JPH08509359A

JPH08509359A - 成分ｂと命名された新規な蛋白質

Info

Publication number: JPH08509359A
Application number: JP6514813A
Authority: JP
Inventors: シルナ，アントニオ
Original assignee: アプライド・リサーチ・システムズ・エイアールエス・ホールディング・ナムローゼ・フェンノートシャープ
Priority date: 1992-12-22
Filing date: 1993-12-21
Publication date: 1996-10-08
Anticipated expiration: 2015-03-27
Also published as: UA46702C2; EP0675956A1; KR950704486A; FI953091A0; NO952494L; ITRM920919A0; ATE236976T1; ITRM920919A1; NO315800B1; IL108149A; DK0675956T3; ES2193152T3; FI116059B; KR100193107B1; EP0675956B1; IL108149A0; RU2177480C2; AU690093B2; WO1994014959A1; NO952494D0

Abstract

(57)【要約】尿から、抽出、ならびにイオン交換クロマトグラフィーおよび高分解能クロマトグラフィーによる精製によって得られる新規な蛋白質が記載される。

Description

【発明の詳細な説明】成分Ｂと命名された新規な蛋白質本発明は、成分Ｂと命名された新規な蛋白質に関するものである。特に本発明は、尿から得られる新規な蛋白質、尿からのそれの調製、この新規な蛋白質をコードするゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを用いる組換えＤＮＡ技術によるそれの製造、ならびにそれを含有する薬剤組成物、および療法におけるそれの使用に関するものである。尿誘導体の抽出および精製過程で新規な蛋白質が単離された。この蛋白質はポリペプチドの性質および比較的低い分子量を示す。人尿を吸着材、たとえばカオリンで処理し、次いで濾過、イオン交換クロマトグラフィー、および高分解能クロマトグラフィーを、好ましくは後記の方法に従って行うと、凍結乾燥後に、ある化合物が高圧逆相液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ−ＲＰ）において単一ピークとして移動し、ポリアクリルアミドゲル上でドデシル硫酸ナトリウムの存在下に還元性条件下での電気泳動（ＳＤＳ−Ｐａｇｅ）により分析した場合に約９ＫＤａの分子量をもつ、非晶質白色粉末として得られる。この蛋白質は成分Ｂと命名され、以下このように呼ばれる。成分Ｂは、より詳細には配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：１として提示されるアミノ酸配列により表される。従って本発明は、尿の透析濃縮物から吸着剤で処理して、化合物自体の粗製両分を単離し、次いでそれを後記のようにイオン交換クロマトグラフィーおよび高分解能クロマトグラフィーにより精製することにより得られる、成分Ｂと命名される新規な蛋白質を得るものである。好ましくは本発明による蛋白質は、工業的生産に有用な多量で得られるという理由で人尿から抽出される。本発明は特に配列番号：１からなるポリペプチド、その塩類、機能性誘導体、前駆物質および活性画分、ならびにその活性突然変異体、すなわち成分Ｂと同じ活性をもつポリペプチドまたは蛋白質を得るためにその構造の１もしくは２以上のアミノ酸が排除され、もしくは他のアミノ酸で置換され、または１もしくは２以上のアミノ酸がその配列に付加された他の蛋白質またはポリペプチドに関するものであり、また対応する融合蛋白質、すなわち他の蛋白質と融合し、かつ体液中でより長く持続する半減期をもつ成分Ｂまたはその突然変異体からなるポリペプチドをも含む。従って成分Ｂは他の蛋白質、たとえば免疫グロブリンと融合する可能性がある。本明細書において用いる定義“塩類”は、既知の方法で得られる、本化合物のカルボキシル基の塩類およびアミノ官能基の塩類の双方を意味する。カルボキシル基の塩類は、無機塩類、たとえばナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、および有機塩基との塩類、たとえばアミン、たとえばトリエタノールアミン、アルギニンまたはリシンにより形成されるものを含む。アミノ基の塩類は、たとえば無機酸、たとえば塩酸との塩類、および有機酸、たとえば酢酸との塩類を含む。本明細書において用いる定義“官能性誘導体”は、アミノ酸部分の側鎖（ｌａｔｅｒａｌｃｈａｉｎ）上、または末端Ｎ−もしくはＣ−基上に存在する官能基から既知の方法に従って製造することができ、本発明においてはそれらが薬剤学的に受容しうる場合、すなわちそれらが蛋白質活性を破壊せず、またはそれらを含有する薬剤組成物に毒性を付与しない場合に構成される誘導体を意味する。それらの誘導体には、たとえばカルボキシル基のエステルもしくは脂肪族アミド、および遊離アミノ基のＮ−アシル誘導体、または遊離ヒドロキシル基のＯ−アシル誘導体であって、アシル基、たとえばアルカノイル基またはアロイル基により形成されるものが含まれる。 “前駆物質”は、ヒトまたは動物の体内で成分Bに変換する化合物である。この蛋白質の“活性画分”としては本発明は、本化合物自体のポリペプチド鎖、単独、またはそれに結合した関連の分子もしくは残基、たとえば糖もしくはリン酸の残基との組み合わせ、またはこのポリペプチド分子の凝集体の、任意のフラグメントまたは前駆物質を意味する（それらのフラグメントまたは前駆物質が薬剤として成分Ｂと同じ活性を示す場合）。本発明はポリペプチドおよび前記誘導体の混合物をも意味する。本発明の第２観点は、成分Ｂの製造方法であって、尿の透析濃縮物から吸着剤による処理によって蛋白質の粗製画分を単離し、それをイオン交換クロマトグラフィーおよび高分解能クロマトグラフィーによって精製することを含む方法に関するものである。好ましくは成分Ｂは図１に示した、下記工程を含む方法により製造される：ａ）尿を酸性ｐＨでカオリンに吸着させ、そしてアンモニアで抽出し、ｂ）画分（ａ）をバイオ・レックス（ＢｉｏＲｅｘ）７０樹脂上でアンモニアにより溶離し、ｃ）画分（ｂ）をＤＥＡＥセファロース樹脂上で酢酸緩衝液により溶離し、ｄ）画分（ｃ）をＣＭセファロース樹脂上で酢酸緩衝液により溶離、ｅ）画分（ｄ）をＨＰＬＣＣ１８樹脂上で酢酸緩衝液およびアセトニトリルの混合物により溶離し、ｆ）画分（ｅ）をＤＥ−５２樹脂上で酢酸緩衝液により溶離し、ｇ）画分（ｆ）をＤ−ツェフィル（Ｄ−Ｚｈｅｐｈｙｒ）樹脂上で酢酸緩衝液により溶離し、ｈ）画分（ｇ）をＨＰＬＣＣ１８樹脂上でトリフルオロ酢酸水溶液およびアセトニトリルの混合物により溶離し、ｉ）画分（ｈ）をＤ−ツェフィル樹脂上で酢酸緩衝液により溶離する。また本発明は、本発明によるポリペプチド、その活性突然変異体または融合蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含む組換えＤＮＡ分子、それを含む発現ベクター、それらのベクターで形質転換された宿主細胞、および適宜な培地におけるそれらの形質転換細胞の培養により上記ポリペプチド、その活性突然変異体または融合蛋白質を製造する方法に関するものである。“組換えＤＮＡ分子”という定義は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡおよびそれらの組み合わせを包含する。特に本発明は、それぞれ配列番号：２および配列番号：３に示したヌクレオチド配列に関するものである。配列番号：２は成分ＢをコードするゲノムＤＮＡ配列を提示する；図２は成分Ｂ転写単位の制限地図を提示する；配列番号：３は成分ＢをコードするｃＤＮＡ配列を提示する；図８は成分Ｂの完全なｃＤＮＡ配列を示し、それには制限部位が指示される；成分Ｂのクローニングは種々の方法で実施しうる。これらの方法のうちの一つによれば、それらの配列が成分Ｂまたはそのフラグメントの配列に由来するオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド混合物が製造され、これらは成分ＢをコードするｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡをクローニングするためのプローブとして用いられる。配列番号：４は配列番号：２に提示したゲノムＤＮＡにより、および配列番号：３に提示したｃＤＮＡの両方によりコードされるアミノ酸配列を提示する。また本発明は、成分ＢまたはそのフラグメントをコードするＤＮＡ配列とハイブリダイズする組換えＤＮＡ分子に関するものである。その遺伝子は天然のイントロンを含み、または含まず、たとえば既知の方法で適宜な細胞から抽出し、そして精製することにより得られる。ＤＮＡ、たとえばヒトゲノムＤＮＡの適宜な調製物を適宜な方法で、好ましくは制限酵素で切断し、こうして得られたフラグメントをＤＮＡライブラリーの形成のために適宜な組換えベクターに導入する。それらのベクターを、本発明による成分Ｂをコードする配列の同定のために合成オリゴヌクレオチドプローブにより選択することができる。特に本発明によれば、成分ＢのゲノムＤＮＡが単離され、クローン化された。他方、成分Ｂを発現する細胞から対応するｍＲＮＡを既知の方法で単離し、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を製造するために用いることができる。このｃＤＮＡを二重らせんに変換したのち適宜なベクターに導入し、これを次いで適宜な宿主細胞の形質転換のために使用しうる。次いで標的配列をコードするｃＤＮＡを得るために、得られた培養物を適宜なプローブで選択する。目的とするクローンが単離されると、ｃＤＮＡを本質的にゲノムＤＮＡの場合と同じ方法で取り扱うことができる。ｃＤＮＡはイントロンを含まない。遺伝子コードの縮重のため、特定のアミノ酸をコードするのに種々のコドンが用いられ、従って１種類または２種類以上のオリゴヌクレオチドが産生され、それらがそれぞれ成分Ｂのフラグメントをコードする可能性がある。しかしこのプールの１員子のみが遺伝子のものに一致するヌクレオチド配列を有する。プールの中にそれが存在し、かつそれがプールの他の員子の存在下でも上記ＤＮＡとハイブリダイズしうる場合、分画されていない一群のオリゴヌクレオチドを単一オリゴヌクレオチドの場合と同様に、標的ペプチドをコードする遺伝子のクローニングに使用しうる。あるいは理論的に成分Ｂの遺伝子フラグメントをコードしうる可能性が最も高い配列を含む単一オリゴヌクレオチド（“コドンの使用に関するきまり”，ラス（ＬａｔｈＲ．）ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８３：１− １２（１９８５）に記載されたものによる）によれば、成分Ｂまたはそのフラグメントをコードする相補的ＤＮＡを同定することができる。核酸のハイブリダイゼーション法は既知であり、たとえばマニアチス（ＭａｎｉａｔｉｓＴ.）ら，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：Ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ．コールド・スプリング・ハーバー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク（１９８２）、およびヘイムズ（ＨａｙｍｅｓＢ．Ｔ.）ら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａｐｒａｃｔｉｃａｌａｐｐｒｏａｃｈ、ＩＲＬプレス、英国オックスフォード（１９８５）に記載されている。上記のプローブまたはプローブ群を用いるハイブリダイゼーションにより、ゲノムまたはｃＤＮＡライブラリー中においてこのようなハイブリダイゼーションが可能なＤＮＡ配列を同定することができ、それらが本発明によるポリペプチド（すなわち成分Ｂ）をコードすることをのちに分析により確認する。このような相補的配列を含むオリゴヌクレオチドを合成し、本発明によるポリペプチド、すなわち成分Ｂの遺伝子を同定および単離するためのプローブとして用いることができる（マニアチス（ＭａｎｉａｔｉｓＴ．）ら，前掲）。上記の方法で成分Ｂに対して特異的な適宜なオリゴヌクレオチドが選択されると、それを合成し、目的遺伝子を発現しうる細胞に由来するＤＮＡまたは好ましくはｃＤＮＡとハイブリダイズさせることができる；好ましくは、たとえば目的遺伝子を高水準で産生する細胞からＲＮＡを抽出し、そしてこのＲＮＡを逆転写酵素により対応するｃＤＮＡに変換することによってｃＤＮＡ源に目的配列を富化したのち。あるいは成分Ｂに対して特異的な適切なオリゴヌクレオチドを合成し、ＲＡＣＥ−ＰＣＲによる成分ＢｃＤＮＡフラグメントの増幅のためのプライマーとして用いることができる（イニス（Ｍ．Ａ．Ｉｎｎｉｓ）ら、ＰＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌｓ，ＡＧｕｉｄｅｔｏＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、アカデミック・プレス、１９９０）。特に本発明によれば、まず成分ＢのｍＲＮＡに利用しうる最良の供給源を同定するために、種々のヒトおよび細胞組織のスクリーニングを実施した。脳、腎臓、肝臓、肺臓、心臓、膵臓、胎盤、脾臓、睾丸、胸腺および子宮からのヒト組織、ならびに類上皮癌、前骨髄球性白血病、乳腺癌、バーキットリンパ腫および骨髄腫の細胞系をこの目的でスクリーニングした。スクリーニングは高感度のアッセイ法“逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）”を用いて実施された。ヒト子宮組織が最良のｍＲＮＡ源を与えた。成分ＢのｃＤＮＡクローンはその組織から、“３′側および５′側ｃＤＮＡ末端の迅速増幅”と呼ばれる増幅法を用いて得られた。上記方法で得た、成分ＢをコードするＤＮＡ分子を、既知の方法で構築した発現ベクターに導入した（マニアチス（ＭａｎｉａｔｉｓＴ．）ら，前掲）。たとえば合成ＤＮＡアダプターを使用することよりなる方法、または“平滑末端配列（ｂｌｕｎｔ−ｅｎｄｅｄ）”を結合させる方法により、二重らせんｃＤＮＡをプラスミドベクターにリゲートする。標的蛋白質の発現のためには発現ベクターは、目的蛋白質をコードするＤＮＡに遺伝子発現および蛋白質産生が可能な様式で結合する、転写および翻訳を調節する情報を含む特異的ヌクレオチド配列をも含むべきである。第１に遺伝子が転写可能であるためには、ＲＮＡポリメラーゼが認識することができ、かつこれにポリメラーゼが結合し、こうして転写過程を開始しうるプロモーターが前方に存在しなければならない。原核細胞または真核細胞において使用した場合に異なる種々の効率で作動する多数のプロモーター（強いまたは弱いプロモーター）が知られている。本発明に使用しうるプロモーターは構成性であってもよく、たとえばラムダバクテリアファージのプロモーターｉｎｔ、ｐＢＲ３２２のβ−ラクタマーゼの遺伝子のプロモーターＢｌａ、およびｐＰＲ３２５のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼの遺伝子のプロモーターＣＡＴなどであり、または誘導性であってもよく、たとえば原核細胞のプロモーター、たとえばラムダバクテリアファージの左右の主プロモーター（ＰｌおよびＰｒ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のプロモーターｔｒｐ、ｒｅｃＡ、ｌａｃＺ、ｌａｃｌ、ｏｍｐＦおよびｇａｌ、またはハイブリッドプロモーターｔｒｐ−ｌａｃなどである（グリック（ＧｌｉｋＢ．Ｒ．）Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１：２７７−２８２（１９８７））。原核細胞において大量のｍＲＮＡを産生して高い水準の遺伝子発現を与える強力なプロモーターと共に、ｍＲＮＡが効率的に翻訳されるのを保証するためにリボソームに対する結合部位を用いることも必要である。たとえば出発コドンから適宜な位置に配置されたシャイン−ダルガーノ（ＳＤ）配列が挙げられる。真核宿主細胞については、転写および翻訳を調節する種々の配列を宿主の性質に従って使用しうる。これらはウイルス源、たとえばアデノウイルス、またはパピローマウイルス、サルウイルスなど、高水準の発現を示す特異的遺伝子に調節シグナルが結合したものから得られる。使用しうる例は、ヘルペスウイルスのプロモーターＴＫ、ＳＶ４０のプロモーター、酵母の遺伝子ｇａ１４のプロモーターなどである。遺伝子の発現をそれに応じて変調しうる様式で抑制または活性化を生じるために、転写開始を調節するシグナルを適切に選ぶことができる。本発明の成分Ｂをコードするヌクレオチド配列、ならびに転写および翻訳を調節するシグナルを含むＤＮＡ分子が、標的遺伝子の配列を宿主細胞の染色体内に組み込むことができるベクターに導入される。