JPH07507684A - Nmdaレセプター活性を有する新規ポリペプチド,これらのポリペプチドをコードする核酸,及び利用 - Google Patents
Nmdaレセプター活性を有する新規ポリペプチド,これらのポリペプチドをコードする核酸,及び利用Info
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- JPH07507684A JPH07507684A JP6501186A JP50118694A JPH07507684A JP H07507684 A JPH07507684 A JP H07507684A JP 6501186 A JP6501186 A JP 6501186A JP 50118694 A JP50118694 A JP 50118694A JP H07507684 A JPH07507684 A JP H07507684A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
NMDAレセプター活性を有する新規ポリペプチド、これらのポリペプチドをコ
ードする核酸、及び利用
本発明は新規ポリペプチド類及びそれらを発現させる遺伝物質に関する。さらに
特定すると本発明はNMDAレセプター活性を有する新規ポリペプチドに関する
。
グルタミン酸(グルタメート)はいわゆる興奮性アミノ酸であり、その活性は特
異的レセプターとの相互作用において現れる。これらのレセプターの中でNMD
A (N−メチル−〇−アスパルテート)レセプターと称されるサブタイプは神
経可塑性、長期増強作用(long−term potentiation)、
及び又神経死又はある種の退行性疾患などの多くの過程において哺乳類の中枢神
経系に含まれると思われる。
近年薬理学的研究及び分子生物学的研究が、ラットNMDAレセプター、レセプ
ターNMDARI [Morjyoshi et al、、Nature 35
4 (1991)31]及びレセプターNMDAR2[M。
nyer et al、、5cienc 256 (1992)12]、ならび
にマウスNMDAレセプター[Yamazaki et al、。
Febs Le t t、300 (1992)39]を明示し、クローニング
することを可能にした。
本発明はNMDAレセプター活性を有する新規ポリペプチドの明示の結果である
。これらの新規ポリペプチドはイオンチャネルに伴うレセプターの種類に属する
が、すでに記載されたNMDAレセプターとは構造的観点及び薬理学的観点の両
方から異なっている。特に問題のレセプターは、特に長期増強作用(LTP)に
含まれる前シナプス起源(presynaptic origin)のレセプタ
ーである。
さらに特定すると本発明はGR33と称される新規ポリペプチド、及び又その発
現又は同定を可能にする遺伝物質の単離及び特性化の結果である。本発明は又、
GR33ポリペプチドを診断に利用できるようにするプローブ及び組み換え細胞
の製造、及び新規活性分子の開発にある。
従って本発明の第1の主題は配列番号:1又はその誘導体の全部又は一部を含む
ポリペプチドにある。
本発明の目的の場合、誘導体という用語は、ポリペプチド配列番号:1の遺伝的
及び/又は化学的性質の改変によって得られたいずれの分子も示す。遺伝的及び
/又は化学的性質の改変は、1つ又はそれ以上の残基のいずれの突然変異、置換
、欠失、付加及び/又は修正も意味すると理解される。そのような誘導体は、特
にペプチドのそのリガンドへの親和力の向上の目的、その生産量の増加の目的、
そのプロテアーゼへの耐性の強化の目的、その活性の向上及び/又は改変の目的
、あるいはそれに新規な薬物動態学的及び/又は生物学的性質を与える目的など
の種々の目的で生成することができる。付加から生ずる誘導体の中で、例えば追
加の異種部分をその一端に結合して含むキメラポリペプチドを挙げることができ
る。誘導体という用語は、他の細胞源からの、特にヒト起源又は他の生物の細胞
に由来し、同種の活性を有する、ポリペプチド配列番号=1と相同であるポリペ
プチドも含む。そのような相同ポリペプチドは実施例に記載のハイブリッド形成
及び/又はPCR実験により得ることができる。
本発明のポリペプチドはグルタメートに結合する能力を有するポリペプチドであ
ることが好ましい。さらにそれらはNMDAレセプター活性を有するポリペプチ
ドであることがより好ましい。さらに好ましい実施態様に従い、本発明のポリペ
プチドは配列番号=1の完全ペプチド配列を認識する抗体により認識されること
ができる。
本発明の特定の実施態様は、配列番号・1の全ペプチド配列を含むポリペプチド
GR33により示される。実施例に示す通り、このポリペプチドはクセノプス(
Xenopus)卵において発現しニー100μMのNMDAの存在が内部への
電流を誘導する、−培地におけるグリシンの不在はNMDAへの応答をほとんど
完全に阻害する、
−NMDへへの応答はAP5 (D−2−アミノ−5−ホスホノ/くレリアン酸
)又はAP7 (D−2−アミノ−7−ホスホノへブタン酸)などの競争的拮抗
剤の存在下で低下する、
−最大応答の50%を与えるNMDA濃度(ED、。)は約10μMであり、レ
セプターNMDAR1の場合に測定された値に対応する、−調べた池の興奮性ア
ミノ酸(グルタメート、カイネート、クイスクアレート、ホモシステート)の中
