UA46702C2 - Поліпептид, спосіб одержання поліпептиду (варіанти),фрагмент днк (варіанти), експресуючий вектор (варіанти), штам e.coli, лінія клітин (варіанти), білок, фармацевтична композиція (варіанти) - Google Patents

Abstract

Новий білок, отриманий із сечі шляхом екстракції та очищення за допомогою іонообмінної хроматографії і хроматографії високої роздільності і який відрізняється протизапальною, антикоагулюючою і протипухлинною активністю. Білок є інгібітором зв'язування TGF-альфа з рецептором.

Description

Опис винаходу

Настоящее изобретение относится к новому белку, названному Компонентом В. Более конкретно, настоящее 2 изобретение относится к новому белку, получаемому из мочи; к получению зтого белка из мочи; к его синтезу посредством техники рекомбинантньїх ДНК с использованием геномной ДНК или кКДНК, кодирующей указанньй

Новій белок; а также к фармацевтической композиции, содержащей зтот белок; и ее использованию в терапевтических целях.

Новьїй белок имеет относительную низкую молекулярную массу и полипептидную природу, и может бьїть 70 вьіделен в процессе зкстракции и очистки производньхх мочи. Для зтого, мочу человека обрабатьвают адсорбирующими материалами, такими, как каолин, затем подвергают фильтрации, ионообменной хроматографии, и вьісокоразрешающей хроматографии, предпочтительно в соответствии с нижеописанной техникой; и после лиофилизации получают соединение в виде белого аморфного порошка, которьй в обращенно-фазовой жидкостной хроматографии вьісокого давления (ОФ-ЖХВД) перемещается как один пик, и 72 которьй имеет молекулярную массу около ОкДа, как бьло показано с помощью озлектрофореза в полиакриламидном геле с дедецилсульфатом натрия (ДСН-ПААГ), проводимого в восстанавливающих условиях. Зтот белок бьіл назван Компонентом В.

Аминокислотная последовательность Компонента В представлена ниже как ЗЕО ІЮ Мо 1.

Настоящее изобретение относится к получению нового белка, названного Компонентом В, способом, предусматривающим вьіделениє сьірой фракции самого соєдинения из диализованного концентрата мочи после ее обработки адсорбирующим агентом и очистки с помощью ийонообменной хроматографиий и вьісокоразрешающей хроматографии, как описано ниже.

Предпочтительно, если белок настоящего изобретения зкстрагируют из мочи человека, поскольку она существует в больших количествах, а позтому может бьіть использована в промьішленном производстве. Более с конкретно, настоящее изобретение относится к полипептиду, имеющему последовательность ЗЕОІО Мо 1,кего (3 солям, функциональньм производньм, предшественникам, активньм фракциям, а также к их активньм мутантам, т.е., к другим белкам или полипептидам, в которьїх одна или несколько аминокислот бьіли удалень, замещеньі другими аминокислотами, или добавленьі в целях получения полипептидов или белков, имеющих активность, аналогичную активности Компонента В: кроме того, настоящее изобретение также относится к с гибридньім белкам, т.е., полипептидам, содержащим Компонент В или его мутацию, лигированньй с другим «з белком, и имеющим более продолжительное время полужизни в физиологических жидкостях в организме.

Позтому, Компонент В кокет бьіть подвергнут слиянию с другим белком, например, таким, как иммуноглобулин. -

Термин "соли", используемьй в настоящем описаний, означает соли карбоксильньїх групп и соли Ге) функциональньїх аминогрупп соединении, синтезируемье известньми способами.

Зо Соли карбоксильньмх групп могут бьіть неорганическими солями, например, такими, как соли натрия, калия, и М кальция, а также солями, образованньми органическими основаниями, такими, как аминьі, например, тризтиламин, аргинин, или лизин. Соли аминогрупп могут представлять собой соли, образованнье неорганическими кислотами, такими, как соляная кислота, и органическими кислотами, такими, как уксусная « кислота. Термин "функциональнье производньюе", используемьй в настоящем описаний, относится к З 0 производньм, которье могут бьіть полученьї из функциональньх групп, присутствующих на боковьх цепях с аминокислотньїх остатков или на концевьх М - или С-группах, в соответствия с известньми методами; и з» которье входят в обьем настоящего изобретения в том случає, если они являются фармацевтически приемлемьі!ми, т.е., обладают активностью, аналогичной активности белка, или не наделяют фармацевтические композиции, содержащие указаннье производньве, токсическими свойствами.

Примерами таких производньх являются, например, сложнье зфирь или алифатические амидь е карбоксильньїх групп, и М-ацильньюе производнье свободньїх аминогрупп, О-ацильнье производнье свободньх

Ге»! гидроксильньх групп, а также производнье, образованнье ацильньми группами, например, алканосильньіми или ароильними группами. 7 Термин "предшественники" означает соединения, которье в организме человека или животного ав! 20 превращаются в Компонент В. Термин "активнье фракции" белка настоящего изобретения означаєт любой фрагмент или предшественник полипептидной цепи самого соединения, взятьій отдельно или в комбинации со о связанньіми с ним родственньіми молекулами или остатками, например, остатками сахароз или фосфатов, или агрегатьї полипептидной молекуль, при условии, что такие фрагменть! или предшественники как лекарственнье средства обладают активностью, аналогичной активности Компонента В. 25 Настоящее изобретение также относится к смеси полипептидов и производньхх, определенньх вьіше.

ГФ) Во втором варианте своего осуществления, настоящее изобретение относится к способу получения юю Компонента В, предусматривающему вьіделение сьірой фракции из диализованного концентрата мочи, после его обработки адсорбирующим агентом и очистки с помощью ионообменной хроматографий и вьісокоразрешающей хроматографии. 60 Компонент В предпочтительно получают способом, проиллюстрированньїм на рис. 1, и включающим в себя следующие стадии: а) адсорбция мочи при кислотном рН на каолине, и ее зкстракция аммиаком; в) злюирование фракции (а) на смоле Віо Кех 70 с использованием аммиака; с) злюирование фракции (в) на ОЕАЕ-Сефарозной смоле с использованием ацетатного буфера; бо а) злюирование фракции (с) на СМ-Сефарозной смоле с использованием ацетатного буфера;

е) злюирование фракции (4) на С18-смоле (ВЗЖХ) с использованием смеси ацетатного буфера и ацетонитрила;

У) злюирование фракции (е) на ОЕ-52-смоле с использованием ацетатного буфера; 9) злюирование фракции (Її) на О-7Перпуг-смоле с использованием ацетатного буфера;

Р) злюирование фракции (4) на С18-смоле (ВЗЖХ) с использованием смеси водной трифторуксусной кислотьі и ацетонитрила.

І) злюирование фракции (п) на О-пердуг-смоле с использованием ацетатного буфера.

Кроме того, настоящее изобретение относится к рекомбинантньм ДНК-молекулам, которье содержат 7/0 нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид настоящего изобретения, его активнье мутанть, или гибриднье белки; а также ок содержащим их векторам зкспрессии; ок клеткам-хозяевам, трансформированньм зтими векторами; и к способу получения указанньім полипептидов, их активньїх мутантов, или гибридньїх белков, путем культивирования указанньїх трансформированньїх клеток в соответствующей культуральной среде. Термін "рекомбинантнье ДНК-молекуль!" относится к геномной ДНК, кКДНК, синтетической 7/5. ДНК, и к комбинациям. В частности, настоящее изобретение относится к нулютидньм последовательностям, проиллюстрированньім в ЗЕО ІЮО Мо 2 и БЕО ІЮ Мо 3, соответственно.

ЗЕО ІЮ Мо 2 представляет собой геномную ДНК-последовательность, кодирующую Компонент В.

На рис. 2 показана рестрикционная карта транскрипционной единицьї Компонента В;

ЗЕО ІЮ Мо З представляет собой кКДНК-последовательность, кодирующую Компонент В;

На рис. 8 показана полная кДНК-последовательность, кодирующая Компонент В, в которой указань! сайть рестрикции. Клонирование Компонента В может бьіть осуществлено различньми способами. В одном из таких способов, получают олигонуклеотид или смесь нуклеотидов, последовательность которьїх, вбіведенную всходя из последовательности Компонента В или его фрагмента, используют в качестве зонда для клонирования кКДНК или геномной ДНК, кодирующей Компонент В. сч

ЗЕО ІЮ Мо 4 представляет собой аминокислотнье последовательности, кодируемье геномной ДНК (ЗЕО ІЮ

Мо 2) й КДНК (ЗЕО І Мо 3). і)

Настоящее изобретение также относится к рекомбинантньм ДНК-молекулам, которне гибридизируются с

ДНК-последовательностью, кодирующей Компонент В или его фрагмент.

Нужньйй ген может содержать или не содержать природнье интронь), и может бьіть получен, например, су зо путем зкстракции из соответствующих клеток с последующей очисткой известньми методами.

Соответствующие препаратьі ДНК, как человеческая геномная ДНК, разрезают подходящими способами, о предпочтительно с использованием рестриктирующих ферментов, и полученнье таким образом фрагменть! М. вводят в соответствующие рекомбинантнье векторь! для создания библиотеки ДНК. Указаннье векторь! могут бьть оотобрань с помощью синтетических олигонуклеотидньїх зондов в целях идентификации ісе) з5 последовательности, кодирующей Компонент В настоящего изобретения. «г

В соответствий с настоящим изобретением, геномную ДНК Компонента В вьіделяют и клонируют.

С другой сторонь, из клеток, зкспрессирующих Компонент В, может бьіть вьіделена соответствующая мРНК и использована для продуцирования комплентарной ДНК (кКДНК) известньми методами. Зта кДНК, после превращения в двойную спираль, может бьіть введена в соответствующий вектор, которьій затем используют « для трансформации подходящей клетки-хозяина. После зтого, культурь отбирают с использованием в с соответствующего зонда в целях получения кДНК, кодирующей целевье последовательности. После . вьіделения нужного клона, кДНК подвергают, в основном, таким ее манипуляциям, что и геномную ДНК. а КДНК не содержат интроньї. Из-за виірожденности генетического кода, могут бьіть использовань!і различнье кодонь, кодирующие конкретную аминокислоту, так, чтобьі продуцировался один или несколько олигонуклеотидов, каждьй из которьїх способен кодировать фрагменть! Компонента В. Однако, лишь один член ї5» зтого пула имеет нуклеотидную последовательность, идентичную последовательности данного гена.

Присутствие зтого члена в пуле и его способность гибридизироваться с ДНК также в присутствийи других членов

Ме. пула позволяет использовать группу нефракционированньїх олигонуклеотидов таким же образом, как один -І олигонуклеотид, которьій должен бьть использован для клонирования гена, кодирующего целевой пептид. Альтернативно, единственньій нуклеотид, содержащий последовательность, относительно которой можно о теоретически с найболее вьісокой степенью вероятности предположить, что она способна кодировать геннье

Ге фрагментьї Компонента В (согласно описанию, приведенному в "гцШевз їог Ни ве ої содопев" (правила использования кодонов") - 7а(Ше КК. Еї аї., Моїес.ВІд., 183:1 - 12 (1985)), позволяет идентифицировать комплементарную ДНК, кодирующую Компонент В или в его фрагмент.

Способьї гибридизации нуклеиновьїх кислот известнь! и описаньї в литературе (см., например, Мапіаїз Т. еї аі., Моїіесшаг Сіопіпд:; а 2арогагу Мапиа)Ї, Соїа. Зргіпд Нагрог Ргевзв, Сода. Зргіпд Нагрог, пу, 1982);

Ф) Наутез В.Т. еї аї., МисіІеіс Асіа НуБбгіділайоп; а РгасісаІ Арргоасі, КІ Ргевзв, Охіога, Епдіапа, (1985)). ка Гибридизация с о использованием указанного зонда или группьі нуклеотидньїх зондов позволяет идентифицировать в огеномной или кДНК-библиотеке ДНК-последовательности, способнье ок такой бор Гибридизации, которне после последующего анализа, подтверждали свою способность кодировать полипептид настоящего изобретения (те, Компонент В). Олигонуклеотид, содержащий такую комплементарную последовательность, может бьть синтезирован и использован в качестве зонда для идентификации и вьіделения гена полипептида настоящего изобретения т.е., Компонента В (Маниатис и др., см. вьіше).

