CA2138151A1 - Nouveaux polypeptides ayant une activite de recepteur nmda, acides nucleiques codant pour ces polypeptides et utilisations - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne de nouveaux polypeptides ayant une activité de récepteur NMDA et le matériel génétique permettant leur expression. Elle concerne également un procédé pour la mise en évidence et l'isolement de ligands et/ou modulateurs de l'activité de ces polypeptides, et l'utilisation de ceux-ci à titre de médicaments.

Description

wo g3/25679 ~ 1 3 8 1 5 1 NOUVF~UX POLY~ 11 )F.~ AYANT UNF. ACTIVITF. DE ~FC~ 1R
NMDA. AC~FS NUCT.F.TQUES CODANT POUR CES
pOT.~ L)FA~ F.T UT~ T~A~TIoNs La pf~senle invention c~n~P~n~ de nou-,~,x polypepti~e~ et le m~tP~riel 5 génétique pe~ leur P,~r~sion. Plus particulièr~ ell~, elle conre. .~P' deno~lveau~ polypepti~es ayant une activité de r~ceple r NMDA.
L'acide ,~ ique (~ le) est un acide aminé dit P~ e~, dont l'activité se manifeste par son ,n~ld~;lion avec des receyle! s specifiques. Panni ces ,e:ceyt~s~ un sous-type, désigné réoeyteul~ NMDA (N-méthyl-D-asp~le) semble 10 impliqué, dans le système nerveux central des ...h.-.~-.;rères, dans de nombreux pr~cessus tels que la pl~ti~ité neuronale, la po~ l;on à long tenne, ainsi que la mort ~ eur~ ale ou ce~ s désonlles ~np.~l;rs~ Des études ph~m~cologiques et de biologie moléclllaire ont recP~ nt permis la mise en évidence et le cl~ n~ge de récel~te~ NMDA de rat, le lé~ple r NMDAR1 [Moliy~Li et al., Nature 354 (1991) 31] et le récep~ r NMDAR2 [Monyer et al., SciPn~ ~ (1992) 12], et d'un récepte..r NMDA de souris [Y~m~7~ki et al., Febs Lett. ~ (1992) 39].
La p~se"~e invention résulte de la mise en évidence de nouveawc polypepti-les ayant une activité de ~ce~le!.r NMDA. Bien qu'app~lenanl à la famille des récepteurs liés à des canaux ioniques, ces nou.,-~u~ polypeptides dirrèrenl des 20 rPcepLeu,s NMDA déjà décrits du point de vue shllc~ l comme du pont de vue ph~ m~cologique. En particulier, il s'agit de lecepleu.~ d'origine présynaptique, impliqués not~mment dans la potPn~i~tion à long terme (LTP).
Plus particuli~le~enL~ l'invention résulte de l'isolement et de la caractéri-sation de no~lveau~ polypeptides, ~P~i nés GR33, ainsi que du m~tPriel génétique25 p~mett~nt -leur eApr~ion ou leur idPntifif~tir-n L'invention réside eg~lemPnt dans la pr~a~aLion de sondes et de cellules recombinees permettant l'exploitation des polypeptides GR33 dans le di~ stic et la mise au point de nouvelles molécules actives.
Un premier objet de l'invention réside donc dans des polypeptides 30 cc,n~pr~,lant tout ou partie de la séquence peptidique SEQ ID n 1 ou d'un dérivé de celle-ci.

Au sens de la pLésel.le invention, le terme dérivé ~P~i~nP toute mo1P~1e .,e par morlific~ti-~n de nature génétique et/ou cl~ que de la séquence pep~ ;q,le SEQ ID n 1. Par m~ification de nature génétique etlou chimique, on peut enlend~e toute mllt~tic~n~ s~1bstitutinn, ~1élétic~n ~dtliti~n et/ou mt~ific~tiQn d'un 5 ou ph~ s résidus. De tels dérivés peuvelll être générés dans des buts différènls. tels que n..l~ n~ celui d'~ ,n~ ffil~é du peptide pour son(ses) ligand(s), celui d'améliorer ses IIL~UX de p~l~ ;Qn, celui d'a1l~ er sa ~ ce à des p~t~ A~5, celui d'a1~ n~e~ et/ou de mo~ifiPr son activité, ou celui de lui co. fe.~. de nouvelles prop iétés ph~ r~inptiques et/ou bio10~iques. Parmi les dérivés 10 résv1~nt d'une ~rlt~ l, on peut citer par t~y~pmple les polypeptid~ps chi".è,es oompG,~ll une partie hétérologue suppl .-t~ ;-e liée à une eAI-ên~ilé. Le terme dérivé cOlll~lelld e~1Pm~nt les polypeptides homt~lQ~1çs au polypeptide SEQ ID n 1, issus d'autres sources cçl11~ es et nnt~mmçnt de cellules d'origine h1lm~ine, ou d'autres o~ .es, et po~ 1 une activité de même type. De tels polypeptides 15 htlmt~le~nps peuven~ être obtPmle par des t-~l~t~e~c~S d~hybr~ tion etlou de PCR
comme décrit dans les er~ es.
Prèri:~e..l;~llPmPnt les polypepti~ e de l'invention sont des polypeptitles possé~nt la c~r~citP de lier le glt1t~m~te Encore plus préférPntiç11rmçnt il s'agit de polypepti-ies ayant une activité de récepteur NMDA. Toujours selon un mode préféré, les polypeptitl~s de l'invention sont sliec~;h'e~ d'être reconnue par des anticorps eu~ ie.e~nt la séquence peptidique complete SEQ ID n 1.