で、グルタメート及びホモシステートが最強の応答を誘導するアミノ酸である、
というNMDAレセプターのすべての薬理学的特性を示す機能性グルタメートレ
セプターを形成することができる。
さらに、得られた結果は配列番号:1の全ペプチド配列を含むGR33ポリペプ
チドが、他の既知のNMDAレセプターと区別される特徴を示すことを示してい
る。特にマグネシウムは部分的阻害効果しか有していないが(30〜70%)、
これは既知のNMDAレセプターの活性を完全に阻害し、カルシウムは阻害効果
を示すがこれは記載されているNMDAレセプターの活性を賦活する。さらにこ
れらの区別的な薬理学的特徴は区別的構造的特徴を伴う。事実、288アミノ酸
を含み、約33kDaの分子量を有するGR33ポリペプチド配列番号=1は1
つの疎水性ドメイン(C末端側の20〜23非帯電残基)を含むのみである。
このポリペプチドは二次構造の形成に含まれ得る2つの有力なグリコジル化部位
(Asnl15及び134)、ならびに4つのシスティンも含む。
本発明の他の特定の実施態様は、図1に示す配列を含むポリペプチドにより示さ
れる。この配列はヒト脳バンクから得た、ポリペプチド配列番号:1と相同のレ
セプターのフラグメントに対応する。
本発明のポリペプチドは下記の通り細胞宿主におけるヌクレオチド配列の発現に
より、与えられた配列番号:1及び図1に基づき当該技術分野における熟練者に
既知の方法を用いた化学合成により(固−又は液相ペプチド合成など)、あるい
はこれらの方法の組み合わせにより得ることができる。
下記において、上記の本発明のポリペプチドをGR33ポリペプチドと称する。
本発明の主題は、GR33ポリペプチドをコードするいずれのヌクレオチド配列
でもある。そのような配列は:(a)配列番号:1のヌクレオチド配列又はその
相補鎖の全部又は一部、
(b)配列(a)とハイブリッド形成し、上記のポリペプチドをコードするいず
れかの配列、及び
(C)配列(a)及び(b)から遺伝コードの縮重の結果として誘導される配列
から選ばれるのがさらに好ましい。
本発明の種々のヌクレオチド配列は人工起源又は他の起源のものであることがで
きる。それらはゲノム、cDNA又はRNA配列、ハイブリッド配列、又は合成
もしくは半合成配列であることができる。これらの配列は、例えば配列番号:1
の配列に基づいて工夫されたプローブを用いたDNAライブラリ(cDNAライ
ブラリ、ゲネムDNAライブラリ)のスクリーニングにより得ることができる。
そのようなライブラリは当該技術分野の熟練者に既知の分子生物学の標準的方法
により、種々の起源の細胞から調製することができる。本発明のヌクレオチド配
列は化学合成により、特にホスホルアミダイト法に従って、又は別の場合ライブ
ラリのスクリーニングによって得た配列の化学又は酵素改変を含む混合法により
製造することもできる。
配列(a)とハイブリッド形成し、本発明のポリペプチドをコードする配列の例
として図2に示す配列を挙げることができる。相同配列の他の例は、やはりハイ
ブリッド形成により単離された図3に記載のヒトゲノムクローンにより示される
。
本発明のヌクレオチド配列は上記で定義したGR33ポリペプチドの生産に用い
ることができる。この場合一般に該ポリペプチドをコードする部分を、細胞宿主
においてその発現を可能にするシグナルの存在下に置く。これらのシグナル(プ
ロモーター、ターミネータ−など)の選択は用いられる細胞宿主に従って変える
ことができる。この目的のために本発明のヌクレオチド配列はベクターの一部を
形成することができ、そのベクターは自律複製又は組み込みベクターであること
ができる。さらに特定すると自律複製ベクターは、選ばれた宿主において自律的
に複製する配列を用いて製造することができる。組み込みベクターに関しては、
これらは例えば相同組み換えによるベクターの組み込みを可能にする、宿主のゲ
ノムのある領域と相同の配列を用いて製造することができる。
組み換え法による本発明のGR33ポリペプチドの生産に用いることができる細
胞宿主は真核又は原核宿主のいずれかである。適した真核宿主の中に動物細胞、
酵母又は菌を挙げることができる。特に酵母に関し、サツカロミセス(sacc
haromyces) 、クルイベロミセス(KIuyveromyces)
、ピチア(Pichia)、シュワニオミセス(Schwann iomyce
s)又はハンセヌラ(Hansenula)属の酵母を挙げることができる。動
物細胞に関し、cos、cHO1C127細胞、クセノブス卵などを挙げること
ができる。菌の中でさらに特定するとアスペルギルス種(Aspergillu
s ssp、 )又はトリコデルマ種(Trichoderma spp、)を
挙げることができる。原核宿主として以下のバクテリア:E、コリ(E。
co I i) 、バシルス(Bac i 11us)又はストレプトミセス(
Streptomyces)の使用が好ましい。
本発明のヌクレオチド配列は製薬学的分野においても、遺伝子療法と関連して用
いることができるセンス又はアンチセンス配列の生産のために、あるいは池の場
合、生物試料におけるNMDAレセプターの発現のハイブリッド形成実験による
検出、及び遺伝子異常(多型、突然変異)又は異常発現(aberrant e
xpression)の明示を可能にするプローブの生産のために用いることが
