JPH06510790A - 分泌Ｍａｃ−２結合糖タンパク質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 必ＭａＣ−２Ｐム　タンパク 本発明は、分子生物学／生化学の領域に属し、そしてヒトレクチンＭａｃ−２に 結合して細胞表面で相互作用イベント１こ重要な役割を担う精製糖タン、ｆり質 、このタンノくり質をコート′するＤＮＡ配列、およびそれを発現する発現系を 提供する。このタンパク質は、免疫反応に関係する細胞表面相互作用の調節、病 原体／ホスト細胞相互作用、転移、および細胞接着と細胞移動を含む医学的応用 およびプレ抗体免疫のような発生的機能の多様性を持って（する。 細胞表面分子は、ウィルスおよび他の病原体の標的細胞１こ対する感染力におい て要となる役割を果たす。例えｌｆ、　インテグリノ結合のための内皮細胞レセ プターであるＩｃＡＭ−１１１またライノウィルス結合のレセプターでもある。 ライノウィルスは、ピッルナウィルス科の一種であり、ヒトの普通の風邪の約５ ０％の原因となっている。そのような半目互作用のもう一つの古典的例は、イン フルエンザ血球凝集素、つまり感染の第一段階でホスト細胞上のシアル酸（こ結 合するレクチンである。このように、普通の風邪を防ぐ予防的アプローチ（よ、 ライノウィルスが、細胞に結合して（為るＩＣＡＭ−１＋こ結合することを、可 溶性結合競合物をホストレセプター（こｔ貸与することにより防げることである 。 レクチンは、炭水化物を特異的に、そして非共有結合的に結合するタンパク質の クラスである。Ｌｉｓ、Ｈおよび５ｈａｒｏｎ、　Ｎ。 、１９８６．Ａｎｎｕａｌ　Ｒｅｖｉｅｗ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ　、 ５５：３５゜非常に多数のレクチンが、高等動物において、膜結合性および可溶 性の双方について確認され、そして、それらの転移における役割に加えて、さま ざまな細胞認識現象に関係した。 レクチンは一般に、結合特性がカルシウム依存性であり、構造的にアシアロ糖タ ンパク質レセプターに関係するＣ型、または、チオール依存性レクチンであるＳ 型のどちらかに分類される。しかしながら、これらの分類には明らかに当てはま らないが、レクチンの性質を有する他のタンパク質、例えばフィブロネクチンお よびラミニンようなタンパク質があることに留意するべきである。Ｄｒｉｃｋａ ｍａｒ、　Ｋ、　、　１９８ｇ、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　ＣｈｅＬ、出：９Ｓ５７ ゜ レクチンは、原形質膜のレベルで開始される細胞イベントを調節する役割を行っ ていると考えられている。例えば、原形質膜に結合した分子は、リンパ球様細胞 、特にＴリンパ球のさまざまなサブセットの活性化に関係し、細胞表面分子はこ れら細胞を活性化し、結果として免疫反応の間、それらの応答の原因になること が知られている。この現象は、白血球凝集性植物凝集素（ＰＨＡ）およびコンカ ナバリンＡ　（ｃａｎ　Ａ）のようなさまざまな植物性レクチンを用いて研究さ れてきた。これらの分子は、Ｔ　ＩＪンバ球細胞表面上の特定の分子と会合する 炭水化物の一部分に結合することによってＴ細胞を活性化すると考えられている 。 ある既知のヒトレクチンは、元来は細胞会合マクロファージ抗原と記述されるが 、　ｒＭａｅ−２Ｊと呼ばれる。ＨＯおよびＳｐｒｉｎｇｅｒｊ、Ｉｍｎ＋ｕｎ ｏ１．、（１９８２＞　１２８＋１２２１−１２２８゜３２ｋＤレクチンＭａｃ −２は、常在性マクロファージでな（チオグリコレート誘導マウスマクロファー ジにおいて著しい量が発現され、細胞接着または免疫応答に関与し得る。ヒトＭ ａｃ−２同族体は、クローニングされ、そしてリーダー配列がないにも関わらず 外在化されたラクトース／ガラクトース特異的レクチンであることが示された。 Ｏｄａら、Ｇｅｎｅ（１９９１）９９　：２７９−２８３；Ｃｈｅｒａｙｉｌら 、凹１す（１９９０）８７：７３２４−７４３８゜Ｍａｃ−２は、他の以前に記 載されたタンパク質と同一または密接に関連している：　ＥＢＰ、新い）型の細 胞接着をすると考えられるタン、ｆり質（ＦｒｉｇｅｒｉおよびＬｉｕ、　Ｊ、 １ｍｍｕｎｏ１．、（１９９２）ｌ＋劉：８６１−８６７）、Ｃ８Ｆ１８　、ガ ラクトース結合レクチン（ＪａｉおよびＷａｎｇ、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、 （１９８８）２６３：６００９−６０１１）、非インテグリンであるラミニン結 合タンノずり質（Ｗｏｏら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　（１９９０）２６ ５ニア０９７−７０９９）、ＲＬ−２９、ラクトース特異的肺レクチ７　（Ｌｅ ｆｆｌｅｒおよびＢａｒｏｎｄｅｓ、　Ｊ、　Ｂ±（社）−山＝ｍ、　（１９８ ６）工１０１１９−１０１２６）、およびＬ−３４すなわち新生形質転換および 転移に相互に関係するガラクトース結合レクチン（Ｒａｚら、Ｉｎｔ、　Ｊ、　 Ｃａｎｃｅｒ（１９９０）４６：８７１−８７７）。Ｍａｃ−２１よ、ヒト病原 体のコロニー形成の標的となり得る腸柔突起の先端に力）なりの濃度で存在する 。 数人の研究者が、さまざまなレクチンに対する１ツカ゛ンドとして働（糖タンパ ク質を単離精製した。例えば、タム・ホースフォール糖タンパク質と呼ばれるタ ンパク質は、ＰｈａｓｅｏｌｕΣ匹ム肛ｎ由来の白血球凝集素および赤血球凝集 素を含む数種のレクチンによって誘起されるリンパ球の活性化を阻害することを 示した。５ｅｒａｆｉｎｉ−Ｃｅｓｓｉ、　Ｆ、ら、１９７９．　Ｂｉｏｃｈｅ ｍｉｃａｌＪｏｕｒｎａｌ、　１８３：３８１−３８８゜さらに、ＰＨＡ結合因 子として動く糖タンパク質が、ブタの牌リンパ球から部分的に精製された。さら なる研究もまたブタのリンパ球のＰＨＡ活性化が部分的に精製糖タンパク質によ って阻害されることを示す。（Ｄｕｐｕｉｓ、　Ｇ、ら、１９８５、Ｃａｎａｄ ｉａｎ　Ｊｏｕｒｎａ　ｏｆ　Ｂ’ｏｃｈｅ＋５ｉｓｔｒ　＆　Ｃｅ１ｌ　１ｏ ｌｏ　、ｉｌ・９３２−９４０）。これらの研究者は、阻害活性を示す、正確な 分子量を持った種を同定できなかった。むしろ、かれらは、ドデノル硫酸ナトリ ウムポリアクリルアミドゲルのクーマシーブルー染色で示されるように、部分的 精製調製物においである分子量分布を持った種を報告した。主要なバンドが、約 ５０−５５．７５．９５．１３０、および１５５ｋＤの見かけの分子量を持って いることが観察された。付随している微量種は、約４２．４５．６０−６５．１ ７５、および２００−２５０ｋＤの見かけの分子量を示した。 他の研究者による類似の研究は、他のＰＨＡ結合分子の存在を示した。例えば、 子ブタの腸間膜リンパ節由来のＰＨＡ結合因子が単離され、約１００ｋＤの分子 質量を持っていることが示された。 Ａ１１ａｎ、ＤおよびＣｒｕｍｐｔｏｎ、　Ｎ、　Ｊ、　、　１９７３．Ｅｘ　 、　Ｃｅ１１．　Ｒｅｓ、　、７８　：２７１−２７８゜子ブタの下顎リンパ節 リンパ球由来の原形質膜に存在するＰＨＡ結合分子は、９４ｋＤより大きい見か けの分子質量を示すことが示された。Ａ　１ｅｘａｎｄｅｒ、　Ｓ、ら、１９７ ８．Ｂｉｏｃｈｅｗｉｃａｌ　Ｂｉｏ　ｈ　ｓ２〜已ａ、　、　５１２：３５０ −３６４゜他のＰＩＩＡ結合リガンドが、アフィニティークロマトグラフィーに よってヒト末梢血液から単離され、２０−３５．４３．６０、および７０ｋＤの 範囲の分子質量を有することが見いだされた。Ｓｋｏｏｇ、　Ｂ、ら、１９８０ ，５ｃａｎｄ、Ｊｏｕｒｎａｌ　Ｉｎ＋ｍｕｎ、、１１３６９−３７６゜他の研 究者らは、ノイラミダーゼ処理した末梢ヒトＴリンパ球に、分子量が４３から２ ５０ｋＤの範囲にある白血球凝集素レセプター糖タンパク質が存在することを報 告した。 ヒトの母乳の健康上の利点がずっと認められてきた。最近、胃腸の感染症防止に おいて、母乳の予防効果が記載された。 Ｇｅｒｒａｒｄ、　Ｊ、　、　１９７４．Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ、　５４　ニア ５７−７６４゜少なくともいくぶん、これは、母乳に存在して、新生児をウィル スまたは細菌の感染から守る結合特性を有する非免疫グロブリン糖タンパク質に よるものであるｏ　Ｌｏｎｎｅｒｄａｌ、Ｂ、、１９８５．ＡｔＪ、Ｃ１１ｎ、 、４２：１２９９−１３１７およびＨｏｌｍｇｒｅｎ、　Ｊ　ら、１９８３．　 Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｍ＋ｏｕｎ、　、　３３　：４５９−４６３゜これらのタン パク質は、少なくともいくぶん、細菌性粘着性物質またはウィルス性赤血球凝集 素に結合することによって細菌またはウィルスの腸上皮への接着を妨げるか破壊 することで、効果を及ぼすと考えられている。細菌性粘着性物質およびウィルス 性赤血球凝集素は、感染の初期段階でこれらの生物の上皮細胞表面への接着を容 易にする表面分子である。この過程に関与する母乳タンパク質は、まだよく特性 がわかっていない。）Ｉｏｌｍｇｒｅｎ、　Ｊ　ら、１９８３．　Ｉｎｆｅｃｔ 、　Ｉｍｍｕｎ、、３３：４５９−４６３゜しかしなから、４００．０００より 大きい分子量を有する糖タンパク質は、呼吸融合ウィルス（ｒｅｓｐｉｒａｔｏ ｒｙ　５ｙｎｃｙｔｉａｌｖｉｒｕｓ）を得ることができることが記載されてい る。Ｌａｅｇｒｅ　ｉｄ、　Ａ、ら、　１９８６．　Ａｃｔａ　Ｐａｅｄｉａｔ ｒｉｃ、　５ｃａｎｄ、　、　７５：６９６−７０１゜そのようなタンパク質に より提供される免疫保護および抗感染機能に加えて、他のヒトの母乳タンパク質 は特殊な栄養のキャリアとして特別な役割を演じている。 同様に、Ａ型肝炎ウィルスのさまざまな細胞系への付着および感染を妨げる高分 子量物質が、ヒトの血清中に確認された。 Ｚａｊａｃ、Ａ　ら、１９９１．Ｊ、ｏｆ　Ｇｅｎ、Ｖｉｒｏｌ、７２：１６６ ７−１６７５゜この物質は、精製されておらず、さらなる性質も明らかにされて いない。 Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　（１９９１）２６６　 ＋１８７３１−１８７３６は、結腸癌細胞由来のＭａｃ−２結合タンパク質を記 載し、そして一部分のＮ末端のタンパク質配列を報告している。Ｌｉｎ５ｌｅｙ ら、Ｂｉｏｃ■ｍ、　（１９８６）ハ：２９７８−２９８６は、似ているが同一 ではないＮ末端のタンパク貫配列を有する肺癌タンパク質Ｌ３の特徴を明らかに した。いまだにヒトＭａｃ−２レクチンに特異的である新規な糖タンパク質の全 アミノ酸配列は確認されておらず、およびそのような配列をコードするｃＤＮＡ のクローニングもされていない。 本発明の目的は、Ｍａｃ−２に結合する実質的に精製されたタンパク質の記載に ある。このｒ　Ｍａｃ−２結合タンパク質」ハ、１２００ｋＤを越える見かけの 固有分子量、約２５Ｓの沈降値を持ち、そして約５６７アミノ酸残基を有するグ リコジル化されたサブユニットにより構成される。供給源とグリコジル化の程度 に依存シテ、タンパク質分解されないサブユニットのＳＤＳゲル電気泳動で示さ れる見かけの分子量は、約８５−９７ｋＤである。 本発明の第二の目的は、サブユニットをコードするＤＮＡ配列およびその配列で コードされるタンパク質を発現させるためのベクターの記載にある。 本発明の策三の目的は、標的細胞の細胞表面に病気を起こす薬剤が結合する結果 起こる病気を治療または予防するのに有用なレクチン結合タンパク質からなる薬 物の記載にある。 本発明の第四の目的は、生物学的液体中のｇｐ８５−９７タンパク質濃度を決定 するための、好ましくは抗体の性質を有する、医療診断百薬の記載にあり、この 情報は個人の病気に対する感受性を含む個人の健康状態を予測し得る。好ましい 用途は、小児が最大の健康上の恩恵を受けるのに適切な量のｇｐＨ５−９７タン パク貫を得ているかどうか決定するため、ヒトの母乳中のｇｐ８５−９７タンパ ク質ａ度をモニターすることにある。 本発明の第五の目的は、ｇｐ８５−９７タンパク質によって与えられる医療上の 互恵を必要とする小児に与え得る、組換えまたは精製された天然のタンパク質が 補給された小児人工栄養からなる組成物にある。 本発明の第六の目的は、癌治療に有効な濃度にその分子を投与することからなる 癌、好ましくは乳癌の治療方法を提供することにある。 本発明の第七の目的は、患者の感染病、好ましくは鼻道または腸上皮にコロニー を形成する病原体によって起こる感染病の治療方法にあり、この方法は治療上有 効な量のｇｌ）１１５−９７タンバク質および薬学的に受容し得るキャリヤーの 投与治療を必要とする。患者に、そうした治療を施すことからなる。 本発明のこれらおよび他の目的は、本発明の以下の記載を読むと明らかとなる。 図１　ハ、５Ｋ−ＢＲ−３分泌ｇｐ９７（Ｄ分析用）ｚ　ニル−ＴＳＫ　ＨＰＬ Ｃクロマトグラフィープロフィールを示す。ＰＨＡ被刺激細胞の増殖活性の阻害 をアッセイして、ｇｐ９７を含有する画分を明らかにした。 図２は、抗ｇｐ８５−９７抗体による非変性ドツトプロ１トアノセイを用いて検 出された精製Ｓ！［−ＢＲ−３ｇｐ９７のスクロース勾配遠心分離プロフィール を示す。５ＤＳ−ＰＡＧＥによる精製ｇｐ９７の代表的なＲ製品の分析も示され る。 図３は、セファロース６サイズ排除ＨＰＬＣカラム上のクロマトグラフィーを経 て決定された５Ｋ−ＢＲ３細胞から単離されたｇｐ９７の見かけの固有分子質量 を示す。 図４は、部分的に精製されたトリプシン消化または未消化の５Ｋ−ＢＲ−３ｇｐ ９７のＢｊｏ−Ｓｉｌ　ＳＥＣ２５０サイズ排除＋（ＰＬＣクロマトグラフィー プロフィールを示す。 図５は、ＣＯ３細胞発現ｇｐ８５−９７のウェスタンプロット分析を示す。 図６は、ピーク画分の５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析と共に、ヒトの母乳由来のｇｐ８５ のフェニルＴＳＫ　１（ＰＬＯクロマトグラフィープロフィールを示す。 図７は、抗ｇｐ８５−９７抗体の存在下でのさまざまなヒト体液のウェスタンプ ロット分析を示す。 図８は、）ＩＴ−２９およびＨＬ−６０細胞由来のｇｐ８５−９７の共沈澱物の ウェスタンプロット分析を示す。 表１は、５Ｋ−ＢＲ−３細胞による３Ｈ−チミジン取り込みにおける抗ｇｐ８５ −９７抗体の効果を示す。 本明細書に記載された発明は、先に発行された文献および係属中の特許出願と関 連する。例を通して、そのような文献は、科学論文、特許、または係属中の特許 出願からなる。以上または以下に引用したこれら全ての発行物および出願は、本 明細書中では全部参考文献に取り入れる。 本明細書中では「ｇｐＨ１５−９７Ｊは、以下に記載するようにレクチン結合特 性および生物学的活性を有する構造的に相同な分子クラスを意味すると定義され る。「構造的相同」とは、ｇｐ８５−９７遺伝子でコードされ、そして細胞酵素 でタンパク質分解的に処理されてリーター配列が除去されることにより「成熟」 Ｎ末端を発現する、実質的に同一のポリペプチド骨格を含有するタンパク質を意 味すると定義される。