После того, как соответствующий олигонуклеотид, специфичньій для Компонента В, будет отобран в б5 Соответствий с вьішеописанньм методом, он может бьть синтезирован и гибридизирован с ДНК, или, предпочтительно, с КДНК, происходящей от клеток, способньїх зкспрессировать нужньй ген, предпочтительно,

после обогащения источника кКДНК нужньіми последовательностями, например, путем зкстракции РНК из клеток, продуцирующих вьісокие уровни нужного гена, и последующего превращения зтой РНК в соответствующую

КДНК с использованием обратной транскриптазь.

Альтернативно, могут бьіть синтезировань! подходящие олигонуклеотидьі, специфичнье для Компонента В, и затем использованьі в качестве праймеров для амплификации кКДНК-фрагментов Компонента В с помощью

РАСЕ-РСК (М.А. Іппісег аІ,, ОСК Ргофосоїв А Уціде о Меїйподз апа Арріїсаноп, Асадетіс Ргезз, 1990).

В частности, в соответствий с настоящим изобретением, сначала, для идентификации наиболее подходящего источника для мРНК Компонента В, осуществляли поиск соответствующих тканей человека и 7/о клеточньїх линий. Для зтого скринировали ткани человека, пройсходящие из головного мозга, почек, печени, легких, сердца, поджелудочной железь, плаценть, селезенки, яичек, тимуса, и матки, а также клеточнье линий зпителисидной карциномьї, промиелоцитарного лейкоза, аденокарциномь! молочной железьі, лимфомь! Беркита и миеломь!.

Скрининг осуществляли с помощью чувствительного анализа, основанного на полимеразно-цепной реакции /5 5 использованием обратной транскриптазь (КТ-РСК).

Найлучшим источником мРНК оказались ткани матки человека.

Из зтой ткани, с использованием метода бьістрой амплификации, назьшваемого "бьістрой 3- и 5'-амплификацией кДНК-концов" получали кДНК-лоньї Компонента В.

Затем, ДНК-молекуль, кодирующие Компонент В, и полученнье вьшеуказанньм методом, вводят в 2о Ззкспрессирующие векторь! с использованием известной техники (Маниатис и др., см. вьиіше). Двухспиральную

КДНК лигируют в плазмиднье векторь! с помощью, например, метода, в котором используются синтетические

ДНК-адапторь, или с помощью метода, в котором проводится "связьівание по тупьім концам".

Для зкспрессии целевого белка, зкспрессирующий вектор должен также включать в себя специфические нуклеотиднье последовательности, содержащие информацию, необходимую для регулирования транскрипции с ов М трансляции ДНК, кодирующей нужньй белок, так, чтобьї могли осуществляться зкспрессия нужного гена й продуцирование белка. Сначала, для того, чтобьї осуществлялась транскрипция нужного гена, перед зтим геном і) должен бьть помещен промотор, которьій может распознаваться РНК-полимеразой, и с которьм зта полимераза связьівается, способствуя, тем самьм инициации транскрипции.

Многие из известньїх промоторов, "работающих" с различной степенью зффективности (сильнье промоторь! с зо М слабье промоторь), подразделяются на промоторь), используемье в прокариотических клетках, и на промоторьї, используемьсе в зукариотических клетках. о

Промоторь, которье используются в настоящем изобретении, могут бьть конститутивнь!ми ї- (нерегулируемьіми) промоторами, например, такими, как промотор Іпі лямбда-бактериофага, промотор Віа гена рд-лактамазь в рВК322, и промотор САТ гена хлорамфеникол-ацетилтрансферазьі рРКЗ25, и т.п., или ісе) 3з5 индуцибельньмми промоторами, например, такими, как промоторьії прокариотов, например, правьй и левьй «ф главнье промоторь! лямбда-бактериофага (РІ и Рг), промоторьї, ігр, гес А, Іас 7, Іас І, отрЕ и да! Е.СоїЇ или гибридньй промотор ігр-Іас, и т.п. Міс В.К., У.Іпа.Місгобіо!., 1:277 - 282 (1987)).

Для гарантий зффективной трансляции мРНК, необходимо, чтобьі вместе с сильньмми промоторами, способньми к продуцированию очень больших количеств МРНК, обеспечивающих вьісокие уровни зкспрессии « гена в прокариотических клетках, использовались также сайть! связьівания с рибосомами. В качествепримера 8) с могут служить последовательности ЗпІпе-Оаідапо (50), помещеннье на соответствующем расстоянии от й инициирующего кодона. "» Для зукариотических клеток-хозяев могут бьть использованьь различнье последовательности, регулирующие транскрипцию и трансляцию, в зависимости от природь! конкретного хозяийна.

Зти последовательности могут происходить от вирусньх источников, таких, как аденовирус, вирус ї» папиломь!, обезьяний вирус или т.п., где сигналь! регуляции ассоциируются со специфическим геном, имеющим вьісокий уровень зкспрессии.

Фо В качестве примеров могут служить промотор ТК вируса герпеса, промотор вируса ЗМ 40, промотор гена -І да!4 дрожжей, и т.п. Сигнальь инициация транскрипции могут бьїть вьібраньї таким образом, чтобь! при 5ор индуцировавши супрессий или активации можно бьло соответствующим образом модулировать зкспрессию о генов. з Затем ДНК-молекулу, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую Компонент В настоящего изобретения, вместе с сигнальньми последовательностями, регулирующими транскрипцию и трансляцию, вводят в вектор, которьій способен интегрировать последовательности целевого гена в хромосоме Кклетки-хозяина.

Клетки, несущие в своих хромосомах введенную ДНК, могут бьїть отобрань! путем введения одного или іФ) нескольких маркеров, позволяющих вьібрать клетки, которье содержат зкспрессирующий вектор. Такие ко маркерь! могут сообщать клеткам, например, резистентность к антибиотикам или к тяжель!м металлам (таким, как медь). Селективньй ген может бьть непосредственно связан с ДНК-последовательностями, которье бо должнь бьть зкспрессировань, или он может бьть введен в саму клетку путем констрасфекции. Для осуществления более вьісокой степени зкспрессии гена, может оказаться необходимьм также присутствие других злементов. Такими злементами могут бьіть, например, знхансерь! транскрипции, сигналь! терминации транскрипции, и интроньі. Зкспрессирующие векторьї, которье содержат такие злементь! описаньі ОкКауата Н,,

Мої. Сеї! Вісі. 3: 280 (1983). 65 При вьіборе конкретного плазмидного или вирусного вектора доленьі учитьшаться следующие факторь!: легкость обнаружения клеток, содержащих данньій вектор, т.е., зти клетки доленьі бьїть легко отделень! от клеток, не содержащих зтого вектора; число копий векторов, которнше Желательно получить в данном конкретном хозяине; и возможность или невозможность перенесения вектора среди различньїх клеток-хозяев.

Предпочтительньми прокариотическими векторами являются плазмидь), способнье реплицироваться в

Е.СоїІ, например, такие, как рВК322, СоІЕЇ, РБ С101, рАСУС 184 и т.п. (Мапіаїйз Т. и др., см. вьіше), плазмидь!

Васійив, например, такие как рС194, рС221, рТ127, и т.п. (Угусвап Т.М. Те Моїіесшіаг Віоіоду ої (пе ВасіШІ,

Асадетіс Ргевзв, ММ, 307-329 (1982)), плазмидь! Зігеріотусев, например, такие, как рі)101 (Кепааї! К.). еї аї.,

У.Васіегіої. 169:4177 - 83), плазмидьії Резепдотопаз (Чойп 3.ЕР. еї аії, Кем. Ішесі. ОіІв. 8:693 - 704 (1986) (Ідакі К.Ірп. І.Васіегіої!. 33:729 - 742). 70 Предпочтительньми зукариотическими векторами являются например, ВРМ, 5М40, бакуловирус, и т.п., или их производнье. Указаннье векторьі известньі специалистам (Вовісіп О. Еї аІ., Міаті УМпї Бутр. 19:265 - 274) (Вгоаспй Кк. Те Моїесцшіаг Віооду ої (Ше МУеаві Засспаготусев: 2Ме Сусіе апа Іппегіапсе, Со Збргіпд

Нагрог, МУ, 455 - 470 (1981) (Вгоасп У.К., Се 28:203 - 204 (1982)) (Войоп О.Р. еї аї.,, 9. СІп. Нетай)і.

Опса. 10:39 - 48 (1980)) (Мапіайвз Т. Се Вісїсду. А Срітргепепвзіме Тгеаїйзе моЇ. З: Мепе Ехргезвіоп, Асай. /5 Ртезв, МУ, 563 - 608 (1980)).

Полученньій знслрессирующий вектор вводят в соответствующую хозяйскую клетку стандартньми методами, такими, как трансформация, трансакция, липофекция, коньюгация, слияние протопластов, злектропорация, осаждение фосфатом кальция, прямое микроиньецирование, и т.п. В целях настоящего изобретения могут бьіть использованьі! прокариотические или зукариотические клетки-хозяева.

Предпочтительньми прокариоташ являются бактерии, такие, как Е.соїІ, ВасіІПйв, Зігеріотусез, рзепдотопаз, заІтопега, зетайна и т.п.

Особенно предпочтительной является Е.соїІ, например, штамм 294 Е.соїї К1І2 (АТСС 314446), или Е.сої

Х1776 (АТСС 31537), Е.сої! МУ3110 (Е, лямбда, АТСС 27325).

Предпочтительньми зукариотическими клетками-хозяевами являются клетки млекопитающих, например, с об Кклетки человека, обезьянь, мьіши, или хомяка (СНО, клетки яичника китайского хомячка), поскольку зти клетки обеспечивают посттрансляционную модификацию белковьх молекул, например, правильную укладку и і) гликозилирование в нужньїх положениях.

В целях настоящего изобретения могут бьіть также использованьі дрожжевье клетки. Благодаря имеющейся в настоящее время различной технике рекомбинантньїх ДНК, в которой используются последовательности с зо сильньїх промоторов и большое число копий плазмид, нужньй белок может бьіть продуцирован и в дрожжах.

После введения вектора в хозяйские клетки, зти клетки культивируют в среде, способствующей о селективному росту клеток, содержащих указанньй вектор. ї-

Зкспрессия клонированной ДНК-последовательности обеспечивает продуцирование Компонента В, его мутанта или фрагмента. Продуцированньй таким образом белок вьіделяют иди очищают традиционньми ісе) з5 Методами, например, путем зкстракции, осаждения, хроматографии, злектрофореза, и т.п. или путем «г аффинной хроматографии с использованием антител против Компонента В, иммобилизованньїх на колонке с гелем. Компонент В может бьть также продуцирован как белок, секретируемьй из молока трансгенньїх млекопитающих.

В еще одном своем варианте, настоящее изобретения относится к использованию Компонента В, его солей, «

Ффункциональньїх производньх, предшественников, или активньїх фракций в качестве лекарственного средства. в с В частности, Компонент В обладает противоспалительньми, антиокагулирующими, и противоопухолевьми свойствами. Кроме того, Компонент В может бьіть использован для лечения патологий, связанньїх с изменением ;» уровней ТОЕ-альфа (фактора роста Т-клетокю), например, поведенческих и гормональньїх растройств, антигенеза, и т.п.