できる。
アンチセンスオリゴヌクレオチドによるある種の遺伝子の阻害は、遺伝子の活性
の制御における有望な戦略であることがわかった。アンチセンスオリゴヌクレオ
チドは、与えられた遺伝子のコード鎖に相補的な小さいオリゴヌクレオチドであ
り、その結果転写されたmRNAと特異的にハイブリッド形成することができ、
タンパク質へのその翻訳を阻害する。かくして本発明の主題はGR33ポリペプ
チドの生産を少なくとも部分的に阻害することができるアンチセンスオリゴヌク
レオチドである。
そのようなオリゴヌクレオチドは上記で定義したヌクレオチド配列の全部又は一
部を含むことができる。それらは一般に本発明のペプチドをコードする配列に相
補的な配列又は配列のフラグメントである。そのようなオリゴヌクレオチドは配
列番号=1の配列から、又は図1に示す配列からフラグメント化などにより、又
は化学的合成により得ることができる。ベクター、特にウィルスベクター(アデ
ノウィルス、レトロウィルス、アデノ−停止ウィルスなど)に挿入された本発明
の配列は遺伝子療法に用いることもできる。
上記の通り本発明は、本発明のGR33ポリペプチドをコードする上記で定義し
たヌクレオチド配列、又は対応するmRNAとハイブリッド形成することができ
る合成もしくは他のヌクレオチドプローブの生産も可能にする。そのようなプロ
ーブはGR33グルタメートレセプターの発現の検出のため、又は別の場合遺伝
子異常(誤ったスプライシング、多型、点突然変異など)の明示のための診断手
段として試験管内で用いることができる。グルタメートレセプターの多数の活性
を見ると、本発明のプローブはかくして神経学的、心循環器又は精神疾患のGR
33レセプターに伴うものとしての同定を可能にすることができる。実施例に示
す通り、これらのプローブは他の細胞供給源から、好ましくはヒト起源の細胞か
らの上記で定義したGR33ポリペプチドをコードする相同核酸配列を明示し、
単離するためにも用いることができる。本発明のプローブは一般に少なくとも1
0塩基を含み、配列番号1に示す、又は図1中の配列、あるいはそれらの相補鎖
の全体をも含むことができる。これらのプローブはその使用の前に標識するのが
好ましい。この目的のために当該技術分野における熟練者に既知の種々の方法を
用いることができる(放射性又は酵素標識など)。これらのプローブを用いるこ
とができるハイブリッド形成条件は下記の一般的クローニング法、ならびに実施
例に挙げる。
本発明の他の主題は上記で定義したGR33ポリペプチドに対するポリクローナ
ル又はモノクローナル抗体又は抗体フラグメントにある。そのような抗体は本出
願に示した方法を考慮して当該技術分野における熟練者に既知の方法により生成
することができる。特にこれらの抗体は(1)配列番号:1として示した、又は
図1に示した配列であるGR33ポリペプチドあるいはこれらのフラグメント又
は誘導体に対して動物を免疫化し、(2)採血し、(3)抗体を単離することに
より製造することができる。これらの抗体は当該技術分野における熟練者に既知
の方法に従い、ハイブリドーマの製造によっても生成することができる。
それにより得られた抗体は実施例に示す通り、特に池の細胞供給源から、好まし
くはヒト起源の細胞からの上記で定義したGR33ポリペプチドをコードする相
同核酸配列を明示し、単離するために用いることができる。それらは又GR33
ポリペプチドの明示及び単離にも用いることができる。
本発明の他の主題は、その表面で1つ又はそれ以上のGR33ポリペプチドを発
現することができる組み換え細胞に関する。これらの細胞は本発明のポリペプチ
ドをコードする上記で定義したヌクレオチド配列を導入し、該配列の発現のため
の条件下で該細胞を培養することにより得ることができる。
本発明の組み換え細胞は真核又は原核宿主のいずれかであることができる。適し
た真核宿主の中に動物細胞、酵母又は菌を挙げることができる。特に酵母に関し
、サツカロミセス、クルイベロミセス、ピチア、シュワニオミセス又はハンセヌ
ラ属の酵母を挙げることができる。動物細胞に関し、CO8,CHO,C127
細胞、クセノブス卵などを挙げることができる。菌の中でさらに特定するとアス
ペルギルス・サブスピーシス又はトリコデルマ・サブスピーシスを挙げることが
できる。原核宿主として以下のバクテリア:E、コリ、バシルス又はストレプト
ミセスの使用が好ましい。それにより得られた細胞は種々の分子が本発明のポリ
ペプチドのりガントとして、又はモジュレータ−として挙動する能力を測定する
ために用いることができる。さらに特定するとそれらはかくして本発明のポリペ
プチドのリガンド又はモジュレータ、より好ましくはグルタメート作用薬及び拮
抗剤の明示及び単離の方法において用いることができる。
従って本発明の他の主題は本発明のポリペプチドのリガンドの明示及び/又は単
離の方法に関し、それに従って以下の段階が行われるニーおそらく未同定の分子
、又は種々の分子を含む混合物を、本発明のポリペプチドを表面で発現する上記
で定義した組み換え細胞又はそのような細胞の膜試料と、該分子が該ポリペプチ
ドに親和性を有していたら本発明の該ポリペプチドと該分子の間に相互作用が起
こる条件下で接触させ、
一本発明の該ポリペプチドに結合した分子を検出及び/又は単離する。
特定の実施態様の場合、本発明のこの方法は本発明のポリペプチドに関するグル