タンパク質のこの形は、さらにタンパク質分解的にニック され得るかまたはニックされ得ない、そしてそのアミノ酸側鎖および／またはグ リコ化部化部位もまた、さまざまな程度に改変され得る。ｇｐ８５−９７の正確 な化学的構造は多くの要因に依存する。そのクラスの二つの構成部分は、５Ｋ− ＢＲ−３細胞培養上清およびヒト母乳から単離され、それぞれｒｇｐ９７Ｊおよ びｒｇｐ８５Ｊと定義される。それらの本来の形では、ｌ’ｇｐ８５−９７Ｊ中 に存在するサブユニットは、１２００ｋＤ越える見かけの分子量を有し、そして 約２５３±２５のスクロース速度勾配沈降値を有する天然の「複合体」中に存在 すると理解され、ｇｐ８５−９７サブユニツトを含有する複合体の見かけの固有 分子質量を実験上特定する。 「沈降値」は、実施例に記載の５−２０％スクロース勾配において分析される既 知の沈降値および分子量の標準品の沈降挙動から、外挿されるｇｐ８５−９７に ついての値と定義される。天然のタンパク質の沈降値すなわちＳ値は、一定の条 件下では再現性があり、そしてタンパク質および複合体の分子質量を見積るため に用いられてきた。大きな複合体の分子質量の正確な決定は、困難であることが 知られ、溶液中の複合体密度およびその形状に影響され得る。イオンになり得る アミ７基およびカルボキシル基が分子内に存在しているので、ｇｐ８５−９７は 、酸性塩、塩基性塩、または中性塩の形で得られ得る。適切な環境条件下に置か れた場合、活性を保持するような全ての調製物は、本明細書中でのタンパク質の 定義に含まれる。さらに、タンパク質のアミノ酸−欠配列は、サツカリド、ポリ エチレングリコール（ＰＥＧ）、およびポリオ牛ジエチレングリコール（ＰＯＧ ）との結合だけでなく、糖部分を用いた誘導体化（グリコジル化）または脂質、 リン酸塩、アセチル基などのような他の付加分子によって増加し得る。そのよう な増加の一面は、生産ホストの躬訳後処理系を介して成し遂げられる：他のその ような改変はインビトロで導入され得る。いずれにせよ、そのような改変は、ｇ ｐ８５−９７の定義に包含される。もちろん、そのような改変は、さまざまなア ッセイにおいてタンパク質の活性を高めるかまたは低下させることによって、量 的または質的にその活性に影響し得ることが予想される。さらに、鎖の個々のア ミノ酸残基は、酸化、還元、または他の誘導体化によって改変され得、そしてそ のタンパク質は、開裂され得て活性を保持するフラグメントが得られる。翻訳の 間に配列に取り込まれたアミノ酸の除去、付加、または置換による一次配列自身 への一定の改変は、タンパク質の活性を損なわずになされ得る。活性を損なわな いような置換は、定義からタンパク質を排除せず、実質的に等価なアミノ酸配列 を持っていると考えられる。さらに、Ｎ末端およびＣ末端の除去および融合は、 既知の変異誘発法を用いて成され得る。 天然のｇｐ８５−９７は糖タンパク質であること、およびＳＤＳポリアクリルア ミド電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）での見かけの分子量を基に単に定義するこ とは困難であることを認識することは特に重要である。例えば、以下に記載する ように、その分子のグリコ／ター上処理は、５ＤＳ−ＰＡＧＥで示されるように 分子量の減少をもたらす。したがって、さらに、異なる供給源から単離されたｇ ｐ８５−９７は、いくぶん一定しないグリコジル化の結果、５ＤＳ−ＰＡＧＥで 決定する場合、異なった分子量を示し得ることが認識される。 本明細書中で用いられるように、　「クロマトグラフィー」は、化合物の混合物 を含有する溶液の、吸着剤または、通常、グランエンド剤または他の連続的溶出 剤と共に溶出される他の支持物質への適用を含有すると定義される。支持マトリ ックスから溶出される物質は、溶出物で指定される。連続的溶出は、カラム中の 支持マトリックスを単離し、そして、支持マトリックスに対する親和性を変える 溶出溶液を、マトリックスに、段階的にまたは好ましくは勾配によって、通過さ せることで最も慣例的に行われる。「クロマトグラフィー」の定義に、フィルタ ー中の支持マトリックスの位置決め、および溶出剤をフィルターを通して、また はバッチ式に、連続的投与することが包含されることが認識される。 「疎水性相互作用マトリックス」という句は、ポリスチレン樹脂ビーズ、ゴム、 ノリ力をコートしたシリカゲル、または疎水的にするために疎水性基で十分に置 換された架橋アガロースのような疎水性固体である吸着剤を意味すると定義され る。例えば、フェニルまたはオクチルアガロースのようなアルキル置換アガロー スおよびアリール置換アガロースは、代表的な疎水性材料である。疎水性相互作 用クロマトグラフィーマトリックス上でクロマトグラフィーを用いて分離される 物質の混合物は、一般に、高塩濃度溶液において最初にマトリックスに吸着され 、そして、続いて低塩濃度溶液、またはピロールのような疎水性溶媒中で溶出に よってマトリックスから脱吸着される。 「陰イオン交換マトリックス」は、水溶液中で帯電する固体またはゲル支持マト リ、クスを意味すると定義される。支持マトリックスは、水溶液中で正味電荷を 有するように十分にアミン官能基で置換されたアガロースであり得る。吸着され る材料は、一般に、低塩濃度溶液中で陰イオン交換マトリックスに結合され、そ して一般に、陰イオン交換マトリックスに結合し、吸着材料と置き換わる塩化物 イオンのような陰イオンを含有する高塩濃度溶出剤中で陰イオン交換マトリ。 クスから溶出される。 「高塩濃度条件」という句は、イオン物質が高イオン強度条件を創出するために 与えられる水溶液を意味する。イオン強度は、当該技術分野で一般に理解されて いるように定義され、活性定数により修正される溶液中に存在するさまざまなイ オンの推定濃度から計算され得る。慣例的に使用される高塩濃度は、高濃度の硫 酸アンモニウムを含有する溶液で代表される；　しかしながら、塩化ナトリウム 、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、硝酸ナトリウム、またはリン酸ナトリウムの ような他の塩もまた使用される。 「アフィニティークロマトグラフィー」の定義は、Ｗｉｌｃｈｅｋら、１９８４ ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１０４：３の定義と類似であ ると理解される。「アフィニティークロマトグラフィー」は、「生物学的認識に 基づいた精製方法」と定義される。簡単には、その手順は、リガンドを固体支持 体にカップリングし、そしてリガンドと結合するリガンド認識分子を含有する溶 液とリガンドを接触させることを含む。続いて、そのリガンド認識分子は、リガ ンドから遊離され、そして純粋な形で単離される。Ｗｉ　１ｃｈｅｋらが議論し ているように、多様なリガンドがアフィニティークロマトグラフィーに使用され 得、そしてこれらの例は、レクチン、抗体、レセプター結合タンパク質およびア ミノ酸を含むことが理解される。 「細胞」または「組換えホスト」または「ホスト細胞」は、文脈から明らかであ るように、交互に交換して用いられる。 これらの用語は、直接対象となる細胞および、もちろん、それらの子孫細胞を含 む。全ての子孫細胞が、偶発突然変異または環境の違いにより親細胞と全く同一 ではないことが理解される。しかしながら、上記用語を用いるときは、そのよう な変化した子孫が含まれる。 以下は、本発明の抗体の特徴に関する。 本明細書で用いる「抗体」は、ポリクローナル、モノクローナル、および組換え 構築物を指して言う。このように、この用語は、これらの抗原結合フラグメント はもちろん全ての免疫グロブリンを含む。 本発明は、以下にｇｐ８５−９７を指して言うのに十分に精製した分子のクラス 、分子のクラスの構成物をコードするＤＮＡ配列、および材料の記載、およびそ れらを同定し単離する方法を提供する。さらに、ＤＮＡ配列を発現させるための ベクターもまた示す。ｇｐ８ｓ−９７の構成物、あるいはそれに起源する活性フ ラグメントは、いろいろな病気の治療または予防の薬剤として有用である。 本ｇｐ８５−９７ＤＮＡ配列の同定および単離は、ｇｐ９７から得られたタンパ ク質配列によって予想されたＤＮＡ配列に実質的に相同であるＤＮＡオリゴヌク レオチドプローブの設計によって可能となった。そのようなプローブは、ｇｐ９ ７の部分アミノ酸配列の知識を基にして生み出されたので、本発明の議論の順序 は以下である二ｇｐ８５−９７のアッセイ方法；　ｇｐ９７の精製；　ｇｐ９７ の部分アミノ酸配列；　ｇｐ８５−９７をコードする遺伝子の新規なｇｐ９７ブ ローブを用いたクローニング；そして、サブクローニングを一緒に行う、ｃＤＮ Ａライブラリー中のｇｐ９７ＤＮＡ配列の同定；およびその配列の発現。 １、８５−９７’　ｌこ文・　るア　セイｇｐ８５−９７の特性の一つは、植物 凝集素（ＰＨＡ）に刺激された胸腺細胞の有糸分裂促進反応を阻害する能力であ る。ＣｏｎＡのような、特定の他の有糸分裂促進レクチンは、測定し得るほどに ｇｐ８５−９７によって阻害されず、ＰＨＡに対する大きな特異性を示唆してい る。ＰＨＡは見かけ上多数のリンパ球細胞群で、ＤＮＡ合成を刺激するが（リン パ球の小細胞群の有糸分裂促進反応を引き起こす真の抗原刺激とは似ていない） 、被験体のリンパ球のＰＨＡ！１１激への感受性は、患者の全体的な免疫応答性 と相互に関係することが示された。このように、このアッセイは免疫応答性の研 究に広く用いられる。 植物凝集素増殖アッセイ（ＰＨＡ／ＰＢＬ）を実行する手順は、当業者に周知で ある。簡単に言えば、それは、単離されたヒトリンパ球および適切な量のＰＨＡ を含む適当な生理学的溶液中で、適切な数の細胞をインキュベートすることから なる。トリチウム化されたチミジンが４８時間後に加えられ、そして細胞を洗浄 して計数する前に、２４時間インキュベートする。ＰＨＡとのインキ１べ一ンツ ンに先たつさまざまのｇｌ）ＩＩｓ−９７希釈物の添加は刺激を阻害し、放射性 のチミジンのＤＮＡへの取り込みが減少するので、アッセイされる溶液中のｇｐ ８５−９７の相対濃度の評価ができる。 第二のアッセイ（ＰＨＡ／ＩＬ−１）は、ｇｐ８５−９７が、ＰＨＡとＩＬ−１ の存在下で刺激されてＩＬ−２を生産する細胞系からのＩＬ−２産生を阻害する 能力を基づいてｇｐ８５−９７活性を測定することからなる。 多様な細胞系が、この性質を持っていることが知られており、好ましい細胞系は 、ＬＢＲＭと呼ばれるムリンＴ細胞系である。 ＩＬ−２は、いくつかのアッセイによって測定され得、好ましいアッセイは１ｇ −２４時間期後に見いだされる生存能力のあるＨＴ−２細胞の計数である。ＨＴ −２細胞系は、ＩＬ−２がないと死ぬＩＬ−２依存性マウスヘルパーＴリンパ細 胞系である。そのアッセイは、Ｇ１１１ｉｓら１９７８．Ｊ、ｏｆ　Ｉｍｍｕｎ ｏｌ、、１２０：２０２７によって記載されている。簡単に言えば、ｌ　Ｌ−２ に反応してのＨＴ−２細胞の増殖は、［３月チミジン（［２旧ＴｄＲ）取り込み マイクロアッセイによって測定される。ＨＴ−２細胞を、洗浄し、そして１０％ ＦＢＳを含有するＲＰＭ１１６４０培養液に２ｘｌＯ５／ａ＋１濃度で再懸濁す る。等量の細胞および一連の組換えＩＬ−２を含有する希釈物を、９６−ウェル のマイクロタイタープレート（Ｆａｌｃｏｎ／Ｂｅｃｔｏｎ−ＤＬｃｋｉｎｓｏ ｎ　Ｌａｂｗａｒｅ、０ｘｎａｒｄ、ＣＡ　Ｕ、Ｓ、Ａ）に入れる。２４時間後 、インキュベートした培養物を、１　ｕ　Ｃ４［３Ｈ］ＴｄＲ（特異的活性、７ ０Ｃ４／ｍｍｏｌ；Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ、Ｂｏｓｔｏｎ、 ＭＡ、Ｕ、Ｓ、Ａ）で５時間パルスし、ワットマンＣＦ／Ｃフイルター（Ｗｈａ ｔｍａｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、　Ｉｎｃ、、Ｃ１１ｆｔ ｏｎ、ＮＪ、ＵＳ、　Ａ）上に採取し、そして液体ンンチレーンジンカウンター で放射能を測定した。未知試料のＩＬ−２活性は、国際単位にダイアルを合わせ 、組換えヒ１−ＩＬ−２標準品と比較して測定した。 ｇｐａ５−９７を測定するための他の方法は、天然または変性のｇｐａ５−９７ が、１２５Ｉ標識ＰＨＡに、１２５１標識抗ｇｐ８５−９７抗体に、またはＥＣ Ｌキット（ＡＩＩｌｅｒｓｈａｌｌ）を用いてＨＲＰ結合結合ヤギ中サギ抗体に より発生する蛍光によって検出される抗ｇｐ８５−９７抗体に結合する能力に基 づいた。およそのｇｐａ５−９７の濃度は、５ＤＳ−ＰＡＧＥブ、口、トのオー トラジオグラムまたは上記リガンドでプローブされた非変性ドノトブノロノトア ノセイから測定した。 １１、化８５−９７１λ九紅盈 多様な生物学的材料は、ｇｐａ５−９７の供給源として役に立つ。 確立された細胞系は、利用し得、そして実際にそれらはたやすく取り扱われ、そ してスケールアップされ得るので好ましい供給源である。いくつかの細胞系につ いては、ｇｐａ５−９７が分泌され、それゆえ培地中に大量に存在している。こ のように培地はこの分子の主要な供給源で有り得る。例えば、ｇｐ９７は、５Ｋ −ＢＲ−３細胞培養液から好ましく単離される。ｇｐａ５−９７の付加的な構成 物は、他の生物学的供給源から単離され得る；例えば、ヒトの母乳はｇ＋）８５ の供給源である。抗ｇｐＨ５−９７Ａｂと反応するＰＨＡ結合タンパク貫は、ま た、Ａ３７５ヒトメラノーマ細胞系由来の上清中に検出された。 １１１　旺蝕ｊ１］様製 ｇｐａ５−９７の好ましい精製法は、沈降速度勾配およびサイズ排除）ＩＰＬＣ のようなりロマトグラフィーおよび分子質量に基づいた分離のさまざまな用途を 含む。電荷の違いに基づいた分子構造の分離に効果があり、そして本発明に使用 し得るクロマトグラフィーの一例は、陰イオン交換クロマトグラフィーである。 多様な陰イオン交換クロマトグラフィー材料が使用し得るとはいえ、Ｐｈａｒｍ ａｃｉａ　ＩＪＢ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　Ｉｎｃ、から入手し得るＤ ＥＡＥ−セファロースが好ましい。 陰イオン交換体からタンパク質を溶出する方法は、一般に文献に詳細に記載され ている。例えば、ｇｐａ５−９７は適切に緩衝化された塩グラジェントを用いて ＤＥＡＥから溶出され得る。塩の性質およびグラジェントの傾斜は経験的に決め られ得る。 効果的な塩グラジェントの典型例は、約Ｏから０．８モル変化する塩化ナトリウ ムである。 第二のクロマトグラフィー技法は、特に本発明で好ましく、疎水性相互作用クロ マトグラフィーの形である。疎水性相互作用クロマトグラフィー（）ＩＩＣ）は 、フェニルＴＳＫ　ＨＰＬＣカラムビーズのように固体表面に付着したアルキル 基へ結合することによって、一般にタンパク質の疎水的性質に基づいて、そのタ ンパク質の分離に影響を及ぼすクロマトグラフィーと定義される。タンパク質は 、適切な溶媒で固体表面から別々に溶出され得る。ＨＩＣは、一般に初めのクロ マトグラフィーの段階（複数）に続いて使用され、モしてｇｐａ５−９７および 汚染タンパク質のサブセットを高塩濃度で疎水性マトリックスに結合させること によってｇｐａ５−９７をさらに精製する。