На практике, бьіло показано, что Компонент В ингибирует связьвание ТОЕ-альфа с его рецептором с ї5» константой аффинности, составляющей К, - 0,77 х 10719М, и измеренной путем вьтеснения 1725 - ТОБг-альфа из его рецептора, полученного из мембрань! клеток А 431. б Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим терапевтически -І активное количество Компонента В в комбинации с фармацевтически приемлемьми наполнителями или разбавителями. Такие композиции могут бьїть полученьї для перрального, ректального, интраназального, и о предпочтительно для парентерального введения. з Кроме того, в соответствии с настоящим изобретением, Компонент В может бьіть использован для местного применения.

Композиции настоящего изобретения могут бьіть также изготовленьі в виде форм с пролонгированньм

ВьІсвобождением, например, в виде подкожньїх имплантатов, полученньїх на основе липосом или микрокапсул сополомеров молочной и гликолевой кислот. о Другие варианть! осуществления настоящего изобретения будут очевидньі из нижеследующего подробного ко описания изобретения на конкретньїх примерах.

Пример 1 во Способ получения компонента В из мочи человека

Получение и очистка компонента В из мочи человека полностью проиллюстрировань на ряс. 1. а) Стадия 1

К исходному материалу, представляющему собой мочу человека, добавляли соляную кислоту до тех пор, пока рН не становился равнь!м 3,0. После декантирования осадка, к моче (10г/1л исходной мочи) добавляли 65 каолин.

Полученную суспензию оставляли на 16 часов, а затем центрифугировали.

После удаления супернатанта, каолин зкстрагировали аммиаком 2М при рН - 11,0. рН аммиачного злюата доводили до 8,0 и концентрировали с помощью мембранной ультрафильтрации (отрезок 1000Да). Всю зту процедуру осуществляли при температуре 47.

Стадия 2

К раствору стадии (а) добавляли уксусную кислоту до тех пор, пока рН не становился равньм 4,0, а затем добавляли смолу Віо Кех 70, предварительно уравновешенную в ацетатном буфере при рН - 4,0.

Полученньй раствор оставляли для перемешивания на 4 часа, а затем фильтровали на фильтре-прессе.

Адсорбированньй материал злюировали из смоль! Віо Кех 70 с использованием аммиака при рН - 9,0. 70 Хроматографический злюат концентрировали с помощью мембранной ультрафильтрации (отрезок 1000Да).

Всю зту процедуру осуществляли при температуре 4"7С. с) Стадия З

Материал стадия (в), уравновешенньй в ацетатном буфере, при рН - 5,6, адсорбировали на ионообменной смоле, подобной ОБАЕ-Сефарозе, предварительно уравновешенной при рН - 5,6.

После адсорбции, злюированне осуществляли с использованием аммоний-ацетатного буфера 0,5М при рН - 5,6. Затем хроматографический злюат концентрировали с помощью мембранной ультрафильтрации (отрезок 1000Да). Всю зту процедуру осуществляли при 4"7С. 4) Стадия 4

Материал стадии (с) уравновешивали в ацетатном буфере при рН - 4,5 и адсорбировали на ионообменной смоле, подобной СМ-Сефарозе и предварительно уравновешенной при рН - 4,5.

После завершения адсорбции, злюирование осуществляли аммоний-ацетатньм буфером 0,15М при рН - 4,5. Хроматографический злюат концентрировали с помощью мембранной ультрафильтрации (отрезок 1000Да).

Всю зту процедуру осуществляй при температуре 47С. е) Стадия 5 сч

Материал стадии (4) очищали при температуре 25"С с помощью обращенно-фазозой жидкостной хроматографии вьісокого разрешения на смоле С18, уравновешенное в аммоний-ацетатном буфере 0,05М при і) рН - 5,6.

Адсорбированньй материал злюировали из смольй с использованием раствора ацетата аммония, содержащего 3090 (об/об) ацетонитрил. с зо Хроматографический злюат концентрировали путем дистилляции (4"С) в вакууме.

У Стадия 6 о

Материал стадии (е) очищали с использованием ионообменной скольі, подобной ОЕ-52, и уравновешенной в М аммоний-ацетатном буфере 0,02М при рН - 5,6.

Злюирование адсорбированного материала осуществляли с использованием 0,25М буфера. ісе)

Концентрирование осуществляли с помощью мембранной ультрафильтрации (отрезок 1000Да). Всю зту «Е процедуру проводили при температуре 47. 9) Стадия 7

Материал стадии (Її) очищали на колонке, предварительно упакованной ионообменной смолой, подобной

О-2ерпуг (отвержденной с помощью Зергасог), и уравновешенной при рН - 6,2 в 20мМ буферном растворе « ацетата натрия (буфер А). з с Злюирование абсорбированного материала осуществляли градиентом от 10095 буфера А до 10095 буферного раствора ацетата натрия, содержащего 1М Масі (при рН - 6,2). з п") Стадия 8

Материал стации (9) очищали с помощью обращенно-фазовой жидкостной хроматографии вьсокого разрешения на смоле С18 при температуре 2570. ї5» После завершения адсорбции, злюирование осуществляли линейньім градиентом смеси водного раствора 0,195 трифторуксусной кислоть! и ацетонитрила, подкисленного 0,195 трифтороуксусной кислотой.

Ме, Хроматографический злюат концентрировали путем дистилляции (45"С) в вакууме и лиофилизовали. -І І) Стадия 9

Повторяли стадию 7. В результате зтой процедурьі получали конечньій продукт, компонент В, в виде о аморфного белого порошка.

Ге Пример 2

Аналитическая характеризация Компонента В

В целях определения основньїх физико-химических характеристик Компонента В, полученньій очищенньй ов Материал из мочи человека подвергали следующей аналитической обработке. а) Аминокислотная последовательность (Ф, Аминокислотную последовательность Компонента В определяли в соответствии с методом Здмана. ка Анализ осуществляли с использованием секвенатора Арріїей Віозувіет, модель 477А в соответствии с инструкциейизготовителя. 60 Указанньїй анализ дает возможность идентифицировать аминокислотною последовательность Компонента В с 81 аминокислотньїм остатками, приведенньіми в ЗЕО ІЮ Мо 1. в) Определение молекулярной массь

Анализ осуществляли с помощью масс-спектроскопии злектронньім ударом (МО-ЗД), в результате чего бьіло установлено, что молекулярная масса составляет 8937 ,9Да. Зтот анализ вньіявил пять дисульфидньїх мостиков б5 М остаток в 8ОДа, относящийся к группе 50,4, связанной с Туг (39).

Пример З

Вьіделение геномной ДНК Компонента В человека

Библиотека геномной ДНК человека в лямбда-фаговом векторе ЕМВІ-3 5Рб/17 поставлялась фирмой

СіІопіесп (кат. Мо НІ 1067, 9.20 Мо 1221). Геномную ДНК зкстрагировали из плацентьі человека и частично переваривали ферментом За ЗА. Перед клонированием в ВатНі-сайт вектора ЕМВ-3 5рб/17, ДНК-фрагменть вьіделяли с использованием градиента сахарозьі, с получением фрагментов размером от 8 до 22КБ.

Среда для культивирования

Клетки Е.соїї К8О2, поставляемье ширмой Сіопіеспй (кат. Мо С1004-1) культивировали в ІВ-среде, дополненной 10ММ Мао5о» и 0,295 мальтозой (среда для культивирования). 70 Фаговую библиотеку разводили в 0,1М Масі, 8мМ Мо95О;, 50мМ Трис-СІ (рН 7,5) и 0,0195 'желатине (ЗМ).

ДНК-библиотеку культивировали на | В-чашках с 1,595 агаром. Верхняя агароза для культивирования библиотеки содержала 0,136М Масі, 0,695 агарозу, и 195 триптон (МегскК кат. Мо 7213).

С авнвдпяриджая 11 й 1096178).

Раствор А для промьівки З х 5ЗС, 0,195 505, мочевина, при различньїх концентрациях, в зависимости от типа зонда (НКР-олигонуклеотидь!) (см. ниже). я битмадаеюий!о 11111111

Гибридьії НКР-олиго/ДНК обнаруживали с помощью ЕсСІ -набора и зкспонировали с пленкой (НурепіІт ЕСІ. от фирмьї АтегеНат, кат. Мо РРМ 2106 и 2104, соответственно). 32р-Олигозондированнье фильтрь! обнаруживали путем зкспонирования с пленкой Дд-тах (Нурепіт р-тах, с 29 Атегзпат, кат. Мо РЕМ10). Ге)

Олигонуклеотидь!

Олигонуклеотидьі синтезировали с помощью автоматического синтезатора ДНК (АрріІей Вііозувіет мод. 392).

Олигонуклеитидьі очищали с помощью кассет ОРС (Арріей ВПозувіет кат. Мо 400771) или с помощью сч злектрофореза в денатурирующем полиакриламидном геле (ПААГ). о

Олигонуклеотидьі СВІ, СВ2 и СВЕХ2ІЇ, используемье в качестве зондов, модифицировали с помощью аминомодификатора ММТ-С12 (Сіопіесп кат. Мо 5206-1) в процедуре последнего цикла синтеза. т

Пероксидазу хрена (НКР, Воепгипдег кат. Мо 814393) коньюгировали с модифицированньм (со олигонуклеотидом в соответствии с описанием М. 5. Огдеа (Іпс. Ас. Кев. 16, 4937, 1988), используя 1,4-фенилендиизотиоцианат (Аїагісй, кат. Мо 25855-5) в качестве гомобифункционального кросслинкера. З

НКР-Олигонуклеотиднье зондь! очищали с помощью анионообменной хроматографии вьісокого разрешения (ВЖХР) на колонке с Мисіеорас РА-100 (ОіІопех кат. Мо 043010).

Затем осуществляли злюирование 20мММ буферньім раствором фосфата натрия при рН - 6,0 к линейньім « градиентом хлорида натрия (от 0,2М до 1,0М) в течение 30 минут. З т0 Очищеннье НКР-олигонуклеотидьі концентрировали с помощью Сепігісоп 10, промьівали с фосфатно-буферньїм раствором (РВ5), и хранили в темноте при 47С. :з» Концентрацию НЕКР-олигонулкотида вьічисляли при ОНдоо (Едоз - 89,5см"! х мМ).

Затем синтезировали следующие олигонуклеотидь!:

ЧК» (22) -І о 50

Ко)

Ф) іме) 60 б5 олиго последовательность мишень оііво - зедчепсе сагвес промотор

СВРІ1 х"ТОАСТСАСЗСООССОСТТСТ ргошосег 5ЕО І0 МО: 5 промотор

ПВ СВРСІ х"САбССАТОоТоСАСТОСТОСТ рсошосег 5ЕО І0 МО: 6 зкзон Ї

СВЕХ2, 00 З'АССАСАССССАТОСТОСА ехоп 1 ЗЕО І0 МО: 7 сві 57 ТОСАСОААССАСТОСТСАТ ЗЕВом 2 5ЗЕФ І МО: 8 2 70 сва 5'ТСТОССТТОСАССОбСТААТОСТ Зкзон, ЗЕ ІЮ МО: 9 кон о сві 5'АТбАССАСТОСТТОСТОС Зк8о 2 ЗЕО Ір МО: 10 й интрон о с85 З'АТСССАССТОСТОССТТІТТа іпсгоп 2 ЗЕ0О І0 МО: 11 й интрон 2 5 СВЕХНЦ2 5'СОСбОСТооОАОСАСТ іптїгоп 2 5Е9О І НО; 12 й й с. Зкзон З 15 СБЕ1 Б'АТОСААТТСТАХССАТТУААУСАНТС ехоп 3 ЗЕО ІВ МО: 13

СВЕ2 Б'АТООААТТСТАХССАТТТААУСАВАС ЗКЯЮН ОЗ БО го Мо: 14

Окзон З свВі Б'СТАСААТТСОСОССААТОСАВТОМОСКТС ехоп 3 5Е0 І0 МО: 15

Здкзон З свд2 З'СТАБААТТСОСОССААТОСТНТСМОСНІС ехоп 3 ЗЕО ІЮ МО: 16

Зкзон З

СВЕХШІ 5'АОТАССССТТСЛАССАСАО ехоп 3 ЗЕО ІЮ МО: 17

Зквон З

СВЕХЧЬ 0 5'САСАСАССАТСАСТОАОСТО ехоп 3 5БО І0 МО; 18

Окзон З

СВЕХЦО1 5'ЄАСАССТОСТСТОТбАСоа ехоп 3 ЗЕО ІО МО: 19

СВЕХЧЬІ 5'ССАСТТСТОТАСОСТОТСАСТ Зквон З ЗЕО І МО: 20 где и

Те ге Но А-О., Х 2 С-Т о впа Моз А-6-С-Т. с щі 6)

Титрование библиотеки

Геномную ДНК-библиотеку человека титровали в соответствий со стандартньми процедурами (Р, А!йзгирбвеї, с

Ситепі Ргоїосоїв Іп Моіесшаг ВіІоіоду) путем инфицирования 0,Змл культурь! клеток Е.сої! КВО2, вьідержанной в о течение ночи, различньми разведениями библиотеки, в пределах от 2 х 10 З до 2 х 10-7, Смесь клеток библиотеки инкубировали при комнатной температуре в течение 20 минут, а затем в течение 10 минут смесь - инкубировали при 37"С. МИнфицированнье клетки смешивали с 4 миллилитрами верхней агарозь, «о предварительно нагретой при температуре 502С, а затем вьіливали в 1Осм-планшеть с агаром, предварительно «

Зо нагретом при 37"С. Зти планшеть! инкубировали в течение ночи при температуре 3770.