タメート作用薬及び拮抗剤の明示及び/又は単離に適している。
本発明の他の主題は本発明のポリペプチドのモジュレータ−の明示及び/又は単
離の方法に関し、その方法に従って以下の段階が行われるニーおそらく未同定の
分子、又は種々の分子を含む混合物を、本発明のポリペプチドを表面で発現する
上記で定義した組み換え細胞又はそのような細胞の膜試料とグルタメートの存在
下で、本発明の該ポリペプチドとグルタメートの間に相互作用が起こる条件下で
接触させ、一本発明の該ポリペプチドに関してグルタメートの活性をモジュレー
タすることができる分子を検出及び/又は単離する。
本発明の他の主題は、上記の方法に従って同定及び/又は得られたリガンド又は
モジュレータ−の、医薬品としての利用に関する。事実そのようなリガンド又は
モジレータ−は、GR33レセプターに伴うある種の神経学的、心循環器又は精
神疾患を処置することを可能にすることができる。
本発明は本発明のペプチドに作用する少なくとも1つの分子を活性成分として含
む医薬品に関する。分子は上記の方法に従って同定及び/又は得られたりガント
又はモジュレータ−であることが好ましい。
本発明の他の利点は下記の実施例を読み、明らかになるであろう。実施例は例示
であり、制限ではないと理解するべきである。
図の説明
配列番号:1:ラットGR33レセプターのヌクレオチド及びペプチド配列。
図1=ヒトGR33レセプターのヌクレオチド及びペプチド配ダ11のフラグメ
ント。
図2:配列番号:1の配列と相同の配列を有するヒトゲノムクローンの制限地図
。EV=EcoRV;E1=EcoR1;H=HindI 11:P=Pstl
;S=Smal;B=Baml−110図3 : 288アミノ酸のGR33ポ
リペプチドの疎水性プロファイル。
図4:288アミノ酸のGR33ポリペプチド、配列番号=1の薬理学的及び電
気生理学的研究。結果は200μMのNMDAのみにより誘導される電流に対す
る%として表す。GLUT=グルタメート、HCA=200μMのホモシステー
トKA=300mMのカイネート;QA=50μMのクイスクアレート;NM−
gly=グリシンの不在丁における200μMのNMDA:NM+Mg=200
μMのMg24の存在下における200μMのNMDA;AP7=10μMのA
P7の存在丁における200μMのNMDA0各点は種々のクセノプスEIFI
Iこつ(為で行った少なくとも5回の測定の平均を示す。
図5:小脳(列1)、皮質(列2)、線条体(列3)及び海、鳴(夕114)の
ポリ(A)mRNA (ll1g)についてのノザンブロ・ソトによる相同配列
の明示。用いたプローブは完全cDNA配列番号:Iに女1応する。
図6=シナプトソーム膜についてのウェスタンプロ・ソトによる相同ポリペプチ
ドの明示。
一般的クローニング法
プラスミドDNAの分取抽出、塩化セシウム勾配におけるプラスミドDNAの遠
心、アガロース又はアクリルアミドゲル電気泳動、電気溶出によるDNAフラグ
メントの精製、フェノール又はフェノール/クロロホルムを用いたタンパク質抽
出、食塩水培地中のDNAのエタノール又はイソプロパツール沈澱、E、コリに
おける形質転換などの分子生物学で従来用いられた方法は当該技術分野における
熟練者に周知であり、文献に十分に記載されている[Maniatis ’r’
、et al、、“Mo1ecular Cloning、a Laborat
ory Manua 1″、Co1d Spring Harbor Labo
ratory、Co1d Spring Harbor、N、Y、、1982;
Au5ubel F、M、et at、(eds)、”Current Pro
tocols in Mo1ecular Biology″、John Wi
ley and 5ons、New York1987]。
制限酵素はNew England Biolabs (Biolabs)、B
ethesda Re5earch Laboratories (BRL)又
はAmershamから供給され、供給者の勧告に従って用いる。
pBR322、puc、λgtll及びpGEX型のプラスミド及びM13シリ
ーズのファージは市販起源のものである。
連結の場合、DNAフラグメントはアガロース又はアクリルアミドゲル電気泳動
により大きさに従って分離し、フェノール又はフェノール/クロロホルム混合物
を用いて抽出し、エタノールを用いて沈澱させ、続いてファージT4 DNAリ
ガーゼ(Biolabs)の存在下で供給者の勧告に従ってインキュベートする
。
5゛突出末端(protruding ends)のフィリングイン(f i
I I ing−in)は、E、コリ DNAポリメラーゼ■のフレノウフラグ
メント(Biolabs)を用い、供給者の仕様書に従って行う。3゛突出末端
の破壊は製造者の勧告に従って用いられるファージT4 DNAポリメラーゼ(
Biolabs)の存在下で行う。5゛突出末端の破壊はS1ヌクレアーゼを用
いて制御された処理により行う。
合成オリゴチオキンヌクレオチドによる試験管内の特定部位突然変異誘発は、A
mershamの販売によるキットを用い、Tayloret al、[Nuc
leic Ac1ds Res、13(1985)8749−87643により
開発された方法に従って行う。
K、B、and Faloona F、A、、Meth、Enzym。