汚染タンパク質およびｇｐａ５−９ ７は、そこから塩濃度の低下によって溶出し得る。 疎水性クロマトグラフィーを利用するための材料および方法は、５ｈａｌｔｉｅ ｌ　Ｓ、、１９８４．Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ　ｍｏｌｏ　、１０４：６ ９により記載される。ｇｐａ５−９７の精製に使用し得る多くの疎水性クロマト グラフィー材料および固体支持体があることは明らかではあるが、本発明者らは フェニルＴＳＫが好ましいことを見いだした。だが、フェニルセファロースもま た効果的である。 別のクロマトグラフィー手法、高性能液体クロマトグラフィーまたは）ＩＰＬＣ ｌはｇｐａ５−９７の精製度を高めるのに適用し得る。 ＨＰＬＣは、ｇｐａ５−９７の精製に適用されるＨＰＬＣの好ましい／　（−ジ ョンが、疎水性クロマトグラフィー材料を使用する上記の第三の手法に関係する 。この方法は、少なくとも一観点で上記の疎水性クロマトグラフィ一段階とは異 なる。クロマトグラフィーは、適切な塩濃度下、高圧下で起こる。使用され得る 材料ツタイブおよび方法は、Ｒｅｇｎｉｅｒ、Ｆ、、１９８３．Ｍｅｔｈｏｄｓ 　ｉｎ　ＥｎｚＪ」旦■、　９１：１３７によって記載される。本発明で好まし く使用されるのは、フェニル残基を有するクロマトグラフィー材料である。さら に好ましくは、ＢｉｏＲａｄ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎカ）ら入手可能であり、 フェニルＴＳＫという名で販売されて（する調製用および分析用ＨＰＬＣに用い るクロマトグラフィー材料である０上記のクロマトグラフィー技術に加えて、使 用されるクロマトグラフィー材料から予め決められたサイズの構造体を排除する のに効果的である一方、そのクロマトグラフィー材料がより小さなサイズの構造 物を保持するサイズ排除クロマトグラフィーもまた本発明中で使用され得ること が明らかになる。排除カラムを構築するのに用いられるクロマトグラフィー材料 は、広く利用でき、そして多くの商品名で販売されている。−例としてＰｈａｒ ｍａｃｉａ　ＬＫＢ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　Ｉｎｃ、で売られている 種々のセファクリルがある。適切なりロマトグラフィー材料を使用することで、 ｇｐａ　５−９７は他のタンパク質から分離され得る。高純度でｇｐａ５−９７ を得るため、サイズ排除クロマトグラフィーおよび／または速度勾配遠心分離が 、イオン交換および上記の疎水性クロマトグラフィーと併用され得る。 スクロース速度勾配精製が好ましいが、グリセロールのような他のグラジェント もまた使用され得る。 選ばれた精製方法にかかわらず、そしてｇｐａ５−９７が精製された形態である 生物学的材料の性質に依存して、さまざまな精製溶液に１つかそれ以上のプロテ アーゼ阻害剤、例えば、ＥＤＴＡ、　ＰＭＳＦ、およびロイペプチンなどが存在 することが望ましい。さらに、当該技術分野で知られているように、ある精製段 階は、ｇｐＨ５−９７タンパク質分解のリスクを減少させる′ａ度で行われ得る 。 ウェスタンブロッティングまたはＰＨＡアフィニティーブロッティングは、ｇｐ ａ５−９７を含有する調製物を、還元または非還元条件下（Ｌａｅｍｍｌｉ、　 Ｌｌ、　、　１９７０．　Ｎａｔｕｒｅ、　２２７：６８０−６８５）でドデシ ル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、そしてゲルをｇｐａ ５−９７への抗体、Ｂｕｒｎｅｔｔｅ、　１９８１．　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏ、　 Ｃｈｅｍ、　。 １１２：１９５によって一般に記載される標識されたＰＨＡ、またはＢｕｒｎｅ ｔｔｅ法の改変方法でプロッティングおよびプローブすることにより、ｇｐ８ｓ −９７の精製をモニターすることに用いられ得る。 本来のｇｐ８５−９７は、また、未変性タンパク質のドツトプロティングおよび 抗体または標識されたＰＨＡをもちいてプローブすることにより検出され得る。 ＩＶ、　８５−９７のクローニング Ａ、　二工ヱＬ１汰上 １）　ポリメラーゼ　自を　いたクローニング特定の核酸配列は、ポリメラーゼ 連鎖反応（ＰＣＲ）、そして非相補末端上に制限部位を含有する配列を増幅する プライマーを持ちいてベクターにクローニングされる。ＰＣＲは、１９８７年７ 月２８日発行の米国特許第４．６８３．１９５号、１９８７年７月２８日発行の 米国特許第４．６８３．２０２号、および１９８９年１月２４日発行の米国特許 第４．８００．１５９号に記載される。一般に、ＰＣＨによるＤＮＡ配列の合成 ／増幅は、特定のＤＮＡ配列を指数的量で生産する酵素的連鎖反応を包含する。 この場合、配列末端が、それにハイブリタイズするオリゴヌクレオチドブライマ ーが合成され得るように十分詳細に知られており、そして配列の一部分が連鎖反 応を開始するのに利用され得るという条件が必要である。プライマーは、変性Ｄ ＮＡにアニールされ、続いて、ＤＮＡポリメラーゼＩの大きなフラグメント（ク レノー）、または好ましくは界面活性剤およびヌクレオチドの存在下で安定なり ＮＡポリメラーゼのような、適切なりＮＡポリメラーゼ酵素を持いて伸長され、 その結果標的配列を含有する新たに合成された十鎖および一鎖が生じる。代わり に、耐熱性菌中に存在する熱安定酵素が用いられ得る。その酵素は、１９８９年 １２月２６日発行の米国特許第４．８８９．８１８号に記載のＤＮＡ組換え技術 を用いて生産され得る。 ＰＣＲ合成反応で新たに合成された配列は、また、プライマーのテンプレートに なるので、変性、ブライマーアニーリングおよび伸長のサイクルの繰返しの結果 、プライマーの隣接する領域の指数的蓄積が生じる。このように、ＰＣＲは、使 用した特定のプライマーの末端に対応する末端を有するｃＤＮＡ挿入物の離散的 な核酸２本鎖を産生ずる。 また、本明細書中では全体が参考文献として援用される１９８７年９月９日に公 開された欧州公開特許第２３６，０６９号に記載のサーマルサイクル装置（Ｔｈ ｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ　ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）　（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍ ｅｒ　Ｃｅｔｕｓ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）も有用である。 ｇｐ８５−９７をコードするプラスミドＤＮＡまたはそのフラグメントをＰＣＲ 用のテンプレートとしての使用に代わるものは、米国特許第４．８００．１５９ 号に記載されているＰＣＲ用のテンプレートとしてこれら分子を生産するあらゆ る細胞由来のＲＮＡを使用することである。ＲＮＡが出発材料として利用できる ならば、１つのプライマーから合成された伸長産物は、その相補物から分離され ると、他のプライマー伸長産物の合成のテンプレートとして働き得る。前記のそ れぞれのプライマーは、その５′端の近くに池のプライマー上の制限部位と同一 または異なる制限部位を含有する。十分な増幅が起こった後、増幅産物は、適切 な制限酵素（複数）で処理されて、制限切断物中に開裂産物が得られる。次に、 クローニングすることが所望されるフラグメントは、単離され、適切なりローニ ングベクター中に連結される。 ＰＣＲは多様な反応条件を用いて遂行され得るが、上記の参考文献に記載される ように、好ましい反応条件は次の通りである。特定のプローブにハイブダイズす るプラークは、０．５＋＋１の水または好適に緩衝化された溶液に溶出され、そ して５０μｍの溶出液が、１０μｌのｌ０ＸＰＣＲ緩衝液、１．５μｍの１０ｍ Ｍ　ｄＮＴＰ、それぞれ約２０ｐｍａｌｔ１４度の１μｌの１次および２次プラ イマー、活性１単位に等しい０．２μｌのＴａｑポリメラーゼと一緒にされる。 最終容積は１００μｍである。ＰＣＲ１０ｘ緩衝液は、５００ｄのＫＣＩ、　２ ００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＩ、　ｐＨ８，４，２５ｉＭのＭｇＣｌ２、および１ ｍｇ／ｍｌからなる。 所望のｇｐ８５−９７をコードする配列を含有する好適なベクターの構築は、標 準的な連結反応および当該技術分野で周知の制限技術を使用する。単離されたベ クター、ＤＮＡ配列、または合成オリゴヌクレオチドは、開裂され、改変され、 そして所望の形に再連結される。いくつかのこれら方法の簡単な記載を、本明細 書中にあげる。一般的なりローニングおよび分子生物学的技術が、Ｍａｎｉａｔ ｉｓ、Ｔら、１９８９．Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　、ＣｏｌｄＳｐｒ ｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ、、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｂｏｒ、Ｎ、 Ｙ、、第１巻および第２巻）により記載される。 部位特異的ＤＮＡ開裂は、そして、その詳細がこれらの市販の制限酵素の製造者 によって特定される当該技術分野で一般に理解される条件下で、適切な制限酵素 （複数）を用いて、そのＤＮＡを処理することで行う。例えば、Ｎｅｗ　Ｅｎｇ ｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓの製品カタログを参照のこと。一般的に、約１μｇの プラスミド、またはＤＮＡ配列は、約２０μｍの緩衝液中で酵素１単位により切 断される。本明細書中の実施例においては、典型的には過剰な制限酵素が、ＤＮ Ａ基質の完全な消化を確実にするために用いられる。条件の変動は容認し得るが 、インキュベーション時間は約３７°Ｃで約１〜２時間でよい。各インキュ”Ｃ −’／　ｇン後、タンパク質はフェノール／クロロホルムを用いる抽出により取 り除かれ、引続きエーテル抽出され得る。 そして核酸は、エタノール沈澱により水層画分から回収し、続いて、５ｅｐｈａ ｄｅｘ　Ｇ−５０スピンカラムを用いたクロマトグラフィーに供した。所望され れば開裂フラグメントの、サイズ分離は、標準的な技法を用いて、ポリアクリル アミドゲル、またはアガロースゲル電気泳動によって実施され得る。サイズ分離 の一般的記載は、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ　ｍｏｌｏ　、６５：４９９− ５６０（１９８０）中に見られる。 制限フラグメントは、４つのチオキンヌクレオチド３リン酸（ｄＮＴＰ）存在下 で、５ｈＭのトリスｐＨ７，６，５ｈＭのＮａＣ１，６＋＊ＭのＭｇＣｌ２．６ ｍＭのＤＴＴ、および１０＋ａＭのｄＮＴＰ中で２０〜２５℃、インキュベーシ ョン時間約１５〜２５分で、Ｅ、ｃｏｌｉのＤＮＡポリメラーゼ■の大きなフラ グメント、つまりクレノーフラグメントで処理することによって、平滑末端化し 得る。クレノーで処理した後、混合物はフェノール／クロロホルムで抽出され、 そして、エタノール沈澱される。適当な条件下でのＳＬヌクレアーゼ処理は、一 本鎖部分の加水分解に用いられ得る。 連結反応は、以下の標準的条件および温度下の１５〜３０μｌ容量中で一般的に 行なう：　２０ａ＋ＭのＴｒｉｓ−Ｃ１ｐ）１７．５．１０ｍＭのＭｇＣｌ２． １０ｍＭのＤＴＴ、３３μｇ／ｍｌのＢＳＡ、１０ｍＭ〜５０ｍＭのＮａＣ１， および「付着末端」連結反応については、０℃で、１〜４０μＭのＡＴＰ、　０ ．０１−０．０２（ＷｅｉＳｓ）単位のＴ４　ＤＮＡリガーゼ、または「平滑末 端」連結反応については、１ｍＭ　ＡＴＰおよび０．３〜０．６　（Ｗｅｉｓｓ ）単位のＴ４リガーゼを１４°Ｃで用いた。分子間「付着末端」連結反応は、通 常３３〜１００μｇ／＋ａｌの総ＤＮＡｆｉ度で行なう。平滑末端連結反応では 、該末端の総ＤＮＡ濃度は、約１μＭである。 「ベクターフラグメント」を用いるベクター構築では、５゜リン酸基の除去およ びベクターの再連結反応を防ぐため（こ、ベクターフラグメントを、一般に／　 （クチリア由来アルカリ性ホスファターゼ（ＢＡＰ）で処理する。ＢＡｐ消化は 、ｐ）１８で約１５０ｍＭのトリス中、Ｎａ’およびＭｇ”の存在下、ベクター １μｇあたり約１単位のＢＡＰを用いて、６０℃で約１時間反応させて行う。核 酸フラグメントは、上記調製物をフェノール／クロロホルムで抽出し、続いてエ タノール沈澱により回収する。ある０ζよ、不要なフラグメントの追加の制限酵 素消化により、２重（こ切断されたベクター中で、再連結が防止され得る。 以下に示す構築では、最初に適切なＥ、　ｃｏｌ　ｉ株を連結反応混合物で形質 転換することによって正いＡ連結反応力（確認される。成功した形質転換体は、 アンビンリン、テトラサイクＩＪン、または他の抗生物質に対する耐性、あるい は当該技術分野で理解されているプラスミド構築様式に依存する他のマーカーの 使用により選別される。少量調製（Ｍｉｎｉｐｒｅｐ）　ＤＮＡは、Ｄ、　ｌｓ ｈ−ｔ（ｏｗｏｖｉｃｚら、１９８１．Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、 、９：２９８９の方法によって上記形質転換体から調製され得、そして、制限（ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ）によって分析され得、および／または、Ｆ、　Ｓａｎ ｇｅｒら、１９７７、　蹟カ刀旦■、　７４　：５４６３、さらにＭｅｓｓｉｎ ｇら、１９８１．Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、９：３０９により記 載されるジデオキ７法、またはＭａｘａｖａら、１９８０１Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉ ｎ　Ｅｎｚ　ｍｏｌｏ　、６５：４９９の方法により配列決定され得る。 Ｅ、ｃｏｌｉのに１２株ＤＧ９８のようなファージに感染しゃすいＥ、ｃｏｌｉ 株からなるＭ２Ｓへのクローニングに使用されるホスト株が用いられる。このＤ ０９８株は、１９８４年７月１３日にＡＴＣＣに寄託され、その受託番号は１９ ６５である。 形質転換は、選択されたホスト細胞に適切な標準技術を用いて行われる。Ｓ、Ｎ 、　Ｃｏｈｅｎ、　１９７２．　蹟ハ刀４［、６９：２１１０により記載された 塩化物を用いたカルシウム処理、またはＭａｎｉａｔｉｓら、１９８２、Ｍｏ１ ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　＋　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕａｌ　Ｃ ｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ、２５４頁に記載のＲｂＣ１ ２法を、原核生物に用い得る。