Число бляшек подсчитьівали в каждом планшете. Планшеть! с дубликатами культурьї получали для каждого титра библиотеки.

Как зто ожидалось, титр геномной ДНК-библиотеки составлял 5 х 109БОЕ/мл. «

Скринирование библиотеки з о - с Плетки Е.соїЇ К802 культивировали в течение ночи при температуре 37"С. 0,6 мл клеточной культурь инфицировали аликвотой библиотеки (6 х 10"БОЕ), суспендированной в СМ Инфицирование и культивированиеє и - ит осуществляли вьішеописанньмм способом, за исключением того, что использовали Умл верхней агарозь и 15см-планшеть.

Полуконфлюзнтнье бляшки переносили на найлоновую мембрану Нубопа М" (Атегезпат) в соответствий с «їз» инструкцией руководства фирмь! Атегепат.

Ф Блотированнье ДНК денатурировали путем наложения фильтров, колониями, кверху, на фильтровальную бумагу, пропитанную 1,5М-хлоридом натрия и 0,5М-гидроксидом натрия, на 7 минут. -І Затем блотированнье ДНК нейтрализовали путем наложения фильтров на фильтровальную бумагу, 5ор пропитанную нейтрализующим раствором (1,5М Масі, 0,5М Трис-СІ (рН 7,2), 1мМ ЗДТА)) (в каждом случає, 2 о ХОЗ мин). з Фильтрьі промьівали в 2 х З5С и осушали воздухом. ДНК закрепляли на мембране путем наложения фильтров на фильтровальную бумагу, погруженную в 0,4М Маон, на 20 минут.

После зтого фильтрь! промьівали в 5 х З55С в течение одной минуть, а затем хранили в полизтиленовом мешке при 42С вплоть до гибридизации. Человеческую геномную ДНК-библиотеку (1 х 105 клонов) скринировали о с вьісокой плотностью, с использованием олигонуклеотидньїх зондов НКР-СВ2. Затем бьіли вьібрань! 20 положительньх клонов. іме) Шесть положительньх клонов повторно скринировали с использованием олигонуклеотидного зонда

НАР-СВІ и олигонуклеотидного зонда НКР-СВ2. Три клона, обозначенньсе 40), 128 и 15, били подтверждень как 60 положительнье в отношений гена компонента В.

Гибридизация

Фильтрь! предварительно инкубировали в течение 30 минут при 42"С в гибридизирующем растворе, а затем гибридизировали с использованием соответствующего олигонуклеотидного зонда НКР /(5нг/мл олигонуклеотидной части в гибридизирущем растворе), при температуре 42"С в течение 45 минут, и наконец, 65 дваждь промьівали (по 15 минут каждьй) при температуре 42"С в прорьвающем растворе, содержащем мочевину в соответствующей концентрации (см. ниже).

Затем фильтрьі промьшали в 2 х З5С при комнатной температуре, а гибридизированнье бляшки обнаруживали с помощью ЕСІ -реагентов и зкспонировали с пленкой НурепіЇт в течение 60 минут.

Для минимизации неспецифической гибридизации с Е.соїЇ и ДНК лямбда-фага бьіли зкспериментально определеньі условия промьівки для НЕКР-олигозондированньїх фильтров. Серийнье разведения в пределах от

БОО до 15 аттомолей целевой ДНК бьли нанесеньй пятнами на мембрану Нуропі М в присутствий. ДНК лямбда-фага (1Онг). ДНК лямбда-фага и ДНК Е.сої! (1Онг каждая) бьіли использовань! в качестве негативного контроля. После зтого получали несколько полосок и использовали их в зкспериментах для гибридизации с использованием 5нг/мл олигонуклеотидного зонда. Промьівку осуществляли с использованием промьівочного 70 раствора А, содержащего 095, 990, 18905, 279090 и Збуо-ную мочевину. 182956 и 2795 мочевина ооказалась зффективной для СВ! и СВ2, соответственно. Фильтрь, гибридизированнье с использованием СВЕХ2І, промьвки промьівочньмм раствором А, содержащим 1895 мочевину.

Гибридизацию с использованием З2Р-олинонуклеотида СВЕХ4 осуществляли при 507С, а фильтрь 75 промьівали в промьівочном растворе В при температуре 4576.

Субскринирование бляшек

Позитивнье колонньії собирали в Пастеровскую пипетку и переносили в сосуд, содержащий Імл СМ «1 каплю хлороформа. После 2-часовой инкубации при встряхивания при комнатной температуре, суспензия фага хранилась при 47.

Разведениє 1073 суспензии фага наносили на 1Осм-платьь и рескринировали на двух повторяющихся фильтрах с двумя олигозондами, т.е. один используется в первом скрининге, а другой соответствует примьікающему району компонента В.

Независимье клонь, позитивньсе с обоими зондами, бьіли отобрань и ресуспендировань как указано вьіше.

Приготовление фаговьїх стоков с

Позитивнье клоньі! бьіли размноженьі инфекцией клеток Е.соїЇ К802 и вьіращиванием на 15см-агаровьїх о платах. После инкубации в срезе ОМ при 37", сливающийся лизат бьл собран с агаровьх плат с использованием ЛОмл ЗМ. Бьіли добавленьй несколько капель хлороформа, клеточньй дебрис удален центрифугированием при З00боб/мин в течение 5мин при 4"С и прозрачньїй супернатант, содержащий фаг, бьіл перенесен в 509595 глицерин, разлит на части и заморожен при -807С. с

Зкстракция фаговой ДНК 2 х 109 клеток Е.соїЇ КВО2 бьли инфицированьі отобранньм фаговьм клоном о (соотношение клетка/фаг 4:1) и вніращеньї в 100мл жидкой культуральной средьі ОМ при 37"С.

В конце инкубации осуществлялся полньїй лизис клеток добавлением к культуре хлороформа 5мкл/мл. -

Фаговая ДНК зкстрагировалась с помощью Оціадеп по инструкции изготовителя. Ге

Секвенирование фаговой ДНК

Зо Фаговая ДНК бьіла секвенирована с помощью циклического секвенирующего набора от Арріїей Віозувіет « (саї. Мо 401388) с автоматическим секвенатором ДНК (АрріІей Віозувіет мод. 37ЗА). ДІЖ фага зкстрагировали из кленов 40), 12В и 15, и секвенировали циклами.

Праймерь! для секвенирования подбирали либо исходя из аминокислотной последовательности Компонента «

В (СВЕТ, СВЕ2, СВРІ, СВР2), либо исходя из данньїх секвенирования кКДНК или геномной ДНК. Даннье секвенирования указьівали на три клона, содержащих полную длину гена Компонента В. З с Анализ рестрикции фаговой ДНК "» Фаговую ДНК подвергали однократному или многократному перевариванию рестриктирующим ферментом. " ДНК-фрагментьі разделяли с помощью злектрофореза на 0,695 агарозном геле, а затем блотировали на мембрану Нубопа М".

Фильтрьі повторно зондировали с использованием олигонуклеотидов СВЕХ2І , СВ2, и СВЕХАЇ, ве соответствующих зкзонам 1, 2 и З, соответственно.

Ге») Субклонирование гена Компонента В в ррішезсгірі 11 ЗК.

Рестрикционньй анализ клона 40 Компонента В, проведенньій с использованием ферментов ЕсоК1, Хпої и і ЗП, и Саузернблот-анализ, проведенньій с использованием олигонуклеотидньїх зондов, специфичньїх для трех ав | 20 зкзонов Компонента В, обнаруживали наличие полного гена Компонента В, содержащего 5,2КЬ Есок1-фермент (Рис. 5). о Фаговую ДНК зкстрагировали из клона 40) и переваривали ферментом ЕсоК1. Полученнье ДНК-фрагменть! разделяли с помощью злектрофореза на агарозном геле. 5,2Кр-фрагент очищали с помощью Оцаех (діасеп, кат.

Мо 20020) и лигировали в Есок1-линеаризованньй рВіцезсгірі 11 КС (Зігатадепе кат. Мо 212207). Штамм Е.сої! 25 ХИ-Віце (Зігагадепе кат. Мо 200268) трансформировали с использованием лигирующей смеси, а

ГФ) трансформированньсе клетки отбирали на Ар/Гс-чашках. Как показал рестрикционньіїй анализ с использованием фермента ЕсокК/, бьл вьіделен один клон, содержащий нужную плазмиду, которьй бьіл назван рв5 СВ40. о Затем осуществляли рестрикционньїй анализ с использованием Зтаї!, Крп1, НІпа111, БИ, Асс1, Мой, За11,

Хпо1, ЕсокК, Сіа1, Ніпс111, НіІпа11, Зса!, Во1 11, Аа, Мсо1, Мпе1, Нраї! и Міш1. Кроме того, осуществляли 60 Саузерн-блот-анализ с использованием олигонуклеотидньїх зондов, специфичньїх для Компонента В и плазмидьі рВ5 СВ40 после однократного и двойного переваривания.

На рис. 6 показана рестрикционная карта плазмидьі рВ5 СВ40.

На рис. 4 показана рестрикционная карта гена Компонента В. Ген Компонента В содержит З зкзона, разделенньсе друг от друга двумя нитронами. Зти зкзоньї фланкнрованьі соответствующими сайтами. бо Зкзон 1, имеющий длину 84п.0о., содержит 26 нулеотидов нетранслированной мРНК, и последовательность,

кодирующую 19 аминокислот предполагаемого сигнального пептида. Зтот зкзон отделен от зкзона 2 интроном, длина которого составляет 410п.о.

Зкзон 2, имеющий длину 120п.о., кодирует З аминокислоть! предполагаемого сигнального пептида и 37 аминокислот зрелого белка. Зтот зкзон отделен от зкзона З интроном, длина которого составляет около 550п.0.

Зкзон 3, имеющий длину 326бп.о., кодирует С-концевье 44 аминокислотьі Компонента В, и содержит 192 нуклеотида нетранслируемой мРНК, которая имеет сигнал полиаденилирования (ТАТААА), расположенньй на расстояний 14п.о("вверх по течению") от сайта 3'і-процессинга, к концу которого добавляется роїуА-хвост.

В частности, бьіло установлено, что в трех геномньїх клонах, последовательность, кодирующая сигнальньй 7/0 пептид, содержит кодон І еи в положений 11 предполагаємого сигнального пептида.

