一本鎖のｃＤＮＡに書き写した。二本鎖の合成はＥ、　ＣＯｌ　ｉ　ＤＮＡポリメラーゼを用いて行った。

このｃＤＮＡ５ｎｇを鋳型としてポリメラーゼ連鎖反応中で使用した。このため、Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅ１ｍｅｒ社のＤＮＡ増幅キットＧｅｎｅＡｍｐ　ＴＭ　（注文番号１８２４１４）を使用し、た。これは製造元の記載に従って行った。プライマー配列を、イヌ甲状腺からの機能的に更に特性決定されていないレセプタークローンの公開されたｃＤＮＡ配列から誘導した（Ｌｉｂｅｒｔ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８９）　５ｃｉｅｎｃｅ２４４、３．６９−７２）。このプライマーは次の配列を有していた；ＴＣＣＡＡＣ３’ Ｂ　：　ｓ′　Ａｃｔ　ＡＧＧ　ＡＧＧ　ＣＴＴ　ＴＣＣＧＧＡ　ＣＡＴ　ＧＧＡ　ＣＡＡ　ＣＣＣＴＣ丁　ＧＡＡ　ＡＣＧ　ＣＴＴ　ＧＣb ＧＡＡ　ＡＣＴアニール温度は６０℃であり、３分間保持した６その後、このプライマーを７０ ℃で２分間延長させた。

９４℃で１分間変成させた。この温度サイクルを４０回繰り返した。ポリメラーゼ連鎖反応中で、それぞれ２０ｐｍｏｌのプライマーＡおよびＢを使用した。この反応産生物を分析するために、このバッチの１０％を反応の完了の後に１％のアガロースゲルに載せた。

優性のバンドは、約１２００の塩基対のＤＮＡバンドと共に一緒に移行する。これをゲルから電気泳動により溶離し、０ｎｅ−Ｐｈｏｒ−ａｌｌ緩衝液（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　）に収容し、Ｅ、ｃｏｌｉ　ＤＮＡポリポリーゼ■のフレノウ断片と一緒にインキュベートした。デシキシヌクレオチドトリホスフェートの濃度は、この場合、（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰについてそれぞれ）５０μＭであった。

例２ラットの５．ＨＴｌｘ−レセプターをコード化する一本鎖ＤＮＡの製造出発物質は、ポリメラーゼ連鎖反応からの例１に記載されたＤＮＡ断片である。

この断片を工２℃で１２時間Ｓｍａ　Ｉ　１１００ｎを用いて切断し、市販のクローニングベクターＭ１３ｍｐ１８またはＭ１３ｍｐ１９に連結した。この連結バッチの容量は１０μｌであった。この連結を８０℃で５分間の加熱により終了した。この連結バッチの１／Ｉ　Ｏ容量をコンピテントＪＭＩ　Ｏ１細胞１００ μｌの形質転換のために使用した。形質転換の完了後に、形質転換パッチに０．２ＭのＩ　ＰＴＧ溶液６０μｍおよびＸＧａ１　（２０ｍｇ／ｍ１）１２０μｌを添加した。このパッチをＮＺＹＤＴ寒天プレート上のＮＺＹＤＴ−Ｔｏ　ｐ　ａ　ｇ　ａ　ｒ中でＪＭＩＯＩ細胞２００ＩＬｌ　（ＯＤ６００＝１）を用いて平板培養した。培地ＮＺＹＤＴは市販されている（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ　）。前記したＤＮＡ断片を含有するクローンはプラークの青色が欠落することに基づき同定することができる。これはｍｐＲＢＲ−１として表わされる。ＤＮＡ配列分析（Ｓａｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７４．１９７７、５４６３）を用いて、５−ＨＴｌｘ−レセプターをコード化するｃＤＮＡのＤＮＡ配列が解明された。このＤＮＡ配列は、配列調査記録の配列番号２の中に表わされている。

例３、ＨＥＫ　２９３　細胞中でのクローニングされたレセプター遺伝子の一時的発現特に記載のない限りは、細胞培養のための方法は、Ｌｉｎｄｌ　およびＢａｕｅｒの’Ｚａｌｌ−ｕｎｄ　Ｇｅｗｅｂｅｋｕｎｕｒ”（Ｇｕｓｔａｖ　Ｆｉｓｃｈｅｒ　Ｖｅｒｌａｇ）を参照することができる。

二本鎖のｍｐ　１８　ＲＢＲ−Ｉ　ＤＮＡを、酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて再緊縮（ｒｅｓｔｒｉｎｇｉｅｒｔ　）させた。こうして得られた付着末端を有するｍｐ１８ＲＢＲ−１断片は、プラント末端を生じさせるために、酵素Ｔ４−ＤＮＡポリメラーゼおよびＥ−ｃｏｌｉ　ＤＮＡポリメラーゼを用いて標準条件（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｓ、ｏ、　）で処理した。その後、この断片に、配列・５ ’　ＣＴＴＡ　ＧＡＧ　ＣＡＣＡ　３″　３’　ＧＡＡＴＣＴＣ５’を有する市販されているリンカ−（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を連結した。このリンカ−を備えたＤＮＡ断片を、標準条件下で市販のＢｓｔＸＩ切断ベクターｐ　ＣＤ　Ｍ　８　（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ　）中に連結させた。こうして得られた組み換えプラスミドｐＣＤＮ８−５ＨＴ、χを標準条件下で増殖させた。