発現ベクターを含む宿主細胞の選択を可能にする１または２以上のマーカーをも導入することにより、導入されたＤＮＡをそれらの染色体内に保有する細胞を選択することができる。マーカーは細胞に、たとえば抗生物質耐性または重金属（たとえば銅）耐性を付与しうるものである。選択遺伝子は、発現しなければならないＤＮＡ配列に直接に結合させるか、または同時トランスフェクションにより細胞自体に導入しうる。より高度の遺伝子の発現には他の要素も必要な場合がある。これらの要素には、たとえば転写エンハンサーならびに終止シグナルおよびイントロンが含まれる。これらの要素を含む発現ベクターは、オカヤマ（ＯｋａｙａｍａＨ．），Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２８０（１９８３）に記載のものからなる。特定のプラスミドまたはウイルスベクターを選択するために考慮すべき因子には下記のものが含まれる：そのベクターを含む細胞を、それを含まない細胞から容易に区別しうる検出成分；特定の宿主において求めるベクターのコピー数、および異なる宿主細胞間でそのベクターを転移させうる可能性の有無。好ましい原核細胞ベクターは、たとえば下記のプラスミドを含む：大腸菌において複製しうるプラスミド、たとえばｐＢＲ３２２、ＣｏｌＥｌ、ｐＳＣ１０１、ｐＡＣＹＣ１８４など（マニアチス（ＭａｎｉａｔｉｓＴ．）ら，前掲）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）プラスミド、たとえばｐＣ１９４、ｐＣ２２１、ｐＴ１２７など（グリザン（ＧｒｙｃｚａｎＴ．Ｍ．），ＴｈｅＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙｏｆｔｈｅＢａｃｉｌｌｉ）、アカデミック・プレス、ニューヨーク、３０７−３２９（１９８２）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｏｔｏｍｙｃｅｓ）プラスミド、たとえばｐＩＪ１０１（ケンダル（ＫｅｎｄａlｌＫ．Ｊ．）ら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：４１７７−４１８３）、およびシュードモナス（Ｐｓｅｄｏｍｏｎａｓ）プラスミド（ジョン（ＪｏｈｎＪ．Ｆ．）ら，Ｒｅｖ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．８：６９３−７０４（１９８６）（イザキ（ＩｚａｋｉＫ．），Ｊｐｎ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．３３：７２９−７４２）。好ましい真核細胞ベクターは、たとえばＢＰＶ、ＳＶ４０、バキュロウイルスなど、またはそれらの誘導体からなる。それらのベクターは当技術分野で知られている（ボステイン（ＢｏｓｔｅｉｎＤ．）ら，ＭｉａｍｉＷｉｎｔＳｙｍｐ．１９：２６５−２７４）（ブローチ（ＢｒｏａｃｈＪ．Ｒ．），ＴｈｅＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙｏｆｔｈｅＹｅａｓｔＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ：ＬｉｆｅＣｙｃｌｅａｎｄＩｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク、４５５−４７０（１９８１）（ブローチ（ＢｒｏａｃｈＪ．Ｒ．），Ｃｅｌｌ２８：２０３−２０４（１９８２）（ボロン（ＢｏｌｌｏｎＤ．Ｐ．）ら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．１０：３９−４８（１９８０）（マニアチス（ＭａｎｉａｔｉｓＴ．）ら，ＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ：ＡＣｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅＴｒｅａｔｉｓｅＶｏｌ．３：ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、アカデミック・プレス、ニューヨーク、５６３−６０８（１９８０）。こうして調製された発現ベクターを適宜な方法、たとえば形質転換、トランスフェクション、リポフェクション（ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ）、接合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リン酸カルシウムによる沈殿法、直接マイクロインジェクシヨンなどで、適宜な宿主細胞に導入する。本発明に使用しうる宿主細胞は原核細胞または真核細胞のいずれであってもよい。好ましい原核細胞には大腸菌、バチルス、ストレプトミセス、シュードモナス、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）などが含まれる。特に好ましいものは大腸菌、たとえば大腸菌Ｋ１２の２９４株（ＡＴＣＣ３１４４４６）、大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ３１５３７）、大腸菌Ｗ３１１０（Ｆ．ｌａｍｂｄａ，ＡＴＣＣ２７３２５）である。好ましい真核宿主細胞は、哺乳動物細胞、たとえばヒト、サル、マウスまたはハムスター（チャイニーズ・ハムスター卵巣、ＣＨＯ）細胞である。それらは蛋白質分子の翻訳後修飾、たとえば適正な折り畳みおよび適切な位置におけるグリコシル化を保証するからである。酵母細胞も本発明に使用しうる。酵母において強力なプロモーターの配列および高いコピー数のプラスミドを使用し、目的蛋白質を産生しうる種々の組換えＤＮＡ技術がある。ベクターを宿主細胞に導入したのち、そのベクターを含有する細胞の選択的増殖が可能な培地中でこれらを培養する。クローン化ＤＮＡ配列を発現させることにより、成分Ｂ、その突然変異体またはフラグメントを産生させることができる。こうして発現された蛋白質を、抽出、沈殿法、クロマトグラフィー、電気泳動、もしくはこれに類する方法、またはカラムゲルに固定化した抗一成分Ｂ抗体を用いるアフィニティークロマトグラフィーを含めた常法により単離もしくは精製する。成分Ｂはトランスジェニック動物において乳汁分泌性蛋白質として産生させることもできる。本発明の他の観点は、成分Ｂ、その塩類、官能性誘導体、前駆物質または活性画分を薬剤として使用することである。特に成分Ｂは抗炎症性、抗凝血性および抗腫瘍性を示した。さらに成分ＢはＴＧＦ−アルファの水準変化に関連した病理的状態、たとえば行動およびホルモン障害の療法、脈管形成などに有用である。事実、成分ＢはＴＧＦ−アルファがそれの受容体に結合するのを阻害することが示され、アフィニティー定数はＡ４３１細胞膜より得たその受容体からのＩ¹² ⁵ −ＴＧＦ−アルファの置換により測定してＫ_i＝０．７７×１０¹⁰Ｍである。療法上有効な量の成分Ｂを薬剤学的に受容しうる賦形剤または溶媒と共に含有する薬剤組成物も本発明の目的である。それらの組成物は経口、直腸、鼻、および特に非経口投与用として配合することができる。成分Ｂの局所使用も本発明に包含される。本発明による配合物には、遅延形製剤、たとえばリポソーム、または乳酸およびグリコール酸のコポリマーのマイクロカプセルを基礎とする皮下埋込み剤も包含される。本発明の他の観点は以下の詳細な記述からみて自明であろう。実施例１−人尿からの成分Ｂの調製法人尿からの成分Ｂの調製および精製を図１にまとめる。ａ）工程１出発原料は人尿にＨＣｌを添加してｐＨ３．０となしたものである。沈殿のデカンテーション後に、尿にカオリンを添加する（１０ｇ／１（原料尿））。この懸濁液を１６時間放置し、次いで遠心分離する。上清を分離し、アンモニア、２Ｍ、ｐＨ１１．０、でカオリンを抽出する。アンモニア溶離液のｐＨを８．０となし、膜限外濾過（カットオフ１０００ダルトン）により濃縮する。操作全体を４℃で実施する。ｂ）工程２工程（ａ）の溶液に酢酸を添加してｐＨ４．０となし、次いで予め酢酸緩衝液でｐＨ４．０に平衡化したバイオ・レックス７０樹脂を添加する。この溶液を撹拌下に４時間放置し、次いでプレスフィルターで濾過する。吸着した材料をバイオ・レックス７０樹脂からｐＨ９．０のアンモニアを用いる溶離により溶出させる。このクロマトグラフィー溶出液を膜限外濾過（カットオフ１０００ダルトン）により濃縮する。操作全体を４℃で実施する。