Бьіло установлено, что аминокислотная последовательность Компонента В, продуцированная геномньм геном, идентичная последовательности, зкспериментально определенной методом расщепления по Здману.

Анализ последовательности, расположенной перед зкзоном 1, вьіявил промоторную область (Рис. 3), содержащую ТАТА-блок (в-28), и различнье, расположеннье "вверх по течению" злементь! промотора и /5 знхансерь,, включая осС-богатьй участок в-58, АР-1-сайт в-83, АР-2-сайт в-360, и несколько Е-блоков, ТАТА-блок является предпочтительньїм сайтом связьівания для инициации транскрипции фактора ТЕ111.

СС-богатьй участок представляет собой сайт связьшания для 5р-1, главного фактора транскрипции, участвующего в транскрипции широкого ряда генов (Тгапзсгірноп апа ЗріїсІпдо, В.О. Натез 5 О.М. Сіомег Зав.,

ІК. Ргезв, 1988).

АР-1-сайт является сайтом связьівания для АР-1, комплекса факторов транскрипции, образованного с-їс8 и с-їдп. АР-1-сайт присутствует в нескольких генах, ответственньїх за рост и дифференцировку клеток. АР-1 является одним из нескольких сіз-злементов, опосредующих ответную реакцию по отношению к активаторам протеинкиназь С (Те погтопаї сопігої ої депейгапзсгіоПйоп Р. Сопеп 8 9.0. РоціКез Епа ЕкКеїгіг, 1991).

АР-2-сайт является мишенью для АР-2, фактора транскрипции, активированного РМА и сАМР (Шает). сч

Е-блоки являются обобщающие последовательностями, обнаруженньми в нескольких знхансерньх областях, и играют важную роль для определения тканеспецифической зкспрессии генов, Е-блок содержит і) последовательность САММТО, где два основания, расположеннье в середине, могут меняться для каждого конкретного Е-блока. (К.Е. І Іпдвіоп Сигепі Оріпіоп Сеї! Віої. 1989; 1, 1081 - 1087).

Промотор Компонента Б содержит потенциальньй восприимчивьій злемент для рецептора фактора с зо глюкокортикоидной реакции (ЗРЕ) что указьшаєт на то, что ген Компонента В может бьіть индуцирован глюкокортикоидами. о

Субклонирование гена Компонента В в вектор для зкспрессии в клетках млекопитающих ї-

Известно, что продуцирование гес-белкююов в клетках млекопитающих может бьіть увеличено благодаря присутствию нитронов. Геномная ДНК Компонента В может бьіть зкспрессирована в клетках млекопитающих. ісе)

Для зтого, 1364п.о. - фрагмент, простирающийся от 450 до 1413 гена Компонента В, вньірезали из плазмидь! «Е р СВ4О0 путем переваривания ферментами Рми 11 и Маг 1. На рис. 2 показана рестрикционная карта транскриптона Компонента В, где Рми 11- и Маг 1-сайтьї расположеньі по концам. Полньій ген Компонента В восстанавливали путем датирования зтого фрагмента с синтетическим олигонуклеотидом, воспроизводящим 5-конец гена, фланкированного соответствующим рестрикционньм сайтом для последующего клонирования « гена в зукариотической зкспресирующей плазмиде. в с Пример 4

Вьіделение кКДНК-клонов Компонента В ;» Для получения частичньїх кКДНК-клонов, соответствующих 5'- и 3-концам мРНК Компонента В использовали способ бьістрой амплификации кДНК-концов, описанной Егоптап еї аї., (1988) Ргос. Май. Асад. Зсі., ОБА 85; 8998. Частичнье клоньі содержат перекривающуюся ДНК-последовательность, а позтому, они могут бьіть ї5» использованьї для конструирования полной кКДНК-последовательности Компонента В. Схема, иллюстрирующая общую стратегию для РАСЕ-клонированля, показана на рис. 7.

Ме. В 3-РАСЕ, ДНК-последовательность второго зкзона гена Компонента В использовали для конструирования -І генного специфического праймера СКСВ1 (-ТСААСТОСТАСАССТОССААССАС-3) (ЗЕО ІЮ Мо 21). Синтез КДНК мМнициировали от роїу А-конца роїу А" РНК матки человека с использованием в качестве праймера о одигонуклеотид 5-СОССАООСОТСОАСТОТАСТТТТТТТТТТТТТТТТТ-3" (зед ІдмМо 24), назьіваемьй адапторньм

Кз праймером АР. кДнк использовали в качестве матриць! для полимеразно-цепной реакции (РСК), где в качестве праймеров использовали СКСВІ и АР, которье продуцировали фрагмент, имеющий приблизительно 450п.0., и Ссоответствующий З3'-концу КДНК Компонента В.

В 5-РАСЕ, из ДНК-последовательности 450п.о. 3-РАСЕ-фрагмента конструировали праймер СКСВ7

Ф, (5-ССТСАСАСАСсОАОоСТС-3) (5БЕО ІЮ Мо 22), которьій использовали в качестве праймера для синтеза кКДНК из ко рої А- РНК матки человека. После очистки в целях удаления мРНК и праймера СКСВ7, конец олигодезоксицитидана добавляли к 3-концу КДНК. Зту кКДНК с "хвостом" использовали в качестве матриць в 60 РСК, где в качестве праймеров служили "гнездовой" праймер СКСВ2 (5'АСССТСАССАССОТтОоОТО-3) (ЗЕО ІЮ

Мо 23) и "якорньій" праймер (АСР, 5-СТАСТАСТАСТАВОССАСОСОТСОАСТАСТАСООСИООСПОССПО-3) (5ЕО

ІО Мо 25), или смесь АСР и унийверсального праймера амплификации (ПАР, 5-СТАСТАСТАСТАВОССАСОСОТСОАСТАСТАС-3) (ЗЕБЕО ОО Мо 26). СКСВ2 гибридизировали с 3-концов последовательности второго зкзона а АСР гибридизировали с олигодезоксицитидиновьм "хвостом". В 65 результате получали фрагмент приблизительно в 230п.о., которьій содержал ДНК-последовательность, соответствующую 5-концу ИРНК Компонента В.

Используемье общие схемь! зксперимента (например, злектрофорез в полиакриламидном геле, осаждение зтанолом, лигирование, и переваривание рестриктирующими зндонуклеазами), бактериальнье культуральнье средьі (например, ІВ), и химические растворь! (например, фенол) подробно описаньі ЗатрбгоокК ег аї., (1989)

Моїіесшіаг Сіопіпу: А І арогаїогу Мапиаї, 2па ед., Соїа Зргіпд Нагрог І арогаїогу Ргез5, Мем/ МогК, если зто не указано особо.

Процедурьі З КАСЕ-клонирозания

З КАСЕ - система для бьістрой амплификации кДНК-концов бьіла закуплена у І Ме Тесппоіодіез, Іпс., Угапа

ІвіІапа, МУ, Роїу А"-РНК матки человека закупали у Сіопіесі! І арогайогіев, Іпс., Раю Айо, СА. Синтез первой 70 нити КДНК осуществляли с использованием протокола и реагентов, составляемьх вместе с 3-КАСЕ-системой.

Для зтого, мкл (1мкг) роїу А"-РНК матки обьєединяли с мкл 10мкМ раствора АР и 12мкл водьі, обработанной дизтилпирокарбонатом (ДЕРС), и полученную смесь нагревали 10 минут до 65"С. После охлаждения смеси на льду, реакционнье компоненть! добавляли так, чтобь! конечная композиция имела приблизительно следующий состав: 20мММ Трис-КСІ (рН 8,4, 50мММ КСІ, 2,5мМ КСІ, 2,5мМ Маосі», 100мкг-мл альбумина бьічьей сьіворотки, 75 Б5ООНМ АР, 500мкМ каждого из АТР, асСтР, асте и аттР, и 5онг/мкл РНК, в обьеме 19мкл). Реакционную смесь нагревали до 422С, а затем добавляли 1мкл (20ед) обратной транскриптазь! Зирег Зсагірі. После З0-минутного инкубирования при 42"С, реакционную смесь охлаждали на льду, и добавляли мкл (2ед.) РНКазь ІІ. Затеьі проводили РНкКаза ІІ-переваривание в течение 1Оминут при 4222. Полученную реакционную смесь хранили при -207С вплоть до осуществления РОК.

Для осуществления РСК, бьіли полученьі четное идентичнье смеси (40мкл), каждая из которьїх имела следующий состав: їмкл роїу А? к ДНК матки в 40мМ КСІ, 70мМ Трис-НСЇ (рН 8,8) 0,195 Тритон Х-100, 1мМ

Мас», 0,25мкМ СКСВІ, и О0,5мкМ АР. Реагентьі из 3-КАСЕ-системь! не использовалась для РОК. СКСВ1- и

АР-праймерь! синтезировали на олигонуклеотидном синтезаторе модели 392 (Арріїєд Віозузіетв, Іпс.). После разблокирования, лиофилизации, и ресуспендирования в ЮСЕРС-обработанной воде, измеряли оптическую с 29 плотность каждого раствора при длине волньії 2бОнм. МЙИсходя из измерений оптической плотности, в Ге)

ОЕРС-обработанной воде приготавливали 1ОмкМ-раствор каждого из олигонуклеотидов. Неочищеннье олигонуклеотиднье растворьі использовали для РСК-реакции без дополнительной очистки. Концентрацию неочищенного АР, которьій давал результатьї, идентичнье результатам, полученьм с использованием 3

КАСЕ-системь), определяли зкспериментально: 0,4мМкМ о неочищенного АР зквивалентньь 0,2мМкМ АР, с закупленного у І Ме Тесппоіодіез для РСОК-реакции. о 40О0мкл РСК-реакционной смеси нагревали в термоячейке до температурь! 947"С, а затей к каждой смеси добавляли 1Омкл смеси, содержащей следующие компоненть!: 1,25ед. ДНК-полимеразьі Атрі!Тад (Репіп ЕІтег -

Сегив, Могмаїк, СТ), 40мМ КСІ, 70мММ Трис-НСЇ (рН 8,8), 0,195 Тритон-Х-100, мМ Маосі», и 1мМ каждого из АТР, (Се) аттР,астре и астР.

Конечная концентрация каждого реагента в РСР составляла приблизительно їмкл кКДНК матки на 5Омкл, З 1,25ед. ДНК-полимеразьї АтріїТад на 5Омкл; 40мМ КС, 70мММ Трис-НСІ (рн 8,8), 0,195 Тритон-Х-100, 1мММ

МасСІ», и 0,2мМ СКСВІ, О4мкМ АР, 0,2 каждого из аАТР, аттТР, астР и астрР. После завершения 5-минутного инкубирования при 947С, осуществляли программу термоциклической РСК "Тоиспдом/уп" в соответствии с « описанием ЮОоп К.Н., Сох Р.Т., МаІпмтідні В.)., ВаКег К, 5 Майтск 9.5. (1991) Мисі. Асідз Кев. 19, 4008, З т0 варьируя температуру отжига от 739 до 63об. с После РСК-ампилификации, четьіре реакционньїх смеси обьединяли, и ДНК-продукть! фракционировали по :з» размерах с помощью злектрофореза на 595 полиакриламидном сгеле. ДНК-продукт, имеющий длину приблизительно 450п.о., вьірезали из геля, и очищали путем злектрозлюирования в диализной трубке. Злюат зкстрагировали смесью фенола и хлороформа (50:50, об/0б) осаждали зтанолом, осушали, и їз 15 ресуспендировади в 1О0мкл стерильной водь.