例えばＳｆ９細胞のような昆虫細胞のトランスフ ェクションは、す／酸カルシウム沈澱技術（Ｇｒａｈａｍ、　Ｆ、　Ｌ、ら、１ ９７３．　Ｖｉｒｏｌ虫、５２：４５６）の、昆虫細胞に適合（Ｊ、　Ｐ、　Ｂ ｕｒａｎｄら、１９８０．　Ｖｉｒｏｌｏｇ、１０１　；Ｅ、　Ｂ、　Ｃａ５ｓ ｔｅｎｓら、１９８０．　■胆泣■、１０１：３１１）する修正法を用いること で成し遂げられ得る。 Ｂ、オリゴヌクレオチドム　： 合成オリゴヌクレオチドは、Ｍａｔｔｅｕｃｃｉら、１９８１．　Ｊ、　Ａａ　 Ｃｈｅｍ、　Ｓａｃ、、１０３：３１８５のトリエステル法または市販の自動オ リゴヌクレオチド合成機を用いて調製され得る。アニーリングする前の、または 標識化のための一本鎖のリン酸化を、５０ａ＋ＭＴｒｌｓｓ　ｐＨ７，６，１０ ｍＭ　ＭｇＣｌ２．５ｍＭジチオスレイトール、１〜２ｍＭ　ＡＴＰ、１．７ｐ ｍｏｌλ”Ｐ−ＡＴＰ　（２，９ｍＣ４／ｍｍｏｌ）、０．１ｍＭスペルミジン 、０．１ｍＭ　ＥＤＴＡの存在下で、Ｏ，ｌｎｍｏｌの基質に対して過剰の（例 えば、約１０単位の）ポリヌクレオチドキナーゼを用いて行う。 以下に記載した部分Ｎ−末端および内部のｇｐ８５−９７アミノ酸配列、および それに加えて既知のコドン縮重を用いて、以下に記載のように、ＤＮＡオリゴヌ クレオチドを合成し、ｇｐ８５−９７をコードする配列に対するｃＤＮＡライブ ラリーをプローブするためのプローブとして、またはＰＣＲ反応を行うためのプ ライマーとして用いた。 Ｃ，８５−９７ＤＮＡ　ｌのｄ　および　：ｇｐ８５−９７のＤＮＡ配列を同定 するのに適切であり得る手順としては、いくつかの手順が利用可能である。１つ の手順は、上記のように同定および合成したオリゴヌクレオチドプローブを用い て、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることである。ｃＤＮＡライブラ リーは、当該分野において周知の技法を用いて構築され得るか、または市販のも のが用いられ得る。 ｇｐ８５−９７配列を含むＣＤＮＡライブラリーを作製する例示的な手順は、適 切な開始材料から得た全細胞質ＲＮＡを単離する工程とさらにそれからメツセン ジャーＲＮＡを単離する工程とからなり得る。後者のメツセンジャーＲＮＡは、 さらにポリ（Ａ＋）メツセンツヤ−ＲＮＡに分画され得、これは、順にｇｐ８５ −９７メソセンジヤーＲＮＡを含むポリ（Ａ＋）メツセンジャーＲＮＡ画分にさ らに分画される。次いで、目的とするｇｐ８５−９７メ／センジヤーＲＮＡを逆 転写し、適切なベクター中にクローニングしてｃＤＮＡライブラリーを作製し得 る。 さらに詳細には、開始材料（すなわち、組織、細胞）をリン酸緩衝生理食塩水で 、そして非イオン性デタージェント（例えば、エチレンオキシドのポリマー）で 洗浄する。例えば、ＮＰ−４０を、細胞膜を溶解する量で、好ましくは通常約０ ．３％で、加える。次いで、１．０００　Ｘ　ｇで１０分間の遠心分離にかけて 核を取り除き得る。核を取り除いた後の上清を、等量のＴＥ（１０ｍＭ　Ｔｒｉ ｓ、　１ｍＭエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、ｐＨ７，５）で飽和し た、０．５％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）および１０ｍＭ　ＥＤＴＡを含 有するフェノール／クロロホルム（１：１）に加える。この上清を４回再抽出し 、２．０００　Ｘ　ｇで１２０分間の遠心分離により水層を分離する。試料を０ ．２５Ｍ　ＮａＣ１に調整し、２倍量の１００％エタノールを加え、−２０°Ｃ で貯蔵することにより、ＲＮＡを沈澱させる。次いで、このＲＮＡをｓ、ｏｏｏ 　ｘ　ｇで３０分間でペレット化し、７０％および１００％のエタノールで洗浄 し、乾燥する０　これにより、全細胞質ＲＮＡが得られる。ポリアデニル化（ポ リＡ＋）メツセンツヤ−ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）は、オリゴ（ｄＴ）セルロースでの りロマトグラフイーにより、全細胞質ＲＮＡから得られ得る（Ｊ、Ａｖｉｖ呟　 １９７２．　ＰＮＡＳ、６９：１４０８−１４１２）。ＲＮＡは、２ｍｇ／ｍｌ の濃度でＥＴＳ　（１０＋ｓＭ　Ｔｒｉｓ、１ｉＭ　ＥＤＴＡ、　０．５％ＳＤ Ｓ、　ｐＨ７，５）に溶解する。 この溶液を６５℃に５分間加熱し、次いで４℃に急冷する。ＲＮＡ溶液を室温に 戻した後、この溶液を０．４Ｍ　ＮａＣ１に調整し、結合緩衝液（５００ｍＭ　 ＮａＣ１，１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、１ａ＋Ｍ　ＥＤＴＡ、　ｐＨ７，５）で予め平 衡化したオリゴ（ｄＴ）セルロースカラム中にゆっくりと通す。流した溶液をさ らに２回カラムに通し、そしてカラムを１０倍量の結合緩衝液で洗浄する。ポリ （Ａ＋）ｍＲＮＡを、ＥＴＳのアリコートで溶出し、ＴＥ胞相和フェノールクロ ロホルム１回抽出し、ＮａＣ１を０．２Ｍに調整して２倍量の１００％エタノー ルを加えることにより沈澱させる。このＲＮＡを２回再沈澱し、乾燥前ζこ７０ ％エタノールで１回、次いで１００％エタノールで洗浄する。 次いで、ポリ（Ａ＋）ａ＋ＲＮＡを用いて、ｃＤＮＡライブラリーを作製し得る 。 ｃＤＮＡは、Ｏｋａｙａｍａ、Ｈ，、ら、１９８３．　Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｌ　Ｂ ｉｏｌ、、ｉ：２８０の方法（本明細書中に参考として援用されてｔする）を用 ０て、ポリＡテイルのオリゴ（ｄＴ）ブライミングおよびＡＭＶ逆転写酵素を用 い、ｍＲＮＡが富化された画分から作製され得る。 ｃＤＮＡライブラリーを調製する他の方法もまた、もちろん当該分野において周 知である。１つの方法は、オリゴ（ｄＴ）プライマー、逆転写酵素、ボ’Ｊ（ｄ Ｇ）での二本鎖ｃＤＮＡの末尾付加（テーリング）、およびｐＢｌ’１３２２ま たはそれらの誘導体のような適切なベクターへのアニーリングを用し）、この方 法（こより、所望の制限部位で切断され、ポリ（ｄＣ）で末尾付加される。こ７ ４８号に見いだされる。この特許は、１９８３年４月１３日に公開され、同−譲 渡人に譲渡されており、本明細書中に参考として援用されている。実際、この方 法は好ましく、ベクターｐＣＤＬ−３Ｒα２９６を用いてｒＨｐ−を細胞系がら ｃＤＮＡライブラリーを作製するのに用い、ｇｐ８５−９７のＤＮＡ配列を同定 し、単離した。 好ましいｃＤＮＡライブラリーは、上記の方法により、ヒト単球性白血病細胞系 のＴＨＰ−１（Ｒｅｓ、　１ｎｓｔ、　ｆｏｒ　Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓａｎ ｄ　Ｃａｎｃｅｒ、　Ｔｏｈｏｋｕ　Ｕｎｉｖ、ＪａｐａｎのＤｒ、　Ｔｓｕｃ ｈｉｇａ）からのｍＲＮＡを用いて作製される。 最も好ましくは、メゼリン（ｍｅｚｅｒｉｎ）処理ＴＨＰ−１細胞から単離した ｍＲＮＡ、およびベクターｐＣＤＬ　ＳＲα−２９６を用いてｃＤＮＡライブラ リーを構築することである。ｐｃＤＬｓ！？α−２９６は、ＤＮＡＸ　Ｃｏｒｐ ｏｒａｔ　ｉｏｎから入手し得、Ｔａｋｅｂｅら、１９８８．　Ｍｏ１ｅｃｕｌ ａｒ　ａｎｄ　Ｃｅ１１ｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏ　、　８（１）：４６６により； および米国特許第４．６９５゜５４２号中に記載されている。 最後に、上述のように、ｃＤＮＡライブラリーは市販されており、所望のｇｐ８ ５−９７　ＤＮＡ配列を同定し単離するために、これを購入して用い得る。特に 有用なライブラリーは、Ｃ１ｏｎｔｅｃｈにより販売されている（カタログ番号 ＃Ｌ　Ｈ１００８）。これは、全ポリ（Ａ＋）メツセンジャーＲＮＡから作製さ れたλｇｔｌｌヒト胎盤ＣＤＮＡライブラリーである。 ■、８５−９７に文・　る ｇｐ８５−９７に対するポリクローナル、モノクローナル、または組換え抗体は 、種々の技法を用いて生成され得る。非ヒト抗体でも十分に働くが、抗体は、好 ましくは、ヒトまたはヒト形化したものである。高力価中和ポリクローナル抗体 の調製は、種々の種を免疫感作し、いくつかの異なる免疫感作レジメのうち１つ を用いることにより行われ得る。本発明の好ましい方法は、完全フロインドアジ ュバント中で調製したｇｌ）８５＝９７で、ウサギを免疫感作することである。 ８５〜９７ｋＤの分子および／またはそれらに由来するフラグメントを含む天然 複合体が、免疫原として利用され得る。動物には、続いて複数回の不完全フロイ ンドアジユバントでのブースト（目的とする分子の元の量の約半分を含む）を、 約２１日の期間をあけて行う。それぞれの約２１日期間から約１０日後に、２０ 〜３０＋ｅｌの血液を採り、血清を単離し、そこから抗体を単離する。この手順 は、数カ月間行われ得る。 モノクローナル抗体は、天然ｇｐ８５−９７複合体、そのサブユニット、または それら由来のフラグメントを免疫原として用いて産生され得る。その手順は、Ｋ ｏｈｌｅｒ、　Ｇ、およびＭｉ　ｌ５ｔｅｉｎ。 Ｃ，、１９７５，Ｎａｔｕｒｅ、　２５６：４９５により記載の手順、または当 該分野において周知であるそれらの改変法が用いられ得る。 上記のＫｏｈｌｅｒおよびＭｉ　１ｓｔｅｉｎの研究は、マウスリンパ球と薬剤 選択性プラズマ細胞腫とを融合してハイブリドーマを生成することに関わる。適 切なプラズマ細胞腫は、Ｓｐ　２１０−Ａｇ１４てあり、当業者に広く用いられ ている。ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎの研究以後、ハイブリドーマ技法 は、ヒトモノクローナル抗体を分泌するハイブリッド細胞系を生成するために用 いられている。最近では、Ａｂｒａｍｓ、　Ｐ、　１９８６．　Ｍｅｔｈｏｄｓ 山り担ｕ肛艮■、　１２１：１０７に記載の手法が一般的に用いられるが、他の 改変法は、当業者に周知である。 産生される抗体がマウスまたはヒト抗体であるかどぅかに関わらず、抗体分泌細 胞を融合パートナ−と組合せ、その細胞を適切な融合剤、好ましくはポリエチレ ングリコール、より好ましくはポリエチレングリコール１０００で融合する。こ の融合剤を、抗体分泌細胞を含む細胞ペレットおよび融合パートナ−に、短時間 穏やかに攪拌しながら少量加える。融合剤を加えた後、細胞混合物を洗浄して融 合剤および細胞デブリを除去し、そして融合細胞および非融合細胞からなる細胞 混合物を選択増殖培地を含む適切な細胞培養チャンバーに播種する。数週間後、 ハイブリッド細胞が見られ、目的とする抗体産生に対してスクリーニングし、サ ブクローニングして、安定なハイブリッド細胞系を確実に得られるようにし得る 。 細胞はまた、当該分野において周知である電気融合法を用いても融合され得る。 好ましい抗体は、ｇｐ８５−９７材料により感作されたリンパ球からＦｉ製され 得るヒトモノクローナル抗体である。この抗体の調製は、上記の細胞融合法を用 いて、インビボまたはインビトロのいずれかで、抗体産生ハイブリッド細胞系を 不朽化し、それにより所望の抗体の永久源を得ることにより行われる。 あるいは、感作リンパ球は、２つの技法、ウィルス形質転換および細胞融合、の 組合せにより不朽化され得る。好ましい組合せは、エプスタイン・バールウィル スでの抗体産生細胞の形質転換と、次いで行われる適切な融合パートナ−への形 質転換細胞の融合とからなる。このような融合パートナ−は当該分野において周 知であり、例えば、融合パートナ−は、マウス骨髄腫細胞系、異種骨髄腫系（ｈ ｅｔｅｒｏｎｙｅｌｏｍａ　１ｉｎｅ）、またはヒトを髄腫系、または他の不朽 化細胞系であり得る。 ＰＣＴ特許出願第８１１００９５７号；　５ｃｈｌｏ＋ｓら、１９８０．　ＰＮ ＡＳ　ＵＳＡ、　？７：６８４１　；　Ｃｒｏｃｅら、１９８０．Ｎａｔｕｒｅ 、　２８８：４８８゜好ましい融合パートナ−は、マウス−ヒト異種ハイブリッ ドであり、より好ましくは、Ｆ３Ｂ６と称される細胞系である。この細胞系は、 Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、受託番 号ＨＢ８７８５として寄託されている。これは１９８５年４月１８日に寄託され た。Ｆ３Ｂ６を作製する手順は、欧州特許出願、公開番号第１７４，２０４号に 記載されている。エプスタイン・バールウィルス形質転換の使用および不朽化抗 体分泌細胞系の産生に適した技法は、Ｒｏｄｅｒ、　Ｊ、ら、１９８６、　Ｍｅ ｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ　ｍｏｌｏ　２．１２１＋１４０に示されている。 上述のように、本発明の好ましい実施管機は、ｇｐ８５−９７モノクローナル抗 体を不活性化することであるが、このような抗体は改変されて生物学的活性を維 持し得ることが、当業者に明らかである。従って、本発明の範囲内には、例えば Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、　Ｆｖなとのような種々のサイズのフラグメントに還 元（ｒｅｄｕｃｔ　１ｏｎ）することにより改変された抗体が含まれる。また、 抗体を産生ずるハイブリッド細胞系は、所望の抗体をコードするＤＮＡの供給源 であるとみなされ、これらは、遺伝的に工作された抗体を産生ずるために、既知 の遺伝子技術により単離されて細胞に転移され得る。後者の例は、本明細書中に 記載のハイブリドーマの抗体結合部位を有する一本鎖抗体を産生ずることである 。一本鎖抗体は、米国特許第４．７０４．６９２号に記載されている。 遺伝子的に工作された抗体の２番目の例は、組換え抗体、またはキメラ抗体であ る。組換え抗体を産生ずる方法は、Ｃａｂｉｌｌｙらによる米国特許第４．１１ １６．５６７号；　１９８４年８月１５日に出願された日本特許出願番号筒８４ −１６９３７０号；　１９８４年９月３日に出願された英国特許出願８４２２２ ３８；　１９８Ｓ年１０月２８日に出願された日本特許出願第８５−２３９５４ ３号に示されている。また、１９８６年３月２７日に出願された英国特許出願第 ８６７６７９号には、軽鎖または重鎮の可変ドメインの相補的決定領域（ＣＤＲ ｓ）の少なくとも一部分が、異なる特異性の抗体由来のＣＤＨの相似部分により 置換されている改変抗体を産生ずる方法が記載されている。 その明細書中に記載されている手順を用いることにより、ある種において、置換 されたＣＤＲ領域を有する別の種に由来の抗体に融合したＣＤＲ領域を有するよ うな組換え抗体を構築することが可能である。 出願人が彼らの発明であると考えていることを記載しており、ヒト乳および５Ｋ −ＢＲ−３細胞からそれぞれ単離されたｇｐ８５およびｇｐ９７に関連する以下 の実施例は、本発明を説明するものてあり、本発明の範囲を限定するように構築 されるものではない。例えば、起源、種類、または方法における変更は、本発明 の範囲から逸脱することなく用いられ得る。 支意且Ｊ ＳＫ−ＢＲ−３９７のアッセイ　１　、けｇｐ８５−９７の活性を、２つのＰＨ Ａ−刺激細胞アッセイのうち１つを用いて測定した。