Un mode de réalisation particulier de l'invention est représenté par le polypeptide GR33 co.llp~ena,~l toute la séquence peptidique SEQ ID n 1. Comme indiqué dans les eYemrl~e, ce polypeptide peut être PYrrimé dans les oeufs de 2s Xénope pour former un léceylei~r au ~ ,.le fonrtionn~Pl, pr~sPnt~n~ toutes les c~.cle. ;~;ques ph~rm~cologiques d'un ~ceytæl~ NMDA:
- la présence de 100 IlM de NMDA induit un courant entrant;
- l'~hsPnre de glycine du milieu inhibe presque comrletPm-ont la réyonse au NMDA;
- les réponses au NMDA sont réduites en présence d'antagonistes compétitifs tels que l'AP5 (acide D-2-amino-5-phosphonovalérique) ou l'AP7 (acide D-2-amino-7-phosphonoheptanoique);

WO g3/~567g ~ 1 3 8 ~ 5 1 -la concçntration en NMDA ~onn~nt 50 ~o de la ~ponse maximum (ED50) est de 10 ~M environ, ce qui correspond aux valeurs d~lell,Pinées dans les cas du récepteur NMDAR1;
- parmi les autres acides aminés ~ Ie .. ~ testés (glllt~m~te, k~in~te, - 5 quisqualate, homocy~teale)~ le ~ )t~m~te et l'ho,n~y~ale sont ceux qui in~ i~nt les plus fortes répollses.
Par ailleurs, les résultats obtenus Illoll~ nl que le polypeptide GR33 con,p~enant toute la séquence peptidique SEQ ID n 1 p~sell~e des particularités par rapport aux autres récepleul~ NMDA connus. Not~mment, le magné~ium n'a qu'un 0 effet inhibitel~r partiel (30-70~o) alors qu'il inhibe complète-ment l'activité des récepleul~ NMDA conm.~, et le c~lcium a un effet inhibitellr alors qu'il stimulel'activité des réceple~ NMDA décrits. De plus, ces particularités ph~rm~cologiques sont liées à des part~ rites ~I,u-;lu,~les. En effet, le polypeptide GR33 SEQ ID n 1, qui conlprend 288 acides aminés et possède un poids moléc ll~ire de 33 kDa environ, ne comporte qu'un seul dom~ine hy~ophobe (20 à 23 résidus non chargés du coté C-terminal). Ce polypeptide COlllpOl le é~ m~nt 2 sites potentiels de glycosylation (Asn 115 et 134) et 4 cystéines qui pourraient être impliquées dans la formation de structures sec- n~ires.
Un autre mode particulier de réalisation de l'invention est l~plesenlé par un polypeptide co",p~n~ll la séquence p,e~l~ee sur la figure 1. Cette séquence correspond à un fragment d'un ~c~leilr hornolo~e au polypeptide SEQ ID n 1, obtenu à partir d'une banque de cer~ea.l hllm~in Les polypeptides de l'invention peuvent être obtenus par expression dans un hôte cellulaire d'une séquence nucléotidique telle que décrite ci-dessous, par synthèse chimique, sur la base des séquences c~onneçs SEQ ID n 1 et figure 1 en l~tili~nt les techniques connu~s de l'homme du métier (synthèse peptidique en phase solide ou liquide, etc), ou par une cornbin~i.con de ces techniques.
Dans ce qui suit, les polypeptides de l'invention tels que définis ci-dessus sont de~i~nés par polypeptides GR33.
La présente invention a ég~lçrn~nt pour objet toute séquence nucléotidique codant pour un polypeptide GR33. Plus préférentiellement, il s'agit d'une séquence choisie parmi:

FEUILLE DE F~E~IPLACEMENT
ISAIEP

WO 93/25679 PCr/FR93/00557

2~38~S~ , (a) tout ou partie de la séquence nucléoti~ique SEQ ID n 1 ou de son brin cQmp~ nlA;~J
(b) toute séquence hybridant avec une seqllence (a) et codant pour un polypeptide tel que défini ~ckle~ , et, (c) les séquel~ces dérivées des séquences (a) et (b) en raison de la dégéné-esc~n~e du code génétique.
Les di~r~l~-tes séquences m~ léoti~iques de l'invention peuv~nt être d'origine artifi~iP11e ou non. Il peut s'agir de séquences génomiques, d'ADNc, d'ARN, de séquences hybrides ou de séquences synthétiques ou semi-synthétiques. Ces 10 séquellces peuvenl être obt~ par PYPmp1e par ~rih1~ de banques d'ADN (banque d'ADNc, banque d'ADN ~E~pnomique) au moyen de sondes élaborées sur la base de laséquence SEQ ID n 1. De telles l~anques peuv~ -l être préparées à partir de cellules de dilré~ntes origin~s par des tecl~niques classiques de biologie moléculaire conn.jes de l'homme du métier. Les séquences nucléotidiques de l'invention ~XUV~
P~ pmpnt être préparées par ~lllhèse chimique, nol~.. en1 ælon la méthocle des phospho~ es~ ou encore par des mPth~es mixtes in~ nt la mo iifi~ticn chimique ou enzymatiqe de séquences o~t~ n~es par criblage de banques.
A titre d'exemple de séquences hybridant avec une séquence (a) et codant pour un polypeptide selon l'il,venLion, on peut citer la séquence présentée sur la figure 20 2. Un autre PYenlr1e de séquence homolo~le est ~p~s~ é par le clone génomique humain décrit sur la figure 3, P~lPmP,nt isolé par hybridat on Les séq.lences nllcléotil1iques de l'invention peuv~nl être uti~ é~s pour la prorluction des polypepti-les GR33 tels que définis précé 4.. ~-.L Dans ce cas, la partie codant pour ledit polypeptide est génér~lçmPnt placée sous le contrôle de25 ~ permett~nt son eAl)lession dans un hôte cçl1~ ire. Le choix de ces signaux (promoteurs, termin~tellrs~ etc) peut varier en fonction de l'hôte ce1h~1~ire utilisé. A
cet effet, les séquences nucléotidiques de l'invention peuvenl faire partie d'un vecteur, qui peut être à rép1ic~tion ~utonomP, ou intpgratif. Plus particulièrement, des vecteurs à réplication ~utonome peuvent être p,~pa~s en ~1ti1i~nt des séquences à réplication 30 autonome chez l'hôte choisi. S'2lgi~nt des vecteurs intégratifs, ceux-ci peuvent être p,ep~es par exemple en uti1i~nt des séquences homologues à certaines régions du génome de l'hôte, permett~nt, par recomhin~i~n homologue, l'intégration du vecteur Les hôtes cPllt-l~ires uti1i~ab1es pour la production des polypepti~les GR33 de WO 93/25679 ~! 1 3 8 1 5 1 l'invention par voie recombin~nte sont aussi bien des hôtes euc~yoles que proca.~otes. Parmi les hôtes ellcalyoles qui convienn~nt on peut citer les cellules ~nim~l~s, les levures, ou les ~h~mpignon~ En particulier, s~agi.ce~nt de levures, on peut citer les levures du genre Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, 5 Schwanniomyces, ou Han.~e~ l(7. S'~gi.~nt de c~ les ~nim~les, on peut citer les c~ COS, CHO, C127, les oeufs de Xénope, etc. Parmi les ~h~mpi~on~ on peut citer plus particulièrement Aspergillus ssp. ou Trichoderma ssp. Comme hôtes pnx&~c,les, on préfère utiliser les ba~t~ri,os s..iv~les E.coli, R~/c~ ou Streptomyces.
Les séquences nucléotidiques de la présente invention sont également utilisables dans le rlom~in~ pharm~eutique~ soit pour la réalisation de séquences sens ou ~nti~n.c utilisables dans le cadre d'une thérapie génique, soit encore pour la réalisation de sondes pellllel~l la détection, par des eApériences d'hybridation, de l'eA~,~s~ion de récepleul~ NMDA dans des éch~ntillons biologiques et la mise en évidence d'~ncm~lies génétiques (polymorphis.l,e, mut~tion~) ou d'~A~ ssions abell~llles.
L'inhibition de l'eAp~ion de certains gènes par des oliEonucléotides ~nti~Pn~ s'est avérée être une stratégie pn)...~lle..~ dans le contrôle de l'activité d'un gène. Les oligonucléotides ~nti~n~ sont des oligonucléotides de petite taille, 20 complem~nt~ires du brin codant d'un gène donné, et de ce fait capables d'hybrider speçifiquement avec l'ARNm ~ansclil, inhih~nt sa traduction en protéine. L'invention a ainsi pour objet les oligonncléotides ~nti~enc capables d'inhiber au moins partiellement la production de polypeptides GR33. De tels oligonll~cleQtides peuvent être constitués par tout ou partie des séquences nucléotidiques définies ci-avant. Il 25 s'agit généralement de séquences ou de fr~gments de séquences complem~nt~ires de séquences codant pour des peptides de l'invention. De tels olig~mlcléoti~es peuvenl être obtenus à partir des séquences SEQ ID n 1 ou donnée dans la figure 1, par fr~gm~nt~tion, etc, ou par synthèse chimique. Les séquences de l'invention peuvent également être ~tili~ees en thérapie génique, incorporées à des vecteurs, notamment 30 des v~cleu~ viraux (adénovirus, rétrovirus, virus adéno-~iés, etc).
Comme indiqué ci-dessus, l'invention permet ég~l.om.ont la réalisation de sondes nucléotidiques, synthétiques ou non, capables de s'hydrider avec les séquences - nucléotidiques définies ci-avant qui codent pour des polypeptides GR33 de FEUILLE D~ REMPLACEMENT
ISA/EP