ｃ）工程３酢酸緩衝液でｐＨ５．６に平衡化した工程（ｂ）の材料を、予め酢酸緩衝液でｐＨ５．６に平衡化したＤＥＡＥセファロースなどのイオン交換樹脂に吸着させる。吸着が終了した時点で、酢酸アンモニウム緩衝液、０．５Ｍ、ｐＨ５．６、で溶離を行う。このクロマトグラフィー溶出液を膜限外遠心濾過（カットオフ１０００ダルトン）により濃縮する。操作全体を４℃で実施する。ｄ）工程４工程（ｃ）の材料を酢酸緩衝液でｐＨ４．５に平衡化し、ｐＨ４．５に平衡化したＣＭセファロースなどのイオン交換樹脂に吸着させる。吸着が終了した時点で、酢酸アンモニウム緩衝液、０．１５Ｍ、ｐＨ４．５、で溶離を行う。このクロマトグラフィー溶出液を膜限外濾過（カットオフ１０００ダルトン）により濃縮する。操作全体を４℃で実施する。ｅ）工程５工程（ｄ）の材料を２５℃で、酢酸アンモニウム緩衝液、０．０５Ｍ、ｐＨ５ .６、中で平衡化したＨＰＬＣＣ１８樹脂上での逆相クロマトグラフィーにより精製する。アセトニトリル３０％（ｖ／ｖ）を含有する酢酸アンモニウム溶液を用いて、吸着した材料を樹脂から溶離する。このクロマトグラフィー溶出液を真空下での蒸留（４０℃）により濃縮する。ｆ）工程６工程（ｅ）の材料を、酢酸アンモニウム緩衝液、０．０２Ｍ中でｐＨ５．６に平衡化したＤＥ−５２などのイオン交換樹脂上で精製する。吸着した材料の溶離は緩衝液、０．２５Ｍを用いて行う。膜限外濾過（カットオフ１０００ダルトン）により濃縮を行う。操作全体を４℃で実施する。ｇ）工程７工程（ｆ）の材料を、２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（緩衝液Ａ）中でｐＨ６．２に平衡化したＤ−ツェフィルプレパックカラム（セプラコルにより販売）などのイオン交換樹脂上で精製する。吸着した材料の溶離は緩衝液Ａの１００％から１ＭＮａＣｌを含有する２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．２、の１００％までの濃度勾配溶離により行う。ｈ）工程８上程（ｇ）の材料を２５℃で、Ｃ１８樹脂上でのＨＰＬＣのような逆相クロマトグラフィーにより精製する。吸着後に、トリフルオロ酢酸水溶液（ＴＦＡ０．１％）、およびＴＦＡ（０．１％）で酸性化したアセトニトリルの二成分混合物により形成される直線濃度勾配により溶離を行う。このクロマトグラフィー溶出液を真空下での蒸留（４５℃）により濃縮し、凍結乾燥する。ｉ）工程９工程７を反復する。最終生成物である成分Ｂが非晶質粉末として採集される。実施例２−成分Ｂの分析解明成分Ｂの主要な物理−化学的特性を解明するために、尿からの精製材料につき下記の分析コントロールを行った。ａ）アミノ酸配列成分Ｂのアミノ酸配列はエドマン法により決定された。この分析はシークエンサー、アプライド・バイオシステム（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍ）、モデル４７７Ａを用いて、製造業者により与えられた指示に従って行われた。この分析により配列番号：１に提示した８１アミノ酸残基との相関において成分Ｂのアミノ酸配列を同定することができた。ｂ）分子量の測定この分析は“電子スプレー−質量分析”（ＥＳ−ＭＳ）により行われ、分子量８９３７．９ダルトンを示した。この分析により５個のジスルフィド橋およびＴｙｒ（３９）に結合したＳＯ₄基に起因する８０ダルトンの残基が証明された。実施例３：ヒト成分ＢゲノムＤＮＡの単離ラムグファージベクターＥＭＢＬ−３ＳＰ６／Ｔ７中のヒトゲノムＤＮＡライブラリーをクローンテクから購入した（カタログＮｏ．ＨＬ１０６７Ｊ，ロットＮｏ．１２２１）。ゲノムＤＮＡはヒトの胎盤から抽出され、Ｓａｕ３Ａにより部分消化された。ＤＮＡフラグメントは、ＥＭＢＬ−３Ｓｐ６／Ｔ７ベクターのＢａｍＨＩ部位へクローニングする前にスクロース濃度勾配上で分離され、８−２２Ｋｂのサイズ範囲が得られた。培地クローンテクから購入した大腸菌Ｋ８０２細胞（カタログＮｏ．Ｃ１００４− １）を、１０ｍＭＭｇＳＯ₄および０．２％マルトースを補充したＬＢ培地中で培養した。ファージライブラリーを０．１ＭＮａＣｌ、８ｍＭＭｇＳＯ₄、５０ｍＭトリス−Ｃｌ、ｐＨ７．５、０．０１％ゼラチン（ＳＭ）中に希釈した。このＤＮＡライブラリーを１．５％寒天−ＬＢ平板上で平板培養した。ライブラリー平板培養のための上層アガロースは、０．１３６ＭＮａＣｌ、０．６％アガロース、１％トリプトン（メルク、カクログＮｏ．７２１３）であった。ハイブリダイゼーション試薬２０×ＳＳＣ３ＭＮａＣｌ、０．３Ｍクエン酸Ｎａ、ｐＨ７．０ハイブリダイゼーション溶液５×ＳＳＣ、０．０２％ＳＤＳ、０．１％Ｎ−ラウロイルサルコシン、０．５％ブロッキング試薬（ベーリンガー、カタログＮｏ．１０９６１７６）洗浄溶液Ａ３×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、個々のプローブ（ＨＲＰ−オリゴ）に応じて種々の濃度の尿素（後記参照）洗浄溶液Ｂ１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ（³²Ｐ−オリゴＣＢＥＸ４Ｌ）検出系ＨＲＰ−オリゴ／ＤＮＡハイブリッドは、アメルシャムからのＥＣＬキットおよびハイパーフィルム（Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ）への露光により検出された（それぞれカタログＮｏ．ＲＰＭ２１０６および２１０４）。 ³²Ｐ−オリゴプローブ化フィルターは、ハイパーフィルムβ−マックス（アメルシャム、カタログＮｏ.ＲＰＮ１０）に露光することにより検出された。オリゴヌクレオチドオリゴヌクレオチドは自動ＤＮＡ合成装置により合成された（アプライド・バイオシステム、モデル３９２）。オリゴヌクレオチドはＯＰＣカートリッジ（アプライド・バイオシステム、カタログＮｏ．４００７７１）により、または変性ＰＡＧＥにより精製された。プローブとして使用するオリゴヌクレオチドＣＢ１、ＣＢ２およびＣＢＥＸ２Ｌは、最後の合成サイクルに際してＮ−ＭＭＴ−Ｃ１２−アミノモディファイヤー（クローンテク、カタログＮｏ．５２０６−１）で５′修飾された。西洋ワサビ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ）ベルオキシダーゼ（ＨＲＰ、ベーリンガー、カタログＮｏ．８１４３９３）を上記の修飾オリゴヌクレオチドに、ウルデア（Ｍ．Ｓ．Ｕｒｄｅａ）（Ｎｕｃ．Ａｃ．Ｒｅｓ．１６，４９３７，１９８８）の方法に従って、ホモ二官能性架橋剤としての１，４−フェニレンジイソチオシアネート（アルドリッヒ、カタログＮｏ．２５，８５５−５）を用いて結合させた。ＨＲＰ−オリゴプローブはヌクレオパック（Ｎｕｃｌｅｏｐａｃ）ＰＡ−１００カラム（ダイオネックス、カタログＮｏ．０４３０１０）上でアニオン交換ＨＰＬＣにより精製された。溶離は２０ｍＭリン酸Ｎａ緩衝液、ｐＨ６．０、および３０分で０．２Ｍから１．０ＭまでのＮａＣｌ直線濃度勾配を用いて行われた。精製されたＨＲＰ−オリゴヌクレオチドをセントリコン（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ）１０により濃縮し、ＰＢＳで洗浄し、４℃で暗所に保存した。ＨＲＰ−オリゴヌクレオチドの濃度は、ＯＤ₄₀₃（ε₄₀₃＝８９．５ｃｍ ¹ｘｍＭ¹）により計算された。下記のオリゴヌクレオチドが合成された：ライブラリーの力価測定ヒトゲノムＤＮＡライブラリーを標準法（アウスユーベル（Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌ），ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ）に従って、大腸菌Ｋ８０２細胞の一夜培養物０．３ｍｌに２×１０³ −２×１０⁷の種々のライブラリー希釈液を感染させることにより力価測定した。細胞−ライブラリー混合物を室温で２０分間インキュベートし、次いで３７℃ に１０分間移した。感染細胞を予め５０℃に加熱した11層アガロース４ｍｌと混合し、予め３７℃に加温した１０ｃｍの寒天平板上に注入した。平板を３７℃で一夜インキュベートした（ＯＮ）。各平板のプラーク数を計数した。各ライブラリーにつき２個の平板を用意した。ヒトゲノムＤＮＡライブラリーの力価は予想どおり５×１０⁹ｐｆｕ／ｍｌであることが認められた。ライブラリーのスクリーニング大腸菌Ｋ８０２細胞を３７℃で一夜増殖させた。細胞培養物０．６ｍｌに、ＳＭに懸濁したライブラリーのアリコート（６×１０⁴ｐｆｕ）を感染させた。感染および平板培養は前記に従って行われたが、９ｍｌの上層アガロースおよび１５ｃｍの平板を用いた。