ヒト末梢血単核細胞を、Ｆ ｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（Ｐｈａｒ＋ｎａｃｉａ　ＬＫＢ　Ｂｉｏｔｅｃｈ ｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｃ、）を用いる密度遠心分離により、新鮮なヘパリン処理血 液から単離した。単核細胞を、界面から単離し、１％Ｌ−グルタミン、ペニシリ ン（１００単位／ｍｌ）、ストレプトマイフン（１ｏｏ　ｔｔ　ｇ／＋１）を補 足したＲｏｓｙｅｌｌ　Ｐａｒｋ　Ｍｅｍｏｒｉａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　１ ６４０（ＲＰＭＩ　１６４０）培地で３回洗浄し、そして得られた細胞を、アッ セイの実施に用いられる培地に再懸濁した。 この単核細胞を、以下を含むアッセイ混合物中に、細胞０゜６７　Ｘ　１０’個 ／ｍｌの濃度て再懸濁した：　２５ｍＭヘペス、１０％熱不活性化ウンつ児血清 、１％Ｌ−グルタミン、および２％ベニンジン（２００単位／ｍｌ）およびスト レプトマイシン（２００μｇ／＋＋ｌ）を含むＲＰＭＩ　１６４０゜ 次に、ＰＨＡ　（０，２５μｇ／ｍｌ）を含む単核細胞懸濁液１５０μｌを、９ ６ウエルのＵ底の組織培養プレート（Ｃａｓｔｅｒ）のウェル中に加えた。この 懸濁液は、細胞をＩ　Ｘ　１０５個／ウェル含んでいた。 この混合物を、ｇｐ８５−９７活性をアッセイする試料５０μ１１　またはコン トロール緩衝液５０ｔ１１のいずれかを含むウェルに加えた。 この９６ウエルプレートを、３７℃で３日間組織培養インキュベーター中でイン キュベートした。アッセイを完了する１８時間前に、細胞培養物を０．５ｕＣｉ ／ウエルの３Ｈ−チミジン（２Ｃｊ／ｍｍｏｌ）で標識した。１８時間の放射線 標識の後、９６ウエルプレートからの細胞を、自動細胞採集機（ａｕｔｏｍａｔ ｅｄ　ｃｅｌｌ　ｈａｒｖｅｓｔｅｒ）　（Ｓｋａｒｔｏｎ、Ｉｎｃ、、Ｓｔｅ ｒｌｉｎｇ、　Ｖｉｒｇｉｎｉａ）で採集し、液体シンチレーション計数を行っ た。ＬＫＢβプレート／ンチレーションカウンター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＬＫ Ｂ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　Ｉｎｃ、　）を用い、ＤＮＡへの３日−チ ミジンの取り込みを測定した。図に示したデータは、コントロール緩衝液を含む 培地で処理したフントロール細胞と比較した、増殖の阻害パーセントとして表し ている。 上記の増殖アッセイに加えて、ｇｐＨ５−９７活性を、その分子の、ＬＢＲＭ− ３３細胞からのＩＬ−２の産生を阻害する能力を測定することによりアッセイし た。ＰＨＡおよびＩＬ−１の存在下で、この細胞系がＩＬ−２を分泌するので、 増殖のためにＩＬ−２を必要とするＨＴ−２細胞でアッセイされ得る。 このアッセイは、９６ウ工ル組織培養プレート（Ｆａｌｃｏｎ　Ｃａｒｐ、、　 ３０７２）で行った。ｇｐ８５−９７に対して試験しようとするクロマトグラフ ィー画分をＰＢＳ中で透析し、１０％ウシ胎児血清および５　Ｘ　１０−５Ｍβ −メルカプトエタノールを補足したＲＰＭＩ　１６４０からなるアッセイ培地に 希釈した。最終容量は、５０μｌ／ウエルであった。アッセイの前に、プレート を紫外線照射により滅菌した。次に、ＬＢＲＭ−３３細胞を上記のアッセイ培地 にＩｌｌ当たり５Ｘ　１０５個に希釈し、そしてＰＨＡ−Ｌ　（Ｓｉｇａ＋ａ　 Ｌ−４１４４）を最終濃度が２５Ｍｇ／＋ｔｌになるように加えた。１００μｌ ／ウエルのＬＢＲＭ−３３細胞を試料に加え、ｇｐ９７活性に対して試験した。 ＩＬ−１を加える前に、この混合物を３７℃で１時間インキュベートした。 １時間インキュベートした後、最終濃度が０．０８単位／ｍｌとなるように、Ｉ Ｌ−１を５０μｌ／ウエルで各ウェルに加えた。ＩＬ−１は、アッセイ培地中で 、０．３１２単位／ｍｌの濃度になった。ＩＬ−１を与えないコントロール試料 には、５０μｌ／ウエルのアッセイ培地のみを与えた。ウェル中のＩＬ−１の最 終濃度は、０．０８単位／ｉｔであった。コントロールは、Ｐ）ＩＡを与えずＬ ＢＲＭ−３３細胞を含むウェルと、ＬＢＲＭ−３３細胞およびＰＨＡの両方を含 まないウェルとを包含する。 次いで、組織培養インキュベーター中で３７℃で１８〜２４時間、ウェルをイン キュベートした。このプレートを１．００Ｏｒｐｍで１０分間遠心分離すること により細胞をペレット化し、各ウェルの上清の最上部分５０μｍを新しいウェル に移した。ＨＴ−２細胞番よ、アッセイ培地で細胞２×１０５個／ｍｌの濃度に まで生成され、このうち５０μｍを、ウェルに対して５０μｌの上清を含むよう に加えた。ＨＴ−２細胞を３７℃で１８〜２４時間インキュベートし、１ｕＣ１ ／ウエルの３Ｈ−チミジン　（５０μｌ／ウェル、ＮＥＮ　Ｎｏ、ＮＥＴ−０２ ７Ａ）でのパルスを３〜４時間行った。ウェルを自動細胞採集機で採集し、液体 ／ンチレー７ヨン計数を行った。 ノティング： ｇｐ８５−９７のｍｌをモニターするために、ウェスタンブロッティング、また はＰＨＡアフィニティーブロッティングを用いた。 このプロ・ノティングは、その分子を含む調製物を、還元下、または「非還元」 条件下で（Ｌａｅｍｉｌｉ、　Ｕ、、　１９７０　Ｎａｔｕｒｅ、　２２７　： ６８０−６８５）　ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル 電気泳動にかける工程、および、プロットし、そのプロットをｇｐ８５−９７ま たは標識ＰＨＡに対する抗体でプローブする工程からなる。これらは、一般的に はＢｕｒｎｅｔｔｅ、１９８１．　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏ、　Ｃｈｅｍ、、　１１ ２＋１９５に記載の方法、または、Ｂｕｒｎｅｔｔｅ法の改変法により行われる 。試料を、０．４５μｍ　ＩＩＩｍｏｂｉｌｏｎ　Ｐ　（Ｍｉｌｌ　１ｐｏｒｅ ）上にプロットし、０，０２％アジド、０．１％ウソ血清アルブミン、０．１％ オボアルブミン、および０，１％Ｔｗｅｅｎ　２０が加えられた、３＋ｎＭ　Ｋ ＣＩ、　０．１４Ｍ　ＣａＣ１，１，５ａＭ　Ｋ２ＨＰＯｊ、　８ｍＭ　ＮａＨ ２ＰＯｊ。 ｐＨ７，４（ＰＢＳ）からなるウェスタン緩衝液でブロックＬ、！２８１−ｐＨ Ａ−Ｌ　（Ｐｉｅｒｃｅ　１ｏｄｏ−Ｂｅａｄｓを用いて標識した）でプローブ し、洗浄し、マルチワイヤー比例検出器（ｍｕｌｔｉ−ｗｉｒｅ　ｐｒｏｐｏｒ ｔｉｏｎａｌ　ｄｅｔｅｃｔｏｒ）　（自動化されたＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ 　Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ、）で計数した。 いくつかの場合において、ｇｐ８５−９７の濃度を、順に画分を希釈し、ポリビ ニリデンジフルオライド紙上にドツトプロットし、抗ｇｐ８５−９７Ａｂでプロ ーブし、モしてｇｐ９７の希釈に対して標準化したオートラジオグラムの定量走 査を行うことによってもまた測定した。比重測定は、Ａｂａｔｏｎ　５ｃａｎプ ログラムで、Ａｐｐｌｅ　Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ　ＩＩコンピューターおよび１６ ビノトＡｐｐｌｅスキヤナーを用いて行った。選択されたドツトプロ、ト希釈の オートラジオグラムを走査して、相対的なｇｐ８５−９７濃度を、ドツトの平均 密度に対する生成物サイズのドツト倍から、Ｉｉ＋ａｇｅ１３５、プログラムを 用いて測定した。絶対的なｇｌ）８５−９７濃度は、次いで、同じオートラジオ グラム上で、既知の量の精製ｇｐａ　５−９７の希釈を走査することにより測定 され得る。 抗ｇｐ８５−９７抗体ドツトプロットのために、精製された天然ｇｐ９７に対す るポリクローナルウサギ抗体を、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ　Ａｎｔｉｂ。 ｄｙ　Ｃｏ＋ｎｐａｎｙにより調製し、プロティンＡセファロースクロマトグラ フィーにより、次いで９７ｋＤおよび７０ｋＤの５Ｋ−ＢＲ−３ｇｐ９７サブユ ニット（高性能電気泳動クロマトグラフィーにより精製された）を用いるアフィ ニティークロマトグラフィーにより精製した。これらのサブユニットは、Ｂｉｏ Ｒａｄ　Ａｆｆｉｇｅｌ　１０／１５に結合しており、１）Ｈ２での０．ＩＭグ リンフン溶出した。ｇｐ８５−９７′ａＩｉは、順に希釈した試料をドツトプロ ットし、ブロックしく上記と同様）、１２５１−襟識抗ｇｐＨ５−９７抗体でプ ローブし、そしてオートラジオグラムての定量比重測定を行うことにより測定し た。 ｇｐ８５−９７のＮ末端気相配列決定は、精製した物質の以下の５ＤＳ−ＰＡＧ ＥおよびＰＶＤＦメンブレンへの転移に続いて行われ得る。 内部アミノ酸配列は、適当な酵素（例えば、Ｌｙｓ−Ｃブロテアーセ）　テｇｐ ８５−９７を消化し、次イテ５ＤＳ−ＰＡＧＥニかけ、ＰｖＤＦメンブレン上に 移し、ＡＢＩ気柑／−クエンサーを用いて配列決定することにより得られ得る。 ＋１．旺Ｈ亘■Ｉ ｇｐ９７の精製の供給源として、１０リツトルの５Ｋ−ＢＲ−３細胞培養土清を 用いた。培地を採集する前に、細胞を血清フリーおよびインスリンフリーのＤＭ ＥＭ培地で３日間培養した。 馴化培地を種々のプロテアーゼインヒビターを含むように調整した。このインヒ ビターには、１＋ｎＭ　ＥＤＴＡ、１　ｔｔ　ｇ／ｍ１ロイペプチン、および２ ００μＭ　ＰＭＳＦが含まれる。精製の間を通して、これらの濃度でのこれらの インヒビターを全ての緩衝液中で用いた。 馴化培地を、Ａｍ１ｃｏｎ　ＹＭＩＯ５ｐｉｒａｌ　Ｃａｒｔｒｉｇｅ濃縮器で ２０倍に濃縮した。保持物質を２５１１ＩＭトリス緩衝液、ｐＨ８，５中で透析 し、５　Ｘ　２０　ｃｍの大きさのＤＥＡＥ−セファロース（Ｐｈａｒｍａｃ　 ｉａ）カラムを通してクロマトグラフィーにかけた。タンノくり質を、全容量１ ．５リツトルをｔｏｉｌ／分の速度で流した塩化ナトリウムの０〜０．７Ｍのグ ラジェントで溶出した。ｇｐ９７を富化したこれらの画分を、次のクロマトグラ フィー手順を開始する前に、プールして、硫酸アンモニウム、ｐＨ７，０で０． ８Ｍにした。 ＤＥＡＥ−セファロ−スプール画分から得た全量１５ｈｇのタンノくり質をそれ ぞれ含有する３つのアリコートを、２１．５　ｘ　ｌｓ。 ＋＋ｏｎの大きさのＢｉｏＲａｄの調製用フェニル−ＴＳＫ　）ＩＰＬＣカラム にそれぞれ別々にかけた。タンパク質を、硫酸アンモニウムを減少させ（０，８ Ｍで開始）エチレングリコールを０から３０％に増加させる十字交差型グラジェ ントで、３　ｍ１７分でカラムから溶出した。３つのＤＥＡＥ−セファロースア リコートのそれぞれをこの方法で処理し、続いてフェニルｉＳＫカラムからｇｐ ９７の単一ピークを得た。この段階での精製のフェニル−ＴＳＫクロマトグラフ ィーの代表例を、図１に示す。これらのフェニル−ＴＳＫカラム画分をプールし 、リン酸緩衝生理食塩水中で透析し、ＹＭＩ　Ｏメンブレンを用いるＡｍ１ｃｏ ｎ　５ｔｉｒ　ｃｅｌ＋で２０倍に濃縮した。 次に、濃縮した物質の２ｍｌアリフートを、リン酸緩衝生理食塩水で緩衝させた ５から５０％のスクロースグラジェント３７ｍ１で展開し、１０℃、２４．００ Ｏｒｐｍで３９時間、Ｂｅｃｋｍａｎ　５Ｗ２Ｂローターで遠心分離した。チュ ーブの底に穴を開け、そこから画分を採取した。この精製ｇｐ９７を、プロテア ーゼインヒビターを含まないリン酸緩衝生理食塩水中で透析し、０．４５μｒａ 　ａｃｒｏｄｉｓｃフィルター（Ｇｅｌｍａｎ　５ｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて濾 過滅菌し、そして４°Ｃで貯蔵した。５Ｋ−ＢＲ−３細胞の３日間培養から得た 馴化培地から始まる精製プロトコルにより、３．３ｏ＋ｇのｇｐ９７が得られ、 この画分は、７０ｋＤおよび２７ｋＤの７ラグメントに切断されていた。これは 、３００倍精製に相当し、回収率は２０％であった。 本質的に同一の精製から得られた精製ｇｐ９７タンパク質を、ＰＢＳに対して透 析し、Ａｍ１ｃｏｎ　ＹＭ３０限外濾過により０．５Ｂｇ／ｍｌに濃縮した。こ れを、Ｏ，ＬＭ　トリス、ｐＨ１１，９および０．１％ＳＤＳおよび０．１ｍＭ チオグリコレート中で１時間予め電気泳動し、次いで緩衝液（０，１ｍＭチオグ リコレートを含む）を流してゲルを回復させた８％還元５Ｏ３−ＰＡＧＥに流し 、試料を分離した。タンｌ＜り質のバンドをＰＶＤＦメンブレン（Ｐｒｏ−Ｂｌ ｏｔ、　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｏ＋ｓ、Ｉｎｃ、）に移し、簡単な り−マンーブルー染色により可視化した。優勢な７０ｋＤのバンドを検出し、次 いで気相ンークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて配 列決定した。以下のＮ末端配列が得られた：　ＶＮＤＧＤＭ？ＬＡＤ、　９７ｋ Ｄの分子量のバンドもまた、本質的に同一の３番目のｇｐ９７１ｉ製物から配列 決定し、以下のＮ末端配列を得た：　（配列番号・ｌ）。 Ａ、丘住佳Ｕ； 精製５ｘ−ｓＲ−３？Ｉ合体の見かけの固有分子量は、２．５ｍＭ　ＥＤＴＡ、 ０．２ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオライド、および２μｇ７１０イペブ チンを含むリン酸緩衝生理食塩水中の５から２０％のスクロース（Ｗ／Ｖ）グラ ジェント１２ｍ１を用いる沈降速度法により推定した。精製５Ｋ−ＢＫ−３ｇｐ ９７　（６μｇ）を、０．２ｍｇのウシ血清アルブミンと、全部で２００μｍの ＰＢＳ中で混合し、１５℃、２８Ｋｒｐｎ＋で１６時間、５１４０　Ｃュータ− で遠心分離した。画分を底から採集し、ＢｉｏＲａｄアッセイによりマーカータ ンパク質に対してアッセイした（５９５ｎｍで読み取る）。２００μｌ　ＰＢＳ 中に４００ｕｇ　ＢＳＡおよび６００ｕｇ　ＩｇＭ　Ｔａ２を含むコントロール グラジェントもまた、平行して行った。ｇｐ９７のピークは、各両分１０μｍの ウサギ抗ｇｐ８ｓ−９７／ヤギ抗ウサギ１（ＲＰ抗体検出により位置を突き止め 、続いてこれを希釈し、ＰＶＤＦメンブレンにトンドブロットし、蛍光により可 視化した。オートラジオグラムを走査して、相対的なｇｐ９７濃度を定量し、ピ ークの位置を決定した。巨大分子の沈降係数は、固有分子量を決定するために用 いられた。 ｇｐ９７のＳ値は、約２５であった。 ５Ｋ−ＢＲ−３細胞培養上清から単離したｇｐ９７の見かけの固有分子量はまた 、移動相として０．５＋ｅｌ／分のリン酸緩衝生理食塩水を用いるセファロース ６サイズ排除ＨＰＬＣカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）でのクロマトグラフィーに より推定した。図３に結果を示す。 上記のような’　２５１−ＰＨＡドツトプロ、ドア７セイを用いて、ｇｐ９７を 含む画分を同定した。見かけの固有分子量は、最も大きい襟準であるＩｇＭ　Ｔ ａ２よりも大きく、１２００ｋＤを超えると推定される。