WO 93/25679 PCr/FR93/00557 ~3~Sl 6 -l'invention, ou avec les ARNm co"espondant. De telles sondes peuv~ être uhli.~ées in vitro comme outil de ~ gnc)stic~ pour la ~étection de l'~A~l~ion d'un récepteur du ~hlt~m~te GR33, ou encore pour la mise en évidence d'anomalies génétiques (.I,allv~is épi~e~ge, polymo",hisll.e, mut~tion.~ pnnc~uelles~ etc). Compte tenu des 5 activités multiples des réc~læ~ du glu~ te, les sondes de l'invention peuvent ainsi pelme~ e d'identifier des affections neurologique, cardiovasculaire ou psychiatrique comme étant liées aux réce~leUI~ GR33. Ces sondes peuvt:lll également être l~tili~ées pour la mise en évidence et l'isolement de séquences d'acides nucléiques homologues codant pour des polypeptides GR33 tels que définis precé(lemm.?nt à
0 partir d'autres sources cellul~ires et plerér~ntiellement de cellules d'origines h,--..Aines, ainsi qu'illustré dans les exemples. Les sondes de l'invention COmpOI~
généralement au moins 10 bases, et elles peuvell~ CO~ er jusqu'à l'intégralité de la séquence p~s~ ée SEQ ID n 1 ou sur la figure 1 ou de leur brin complémentaire.
r~fé~,.liell~ment ces sondes sont, préalablement à leur utilisation, marquées. Pour 15 cela, dirrér*~tes techniques cnnmles de l'homme du métier peuvenl être employées (marquage radioactif, el~ymaLql.e, etc). Les conditions d'hybridation dans lesquelles ces sondes peuvenl être lltili~ées sont indiquées dans les techniques générales de clon~ge ci-après ainsi que dans les exemrles.
Un autre objet de l'invention réside dans des anticorps ou fragments 20 d'anticorps polyclonaux ou monoclonaux dirigés contre un polypeptide GR33 tel que défini ci-avant. De tels anticorps peuvenl être générés par des méthodes connues de l'homme du métier, compte tenu des en~eig~n~ donnés dans la présente dem~n(1e. En particulier, ces anticorps peuv~ll être pr~pa,es par (1) ;...n.,..~ tion d'un animal contre le polypeptide GR33 dont la séquence est donnée SEQ ID n 1 ou 25 sur la figure 1, ou tout fragment ou dérivé de ceux-ci, (2) prélèvement du sang, et (3) isolement des anticorps. Ces anticorps peuvenl également être générés par p.ep~lion d'hybridomes selon les techniques connu~s de l'homme de l'art.
Les anticorps ainsi obtenus peuv~ not~mm~nt être utilisés pour la mise en évidence et l'i.colem~nt de séquences d'acides nucléiques homologues codant pour des polypeptides GR33 tels que définis précé~e.. ~.. l à partir d'autres sources cellulaires et pr~rér~nliPllem~nt de cellules d'origin~s hllm~ines, ainsi qu'illustré dans les exemples. Ils peuvenl également être utilisés pour la mise en évidence et l'isolement de polypeptides GR33.

~_Ul' LE ~~ AGE.~"ENT
ISA/EP

wo 93/2s67g 2 1 3 8 1 5 1 Un autre objet de l'ir.v~l.lion conf~ne les c~-llt~ e recomhin~s capables d'~Yrrimer à leur sudace un ou plusieurs polypeptilles GR33. Ces ce11t-1r.q peu~être obtPn~ par 1.l1.~ n d'une sequence n~)eleot~ ue telle que définie ci-dessus codant pour un polypeptide de l'invention, puis culture ~es~litps c~ q dans 5 des C~ nA;I;~ nc d'~ ~s~ion de ladite séq.l~ce.
Les c~ c recomhinee~s selon l'invention peuvel~ être aussi bien des c~lltl1~s euca",olæq que pl~ca"~s. Parmi les c~ Jlp~q euc~yo~es qui conv;pnnpnt~ on peut citer les crlltlle.q ~nim~ , les levures, ou les rh~mri~nn~. En particulier, s'agic~nt de levures, on peut citer les le~ures du genre ,S~7cchnromyces, lo Kluyv~,~,my~es, Pichia, Schwanniomyces, ou Hnn~r~la. S'a~is.~nt de cpllt~lp~s~nim~ , on peut citer les c~ s COS, CHO, C127, les oeufs de Xénope, etc. Parmi les rh~mrignon~ on peut citer plus particuliè~n~enl Aspe~illus ssp. ou Trichoderma ssp. Comme cellules proca,yoles, on préfère utiliser les b~tpr~ s suiv~les E.coli, Racilh~, ou Streptomyces. Les CPll~ s ainsi obt~nl~s peuven~ être llltili~ées pour 15 .nesu~er la c~p~c;le de difrél~.læs molecl~l~.s à se co ,po ler comme ligand ou com-me m~ tell. des polypeptilles de l'il~vel~lion. Plus particulièrement, elles peUVèl~l ainsi être utiliséP~s dans un procédé de mise en évidence et d'isolement de ligands ou de m~lll~tellrs des polypepti~es de l~i..v~,.li~n, et, plus pr~ré~ m~nt~ d'~gon.~l~s et d'antagol~i~les du ~l,.l;....~e Un autre objet de l'invention co~ .. e donc un procédé de mise en évidence etlou d'i~olem~nt de ligands des polypeptides de l'invention, selon lequel on réalise les étapes sui~ les:
- on met en contact une molé~)le ou un m~l~n~e cQnt~n~nt différentes molec..lf~$, eventllell~mPnt non-i~l~ontif~ s~ avec une cellule recomhinee telle que décrite ci~essus ~,p~;m~.~l à sa surface un polypeptide de l'invention ou avec une prépala~ion meml) an~ d~une telle cellule dans des conrli~;ons permett~nt l'inter-action entre ledit polypeptide de l'invention et ladite moléalle dans le cas où celle-ci pos~è~ie-ait une affinité pour ledit polypeptide, et, - on détecte et/ou isole les molécules liées au dit polypeptide de l'invention.
Dans un mode particulier, ce procédé de l'invention est adapté à la mise en évidence et/ou l'isolement d'~go,~ s et d'~nt~g~ es du giu~ le pour les polypeptides de l'invention.
Un autre objet de l'invention con~rn~ un procédé de mise en évidence et~ou d'i~solement de modtll~tell~ des polypepti~les de l'invention, selon lequel on réalise les étapes sl~iv~les:

WO 93/25679 PCr/FRg3/00557 2~38il~ 8 - on met en contact une molécule ou un mPl~nge co~ A--~ dirr~len~es moléc--lPs, évenblPllPmPnt non-iriPntifiP,Ps~ avec une cellule recombinPe telle que décrite ci-dessus exprimant à sa surface un polype~ptide de l'invention ou avec une plép~alion membl~laire d'une telle cellule, en plesellce de gl.,l;...-~te, dans des 5 cQn~lition~ permettant l'illle.~ ion entre ledit polypeptide de l'invention et le glllt~m~te, et, - on détecte et/ou isole les molec11lp~s c~p~bles de mo(llller l'activité du gl.,~ e sur ledit polypeptide de l'invention.

Un autre objet de l'invention cr)n~prnp l'utilisation d'un ligand ou d'un o mocilllatelur identifié et/ou obtenu ælon le procédé décrit ci-avant comme méfiic~ment. De tels ligands ou modlll~tPl~rs peuve.ll en effet pel.,.t:llle de traiter cel~ines affections neurologique, cardiovasculaire ou psychiatrique liées aux réce~le. .. ~ GR33.
L'invention co~-c~. ..e ég~lPmPnt tout m~Aic~nPnt com~r~n~nl comme 15 p~incipe actif au moins une molécule agic~nt sur un peptide de l'invention.
P~fél~,llliPll~mPnt la molécule est un ligand ou un mo(llll~teur identifié et/ou isolé
selon le procédé décrit précéclPt~....~..l - D'autres avantages de la p~se"le invention appa a.llont à la lecture des Py~mples qui suivent, qui doivent être considérés comme illu~alirs et non limit~tifs.
Lé~ende des fi.~ures SEQ ID n 1: Séquences nucléotidique et peptidique du récepteur GR33 de rat.
Figure 1: Fragment de la séq,lence nucléotidique et peptidique du récepteur GR33 hllm~in.
Figure 2: Carte de restriction du clone génomique humain portant une séquence homologue à la séquence SEQ ID n 1. EV=EcoRV; El=EcoRl; H=HindIII;
P=PstI; S=SmaI; B=BamHI.
Figure 3: Profil d'hy~ophobicité du poly-peptide GR33 de 288 acides aminés.
Figure 4: Etude pharm~cologi-lue et élec~ophy~iologique du polypeptide GR33 de 288 acides aminés SEQ ID n 1. Les résultats sont exprimés en ~o du courant induit par 200 ,uM de NMDA seul. GLUT = ghlt~m~tP; HCA = homocy~leale 200 ,uM;
KA = kainate 300 mM; QA = quisqualate 50 ~M; NM-gly = 200 ~M de NMDA en i'ahsence de glycine; NM+Mg = 200 ~M de NMDA en présence de 200 ~M de FEUILLE DE REMPLACEMENT
IS~/EP

WO 93/25679 ~! 1 3 8 1 5 1 Pcr/FRg Mg2+; AP7 = 200 ,uM de NMDA en présence de 10 ~M d'AP7. Chaque point esente un moyenne de 5 mesures au moins ~rret luées sur des oeufs de xénope dirrt ~
Figure 5: Mise en évidence de séquences homolo~es par Northern blot sur des 5 ARNm polyA (1 ~g) de cervelet (piste 1), cortex (piste 2), stn~tum (piste 3) et hippoc~,llpus (piste 4). La sonde utilisée correspond à l'ADNc complet SEQ ID n 1.
Figure 6: Mise en évidence de polypeptides homologues par Western blot sur des membranes sy,la~lQson.Ales.
Techni~ues ~énérales de clonage Les méthocles classiqueme -l llt~ éPs en biologie molec~ ire telles que les extractions pr~a~ives d'ADN pl~mi-iique, la ce,-llirugation d'ADN pl~cmit3ique en - gradient de chlorure de cç~ m, l'éle~,~kol)horèse sur gels d'agarose ou d'acrylamide, la purification de fragments d'ADN par électroéllltion, les extractions de protéines au phénol ou au phénol-chlororo.me, la précirit~tion d'ADN en milieu salin par de 5 l'éthanol ou de l'isopropallol, la k~r~îo,.ation dans Escherichia coli, etc, sont bien connuPs de l'homme de métier et sont abond~mPnt tl~ntPs dans la Ll~é.~lu e [Maniatis T. et al., "Mo~ccl~l~r Cloning, a Labo~a~o-y Manual", Cold Spring Harbor Labo.~lo.y, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Ausubel F.M. et al. (eds), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987].
Les enzymes de restriction ont été fournies par New F.ngl~n-l Biolabs (Biolabs), BethPsci~ Research Labo~ ;es (BRL) ou ~mPr~h~m et sont utili~ees selon les recomm~n~tions des follrni~sPllrs.
Les pl~mi~ie~ de type pBR322, pUC, ~gtll, pGEX et les phages de la série M13 sont d'origine commerciale.
Pour les ligatures, les fragm~nts d'ADN sont séparés selon leur taille par électrophorèse en gels d'agarose ou d'acrylamide, extraits au phénol ou par un mçlAnge phénoVchlor~fo~n~e, précipités à l'éthanol puis incubés en présence de l'ADN ligase du phage T4 (Biolabs) selon les recon~r~A~ ations du follrni~setlr.Le remplissage des e,-kemilés 5' prce~..;nç~.lPs est effectué par le fragment de30 Klenow de l'ADN Polymérase I d'E. coli (Biolabs) selon les spécifications du follrni~sellr. La destruction des e~l.emi~és 3' pr~?eminentes est effectuée en présence de l'ADN Polymérase du phage T4 (Biolabs) utilisée selon les recomm~n~iAtions dufabricant. La destruction des extrémités 5' pr~éminentes est effectuée par un tr~itemPnt ménagé par la mlclP~ce S1.
FEUiLLE DE REMPLACEMENT
ISA/EP