準集密プラークをハイボンド（Ｈｙｂｏｎｄ）Ｎ⁺ナイロン膜（アメルシャム）に、アメルシャムの指示書に従って移した。これらのフィルターをプラーク側を上にして、１．５ＭＮａＣｌ、０．５ＭＮａＯＨに浸漬した濾紙に７分間乗せることにより、ブロッティングしたＤＮＡを変性した。次いでフィルターを、中和溶液（１．５ＭＮａＣｌ）０．５Ｍトリス−Ｃｌ、ｐＨ７．２、１ｍＭＥＤＴＡ）に浸漬した濾紙に３分間ずつ２回乗せることにより、ブロッティングしたＤＮＡを中和した。フィルターを２×ＳＳＣ中で洗浄し、風乾した。フィルターを、０．４ＭＮａＯＨに浸漬した濾紙に２０分間乗せることにより、ＤＮＡを膜に固定した。最後にフィルターを５×ＳＳＣ中で１分間洗浄し、ハイブリダイゼーションまでプラスチックバッグ内で４℃に保存した。ヒトゲノムＤＮＡライブラリー（１ ×１０⁶クローン）を高い平板培養密度でＨＲＰ−ＣＢ２オリゴプローブによりスクリーニングした。２０の陽性クローンが選択された。６つの陽性クローンをＨＲＰ−ＣＢ１およびＨＲＰ−ＣＢ２オリゴプローブの両方で再スクリーニングした。４Ｄ、１２Ｂおよび１５と命名された３クローンが成分Ｂ遺伝子につき陽性であることが確認された。ハイブリダイゼーションフィルターをハイブリダイゼーション溶液中で４２℃において３０分間、プレインキュベートし、次いで４２℃で４５分間、適宜なＨＲＰ−オリゴプローブ（ハイブリダイゼーション溶液中に５ｎｇ／ｍｌのオリゴヌクレオチド）とハイブリダイズさせ、最後に適宜な濃度の尿素（後記参照）を含有する洗浄溶液中において４２℃で１５分間ずつ２回洗浄した。フィルターを室温の２×ＳＳＣ中で短時間洗浄し、ハイブリダイズしたプラークをＥＣＬ試薬およびハイパーフィルム（Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ）への６０分間の露光により検出した。大腸菌およびラムダファージＤＮＡの非特異的ハイブリダイゼーションを最小限に抑えるために、ＨＲＰ−オリゴプローブ処理フィルターの洗浄条件を実験により決定した。５００−１５ａｔｔｏｍｏｌの標的ＤＮＡ系列希釈液をラムダＤＮＡ（１０ｎｇ）の存在下でハイボンドＮ⁺ナイロン膜上にスポットした。ラムダおよび大腸菌ＤＮＡ（各１０ｎｇ）を陰性対照として用いた。数枚のストリップを用意し、５ｎｇ／ｍｌのプローブとのハイブリダイゼーション実験に用いた。洗浄は０、９、１８、２７および３６％尿素を含有する洗浄溶液Ａを用いて行われた。１８％および２７％尿素がそれぞれＣＢ１およびＣＢ２に有効であることが認められた。ＣＢＥＸ２Ｌとハイブリダイズしたフィルターを、１８％尿素を含有する洗浄溶液Ａで洗浄した。 ³²Ｐ−オリゴＣＢＥＸ４Ｌとのハイブリダイゼーションを５０℃で行い、フィルターを４５℃で洗浄溶液Ｂ中において洗浄した。プラークのサブスクリーニング陽性プラークをパスツールピペットで拾い上げ、１ｍｌのＳＭおよび１滴のクロロホルムを入れた試験管に移した。室温で振盪下に２時間のインキュベーション後に、ファージ懸濁液を４℃に保存した。ファージ懸濁液の１０³希釈液を１０ｃｍの平板上で培養し、２枚のレプリケートフィルター上で２種類のオリゴプローブ、すなわち最初のスクリーニングに用いたもの、および成分Ｂの隣接領域に一致する他のものを用いて再スクリーニングした。両プローブにつき陽性である独立したクローンを前記に従って拾い上げ、再懸濁した。ファージ原液の調製陽性クローンを、大腸菌Ｋ８０２細胞への感染および１５ｃｍ寒天平板上での増殖により増量させた。３７℃で一夜のインキュベーション後に、集密細胞溶解物を寒天平板から１０ｍｌのＳＭにより採集した。数滴のクロロホルムを添加し、細胞残屑を３０００ｒｐｍで４℃において５分間の遠心分離により除去し、ファージを含有する透明な上清を５０％グリセリンとなし、分割して−８０℃に保存した。ファージＤＮＡの抽出２×１０⁹の大腸菌Ｋ８０２細胞に、選択されたファージクローンを感染させ（細胞数／ファージの比率＝４：１）、１００ｍｌの液体培地中において３７℃ で一夜増殖させた。インキュベーション終了時に培養物にクロロホルム（５μｌ／ｍｌ）を添加することによって完全な細胞溶解を達成した。ファージＤＮＡをキアゲン（Ｑｕｉａｇｅｎ）により、製造業者の指示に従って抽出した。ファージＤＮＡの配列決定アプライド・バイオシステムからのサイクル配列決定キット（カタログＮｏ．４０１３８８）により、自動ＤＮＡシークエンサー（アプライド・バイオシステム、モデル３７３Ａ）を用いてファージＤＮＡの配列を決定した。クローン４Ｄ、１２Ｂおよび１５からファージＤＮＡを抽出し、サイクル配列決定法により配列決定した。配列決定用プライマーは成分Ｂのアミノ酸配列から（ＣＢＦ１、ＣＢＦ２、ＣＢＲ１、ＣＢＲ２）、または入手されるｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡ配列決定データから得られた。配列決定データから、これらの３クローンは全長成分B遺伝子を含むことが示された。ファージＤＮＡ制限分析ファージＤＮＡに１回および多数回の制限酵素消化を施した。ＤＮＡフラグメントを０．６％アガロースゲル電気泳動により分離し、次いでハイボンドＮ⁺ナイロン膜上にブロットした。フィルターを、それぞれエキソン１、２および３に一致するオリゴヌクレオチドＣＢＥＸ２Ｌ、ＣＢ２およびＣＢＥＸ４Ｌで反復探査した。ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔＩＩＳＫへの成分Ｂ遺伝子のサブクローニングＥｃｏＲ１、ＸｈｏＩおよびＳｆｉ１を用いた成分Ｂクローン４Ｄの制限分析、ならびに成分Ｂの３エキソンに特異的なオリゴプローブを用いたサザーンブロッティングから、成分Ｂ遺伝子全体が５．２ＫｂのＥｃｏＲ１フラグメント中に含まれることが示された（図５）。ファージＤＮＡをクローン４Ｄから抽出し、ＥｃｏＲ１で消化した。得られたＤＮＡフラグメントをアガロースゲル電気泳動により分離し、５．２Ｋｂフラグメントをキアエックス（Ｑｉａｅｘ、キアゲン、カタログＮｏ．２００２０）により精製し、ＥｃｏＲ１で線状化したｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（ストラタジーン、カタログＮｏ．２１２２０７）にリゲートした。大腸菌株ＸＬ１ −Ｂｌｕｅ（ストラタジーン、カタログＮｏ．２００２６８）をリゲーション混合物で形質転換し、これらの形質転換細胞をＡｐ／Ｔｃ平板上で選択した。ＥｃｏＲ１を用いた制限分析により示された予想プラスミドを含む１クローンを単離し、ｐＢＳＣＢ４Ｄと命名した。下記を用いてさらに制限分析を行った： Sma1，Kpn1，Hind III,Sfi1,Acc1,Not1,Sal1,Xho1, EcoRV,Cla1,Hinc II,Hind I I．Sca1,Bgl II,Aat 2,Nco1,Nhe1,Hpa1およびMlu1. さらに１回および２回の消化後に、ｐＢＳＣＢ４Ｄに対する成分Ｂ特異性オリゴプローブを用いてサザーンブロッティングを行った。図６はｐＢＳＣＢ４Ｄプラスミドの制限地図を示す。図４は成分Ｂ遺伝子の制限地図を示す。成分Ｂ遺伝子は２つのイントロンで分離された３つのエキソンを含む。これらのエキソンは適宜な共通配列のアクセプターおよびドナースプライス部位によりフランキングされている。エキソン１は８４ｂｐの長さであり、２６ｎｔの非翻訳ｍＲＮＡを含み、この配列は想定シグナルペプチドの１９アミノ酸をコードする。それは４１０ｂｐのイントロンによりエキソン２から分離されている。エキソン２は１２０ｂｐの長さであり、想定シグナルペプチドの３アミノ酸および成熟蛋白質の３７アミノ酸をコードする。それは５５０ｂｐのイントロンによりエキソン３から分離されている。エキソン３は３２６ｂｐの長さである；それは成分ＢのＣ−末端４４アミノ酸および１９２ｎｔの非翻訳ｍＲＮＡをコードし、３′側プロセシング部位の１４ｂｐ上流にポリアデニル化シグナル（ＴＡＴＡＡＡ）を含み、その末端にポリ（Ａ）テイルが結合している。特に前記の３ゲノムクローンにおいてシグナルペプチドコード配列は想定シグナルペプチドの位置１１にＬｅｕコドンを含むことが見出された。ゲノム遺伝子から求めた成分Ｂのアミノ酸配列はエドマン分解により実験的に決定されたものと一致することが認められた。エキソン１の上流の配列分析により、プロモーター領域（図３）は−２８におけるＴＡＴＡボックス、ならびに種々の上流プロモーター要素およびエンハンサーを含むことが証明された：これには−５８における高ＧＣ含有ボックス、−８３におけるＡＰ−１部位、−３６０におけるＡＰ−２部位、および幾つかのＥボックスが含まれる。