ＩｇＭ　Ｔ８８モノク ローナル抗体を分泌するハイブリドーマは、　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃ ｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎに受託番号）ＩＢＴ４３１で寄託されてい る。 精製５Ｋ−ＢＲ−３ｇｐ９７複合体の密度は、平衡密度遠心分離により測定した 。ここで、３０μｇのｇｐ９７を、密度１．３５ｇｍ／讃ｌでＣｓＣｌを含むリ ン酸緩衝生理食塩水１４ｍ１中に混合した。この混合物を、５℃、２Ｂ、　ＧＯ Ｏｒｐｍで７０時間、Ｂｅｃｋｍａｎ　５Ｗ４０ローターで遠心分離した。チュ ーブの底に穴を開け、０．５ｍｌの画分を採取し、各面分の密度を、密閉した３ 組のチューブの画分のアリコートを計量することにより測定した。精製５Ｋ−Ｂ Ｒ−３ｇｐ９７の密度は、約１．３５ｇｍ／ｍｌであると決定された。 部分的に精製した［ｐ９７のトリプシン消化に対する感受性を決定するために、 実験を行った。ｇｐ９７天然複合体を、トリプ／ンを用いて、１：１０の割合（ Ｗ／Ｖ、全タンパク質に対するトリブノン）で３７°Ｃて６０分間処理した。１ ２Ｉ４は、消化前と後の物質のＢｌｏ−３ｉｌ　５ＥＣ−２５０サイズ排除ＨＰ ＬＣクロマトグラフイープロフイールを示す。これら２つの調製物の５ＤＳ−Ｐ ＡＧＥにより、手積製ｇｐ９７は、比較的プロテアーゼ抵抗性（トリプシンでの 限定的な消化を行った後）であり７０ｋＤと２７ｋＤのフラグメントに　・なる が、他のバンドはさらに広範囲に分解した。７０　ｋＤバンドのＮ末端配列（Ｐ ＶＤＦメンブレンに移しな後）が、上記の精製５Ｋ−ＢＲ−３ｇｐ９７の配列に 相当した。 レクチン結合の研究をｇｐ９７　（７０ｋＤおよび２７ｋＤのフラグメントを含 む）で行い、この糖タンパク質の糖成分を部分的に特性付けた。用いたレクチン の糖の特徴は以下のように報告されている：１）ｃｏｎＡ（α−Ｄ−マンノース およびα−Ｄ−グルコサミン）、２）　レンズマメレクチン（α−０−マンノー ス）、３）コムギ胚芽アグルチニン［（Ｄ−ｇｌｃＮＡｃ）　２およびＮｅｕＮ Ａｃコ、および４）フィトヘマグルチニン、白血球特異性（オリゴ糖）。 精製ｇｐ９７　（ＰＢＳ　３００ｕ　１中５０ｎｇ）を、種々のアガロースビー ズ（インキュページフンにつきビーズ２５μｌ）に固定した種々のレクチンと共 に、室温で２時間攪拌しながらインキュベートした。遠心分離によりビーズを取 り除いた後、上清中で残渣と結合していないｇｌ＋’１７を、上記の抗ｇｐＨ５ −９７抗体ドツトプロットアッセイにより測定した。ＰＨＡ−Ｌおよびコムギ胚 芽アグルチニンのみが顕著な量でｇｐ９７と結合した。 ５ＤＳ−ＰＡＧＥ上に流し、ＰＶＤＦ紙にプロットしたｇｌ）！１７に結合する １２５Ｉ標識ＰＨＡ−Ｌを用い、同様の研究を行った。グリコシダーゼでの前処 理による影響についてもまた、このシステムにおいて研究し、ｇｐ９７中の糖の 結合についての部分的な特性付けを行った。各グリフンダーゼ反応は、ｐＨ７， ０で１００ｍＭヘペス中に２−メルカブトエタノールを含有する０、１％ドデシ ル硫酸ナトリウム中で５分間煮沸することにより変性させた精製ｇｐ９７６マイ クログラムで行った。ＮＰ４０を最終ａ度が１％（Ｗ／Ｖ）になるように加え、 そして個々の６０マイクロリツトルの反応液を、以下の酵素単位を加えた後、３ ７℃で１８時間インキュベートした：１）２ミリ単位のノイラミニダーゼ（Ｂｏ ｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）　；　２　 ）　２ミリ単位のノイラミニダーゼと１ミリ単位の０−グリカン−ペプチド−ヒ ドロラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉ＋ｍ）　：　および３）０ ．５ミリ単位のＮ−グリカナーゼ（Ｇｅｎｚｙｍｅ）。メイラミニダーゼを含有 する反応液中に、ＣａＣｌ２を４ｍＭとなるように加えた。コントロール反応液 を含む各反応液について、２０マイクロリツトルアリコートを３組で５ＤＳ−Ｐ ＡＧＥを行った。生成物を、それぞれ以下の方法により可視化した：　１）クー マン−ブルー染色；　２）ブロッティングし、１２５１−プロティンＡで標識し た抗ＳＫ−ＢＲ−３ｇｐ９７抗体でプローブすること：および３）ブロッティン グし、’　２５１−ＰＨＡでプローブすること。 ３つの検出法はすべて、グリコシダーゼ処理後の５ＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、分 子の分子量が変化することを示した。ノイラミニダーゼ処理によりわずかな移動 が生じたので、シアル酸力（存在することが示される。０−グリカン−ペプチド −ヒドロラーゼ処理ではいかなる影響も生じなかったので、明らかなＯ−グリコ リル化は起こっていないと考えられる。Ｎ−グリカナーゼ処理では、分子量の大 きな移動が生じたため、明らかなＮ−結合グリコリル化が起こっていると考えら れる。ｌ　２５１−ｐ　ｏ　ｐ、では、Ｎ−グリカナーゼで処理した物質以外の 全ての抗体反応バンドに結合することが観察されたので、ＰＨＡ−Ｌはｇｐ９７ のＮ−結合糖成分に結合すると考えられる。 （以下余白） 実ｉｆ鉗ｌ ヒト　９７をコード　る　−のクローニングヒトｇｐ８５−９７をコードする遺 伝子は、以下の一般的方法を用いてクローン化した。まず、部分的にタンパク質 分解された形で回収した５Ｋ−ＢＲ−３ｇｐ９７を、変性し、還元し、そして、 ９７ｋＤおよび７０ｋＤの分子を、０１％のＳＤＳで、サイズ排除ＨＰＬＣを用 いて精製した。この９７ｋＤおよび７０ｋＤの分子を、Ｌｙｓ−Ｃプロテアーゼ で消化し、そして得られたペプチドを精製し、配列決定した。次に、ペプチドの 一つであるペプチドＩのアミノ酸配列を基に、縮重したオリゴヌクレオチドブラ イマーを合成し、５Ｋ−ＢＲ−３ｍＲＮＡ上でのＰＣＲ反応に用いた。ここで得 たＤＮＡ配列は、順次、結局、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするため の特異的ＤＮＡプローブを合成するための、他のオリゴヌクレオチドブライマー を合成するために使用され、５Ｋ−ＢＲ−３ｇｐ９７をコードする全長のｃＤＮ Ａ配列を得た。 より明確には、１ｍｇの部分的にタンパク質分解したＳＫ−ＢＲ−３ｇｐ９７を 、２％のドデシル硫酸ナトリウムで変性し、そして４０ｍＭのジチオスレイトー ルで還元した。混合物を１０分間５０　’Ｃに加熱し、Ｐｈａｒｍａｃｉａ　５ ｕｐｅｒｏｓｅ　６サイズ排除−ＨＰＬＣカラム上で、１ｍＭ　ＥＤＴＡを含む ２５ｍＭのトリス（ｐＨ８，５）中の０．１％のドデシル硫酸ナトリウムを移動 相に用い、ｏ、ａｍ＋／分の速度でクロマトグラフィーを行った。精製した９７ ｋＤのサブユニ、トおよび７０ｋＤのフラグメントは、別々に５％（Ｗ／Ｗ）の Ｌｙｓ−Ｃブロテアーセで、３７°Ｃ５１８時間処理した。消化およびペプチド 生成の程度を決定するために、９７ｋＤおよび７０ｋＤの消化物の３分の１を、 １４％アクリルアミドＴｒｉｃｉｎｅ緩衝化ゲルを用いて、還元５ＤＳ−ＰＡＧ Ｅで電気泳動した。ゲルは、ＰＶＤＦメンブレン（Ｐｒｏ−Ｂｌｏｔ、　Ａｐｐ ｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてプロットし、クーマシーブルー染色 で可視化した。２組のレーンを、”Ｊ−ＰＨＡ結合に対して分析した。各消化物 の残りの３分の２は、アセトニトリル／ＴＦＡを移動相として、Ｖｙｄａｃ　Ｃ −カラムを用いるＲＰ−ＨＰＬＣによりクロマトグラフィーを行った。各カラム 画分のアリフートを、凍結乾燥し、１４％アクリルアミドＴｒｉｃｉｎｅ緩衝化 ゲルで、５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、各画分の残りのタンパク質を、Ｎ末端 から配列決定した。９７ｋＤおよび７０ｋＤの両方の分子をＬｙｓ−Ｃプロテア ーゼで消化すると、同様の消化パターンを示し、これらの分子が構造上関係があ る証拠を得た。４つのＲＰ−）ＩＰＬｃのピークを選び、そしてピークＩと命名 したその１つを、Ｐ’／ＤＦメンブレンに移しＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔ ｅｍｓの気相シークエンサーを用いて配列決定した。ピークＩのペプチドから得 られたＮ末端のアミノ酸配列を、（配列番号＝２）に示す。 ペプチドＩのアミノ酸配列から、３つの縮重オリゴヌクレオチドブライマーを、 一部がペプチドの種々の領域に対応するように合成した。オリゴヌクレオチドを 、５Ｋ−ＢＲ−３ポリＡ十議ＲＮＡ上のプライムＰＣＲ反応に使用した。縮重は 、いくつかの選択したゆらぎの位置をイノシンで置換することにより、幾分減少 した。オリゴヌクレオチドは、下記の配列：　（配列番号：３）：　（配列番号 ：４）；および（配列番号：５）を有すアンダーラインは、（配列番号＝３）に ついては旧ｎｄＩＩ［の、および（配列番号：４）および（配列番号＝５）につ いてはＥｃｏＲＩの制限部位の位置を示す。。制限部位は、ｐＵＣベクターへＰ ＣＲ生成物を容易にクローニングするようなプライマーの設計を含んだ。 ＰＣＲ反応は、　（配列番号：４）または（配列番号＝５）と組合せて、　（配 列番号：３）を用いて行った。 簡単にいえば、ＰＣＲは総量５０μｌ中、最終濃度１ｘＰＣＲ緩衝液、５０℃Ｍ のｄＮＴＰＳｌμＭの５゛および３゛の各プライマー、および１単位のＴａｑポ リメラーゼで行った。Ｔａｑポリメラーゼを加える前に、反応混合物を８０℃に 加熱した。増幅は２つの結合したサイクル方式を用いて行った。増幅の最初の５ サイクルは、９５°Ｃで３０秒の変性、４５℃で３０秒のアニーリング、および ７２°Ｃで３０秒の伸長からなる。これに続いて、それは、９５℃で３０秒の変 性、５５°Ｃで３０秒のアニーリング、および７２℃で３０秒の伸長からなる、 ３０サイクルの増幅を行った。 予測したＰＣＲ生成物は、約２４塩基対が異なると予測され、そして実際に、ゲ ル電気泳動の移動度から判断し、得られた生成物は約９７および１２１塩基対の 長さであった。 ５Ｋ−ＢＲ−３ｇｐ９７のアミノ末端のアミノ酸配列を、上記のように決定し、 そしてこれらのデータを用いて、さらに他のオリゴヌクレオチドブライマーを合 成し、それらのプライマーを、（配列番号：４）および（配列番号：５）のプラ イマーを用いた、以下のＰＣＲ反応に用いた。 一部アミン末端の配列に基づくオリゴヌクレオチドプライマーを、　（配列番号 ：６）に記載し、上記のように設計した。 （配列番号＝６）と（配列番号＝４）または（配列番号：５）のどちらかとを用 いたＰＣＲ反応により、それぞれ、約７４０および７６５塩基のＤＮＡ配列を得 た。 ＤＮＡ配列を、上記ＰＣＲ反応によって生成した物質から得た。 この配列に基づいて、さらに２つのオリゴヌクレオチド配列を合成し、ＴＨＰ− １ｃＤＮＡライブラリーをプローブするのに用いて、ｇｐ９７の全長をコードす る配列を有するクローンを同定した。これらのオリゴヌクレオチド配列は、　（ 配列番号ニア）および（配列番号二８）である。それらの配列は、以下の（配列 番号ニア）および（配列番号：８）である。 支立孤ユ ８５−９ＨＣＺ−６ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングｃＤＮＡライブラリ ーを、１１００ｎ／ｍｌのメゼレイン（ｍｅｚｅｒｅｉｎ）で２４時間誘導した 、ＴＨＰ−１細胞から単離したｍＲＮＡから作成した。 その手順は、上記の手順を用いてｍＲＮＡを単離する工程、および直鎖状にした プラスミド、ｐｃＤＬ−ＳＲα２９６に共有結合したオリゴ（ｄＴ）でプライム することにより一本鎖ｃＤＮＡの合成を行う工程からなる。 ポリ（ｄＴ）テイル化は、１０×ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフ エラーゼ緩衝液（本願明細書では、以下１（ｌＸＴｄＴ緩衝液と称す）を用いて 行った。この緩衝液は、以下のように調製した：　１３．８ｇのカコジル酸を、 ３．０ｇのトリス塩基を溶解した６０ｍ１の水に加える。固体のＫＯＨをゆっく り加えることにより溶液をｐＨ７，６に調整し、その後容量を水で８８ｍ１に増 やす。次に、溶液をＯ″Ｃに冷却し、それから溶液を一定に攪拌しながら、０． １ＭＤＴＴを２１加えた後、Ｏ，１ＭのＭＩＩＣ１２を１０ｎｌａ下する。２０ μｍの１０ＸＴｄ丁緩衝液に、５、Ｏμｌの１ｈＭのｄＴＴＰ。 および、２００μｇのＫｐｎエンドヌクレアーゼ消化ｐｃＤＬ−ＳＲａ　２９Ｇ プラスミドを加える。溶液の総量が２００μｌになるように、水を加える。溶液 を３７℃に１５分間暖め、約３μｍ中の３６０単位のＴｄＴを加えて、３７℃で ５分間インキュベートする。 次に、ｃＤＮＡ合成を当該分野で公知のように、逆転写酵素を用いて行い、新た に合成したｃＤＮＡの３°ヒドロキシル末端に（ｄＣ）テイルを付加する。ｐｃ ＤＬ−ＳＲα２９６の３°末端に、反応中に付加した（ｄＣ）テイルを、Ｈｉｎ ｄｌＩＩで消化して除去した。１００μｌの逆転写酵素反応は、１０℃ｇのポリ （Ａ＋）ＴＩＰ−Ｉ　ＲＮＡ、２０ａ＋Ｍのトリス−ＭＣＩ、ｐＨ８，３，２， ５ｍＭのＭｇＣｌ２．５０＋ＩＩＭのＫＣＩ、１ｍＭのＤＴＴ、　０．５ｍＭの 各１００単位のＲＮＡ５ｉｎ、５　ｔｔ　ｇのポリ（ｄＴ）単一テイル化ベクタ ーープライマーＤＮＡ、および１００単位の逆転写酵素を含む。反応は、３７° Ｃで３０分間行った。 最終的に、オリゴ（ｄＣ）テイル化ｃＤＮＡ−ｍＲＮＡプラスミドは、ＳＲαプ ロモーター−リッカーで環状にした。それは、一方の端のＩＢ１部位、および他 方のホモポリマーチイルのｄＧで行った。アニーリング反応は、１０×アニーリ ング緩衝液からなるアニーリング溶液を用いて、標準条件下で行った。１０×ア ニーリング緩衝液は、０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣＬ、　ｐＨ７，６，１，０Ｍの ＮａＣｌ、　１０ｍＭのＥＤＴＡからなる。１ＲＮＡ鎖は、連続的にＥ、ｃｏｌ ｉのＲＮａｓｅ　ＨｓＤＮＡポリメラーゼ■、およびＤＮＡリガーゼを用いて、 ＤＮＡに置き換えた。次いでＤＮＡを、ＤＨ５−α細菌内へと形質転換した。　 （ＤＨ５−ａ細菌は、Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏ ｒｉｅｓ、　Ｒｅ５ｅａｒｃｈＰｒｏｄｕｃｔｓ　Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、　Ｌｉｆ ｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ、、　Ｇａ１ｔｈｅｒｓｂｕｒＢ、　Ｍ Ｄ　Ｚ０８Ｔ７．Ｃａｔ、Ｎｏ、）ＩＺ５８５Ａから得る：　Ｍａｘ　Ｅｆｆｉ ｃｉｅｎｃｙ　ＤＨ５−α感応細胞） 上記で得たｃＤＮＡライブラリーを、当該分野では周知の手順を用いて増幅し得 、ライブラリーを−７０”Ｃで、ＬＢ培地中１２，５％グリセロール中で細胞ペ レットを懸濁して保存し得る。 ｅＤＮＡライブラリーは、１．６５Ｘ　１０”個の形質転換体を平板培養し、（ 配列番号二８）を有するオリゴヌクレオチドを用いることによりスクリーニング した。