WO g3r2567g PCI/F1~93/00557 2~3~S l 10 La mut~nPse dirigée in vitro par oligcdé~yynlrléoti~lps synthétiques est effectuée selon la mPtho(le développée par Taylor et al. [Nucleic Acids Res. 13 (1985) 8749-8764] en ~tili~Ant le kit distribué par ~ hn~
L'~mplific~tion enzymatique de fr~gment~ d'ADN par la technique dite de PCR Lolymelase-catalyzed Çhain Reaction, Saiki R.K. et al., Science ~Q (1985) 1350-1354; Mullis K.B. et Faloona F.A., Meth. Enzym. 155 (1987) 335-350] est effectuée en utili~nt un "DNA thermal cycler" (Perkin Elmer Cetus) selon les spécifi~tion~ du f~bric~nt La vérification des séquences nucléotidiques est effectuée par la métho(le lo développée par Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463-5467] en tilis~nt le kit distribué par ~mer~h~m Pour les expériences d'hybridation, les conditions de stringPnce nor nales sont génér~lemP-nt les suiv~les: hybridation: 3 x SCC en présence de 5 x Denhart's à
65C; lavage: 0,5 x SSC à 65 C.
1. Clon~e de l'ADNc H500 de la f~lre 1.

Cet exemple décrit le clonage d'un ADNc de 500 pb environ à partir de ceL~eau h1lm~in, codant pour une partie d'un polypeptide GR33. Cet ADNc a été
obtenu par criblage d'une banque de cet~eau humain au moyen d'anticorps dirigés contre des protéines liant le gllJ~
1.1. ~l~p~alion de p,.~leines liant le ~lu~ te p~lrifiées Des membranes synaptosom~les ont été préparées selon la technique décrite par Michaelis et al. [J. Neurochem. 42 (1984) 397] et solubilisées en présence de sodium-déoxycholate. Les membranes ainsi solubilisées ont ensuite été soumises àune chromatographie d'affinité sur une colonne de glut~m~te Les p,oléines liant le gh.~ e ont été éluées par une solution NaCl lM, et dialysées conke un tampon Tris-HCl en présence de 0,05 % de sodium-déoxy~-hol~te.

1.2. Production d'anticorps polyclonaux.
Des anticorps polyclonaux dirigés contre les protéines liant le glllt~m~te obtenues ci-dessus ont été pli~pali:S chez la souris. Pour cela, des souris BALB/C ont été il.lm~lisées avec 50-100 ~g des protéines liant le glut~m~te obtenues ci-dessus en présence d'adjuvant complet de Freund. Les injections subséquentes (tous les 8 à 10 FEUILLF DE RE~/EPLAC~MEt\!~
IS~JE?

WO 93/25679 2 :1 3 81 5 ~ PCI/FR93/00557 jours) ont été faites avec 5t) llg des p~léines liant le ~lut~m~t~, mais sans adjuvant cQmrl~t de Freund. Après 5 injecti-)nc, les sérums ont été collçctés et conse,vés congelés.
1.3. Cnhl~ge d'une banque de ce, veau hllm~in Les anticorps p,~par~s ci-dessus ont été utilisés pour cribler une banque de ce,veau hllm~in réalisée dans le v~;~e"r lambda gtll (Clontech). Deux millions de clones de cette banque ont ainsi été criblés imm~mologirlue...e..l, selon la technique décrite par Sambrook, Fritsch et Maniatis (Cf techniques générales de clonage). Les clones positifs i~l.ontifiçs ont ensuite été purifiés à homogénéité par plllci~-rs étapes lO successives de criblage. A partir de ces clones, un ADNc de 500 pb environ a été
obtenu et séquencé sur les 2 brins. La séquence de cet ADNc, désigné H500, est présentée sur la figure 1. Aucune homologie particulière n'a été trouvée entre cette séquence et celles accç~cibles dans les banques.
2. Clona~e de l'ADNc codant l?our le polypeptide GR33 SEO ID n 1.
Cet ~Y~mple décrit le clonage d'un ADNc de 1,7 kb environ à partir de ce,veau de rat, codant pour le polypeptide GR33 SEQ ID n 1. Cet ADNc a été
obtenu par criblage d'une banque de ce, veau de rat en utilic~nt comme sonde l'ADNc H500 radiomarqué.
L'ADNc codant pour le polypeptide GR33 SEQ ID n 1 a été obtenu par criblage d'une banque de cerveau de rat col~LI,liLe dans le vecteur lambda ZAP
(Stratagène). Cette banque a été criblée avec l'ADNc H500 préalablement marqué au 32p par la technique du "random priming" [Feinberg et Vogelstein, Analytical Biorh~micty 132 (1984) 6}]. L'hybridation a été réalisée dans les conditions de stringence élevée suivallles: hybridation à 65C, 3-4 x SSC, 5 x Denhardt's, rinçage à
65C, 0,1 x SSC, 1 % SDS. Environ 1 million de clones de la banque ont ainsi étéanalysés. Un clone positif a été isolé et purifié. Le pl~mide porté par ce clone a été
excisé de l'ADN du lambda ZAP au moyen d'un phage helper (Str~t~g.one), et l'ADNc de 1,7 kb porté par ce pl~cmi~e a été séquencé sur les 2 brins. Une partie de laséquence ainsi obtenue est plt:ænlée sur la SEQ ID n 1.