ＴＡＴＡボックスは転写開始因子ＴＦＩＩＤにとって好ましい結合部位である。高ＧＣ含有ボックスはＳｐ−１、すなわち多様な遺伝子の転写に関与する一般的な転写因子の結合部位である（ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｎｄＳｐｌｉｃｉｎｇ，ヘイムズおよびグローバー（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ，Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ）編，ＩＲＬプレス，１９８８）。ＡＰ−１部位は、ＡＰ−１、すなわちｃ−ｆｏｓおよびｃ−ｊｕｎにより形成される転写因子複合体の結合部位である。ＡＰ−１部位は、細胞の増殖および分化に関与する幾つかの遺伝子中に存在する。ＡＰ−１はプロテインキナーゼＣの活性剤に対する誘導応答を仲介する幾つかのシス−要素の１つである（Ｔｈｅｈｏｒｍｏｎａｌｃｏｎｔｒｏｌｏｆｇｅｎｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ．コーエンおよびファウルキス（Ｐ．Ｃｏｈｅｎ，Ｊ．Ｇ．Ｆｏｕｌｋｅｓ）編，エルゼビル，１９９１）。ＡＰ−２部位はＡＰ−２、すなわちＰＭＡおよびｃＡＭＰにより活性化された転写因子に対する標的である（同書）。Ｅボックスは幾つかのエンハンサー領域に見出される共通配列であり、遺伝子の組織特異的発現を決定する際に重要な役割を果たす。Ｅボックスは配列ＣＡＮＮＴＧを含み、内部の２塩基は個々のＥボックスに応じて変化する（キングストン（Ｒ．Ｅ．Ｋｉｎｇｓｔｏｎ），ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎＣｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９８９；１，１０８１−１０８７）。成分Ｂプロモーターはグルココルチコイド受容体（ＧＲＥ）に対する潜在的な応答要素を含み、このことは成分Ｂ遺伝子をグルココルチコイドによって誘導しうることを示す。哺乳動物細胞において発現させるためのベクター中への成分B遺伝子のサブクローニング哺乳動物細胞におけるｒｅｃ−蛋白質の発現をイントロン（１または２以上）の存在によって向上させうることは知られている。成分ＢゲノムＤＮＡを哺乳動物において発現させうることは可能である。このために、成分Ｂ遺伝子＋５０から＋１４１３に及ぶ１３６４ｂｐのフラグメントを、ｐＢＳＣ４ＤからＰｖｕＩＩおよびＮａｒ１消化により切り取る。図２はＰｖｕＩＩおよびＮａｒ１部位に基づく成分Ｂ転写単位の制限地図を示す。このフラグメントと遺伝子の５′末端を再生する合成オリゴヌクレオチド−−後続の真核細胞性発現プラスミド中への遺伝子クローニングに適した制限部位でフランキングされたもの−−とのリゲーションにより、成分Ｂ遺伝子全体が再構成される。実施例４：成分ＢｃＤＮＡクローンの単離ｃＤＮＡ末端の迅速増幅法（ＲａｐｉｄＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｃＤＮＡＥｎｄｓ，ＲＡＣＥ）、すなわちフローマン（Ｆｒｏｈｍａｎ）ら，（１９８８）Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５，８９９８、が述べた方法を用いて、成分ＢｍＲＮＡの５′および３′末端に対応する部分ｃＤＮＡクローンを得た。これらの部分クローンはオーバーラップＤＮＡを含み、従って組み合わせて全長成分ＢｃＤＮＡ配列を構築することができる。ＲＡＣＥクローニングに用いられる一般的方法を表す図を図７に示す。３′ＲＡＣＥのためには、成分B遺伝子の第２エキソンのＤＮＡ配列を利用することができ、これを用いて、遺伝子特異性プライマーを設計した。ｃＤＮＡ合成はヒト子宮ポリＡ⁺ＲＮＡのポリＡテイルから、ＡＰアダプタープライマーと呼ばれるオリゴヌクレオチドを用いて開始された。このｃＤＮＡを、ＣＫＣＢ１およびＡＰプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の鋳型として使用し、これにより成分ＢｃＤＮＡの３′末端に対応する約４５０ｂｐのフラグメントが産生された。５′ＲＡＣＥのためには、この４５０ｂｐの３′ＲＡＣＥフラグメントのＤＮＡ配列からプライマーを設計し、ヒト子宮ポリＡ⁺ＲＮＡからのｃＤＮＡ合成の開始に使用した。ｍＲＮＡおよびＣＫＣＢ７プライマーを除去する精製ののち、このｃＤＮＡの３′末端にオリゴデオキシシチジンテイルを付加した。このテイル付きｃＤＮＡを入れ子型（ｎｅｓｔｅｄ）プライマーおよびアンカープライマーまたはＡＣＰとユニバーサル増幅プライマーの混合物を用いるＰＣＲにおける鋳型として使用した。ＣＫＣＢ２は第２エキソン配列の３′末端にアニーリングし、ＡＣＰはオリゴデオキシシチジンテイルにアニーリングした。成分ＢｍＲＮＡの５′末端に対応するＤＮＡ配列を含む約２３０ｂｐのフラグメントが得られた。用いた一般的な実験プロトコル（たとえばポリアクリルアミドゲル電気泳動、エタノール沈殿、リゲーション、および制限エンドヌクレアーゼ消化）、細菌培地（たとえばＬＢ）、および化学薬品溶液（たとえばフェノール）は、特に指示しない限りサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら，（１９８９）ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，第２版，コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、ニューヨーク、に詳述されている。３′ＲＡＣＥクローニング法ｃＤＮＡ末端の迅速増幅法に用いる３′ＲＡＣＥシステムは、ライフ・テクノロジーズ・インコーポレーテッド、ニューヨーク州グランド・アイランド、から購入された。ヒト子宮ポリＡ⁺ＲＮＡはクローンテク・ラボラトリーズ・インコーポレーテッド、カリフォルニア州パロ・アルト、から購入された。第１鎖ｃＤＮＡ合成は３′ＲＡＣＥシステムと共に供給されたプロトコルおよび試薬を用いて行われた。要約すると、１μｌ（１μｇ）の子宮ポリＡ⁺ＲＮＡを１μｌの１０μＭＡＰ溶液および１２μｌのジエチルポリカーボネート（ＤＥＰＣ）−処理水と混和し、この混合物を６５℃に１０分間加熱した。混合物を氷上で冷却したのち、１９μｌの容量において最終組成がほぼ２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）、５０ｍＭＫＣｌ、２．５ｍＭＭｇＣｌ₂、１００μｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、５００ｎＭＡＰ、各５００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、ならびに５０ｎｇ／μｌＲＮＡとなるように反応成分を添加した。反応混合物を４２℃に加熱し、１μｌ（２０単位）のスーパースクリプト（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ）逆転写酵素を添加した。４２℃で３０分間インキュベートしたのち、反応混合物を氷上で冷却し、１μｌのＲＮａｓｅＨ（２単位）を添加した。ＲＮａｓｅＨ消化を４２℃の温度で１０分間行った。ＰＣＲ前は反応混合物を−２０℃に保存した。ＰＣＲのためには、下記組成をもつ４つの等しい４０μｌ混合物を用意した：４０ｍＭＫＣｌ、７０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、０．１％トリトンＸ−１００、１ｍＭＭｇＣｌ₂、０．２５μＭＣＫＣＢ１、および０．５μ ＭＡＰ中の、１ｐｌの子宮ポリＡ⁺ ｃＤＮＡ。ＰＣＲには３′ＲＡＣＥシステムからの試薬を用いなかった。ＣＫＣＢ１およびＡＰプライマーは両方ともアプライド・バイオシステムズ・インコーポレーテッド、モデル３９２オリゴヌクレオチド合成装置により合成された。脱保護、凍結乾燥、およびＤＥＰＣ−処理水中への再懸濁後に、各溶液の光学濃度を２６０ｎｍの波長で測定した。測定された光学濃度に基づいて、ＤＥＰＣ−処理水中における各オリゴヌクレオチドの１０μＭ溶液を調製した。これらの粗製オリゴヌクレオチド溶液をさらに精製することなくＰＣＲに用いた。３′ＲＡＣＥシステムと共に供給されたＡＰと均等な結果を与えた粗製ＡＰの濃度を実験により測定した；０．４μＭの粗製ＡＰがライフ・テクノロジーズ・インコーポレーテッドからの０．２μＭのＡＰと均等であった。