ＨＥＫ２９３細胞を標準条件下で１０ｃｍの細胞培養シャーレ中で細胞数が７〜８ＸＩＱ”個まで培養した。トリプシン処理した後、この細胞を、ＮａＨＣＯ３２，２ｇ／ｌを含有するＭ　Ｅ　Ｍ培地中で１：３に希釈し、新たに１０ｃｍのベトリ皿に播種した。その後、細胞を４０〜４８時間３７℃で培養した。

トランスフェクションすべきＤＮＡ、ｐＣＤＭＳ−５−ＨＴｌｘを、次のように準備した　ＣｓＣ１勾配を用いてＰ４製したＤ　Ｎ　Ａ溶液２０μｇ　（１ｍｇ／ｍｌ）に、Ｈ２Ｏ４３７μｌを添加し、その後で２ＭのＣａＣｌ２６２．５μ ｍを添加し、引き続きＢＢＳ５０Ｃ１μｌを添加した。この順番は厳守されねばならない。

１０分間で室温でＣａ＋＋沈殿が生じた。

この溶液を、前記の方法により培養した２９３細胞を有する１０ｃｍの細胞培養シャーレに注いだ。注意深く混合した後、この細胞を１５〜２０時間３％のＣＯ，インキュベーター中で３７℃で培養した。その後、注意深（血清不含の培地５ｍｌを添加した。全ての培地を除去し、血清不含の培地５ｍｌを用いた生長工程を繰り返した後、細胞を完全培地１０ｍ１に添加した。

５％のＣＯｉインキュベーター中での４８時間のインキュベーションの後、このｍ胞を薬理学的および電気生理学的調査のために使用することができた。

例４レセプター結合試験例４によりトランスフェクションし、培養した細胞に冷たいＰＢ３２．５ｍｌを添加した。室温で５分間インキュベートした後、更にＰＢ３５ｍｌを添加し、この細胞を注意深く培養シャーレの表面から取り出した。この細胞懸濁液を遠心分離管に移し、約１２００ｇでＴｏ分間遠心分離した。上澄液を注意深く取り除いた後、この細胞を膜調製のために使用した。

細胞ベレットのｌｏｍＭのトリス−ＨＣｌｌ、５ｍｌ　（ｐＨ７，２）中での再懸濁の後、この細胞をＵＬＴＲＡ−ＴＵＲＲＡＸ［Ｆ］を用いて均買化した。この膜ペレットを１０ｍＭのトリス−ＨＣｌｌ、５ｍｌ　（ｐＨ７，２）に収容し、新たにＵＬＴＲＡ−ＴＵＲＲＡＸ■を用いて均質化した。前記したように遠心分離した後、ベレットをＢＢ（１０ｍＭのトリス−ＭＣＩ　（ｐＨ７，２）、１００ｍＭのＮａＣ１）に収容した。短時間均質化した後、組織−ホモジナイザーを用いて、この膜を実際の結合試験で使用した。

こうして製造された膜８００μｌを、４℃で［３Ｈ］セロトニン（最終濃度２ｎＭ）および多様な濃度の試験すべき物質と一緒に２時間インキュベートした。その後、この膜を、結合していない放射性に標識したセロトニンを分離するためにガラス繊維フィルター（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　＆　５ｃｈｕｅｌｌ　Ｎｏ、　３４）で濾過した。結合したスビベロン（Ｓｐｉｐｅｒｏｎ　）の量を液体シンチレーションカウンター中で測定した。