3. Traduction in vitro de l'ADNc de 1.7 kb FEUiLLE DE REMPLA~ME~NT
ISA/EP

WO 93/25679 PCr/FR93/00557 2~3~-S~ 12 L'ADNc de 1,7 kb isolé ci-dessus a été traduit in vitro dans le système des rét~ ocytes de lapin (Promega). Ceci a permis de mettre en évidence une protéineexprimée ayant un poids mol~.l~ire de 35 kDa environ. La protéine déduite de la séquence SEQ ID n 1 possède un poids théorique de 33,2 kDa. Le profil 5 d'hy~phobicité de la pn~léine de 288 acides aminés rés~lt~nte a été analysé selon le programme de Kyte et Doolittle [J. Molec. Biol. 157 (1982) 105]. Le profil obtenu est plesenlé sur la figure 3. Il indique que le polypeptide GR33 co--.prellanl la séquence entière SEQ ID ne 1 ne possède qu'un ~om~in~ l~y~ln~l)hobe.

4. Expression du yolype~tide GR33 SFO ID n 1 dans les oeufs de Xéno~e et étude l0 pharmacolo~ique et électrophysiolo~ique.
Le fragment d'ADNc isolé dans l'exemple 2 a été l~ansc~il en ARNm et microinjecté dans des oeufs de Xénope. Les oeufs microinjectés ainsi obtenus ontensuite été testés pour leur c~pac;~P à lier certains ligands de récepleu~ NMDA
marqués ou pour leur compolle...ent vis-à-vis de mocllll~te.lrs de ces rPcept~lrs.
4.1. Transcription in vitro Le pl~cmi(le cc-~le~..l l'ADNc de 1,7 kb codant pour le polypeptide GR33 SEQ ID n 1 a été linP~ri~é en présence de l'enzyme SmaI, puis soumis à une étape de transcription en présence de l'ARN polymérase du phage T7. La transcription a été
effectuée en utili~nt le Kit Strat~n~ selon les reco.. ~n.1~tions du fabricant.
4.2. Microinjection L'ARN synthhique obtenu ci-dessus en solution dans l'eau stérile a été
utilisé (5 ng) pour être injecté dans des oeufs de xénope matures (stades V et VI) dans un volume de 50 nl. Les oeufs ont ensuite été ..~ nilc 3 jours à 19C dans des plaques multi-puits dans un milieu Barth supplem~ntée d'antibiotiques (Miledi etSumikawa, Biomed. Res. 3 (1982) 390).
4.3. Etude pharmacologique et électrophysiologique Les oeufs ainsi obtenus ont ensuite été testés pour la présence à leur surface de récep~e~ NMDA fonctionnels. Pour cela, les oeufs ont été transférés en milieuOR-2 modifié, dépourvu de m~gn~ lm, de ccs,-,posilion: NaCl 88 mM, KCl 2,5 - 30 mM, CaCl2 1 mM, tampon HEPES 10 mM, pH 7,4 ajusté avec de la soude. Les FEUILLE DE REMPLACEMENT
ISA/EP

wO g3/2s679 2 1 3 8 1 5 1 PCl/FR93/00557 différentes drogues (lig~nrl~ ou mo~ te lrs) ont été appliquées par perfusion (10 ml/mn) pen~l~nt 10-30 secc-n~l~.s, sous une di~l~nce de potentiel imposée de -80 ou -90 mV. Les ré~lt~t~ ob~ s sont p,esentés sur la figure 4. Ils montrent que:
- l'application de gll~t~m~t~ (0,1-1 mM) ou de son agoniste, le NMDA (200