４０μｌのＰＣＲ反応物を温度循環装置内で９４℃に加熱したのち、それぞれに下記を含有する混合物１０μｌを添加した：１.２５単位のＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（パーキン・エルマー・シータス、コネチカット州ノーウォーク）、４０ｍＭＫＣｌ、７０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、０．１５％トリトンＸ−１００、１ｍＭＭｇＣｌ₂、ならびに各１ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＣＴＰ。ＰＣＲにおける各試薬の最終濃度はほぼ下記のとおりであった：１μｌの子宮ｃＤＮＡ／５０μｌ、１．２５単位のＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼ／５０μｌ、４０ｍＭＫＣｌ、７０ｍＭトリス −ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、０．１％トリトンＸ−１００、１ｍＭＭｇＣｌ₂、０．２μＭＣＫＣＢ１、０．４μＭＡＰ、ならびに各０．２ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＣＴＰ。９４℃で５分間のインキュベーションを完了したのち、“タッチダウン（Ｔｏｕｃｈｄｏｗｎ）”ＰＣＲ温度循環プログラムを、ダン、コックス、ウェインライト、ベーカーおよびマチック（Ｄｏｎ，Ｒ．Ｈ．，Ｃｏｘ，Ｐ．Ｔ．，Ｗａｉｎｗｒｉｇｈｔ，Ｂ．Ｊ．，Ｂａｋｅｒ，Ｋ．，Ｍａｔｔｉｃｋ，Ｊ．Ｓ．）（１９９１）Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１９，４００８に従って、アニーリング温度を７３℃から６３℃まで変化させることにより実施した。ＰＣＲ増幅後に４つの反応物を合わせて、ＤＮＡ生成物を５％ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動によりサイズ分画した。約４５０ｂｐのＤＮＡ生成物をゲルから切り取り、透析チューブ内で電気溶出により精製した。溶出物をフェノールおよびクロロホルムの５０：５０（ｖ／ｖ）混合物で抽出し、エタノール沈殿させ、乾燥させ、１０μｌの無菌水に再懸濁した。ＴａｑＤＮＡポリメラーゼの鋳型非依存性の末端基転移酵素活性、およびｄＡＴＰに対するそれの強い嗜好性のため（クラーク（Ｃｌａｒｋ，Ｊ．Ｍ．）（１９８８）Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１６，９６７７、ならびにモル、イゴーおよびレーン（Ｍｏｌｅ，Ｓ．Ｅ．，Ｉｇｇｏ，Ｒ．Ｄ．Ｌａｎｅ，Ｄ．Ｐ．）（１９８９）Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１７，３３１９）、精製された４５０ｂｐのＰＣＲフラグメントは各３′末端に単一デオキシアデノシン残基を有すると予想される。このＰＣＲフラグメントをサブクローニングおよび解明するために、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ⁺（ストラタジーン、カリフォルニア州ラ・ヨラ）“Ｔ−ベクター”を本質的にはマーチャク（Ｍａｒｃｈｕｋ）ら，（１９９１）Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１９，１１５４の記載に従って、調製した。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミド（２０μｇ）をＥｃｏＲＶ制限エンドヌクレアーゼで消化し、次いでフェノールおよびクロロホルムの５０：５０（ｖ／ｖ）混合物で抽出することにより精製した。エタノール沈殿後に、ＤＮＡを９単位のＴａｑＤＮＡポリメラーゼで７０℃において２時間、５０ｍＭＫＣ１、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、０．１％トリトンＸ−１００、１．５ｍＭＭｇＣｌ₂および２ｍＭｄＴＴＰを含有する反応液５０μｌ中で処理した。このベクターを再度フェノールおよびクロロホルム（５０：５０ｖ／ｖ）による抽出およびエタノール沈殿によって精製した。この処理により各３′末端に１個のデオキシチミジンが付加され、ベクターがＴａｑＤＮＡポリメラーゼを用いて合成されたＤＮＡフラグメントの挿入に適した状態となった。前記の非リン酸化４５０ｂｐＰＣＲフラグメントを、製造業者が指示した条件を用いてＴ４ＤＮＡリガーゼ（ニュー・イングランド・バイオラボズ、マサチュセッツ州ビバリー）との反応において、Ｔ−ベクター中へ挿入した。リゲーション反応物を１６℃で約７２時間インキュベートし、次いでこれを用いてコンピテント大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞（ストラタジーン、カリフォルニア州ラ・ヨラ）を形質転換した。形質転換した細胞を、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含有するＬＢ寒天上で平板培養した。細胞の培養前に１００μｌの２％Ｘ−ｇａｌ（ライフ・テクノロジーズ・インコーポレーテッド、ニューヨーク州グランドアイランド）および４０μｌの１００ｍＭＩＰＴＧ（ライフ・テクノロジーズ・インコーポレーテッド、ニューヨーク州グランドアイランド）を順次各平板の寒天表面に展延し、乾燥させた。３７℃で一夜のインキュベーション後に、青色色素を含むコロニーおよび色素をもたないコロニー（白色）が見えるようになった。１２の白色コロニーの培養物からプラスミドＤＮＡを精製した。１２の分離体すべてが前記の４５０ｂｐ挿入配列を含んでいた。さらに分析するために５クローンを選んだ：３ＣＢ４、３ＣＢ６、３ＣＢ７、３ＣＢ８および３ＣＢ９。シーケナーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ）バージョン２．０キット（ユナイテッド・ステーツ・バイオケミカル、オハイオ州クリーブランド）を用いて、ＤＮＡ配列分析を行った。５′ＲＡＣＥクローニング法ｃＤＮＡ末端の迅速増幅法に用いる５′ＲＡＣＥシステムは、ライフ・テクノロジーズ・インコーポレーテッド、ニューヨーク州グランド・アイランド、から購入された。ヒト子宮ポリＡ⁺ＲＮＡはクローンテク・ラボラトリーズ・インコーポレーテッド、パロ・アルト、カリフォルニア州、から購入された。５′ＲＡＣＥクローニング実験は、下記を除いて５′ＲＡＣＥシステムと共に供給されたプロトコルおよび試薬を用いて行われた：（ａ）ＣＫＣＢ７、ＡＣＰおよびＵＡＰプライマーを、アプライド・バイオシステムズ・インコーポレーテッド、モデル３９２オリゴヌクレオチド合成装置により合成され前記３′ＲＡＣＥクローニング法に従って調製され、（ｂ）３′ＲＡＣＥクローニングにつき記載した“タッチダウン”ＰＣＲ温度循環プログラムをｃＤＮＡの増幅に用いた。第１鎖ｃＤＮＡは下記により合成された：１ｐｌ（１ｐｇ）の子宮ポリＡ⁺ＲＮＡを０．５ μ ｌの１０μＭＣＫＣＢ７溶液および１３．５μｌのＤＥＰＣ−処理水と混和し、この混合物を７０℃に１０分間加熱した。混合物を氷上で冷却したのち、２４ μｌの容量において最終組成が約２０ｎＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８.４）、５０ｍＭＫＣｌ、３ｍＭＭｇＣｌ₂、１０ｍＭＤＴＴ、２００ｍＭＣＫＣＢ７、各４００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、ならびに４０ｎｇ／μｌＲＮＡとなるように反応成分を添加した。反応混合物を４２℃に加熱し、１μｌ（２２０単位）のスーパースクリプトＩＩ逆転写酵素を添加した。４２℃で３０分間および７０℃で１５分間インキュベートしたのち、反応混合物を５５℃に置き、１μｌのＲＮａｓｅＨ（２単位）を添加した。ＲＮａｓｅＨ消化を５５℃の温度で１０分間行った。ｃＤＮＡを、取り込まれなかったｄＮＴＰ、ＣＫＣＢ７および蛋白質からグラスマックス（Ｇｌａｓｓｍａｘ）ＤＮＡ分離用スピンカートリッジ（５′ＲＡＣＥシステムに含まれる）により分離した。詳細には、１２０μｌの結合溶液（６ＭＮａＩ）を第１鎖反応物に添加し、ｃＤＮＡ／ＮａＩ溶液をグラスマックス −スピンカートリッジに移した。１３，０００×ｇで２０秒間の遠心分離後に、０．４ｍｌの低温（４℃）１×洗浄用緩衝液を添加した。スピンカートリッジを１３，０００×ｇでさらに２０秒間回転させた。