FI116059B - Analogiamenetelmä komponentti B:ksi kutsutun rekombinanttiproteiinin valmistamiseksi sekä DNA-molekyyli, ilmentämisvektori ja isäntäsolu - Google Patents

Description

116059

Analogiamenetelmä komponentti B:ksi kutsutun rekombinantti-proteiinin valmistamiseksi sekä DNA-molekyyli, ilmentämisvektori ja isäntäsolu - Analogiförfarande för framställning av ett rekombinantprotein kallat komponent B samt DNA-molekyl, expressionsvektor ooh värdcell.

Keksintö koskee analogiamenetelmää valmistaa uutta B-komponentiksi kutsuttua rekombinanttiproteiinia, joka on myös saatavissa virtsasta. Analogiamenetelmässä käytetään mainittua proteiinia koodaavaa genomista DNA:ta tai cDNA:ta, sekä näitä DNA-molekyylejä sisältäviä ilmentämisvektoreita ja isäntäsoluj a.

Virtsasta eristetty proteiini puhdistettiin ja karakterisoitiin ja sillä todettiin olevan polypeptidin luonne ja suhteellisen alhainen molekyylipaino. Kun ihmisen virtsaa käsitellään adsorboivilla aineilla, kuten kaoliinilla, ja sen jälkeen sille tehdään suodatus, ioninvaihtokromatografia ja korkean erotuskyvyn kromatografia, edullisesti jäljempänä kuvatun menetelmän mukaisesti, yhdiste saadaan lyofilisoinnin jälkeen amorfisena valkeana jauheena, joka liikkuu yhtenä , , piikkinä korkean erotuskyvyn käänteisfaasi- nestekromato- grafiassa (HPLC-RP) ja jonka molekyylipaino on noin 90 kDa analysoituna elektroforeesilla polyakryyliamidigeelillä * * * '·!.* natriumdodekyylisulfaatin (SDS-Page) läsnäollessa pelkistävis- sä olosuhteissa. Tämä proteiini nimettiin komponentti B:ksi ja jäljempänä siihen viitataan tällä nimellä.

Komponentti B karakterisoidaan yksityiskohtaisemmin aminohappo-j sekvenssillä, joka esitetään sekvenssinä SEKV. ID NO: 1.

Komponentti B:ksi nimetty proteiini, on siis saatavissa * t » !·· : menetelmällä, jossa itse yhdisteen raakafraktio eristetään ·... dialysoidusta virtsakonsentraatista sen jälkeen, kun sitä on :v, käsitelty adsorboivalla aineella, ja puhdistetaan ioninvaihto- kromatograf iällä ja korkean erotuskyvyn kromatograf iällä kuten jäljempänä kuvataan.

2 116059 B-komponentiksi kutsuttu proteiini uutetaan edullisesti ihmisen virtsasta, josta sitä on saatavana suuria määriä käyttökelpoisena teolliseen tuotantoon, mutta keksintö koskee erityisesti rekombinanttiproteiinia, joka sisältää peptidin jolla on sekvenssin SEKV. ID NO 1, sen suoloja, funktionaalisia johdannaisia, esiasteita ja aktiivisia fraktioita samoin kuin sen aktiivisia mutantteja, s.o. muita proteiineja tai polypeptidejä, joissa rakenteen yksi tai useampi aminohappo on eliminoitu tai substituoitu muilla aminohapoilla tai yksi tai useampi aminohappo on lisätty tähän sekvenssiin sellaisten polypeptidien tai proteiinien saamiseksi, joilla on sama aktiivisuus kuin komponentti B:llä, ja käsittää myös vastaavat fuusioproteiinit, s.o. polypeptidit, jotka sisältävät komponentti B:n tai sen mutaation fuusioituna toiseen proteiiniin ja joilla on kauemmin kestävä puoliintumisikä ruumiinnesteissä. Komponentti B voidaan sen tähden fuusioida toisen proteiinin, kuten esimerkiksi immunoglobuliinin, kanssa.

Määritelmä "suolat" tarkoittaa tässä käytettynä sekä yhdisteen karboksyyliryhmien suoloja että aminotoimintojen suoloja, jotka ovat saatavissa tunnetuilla menetelmillä.

Karboksyyliryhmien suoloihin kuuluvat epäorgaaniset suolat, kuten esimerkiksi natrium-, kalium-, kalsiumsuolat ja orgaanis-ten emästen kanssa muodostetut suolat, kuten ne, jotka on • · ··; muodostettu amiinin, kuten trietanoliamiinin, arginiinin tai ·;··' lysiinin, kanssa. Aminoryhmien suolat sisältävät esimerkiksi epäorgaanisten happojen, kuten kloorivetyhapon, kanssa muodostetut suolat ja orgaanisten happojen, kuten etikkahapon, ;,· j kanssa muodostetut suolat.

• s ;[ _ Määritelmä "funktionaaliset johdannaiset" tarkoittaa tässä ‘ käytettynä johdannaisia, jotka voidaan valmistaa aminohappo- osien sivuketjuissa tai terminaalisissa N- tai C-ryhmissä olevista funktionaalisista ryhmistä tunnettujen menetelmien : mukaisesti ja jotka sisällytetään keksintöön silloin, kun ne ovat farmaseuttisesti hyväksyttäviä, s. o. kun ne eivät tuhoa proteiinin aktiivisuutta tai eivät tee niitä sisältävistä 3 116059 farmaseuttisista koostumuksista myrkyllisiä. Sellaisiin johdannaisiin kuuluvat esimerkiksi karboksyyliryhmien esterit tai alifaattiset amidit ja vapaiden aminoryhmien N-asyylijohdannaiset tai vapaiden hydroksyyliryhmien O-asyylijohdannaiset, ja niitä muodostetaan asyyliryhmien, kuten esimerkiksi alkano-yyli- tai aroyyliryhmien, kanssa.

"Esiasteet" ovat yhdisteitä, jotka muutetaan komponentti B:ksi ihmisen tai eläimen kehossa. Proteiinin "aktiivisina fraktioina" keksintö tarkoittaa mitä tahansa itse yhdisteen polypep-tidiketjun fragmenttia tai esiastetta, joko yksin tai yhdistelmässä siihen sitoutuneiden vastaavien molekyylien tai tähteiden, esimerkiksi sokeri- tai fosfaattitähteiden, tai polypep-tidimolekyyliaggregaattien kanssa, kun sellaisilla fragmenteilla tai esiasteilla on lääkkeenä sama aktiivisuus kuin komponentti B:11ä.

Keksintö koskee myös edellä mainittujen polypeptidien ja johdannaisten seosta.

Rekombinanttiproteiinin valmistusta edelsi komponentti B:n karakterisointi käyttäen valmistusprosessia, jossa eristetään l proteiinin raakafraktio dialysoidusta virtsakonsentraatista : sen jälkeen, kun sitä on käsitelty adsorboivalla aineella, ja .· puhdistetaan ioninvaihtokromatografiällä ja korkean erotus- « I ( kyvyn kromatografiällä. Komponentti B:tä valmistetaan edul- * · · lisesti kuvassa 1 esitetyllä menetelmällä ja siihen sisältyvät t % » « ,···, seuraavat vaiheet: « * a) virtsan adsorptio happamassa pH-.ssa kaoliinille ja uutto , , ammoniakilla b) fraktion (a) eluutio Bio Rex 70-hartsilla ammoniakilla » » c) fraktion (b) eluutio DEAE Sepharose-hartsilla asetaattipus- ; i': kurilla d) fraktion (c) eluutio CM Sepharose-hartsilla asetaattipusku-rilla i · * ‘‘v e) fraktion (d) eluutio HPLC C18-hartsilla asetaattipuskurin * I * » .

ja asetonitriilin seoksella 4 116059 f) fraktion (e) eluutio DE-52-hartsilla asetaattipuskurilla g) fraktion (f) eluutio D-Zephyr-hartsilla asetaattipuskurilla h) fraktion (g) eluutio HPLC C18-hartsilla trifluorietikka-hapon vesiliuoksen ja asetonitriilin seoksella i) fraktion (h) eluutio D-Zephyr-hartsilla asetaattipuskurilla

Keksintö koskee erityisesti yhdistelmä-DNA-molekyylejä, jotka sisältävät keksinnön mukaista polypeptidiä tai sen aktiivisia mutantteja tai fuusioproteiineja koodaavan nukleotidisekvens-sin, sen sisältäviä ilmentymisvektoreita, sellaisilla vektoreilla transformoituja isäntäsoluja sekä menetelmää sellaisen polypeptidin, sen aktiivisten mutanttien tai fuusioproteiinien valmistamiseksi viljelemällä mainittuja transformoituja soluja sopivassa kasvualustassa. Määritelmä "yhdistelmä-DNA-molekyy-lit" sisältää genomisen DNA:n, cDNAm, synteettisen DNA:n ja näiden yhdistelmät. Erityisesti keksintö koskee nukleotidisek-venssejä, jotka esitetään SEKV. ID NO: 2:ssa ja vastaavasti SEKV. ID NO: 3:SSa.

SEKV. ID NO: 2: esittää komponentti B:tä koodaavan genomisen DNA-sekvenssin;

Kuva 2 esittää komponentti B:n transkriptioyksikön restriktio- 5 * • · kartan; * « · SEKV. ID NO: 3: esittää komponentti B:tä koodaavan cDNA- » ·' : ·* sekvenssin; 6'*: Kuva 8 esittää täydellisen komponentti B:n cDNA- sekvenssin, ··· jossa osoitetaan restriktiokohdat. Komponentti B:n kloonaus voidaan suorittaa eri tekniikoilla. Yhden tällaisen tekniikan » # mukaisesti valmistetaan oligonukleotidi tai oligonukleotidien ; (*> seos, joiden sekvenssi on saatu komponentti B:n tai sen frag- » · mentin sekvenssistä, ja käytetään koettimena komponentti B:tä ‘koodaavan cDNA:n tai genomisen DNA:n kloonaukseen.

*,· ; SEKV. ID NO: 4: esittää aminohapposekvenssin, jota koodaa sekä : : SEKV. ID NO: 2:ssa esitetty genominen DNA että SEKV. ID NO: 3:ssa esitetty cDNA.

• » I

**·»».

5 116059

Keksintö koskee myös yhdistelmä-DNA-molekyylejä, jotka hybridi-soituvat komponentti B:tä tai sen fragmentteja koodaavan DNA-sekvenssin kanssa.

Geeni voi sisältää luontaisia introneita tai ei, ja se voidaan saada esimerkiksi sopivista soluista uuttamalla ja puhdistamalla tunnetuilla menetelmillä. Sopivat DNA- preparaatit, kuten ihmisen genominen DNA, pilkotaan sopivalla tavalla, edullisesti restriktioentsyymeillä, ja näin saadut fragmentit pannaan sopiviin yhdistelmävektoreihin DNA-kirjaston muodostamiseksi. Sellaiset vektorit voidaan valikoida synteettisillä oligonuk-leotidikoettimilla keksinnön mukaista komponentti B:tä koodaavan sekvenssin tunnistamiseksi.

Erityisesti keksinnön mukaan eristettiin ja kloonattiin komponentti B:n genominen DNA.

Toisaalta vastaava mRNA voidaan eristää soluista, jotka ilmentävät komponentti B:tä, ja käyttää komplementaarisen DNA:n (cDNA:n) tuottamiseen tunnetuilla menetelmillä. Tämä cDNA voidaan sen kaksisäikeiseksi muuttamisen jälkeen panna sopivaan vektoriin, jota voidaan myöhemmin käyttää transformoimaan ’·'·* sopiva isäntäsolu. Tuloksena saadut viljelmät valikoidaan sit- ♦ » · ··'·' ten sopivalla koettimella sellaisen cDNArn saamiseksi, joka ·...’ koodaa kohteena olevia sekvenssejä. Kun haluttu klooni on ker- ran eristetty, cDNA:ta voidaan käsitellä pääasiallisesti samal-: la tavalla kuin genomista DNA:ta. cDNA ei sisällä introneita.

Geneettisen koodin degeneraation vuoksi monia eri kodoneita .*·, voidaan käyttää spesifisen aminohapon koodaamiseen, niin että voidaan tuottaa yksi tai useampi oligonukleotidi, joista jokainen pystyy koodaamaan komponentti B:n fragmentteja. Kuitenkin vain yhdellä tämän ryhmän jäsenellä on geenin kanssa identtinen nukleotidisekvenssi. Sen läsnäolo ryhmässä ja sen ; kyky hybridisoitua DNA:n kanssa myös muiden ryhmän jäsenten läsnäollessa mahdollistaa ei-fraktioiduista oligonukleotideis-ta koostuvan ryhmän käyttämisen samalla tavalla, kuin yksit 6 116059 täistä oligonukleotidia voidaan käyttää kyseistä peptidiä koodaavan geenin kloonaukseen. Vaihtoehtoisesti yksittäinen oligonukleotidi, joka sisältää sekvenssin, joka teoreettisesti kaikkein todennäköisimmin pystyy koodaamaan komponentti B:n geenifragmentteja (sen mukaan, mitä Lathe R. et ai. ovat kuvanneet "kodonien käytön säännöistä" artikkelissa J. Molec. Biol. 183: 1-12 (1985)), mahdollistaa komponentti B:tä tai sen fragmenttia koodaavan komplementaarisen DNA:n tunnistamisen.