155 (1987)335−3501法によるDNAフラグメントの酵素増幅
は“DNA熱サイクラ−” (Perkin Elmer Cetus)を用い
、製造者の仕様書に従って行う。
ヌクレオチド配列のベリフィケーションはSanger et al。
[Proc、Natl、Acad、Sci、USA、ヱ4 (1977)546
3−5467]により開発された方法により、Amersham販売のキットを
用いて行う。
ハイブリッド形成実験の場合、緊縮の正常な条件は以下の通りである:ハイブリ
ッド形成=65℃の5Xデンハートの存在下における3xSCC;洗浄=65℃
における0、5xSCC01、図1のcDNA H3O0のクローニングこの実
施例はGR33ポリペプチドの一部をコードするヒト脳からの約500−bpの
cDNAのクローニングを説明する。このcDNAはグルタメート−結合タンパ
ク質に対する抗体を用いてヒト脳ライブラリをスクリーニングすることにより得
た。
1.1 精製グルタメート−結合タンパク質の調製シナブトソーム膜をMich
aelis et al、[J、Neurochem、42 (1984)39
7]により記載の方法に従って調製し、ナトリウムデオキシコレートの存在下で
可溶化した。かくして可溶化された膜を続いてグルタメートカラム上でアブイニ
テイークロマトグラフィーにかけた。グルタメート−結合タンパク質をLM N
aCl溶液を用いて溶出し、0.05%のナトリウムデオキシコレートの存在下
でTris−HCI緩衝液に対して透析した。
1.2.ポリクローナル抗体の生産
上記で得られたグルタメート−結合タンパク質に対するポリクローナル抗体をマ
ウスにおいて製造した。この目的のために上記で得られた50〜100μgのグ
ルタメート−結合タンパク質を用い、フロイント完全アジュバントの存在下でB
ALB/Cマウスを免疫化した。その後の注射(8〜10日毎)は50μgのグ
ルタメート−結合タンパク質を用いるがフロイント完全アジュバントを用いずに
行った。5回の注射の後、血清を集め、凍結保存した。
1.3.ヒト脳ライブラリのスクリーニング上記で製造した抗体を用い、ベクタ
ー ラムダgill (C1ontech)中に作ったヒト脳ライブラリをスク
リーニングした。このライブラリの200万のクローンをこの方法でSambr
ook、Fr1tsch and Maniatisにより記載の方法(一般的
クローニング法を参照)に従って免疫学的にスクリーニングした。続いて同定さ
れた陽性のクローンを数回の連続的スクリーニング段階により精製して等質性と
した。これらのクローンから約500−bpのCDNAが得られ、両鎖につき配
列決定した。H3O0と称されたこのcDNAの配列を図1に示す。この配列と
ライブラリにおいて利用できる配列の間に特定の相同性は見いだされなかった。
この実施例はGR33ポリペプチド配列番号:1をコードするラット脳からの約
1.7−kbのcDNAのクローニングを説明する。このCDNAは放射性標識
cDNA H3O0をプローブとして用いたラット脳ライブラリのスクリーニン
グにより得た。
GR33ポリペプチド配列番号:1をコードするcDNAは、ベクター ラムダ
ZAP (Stratagene)中に構築したラット脳ライブラリのスクリー
ニングにより得た。このライブラリを、“ランダムプライミング法[Feinb
erg and Vogelstein。
Analytical Biochemistry 132(1984)6)]
によりあらかじめ34pで標識したcDNA I(500を用いてスクリーニン
グした。ハイブリッド形成は以下の高緊縮条件下で行った二65℃におけるハイ
ブリッド形成、3〜4xSSC15xデンl\−ト、65℃における濯ぎ、0.
1xSSC,1% SDS、ライブラリの約100万のクローンをこの方法で分
析した。1つの陽性のクローンを単離し、精製した。このクローンが有するプラ
スミドを、ヘルパーファージ(Stratagene)を用いてラムダZAP
DNAから切り出し、このプラスミドが有する1、7−kbのcDNAを両鏡に
つき配列決定した。それにより得られた配列の一部を配列番号=1に示す。
3.1.7−kbのcDNAの試験管内翻訳上記で単離した1、7−kbのcD
NAを試験管内でウサギ網状赤血球系(Promega)において翻訳した。こ
れにより分子量が約35KDAの発現タンパク質を明示することができた。配列
番号:1の配列から推定されるタンパク質は33.2kDaの理論的分子量を有
する。
得られた288アミノ酸のタンパク質の疎水性プロファイルをKyteand
Doolittle [J、Mo1ec、Biol、157 (1982)10
5]のプログラムに従って分析した。得られたプロファイルを図3に示す。それ
は配列番号:1の全配列を含むGR33ポリペプチドが疎水性ドメインを1つだ
け有することを示している。
4、クセノブス卵におけるGR33ポリペプチド配列番号:1の発現、ならびに
薬理学的及び電気生理学的研究実施例2で単離したcDNAフラグメントをmR
NAに転写し、クセノプス卵に微量注入した。それにより得られた微量注入弁を
続いである種の標識NMDAレセプターリガンドに結合するその能力、又はNM
DAレセプターのモジュレータ−に関するそれらの挙動につき調べた。
4.1.試験管内転写
GR33ポリペプチド配列番号=1をコードする1、7−kbのcDNAを含む