次の物質が試験物質として使用された５−ＨＴ　（＝セロトニン）５−ＣＴ　（−５−カルボキシアミドトリプトアミン）ケタンセリン（Ｋｅｔａｎｓｅｒｉｎ）ミアンセリン（Ｍｉａｎｓｅｒｉｎ）ラウオールスシン（Ｒａｕｗｏｌｓｃｉｎ）プロブラロノール（Ｐｒｏｐｒａｎｏｊｏｌ）この場合衣のに１値が測定されたＬｙｓ　Ｌａｕ　Ｈｌｓ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ａｓｎ　’ｒｙｒ　Ｌｅｕ　ｒｌｅ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　入１ａ　Ｔｈｒ　Ｔｈ■ 人ｓｐ　Ｌａｕ　Ｌａｕ　Ｖａｌ　５ｅｒ　工１ｅ　Ｌｅｕ　ｖａＩ　Ｍｅｔ　Ｐｒｏ　工ｌａ　Ｓｅｒ　工１ｅ　八ｌａ　Ｔｙｒ　ＴｈｒＬｙｓ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　入１ａ　Ｇｌｙ　）ｌｉｓ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｈｅセ　Ｘ１ｅ　入１ａ　入１ａ　Ｖａｌ　Ｔｒ■ Ｓ＠ｒ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　工ｌｅ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　入１ａ　Ｐｈｅ　Ｔｙｒ　工ｌｅ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　工１ｅＬｅｕ　Ｌｅｕ　ｔｌａ　工１ｅ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　工１ｅτｙｒ　Ｖａｌ　入１ａ　入１ａ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　入ｒｑ１１ｅ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ｇｕｙ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　入１ａ　Ｇ１ｎ２２５　°　２コ０　２］５　２４０Ｌｅｕ　工Ｌｅ　Ｔｈｒ　Ｇｕｙ　Ｓｅｒ　入１ａ　Ｃ１ｙ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　５ｅｒＳａｔ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ａｒｑ　Ｇｌｕ　Ａｒｑ　Ｌｙｓ　入１ａ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｘ１ｅ　ｒｌｅ　Ｌｅｕ２９０　２９５　コ００ＧＩＹ＾ｌａ　Ｐｈｅ　Ｉｌｅ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ｔｒｐ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｖａｌコ０５　コ１０　１１５　、　）２ＯＬｅｕ　Ｐｒｏ　ＩＩｓ　Ｃｙｓ　入ｒｇ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ｔｒｐ　Ｉｌｅ　Ｈｉｓ　Ｐｒｏ　入１ａ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ａｓｐコ２５　３コ０　〕］５Ｐｈｅ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ｔｒｐ　Ｌｅｕ　Ｇｕｙ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｈｅ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｚｌｅコ４０　コ４５　３５０Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　ＶａＬ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　Ｇｌｕ　ＧＬｕ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　Ｉｌｌ；ｉｎ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ｇｉｎ　Ａｒｑ　Ｖａｌ　uａｌコ５５　コロ０　コロ５ＣＣＴＣＴＴＴ（１，Ａｃ　ＴＴＣＴＴＣＡＣＧＴ　ＧＧＣＴＡＧＧＴＴＡ　ＴＴｒＡ入入Ｃへ人Ｔ　ＣＴＣＡＴＴ入入ＣＣへ人１０５０ＣＣＧＴＣＡＴＣＴＡ　Ｃ入ＣＴＧＴＧＴＴＣＡＡＣＧ入λＧＡにＴ　ＴＴＣＧＧＣ入＾ＧＣＧＴＴＴＣ八Ｇ入Ｇへ　１１００ＧＴＴＧＴＣＣＡＴＧ　ＴＣＣＧＧＡＡＡＧＣＣＴＣＣＴＡＧＴＣ，Ｇ　ＧＧＡＴＣＣＧＴＣＧ　ＡＣＣＴＣＣＡＧＣＣ１１５０人＾ＧＣＴＴＧＧＣＧ　Ｔ入＾ＴＣＡＴＧＧＴ　ＣＡＴＡＧＣＴＧＴＴ　ＴＣＣ１１８３国際調査報告国際調査報告ＥＰ　９１０２３８５フロントページの続き（５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃｌ２Ｎ　１５／１２　ＺＮＡＣ１２Ｑ　１１０２　６８０７−４Ｂ／／　Ａ　６１　Ｋ　３７１０２　８３１４−４Ｃ（Ｃ１２Ｐ　２１１０２Ｃ１２Ｒ１：９１）ドイツ連邦共和国　Ｄ−６８３６オフタースハイム　ガルテンシュトラーセ　あＩ（７２）発明者　ゼーブルク、　ベータードイツ連邦共和国　Ｄ−６９００ハイデルベルク　エアツエッカーヴエーク　５

Claims

【特許請求の範囲】

１．配列調査記録の配列番号１に記載されたアミノ酸配列を有する場合によりグリコシル化されたポリペプチドならびに比較可能な結合特任を有するそのアミノ酸の欠失、置き換え、挿入、逆転、付加および交換により得られたポリペプチド。
２．請求項１記載のポリペプチドについてコード化するＤＮＡ配列。
３．請求項２記載のＤＮＡ配列を含有する組み換えＤＮＡ分子。
４．適当な宿主系において発現することができる発現制御配列と機能的に結合している請求項２記載のＤＮＡ配列を含有する組み換えＤＮＡ分子。
５．発現制御配列が、Ｅ．ｃｏｌｉ中で有効なプロモーター系、Ｅ．ｃｏｌｉバクテリオフアージ、酵母発現制御配列またはその他の真核性の発現制御配列である請求項４記載の組み換えＤＮＡ分子。
６．請求項３、４または５記載の少なくとも１種の組み換えＤＮＡ分子を含有する宿主生物。
７．細菌、菌類、動物性またはヒトの細胞である請求項６記載の宿主生物。
８．適当な宿主生物中に発現のための請求項１記載のペプチド配列についてコード化するＤＮＡ配列を持ち込むことを特徴とする請求項１記載のポリペプチドを製造するための遺伝子工学的方法。
９．請求項１記載のポリペプチドに結合することができる物質をスクリーニングするために請求項８により製造されたポリペプチドまたは請求項７記載の宿主生物の使用。
１０．医薬のデザインの目的で請求項１記載のポリペプチドの立体構造を解明するための請求項８により製造されたペプチドの使用。