Menetelmät nukleiinihappojen hybridisoimiseksi ovat tunnettuja ja kuvattuja, esimerkiksi teoksessa Maniatis, T. et ai., Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor

Press, Cold Spring Harbor, NY, (1982) ja teoksessa Haymes B.T. et al., Nucleic Acid Hybridization: A practical approach, IRL Press, Oxford, Englanti, (1985). Hybridisaatiolla mainittua koetintä tai nukleotidikoettimien ryhmää käyttäen on mahdollista tunnistaa ne genomisessa tai cDNA-geenikirjastossa olevat sellaiseen hybridisaatioon pystyvät DNA-sekvenssit, jotka analysoidaan jälkeenpäin sen varmistamiseksi, että ne koodaavat keksinnön mukaista polypeptidiä (s.o. komponentti . B:tä). Sellaisen komplementaarisen sekvenssin sisältävä _** oligonukleotidi voidaan syntetisoida ja käyttää koettimena t · >·.’ keksinnön mukaisen polypeptidin, s. o. komponentti B:n, geenin tunnistamiseen ja eristämiseen (Maniatis T. et ai., ibid.).

* · '· Kun sopiva, komponentti B:lle spesifinen oligonukleotidi on kerran valikoitu edellä mainittua menetelmää käyttäen, se on ♦ · > mahdollista syntetisoida ja hybridisoida DNA:n kanssa tai edullisesti sellaisen cDNA-.n kanssa, joka on saatu soluista, jotka pystyvät ilmentämään haluttua geeniä, edullisesti sen jälkeen, kun cDNA:n lähde on rikastettu halutuilla sekvensseil-lä, esimerkiksi uuttamalla RNA soluista, jotka tuottavat : haluttua geeniä runsaina tasoina, ja muuttamalla RNA vastaa- ,···, vaksi cDNA:ksi käänteiskopioijaentsyymiä käyttäen.

• · * i * fr 1 ’ Vaihtoehtoisesti sopivat, komponentti B:lle spesifiset oligo- nukleotidit voidaan syntetisoida ja käyttää alukkeina kompo- 7 116059 l nentti B:n cDNA-fragmenttien monistamiseen RACE-PCR:llä (M.A. Innis et ai., PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Academic Press, 1990).

Erityisesti keksinnön mukaisesti ensin suoritettiin eri ihmis-ja solukudosten seulonta komponentti B: n mRNA:n parhaan käytettävissä olevan lähteen tunnistamiseksi. Tähän tarkoitukseen seulottiin ihmisen kudoksia aivoista, munuaisesta, maksasta, keuhkoista, sydämestä, haimasta, istukasta, pernasta, kiveksistä, kateenkorvasta ja kohdusta, samoin kuin epiteelikarsinooma-, promyelosyyttileukemia-, rintarauhas- I syöpä-, Burkittin lymfooma- ja myeloomasolulinjoja.

Seulonta suoritettiin käyttämällä havaittavaa (sensible) määritystä "käänteistranskriptaasi - polymeraasiketjureaktio" (RT-PCR).

Parhaaksi mRNA-lähteeksi saatiin ihmisen kohtukudos.

Komponentti B:n cDNA-kloonit saatiin mainitulla kudoksella , , käyttämällä monistusmenetelmää, jota kutsutaan "nopeaksi 3 1 - ; ja 5 '-cDNA-päiden amplif ikaatioksi" (RACE).

Edellä mainitulla menetelmällä saadut komponentti B:tä koodaa-vat DNA-molekyylit pantiin ilmentymisvektoreihin, jotka oli konstruoitu tunnetuilla tekniikoilla (Maniatis, T. et ai., ibid.). Kaksoishelikaalinen cDNA liitetään plasmidivektoreihin käyttämällä esimerkiksi tekniikoita, joissa käytetään synteettisiä DNA-adaptereita, tai "tylppien päiden" sitomisteknii-·· koita. . .

• t • · I * »

Kohteena olevan proteiinin ilmentämiseksi ilmentymisvektorin tulee sisältää myös spesifiset nukleotidisekvenssit, jotka sisältävät transkriptiota ja translaatiota säätelevää informaa- t > » ! . tiota sitoutuneena haluttua proteiinia koodaavaan DNA:han sellaisella tavalla, että geenin ilmentyminen ja proteiinin tuotanto sallitaan. Jotta geeni voidaan transkriboida, sitä ' 8 116059 täytyy kaikkein ensimmäisenä edeltää promoottori, jonka RNA-polymeraasi voi tunnistaa ja johon polymeraasi sitoutuu aloittamalla siten transkriptioprosessin.

Tunnetaan useita tehokkuudeltaan erilaisia promoottoreita (vahvoja ja heikkoja promoottoreita), jotka ovat erilaisia käytettäessä prokaryootti- tai eukaryoottisoluissa.

Promoottorit, joita voidaan käyttää tässä keksinnössä, voivat olla konstitutiivisia, kuten esimerkiksi bakteriofaagi lambdan int-promoottori, pBR322-.n β-laktamaasin geenin Bla-promoottori sekä pPR325:n kloramfenikoliasetyylitransferaasin geenin CAT-promoottori, jne., tai indusoitavia, kuten esimerkiksi prokaryoottien promoottorit, kuten bakteriofaagi lambdan pääasialliset oikean- ja vasemmanpuoleiset promoottorit (P1 ja Pr) , E. colin promoottorit trp, rec A, lac Z, lac I, ompF ja gal, tai hybridipromoottori trp-lac, jne. (Glik, B.R., J. Ind. Microbiol. 1: 277-282 (1987).

Yhdessä sellaisten vahvojen promoottorien kanssa, jotka . , pystyvät tuottamaan mRNA:ta valtaisia määriä mahdollistaen gee- nin ilmentymisen korkeat tasot prokaryoottisoluissa, on väittä- * | mätöntä käyttää myös sitoutumiskohtia ribosome ja varten, jotta varmistutaan siitä, että mRNA transloidaan tehokkaasti. Esi- • t » merkkinä mainitaan Shine-Dalgarno (SD)-sekvenssi, joka sijaitut" see sopivassa suunnassa aloituskodonista.

* »

Eukaryootti-isäntäsoluilie voidaan käyttää eri transkriptiota ja translaatiota sääteleviä sekvenssejä isännän luonteen mukaisesti. - .

i Näitä voidaan saada viruslähteistä, kuten adenoviruksesta tai :ιΐ(ί papilloomaviruksesta, apinan Simian-viruksesta tai samankaltai- sesta, jossa säätelysignaalit liittyvät spesifiseen geeniin, I t ( ( . jolla on korkea ilmenemistaso. Mahdollisia esimerkkejä ovat » .« * herpesviruksen TK-promoottori, SV40.-n promoottori, hiivan gal4-geenin promoottori, jne. Transkription aloitusta sääte- i 9 116059 levät signaalit voidaan valita sopivasti aikaansaamaan repressio tai aktivoituminen sellaisella tavalla, että geenien ilmentymistä voidaan mukauttaa sen mukaisesti.

DNA-molekyyli, joka sisältää keksinnön mukaista komponentti B:tä koodaavan nukleotidisekvenssin, pannaan yhdessä transkription ja translaation säätelysignaalien kanssa vektoriin, joka pystyy integroimaan kyseisen geenin sekvenssit isäntäsolun kromosomiin.

Solut, jotka kantavat kromosomeissaan sisään vietyä DNA:ta, voidaan valikoida viemällä sisään myös yksi tai useampi markkeri, jotka mahdollistavat ilmentymisvektorin sisältävien isäntäsolujen valikoimisen. Markkeri voi antaa soluille esimerkiksi resistenssin antibiootteja kohtaan tai raskasmetalli (kuten kupari) -resistenssin. Valintageeni voidaan sitoa suoraan ilmennettäviin DNA-sekvensseihin tai ne voidaan viedä itse soluun kotransfektiolla. Runsaaseen geenin ilmentymiseen saatetaan tarvita myös muita osasia. Näihin osasiin saattavat kuulua esimerkiksi transkription vahvistajat ja terminaatio-, , signaalit sekä intronit. Sellaisia osasia sisältäviin ilmenty- misvektoreihin kuuluvat ne, jotka on kuvannut Okayama, H. , Mol. Cell. Biol. 3: 280 (1983).

• > I

Tiettyä plasmidia tai virusvektoria valittaessa huomioon 'i* otettavien seikkojen joukossa ovat: vektorin sisältävien * * < » solujen toteamisen helppous, jotka solut voidaan helposti • * · erotella niistä, jotka eivät sitä sisällä; vektorien kopioiden ,*. lukumäärä, jotka spesifisessä isännässä halutaan, sekä joko mahdollisuus siirtää vektori eri isäntäsoluj en kesken tai ei.

Edullisiin prokaryoottivektoreihin kuuluvat plasmidit, kuten :>t_: ne, jotka pystyvät replikaatioon E. colissa, kuten pBR322, ,*·, ColEl, pSCIOI, pACYC 184, jne. (Maniatis T. et ai., ibid.), «ti ! . Bacillus-plasmidit, kuten pC194, pC221, pT127, jne. (Gryczan * ' T.M., The Molecular Biology of the Bacilli, Academic Press, NY, 307-329 (1982)), Streptomyces-plasmidit, kuten pIJIOl ί 10 116059 (Kendall K.J., et al. , J. Bacteriol. 169: 4177-4183) sekä

Pseudomonas- plasmidit (John J.F., et al. , Rev. Infect. Dis. 8: 693-704 (1986)) (Izaki K., Jpn. J. Bacteriol. 33: 729-742).

Edullisiin eukaryoottivektoreihin kuuluvat esimerkiksi BPV, SV40, bakulovirus, jne. tai niiden johdannaiset. Sellaiset vektorit ovat alalla tunnettuja (Bostein D., et ai., Miami I Wint. Symp. 19: 265-274) (Broach J.R., The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces: Life Cycle and Inheritance, Cold

Spring Harbor, NY, 455-470 (1981)) (Broach J.R., Cell 28: 203-204 (1982)) (BollonD.P., et al., J. Clin. Hematol. Oncol. 10: 39-48 (1980)) (Maniatis T., Cell Biology: A Comprehensive

Treatise Vol. 3: Gene Expression, Acad. Press, NY, 563-608 (1980)).

Näin valmistettu ilmentymäsvektori viedään sopivaan isäntä-soluun sopivalla menetelmällä, kuten transformaatiolla, transfektiolla, lipofektiolla, konjugaatiolla, protoplastifuu-siolla, elektroporaatiolla, saostuksella kalsiumfosfaatin kanssa, suoralla mikroinjektiolla, jne. Isäntäsolu, jota , voidaan käyttää tähän keksintöön, voi olla prokaryootti- tai i eukaryoottisoluja.

Edullisia prokaryootteja ovat bakteerit, kuten E. coli, ·,,,·' Bacillus, Streptomyces, Pseudomonas, Salmonella, Serratia, tiJ* jne. Erityisen edullinen on E. coli, kuten esimerkiksi E.

colin K12 kanta 294 (ATCC 314446) tai E. coli X1776 (ATCC 31537), E. coli W3110 (F, lambda, ATCC 27325).

> f · ,"’t Edullisia eukaryootti-isäntäsoluja ovat nisäkässolut, kuten ihmisen, apinan, hiiren tai hamsterin (kiinanhamsterin muna-sarjan, CHO) solut, koska ne varmistavat proteiinimolekyyleil-le post-translationaaliset modifikaatiot, kuten esimerkiksi oikean laskostuksen ja glykosylaation oikeissa asemissa.

* ♦ t • * t ! »

Keksintöön voidaan käyttää myös hiivasoluja. On olemassa monia eri yhdistelmä-DNA-tekniikoita, joissa käytetään vahvojen I 11 116059

J

promoottorien sekvenssejä ja plasmidin korkeita kopiolukuja ja jotka mahdollistavat halutun proteiinin tuotannon hiivassa.

Sen jälkeen, kun vektori on viety sisään isäntäsoluihin, näitä viljellään elatusaineessa, joka mahdollistaa vektorin sisältävien solujen valikoivan kasvun.

Kloonatun DNA-sekvenssin ilmentäminen mahdollistaa komponentti B:n, sen mutantin tai fragmentin tuotannon. Näin ilmennetty proteiini eristetään tai puhdistetaan tavanomaisilla tekniikoilla, joihin kuuluvat uutto, saostus, kromatografia, elektroforeesi tai samankaltaiset tekniikat, tai affiniteettikromato-grafialla käyttämällä geelipylväälle immobilisoituja anti-komponentti B-vasta-aineita. Komponentti B:tä voidaan tuottaa myös maitoon eritettävänä proteiinina transgeenisissä eläimissä .

Keksintöä koskeva toinen näkökulma on komponentti B:n, sen suolojen, funktionaalisten johdannaisten, esiasteiden tai aktiivisten fraktioiden käyttö lääkkeenä.

it>·' Erityisesti komponentti B:llä on osoitettu anti-inflammatori- '···' siä, koaguloitumisenesto- ja kasvaimenvastaisia ominaisuuksia.

Lisäksi komponentti B voi olla hyödyllinen TGF-alfan muuttu-·,,,· neiden tasojen kanssa korreloivien tautien hoidossa, kuten käyttäytymis- ja hormonaalisissa häiriöissä, angiogeneesissä, jne.