Вследствие независимой от матриць! концевой трансферазной активности ДНК-полимеразь! Тад, и ее в (о) вьісокой степени избирательности по отношению аАТР (Сіагк У.М. (1988) Мисі. Асідз Кев. 16, 9677, и Моїе 5.Е., -1 Іддо К.О. б Іае О.Р. (1989) Мисі. Асіаз Кевз. 17, 3319), очищенньій РСК-фрагмент в 450п.о., имел, как и ожидалось, один дезоксиаденозиновьій остаток у каждого 3-конца. Для субклонирования и характеризации (ав) 50 РСЕ-фрагмента, получали "Т-вектор рВішезсгірізК (Зігаїадепе, а доМа, СА) в соответствий с описанием

Магсдик и др., (1991) Мисі. Асіаз Кев. 19, 1154. Плазмиду рВішезсгірі (20мкг) переваривали рестриктирующей

Ко) - о зндонуклеазой ЕсокКУ, а затем очищали путем зкстракции смесью (50:50, об/об) фенола и хлороформа. После осаждения зтанолом, ДНК обрабатьшвали 9 единицами Тад-ДНК-полимеразь! в течение 2 часов при 709С в 5 5Омкл реакции, содержащей 50мММ КСІ, 10мМ Трис-НСЇ (рН 9,0), 0,196 Тритон-Х-100, 1,5мММ Масі», и 2мм аттр.

После зтого вектор снова очищали путем зкстракций фенолом и хлороформом (50:50, об/об), и осаждали (Ф) зтанолом. Результатом зтой процедурь! бьіло добавление одиночного дезокситимидинового остатка к каждому з З-концу, что позволяло использовать зтот вектор для инсерции ДНК-фрагментов, синтезированньмх посредством Тад-ДНК-полимеразь. во Нефосфорилированньій РСК-фрагмент в 450п.о. вставляли в Т-вектор посредством реакции с ДНК-дигазой

Т4 Мем Епдіапа Віоїаб5, Вемепу, МА), используя условия, рекомендуемье изготовителем. Лигирующую реакционную смесь инкубировали приблизительно 72 часа при 16"С, а затем использовали для трансформации компетентньїх клеток ХІІ-Віце Е.сої! (Зігаїадепе, а МоМа, СА), Трансформированньое клетки вьісеивали на

ЇВ-агар, содержащий Б5Омкг/мл ампицилина. Перед посевом клеток, на поверхность агара каждой чашки наносили путем распьіления 1ООмкл 295 Х-да! (Ме Тесппоіодіеєз Іпс., Угапа Івіапа, МУ), и 4О0мкл 100мММ ІРТО б5 (бе Тесппоіодіез, Іпс., Угапа Ізіапа, МУ) и оставляли для осушки. После инкубирования в течение ночи при

372С, били видньї колонии, окрашеннье голубьім пигментом, и неокрашеннье колоний (белье). Из культур с 12 бельми колониями вьіделяли плазмидную ДНК. Все 12 изолятов содержали вставку в 450п.о. Для последующего анализа вьібирали 5 клонов: ЗСВ4, ЗСВб, З3СВ7, ЗСВ8 и ЗСВО. Анализ ДНК-последовательности проводили с использованием секвеназного набора "Зедцепазе мегзіоп 2,0" (Опіеа 5іаіез ВІоспетісаї, СіІемеїіапа,

ОПО).

Процедура 5-КАСЕ-клонирования 5-КАСЕ-систему для бьістрой амплификации кДНК-концов закупали у І Ме Тесппоіодіев, Іпс., Угапа Ізіапа, МУ

Ро А" РНК матки человека закупали у Сіопіесп Іарогайгієвх, Раю айо, СА. Зксперименть! по 70 5-КАСЕ-клонированию осуществляли с использованием протокола и реагентов, поставляемьх вместе с 5-КАСЕ-системой, за исключением того, что: (а) СКСВ7-, АСР- и ШАР-праймерь синтезировали на олигонуклеотидном синтезаторе модели 392, АррПей Віозувіет, Іпс. и использовали как описано для

З-КАСЕ-клонирования; и (в) термоциклическую программу РСК "Роцспдом/п", оописанную для

З3-КАСЕ-клонирования использовали для кДНК-амплификации. 15 Первую нить кКДНК синтезировали следующим образом: 1мкл (1мкг) роїу А" РНК матки обьєдиняли с 0,5мкл 10мММ раствора СКСВ?7 и 13,5мкл ОЕРС-обработанной водь, и полученную смесь нагревали при 707С в течение минут. После охлаждения смеси на льду, добавляли реакционнье компоненть, так, чтобьї конечньіїй состав приблизительно содержал: 20НМ ТРИС-НСЇІ (рН 8,4) 5ОмММ КСІ, ЗммМ Масі», томмМ ОтТТт, 200мм СКСВ7, 400мкМ каждого из дАТР, астР, астрР, и аттР, и 4Онг/мкл РНК, в обьеме 24мкл. Реакционную смесь нагревали до 427С, и добавляли мкл (220ед), обратной транснриптазьі, Зирегзсагірі І. После З0-минутного инкубирования при 422С, и 15-минутного инкубирования при 702С, реакционную смесь помещали в условия 55"С, и добавляли мкл (2ед). РНказь ІІ. Переваривание РНКазой ІІ осуществляли в течение 10 минут при температуре 5520.

КДНК отделяли от неключенньїх ОМТРз, СКСВ7, и белков с использованием Міаззтах ОМА Іаоіайоп ріп

Сагпгідде (входящего в 5-КАСЕ-систему). В частности, 120мкл раствора для связьввания (ЄМ Маї) добавляли к с 29 реакционной смеси первой нити, и кКДНК Ма! раствор переносили в центрифужную пробирку СІА55 МАХ. После ге) центрифугирования при 13000 х д в течение 20сек., добавляли 0,4мл холодного (422) промьівочного буфера.

Затем центрифуговали еще 2Осек. при 13000 х д. Зту стадию повторяли еще два раза. После двухкратной промьівки 400мкл холодного (47С) 70905 зтанола, КДНК злюировали путем добавления в центрифужную пробирку

БОмкл стерилизованной дистиллированной водьі, после чего центрифугировали еще 20 секунд при 13000 х 9. с

Гомополимерньй "хвості добавляли ко 3-концу КДНК со использованием / терминальной ав! дезоксинуклеотидилтрансферазь (тат) и астТР. Зту реакцию осуществляли в РСК-совместимом буфере. 10мкл очищено кДНК обьединяли с 7,5мкл ОЕРС-обработанной водь, 2,5мкл 10 х реакционного буфера, 1,5мкл 25мММ - раствора МосСі», и 2,5мкл 2мММ раствора аСтТР. Реакционную смесь инкубировали в течение 2 - З минут при 9470. «о

После охлаждения в течение 1 минуть на льду, добавляли мкл Тат (1Оед./мкл). Конечная смесь имела следующий состав: 1Омкл кКДНК в 20мМ Трне-НСЇ (рН 8,4), 5ОММ КСІ, 1,5мМ Мосі», 200мкМ астР, О4ед./мкл в тат. Реакционную смесь инкубировали в течение 10 минут при 372С, а затем в течение 10 минут при 707С для инактивации тат.

Для осуществления РСК, бьіли приготовлень! четьіре различньіе реакционнье смеси, имеющие следующие « конечнье концентрации праймера (на 5Омкл): 7 то 1. 4008М АСР с 2. ВООНМ АСР "з 3. ЗВОНМ ШАР и 40нМ АСР (ОАР:АСР - 9:1) 4. 720нМ ПАР и 8ОнМ АСР (ОАР:АСР : 9:1).

Конечнье концентрации (на 5Омкл) остальньїх компонентов во всех четьірех реакциях бьіли идентичньми: ї» що Бмкл роїу А" оС-концевой КДНК в 20мМ Триснесї (рН 8,4); 5ХомМ КСІ: 1,5мМ Мосі»: 400нмМ СКСВ2, и 200мкМ каждого из АТР, СТР, ЯОТР и аттТР. Компонентьї, включая АСР- и ПАР-праймерь, смешивали в (22) первоначальном обьеме 45мкл и нагревали до С в термоячейке. Затем к каждой реакции добавляли 5мкл -І смеси 1,25ед. ДНК-полимеразьї АтріїТад (РегкІп ЕІтег Сей5, Могмаік, СТ) в 20мМ Трис-НСІ (рН 8,4) с 5р Доведением конечного обьема до БОмкл. Для амплификации 5і-КДНК-фрагмента использовали программу о термоциклической РОК "Соцспдом/п".

ГЕ После РСК-амплификации, все четьіре реакционнье смеси обьединяли, и ДНК-продуктьї фракционировали по размерам с помощью злектрофореза на 895 полиакриламидном геле. ДНК-продукт составляющий примерно 230п.о. вьрезали из геля, очищали, и субклонировали в "Т-вектор", как бьло описано вьше для 3-КАСЕ-фрагмента в 450п.о. Для дальнейшего анализа вьіделяли 5 клонов: 5СВ2, 5СВ3, 6СВ5, 5286, 5СВ11.

Анализ ДНК-последовательности осуществляли с использованием секвеназного набора "Зедцепазе мегвіоп 2,0" (Ф; (Опнеа 5(ай(е Віоспетісаї, Сіемеїапа, Опов).

ГІ На рис. 8 показана полная кДНК-последовательность Компонента В, собранная из КАСЕ-клонов 5СВЗ и

ЗОВ, в которой указьівается рестрикционньєе сайти. во Анализ первичньїх структур кКДНК-последовательности клонов 5СВЗ3, 5СВб6, 5СВ11 и ЗС84, ЗСвВ7, ЗСв9 показал полное соответствие зтих последовательностей зкзону Компонента В (геномньй клон 48 Примера 3).

Хотя настоящее изобретение описано вьіше на конкретньїх примерах его осуществления, однако, специалистам в данной области очевидно, что в него могут бьіть внесеньі различнье изменения модификации, не вьіходящие за рамки существа и обьема нижеследующей формуль! изобретения. 65 Надписи к рисункам

Рис. 1. Рабочая схема для очистки Компонента В из мочи.

Рис. 2. Рестрикционная карта геномного транскриптона Компонента В. (геномная ДНК указанного компонента

В показана в ЗЕО ІЮ Мо 2). Стрелками показань сайть! сплайсинга.

Рис. 3. Последовательность области промотора Компонента В (область промотора указанного Компонента В показана в ЗЕО ІЮО Мо 2), Сайтьї связьшания для факторов транскрипции АР-1, АР-2, Зр-1 и Е-блоков указьіваются.

Показаньї также ТАТА-блок, и ОРЕ.

Рис. 4. Рестрикционная карта гена Компонента В. Вьіведенная мРНК показана строкой ниже геномного гена: области обведеннье в рамку обозначают последовательность, кодирующую белок. 70 Рис. 5. Рестрикционная карта вставки клона 40.

Рис. 6. Рестрикционная карта плазмидьії рРВЗСВ40.

Рис. 7. Общая схема, используемая для КАСЕ-клонирования ДНК-последовательности Компонента В.

Рис. 8. Полная кДНК-последовательность Компонента В, в которой указаньій сайть! рестрикции (кКДНК указанного Компонента В представлена в 5ЕО ІЮО Мо 3).

Claims (1)

1. Формула винаходу

   1. Полипептид, обладающий противовоспалительной и/или антикоагулирующей и/или противоопухолевой ор активностью й имеющий аминокислотную последовательность: Тен Гуз Суз Тут ТВг Суз Суз СТш Рго Меї Тіт бег Аа бе Су Аге і З 10 І5 с щі 6) ТвВгоЛе Ті о Атгтя Суб Гуз Рго Сі Авро Ти Ада Суб Ме Тго Пи Ген Й с 30 ХМ Ту Ма! СЯ Аа СЯ Тут Рго Рве Ап Сп обего Рго Ма! Ма) Тв к (се) 35 « Ат обет Су бег Зег бет Су Ма! Аза Ті Ар Рго Авр о бег Пе СтТу 6о « 40 - . фі Ав Ніз Тей Ме Рбе Суб Суб Ра Асв АвБроГев Суз Ап о Зег СПЙ » й 4 п Ще 70 75 250 45 т» | не Ге) или его соли, функциональнье производнье, предшественники, активнье фракции или их смеси, обладающие -1 такой же биологической активностью.