３１個のコロニーはポジティブであり、プライマー（配列番号ニア）およ び（配列番号二８）を用いるＰＣＨにより、さらに分析した。３１個のポジティ ブなコロニーのうち、７個のコロニーはおおよそ予測した塩基対の数である４３ ７を有することが見いだされた。７個のコロニーのうち２個の、クローン１７お よび１８を選択し、さらに研究した。 クローン１８の両方の鎖を、上記のαｊ５３およびＳａｎｇｅｒジデオキシ法を 用いて、配列決定した。７−ケネースを、ポリメラーゼとして使用した。クロー ン由来のＤＮＡ配列は、　（配列番号：９）に示す。１８０−１９３４残基は、 ｇｐ８５−９７のプロ型をコードする。２３４−１９３４残基は、ｇｐ８５−９ ７の成熟型をコードする。推定したアミノ酸配列を、　（配列番号：１ｏ）に示 す。アミノ酸１−１８は推定リーダー配列を形成する。 ｇｐ８５−９７遺伝子のＤＮＡ配列は、多数の機能を有すると予測され得る、十 分な大きさおよび複雑度を有する成熟タンパク質をコードする。ＤＮＡおよびタ ンパク質のデータベースのホモロジー検索から、ヒ）　ｇｐ８ｓ−９７のＮ末端 領域に、著しく保存されたドメインが存在することが示される。成熟ｇｐ８５− ９７タンパク質の最初の１０５個のアミノ酸は、タイプｒヒトマクロファージス カベンジャーレセプターの、細胞外末端配列と５０％以上一致している。Ｋｏｄ ａｍａ、　Ｔ、ら、１９９０．Ｎａｔｕｒｅ、　３４３：５３１−５３５゜この ドメインの正確な機能は、現在未知である。しかし、スカベンジャーレセプター の他のドメインは、酸化された低密度リポタンパク質、細菌リポ多糖、および一 本鎖の核酸などの、望ましくない分子を除去することを、明らかに包含する。こ の同じトメイノは、ｇｐ８５−９７と、精子の表面に複製物が見いだされるウニ との間で高度に保存され、そして、精子−活性化卵ペプチドに対するレセプター として機能している。Ｄａｎｇｏｔｔ、Ｌ　ら、１９８９．跡ｊ頂棧醇、Ｈ：２ １２８゜ｇｐ８５−９７のＮ末端ドメインもまた、リンパ尿糖タンパク質ＣＤ＆ のような池のヒトタンパク質と、著しく相同である。従って、ｇｐ８５−９７は 、例えば、感染病に対して応答すること、または免疫応答を促進することを含む 、これらの相同タンパク質と同様の機能を示し得る。 成熟Ｎ末端配列、およびｇｐ８５−９７の見かけの分子量は、まだクロー７化し ていない、肺癌の糖タンパク質であるＬ３抗原の分子量と同一である。Ｌｉｎ５ ｌｅｙら、肛匹■紅旦葺（１９８６）■：２９７８−２９８６゜ 支立史Ａ ＳＫ−ＢＲ−３９７の 全長を有する二つのクローンである、クローン１７および１８を、細胞系Ｃｏｓ 　Ａ２中にトランスフェクトした。細胞系ｒ　Ｃｏ５Ａ２ＪはＣｏ５−１細胞の 軟寒天サブクローン（Ｇｌｕｚ＋ａａｎ、　Ｙ、　、　１９８１．　Ｃ。 ｅｌｌ、２３：１７５−１８２）である。対数増殖期の細胞は、適切なプラスミ ドと、０．０５％のＤＥＡＥ　Ｄｅｘｔｒａｎ　（Ｓｏｉｐａｙｒａｃ、Ｌ、Ｍ 、ら、１９８１、ηｇυ−１７８・７５７５−７５７１１）を用いてトランスフ ェクトした。 細胞を、室温で１時間インキュベートし、次いで洗浄して、゛ＤＥＡＥ−プラス ミドの残基を除去し、１１００ｕのクロロキンを含む増殖培地を添加した。５％ ＣＯ２／９５％空気雰囲気中で、３７°Ｃ４時間インキュベートした後、培地を 除去し、クロロキンを含まない新鮮な増殖培地に取り替えた。細胞を組織培養イ ンキュベーター中でインキュベートし、培地を２４．４８、および７２時間後に 採集した。 ７２時間インキコベー７ｇン物由来の培地は、採集後ただちに遠心分離によって 透明にし、さらに分析するために凍結した。培養上清１ｍｌ中のｇｐ９７タンパ ク質を、４０μｌのＡｆｆｉｇｅｌＩＯビーズ（ＢｉｏＲａｄ）と結合した、精 製抗−ｇｐＨ５−９７抗体に結合することにより、免疫沈降した。結合タンパク 質を、２０μｌの非還元５ＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液中で煮沸することによりペ レット化し、洗浄したビーズから遊離した。ビーズを除去した後、試料を、添加 した２−メルカプトエタノール（１％）の存在下で、煮沸によって還元し、上記 のようにアフィニティー精製’　２５Ｔ　−ｍ　ｍ抗−ｇｐ８５−９７抗体を用 いて、ウェスタンプロ、トによりアッセイした。抗体を以下に記載のように産生 じた。結果を図５に示す。図から明らかなように、ｇｐ９７抗体反応性物質は、 両方のクローンにより産生ずる。糖鎖形成に相違があるので、観測した８５ｋＤ の分子量が５Ｋ−ＢＲ−３ｇｐ９７の分子量と異なる可能性がある。 支胤五工 ５Ｋ−ＢＲ−３９７にり・　る 天然の５Ｋ−ＢＲ−３ｇｐ９７　（スクロース勾配工程を通して上記のように精 製した）を用いる免疫化の手順は、数カ月以上かかって行った。免疫化は、約２ ００μｇの物質で開始した。この免　。 疫化の約２０日後、ウサギを約１００μｇの物質でブーストし、１０日後に採血 した。このブースト／採血の手順は、数カ月にわたって行った。約２００μｇの 最初の免疫化を、完全フロインドアジュバントでニューシーラント白ウサギの膝 後面の節に注入して行った。その後のブーストを、不完全フロインドアジュバン トで筋肉内に投与した。７力月目の最後に、ウサギを瀉血し、血清を単離した。 抗体を、プロティンＡセファロースカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＬＫＢ　Ｂｉ ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ、）で、アフィニティークロマトグラフィーに より精製した。いくつかの実験では、ｇｐ８５−９７抗体を、高性能電気泳動ク ロマトグラフィーで精製し、Ａｆｆｉｇｅｌ　１０／１ｓ（ＢｉｏＲａｄ）に結 合させた、９７ｋＤおよび７０ｋＤの糖ペプチドを利用した、リガンドアフィニ ティークロマトグラフィーによって、さらに精製した。精製した抗体を、グリシ ン／ＨＣＩ、ｐＨ２で溶出した。 ５Ｎ−ＢＲ−３ｇｐ９７に対して生成した抗体が、中和活性を有するかどうかを 決定するために、研究を行った。抗体を、２つの細胞に基づくアッセイ、および 、上記の＋２５Ｉ−ＰＨＡドツトプロットアッセイにおいて、ｇｐ９７に対する 中和力価について試験した。１／４０の希釈で、抗体は、細胞に基づ（生物学的 アッセイで測定したように、ｇｐ９７の２０μｇ／＋ａｌ溶液の５０％を中和し 得た。ｇｐ９７の非存在下で、抗体はアッセイにおいて効力を有しないので、抗 体はｇｐ９７の効力を中和することが明らかである。 抗体の比較的低い中和力価は、大きな多−サブユニットタンパク質複合体である と考えられているものの上に、多くの結合部位を有することを示し得る。同様に 希釈した抗体は、固定化した天然のｇｐ９７の同量に結合した１２５１−ＰＨＡ を中和した。 ５Ｋ−ＢＲ−３ｇｐ９７に対する抗体を、種々の生物学的試料中で、ｇｐ８５− ９７と反応する能力について試験した。ウェスタンプロット、またはドツトプロ ット分析を用いて、抗体を、ヒト血清由来の手積製した物質、およびヒト乳由来 の精製物質と反応した。新鮮ヒト血清由来の物質を、５ＥＣ−１（ＰＬＣで、ボ イドボリュームまたはそれに近い容量で溶出し、従って、５Ｋ−ＢＲ−３細胞か ら精製した物質と同様であった。 １血五旦 ヒト　か゛の　８５の ４００　ミリリットルのヒト乳を多くの匿名の提供者からプールし、これらは旧 ＶおよびＢ型肝炎ウィルスに対して陰性を示す。 乳は、１ｍＭのεＤＴＡ、１Ｈｇ／■Ｉのロイペプチン、および２００μＭのＰ ＭＳＦを含むように調整した。これらのインヒビターを、これらの濃度で、精製 期間中通して使用した。 乳は、４℃で２５，０ＯＯｘ　ｇ、　３０分間、２回の遠心分離によって脂肪分 を除去し、上部の脂肪層を除去した後、水層をグラスファイバーフィルターを通 して濾過し、続いてＧｅ１ａ＋ａｎ　５０Ａ５μｍフィルターを通して濾過した 。濾液は、硫酸アンモニウム（ｐＨ７，０）で０．５Ｍにして、５　ｘ　２０ｃ ｍのフェニル−５ｅｐｈａｒｏｓｅ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムでクロマト グラフィーを行った。タンパク質ヲ、　Ｔａ酸アンモニウムが減少し、エチレン ゾ’）　コ−／ｌ／が０−３０％増加する十字交差型グラジェントで、１ｏ１／ 分でカラムから溶出した。カラムを通した流出物は、同じカラムで再びクロマト グラフィーを行った。ｇｐａｓを富化した画分を、両方のカラムからプールし、 ＰＢＳ中で透析し、ＹＭ３０メンブレンを用いてＡｍ１ｃｏｎ　５ｔｉｒ　ｃｅ ｌｌて３０倍に濃縮した。 Ａｍ１ｃｏｎ濃縮物質は、２つの２５ｍ１アリコートに分割し、それぞれを別々 に５　ｘ　９０ｃ＋ａの大きさを有する５３００５ｅｐｈａｃｒｙｌ　（Ｐｈａ ｒｍａｃｉａ）サイズ排除カラムでクロマトグラフィーを行った。 タンパク質を、５　ｍ１７分でカラムから溶出した。ｇｐ８５のピーク画分をプ ールして、上記のように３０倍に濃縮した。 次に、濃縮物質のうち２ｍｌアリコートを、ＰＢＳで緩衝化した３７ｍ１の５− ５０％スクロースグラジェントに積層し、Ｂｅｃｌｖａｎ　５Ｗ２８０−ターで 、１５°Ｃ１２３時間、２７．ＯＯＯｒｐｍテ遠心分離した。チューブの底に穴 を開け、画分をそこがら採取した。 ｇｐ１１５のピーク画分の５分の２を、１ｍＭの代わりに０．１ｍＭのＥＤＴＡ を含む５０ｎ＋Ｍ（７）　）　’Ｊ　スｐＨ８，１５０ｓＭＩ７）ＮａＣ１中で 透析した。保持物質を、ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２、およびＭｎＣｌ２でｌＩＩＭ に調整し、続いて、前洗浄したＬｅｎｔｉｌ　Ｌｅｃｔｉｎ　５ｅｐｈａｒｏｓ ｅ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のベッドボリューム２０ｍ１を加えた。混合物を４ °Ｃで３時間振盪しながらインキュベートし、２．６ｃ＋ｓ直径のカラムに注ぎ 、周囲の温度で、ＥＤＴＡを除いた５０ｍＭ（７）　ｌ−リフ、　ｐＨ８，１５ ０ｍＭのＮａＣｌで洗浄した。 カラムは、同じ緩衝液中の２００ｍＭのα−メチル−Ｄ−マンノピラノシドで溶 出した。溶出したｇｐａｓを、硫酸アンモニウムｐＨ７，０で０．８Ｍにして、 ７．５　Ｘ　７５ｍｍの大きさを有する分析用フェニル−ＴＳＫ　ＨＰＬＣカラ ム（ＢｉｏＲａｄ）でクロマトグラフィーを行った。タンパク質を、上記の条件 下で、ｌ　ｍ１７分の流速でカラムから溶出した。５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析のため に、全部の画分を１ｍＭのトリスｐ８７．５で緩衝化した０、１％ＳＤＳ中で透 析し、凍結乾燥し、１５μｌの還元試料緩衝液で再懸濁した。バンドを、クーマ シーブリリアントブルーで染色して可視化した。カラムプロフィールおよび５Ｄ Ｓ−ＰＡＧＥ分析を図６に示す。約６０ｋＤ〜１００ｋＤを越える見かけのサブ ユニット分子量の不均一分布は、おそらくグリコジル化における不均一性を反映 している。 精製調製物の２番目のアリコートを、上記のように５ＯＳ−ＰＡＧＥで分画し、 実施例１の５Ｋ−ＢＲ−３７０ｋＤフラグメントの単離に記載のようにＰＶＤＦ メンブレンに転移した。Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｌｌｓ　４７０Ａ気 相シークエンサーを用いて得たＮ末端配列は、以下の（配列番号：ｌｌ）である 。 スクロースグラジェント画分の残りの５分の３は、上記のようなレンズマメ−レ クチンクロマトグラフィーを行った。 ただし、カラムを４°Ｃで溶出し、続いてさらに結合したタンパク質が解離する 周囲の温度での同様の溶出は行わなかった。 ４°Ｃで溶出したｇｌ）８　ｓを、上記の分析用Ｐｈｅｎｙｌ−ＴＳＫ　ＨＰＬ Ｃを用いて、クロマトグラフィーを行った。ｇｐａｓを富化した画分をプールし 、ＰＢＳ中で透析し、１０倍に濃縮して一２０°Ｃで保存した。 周囲の温度で溶出したｇｐａｓを、Ａｍ１ｅｏｎ　ＹＭ３０メンブレンを用いて ７５倍に濃縮し、保持物質を、Ｐｈａｒｎ＋ａｃｉａ　５ｕｐｅｒｏｓｅ　６サ イズ排除ＦＰＬＣカラムでクロマトグラフィーを行った。タンパク質を、ＰＢＳ の移動相で０．５ｍｌ／分でカラムから溶出した。ｇｐａｓのピーク画分をプー ルし、２倍に濃縮し、フィルター滅菌して４°Ｃで保存した。精製プロトコール で、脱脂肪して濾過したヒト乳から始めて、約６％の回収率で１３００倍に精製 した４００μｇのｇｌ）１１５を得た。 上記のｇｐａｓの特性に加えて、５ｕｐｅｒｏｓｅ　６クロマトグラフイーによ って精製した物質を、実施例１に記載のようにスクロースグラジェント沈降速度 によって分析した。ドツトプロットアッセイにおいて、抗ｇｐ８５−９７と反応 した物質の沈降値は、約２５であった。他の反応性物質は、３０を越える沈降値 で検出した。 実去１１ ０の 実施例５に記載したようにして得た中和抗体を、癌細胞の増殖阻害活性について 試験した。アッセイは、チミジン取＋１１）込み機能としての細胞増殖における プロティンＡ精製抗−ｇｐ８５−９７抗体の有効希釈を決定する工程からなる。 ヒトの胸部腫瘍細胞系５Ｋ−ＢＲ−３は、栄養欠失培地（ラン胎児血清を制限し たＲＰＭＩ）での最小刺激条件下で、試験した。抗−ＧＡＰポリクローナル抗体 （Ｈａｌｅｎｂｅｃｋ、　Ｒ，ら、　１９９０．　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、 　２６５：２１９２２−２１９２８）は、以下の同一のプロティンＡ精製にコン トロールとして用いた。 チミジンアッセイを、以下のように行った：　５Ｋ−ＢＲ−３細胞増殖は、２μ Ｃ４／ウエル当たりの３Ｈ−チミジンを加え、３７°Ｃで４時間細胞をインキュ ベートし、その後、細胞を洗浄し、採集し、［ｍ物を用いて計数することにより 測定した。５組でアッセイした全ての試料について、２０アツセイした。結果を 表１に示す。 （以下余白） 表土 傘　全１３１フ７１１し＋ｘｆ４ｇｖ了・・記載（Ａつ最初の実施例では、抗体 または抗体ｇｐ９７を産生ずるのに用いる抗原を欠く培地からなるコントロール に比べて、１：１０および１４０の抗体希釈では、それぞれ、′Ｈ−チミジン取 り込み量で６８％および６０％の減少がみられた。コントロール抗体は、３Ｈ− チミジン取り込みに本質的に効果がない、または刺激効果を有することを示した 。 ２番目の実施例では、′Ｈ−チミジン取り込み量において、１１０および１４０ の抗体希釈で、それぞれ、５７％および４９％の減少がみられた。 支掻匠１ ヒ　ト　の　８５−９７の 分類したヒト体液を、抗ｇｐ８５−９７抗体（上記のように調製した）で免疫沈 降し、ウェスタン分析をした（図７）。レーン１−７はそれぞれ：緩衝液コント ロール；精液、０．５ｍｌ　；母乳、０．０５＋ｉｌ；血漿、１．０ｍｌ；唾液 、０．５ｍｌ　Ｈ涙、０．２ｉ１　；および尿、１．０ｍｌ”Ｉ：’ある。試料 を、最終容量１１のＰＢＳ中で、０．１ｍＭのＰＭＳＦおよび２μｇ／ｍｌのロ イペプチンになるよう調整した。