Itse asiassa komponentti B:n on osoitettu inhiboivan TGF-alfan sitoutumista reseptoriinsa af f initeettivakiolla Kj_= 0,77 * 10“10 M saatuna A 431 -solukalvoista, joka vakio on mitattu χ125-TGF-alfan syrjäyttämisen perusteella sen reseptorista.

t t I

Keksinnön kohteena ovat myös farmaseuttiset koostumukset, ! . jotka sisältävät terapeuttisesti aktiivisen määrän komponentti ' ' B:tä yhdessä farmaseuttisesti hyväksyttyjen täyteaineiden tai 12 116059 i eluenttien kanssa. Sellaiset koostumukset voidaan formuloida oraaliseen, rektaaliseen, nasaaliseen ja erityisesti parente-raaliseen antoon.

Keksintöön sisällytetään myös komponentti B:n paikallinen käyttö.

Keksinnön mukaisiin formulaatioihin sisältyvät myös pidenty-neesti lääkeainetta vapauttavat muodot (retard), kuten ihonalaiset implantaatiot, jotka perustuvat maito- ja glykolihapon kopolymeerejä sisältäviin liposomeihin tai mikrokapseleihin.

Muut keksinnön näkökannat selvenevät seuraavan yksityiskohtaisen kuvauksen valossa.

Esimerkki 1.

Komponentti B:n valmistusprosessi ihmisen virtsasta

Komponentti B:n valmistaminen ja puhdistaminen ihmisen virtsasta esitetään yhteenvetona kuvassa 1.

a) VAIHE 1 Lähtöaineena on ihmisen virtsa, johon lisätään HC1: ää pH- • ( · ’•h’ arvoon 3,0. Sakan dekantoinnin jälkeen virtsaan lisätään *...· kaoliinia (10 g/1 lähtövirtsaa) .

: : Suspensio jätetään 16 tunniksi ja sentrifugoidaan sen jälkeen.

Supernatantti poistetaan ja kaoliini uutetaan 2 M ammoniakilla pH 11,0 .

Ammoniakkieluaatin pH saatetaan arvoon 8,0 ja konsentroidaan kalvoultrasuodatuksella (pidättää 1000 daltonia) . Koko toimen-pide suoritetaan 4 °C:ssa.

< I »

« I

i 13 116059 b) VAIHE 2

Kohdan a) liuokseen lisätään etikkahappoa pH-arvoon 4,0 ja sitten Bio Rex 70-hartsia, joka on aiemmin tasapainotettu pH 4:ssä etikkahappopuskurilla.

Liuos pidetään sekoituksessa 4 tuntia ja suodatetaan sitten painesuodattimella.

Adsorboitunut materiaali eluoidaan Bio Rex 70-hartsista ammoniakkieluutiolla pH-.ssa 9,0.

Kromatografieluaatti konsentroidaan kalvoultrasuodatuksella (pidättää 1000 daltonia). Koko toimenpide suoritetaan 4 °C:ssa.

c) VAIHE 3

Kohdan b) materiaali, joka on tasapainotettu etikkahappopusku-rissa pH 5,6:ssa, adsorboidaan ioninvaihtohartsille, kuten DEAE Sepharoselle, joka on aiemmin tasapainotettu pH 5,6:ssa.

, . Adsorption lopussa suoritetaan eluutio käyttämällä 0,5 M

*; * * ammoniumasetaattipuskuria pH 5,6:ssa. Kromatografieluaatti » 1 *·* konsentroidaan kalvoultrasuodatuksella (pidättää 1000 dalto- nia) . Koko toimenpide suoritetaan 4 °C:ssa.

t * d) VAIHE 4

Kohdan c) materiaali tasapainotetaan asetaattipuskurilla pH 4,5:ssä ja adsorboidaan ioninvaihtohartsille, kuten CM Sepharoselle, joka on aiemmin tasapainotettu pH 4,5:ssä.

Kun adsorptio on täydellinen, suoritetaan eluutio 0,15 M ammoniumasetaattipuskurilla pH 4,5: ssä. Kromatograf ieluaatti :<i#: konsentroidaan kalvoultrasuodatuksella (pidättää 1000 dalto- ,···, nia). Koko toimenpide suoritetaan 4 °C:ssa.

I * 14 116059 e) VAIHE 5

Vaiheen d) materiaali puhdistetaan 25 °C:ssa käänteisfaasi-kromatografiällä HPLC C18-hartsilla, joka on tasapainotettu 0,05 M ammoniumasetaattipuskurilla pH.-ssa 5,6.

Adsorboitunut materiaali eluoidaan hartsista ammoniumasetaatti-liuoksella, joka sisältää 30 % (v/v) asetonitriiliä.

Kromatografieluaatti konsentroidaan tislauksella (40 °C) tyhjössä.

f) VAIHE 6

Vaiheen e) materiaali puhdistetaan ioninvaihtohartsilla, kuten DE-52:lla, joka on tasapainotettu pH 5,6:ssa 0,02 M ammonium-asetaattipuskurissa. Adsorboituneen materiaalin eluutio suoritetaan 0,25 M puskurilla. Konsentraatio suoritetaan kalvo-ultrasuodatuksella (pidättää 1000 daltonia). Koko toimenpide suoritetaan 4 °C:ssa.

g) VAIHE 7 , . Vaiheen f) materiaali puhdistetaan ioninvaihtohartsilla, kuten esipakatulla D-Zephyr-pylväällä (myyjä Sepracor), joka on tasapainotettu pH 6,2.-ssa 20 mM natriumasetaattipuskuriliuok-sessa (puskuri A) . Adsorboituneen materiaalin eluutio suorite-·...* taan gradienttieluutiolla 100%:isesta puskuri A:sta 100%: seen

.,(·* natriumasetaattipuskuriliuokseen pH 6,2:ssa, joka sisältää 1 M

NaCl.

h) VAIHE 8

Vaiheen g) materiaali puhdistetaan käänteisfaasikromatografial- • la 25 °C:ssa C18-hartsilla, kuten HPLC:llä. Adsorption jälkeen < * » suoritetaan eluutio lineaarigradientilla, joka muodostetaan kaksikomponenttisella seoksella trifluorietikkahapon vesiliuos-ta (TFA 0,1 %) ja asetonitriiliä, joka on tehty happamaksi ,·, ; TFA:lla (0,1 %). Kromatografieluaatti konsentroidaan tislauk sella (45 °C) tyhjössä ja lyofilisoidaan.

i 15 116059 i) VAIHE 9 Toistetaan vaihe 7.

Lopputuote, komponentti B, otetaan talteen amorfisena valkeana j auheena.

Esimerkki 2.

Komponentti B:n analyyttinen karakterisointi

Komponentti B:n tärkeimpien fysikaalis-kemiallisten ominaisuuksien määrittelemiseksi virtsasta puhdistetulle materiaalille tehtiin seuraavat analyyttiset tarkastukset.

I a) AMINOHAPPOSEKVENSSI

Komponentti B:n aminohapposekvenssi määritettiin Edmanin menetelmän mukaan. Analyysi suoritettiin käyttämällä sekvensoijaa Applied Biosystem, malli 477A, valmistajan antamia arvoja noudattaen. Sellainen analyysi antoi mahdollisuuden tunnistaa komponentti B:n aminohapposekvenssi suhteessa SEKV. ID NO:l-.ssä esitettyyn 81 aminohappotähteeseen.

i ·

b) MOLEKYYLI PAINON MÄÄRITYS

* · *···’ Analyysi suoritettiin "elektronisuihku- massaspektrometrialla" (ES-MS) ja se osoitti 8937,9 daltonin molekyylipainon. Sellai-*...· nen analyysi on paljastanut viisi disulf idisiltaa ja 80 daltonin tähteen, joka katsotaan johtuvan Tyr-tähteeseen (39) : : sitoutuneesta S04-ryhmästä.

,Esimerkki 3 : ··, Ihmisen komponentti B:n genomisen DNA.-n eristys ...: Ihmisen genomi-DNA-kir j asto lambdaf aagivektorissa EMBL-3 \tl· SP6/T7 ostettiin yhtiöltä Clontech (kataloginumero HL 1067 J, eränumero 1221) . Genominen DNA uutettiin ihmisen istukasta ja ; osittaispilkottiin Sau 3A:lla. Ennen kloonausta EMBL-3 Sp6/T7 -vektorin BamHI-kohtaan, DNA- fragmentit eroteltiin sakkaroosi-gradientilla, jolloin saatiin kokoalue 8-22 kb:n välillä.

* 1 I

16 116059

Kasvualusta E. coli K802 -soluja, jotka ostettiin yhtiöltä Clontech (kataloginumero C1004-1) , viljeltiin LB-alustalla, johon oli lisätty 10 mM MgSC>4 ja 0,2 % maltoosia (viljelyalusta) .

Faagikirjasto laimennettiin seoksessa 0,1 M NaCl, 8 mM MgS04, 50 mM Tris-Cl, pH 7,5, 0,01 % gelatiinia (SM). DNA-kirjasto levitettiin maljalle l,5%:isille agar-LB-maljoille. Kun kirjastoa levitettiin maljalle, käytettiin päällimmäisenä agaroo-sikerroksena: 0,136 M NaCl, 0,6 % agaroosia, 1 % tryptonia (Merck, kataloginumero 7213) .

Hvbridisaatioreagenssit 20 x SSC 3 M NaCl, 0,3 M Na-sitraatti, pH 7,0

Hybridisaatioliuos: 5xSSC, 0,02 % SDS:ää, 0,1 % lauroyyli- sarkosiiniä, 0,5 % Blocking-reagenssia (Boehringer, kataloginumero 1096176) . Pesuliuos A: 3xSSC, 0,1 % SDS:ää, ureaa eri konsentraa- . tioina spesifisestä koettimesta riippuen (katso jäljempänä) .

Pesuliuos B: 1XSSC, 0,1 % SDSrää.

(1P-oligo-CBEX4L) • » • · ..i * Toteamissvsteemi • » HRP-oligo/DNA-hybridit todettiin ECL-pakkauksella ja altista-maila ja kehittämällä Hyperfilm E CL Amersham-yhtiöltä (kata-loginumero RPM 2106 ja vastaavasti 2104).

« i > P-oligokoetetut suodattimet ilmaistiin altistamalla ja kehittämällä Hyperfilm β-max (Amersham, kataloginumero RPN10) .

17 116059

Oligonukleotidit

Oligonukleotidit syntetisoitiin automaattisella DNA-synteti-saattorilla (Applied Biosystem malli 392).

Oligonukleotidit puhdistettiin OPC-patruunoilla (Applied

Biosystem, kataloginumero 400771) tai denaturoivalla PAGE :11a.

Koettimina käyttämistä varten oligonukleotidit CB1, CB2 ja CBEX2L 5'-modifioitiin N-MMT-C12-aminomodifioijalla synteesin viimeisen syklin aikana (Clontech, kataloginumero 5206-1) .

Piparjuuri-peroksidaasi (HRP, Boehringer, kataloginumero 814393) konjugoitiin modifioituun oligonukleotidiin M. S.

Urdean (Nuc. Ac. Res. 16: 4937, 1988) mukaan käyttämällä 1,4-fenyleenidi-isotiosyanaattia (Aldrich, kataloginumero 25,855-5) homobifunktionaalisena silloittaja-aineena.

HRP-oligokoettimet puhdistettiin anioninvaihto-HPLC:llä

Nucleopac PA-100-pylväällä (Dionex, kataloginumero 043010) .

Eluutio suoritettiin 20 mM Na-fosfaattipuskurilla, pH 6,0, ja

NaCl:n lineaarigradientilla 0,2:sta l,0:aan M 30 minuutissa.

Puhdistetut HRP-oligonukleotidit konsentroitiin Centricon 10 :11 ä, pestiin PBS:llä ja säilytettiin 4 °C-.ssa pimeässä.

. HRP-oligonukleotidikonsentraatio laskettiin OD4Q3:lla (€493 = .‘.I 89,5 cm-1 x mM"l) .

• · ··;’ Syntetisoitiin seuraavat oligonukleotidit: ’’’·' oligo # sekvenssi kohde CBPU1 5 ' TGACTCACACGGCCGGTTCT promoottori SEKV. ID NO: 5 CBPLl 5 ' CAGCCATGTCCAGTGGTCCT promoottori SEKV. ID NO: 6 CBEX2L 5 ' ACCACAGCCCATGCTCCA eksoni 1 SEKV. ID NO: 7 CB1 5'TGCAGGAAGCACTGGTCAT eksoni 2 SEKV. ID NO:8 h CB2 5'TCTGGCTTGCAGCGGGTAATGGT eksoni 2 SEKV. ID NO:9 U CB3 5'ATGACCAGTGCTTCCTGC eksoni 2 SEKV. ID NO:10 CB5 5'ATCCCACCTGCTGCCTTTTG introni 2 SEKV. ID NO:11 CBEX4U2 5' CGGCGGCTGGGAGCAGT introni 2 SEKV. ID NO: 12 CBF1 5' ATGGAATTCTAYCCATTYAAYCARTC eksoni 3 SEKV. ID NO: 13

,·. : CBF2 5 ' ATGGAATTCTAYCCATTYAAYCARAG eksoni 3 SEKV. ID

* - * ' ‘ NO:14 18 116059

CBR1 5'GTAGAATTCGCGCCAATGGARTCNGGRTC eksoni 3 SEKV. ID

NO :15

CBR2 5'GTAGAATTCGCGCCAATGCTRTCNGGRTC eksoni 3 SEKV. ID

NO :16 CBEX4U 5'AGTACCCCTTCAACCAGAG eksoni 3 SEKV. ID NO :17 CBEX4L 5'CAGACACCATGAGTGAGCTG eksoni 3 SEKV. ID NO :18 CBEX4U1 5'GACACCTCCTCTGTGACGG eksoni 3 SEKV. ID NO :19 CBEX4L1 5'CCAGTTCTGTAGGGTGTCAGT eksoni 3 SEKV. ID NO:20 jossa R= A-G, Y= C-T ja N= A-G-C-T.