   2. Полипептид по п. 17, отличающийся тем, что он предназначен для использования в качестве (ав) 50 лекарственного средства. Кз З. Полипептид по п. 1, отличающийся тем, что он предназначен для получения лекарственного средства, обладающего противовоспалительной и/или антикоагулирующей и/или противоопухолевой активностью.

   4. Способ получения полипептида по п. 1, отличающийся тем, что осуществляют адсорбцию мочи при кислотном рН на каолине и ее зкстракцию аммиаком с последующим злюированием полученной ранее фракции 59 на смоле Віо Кех 70 с использованием аммиака, с дальнейшим злюированием на ДЕАЕ-Сефарозной смоле с ГФ) использованием ацетатного буфера, с последующим злюированием на СМ-Сефарозной смоле с 7 использованием ацетатного буфера, с дальнейшим злюированием полученной фракции на С18-смоле (ВЗЖХ) с использованием смеси ацетатного буфера и ацетонитрила, с последующим злюированием на ДЕ-52-смоле с использованием ацетатного буфера, с злюированием полученной на предьдущем зтапе фракции на бо Д-7ерпуг-смоле с использованием ацетатного буфера с дальнейшим злюированием фракции на С18-смоле (ВЗЖХ) с использованием смеси водной трифторуксусной кислотьі и ацетонитрила, с дальнейшим злюированием фракции на Д-7ерпуг-смоле с использованием ацетатного буфера.

   5.Способ по п. 4, отличающийся тем, что указанной мочой является моча человека.

   б. Фрагмент ДНК, кодирующий полипептид по п. 1 и имеющий следующую нуклеотидную бо последовательность ЗЕ9 0 Мо2:

   тбссесСатос тТАСссстТоАСС тбдсдостос тТтТсстАсстТо ТооТТтСТАС тТтТтосАСо три - Го 120 тататовост СТАСАСАСАС сСАостАСАОо тТстТотосАсА сбостосАоо севасОостТасА СССААСОоСоТ ОССАСССОСо ОСТАСАССАА САДОСОСАСА СОСТАСАСТО АССстТоссТе 180 ТТААСосТоС СССАСОСТоС СоСТоооТоо ССТАТСТОАА СОССАБАСОС АСАСССАСсА 240

   САТОСССОСТ САТСАбАСОС ССАСТСТОАС СТСАССАСОА АдДСоССТІСТ СТОТСАсАСС 300 ТОТСССАССА ССАСТОСАСА ТОССТОАССА АСАСТОАСТТ СССсСАстТотТтТ бодДостТетос 360

   ААССАСАССС СТОбССАТОС ТОСТСАСАСА САССТСССАб АтТосАсстТос стососотТст а20 СССАТСТТСС ТоССВостТос СТССССАСТО СОСОСТТТАС САСОТТССТО АСТСАСАСоб 4во

   ССоСТТСТоС САСОССССАС ААСССооТоС ССААОСоССТ ОбСТАТАДАТ ССТТаАТоТа 540 ВООСТООСТА ССТСТСАТСА СТТІСТОдДоСА сосвосаА АТО бос тот сос тос ост 595 Мехс Аза бек Агу Ттр Віа с » -22 -20 о ото сСАо сто сто Сто ото бсСА бос Ттоо АС АТО бос тот б СТоАСТосоО 645 Уаї сіп бе цей Пец Уаї Аза діа Тур бек Мей біу Сув сч -ї5 -39 -5 Га») сСесАсостТос ТоСССАССТІ СОСТОТоАОС тТтТотстТоСОос АССТоСТАСС СОобАТОССОС 705 - ТСІТТОсСОсстТ ОСТТТОТОоСо ТОАСАбОСТО СТТАОСОСТО САТОДСОСТо АСОСТОСТСА 765 (Те) 325 ТТСТСВОТОА бСстТесСтТобс ТоССАСАССС сСАосттТедес СстТаСОодсАСо сстедоссстТ 825 З ССАСТСТОСА ОСААССОАбА СТОАФОСТТо СТоСАСбСАтТ ССАССАТТСА детотетосе 885 « 20 ТСАБСТСАСТ ТАСАСАААСС ТОССАСАСАС ососСстТтТоАА ссестососСо ссосстТтТеВА 945 - с АСАТСТСАСС САСАСТОСТТ САОССССТОС СТОСТОсСТТО САССАТОВСМ ССАСССАсСсТ 1005 з САССТСАТОА ОСТТСТОССС ССАТСССТСА СОССАС СТ од бос сто ААб ТОс 1057 с1іу біз Ада Пец Пцув Сув т» -2 1 Ме ТАС АСС ТОС ААб ОА ССС АТО АСС АСТ Ост Тоо ТОС Або дос АтТтТ дес г 1105 -І Тут ТпЕ Сув Пув біз ко Мех ТТН бек А1їа Зер Сув Агу Так І1е Тнг ою 5 19 І5 СОС ТосС Ал ССА САб САС АСА ОСС ТОС АТО Асо дос ста ста доб сте 1153 їз Ага Ссув цу Рго сій Авр Тпк Аїа Суз Мес Тих Твгопец уаі Таг уаї 20 25 30 35

   Ф) го 60 65

   САС бСА б СТСАССССАС СССССАССоС АССССТоСоОТ ссСАстТосАсСТ СсАососсАСсСе 1210 біз діа 2 тТОСоСсАдст ссстТеосТос ТТТОоСсТосТо СТосСТоСебо СеСАЛАДОСА АССАОоТооо 1270 АТОСОСАСАА сСдоостТОасСсА САССТТОбСА сооотТосстт ссдеоВОосоТ СОСсАСАбоссСе 1330 70 СеТоДСАСВС ССАСТоСТоо бОСАоСАСоСс ссСтТоСАосТо остТоосОостТТ ААТОСОСОЮ 1390 СТАСССТССо СОССТСАААС СССАССТСТО АСАСАСАССС дстоостТостТ ОТТОССАСАС 450 СетТСтТосастТ СОСОСТОССА ТСТСАОСОСА СОСАСТТСАС АССТСТОАСА АСОССТААТА 1510

   АТТСАТСААС АОСТОАСАСТ САСАссдосо СТобоССстТо соТсосСтТТсСА САСАТОТСОА 1570 СТАТТСОСВА САСОСАТСАС АСССАСОКТОо дОоСтТеАбБСо АсоСосбосСсто ОСАСсСАСТоС 1530

   ЗОСАСОАСосС дососстТосА собсастТоОАС ОСТТСТСАСА СТОССОСАСС СТОСАС до 1688 сіц тус сос тт ДАО сао дос сос сто сто Ат сос тТос тос тс дос тес 1736 Тус Рко Ре Ап біп баг Рко Маї Уа) Тіс Ако бес Сув бех бек бехг с 40 45 5о о тот сто бос ДСС Одо сСссС АС АОС АТС боб сс ос САС СТО АТС ТТС 1і1784 Ссув Уаї діа ТП Авр Руто Авр бек І1е сіу Аіа Аїа Нів Пец І1їе Рпе 35 ' во 55 70 сч то то тт сСоА САС Сто ТОоС ЛАС ТСОо САА СТО ТОАдеСсСАсс ссоосСАооос 1837 о Суз Сув Рпе Агу Авр цем Сув Авп Зек сіц Пец 75 по ї- СсСАдОоТОоСтТ ССТСАСОСАС СТоСТСТСТо дооооСссСтТо ССТоСАССТОо ТСАТОдОСТО 1897. 7. (Се) « сСостосттТС СТеСТосСтТСТ ОБСАСАССТС АСТСАТОСОС ТСТОАБОССА САСАДОСАСА 1957 ссдесосссо ССТСТосСсСТтТ ССАТАССССА СОСТТАТАВА АСАТААСТАА СССАДбБАбТО 2017 « САСАТОАСТТ ТТОоТ 2031 о) с Фрагмент ДНК, кодирующий полипептид по п. 1 имеющий следующую нуклеотидную последовательность :з» ЗЕ Іо Мо З:

   г» Ге») -І о І»

   Ф) го 60 65

   АТСАСТТСТО АДоСЬСОСАСС А АТО бе тТстТ сосС тТоб сст сто сдо сто сто 51 Мет А1а бек Аку Тгр зіа Уаї біп їеч Гцец -22 -20 -15 сто сте СА бо тоб АОС АТО боб тет сот бо асо Сто Адб Тос ТАС 99 їеч Уаї Аліа Аїіа Ткгр бБег Месє Сіу Сув сіу сії Азїа Ге П0уз Сув Тугх -10 -3 1 , АСО Тс ВАС сде ССС АТО АС АСТ ОСТ ТоС ТОсС Або ДСС АтТтТ дос сос 147 Тпк Сув пуз бід Рко Меб ТП бек А1а бек Сув Аку Тпї І16 ТіК АкгЧ 5 10 15 20 75 тес ААФ СеА САС САС АСА СОС ТОС АТО АСО АСО сто сто АСо сто САС 195 Сув цув ргхо біз Аво ТП Аза Суз Ме ТК о ТлЛк печу Уаї Тпх Уаї бі 50 35 го ФЧсА ЗАС ТАС ССС ТТе ААС САС дос ссс сто сто дес сСос тос тес Ттос 243 діа бі тТукг Рхо Рпе Авп біп,Зекг Рго Уаї Уа1ї Тпш Акуд бек Сув б5ег то) 45 50 дес тос тот сто СС АСС САС СОС САС АС АТО боб осо бос САС сто 251 с 25 Бек бек Сув уаї А1їа Тис Авр Рко Авр бек Ізїе сіу Аіа діа Нів Геч Ге) 55 60 65 То ТТ ТтОосС Тос ТТ сСоА САС Сто ТС ЗАС ТС САА СТО ТОоАдессдоо 340 сч зо Ііа еле Суз сув Рпе Акд АБр Ге Суз Авп бек с13 без то 75 во о ссоссАссос солАшатТОостТ сстовоссас стестстстТо АссососстТо сстТесАостТо 400 - (се) ТОАТСАССТС СеСсТОоСсТТо СТОСТОоСТоТ СОСАСАССТо АСТСАТОобОоС ТСТоАсОосА 460 « САСААБСАСА ССС ССТСТОССТТ ССАТАССССА СОСТТАТААА АСАТААСТАА 520 СССААААААА АААААААААА 540 «

   8. Зкспрессирующий вектор, включающий фрагмент ДНК, имеющей нуклеотидную последовательность З с ЕС ОО Мо2: . 2 т ссто 60 2 тобсссАТоС ІАСОСТСАСС ТоАСАССТОС ТІССТАССТО 7оСТТтТСтТАС ТТТОСА теотое "сос7 СОСтТОСА 120 ч 45 СТАТСАССТ СТАСАСАСАС САССТАСАСО ТСТОТОСАСА СбоСТоСВОС ССА (о) СССААСОСОоСТ СССАСОСоСо ССТАСАССАА СААССССАСА СОСТАСАСТО ААссТосстТе 180 -І о 50 УТАдДОСсТсо СССАСОоСсТос состТСоооТоб ССТАТОТОАА ССССАСАСОС АСАСоСАССА 240 що) САТОССООСТ САТСАСАбоОС ОСАБЕСТоАС СТСАССАССА ВдеоССТІСТ СТОТСАСАоС 300 ТСТСССАССА ССАСТОСАСА ТООСТОАССА АСАСТСАСТТ ССССАСТОТТ осАоСсТсТоС 360 ГФ) ААДССАСАСОСС СТОСОСАТСО ТОСТСАСАСА САССТСССАб АТоСАССстТоС стТоСсСОостТотТ 420 го СССАТОТТСС ТОССАССТОС СТоСССАСТо СОСОСТТІТАС САССТТОСТО АСТСАСАСоОо ав8о 60 ССОСТТСТоС САССССССАС АдосССооТоС ССААбсоосСТ СССТАТАААТ ССТТОАТОТО 540 ЗСОСТоОСТА ССТСТСАТСА СТІСТСАССА СОСАССА дто ссс ТСстТ сос тоб ост 595 Меїс діа бек Аку Тер діа бо -22 -20