プラスミドを酵素Sma Iの存在下で線状とし、続いてファージT7 RNA
ポリメラーゼの存在下で転写段階に供した。転写はStratageneキット
を用い、製造者の勧告に従って行った。
4.2.微量注入
上記で得られ、無菌水に溶解した合成RNAを用い(5ng) 、50n1の体
積で成熟クセノブス卵(V及びV1期)中に注入した。続いて卵を、マルチウェ
ルプレートにおいて抗体を補足したBarth培地中の19℃で3日間保持した
(Miledi and Sumikawa。
Biomed、Res、3 (1982)390)。
4.3.薬理学的及び電気生理学的研究それにより得られた卵を続いてその表面
における機能性NMDAレセプターの存在に関して調べた。この目的で、88m
MのNaC+、2゜5mMのKCI、1mMのCaC1,,10mMのHEPE
S緩衝液の組成を有し、水酸化ナトリウムでpH7に調整したマグネシウムを含
まない修正0R−2培地に卵を移した。−80又は−90mVの電位差の適用下
で種々の薬剤(リガンド又はモジュレータ−)を潅流(10m 17分)により
10〜30秒間適用した。得られた結果を図4に示す。それらは以下を示してい
るニ
ーグルタメート(0,1〜1mM)又はその作用薬、NMDA (200μM)
の適用は内部への電流を誘導するが、カイネート(300mM)及びクイスクア
レート(50pM)を含む他のグルタメート作用薬はほとんど又は全く効果がな
い。これらの結果は、機能性イオンチャンネルにカップリングしたNMDA型の
グルタメートレセプターを注入弁がその表面に提示していることを示す。
−NMDA (200μM)により誘導された応答は、培地がグリシンを含まな
い場合、又はNMDA拮抗剤、AP5又はAP7がNMDAと同時に適用(20
0μM)された場合に停止する。この結果は注入弁のNMDAに対する応答が本
来のNMDAレセプターの応答に薬理学的に同等であることを示している。
−NMDA (200μM)により誘導された応答は、培地にマグネシウム(2
00μM)が加えられるか、あるいは外部カルシウム濃度が増加する(2.5m
M)と低下する。
5、他の組織における相同ヌクレオチド配列及びポリペプチドの探索続いて配列
番号=1のヌクレオチド配列をプローブとして用い、他の組織上の相同配列を明
示した。この目的で:−ノザンプロットハイブリッド形成、
−その場ハイブリッド形成
の2つの方法を用いた。
相同配列の探索に用いた組織は以下のネズミ起源の組織である:小脳、皮質、線
条体、海馬。
5.1.ノザンプロットによる探索
Chirgwine et al、 [Biochemistry 18 (1
979)5294]により記載のグアニジニウム イソチオシアナート法に従い
、その後オリゴ(dT)−セルロースカラムを通過させることにより上記の組織
からポリ(A)mRNAを調製した。続いてこれらのm RN Aをアガロース
ゲル上で分別し、その後ナイロン膜(HYb o n d N十)上に移した。
ハイブリッド形成に用いたプローブは、あらかじめManiatis et a
l(一般的クローニング法を参照)により記載の方法に従って32pで標識した
実施例2に記載の1.7−kbの全cDNA(配列番号=1)に対応する。種々
の組織とのハイブリッド形成を高緊縮条件下=42℃におけるハイブリッド形成
、6XSSC150%ホルムアミド、1xデンハート、65℃における濯ぎ、0
.1xSSC,1%SDSにおいて行った。
この研究により研究したすべての組織において相同の特異的DNAフラグメント
を明示することができるた(図5)。
5.2.その場ハイブリッド形成による探索その場ハイブリッド形成実験は、H
afen et at、[EMBOJ、2 (1983)617]により記載の
方法に従い、ラット脳のクリオスタット切片について行った。これらの実験に用
いたプローブは、Dumas et al、[J、Neurosci、Res、
25(1990)569]により記載の方法に従ってジゴキシゲニンー標識チオ
キシウリジン三リン酸(dig−U、Boehringer Mannheim
)を用いてあらかじめ標識した実施例2に記載の1. 7−kbの全cDNA
(配列番号=1)に対応する。この非放射性標識、及び又ハイブリッドの検出は
、アルカリ性ホスファターゼに共役させた抗−ジゴキシゲニン抗体を用いた免疫
酵素試験により行い、抗体は製造者(Boehringer Mannheim
)の勧告に従って酵素に関する発色基質である5−ブロモ−4−クロロ−3−イ
ンドリルホスフェート及びニトロブルーテトラゾリウム塩の存在下で視覚化した
。種々の組織とのハイブリッド形成は、高緊縮条件下=42℃におけるハイブリ
ッド形成、6xSSC,50%ホルムアミド、IXXシンート、65℃における
濯ぎ、0.1xSSC11%SDSにおいて行った。
この研究により、特に小脳のプルキンエ細胞及び顆粒細胞、海馬のCA1及びC
A3領域の錐体細胞ならびに皮質のいくつかの領域において本発明の相同配列を
明示することができた。
他の組織、特にヒト起源の組織、ならびに他のプローブを用いて同様の実験を繰
り返すことができると思われる。さらにこれらの実験で明示された相同配列は当
然分子生物学の標準的方法により、後に単離及び/又は増幅することができる。
6、他の組織における相同ヌクレオチド配列及びポリペプチドの明示のための抗