Kirjaston titraus

Ihmisen genomi-DNA-kirjasto titrattiin standardimenetelmien mukaisesti (F. Ausubel, Current Protocols in Molecular

Biology) infektoimalla 0,3 ml E. coli K802-solujen yli yön viljelmää kirjaston eri laimennuksilla alueella 2 x 10-3 - 2 x 10-7. Solu-kirjastoseosta inkuboitiin huoneenlämpötilassa 20 minuutin ajan ja siirrettiin sitten 37 °C:seen 10 minuutiksi. Infektoidut solut sekoitettiin 4 ml:aan päällysagaroosia, joka oli esikuumennettu 50 °C:ssa, ja kaadettiin 10 cm:n agarmal-. joille, jotka oli esilämmitetty 37 °C:ssa. Maljoja inkuboitiin 37 °C:ssa yli yön.

M.' Plakkien määrä arvioitiin jokaisessa maljassa. Kullekin kir- jastolaimennukselle valmistettiin rinnakkaismal jät. Ihmisen genomi-DNA-kirjaston tiitterin havaittiin olevan 5 x 109 pfu/ml, kuten odotettiin.

Kirjaston seulonta « * E. coli K802 -soluja kasvatettiin yli yön 37 °C:ssa. SM: ään suspendoidulla kirjastoerällä (6 x 10^ pfu) infektoitiin 0,6 ml soluviljelmää. Infektio ja maljalle levittäminen suoritet- * tiin kuten edellä, mutta käytettiin 9 ml päällysagaroosia ja • » · ! ; 15 cm.-n maljoja.

19 116059

Semikonfluentit plakit siirrettiin Hybond N+-nailonkalvoille (Amersham) Amershamin käyttöohjeiden mukaisesti.

Blotattu DNA denaturoitiin panemalla suodattimet plakkipuoli ylöspäin suodatinpaperille, jota oli liotettu 1,5 M NaClrssä, 0,5 M NaOH:ssa 7 minuutin ajan.

Sen jälkeen blotattu DNA neutralisoitiin panemalla suodattimet suodatinpaperille, jota oli liotettu neutralointiliuoksessa (1,5 M NaCl, 0,5 M Tris-Cl, pH 7,2, 1 mM EDTA) kahdesti 3 minuuttia kummallakin kerralla.

Suodattimet pestiin 2XSSC:ssä ja ilmakuivattiin. DNA kiinnitettiin kalvolle panemalla suodattimet suodatinpaperille, jota oli liotettu 0,4 M NaOHrssa 20 minuutin ajan.

Lopuksi suodattimia pestiin 5xSSC:ssä 1 minuutin ajan ja varastoitiin muovipussiin 4 °C:ssa hybridisaatioon saakka. Ihmisen genomi-DNA-kirjastoa (1 x 106 kloonia) seulottiin korkealla maljaustiheydellä HRP-CB2-oligokoettimella. Valikoitiin , . 20 positiivista kloonia.

’··* Kuusi positiivista kloonia seulottiin uudelleen sekä HRP-CB1- että HRP-CB2-oligokoettimella. Kolmen kloonin, jotka nimettiin 4D, 12B ja 15, varmistettiin olevan positiivisia komponentti B -geenille.

Hybridisaatio • ·_ Suodattimia esi-inkuboitiin 42 °C:ssa 30 minuutin ajan hybridi - saatioliuoksessa, sen jälkeen ne hybridisoitiin sopivan HRP-oligokoettimen (5 ng/ml oligonukleotidiosuus hybridisaatio-liuoksessa) 42 °C:ssa 45 minuutin ajan ja pestiin lopuksi kahdesti 15 minuuttia molemmilla kerroilla 42 °C:ssa pesuliuok- * > · ! . sessa, joka sisälsi ureaa sopivana konsentraationa (katso jäl jempänä) .

20 116059

Suodattimet pestiin nopeasti 2xSSC:ssä huoneenlämpötilassa ja hybridisoituneet plakit todettiin ECL-reagensseilla sekä altistamalla Hyperfilmille 60 minuutin ajan.

Pesuolosuhteet HRP-oligokoetinsuodattimille määritettiin kokeellisesti minimoimaan ei-spesifinen hybridisoituminen E. colin ja lambdafaagin DNA-molekyyleihin. Kyseisen DNA:n sarja-laimennokset alueella 500-15 attomoolia sijoitettiin Hybond N+-kalvolle lambda-DNA:n läsnäollessa (10 ng) . Lambdan ja E. colin DNA:itä (10 ng kumpaakin) käytettiin negatiivisina kontrolleina. Useita suikaleita (strips) valmistettiin ja käytettiin hybridisaatiokokeissa 5 ng/ml:n kanssa koetinta. Pesut i suoritettiin pesuliuoksella A, joka sisälsi 0, 9, 18, 27 ja 36 % ureaa.

Tehokkaiksi havaittiin 18 % ja 27 % ureaa CBl:lle ja vastaavasti CB2:lle. CBEX2L:n kanssa hybridisoituneet suodattimet pestiin pesuliuoksella A, joka sisälsi 18 % ureaa.

Hybridisaatio 32p_0ligo-CBEX4L:llä suoritettiin 50 °C:ssa ja . . suodattimet pestiin 45 °C:ssa pesuliuoksessa B.

• · '*f Plakkien aliseulonta * i · * I ·

Positiiviset plakit poimittiin Pasteur-pipetillä ja siirret-tiin putkeen, joka sisälsi 1 ml SM:ää ja tipan kloroformia.

: Sen jälkeen, kun oli inkuboitu ravistelemalla 2 tuntia huoneen lämpötilassa, faagisuspensio varastoitiin 4 °C:ssa.

Kymmenen senttimetrin maljalle levitettiin 10"^-laimennus i faagisuspensiota ja seulottiin uudelleen kahdella rinnakkais- ^ » suodattimella kahden oligokoettimen kanssa, s.o. yhtä käytet-tiin ensimmäiseen seulontaan ja toinen sopi komponentti B:n viereiseen alueeseen.

I l· f s « »

Itsenäiset kloonit, jotka olivat positiivisia molempien koet-timien kanssa, poimittiin talteen ja resuspendoitiin kuten ί ! I 116059 21 edellä.

Faacrivarastoien valmistus

Positiivisia klooneja laajennettiin infektoimalla E. coli K802 -soluja ja kasvatettiin 15 cm:n agarmaljoilla. Yli yön inku-boinnin jälkeen 37 °C:ssa konfluentti lysaatti otettiin agarmaljoista talteen 10 ml :11a SM:ää. Muutama tippa kloroformia lisättiin, solujäännökset poistettiin sentrifugoimalla 3000 rpmrllä 5 minuutin ajan 4 °C:ssa ja kirkas supernatantti, joka sisälsi faagit, pantiin 50%:iseen glyseroliin, jaettiin eriin (aliquoted) ja varastoitiin -80 °C:ssa.

Faaqi-DNA:n uutto

Valikoidulla faagikloonilla (solu/faagi-suhde= 4:1) infektoi-tiin 2 x 10^ E. coli K802 -solua ja kasvatettiin 100 ml:ssa nestemäistä kasvualustaa yli yön 37 °C:ssa. Inkuboinnin loppuvaiheessa suoritettiin täydellinen solulyysi lisäämällä viljelmään kloroformia (5 μΐ/ml). Faagi-DNA uutettiin Quiage-j»|.§ nilla valmistajan ohjeiden mukaisesti.

• i « * » » i » • · ’Faagi-DNA:n sekvensointi ti· I >

Faagi-DNA sekvensoitiin yhtiön Applied Biosystem syklisekven-sointipakkauksella (kataloginumero 401388) automaattisella DNA-sekvensoijalla (Applied Biosystem, malli 373A) . Faagi-DNA uutettiin klooneista 4D, 12B ja 15 ja sekvensoitiin syklisek- vensoinnilla.

t

Sekvensointialukkeet saatiin joko komponentti B:n aminohappo-·' sekvenssistä (CBF1, CBF2, CBR1, CBR2) tai saatavissa olevasta ,· cDNA:n tai genomisen DNA:n sekvensointiaineistosta.

; Sekvensointiaineisto osoitti, että kolme kloonia sisälsi täysi mittaisen komponentti B-geenin.

22 116059

Faagj-DNA;n restriktioanalwsi

Faagi-DNA: lie tehtiin yksittäisiä ja monia restriktioentsyymi-pilkkomisia. DNA-fragmentit eroteltiin 0,6%:isella agaroosi-geelielektroforeesilla ja blotattiin sen jälkeen Hybond N+-kalvolle. Suodattimia koetettiin toistuvasti oligonukleo-tideilla CBEX2L, CB2 ja CBEX4L, jotka sopivat vastaavasti eksoneihin 1, 2 ja 3.

Komponentti B-qeenin alikloonaus pBlueScript II SK-plasmidiin

Komponentti B:n 4D-kloonin restriktioanalyysi EcoRI:llä, Xho I:llä ja Sfi I:llä sekä Southern blottaus oligokoettimilla, jotka olivat spesifisiä kolmelle komponentti B:n eksonille, osoitti, että koko komponentti B-geeni sisältyi 5,2 kb:n EcoRI-fragmenttiin (kuva 5).

Faagi-DNA uutettiin 4D-kloonista ja pilkottiin EcoRI:llä. Tuloksena saadut DNA-fragmentit eroteltiin agaroosigeelielekt-roforeesilla. 5,2 kb:n fragmentti puhdistettiin Qiaexilla . , (Qiagen, kataloginumero 20020) ja liitettiin EcoRI:llä lineari- soituun pBluescript II KS -plasmidiin (Stratagene, katalogi-’···* numero 212207) . E. coli -kanta XLl-Blue (Stratagene, katalo- ginumero 200268) transformoitiin ligaatioseoksella ja trans-·...* formoidut solut valikoitiin Ap/Tc-maljoilla. Yksi klooni, joka ,.N* sisälsi odotetun plasmidin, kuten restriktioanalyysillä

EcoRIrllä osoitettiin, eristettiin ja nimettiin pBSCB4D:ksi.

Lisärestriktioanalyysi suoritettiin restriktioentsyymeillä Smal, Kpnl, Hind III, Sfil, Accl, Notl, Sali, Xhol, EcoRV, Clal, Hinc II, Hind II, Seal, Bgl II, Aat 2, Ncol, Nhel, Hpal ja Mlul. Lisäksi tehtiin Southern blot-analyysi komponentti B:lle spesifisten oligokoettimien kanssa pBSCB4D:llä yksittäis-; . ten ja kaksoispilkkomisten jälkeen.

Kuva 6 esittää pBSCB4D-plasmidin restriktiokartan.

23 116059

Kuva 4 esittää komponentti B-geenin restriktiokartan. Komponentti B-geeni sisältää 3 eksonia, joita erottaa 2 intronia. Sopivat akseptori ja donori konsensussilmukointikohdat reunustavat eksoneita.

Eksoni 1 on pituudeltaan 84 bp ja sisältää 26 nt ei- transloi-tua mRNArta ja sekvenssin, joka koodaa oletetun signaalipepti-din 19 aminohappoa. Sen erottaa eksonista 2 410 bp:n introni.

Eksoni 2 on 120 bp pitkä ja koodaa oletetun signaalipeptidin 3 aminohappoa ja kypsän proteiinin 37 aminohappoa. Sen erottaa eksonista 3 noin 550 bp:n introni.

Eksoni 3 on 326 bp pitkä; se koodaa komponentti B:n 44 C-termi-naalista aminohappoa ja 192 nt ei-transloitua mRNA:ta, joka sisältää polyadenylaatiosignaalin (TATAAA) 14 bp:ia ylävirtaan 3'-prosessointikohdasta, johon päähän poly(A)-häntä liitetään.

Erityisesti kolmessa genomisessa kloonissa sekvenssiä koodaa-van signaalipeptidin havaittiin sisältävän Leu-kodoni oletetun , . signaalipeptidin asemassa 11.

'<··' Genomisesta geenistä peräisin olevan komponentti B:n aminohap- posekvenssin havaittiin olevan identtinen yhden sellaisen kanssa, joka määritettiin kokeellisesti Edmanin degradaatiol- la·

Sekvenssianalyysi eksonin 1 ylävirtaan osoitti selvästi promoottorialueen (kuva 3) sisältävän TATA-boksin -28-.ssa sekä !_ eri ylävirran.promoottoriosasia ja vahvistajia, mukaan lukien GC-rikas boksi -58:ssa, AP-l-kohta -83:ssa, AP-2-kohta -360:ssa sekä useita E-bokseja.

* ,··, TATA-boksi on edullinen sitoutumiskohta transkription aloitus- , faktorille TFIID. GC-rikas boksi edustaa sitoutumiskohtaa ’ ' Sp-1:Ile, joka on yleinen monien eri geenien transkriptioon osallistuva transkriptiofaktori (Transcription and Splicing, 24 116059 j B.D. Hames & D.M. Glover, toim. IRL press, 1988) .