   СТО САС СТО СТО СТО сто сосСА осСс тоб ДОС АТО бос тот 0 СТСАСТоСоС 645 Ууаї біп їем Пес Пец Уаї зіа Аїа Тур Бек Мес сіу сув -15 -10 -5

   5 . сесАсостТос ТососАсстТ? осстТотТодос ттотстоссс асстостАсо ссодтососо 705 ТтстТоссоостТ ОСТТТОТоСсС ТСАСАСОСТО СТТАСОССТО САТОАСОСТО АСССТосТоА 765 ТТСТСВОТСА бССТОСТОСОо ТСССАСАССС САССТТСАСС СТОсСоАсасСо сотедссест 825 ССАСТСТОСА ССААСОСАСА СТСАСОСТТС СТССАДСОСАТ ССАССАТТСА дотТстТестТосе 885 ТСАССТСАСТ ТАСАСАДАСС ТОССАСАСАС ОССССТТСАА Со5СТоСОСо ССОССТТеСАА 945 АСАТСТСАОС САСАСТОСТТ САОСссСсСТоС СТОСТОСТТО САССАТОАОУ ССАсСссАсстТ 1005 САССТСАТСА СОТТСТоССС ССАТСССТСА СоСАС ст од ссо сто АВе Ттос 1057 сіу біз Аза це був Суз -2 1 ТАС АСС ТОС АД ОА ССС АТО АСсС АСТ ОСТ ТоС ТоС АОС АС АТТ дес с 1105 тТук Тпж Суз цу бій Рго Мес Тотх Бек Аїа бер Сув Агу Тк ІЇї1е Тпг сч

   5. 10 15 СОС ТС Аде ССА бАб САС АСА ССС ТОС АТО ДСС дос сто сто дсо сто 1153 о Акд Сув пу Рко біц Ар Тпк Аіа Суб мес Так Тв опец Уаї Так Уаї 20 Й 25 | 30 35 зо САС СсСА б ОТоАСоССАС СССССАСбОС АоСССТОоСОТ ОСАСТОСАСТ СсАсСосссАСС 1210 с січ діа («в) М ТССССсАдстТ бСоТССсСТСС ТТТОСТОооТОо СТеСТеССоС СССАЛААССА АССАССТобо 1270 со 32 АТОбОСАСАА САСОСТОССА САССТТОССА ссостоссСттТ ССАСоАСОСТ СОСАСАСССС 330 - ССТОСАСАСАС ССАСТоСТОо СОСАССАбоС осСтТобАостТо осТооСосСтТТ ААТОоСССбОоС :390 « 70 стТАСеСТОобо ССОСТСАДАС СоСАОСТСТо АСАСАСАССС АСТоССТостТ СТТеССАСАС 1450 2 с "» ССТСТОоСОоСстТ СООССТСССА ТСТСАССОСА СОСАСТТСАС АОСТСТОАСА АСОССТААТА 1510 АТТСАТСААС АОСТСАСАСТ САСАСоАСос СтТобоСосСТо оСТоОСТІСА САСАТСТОСА 1570 що СТАТТСССВА САСОСАТСАС доссАСОКТо достТеАСБСо АСобсоостТо ссАСсСАСсТОС 1630 (2) -і ДОСАССАСОС АбОСОСТОСА СооСАСТСАС ОСТТСТОАСА СТОССССАСС СТОСАб до 1588 о сіц г» ТАС ССО ТТ АС САС дос сос бто ото АТо сСос тТос тТос тТос дос тес 1736 Туш Рго Ре Авп біп бек Рко Мазі Уаї Ті Аку бек Суз бек бек 5ег Ко) 283, 50 22 тот ото бос АСС САС СОС бАС АбС АТС боб ССС сс САС СТО АТ ТТ 1784 (Ф) Сує Уаї А1іа Тах Авр Руо Авор Зек Ії с1і1у іа Аїа Бів'цец Ізче Рпе юю 35 во 55 70 ТоС ТтоС ТТ сСбА САС СТО ТОС АВС То САА СТО ТоАдессСАбо осоосСАОсоС 1837 60 Сув Сув РМпе Агу Авр цез Сувз Авп 5ех бі Печ 75 во 65

   ССАДССТОоСТ ССТСАбоСАС СТоСТСТСТо десообосстТо ОСТССАССТо ТСАТодеоСстТе 1897 сссстоесттсС сСТосСТОосСсТсТ СОСАСАССТС АСТСАТоСОСС ТСТОДССССА САСААССАСА 1957 СссАСсоосос ССТСТОССТТ ССАТАССССА СОСТТАТААА АСАТААСТАА СССААСАСТо 2017 САСАТОАСТТ ТТСТ . 2031

   0 З. Зкспрессирующий вектор, включающий фрагмент ДНК, имеющей нуклеотидную последовательность ЕС ІО Моз: ЗТСАСТТІСТОо десСАСобАСС А АТ бос тТстТ Со Тоо сст сто САС сто сто зі Хес Аза бек Ак Ткр Аїа Уаї сіп йеч Бей -22 -20 -5 сто сто СА ссс То дес АТО ссо ТстТ ост САС осо сто АдДОо ТОос ТАС 59 їеч Маї ліа А1іа Тер 5ег Меб біу Сув біу бі дів це Пув Сув Туг "10 -5 1

   20 . АС То ААС САС СОС АТС АСС АСТ ОСТ тТоС ТоС АБО ДОС АтТтТ дес сс 4147 Тих Суз ув сі Рхо Мек ТПпх Зех Аза бек Сув Агу Тпш Її ТПпх Акх9д 5 10 15 20 с тбС АВ ССА САб САС АСА ССС ТоС АТО АСС Ас сто стб всо сто САС 195. МО Суз цу Рго біз Авр Тпс Аза Суз Мес ТПк Тк Пей Уаї Тпг Уаї сім 25 30 35 с ССА ОС ТАС со ТТ ААС ОсСАС доб сосС осто сто дес сСоес тос отас тес 243 о А1а біз Туг Рго Рце Авп сСіп Зег Рко Уа1ї Уа1ї Тпр Акгу бек Сувз бег -0 45 ' 50 - (Се) дес тос тот ста ССС АСС САС ССС САС АС АТО сс ссс сс сАо сто 291 ект Бек Сув Уаї Аїіа Тл Авр Ркго Ар 5ег Іїе Ссіу діа А1а Ніз реч З 50 65 ЗТ тТтТо Ттос То То СА САС СТО То ААС ТО САА СТО ТОААсСсоАсо 340 « 30 іії2г впе Сув Суз Рпйе Агу Азр Пе Сув Авзвп бек бій Пец - с то 75 Тв) но ссбосСАСОСо ООСАдостТостТ СстТоеАСбсСАС СТССТСТоТо деобососсто сстесдосто або їх но тбАтТеАсстсе сесосстТостТо сТостТостТотТ сосдедеосте дстсатссос ТСТОоАСОССоА або б САСААССАСА ССАбССоСоС ССТСТОССТТ ССАТАССССА СОСТТАТАДА АСАТААСТАА 520 -І о 50 СССААААААА ААААААВАХА 540 "з 10. Штамм БЕ. соїІ, трансформированньй зкспрессирующим вектором, которьій содержит нуклеотидную последовательность ЗЕО ІЮ Мо 3, где указанньій штамм продуцирует полипептид по п. 1.

   11. Линия клеток млекопитающего, трансформированньїх зкспрессирующим вектором, которьій содержит нуклеотидную последовательностьзЕО ІЮО Мо 2, продуцирующая полипептид по п. 1. 59 12. Линия клеток млекопитающего, трансформированньїх зкспрессирующим вектором, которьій содержит ГФ) нуклеотидную последовательность ЗЕО ІЮ Мо З продуцирующая полипептид по п. 1. 7 13. Линия клеток млекопитающего по п. 11 или 12, отличающаяся тем, что представляет собой линию клеток сно.

   14. Способ получения полипептида по п. 1, обладающего противовоспалительной и/или антикоагулирующей бо и/или противоопухолевой активностью, включающего последовательность ЗЕО ІЮО Мо 1, где способ включает культивирование клетки и вьіделение белка из указанной клетки, отличающийся тем, что клетка трансфицирована зкспрессирующим вектором по п. 8.

   15. Способ получения полипептида по п. 1, обладающего противовоспалительной и/или антикоагулирующей и/или противоопухолевой активностью, включающего последовательность ЗЕО ІЮО Мо 1, где способ включает 65 культивирование клетки и вьіделение белка из указанной клетки, отличающийся тем, что клетка трансфицирована зкспрессирующим вектором по п. 9.

   16. Белок, содержащий полипептид по п. 1, его соли, функциональнье производнье, предшественники и активньіе фракции или их смеси, обладающие такой же биологической активностью, отличающийся тем, что для его получения осуществляют адсорбцию мочи при кислотном рН на каолине и ев зкстракцию аммиаком с последующим злюированием полученной ранее фракции на смоле Віо Кех 70 с использованием аммиака, с дальнейшим злюированием на ДЕАЕ-Сефарозной смоле с использованием ацетатного буфера, с последующим злюированием на СМ-Сефарозной смоле с использованием ацетатного буфера, с дальнейшим злюированием полученной фракции на С18-смоле (ВЗЖХ) с использованием смеси ацетатного буфера и ацетонитрила, с 7/0 последующим злюйрованием на ДЕ-52-смоле с использованием ацетатного буфера, с злюированием полученной на предьдущем зтапе фракции на Д-7ерпуг-смоле с использованием ацетатного буфера с дальнейшим злюированием фракции на С18-смоле (ВЗЖХ) с использованием смеси водной трифторуксусной кислотьі и ацетонитрила, с дальнейшим злюйрованием фракции на Д-7ерпуг-смоле с использованием ацетатного буфера.

   17. Белок по п. 16, отличающийся тем, что предназначен для использования в качестве лекарственного средства.

   18. Фармацевтическая композиция, отличающаяся тем, что содержит терапевтически приемлемое количество полипептида по п. 7 или его солей, функциональньїх производньїх, предшественников, активньх фракций или их смесей, обладающих такой же биологической активностью, в комбинации с одним или несколькими терапевтически приемлемьми наполнителями или разбавителями.

   19. Фармацевтическая композиция, отличающаяся тем, что содержит терапевтически приемлемое количество белка по п. 16 или его солей, функциональньїх производньїх, предшественников, активньїх фракций или их смесей, обладающих такой же биологической активностью, в комбинации с одним или несколькими терапевтически приемлемьми наполнителями или разбавителями. с

   20. Полипептид по п. 1, отличающийся тем, что он предназначен для применения при лечении заболевания, связанного с измененньмми уровнями ТОЕ-альфа. і)

   21. Полипептид по п. 17, отличающийся тем, что он предназначен для применения при получений лекарственного средства для лечения заболевания, связанного с измененньми уровнями ТОЕ-альфа.

   22. Полипептид по п. 1, отличающийся тем, что он предназначен для применения при лечении заболевания, су зо путем ингибирования связьівания ТОЕ-альфа с рецептором ТОг-альфа.

   23. Полипептид по п. 17, отличающийся тем, что он предназначен для применения при получений о лекарственного средства для лечения заболевания путем ингибирования связьвания ТОЕ-альфа с рецептором ї- тТог-альфа. (Се) «

   - . и? щ» (о) -і («в) Ко) іме) 60 б5