この工程をさらに２回反復した。４００μｌの低温（４℃）７０％エタノールで２回洗浄したのち、５０μｌの無菌蒸留水をスピンカートリッジに添加することによりｃＤＮＡを溶離し、１３，０００×ｇで２０秒間、遠心分離した。ｃＤＮＡの末端に、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）およびｄＣＴＰを用いてホモポリマーテイルを付加した。テイル付加反応はＰＣＲ適合性の緩衝液中で実施された。１０μｌの精製cＤＮＡを７．５μｌのＤＥＰＣ−処理水、２．５μｌの１０×反応用緩衝液、１．５μｌの２５ｍＭＭｇＣｌ₂溶液、および２．５μｌの２ｍＭｄＣＴＰと混和した。反応混合物を９４℃で２−３分間インキュベートした。氷上で１分間冷却したのち、１μｌのＴｄＴ（１０単位／μｌ）を添加した。従って最終組成は２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）、５０ｍＭＫＣｌ、１．５ｍＭＭｇＣｌ₂、２００μＭｄＣＴＰ、０．４単位/μｌＴｄＴ中において１０μｌのｃＤＮＡであった。反応混合物を３７℃で1０分間、次いで７０ ℃で１０分間インキュベートして、ＴｄＴを不活性化した。ＰＣＲのために、下記の最終プライマー濃度（５０μｌ当たり）の４つの異なる反応物を用意した：１．４００ｎＭＡＣＰ２．８００ｎＭＡＣＰ３．３６０ｎＭＵＡＰおよび４０ｎＭＡＣＰ（ＵＡＰ：ＡＣＰ，９：１）４．７２０ｎＭＵＡＰおよび８０ｎＭＡＣＰ（ＵＡＰ：ＡＣＰ，９：１）残りの成分の最終濃度（５０μｌ当たり）は４つの反応物すべてにおいて同じであった：２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）、５０ｍＭＫＣｌ、１．５ｍＭＭｇＣｌ₂、４００ｎＭＣＫＣＢ２、ならびに各２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ中において５μｌの子宮ポリＡ⁺ｄＣ−テイル付きｃＤＮＡ。ＡＣＰおよびＵＡＰプライマーを含めて、これらの成分を初期容量４５μｌ中で混合し、温度循環装置内で９４℃に加熱した。１．２５単位のＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（パーキン・エルマー・シータス、コネチカット州ノーウォーク）の、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）中における混合物５μｌを各反応物に添加して、最終容量を５０μｌにした。“タッチダウン”ＰＣＲ温度循環プログラム（３′ＲＡＣＥクローニングにつき記載したものと同様）を用いて５′ｃＤＮＡフラグメントを増幅させた。ＰＣＲ増幅後に４つの反応物を合わせて、ＤＮＡ生成物を８％ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動によりサイズ分画した。約２３０ｂｐのＤＮＡ生成物をゲルから切り取り、精製し、４５０ｂｐの３′ＲＡＣＥフラグメントにつき記載した“Ｔ−ベクター”中へ挿入した。さらに分析するために５クローンを選んだ：５ＣＢ２、５ＣＢ３、５ＣＢ５、５ＣＢ６および５ＣＢ１１。シーケナーゼ、バージョン２．０キット（ユナイテッド・ステーツ・バイオケミカル、オハイオ州クリーブランド）を用いて、ＤＮＡ配列分析を行った。図８にＲＡＣＥクローン５ＣＢ３および３ＣＢ７から組み立てられた完全な成分ＢのｃＤＮＡ配列を報告し、そこに制限部位を示す。配列アラインメントによって、クローン５ｃｂ３、５ｃｂ６、５ｃｂ１１と３ｃｂ４、３ｃｂ７、３ｃｂ９のｃＤＮＡ配列は成分Ｂエキソン（実施例３のゲノムクローン４Ｄ）と完全に一致することが示された。本発明を具体例により説明したが、本発明の精神および範囲内において前記の操作につき変更をなしうることは明らかである。図面の説明図１．尿からの成分Ｂのプロセスを示すフローチャート。図２．成分Ｂゲノム転写単位（この成分ＢゲノムＤＮＡは配列番号：２に報告される）の制限地図。矢印はスプライシング部位を示す。図３．成分Ｂプロモーター領域（この成分Ｂプロモーター領域は配列番号：２に報告される）の配列。ＡＰ−１、ＡＰ−２、Ｓｐ−１およびＥ−ボックス転写因子に対する結合部位を示す。ＴＡＴＡボックスを示す。ＧＲＥも示される。図４．成分Ｂ遺伝子の制限地図。誘導されたｍＲＮＡはゲノム遺伝子の下方に線で示され、四角で囲んだ領域は蛋白質コード配列を表す。図５．クローン４Ｄ挿入配列の制限地図。図６．ｐＢＳＣＢ４Ｄプラスミドの制限地図。図７．成分ＢＤＮＡ配列のＲＡＣＥクローニングに用いた一般的方法。図８．完全な成分ＢｃＤＮＡ配列。そこに制限部位が示される（この成分ＢｃＤＮＡは配列番号：３に報告される）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｎ 5/10 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＣＢＣ１２Ｐ 21/00 ＡＤＵ //(Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims

【特許請求の範囲】１．配列番号：１のペプチド配列を含むポリペプチド、その塩類、機能性誘導体、前駆物質および活性画分、またはそれらの混合物。２．下記工程を含む、請求項１に記載のポリペプチドの製造方法：ａ）尿を酸性ｐＨでカオリンに吸着させ、そしてアンモニアで抽出し、ｂ）画分（ａ）をバイオ・レックス７０樹脂上でアンモニアにより溶離し、ｃ）画分（ｂ）をＤＥＡＥセファロース樹脂上で酢酸緩衝液により溶離し、ｄ）画分（ｃ）をＣＭセファロース樹脂上で酢酸緩衝液により溶離し、ｅ）画分（ｄ）をＨＰＬＣＣ１８樹脂上で酢酸緩衝液およびアセトニトリルの混合物により溶離し、ｆ）画分（ｅ）をＤＥ−５２樹脂上で酢酸緩衝液により溶離し、ｇ）画分（ｆ）をＤ−ツェフィル樹脂上で酢酸緩衝液により溶離し、ｈ）画分（ｇ）をＨＰＬＣＣ１８樹脂上でトリフルオロ酢酸水溶液およびアセトニトリルの混合物により溶離し、ｉ）画分（ｈ）をＤ−ツェフィル樹脂上で酢酸緩衝液により溶離する。３．尿が人尿である、請求項２に記載の方法。４．請求項１に記載のポリペプチド、その突然変異体または活性画分をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ分子。５．請求項４に記載のＤＮＡ分子とハイブリダイズし、かつ請求項１に記載のポリペプチド、その突然変異体または活性画分をコードするＤＮＡ分子。６．配列番号：２のヌクレオチド配列を含むゲノムＤＮＡ分子。７．配列番号：３のヌクレオチド配列を含むｃＤＮＡ分子。８．請求項４−７のいずれか１項に記載のＤＮＡ分子を含む発現ベクター。９．請求項８に記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。１０．請求項９の記載に従って形質転換された宿主細胞を培養し、そして該細胞から、または培地から蛋白質を採取することを含む、請求項１に記載のポリペブチドの製造方法。１１．下記工程を含む方法により得られる、本質的に純粋な蛋白質、その塩類、機能性誘導体、ブロドラッグおよび活性画分：ａ）尿を酸性ｐＨでカオリンに吸着させ、そしてアンモニアで抽出し、ｂ）画分（ａ）をバイオ・レックス７０樹脂上でアンモニアにより溶離し、ｃ）画分（ｂ）をＤＥＡＥセファロース樹脂上で酢酸緩衝液により溶離し、ｄ）画分（ｃ）をＣＭセファロース樹脂上で酢酸緩衝液により溶離し、ｅ）画分（ｄ）をＨＰＬＣＣｌ８樹脂上で酢酸緩衝液およびアセトニトリルの混合物により溶離し、ｆ）画分（ｅ）をＤＥ−５２樹脂上で酢酸緩衝液により溶離し、ｇ）画分（ｆ）をＤ−ツェフィル樹脂上で酢酸緩衝液により溶離し、ｈ）画分（ｇ）をＨＰＬＣＣ１８樹脂上でトリフルオロ酢酸水溶液およびアセトニトリルの混合物により溶離し、ｉ）画分（ｈ）をＤ−ツェフィル樹脂上で酢酸緩衝液により溶離する。１２．薬剤として使用される、請求項１に記載のポリペプチド。１３．請求項１に記載のポリペプチドを抗炎症および／または抗凝血および／または抗腫瘍活性を有する薬剤の製造に使用する用途。１４．療法上受容しうる量の請求項１に記載のポリペプチド、その塩、機能性誘導体、前駆物質、活性画分、またはそれらの混合物を、薬剤学的に受容しうる賦形剤または溶媒と共に含む薬剤組成物。１５．薬剤として使用される、請求項１１に記載の蛋白質。１６．療法上受容しうる量の請求項１１に記載の蛋白質、その塩類、機能性誘導体、前駆物質、活性画分、またはそれらの混合物成分Ｂを、薬剤学的に受容しうる賦形剤または溶媒と共に含む薬剤組成物。