AP-l-kohta on sitoutumiskohta AP-l:lle, joka on c-fos:n ja c-jun:n muodostama transkriptiofaktorikompleksi. AP-l-kohta esiintyy useissa geeneissä, jotka osallistuvat solun kasvuun ja erilaistumiseen. AP-1 on yksi monista cis-elementeistä, jotka välittävät induktiovasteita proteiinikinaasi C:n akti-vaattoreille (The hormonal control of gene transcription, P. Cohen & J.G. Foulkes, toim, Elsevier, 1991).

AP-2-kohta on kohde AP-2:lle, joka on PMA:n ja cAMP:n aktivoima transkriptiofaktori (ibidem).

E-boksit ovat yleisiä sekvenssejä, joita havaitaan useissa vahvistaja-alueissa, ja ne ovat tärkeitä geenien kudosspesifi-sen ilmenemisen määräämisessä. E-boksi sisältää CANNTG-sekvenssin, jossa spesifisen E-boksin mukaan vaihtuu kaksi sisäistä emästä (R.E. Kingston, Current Opinion Cell. Biol. 1989; 1: 1081-1087) .

Komponentti B:n promoottori sisältää potentiaalisen vaste-osan glukokortikoidireseptorille (GRE), mikä osoittaa sen, ' ,* että glukokortikoidit saattavat indusoida komponentti B -gee- ν', ’ niä.

• ;· Komponentti B-geenin alikloonaus vektoriin nisäkässoluissa ilmentämistä varten >:t Introni (e)n läsnäolon tiedetään voivan parantaa rec- proteii- nien ilmentymistä nisäkässoluissa. Komponentti B:n genominen DNA voidaan ilmentää nisäkässoluissa.

Lopuksi, 1364 bp:n fragmentti, joka käsittää komponentti B -geenin asemasta +50 asemaan +1413, poistetaan pBSCB4D:stä ; , pilkkomalla Pvu II:11a ja Nar l:llä. Kuva 2 esittää komponent- ’* · ti B:n transkriptioyksikön restriktiokartan, jossa Pvu II ja

Nar 1 -kohdat ovat perustana. Kokonainen komponentti B-geeni 25 116059 kootaan uudelleen liittämällä tämä fragmentti sellaisen synteettisen oligonukleotidin kanssa, joka tuottaa jälleen geenin 5'-pään, jota reunustaa sopiva restriktiokohta geenin myöhempää kloonausta varten eukaryoottiseen ilmentymisplasmi-diin.

Esimerkki 4:

Komponentti B:n cDNA-kloonien eristys cDNA-päiden nopeaa monistamistekniikkaa ("Rapid Amplification of cDNA Ends", RACE), joka on Frohmanin ym. (1988) artikkelissa Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 8998 kuvaama tekniikka, käytettiin sellaisten osittaisten cDNA- kloonien saamiseen, jotka vastaavat komponentti B:n mRNA:n 5'- ja 3'-päitä. Osittaiset kloonit sisälsivät päällekkäin menevän DNA-sekvens-sin ja sen vuoksi ne voitiin yhdistää täysipituisen komponentti B: n cDNA-sekvenssin konstruoimiseksi. Kuvassa 7 esitetään kaavio, joka kuvaa RACE-kloonaukseen käytetyn yleisen toimintatavan .

3'-RACE:a varten komponentti B-geenin toisen eksonin DNA-sekvenssi oli saatavissa ja sitä käytettiin geenispesifisen • « alukkeen CKCB1 (5' -TCAAGTGCTACACCTGCAAGGAG-3 ' ) (SEKV. ID NO: 21) suunnittelemiseen. cDNA-synteesi aloitettiin ihmisen koh- * * t dun poly (A)+RNA:n poly (A)-hännästä oligonukleotidin *· 5 1 -GGCCACGCGTCGACTAGTACTTTTTTTTTTTTTTTTT-3 ' (SEKV. ID NO-.24) • · I » kanssa, jota kutsutaan AP:n adapterialukkeeksi. cDNA: ta käytettiin templaattina polymeraasiketjureaktioon (PCR) CKCB1-ja AP-alukkeiden kanssa, jotka tuottivat noin 450 emäsparin (bp) fragmentin, joka vastasi komponentti B:n cDNA-.n 3'-päätä.

» I

„7* 5'-RACE:a varten suunniteltiin aluke CKCB7 Γ’: (5 ' -CGTCAGAGAGGAGGTG-3 ' ) (SEKV. ID NO: 22) 450 bp:n 3 1-RACE- fragmentin DNA-sekvenssistä ja sitä käytettiin aloittamaan ! . cDNA-synteesi ihmisen kohdun poly(A)+RNA:sta. Puhdistamisen * : jälkeen mRNA:n ja CKCB7-alukkeen poistamiseksi cDNA:n 31-pää hän lisättiin oligodeoksisytidiinihäntä. cDNA:ta, johon oli 26 116059 lisätty häntä, käytettiin templaattina PCR-.ssä sisäkkäisaluk-keen (nested primer) CKCB2 (5'-ACCGTCACCAGCGTGGTC-3' ) (SEKV. ID NO: 23) ja ankkurialukkeen (anchor primer) (ACP, 5'- CTACTACTACTAGGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG-3') (SEKV. ID NO: 25) kanssa tai ACP:n ja yleisen amplifikaatioalukkeen (UAP, 5'- CTACTACTACTAGGCCACGCGTCGACTAGTAC-3') (SEKV. ID NO: 26) seoksen kanssa. CKCB2 pariutui toisen eksonin sekvenssin 3'-päähän ja ACP pariutui oligodeoksisytidiinihäntään. Saatiin noin 230 bp.-n fragmentti, joka sisälsi komponentti B:n mRNA:n 5'-päätä vastaavan DNA-sekvenssin.

Käytetyt yleiset koekäytännöt (kuten polyakryyliamidigeeli-elektroforeesi, etanolisaostus, ligaatio ja restriktioendonuk-leaasipilkonta), bakteerien kasvualustat (kuten LB) ja kemialliset liuokset (kuten fenoli) kuvataan yksityiskohtaisesti teoksessa Sambrook et ai., (1989) Molecular Cloning: A

Laboratory Manual, 2. painos, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, ellei muuhun ole viitattu.

3'-RACE-kloonausmenetelmä *·'' 3 1-RACE-j är j estelmä cDNA-päiden nopeaan amplif ikaatioon hankittiin yhtiöltä Life Technologies, Inc., Grand Island, NY. Ihmisen kohdun poly(A)+RNA hankittiin yhtiöltä Clontech : Laboratories, Inc., Palo Alto, CA. Ensimmäinen cDNA-säie ·;· tehtiin käyttämällä 3 '-RACE-järjestelmän sisältämää käytäntöä ja reagensseja. Lyhyesti, 1 μΐ (1 μg) kohdun poly (A)+RNA: ta yhdistettiin 1 μ1:η kanssa 10 μΜ liuosta AP:tä ja 12 μ1:η kanssa dietyylipyrokarbonaatti (DEPC)-käsiteltyä vettä ja seos 1 kuumennettiin - 65 °C:seen 10 minuutiksi. Sen jälkeen, kun seos oli jäähdytetty jäillä, lisättiin reaktiokomponentit siten, että lopullinen koostumus oli noin 20 mM Tris-HCl (pH 8,4), 50 mM KC1, 2,5 mM MgCl2, 100 μg/ml naudan seerumin albumiinia, 500 nM AP:tä, 500 μΜ kutakin nukleotideista dATP, dCTP, dGTP ! . ja dTTP sekä 50 ng/μΐ RNA:ta 19 μ1:η tilavuudessa. Reaktioseos ** ! kuumennettiin 42 °C:seen ja 1 μΐ (20 yksikköä) SuperScript- käänteiskopioijaentsyymiä lisättiin. 30 minuutin inkuboinnin 27 116059 jälkeen 42 °C:ssa reaktioseos jäähdytettiin jäillä ja siihen lisättiin 1 μΐ RNaseHrta (2 yksikköä). RNaseH-pilkontaa tehtiin 10 minuuttia 42 °C:n lämpötilassa. Reaktioseos säilytettiin -20 °C:ssa ennen PCR:ää.

PCRrää varten valmistettiin neljä identtistä 40 μ1:η seosta, joista kullakin oli seuraava koostumus: 1 μΐ kohdun poly (A)+cDNA:ta seoksessa 40 mM KCl, 70 mM Tris-HCl (pH 8,8), 0,1 % Triton X-100, 1 mM MgCl2, 0,25 μΜ CKCBl:tä ja 0,5 μΜ AP:t ä. 3'-RACE-järjestelmän reagensseja ei käytetty PCR:ään.

Sekä CKCB1- että AP-alukkeet syntetisoitiin Applied Bio-systems, Inc. malli 392 -oligonukleotidisyntetisaattorilla. Suojauksenpoiston, lyofilisaation ja DEPC-käsiteltyyn veteen resuspendoinnin jälkeen kunkin liuoksen optinen tiheys mitattiin aallonpituudella 260 nm. Optisen tiheyden mittausten perusteella valmistettiin kunkin oligonukleotidin 10 μΜ liuos DEPC-käsitellyssä vedessä. Raakaoligonukleotiliuoksia käytettiin PCR:ään ilman myöhempää puhdistusta. Raa'an AP-.n konsen-traatio, joka tuotti identtiset tulokset 3'-RACE-järjestelmässä varustettuna olleen AP:n kanssa, määritettiin kokeellisesti; 0,4 μΜ raaka AP oli vastaava Life Technologies, Inc. -yhtiön 0,2 μΜ AP:n kanssa PCR:ssä. 1 μΐ PCR-reaktioita kuumennettiin 94 °C:seen lämpötilan kierrättäjässä (cycler) ennen kuin jokaiseen lisättiin 10 μΐ '·· seosta, joka sisälsi seuraavaa: 1,25 yksikköä AmpliTaq DNA-

polymeraasia (Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT), 40 mM KCl, 70 mM Tris-HCl (pH 8,8) , 0,1 % Triton X-100, 1 mM MgCl2 ja 1 mM

kutakin nukleotideista dATP, dTTP, dGTP ja dCTP. Kunkin reagenssin lopullinen konsentraatio PCR:ssä oli noin 1 μΐ Ί* kohdun cDNA:ta/50 μΐ, 1,25 yksikköä AmpliTaq DNA-polymeraa- sia/50 μΐ, 40 mM KCl, 70 mM Tris-HCl (pH 8,8), 0,1 % Triton

: : X-100, 1 mM MgCl2, 0,2 μΜ CKCBl:tä, 0,4 μΜ AP:tä ja 0,2 mM

kutakin nukleotideista dATP, dTTP, dGTP ja dCTP. Viiden ! , minuutin inkuboinnin 94 °C:ssa päättymisen jälkeen suoritet- * ‘ tiin "Touchdown" PCR-lämpötilan kierrättäjäohjelma artikkelin

Don, R.H., Cox, P.T., Wainwright, B.J., Baker, K. ja Mattick, 28 116059 J.S. (1991) Nucl. Acids Res. 19: 4008 mukaan vaihtamalla emäspariutuslämpötila 73 °C:sta 63 °C:seen.

PCR-monistuksen jälkeen neljä reaktiota yhdistettiin ja DNA-tuotteet kokoeroteltiin elektroforeesilla 5%:isella polyakryyliamidigeelillä. Noin 450 bp:n DNA-tuote irrotettiin geelistä ja puhdistettiin elektroeluutiolla dialyysiputkistos-sa. Eluaatti uutettiin 50:50 (v:v) -seoksella fenolia ja kloroformia, etanolisaostettiin, kuivattiin ja resuspendoitiin 10 ^l:aan steriiliä vettä.

Puhdistetulla 450 bp:n PCR-fragmentilla odotettiin olevan yksittäinen deoksiadenosiinitähde kussakin 3'-päässä, koska Taq-DNA-polymeraasin terminaalinen transferaasiaktiivisuus on templaatista riippumatonta ja se suosii voimakkaasti dATP:tä (Clark, J.M. (1988) Nucl. Acids Res. 16: 9677 sekä Mole, S.E., Iggo, R.D. ja Lane, D.P. (1989) Nucl. Acids Res. 17: 3319) .

PCR-fragmentin subkloonaamiseksi ja karakterisoimiseksi valmistettiin pBluescriptSK+ (Stratagene, La Jolla, CA) "T-vektori" pääasiallisesti siten kuin Marchuk, et ai. (1991) Nucl. Acids Res. 19: 1154 ovat kuvanneet. Plasmidi pBluescript *.V (20 μ$) pilkottiin EcoRV-restriktioendonukleaasilla ja puhdis- ·',,,· tettiin sitten uuttamalla fenolin ja kloroformin 50:50 (v:v) -seoksella. Etanolisaostuksen jälkeen DNA:ta käsiteltiin 9 yksiköllä Taq-DNA-polymeraasia 2 tunnin ajan 70 °C:ssa 50 μ1:η ·[· reaktiossa, joka sisälsi 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 9,0), 0,1 % Triton X-100, 1,5 mM MgCl2 ja 2 mM dTTP:tä. Vektori puhdistettiin uudelleen uuttamalla fenolin ja kloroformin (50:50, v:v) seoksella ja etanolisaostuksella. Tämä menetelmä ; johti yksittäisen deoksitymidiinitähteen lisäämiseen kuhunkin ;·' 3 '-päähän ja teki vektorin yhteensopivaksi Taq-DNA-polymeraa- ,* silla syntetisoitujen DNA-fragmenttien insertoimiseen.

i »

Ei-fosforyloitu 450 bp:n PCR-fragmentti insertoitiin T- t i » ; t vektoriin reaktiolla T4-DNA-ligaasin kanssa (New England '· · Biolabs, Beverly, MA) käyttämällä valmistajan suosittelemia olosuhteita. Ligaatioreaktiota inkuboitiin noin 72 tuntia 16 29 116059 °C:ssa ja käytettiin sitten transformoimaan kompetentit E. coli XLl-Blue-solut (Stratagene, La Jolla, CA). Transformoidut solut levitettiin LB-agarille, joka sisälsi 50 /xg/ml ampisil-liinia. Ennen solujen levittämistä kunkin maljan agarpinnalle päällystettiin peräkkäin 100 μΐ 2%:ista X-galia (Life Technologies, Inc., Grand Island, NY) ja 40 μΐ 100 mM IPTG:tä (Life Technologies, Inc., Grand Island, NY) ja annettiin kuivua. Yli yön 37 °C:ssa inkuboinnin jälkeen sinisenväriset pesäkkeet ja värittömät pesäkkeet (valkoiset) olivat näkyviä. Plasmidi-DNA puhdistettiin 12:sta valkean pesäkkeen viljelmästä. Kaikki 12 isolaattia sisälsivät 450 bp:n insertin. Lisäanalyysiin valikoitiin viisi kloonia: 3CB4, 3CB6, 3CB7, 3CB8 ja 3CB9. DNA-sekvenssianalyysi tehtiin käyttämällä Sequenase versio 2.0-pakkausta (United States Biochemical, Cleveland, Ohio).