−GR33ポリペプチド抗体の利用ポリクローナル抗−GR33ポリペプチド抗
体を製造し、ウェスタンプロット実験により他の組織上で相同ポリペプチドを明
示するために用いた。
6.1.抗体の製造
実施例2に記載の配列番号=1のGR33ポリペプチドをコードする領域を含む
cDNAフラグメントを以下の特異的オリゴヌクレオチドを用いたPCRにより
生成した:
(i)TAATACGACTCACTATAGGATCCGACCCCGGCC
TCCAGCA
(i 1)GCAATTAACCCTCACTAAAGAATTCCCGATG
TGTGGGGAGG
これらのオリゴヌクレオチドは配列番号:1のそれぞれ位11124及び110
4に対応する。
続いてこの増幅の生成物を、グルタチオンS−トランスフェラーゼとの融合タン
パク質(GST−GR33)の形態でそれが発現されるようにE、コリ発現ベク
ターpGEX−2[Smi th and John5ton、Gene 6ヱ
(1988)31]中にサブクローニングした。それにより得られた融合タンパ
ク質を続いて精製し、ウサギにおいて抗体を製造するための抗原として用いた。
この目的で、ウサギをフロイント完全アジュバントの存在下で50〜100μg
の抗原で免疫化した。3週間後、フロイント完全アジュバントを含まない50p
gの抗原でさらに注射を行った。2回の注射の後、血清を集め、凍結保存した。
6.2 相同配列の明示
ノナブトソーム膜をMichael is et al、[J、Neuroch
em、42 (1984)397]による記載の方法に従って調製し、05%の
ナトリウムデオキシコレートの存在下で可溶化した。
それにより得られた約50μgのタンパク質を10% SDSゲル上で電気泳動
分析した。続いてタンパク質をニトロセルロース上に移し、上2の6.1.で製
造した抗体と接触させた。続いて結合抗体をECL検出系(Ame r s h
am)を用いて視覚化した。
図6に見られる通り、この研究により配列番号:1のペプチド配列の全部又は一
部を含み、分子量が約35kDa、69〜70のkDa、97〜98kDa及び
1lQkDaの種々のポリペプチドをシナブトソーム膜で明示することができた
。
この実施例はGR33ポリペプチドをコードするヒトゲノムクローンの単離及び
特性化を説明する。このクローンは、放射性標識cDNAH500をプローブと
して用いたヒトライブラリのスクリーニングにより得た。
図2のヒトクローンはベクター ラムダEMBL3 (Clontech)中に
構築されたヒトゲノムライブラリのスクリーニングにより得た。
このライブラリは、ベクター ラムダEMBL3の5a11部位に挿入された約
13−k bのゲノム挿入片を含む。このライブラリを“ランダムブライミング
法[Feinberg and Vogelstein、Analytical
Biochemistry 132(1984)6]によりあらかじめ34p
で標識したcDNA H3O0を用いてスクリーニングした。ハイブリッド形成
は以下の高緊縮条件下=65℃におけるハイブリッド形成、3〜4xSSC,5
xデンハート、65℃における濯ぎ、0.1xSSC,1%SDSにおいて行っ
た。この方法でライブラリの約2xlO’のクローンを分析した。1つの陽性の
クローンを単離し、精製した。それにより得られたプラスミド(λE17)は約
12−kbのゲノム挿入片を有し、その制限地図を図3に示す。GR33ポリペ
プチドをコードする配列はプラスミドλE17の3゛の6゜5−kb Hind
lll−Pstlフラグメントに位置している。
配列表
配列番号:1
配列の長さ・1200
配列の型:核酸
鎖の数、2本
トポロジー:直鎖状
配列の種類 他の核酸、cDNA
起源
株名:ラット
配列の特徴
特徴を表す記号:CDS
存在位置:211..1077
他の情報:/生成物=“ラットGR33レセプター”配列
TCAσ賀ズχス^A^CAGACCC^GGCAσmc^GCCTCτ 12
00配列番号:2
410)i:X、EDLテムp工KKテ入NKVR5K61 L K A X
): Q S 工E Q E ): G L N RS S A DIll L
RX RK T Q HS T L 19 RK r V E V M ’X
’101 E Y N A T Q S K Y RD RCK D RX Q
RQ1211、EITG RT 丁 テ NEICI、EDMLESGラムダ
E17
FI[;URE 3
NMDA応答に対する%
rlにUR[+
Mr(K)
69 、 rlにURE6
ネー■■
国際調査報告
N* PCT/FR93100557
、、、PCT/FR93100557
フロントページの続き
(51) Int、 C1,6識別記号 庁内整理番号A 61 K 4810
0 8314−4CCO7H21104B 8615−4CCO7K 14/7
05 8318−4H16/28 8318−4H
C12N 1/21 8828−4B
C12P 21108 9161−4BC12Q 1/68 A 9453−4
8GOIN 33153 D 7055−2J331566 7055−2J
//A61K 39/395 D 9284−4C9455−4C
I
A61K 37102 AAB
Claims (29)
- 1.配列番号:1のペプチド配列の全部もしくは一部又はその誘導体の全部もし くは一部を含むポリペプチド。