これらの溶液を、免疫沈降し、実施例１−８に 記載のようにアフィニティー精製１２５Ｉ−標識抗ｇｐ８５−９７抗体を用いて 、非還元５ＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタン分析を行った。免疫反応物質は、大 きさおよび複雑度が幾分変化したが、通常は６０および１００ｋＤａ　Ｍｌの間 の２つのバンドを含んだ。母乳の免疫反応物質を、アッセイ検出のための同じ抗 体を用いて精製し、ｇｐ８５−９７のＮ末端配列を有することは（上記参照のこ と）、別のヒト体液で、同様のサイズの免疫反応バンドもｇｐ８５−９７を表す ことを示す。 実１１匹」− 註舷」と旦夫迭 本質的には既に記述されているように（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、ＬＵｉｏｌ、ｃ ｈｅｍ、（１９９１）　２６６：１８７３１−１８７３６）、ＨＴ−２９細胞（ ＡＴＣＣ）ＩＴＢ３８）を増殖し、０５％のＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００で溶解し 、遠心分離して細胞およびダブリを除去し、抗Ｍａｃ−２モノクローナル抗体（ Ｍ３／３８．Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）およびプロティンＧ　 Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて免疫沈降した。免疫沈降は また、Ａｆｆｉｇｅｌ　１０に固定化したｇｐ８５−９７に対する、精製ポリク ローナルウサキ抗体を用いて行った。ＨＬ−６０細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ　２４０ ）を、８０ｍＭのナルホール１２−ミリステート１３−アセテートで７２時間分 化し、上記のように溶解した。 免疫沈降物を、非還元型または還元型（Ｍａｃ−２抗体でプローブしたレーン） 　５ＤＳ−ＰＡＧＥ、および図８に示すように１２５１−標識抗体（プローブＡ ｂ）でのウェスタン分析により分析した。　（＋１ａｃ）および（＋ｍａｎ）で 印をつけた試料には、それぞれ０．２５Ｍのラクトースまたはマンノースを沈降 前に与えた。各ノくネルの最初のレーンは、溶解緩衝液の免疫沈降由来の７＜　 ノクク゛ラウンドを示す。Ａ）ヒト結腸癌ＨＴ−２９の溶解物（１，５＋ａｇ／ レーン）。Ｂ）ヒト前骨髄腫白血病ＨＬ−６０の溶解物と混合した精製ｇｐ９７ 　（５μｇ）　（０，８ｍｇ／レーン）。図８は、ｇｐ８５−９７カく、ラクト ースと解離し得、炭水化物と結合する性質を通じて、ヒトＭａｃ−２レクチンに より結合することを示す。 ｌｌ笠Ωｌ丘 本発明は、特定の実施態様に関して記述されて一＼る。し力）しながら、本出願 は、添付の請求の範囲およびその意図力）ら逸脱せずに、当業者により成され得 る本発明の改変および置換を網羅するものである。 配列表 （１）一般的情報： （ｉ）出願人：コース、カーストン　イー。 ヘレンベノク、ロバート　エフ６ ティラー、エリツク　ダブリニー。 ワン、アリス　エム。 カシピ、ト、クレイトン　エル。 （ｉ　ｉ）発明の名称：分泌Ｍａｃ−２結合糖タンパク賀（ｉｉｉ）配列数：１ １ （ｉｖ）連絡住所： （Ａ）住所人：ンータス　オンコロジー　コーポレイション（Ｂ）番地：ツイツ チイーサード　ストリート　１４００（Ｃ）市：エミリーピル （Ｄ）州：カリフォルニア （Ｅ）国：アメリカ合衆国 （Ｆ）郵便番号：　９４６０ｇ （Ｂ）コンピューター：　ＩＢＭ　ＰＣ互換用（Ｃ）操作システム：　ＰＣ−Ｄ ＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ（Ｄ）ソフトウェア：パテントインリリース＃１０１バージ ゴン１１１．２５（ｖｉ）現在の出願データ； （Ａ）出願番号：指定されていない （Ｂ）出願日：　１９９２年１０月１５日（Ｃ）分類： （ｖｉｉｉ）代理人／事務所情報： （Ａ）氏名：ゴールドマン、ケネス　エム。 （Ｂ）登録番号：　３４．１７４ （Ｃ）照会／記録番号：　２５９５．１（ｉＸ）電話回線情報： （Ａ）１！話：　（５１０）　４２０−３１５２（Ｂ）テレファックス：　（５ １０）　６５８−５４７０（Ｃ）テレックス：　１１／Ａ （２）配列番号ｌの情報： （１）配列の特色： （Ｃ）鎖の数ニ一本鎖 〈Ｄ）トポロジー：直鎖状 （１１）配列の橿顛：タンパク質 （ｘｉ）配列：配列番号１： （２）配列番号２の情報； （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ＝３８アミノ酸 ＣＢ）型二アミノ酸 Ｌ４ｕ　Ａｌａ　Ｓ＠ｒ　Ａｌａ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　入１ａ　ｋｒｑ　Ｇｉｎ　 Ｌａｕ　ｄｉｎ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｌｓｕ　Ａｌａ　５ａｒＬａｕ　ＰＭ　入１ ａ　工１１１　Ｌｓｕ　Ｌａｕ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｓｓｒ　Ｐ Ｆ６　Ｇｉｎ　Ｍｌｌｔ　Ｓ＠１：　Ｌ≠■ ２０　２５　コ０ Ａｓｐ　ｒａｕ　Ｔｙｒ　入ｌａ　丁ｙｒ　Ａｌａｌミ コ２）配列番号３の情報： （ｉ）配列の特色： （Ｃ）鎖の数ニ一本鎖 （１））　）ボロノー；直鎖状 °“０ＣＴＴＱＱ（”“ｃｃＮＧ（ＪＩ　ＭＧＮＣＡ　２゜（２）配列番号４の 情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ：２６塩基対 （Ｂ）型：核酸 ＧＧＡＡ′ｒＴＣＣＣＡ　”ｒＹＴＧＲ）ＪＪＪＳ％ｌ　ＮＧＧＲＴＣ２６（２ ）配列番号５の情報： （１）配列の特色： （Ｃ）鎖の数ニ一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 ＧＧ入ＡＴ’ＴＣＣにＣＹｒＮ４ＧｅＲＴｋＨＡＲＲＴＣ２５（Ａ）長さ＝２８ 塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニ一本鎖 〈Ｄフトポロジー：直鎖状 （ｉ＋＞配列の種類：　ｃＤＮＡ　ｔｏ　ｍＲＮ＾（ｉｘ）配列の特徴： （Ｂ）型：核酸 （百）配列の種類：　ｃＤＮＡ　ｔｏ　５ＲＮＡ（ｘｉ）配列：配列番号、７： ＧＡＧＡＡＣＣＣＣＡ　ＣＣｅＡＧＧＣＴＣ１９（２）配列番号二８の情報： （＋）配列の特色： （Ａ）長さ：２０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニ一本鎖 （ｘｌ）配列：配列番号、８： ＾にＡＡＧＴ＾ＣＣＴ　ＧＡＧ入ＡＧＧＴＣＣ２０（２）配列番号９の情報： （ｉ）配列の特色： （Ｃ）鎖の数ニ一本鎖 （Ｄ）トポロノー：直鎖状 入＾τＣＧ入ＡＡＧＴ　ＡＧＡＣＴＣＴ？！Ｔ　Ｃ丁ＧＡＡＧＣ入ＴＴ　ＴＣＣ ＴＧＧＧ＾丁ＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＡ　ＣＧＣＴＣＣＡＴＡb６０ ＴＣＴＡＣＣＴＣＣＣＣＡＣＣＡＴＣＣＡＧ　ＡＧＣＴＧＣＴＧＧＡ　ＡＣＴＡ ＣＧＧＣＴＴ　ＣＴＣＣＴＧＣＴＣＣＴＣＧＧＡＣＧＡＧＣP６８０ 人ＡＧＣＣＣＴＣ入Ｔ　ＧＣＴＣＴＧＣＧｋｋ　ＧＧＬ：、ＣＴＣＴＴＣＧ　Ｔ ＧＧＣＡＧＡＣＧＴ　ＣＡＣＣＧＡｍＣＧｋＧＧＧＣＴ（、fＡ　１１１００ ＡＧＧＣＴＧＣＧＡＴ　ＴＣＣＣＡＧ％ＣＣＣＴＧＧ＾Ｃ入ＣＣＡ　＾ＣλＣＣ ＴＣＧ入Ａ　ＧｋＧＣＡＣＣＴＣＣＴＣＣＴτＣＣＣｃＴ　P＋１６０ （２）配列番号１０の情報： （Ｂ）梨二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニ一本鎖 （ｘｉ）配列：配列番号、１０： Ｍａｔ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ａｒｑ　Ｌｌｕ　Ｐｈ１ｌ　Ｔｒｐ　Ｖａｌ 　Ｔｒｐ　Ｌａｕ　ｔａｕ　Ｖａｌ　入１ａ　Ｇｌｙ　丁ｈ■ Ｌ　５　１０　１５ Ｇｉｎ　にｌｙ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ａｓｐ　ＧＬｙ　Ａｓｐ　Ｍｅｔ　Ａｒｇ　 Ｌａｕ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　丁ｈ【２０　２５　コ０ ＾ｓｎ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ａｒｑ　Ｖａｔ　ＧＬｕ　ＩＬ＠　Ｐｈｅ　Ｔｙｒ　 Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｖａ１Ｃｙｓ　Ａｓｐ　Ａ ｓｎ　Ｌｅｕτｒｐ　Ａｓｐ　し＋ｕ　Ｔｈｒ＾ｓｐ＾ｌａ　Ｂａｒ　Ｖａｌ　 Ｖａｌ　Ｃｙｓ　Ａｒｇ　ＡｌａＬＡｕ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　ＧＬｕ　Ａｓｎ　Ａ ｌａ　Ｔｈｒ　Ｃ；ｉｎ　Ａｌａ　Ｌａｕ　Ｇｌｙ　八ｒ９　Ａｌａ　入１ａ　 Ｐｈｅ　Ｇｌ■ Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　５ｅｒ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　工１＠　Ｍａｔ　Ｌｌｕ　Ａｓｐ　 Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｇｉｎ　Ｃｙｓ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　ＴｈｒＧｌｕ　Ａｌａ　Ｓ ｅｒ　Ｌｅｕ　ＡＬａ　Ａｓｐ　Ｃｙｓ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｌａｕ　ＧＬｙ　Ｔ ｒｐ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｓｓｒ　入１ｎＣｙｓ　Ａｒｇ　Ｈｉｓ　Ｇｌｕ　Ａｒ ｇ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｃｙｓ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｇｌ ｕ　Ｔｈｒ　Ａｒｑ１１５　１２Ｑ　１２５ 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Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. １．精製糖タンパク質複合体であって、以下の特性：ａ）見かけの分子量が１２ ００ｋＤ以上、およびスクロース速度勾配沈降値が約２５Ｓである特性；ｂ）サ ブユニット構造であって、該サブユニットが、還元ＳＤＳポリアクリルアミドゲ ル電気泳動において、約８５−９７ｋＤである特性；および ｃ）リンパ球のＰＨＡ依存活性化を妨げる能力を有する特性、 を包含する、精製糖タンパク質複合体。
2. ２．前記還元されたサブユニットが、約８５ｋＤであり、そしてタンパク質分解 によって約６０ｋＤおよび２５ｋＤの減少した分子量のフラグメントに分解し得 る、請求項１に記載の精製糖タンパク質複合体。
3. ３．前記サブユニットが約９７ｋＤであり、そしてタンパク質分解によって約７ ０ｋＤおよび２７ｋＤの減少した分子量のフラグメントに分解し得る、請求項１ に記載の精製糖タンパク質複合体。
4. ４．タンパク質分解によって約７０ｋＤおよび２７ｋＤのフラグメントに分解し 得る、約８５−９７ｋＤの分子量を有する精製糖タンパク質であって、該７０ｋ Ｄフラグメントがリンパ球のＰＨＡ依存活性化を妨げる能力を有する、精製糖タ ンパク質。
5. ５．１２００ｋＤを越える見かけの固有分子量、および約２５Ｓの沈降値を有し 、そしてリンパ球のＰＨＡ依存活性化を妨げる溶液から、糖タンパク質複合体を 精製する方法であって、該方法が以下の工程： ａ）該溶液を陰イオン交換クロマトグラフ用物質と、該糖タンパク質複合体が該 物質と結合するのに十分な時間、接触させる工程； ｂ）該クロマトグラフ用物質から該複合体を溶出することにより該糖タンパク質 複合体を含有する１次溶出液を形成する工程；および ｃ）該１次溶出液を、該糖タンパク質複合体を結合する疎水性クロマトグラフ用 物質と接触させ、そして該糖タンパク質複合体を該疎水性クロマトグラフ用物質 から溶出することにより２次溶出液を形成する工程、 を包含する、糖タンパク質複合体の精製方法。
6. ６．１２００ｋＤを越える見かけの固有分子量および約２５Ｓの沈降値を有する 精製糖タンパク質複合体であって、該タンパク質複合体が８５−９７ｋＤのサブ ユニットを含有し、そして該サブユニットが成熟Ｎ末端アミノ酸配列：（配列番 号：１）を有する、精製糖タンパク質複合体。
7. ７．請求項６に記載の８５−９７ｋＤタンパク質サブユニットをコードする単離 されたＤＮＡ配列。
8. ８．前記配列が（配列番号：９）を含有する、請求項７に記載のＤＮＡ配列。
9. ９．１２００ｋＤを越える見かけの固有分子量および約２５Ｓの沈降値を有する 組換えタンパク質複合体を発現する方法であって、該タンパク質複合体が８５− ９７ｋＤサブユニットを含有し、該方法が以下の工程： ａ）適切な制御配列に実施可能なように連結した該ｇｐ８５−９７サブユニット をコードするヌクレオチド配列を、細胞に挿入する工程；および ｂ）該タンパク質複合体を発現するために該ヌクレオチド配列を含む該細胞を増 殖する工程、 を包含する、方法。
10. １０．ｇｐ８５−９７複合体またはサブユニットに結合する抗体。
11. １１．癌細胞の増殖を阻害する方法であって、該癌細胞を、有効な量のＳＫ−Ｂ Ｒ−３ｇｐ９７に結合する抗体と接触させることを包含する、方法。
12. １２．生物学的試料中のｇｐ８５−９７サブユニットまたは該ｇｐ８５−９７サ ブユニットを含む天然のｇｐ８５−９７複合体の、変化したレベルを検出するこ とによって病気を診断する方法であって、該方法が以下の工程：該生物学的試料 を抗体と共にｇｐ８５−９７に接触させてｇｐ８５−９７サブユニットまたは該 天然のｇｐ８５−９７複合体を含有する抗原−抗体複合体を形成する工程；およ び、該抗体に結合した該ｇｐ８５−９７ｋＤサブユニットまたは該天然のｇｐ８ ５−９７複合体の量を検出する工程、を包含する、方法。
13. １３．患者の感染病を治療または予防する方法であって、該方法がこのような治 療に必要とする有効な量の精製された天然のｇｐ８５−９７または組換えｇｐ８ ５−９７、および薬学的に許容可能なキャリヤーを患者に投与することを包含す る、方法。
14. １４．２成分を含有する組成物であって、第１成分が、精製された天然のｇｐ８ ５−９７および組換えｇｐ８５−９７からなる群から選択され、そして第２成分 が、母乳およびヒトの幼児人工栄養からなる群から選択される、組成物。
15. １５．Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに 受託番号６８６０８で寄託されているプラスミドｐＳＫＢＲ３−ｇｐ９７。