5'-RACE-kloonausmenetelmä 5'-RACE-järjestelmä cDNA-päiden nopeaan amplifikaatioon hankittiin yhtiöltä Life Technologies, Inc., Grand Island, NY. Ihmisen kohdun poly(A)+RNA hankittiin yhtiöltä Clontech » > <*

Laboratories, Inc., Palo Alto, CA. 51-RACE- kloonauskokeet « * tehtiin käyttämällä 5 ' -RACE-järjestelmän käytäntöä ja reagens-seja seuraavin poikkeuksin: (a) CKCB7-, ACP- ja UAP-alukkeet syntetisoitiin yhtiön Applied Biosystem, Inc, malli 392 ;· oligonukleotidisyntetisaattorilla ja valmistettiin kuten 3'-RACE-kloonaukseen kuvattiin, ja (b) cDNA-monistukseen käytettiin 31-RACE-kloonaukseen kuvattua "Touchdown"-PCR- lämpötilasykliohjelmaa. Ensimmäisen cDNA-säie syntetisoitiin seuraavalla tavalla: 1 μΐ (1 μg) kohdun poly(A)+RNA:ta yhdis-'T tettiin 0,5 μ1:η kanssa 10 μΜ liuosta CKCB7:ää ja 13,5 μ1.·η kanssa DEPC-käsiteltyä vettä ja seos kuumennettiin 70 °C:seen ; _: 10 minuutiksi. Sen jälkeen, kun seos oli jäähdytetty jäillä, .·_ lisättiin reaktiokomponentit siten, että lopullinen koostumus

. oli noin 20 nM Tris-HCl (pH 8,4), 50 mM KC1, 3 mM MgCl2, 10 mM

* DTT:tä, 200 mM CKCB7:ää, 400 μΜ kutakin nukleotideista dATP, dCTP, dGTP ja dTTP sekä 40 ng/μΐ RNA:ta 24 μ1:η tilavuudessa.

I 116059 ! 30

Reaktioseos kuumennettiin 42 °C:seen ja 1 μΐ (220 yksikköä) Superscript II -käänteiskopioijaentsyymiä lisättiin. Sen jälkeen, kun oli inkuboitu 30 minuuttia 42 °C.-ssa ja 15 minuuttia 70 °C:ssa, reaktioseos pantiin 55 °C:seen ja siihen lisättiin 1 μΐ RNaseH-.ta (2 yksikköä). RNaseH-pilkontaa tehtiin 10 minuuttia 55 °C:n lämpötilassa.

cDNA erotettiin liittymättömistä dNTP-molekyyleistä, CKCB7:stä ja proteiineista käyttämällä Glassmax DNA Isolation Spin Cartridge-järjestelmää (sisältyy 5'-RACE-järjestelmään).

Yksityiskohtaisesti, ensimmäisen säikeen reaktioon lisättiin 120 μΐ sitoutumisliuosta (5 M Nai), ja cDNA/Nal-liuos siirrettiin GLASSMAX-pyöröpatruunaan (spin cartridge). Sentrifugoi-tiin kiihtyvyydellä 13 000 x g 20 sekuntia, minkä jälkeen lisättiin 0,4 ml kylmää (4 °C) 1 x pesupuskuria. Pyöröpatruu-naa sentrifugoitiin vielä 20 sekuntia kiihtyvyydellä 13 000 x g. Tämä vaihe toistettiin vielä kaksi kertaa. Sen jälkeen, kun oli pesty kahdesti 400 fil:lla kylmää (4 °C) 70%:ista etanolia, cDNA eluoitiin lisäämällä pyöröpatruunaan 50 μΐ steriloitua tislattua vettä ja sentrifugoimalla kiihtyvyydellä 13 000 x g 20 sekunnin ajan. Homopolymeerihäntä lisättiin cDNA:n 31-pää- • · · *·*·’ hän käyttämällä terminaalista deoksinukleotidyylitransferaasia (TdT) ja dCTP: tä. Hännänmuodostusreaktio suoritettiin PCR:n kanssa yhteensopivassa puskurissa. Kymmenen mikrolitraa puh- •,11· distettua cDNA:ta yhdistettiin 7,5 μ1:η kanssa DEPC-käsiteltyä vettä, 2,5 μ1:η kanssa 10X reaktiopuskuria, 1,5 μ1:η kanssa 25 ; mM MgCl2-liuosta ja 2,5 μ1:η kanssa 2 mM dCTP-liuosta. Reaktio- seosta inkuboitiin 2-3 minuuttia 94 °C:ssa. Sen jälkeen, kun oli jäähdytetty 1 minuutti jäillä, lisättiin 1 μΐ TdT:tä (10 yksikköä/μΐ) . . Lopullinen koostumus oli siis-. 10 μΐ cDNA:ta seoksessa 20 mM Tris-HCl (pH 8,4), 50 mM KC1, 1,5 mM MgCl2, ,1’ 200 μΜ dCTP:tä, 0,4 yksikköä/μΐ TdT:tä. Reaktioseosta inkuboi- .* tiin 10 minuuttia 37 °C:ssa ja sen jälkeen 10 minuuttia 70 °C:ssa TdT:n inaktivoimiseksi .

' ‘ PCR:ään valmistettiin neljä eri reaktiota seuraavilla lopulli silla alukekonsentraatioilla (50 μΐ-.aa kohti): 31 116059

1. 400 nM ACP

2. 800 nM ACP

3. 360 nM UAP ja 40 nM ACP (UAP:ACP, 9:1) 4. 720 nM UAP ja 80 nM ACP (UAP:ACP, 9:1) Jäljellä olevien komponenttien lopulliset konsentraatiot (50 /j.l:aa kohti) olivat kaikissa neljässä reaktiossa samat: 5 μΐ kohdun polyA+-dC-hännillä varustettua cDNA:ta seoksessa 20 mM Tris-HCl (pH 8,4), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 400 nM CKCB2:ta ja 200 μΜ kutakin nukleotideista dATP, dCTP, dGTP ja dTTP. Komponentit, ACP- ja UAP- alukkeet mukaan lukien, sekoitettiin 45 μ1:η alkutilavuudessa ja kuumennettiin 94 °C:seen lämpötilan kierrättäjässä. Sitten kuhunkin reaktioon lisättiin 5 μΐ seosta 1,25 yksikköä AmpliTaq-DNA-polymeraasia (Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT) 20 mM Tris-HCl:ssä (pH 8,4) antamaan lopullinen 50 μ1:η tilavuus. 5'-cDNA-fragmentin monistamiseen käytettiin "Touchdown"-PCR- lämpötilasykliohjelmaa (kuten 3'-RACE-kloonaukseen kuvattiin).

PCR-amplifikaation jälkeen neljä reaktiota yhdistettiin ja DNA-tuotteet kokoeroteltiin elektroforeesilla 8%:isella poly-. . akryyliamidigeelillä. Noin 23 0 bp:n DNA-tuote irrotettiin ]] geelistä, puhdistettiin ja subkloonattiin "T-vektoriin", kuten *···' 450 bp:n 3 'RACE-fragmentille kuvattiin. Lisäanalyysiin vali- koitiin viisi kloonia: 5CB2, 5CB3, 5CB5, 5CB6 ja 5CB11.

DNA-sekvenssianalyysi tehtiin käyttämällä pakkausta Sequenase versio 2.0 (United States Biochemical, Cleveland, Ohio).

Kuva 8 esittää täydellisen komponentti B:n cDNA-sekvenssin, joka on koottu RACE-klooneista 5CB3 ja 3CB7, joissa osoitetaan restriktiokohdat.

Sekvenssin suoristamisella kloonien 5CB3, 5CB6, 5CB11 ja 3CB4, 3CB7, 3CB9 cDNA-sekvenssin osoitettiin sopivan täydellisesti komponentti B-.n eksonien kanssa (esimerkin 3 genominen klooni Λ : 4D) · t = i 32 116059

Vaikkakin keksintöä havainnollistettiin yksityiskohtaisin esimerkein, on selvää, että kuvattuihin toimenpiteisiin voidaan tehdä muunnoksia aina keksinnön hengessä ja piirissä pitäytyen.

KUVIEN SELITYKSET

Kuva 1. Vuokaavio komponentti B:n (puhdistus)prosessista virtsasta.

Kuva 2. Komponentti B:n genomisen transkriptioyksikön (sellainen komponentti B:n genominen DNA on esitetty SEKV. ID NO: 2:ssa) restriktiokartta. Nuolet osoittavat silmukointikohdat. Kuva 3. Komponentti B:n promoottorialueen sekvenssi (mainittu komponentti B:n promoottorialue on esitetty SEKV. ID NO: 2:ssa). Sitoutumiskohdat osoitetaan transkriptiofaktoreille AP-1, AP-2, Sp-1 ja E-boksit. TATA-boksi osoitetaan. Myös GRE osoitetaan.

Kuva 4. Komponentti B-geenin restriktiokartta. Johdettu mRNA esitetään genomisen geenin alla viivalla, boksialueet edustavat proteiinia koodaavaa sekvenssiä.

., Kuva 5. Klooni 4D:n insertin restriktiokartta.

Kuva 6. Plasmidin pBSCB4D restriktiokartta.

Kuva 7. Komponentti B:n DNA-sekvenssin RACE-kloonaukseen käytetty yleinen toimintatapa.

Kuva 8. Täydellinen komponentti B-.n cDNA-sekvenssi, jossa o* osoitetaan restriktiokohdat (mainittu komponentti B:n cDNA on ;esitetty SEKV. ID NO: 3:ssa).

33 116059

SEKVENSSILISTAUS

, (1) YLEISTÄ TIETOA: i I (i) HAKIJA: I (A) NIMI: APPLIED RESEARCH SYSTEMS ARS HOLDING N.V.

i (B) KATU: 6 JOHN GORSIRAWEG

(C) KAUPUNKI: CURACAO (E) MAA: ALANKOMAIDEN ANTILLIT

! (ii) KEKSINNÖN NIMITYS: Virtsasta peräisin oleva uus proteiini, joka kutsutaan komponentti B:ksi (iii) SEKVENSSIEN LUKUMÄÄRÄ: 26 (iv) OSOITE KIRJEENVAIHTOA VARTEN: (A) ASIAMIES: Oy Borenius & Co Ab

(B) POSTIOSOITE: Tallberginkatu 2 A

(C) KAUPUNKI: Helsinki (D) MAA: Suomi (E) POSTINUMERO: FIN-00180

(v) MUUT YHTEYSTIEDOT

(A) PUHELIN: 358-0-6866840 (B) TELEFAX: 358-0-68668444 (vi) PRIORITEETTIHAKEMUKSEN TIEDOT: (A) HAKEMUKSEN NUMERO: IT RM 92 A/919 (B) HAKEMISPÄIVÄ: 22.12.1992 (2) SEKV. ID NO: 1 INFORMAATIO:

>·*. (i) SEKVENSSIN PIIRTEET

··.* (A) PITUUS: 81 aminohappoa ; ;*; (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen •ii. (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (iii) HYPOTEETTINEN: Ei (iii) ANTI-SENSE: Ei > : (vi) ALKUPERÄINEN LÄHDE:

(A) ORGANISMI: VIRTSA

;· (xii) SEKVENSSIKUVAUS: SEKV. ID NO: 1: 116059 ! 34 ! Leu Lys Cys Tyr Thr Cys Lys Glu Pro Met Thr Ser Ala Ser Cys Arg ; 1 5 10 15

Thr lie Thr Arg Cys Lys Pro Glu Asp Thr Ala Cys Met Thr Thr Leu 20 25 30

Vai Thr Val Glu Ala Glu Tyr Pro Phe Asn Gin Ser Pro Vai Val Thr 35 40 '45

Arg Ser Cys Ser Ser Ser Cys Val Ala Thr Asp Pro Asp Ser lie Gly 50 55 60

Ala Ala His Leu He Phe Cys Cys Phe Arg Asp Leu Cys Asn Ser Glu 65 70 75 80

Leu (2) SEKV. ID NO: 2 INFORMAATIO:

(i) SEKVENSSIN PIIRTEET

(A) PITUUS: 2031 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) SÄIKEISYYS: yksi (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) (iii) HYPOTEETTINEN: Ei (iii) ANTI-SENSE: Ei (ix) PIIRRE:

(A) NIMI/AVAIN: CDS

\ (B) SIJAINTI: yhdistä(578. . 635, 1041.. 1160, 1687..1817) (ix) PIIRRE: (A) NIMI/AVAIN: eksoni (B) SIJAINTI: yhdistä(552. . 635, 1041..1160, 1687..2012) (ix) PIIRRE: (A) NIMI/AVAIN: matjpeptidi (B) SIJAINTI: yhdistä(1049. . 1159, 1686..1817) (ix) PIIRRE: ·;;; (A) NIMI/AVAIN: TATA_signaali (B) SIJAINTI: yhdistä(524. . 529, 1992..1998) *:· (ix) PIIRRE: (A) NIMI /AVAIN: GC_si gnaal i (B) SIJAINTI: 493..498 (D) MUU INFORMAATIO: /huomaa= "GC-rikas boksi esittää v ’· trans kripti ofaktori Sp-1: n s itomis kohtaa" :.’‘i (ix) PIIRRE: (A) NIMI/AVAIN: promoottori (B) SIJAINTI: 1. . 551 ! 1 116059 f 35 (ix) PIIRRE: (A) NIMI/AVAIN: misc_piirre (B) SIJAINTI: yhdistä(17. . 22, 24..29, 55..60, 66..71, 434..439) (D) MUU INFORMAATIO: /standardi_nimi= "E-boksi" /huomaa= "E-boksin paikka on kuvattu julkaisussa R. E. Kingston Current Opinion Cell. Biol. , I 1989,Voi. 1, 1081-1087 (Sitaatti 1) (ix) PIIRRE: (A) NIMI/AVAIN: mi s c__signaali (B) SIJAINTI: 329. . 342 (D) MUU INFORMAATIO: /funktio= "E-glukokortikoidia vastaava elementti" /standardi_nimi "GRE" (ix) PIIRRE: (A) NIMI/AVAIN: proteiinin_sitorninen (B) SIJAINTI: 469..475 (D) MUU INFORMAATIO:/standardinimi = "AP-1 kohta" /huomaa= "AP-1 on transkriptiofaktori AP-1:n sitomiskohta" (ix) PIIRRE: (A) NIMI/AVAIN: proteiinin_sitominen (B) SIJAINTI: 191..197 (D) MUU INFORMAATIO: /standardi_nimi= "AP-2 kohta" /huomaa= "AP-2 on trans kriptiofaktori AP-2: n ·'·' sitomiskohta" (ix) PIIRRE: (A) NIMI/AVAIN: misc__si$naali ;···. (B) SIJAINTI: yhdistä (578. . 634, 1040..1049 (D) MUU INFORMAATIO:/funktio= oletettu signaalipeptidi" » * * 'I!; (ix) PIIRRE: (A) NIMI/AVAIN: introni (B) SIJAINTI: yhdis tä (63 6. . 1040, 1161..1686, 2013.. 2031 ) :* (xi) SEKVENSSI KUVAUS: SEKV. ID NO: 2: ; " '; TGGCCCATGC TAC.CCTCACC TGACACCTGC TTCCTACCTC TGGTTTCTAC TTTGCAGGTG 60 TGTATCAGGT GTACACAGAC CAGGTAGAGG TCTGTGGAGA GGGCTGCAGG CCAGGCTGCA 120 GGGAAGGGGT GCCAGGCGGG GCTAGAGCAA CAAGGGCAGA GGCTACACTG AACCTGGGTC 180 : : : ytaagggtcc cccaggctgg ggctgggtgg cctatgtgaa ccccagaggc acagccagga 240 * catgggggct catcagaggg gcagtctgag ctcagcagga aaggccttct CTGTCAGAGC 300 TGTCCCAGGA ccactggaca TGGCTGAGGA ACAGTGAGTT CCCCAGTGTT GGAGGTGTGC 360 AAGCAGAGGC CTGGCCATCG TCCTCAGACA CAGCTCCCAG ATCCAGCTCC CTGCCCGTCT 420 36 116059 GCCATGTTCC TGCCAGCTGC CTCCCCACTG GGCCCTTTAC CACGTTCCTG ACXCACACGG 480 CCGGTTCTGC CACCGCCCAG AAGCCGGTGC CCAAGGGCCT GGCTATAAAT CCTTGATGTG 540 AGGCTGGCTA CCTCTCATCA CTTCTGAGCA CGGAGCA ATG GCC TCT CGC TGG GCT 595

Met Ala Ser Arg Trp Ala -22 -20 GTG CAG CTG CTG CTC GTG GCA GCC TGG AGC ATG GGC TGT G GTGAGTGGGC 645

Val Gin Leu Leu Leu Val Ala Ala Trp Ser Met Gly Cys -15 -10 -5 CGCAGGCTGG TGGGGACCTT GCCTCTGAGC TTGTCTGCCC ACCTCCTAGG GGGATGGGGC 705 TGTTGGGGGT GCTTTGTGGC TGAGAGCCTC CTTAGGCCTC CATGAGGCTC ACCCTCCTCA 765 TTCTCAGTGA GCCTCCTGGG TCCCAGAGCC CAGCTTCACC CTGGGACAGG GGTCACGGCT 825 CCACTCTGCA GGAAGGGAGA CTGAGGCTTG GTGGAGGGAT GCAGCATTCA AGTCTGTGGC 885 TCAGCTCAGT TAGAGAAAGC TGCCAGAGAG GCCCCTTGAA GGSCTGCCCG GGGCCTTGAA 945 AGATGTCAGC GAGACTCCTT CAGCCCCTGC CTCCTGGTTC CAGGATGAGV CCACCGAGGT 1005 CAGGTGATGA GGTTCTGCCC CCATCCCTCA CCCAG GT GAG GCC CTC AAG TGC 1057

Gly Glu Ala Leu Lys Cys -2 1 t··. TAC ACC TGC AAG GAG CCC ATG ACC AGT GCT TCC TGC AGG ACC ATT ACC 1105

Tyr Thr Cys Lys Glu Pro Met Thr Ser Ala Ser Cys Arg Thr lie Thr 5 10 15 • · cgc tgc aag cca gag gac aca gcc tgc atg acc acg ctg gtg acg gtg 1153 .*··, Arg Cys Lys Pro Glu Asp Thr Ala Cys Met Thr Thr Leu Val Thr Val 20 25 30 35 ; GAG GCA G GTGAGGCCAG GCCCCACGGC AGCCCTGGGT GCAGTGGAGT CAGGGCCACC 1210 • · Glu Ala I t > ;· TCCCCCAAGT GCGTCCCTCC TTTGCTGGTG CTCCTCCCGG CCCAAAAGGA AGCAGGTGGG 1270 ' / ATGGGCAGAA CAGGCTGCCA CACCTTGGCA GGGGTGCCTT CCACGAGGGT GGCACAGCCC 1330 ;· CCTCAGAGAC CCAGTCCTGG GGCACCAGGC GCTGGAGGTG GGTGGGGCTT AATGGCCGGG 1390 GTACCCTGGG GGGCTCAAAC CCCAGCTCTG ACACAGACCC ACTGGGTGGT GTTGCCACAG 1450 V · CCTCTGGGCT CGGGCTCCCA TCTCAGCGCA GGCACTTCAG AGGTCTGACA AGGCCTAATA 1510 '· · ATTCATGAAC AGGTCACAGT CAGAGGAGGG CTGGGCCCTG GGTGGCTTCA CAGATGTGGA 1570 CTATTGGGAA CAGGGATCAC AGGGAGGKTG AGGTCAGSCG ACGGCGGCTG GGAGCAGTGC 1630 37 116059 AGCAGCAGGC AGGCGCTGCA GGGGAGTGAG GGTTCTGACA CTGGCCCACC CTGCAG AG 1688

Glu TAC CCC TTC AAC CAG AGC CCC GTG GTG ACC CGC TCC TGC TCC AGC TCC 1736

Tyr Pro Phe Asn Gin Ser Pro Vai Val Thr Arg Ser Cys Ser Ser Ser 40 45 50 TGT GTG GCC ACC GAC CCC GAC AGC ATC GGG GCC GCC CAC CTG ATC TTC 1784

Cys Val Ala Thr Asp Pro Asp Ser lie Gly Ala Ala His Leu lie Phe 55 60 65 } 70 TGC TGC TTC CGA GAC CTC TGC AAC TCG GAA CTC TGAACCCAGG GCGGCAGGGC 1837

Cys Cys Phe Arg Asp Leu Cys Asn Ser Glu Leu 75 80 GGAAGGTGCT CCTCAGGCAC CTCCTCTCTG ACGGGGCCTG GCTCCACCTG TGATCACCTC 1897 CCCCTGCTTC CTGCTGCTGT GGCACAGCTC ACTCATGGGG TCTGAGGGGA GAGAAGCACA 1957 CCAGGGGCGC CCTCTGCCTT CCATACCCCA CGCTTATAAA ACATAACTAA GCCAAGAGTG 2017 GACATGACTT TTGT 2031 ·.·. (2) SEKV. ID NO: 3 INFORMAATIO:

(i) SEKVENSSIN PIIRTEET

(A) PITUUS: 540 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) SÄIKEISYYS: yksi ··;’ (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

!"· (ii) MOLEKYYLITYYPPI: mRNA: n vastaava CDNA

(iii) HYPOTEETTINEN: Ei (iii) ANTI-SENSE: Ei :· (ix) PIIRRE:

(A) NIMI/AVAIN: CDS

(B) SIJAINTI: 22. . 330 (ix) PIIRRE: (A) NIMI/AVAIN: mat_peptidi (B) SIJAINTI: 88. . 33 1 (ix) PIIRRE: (A) NIMI/AVAIN: TATA_signaali * ‘ (B) SIJAINTI: 505..511 38 116059 (xi) SEKVENSSI KUVAUS: SEKV. ID NO: 3: ATCACTTCTG AGCACGGAGC A ATG GCC TCT CGC TGG GCT GTG CAG CTG CTG 51

Met Ala Ser Arg Trp Ala Vai Gin Leu Leu -22 -20 -15 CTC GTG GCA GCC TGG AGC ATG GGC TGT GGT GAG GCC CTC AAG TGC TAC 99

Leu Vai Ala Ala Trp Ser Met Gly Cys Gly Glu Ala Leu Lys Cys Tyr -10 -5 1 ACC TGC AAG GAG CCC ATG ACC AGT GCT TCC TGC AGG ACC ATT ACC CGC 147

Thr Cys Lys Glu Pro Met Thr Ser Ala Ser Cys Arg Thr Ile Thr Arg 5 10 15 20 TGC AAG CCA GAG GAC ACA GCC TGC ATG ACC ACG CTG GTG ACG GTG GAG 195

Cys Lys Pro Glu Asp Thr Ala Cys Met Thr Thr Leu Vai Thr Vai Glu 25 30 35 GCA GAG TAC CCC TTC AAC CAG AGC CCC GTG GTG ACC CGC TCC TGC TCC 243

Ala Glu Tyr Pro Phe Asn Gin Ser Pro Vai Vai Thr Arg Ser Cys Ser 40 45 50 AGC TCC TGT GTG GCC ACC GAC CCC GAC AGC ATC GGG GCC GCC CAC CTG 291

Ser Ser Cys Vai Ala Thr Asp Pro Asp Ser Ile Gly Ala Ala His Leu 55 60 65 ATC TTC TGC TGC TTC CGA GAC CTC TGC AAC TCG GAA CTC TGAACCCAGG 340

Ile Phe Cys Cys Phe Arg Asp Leu Cys Asn Ser Glu Leu 70 75 80 GCGGCAGGGC GGAAGGTGCT CCTCAGGCAC CTCCTCTCTG ACGGGGCCTG GCTCCACCTG 400 ·...’ TGATCACCTC CCCCTGCTTC CTGCTGCTGT GGCACAGCTC ACTCATGGGG TCTGAGGGGA 460 GAGAAGCACA CCAGGGGCGC CCTCTGCCTT CCATACCCCA CGCTTATAAA ACATAACTAA 520 * « * ***. GCCAAAAAAA AAAAAAAAAA 540 : (2) SEKV. ID NO: 4 INFORMAATIO: ·. (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: *;’ * (A) PITUUS: 103 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen » * . (ii) MOLEKYYLI TYYPPI: proteiini (Xi) SEKVENSSI KUVAUS: SEKV. ID NO: 4: 39 116059

Met Ala Ser Arg Trp Ala Val Gin Leu Leu Leu Val Ala Ala Trp Ser -22 -20 -15 -10

Met Gly Cys Gly Glu Ala Leu Lys Cys Tyr Thr Cys Lys Glu Pro Met -5 1 5 10

Thr Ser Ala Ser Cys Arg Thr He Thr Arg Cys Lys Pro Glu Asp Thr 15 20 25

Ala Cys Met Thr Thr Leu Val Thr Val Glu Ala Glu Tyr Pro Phe Asn 30 35 40

Gin Ser Pro Val Val Thr Arg Ser Cys Ser Ser Ser Cys Val Ala Thr 45 50 55

Asp Pro Asp Ser He Gly Ala Ala His Leu He Phe Cys Cys Phe Arg 60 65 70

Asp Leu Cys Asn Ser Glu Leu 75 80 (2) SEKV. ID NO: 5 INFORMAATIO:

(i) SEKVENSSIN PIIRTEET

v.; (A) PITUUS: 20 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo *··;’ (C) SÄIKEISYYS: yksi ::: (D) TOPOLOGIA: lineaarinen • * ·

(ii) MOLEKYYLI TYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: Ei (iii) ANTI-SENSE: Ei (xi) SEKVENSSI KUVAUS:· SEKV. ID NO: 5: TGACTCACAC GGCCGGTTCT 20 (2) SEKV. ID NO: 6 INFORMAATIO:

/:* (i) SEKVENSSIN PIIRTEET

··, (A) PITUUS: 20 emäsparia ·..* (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) SÄIKEISYYS: yksi V · (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

*· ; (ii) MOLEKYYLI TYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: Ei (iii) ANTI-SENSE: Ei i 40 116059 (xi) SEKVENSSI KUVAUS: SEKV. ID NO: 6: 20

CAGCCATGTC CAGTGGTCCT

(2) SEKV. ID NO: 7 INFORMAATIO:

(i) SEKVENSSIN PIIRTEET

(A) PITUUS: 18 emäs pari a .