- 2.グルタメートに結合する能力を有することを特徴とする請求の範囲1に記載 のポリペプチド。
- 3.NMDAレセプター活性を有することを特徴とする請求の範囲2に記載のポ リペプチド。
- 4.配列番号:1の完全ペプチド配列を認識する抗体により認識されることがで きることを特徴とする請求の範囲1〜3のいずれか1つに記載のポリペプチド。
- 5.配列番号:1の全ペプチド配列を含むことを特徴とする請求の範囲1〜4の いずれか1つに記載のポリペプチド。
- 6.図1に示すペプチド配列を含むことを特徴とする請求の範囲1〜4のいずれ か1つに記載のポリペプチド。
- 7.図6に記載の分子量が35kDa、69〜70kDa、97〜98kDa及 び110kDaのポリペプチドから選ばれることを特徴とする請求の範囲4に記 載のポリペプチド。
- 8.請求の範囲1〜7のいずれか1つに記載のポリペプチドをコードするヌクレ オチド配列。
- 9.それが: (a)配列番号:1のヌクレオチド配列の全部もしくは一部又はその相補鎖の全 部もしくは一部、 (b)配列(a)とハイブリッド形成し、請求の範囲1〜7のいずれか1つに記 載のポリペプチドをコードする配列、及び(c)遺伝子コードの縮重の結果とし て配列(a)及び(b)から誘導される配列から選ばれることを特徴とする請求 の範囲8に記載の配列。
- 10.ゲノム、cDNA又はRNA配列、ハイブリッド配列、あるいは合成又は 半合成配列から選ばれることを特徴とする請求の範囲9に記載の配列。
- 11.図1に示される配列を含むことを特徴とする請求の範囲9に記載の配列。
- 12.該ポリペプチドをコードする部分が細胞宿主におけるその発現を可能にす るシグナルの制御下に置かれていることを特徴とする請求の範囲8〜11のいず れか1つに記載の配列。
- 13.請求の範囲1〜7のいずれか1つに記載のポリペプチドの生産を少なくと も部分的に阻害することができるアンチセンスオリゴヌクレオチド。
- 14.請求の範囲9に記載のヌクレオチド配列の全部又は一部を含むことを特徴 とする請求の範囲13に記載のオリゴヌクレオチド。
- 15.請求の範囲8に記載の配列、又は対応するmRNAとハイブリッド形成す ることができるヌクレオチドプローブ。
- 16.少なくとも10塩基を含むことを特徴とする請求の範囲15に記載のプロ ーブ。
- 17.配列番号:1の配列、又は図1に示される配列、あるいはそれらの相補鎖 の全部を含むことを特徴とする請求の範囲15に記載のプローブ。
- 18.GR33レセプターの発現の検出、又は遺伝子異常(誤ったスプライシン グ、多型、点突然変異など)の明示、あるいは神経学的、心循環器又は精神疾患 がGR33レセプターに伴うことの同定、あるいは別の場合GR33ポリペプチ ドをコードする相同核酸配列の明示及び単離のための請求の範囲15〜17のい ずれか1つに記載のプローブの利用。
- 19.請求の範囲1〜7のいずれか1つに記載のポリペプチドに対する抗体又は 抗体フラグメント。
- 20.請求の範囲1〜7のいずれか1つに記載の1つ又はそれ以上のポリペプチ ドをその表面で発現することができる組み換え細胞。
- 21.真核細胞又は原核細胞から選ばれることを特徴とする請求の範囲20に記 載の細胞。
- 22.以下の: 一おそらく未同定の分子、又は種々の分子を含む混合物を、請求の範囲1〜7で 定義したポリペプチドを表面で発現する請求の範囲20に記載の組み換え細胞又 はそのような細胞の膜試料と、該分子が該ポリペプチドに親和性を有していたら 該ポリペプチドと該分子の間に相互作用が起こる条件下で接触させ、 一該ポリペプチドに結合した分子を検出及び/又は単離する段階を行うことを特 徴とする請求の範囲1〜7のいずれか1つで定義したポリペプチドのリガンドを 明示及び/又は単離するための方法。
- 23.本発明のポリペプチドに関するグルタメート作用薬又は拮抗剤の明示及び /又は単能のための請求の範囲22に記載の方法。
- 24.以下の: 一おそらく未同定の分子、又は種々の分子を含む混合物を、請求の範囲1〜7の いずれか1つで定義したポリペプチドを表面で発現する請求の範囲20に記載の 組み換え細胞又はそのような細胞の膜試料とグルタメートの存在下で、該ポリペ プチドとグルタメートの間に相互作用が起こる条件下で接触させ、 一該ポリペプチドに関してグルタメートの活性をモジュレートすることができる 分子を検出及び/又は単離する段階を行うことを特徴とする請求の範囲1〜7の いずれか1つで定義したポリペプチドのモジュレーターの明示及び/又は単離の ための方法。
- 25.請求の範囲22〜24の方法に従って同定された、及び/又は得られたリ ガンド又はモジュレーターの医薬品としての利用。
- 26.請求の範囲1〜7のいずれか1つに記載のポリペプチドに作用する少なく とも1つの分子を活性成分として含む医薬品。
- 27.分子が請求の範囲22又は23の方法に従って同定及び/又は単離された リガンド、あるいは請求の範囲24の方法に従って同定及び/又は単離されたモ ジュレーターであることを特徴とする請求の範囲26に記載の医薬品。
- 28.請求の範囲8〜12のいずれか1つに記載のヌクレオチド配列を含むベク ター。
- 29.請求の範囲28に記載のベクターを含む製薬学的組成物。
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