(B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) SÄIKEISYYS: yksi (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(lii) HYPOTEETTINEN: Ei (iii) ANTI-SENSE: Ei (xi) SEKVENSSI KUVAUS: SEKV. ID NO: 7: 18

ACCACAGCCC ATGCTCCA

(2) SEKV. ID NO: 8 INFORMAATIO:

(i) SEKVENSSIN PIIRTEET

(A) PITUUS: 19 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) SÄIKEISYYS: yksi (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: Ei (iii) ANTI-SENSE: Ei (xi) SEKVENSSI KUVAUS: SEKV. ID NO: 8: TGCAGGAAGC ACTGGTCAT 19 (2) SEKV. ID NO: 9 INFORMAATIO:

I! (i) SEKVENSSIN PIIRTEET

(A) PITUUS: 23 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) SÄIKEISYYS: yksi (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLI TYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: Ei (iii) ANTI-SENSE: Ei *···' (xi) SEKVENSSI KUVAUS: SEKV. ID NO: 9: 23

'. ’ TCTGGCTTGC AGCGGGTAAT GGT

; (2) SEKV. ID NO: 10 INFORMAATIO: 41 116059

(i) SEKVENSSIN PIIRTEET

(A) PITUUS: 18 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) SÄIKEISYYS: yksi (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLI TYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: Ei (iii) ANTI-SENSE: Ei (xi) SEKVENSSI KUVAUS: SEKV. ID NO: 10: ATGACCAGTG CTTCCTGC I8 (2) SEKV. ID NO: 11 INFORMAATIO:

(i) SEKVENSSIN PIIRTEET

(A) PITUUS: 20 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) SÄIKEISYYS: yksi (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(lii) HYPOTEETTINEN: Ei (iii) ANTI-SENSE: Ei (xi) SEKVENSSI KUVAUS: SEKV. ID NO: 11: ATCCCACCTG CTGCCTTTTG 20 (2) SEKV. ID NO: 12 INFORMAATIO:

(i) SEKVENSSIN PIIRTEET

,.· (A) PITUUS: 17 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) SÄIKEISYYS: yksi (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

·. (iii) HYPOTEETTINEN: Ei (iii) ANTI-SENSE: Ei (xi) SEKVENSSI KUVAUS: SEKV. ID NO: 12: ’ 17

. ‘ , CGGCGGCTGG GAGCAGT

(2) SEKV. ID NO: 13 INFORMAATIO:

: (i) SEKVENSSIN PIIRTEET

(A) PITUUS: 26 emäsparia ; (B) TYYPPI: nukleiinihappo ; ’ (C) SÄIKEISYYS: yksi / ; (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLI TYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: Ei 42 116059 (iii) ANTI-SENSE: Ei (xi) SEKVENSSI KUVAUS: SEKV. ID NO: 13: ATGGAATTCT AYCCATTYAA YCARTC 26 (2) SEKV. ID NO: 14 INFORMAATIO:

(i) SEKVENSSIN PIIRTEET

(A) PITUUS: 26 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) SÄIKEISYYS: yksi (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: Ei (iii) ANTI-SENSE: Ei (xi) SEKVENSSI KUVAUS: SEKV. ID NO: 14: ATGGAATTCT AYCCATTYAA YCARAG 26 (2) SEKV. ID NO: 15 INFORMAATIO:

(i) SEKVENSSIN PIIRTEET

(A) PITUUS: 29 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) SÄIKEISYYS: yksi (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

= (iii) HYPOTEETTINEN: Ei (iii) ANTI-SENSE: Ei (xi) SEKVENSSI KUVAUS: SEKV. ID NO: 15: \ GTAGAATTCG CGCCAATGGA RTCNGGRTC 29 (2) SEKV. ID NO: 16 INFORMAATIO:

(i) SEKVENSSIN PIIRTEET

(A) PITUUS: 29 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo ( ‘ (C) SÄIKEISYYS: yksi ,“ ( (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: Ei . (iii) ANTI-SENSE: Ei , ‘ , (xi) SEKVENSSI KUVAUS: SEKV. ID NO: 16: : GTAGAATTCG CGCCAATGCT RTCNGGRTC 29 (2) SEKV. ID NO: 17 INFORMAATIO: 43 116059

(i) SEKVENSSIN PIIRTEET

(A) PITUUS: 19 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) SÄIKEISYYS: yksi (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: Ei (iii) ANTI-SENSE: Ei (xi) SEKVENSSI KUVAUS: SEKV. ID NO: 17: AGTACCCCTT CAACCAGAG 19 (2) SEKV. ID NO: 18 INFORMAATIO:

(i) SEKVENSSIN PIIRTEET

(A) PITUUS: 20 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) SÄIKEISYYS: yksi (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: Ei (iii) ANTI-SENSE: Ei (xi) SEKVENSSI KUVAUS: SEKV. ID NO: 18: 20

CAGACACCAT GAGTGAGCTG

(2) SEKV. ID NO: 19 INFORMAATIO:

V: (i) SEKVENSSIN PIIRTEET

··, (A) PITUUS: 19 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) SÄIKEISYYS: yksi ;; (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLI TYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: Ei (iii) ANTI-SENSE: Ei (xi) SEKVENSSI KUVAUS: SEKV. ID NO: 19: .19

GACACCTCCT CTGTGACGG

; (2) SEKV. ID NO: 20 INFORMAATIO:

(i) SEKVENSSIN PIIRTEET

(A) PITUUS: 21 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo , . (C) SÄIKEISYYS: yksi . : (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 44 116059

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(lii) HYPOTEETTINEN: Ei (iii) ANTI-SENSE: Ei (xi) SEKVENSSI KUVAUS: SEKV. ID NO: 20: CCAGTTCTGT AGGGTGTCAG T 21 (2) SEKV. ID NO: 21 INFORMAATIO:

(i) SEKVENSSIN PIIRTEET

(A) PITUUS: 23 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) SÄIKEISYYS: yksi (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: Ei (iii) ANTI-SENSE: Ei (xi) SEKVENSSI KUVAUS: SEKV. ID NO: 21: TCAAGTGCTA CACCTGCAAG GAG 23 (2) SEKV. ID NO: 22 INFORMAATIO:

(i) SEKVENSSIN PIIRTEET

(A) PITUUS: 16 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) SÄIKEISYYS: yksi (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

Y: (ii) MOLEKYYLI TYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: Ei (iii) ANTI-SENSE: Ei (xi) SEKVENSSI KUVAUS: SEKV. ID NO: 22: t CGTCAGAGAG GAGGTG _ 16 , (2) SEKV. ID NO: 23 INFORMAATIO:

(i) SEKVENSSIN PIIRTEET

(A) PITUUS: 18 emäsparia . . (B) TYYPPI: nukleiinihappo Y'* (C) SÄIKEISYYS: yksi (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

: (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: Ei : (lii) ANTI-SENSE: Ei ·, i (xi) SEKVENSSI KUVAUS: SEKV. ID NO: 23: ACCGTCACCA GCGTGGTC 18 45 116059 (2) SEKV. ID NO: 24 INFORMAATIO:

(i) SEKVENSSIN PIIRTEET

(A) PITUUS: 37 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) SÄIKEISYYS: yksi (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

: (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: Ei (iii) ANTI-SENSE: Ei | (xi) SEKVENSSI KUVAUS: SEKV. ID NO: 24: GGCCACGCGT CGACTAGTAC ttTTTTTTTT TTTTTTT 37 (2) SEKV. ID NO: 2 5 INFORMAATIO:

(i) SEKVENSSIN PIIRTEET

(A) PITUUS: 48 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) SÄIKEISYYS: yksi (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: Ei (iii) ANTI-SENSE: Ei (ix) PIIRRE: (A) NIMI/AVAIN: modifioitu_emäs (B) SIJAINTI: yhdis tä ( 3 6. . 37, 41.. 42, 46..47) ;Y: (xi) SEKVENSSI KUVAUS: SEKV. ID NO: 2 5: CTACTACTAC taggccacgc gtcgactagt ACGGGNNGGG NNGGGNNG 48 :· : (2) SEKV. ID NO: 26 INFORMAATIO:

(i) SEKVENSSIN PIIRTEET

’ (A) PITUUS: 32 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) SÄIKEISYYS: yksi (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 1 32

MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(iii) HYPOTEETTINEN: Ei (iii) ANTI-SENSE: Ei (xi) SEKVENSSI KUVAUS: SEKV. ID NO: 2 6:

CTACTACTAC TAGGCCACGC GTCGACTAGT AC

Claims (9)

116059

1. Analogiamenetelmä, lääkeaineena käytettävän, peptidisekvenssin SEKV. ID NO:l sisältävän, B-komponentin aktiivisuutta omaavan, rekombinanttiproteiinin, sen suolojen, funktionaalisten johdannaisten, kehossa B-komponentiksi muuttuvien esiasteiden, aktiivisten fraktioiden, tai näiden seosten valmistamiseksi, tunnettu siitä, että menetelmässä viljellään ilmentymisvektorilla transformoitu isäntäsolu, joka sisältää DNA-molekyylin, joka on eristetty ja puhdistettu nukleotidisekvenssi SEKV. ID NO:2, nukleotidisekvenssin SEKV. ID NO:3 sisältävä cDNA, näiden nukleotidisekvenssien aktiivinen mutantti tai aktiivinen fraktio tai näiden nukleotidisekvenssien kanssa 5xSSC, 0,02% SDS:a, 0,1% lauroyylisarkosiinia ja 0,5% blocking-reagenssia sisältävässä hybridisaatioliucksessa 42°C:ssa tai 50°C:ssa ja 3xSSC, 0,1% SDS:a ja 0, 9, 18, 27 tai 36% ureaa sisältävässä viimeisessä pesuliuoksessa 42°C:ssa hybrid iso ituva DNA-sekvenssi, joka DNA-molekyyli koodaa aminohapposekvenssin SEKV. ID NO:l sisältävän peptidin tai sen aktiivisen mutantin, jolla on sama aktiivisuus kuin komponentti B:llä.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mutanttipeptidin aminohapposekvenssin yksi tai useampi aminohappo on eliminoitu tai substituoitu muilla aminohapoilla tai siihen on lisätty yksi tai useampi aminohappo.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mutantti on ' * · ’ fuusioproteiini, joka sisältää immunoglobuliinin. • · · « · *· ·" 4. Jonkin patenttivaatimuksen 1, 2 tai 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että •. · rekombinanttiproteiini otetaan talteen transformoidun isäntäsolun solusta tai ' . * viljelyalustasta.

5. DNA-molekyyli, tunnettu siitä, että se on eristettyjä puhdistettu nukleotidi- sekvenssi . · SEKV. ID NO:2 tai cDNA, jonka sekvenssi on SEKV. ID NO:3 tai näiden nukleotidisekvenssien aktiivinen mutantti tai aktiivinen fraktio tai näiden nukleotidisekvenssien kanssa 5xSSC, 0,02 % SDS:a, 0,1 % lauroyylisarkosiinia ja 0,5% blocking-reagenssia sisältävässä hybridisaatioliuoksessa 42°C:ssa tai 50°C:ssa ja 3xSSC, » 0,1% SDS:a ja 0, 9, 18, 27 tai 36% ureaa sisältävässä viimeisessä pesuliuoksessa 47 1 1 6059 42°C:ssa hybridisoituva DNA-sekvenssi, joka koodaa aminohapposekvenssin SEKV. ID NO:l sisältävän peptidin tai sen aktiivisen mutantin, jolla on sama aktiivisuus kuin komponentti B:llä ja jossa yksi tai useampi aminohappo on eliminoitu tai substituoitu muilla aminohapoilla tai yksi tai useampi aminohappo on lisätty tähän sekvenssiin.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen DNA-molekyyli, tunnettu siitä, että se on eristettyjä puhdistettu nukleotidisekvenssi SEKV. ID NO:2.

7. Patenttivaatimuksen 5 mukainen DNA-molekyyli, tunnettu siitä, että se on cDNA, jonka sekvenssi on SEKV. ID NO:3.

8. Ilmentymisvektori, tunnettu siitä, että se sisältää jonkin patenttivaatimuksen 5, 6 tai 7 mukaisen DNA-molekyylin.

9. Isäntäsolu, tunnettu siitä, että se on transformoitu patenttivaatimuksen 8 mukaisella ilmentymisvektorilla, joka sisältää patenttivaatimuksen 5 mukaisen DNA-molekyylin.