5 ~M), induit un coul~anl "inward", alors que d'autres agonistes du glut~m~te dont le kainate (300 mM) et le quisqualate (50 ,uM) n'ont que peu ou pas d'effet. Ces résultats indiquent que les oeufs injectes pl~s~ n~ à leur surface des récep~euls au glut~m~te col~plés à des canaux ioniques fonctionnels, de type NMDA.
- la réponse induite par le NMDA (200 ~M) est abolie lorsque le milieu ne contient pas de glycine, ou lorsque les ant~gon;~les du NMDA, AP5 ou AP7, sont appliqués (200 ~M) sim-llt~nPm~nt au NMDA. Ce résultat indique que la réponse auNMDA des oeufs injectés est pharmacologiquement co,l.p~ble à celle d'un réceptet)r NMDA natif.
- la réponse induite par le NMDA (200 ,uM) est ~imim~ee lorsque l'on ajoute du m~gn~sium (200 ~M) dans le milieu, ou lorsque l'on al1gm~nte la concentrationexterne en calcium (2,5 mM).
5. Recherche de sé~uences nucléotidiques et de polypeptides homolo~ues dans d'autres tissus La séquence nucléotidique SEQ ID n 1 a ensuite été utilisée comme sonde pour la mise en évidence de séquences homologues à partir d'autres tissus. Pour cela, 2 techniques ont été utili.~ees:
- l'hybridation en Northern blot, - l'hybridation in situ.

Les tissus utilisés pour la recherche de séquences homologues sont les suivants d'origine murine: cervelet, cortex, str ~t~m, hippocampus.
5.1. Recherche en Northern Blot Les ARNm-polyA ont été p~pares à partir des tissus indiqués ci-dessus selon la technique à l'isothiocyanate de gu~ni(linium décrite par Chirgwin et al.
[Bior~e--.;,l. y 18 (1979) 5294], suivie d'un passage sur colonne d'oligodT-cellulose.
Ces ARNm ont ensuite été fractionnés sur gel d'agarose, puis transférés sur membranes de nylon (Hybond N+). La sonde utilisée pour l'hybridation correspond à
l'ADNc de 1,7 kb entier décrit dans l'exemple 2 (SEQ ID n l) préalablement marqué

FEUiL' E DE RFMPLACEh~EN~
lS~aJEP

WO g3/25679 PCI/FR93/00557 2~J 38~S1 14 au 32p selon la technique décrite par Maniatis et al (Cf techniques générales declonage). L'hybridation avec les di~Çe.e.l~ tissus a été réalisée dans des conditions de strin~en~e élevées: hybri~lation à 42C, 6 x SSC, 50 % fo....~-..;(le, 1 x Denhardt's, rinçage à 65C, 0,1 x SSC, 1 % SDS.
s Cette étude a permis de mèttre en évidence des fragm~nt~ d'ADN spécifiques homologues dans tous les tissus étudiés (figure 5).
5.2. Recherche par hybridation in situ Les ex~rien~es d'hybridation in sitU ont été ré~ s sur des sections cryostatées de cerveau de rat selon la technique décrite par Hafen et al. [EMBO J. 2 0 (1983) 617]. La sonde utilisée pour ces eApé,iences correspond à l'ADNc de 1,7 kb entier décrit dans l'~Y~mple 2 (SEQ ID n 1) préalablement marqué au moyen de déoxyuridine tnphosph~te marquée à la digoxig~-nine (dig-U, Boehringer ~nnh~im) selon la technique décrite par Dumas et al. [J. ~e~sci. Res. ~ (1990) 569]. Ce marquage non radioactif ainsi que la détection des hybrides ont été réalisés par test in"l-uno-enzymatique en uti~ nt des anticorps anti digoxig~nine conjugués à la phosph~t~e ~lc~lin~, qui sont révélés en présence d'un substrat chromogénique del'en_yme, le 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosph~te et le sel de tétra7olit-m du "nitroblue" en suivant les recon\...~n~tions du fabricant (Boehringer Mannheim) L'hybridation avec les dir~éfe.,~ tissus a été réalisée dans des conditions de stringence élevées: hybridation à 42C, 6 x SSC, 50 % fo.. ~-~-.. itle, 1 x Denhardt's, rinçage à
65C, 0,1 x SSC, 1% SDS.

Cette étude a permis de mettre en évidence des séquences homologues selon l'invention notamment dans les cellules de Purkinje et dans les cellules granulaires du cervelet, dans les cellules pyr~mid~l~s des régions CA1 et CA3 de l'hippocampus, et 2s dans certaines régions du cortex.

Il est ~nt.on-lu que les même expériences peuv~nl être répétées en utili~nt d'autres tissus et not~mment des tissus d'origine hllm~ine, et d'autres sondes. Par ailleurs, les séquences homologues mises en évidence lors de ces expériences peuvent évic~emment être ensuite isolées et/ou ~mplifiées par les techniques classiques de 30 biologie moléculaire.

- . FEUILLE L)E REM~'LACEMENT
ISA/EP

wo g3,256,g 2 1 3 8 1 5 1 rCr/~Rg3/no557

6. Utili~tion d'~nticor~s ~nh-polype~tides G~3 po~r la rni~ en évidence de séq~ ces ~l~rléoti~liQues et de polr~ept;des homolo~ues ~l~nc d aul~es tic~lc Des ~ullicol~s polyrl~ n~ c anti polypepti~es GR33 ont été pf~pa~s et utilisés pour la mise en évidence par des P~ ;P~cPc de Weste~n blot de polype~ti~l~s homok~ s à partir d'autres tissus.

6.1. ~p~ ~I;on des anticorps.
Un fr~mPnt de l'ADNc co.~lP~ la région codant pour le polypeptide GR33 SEQ ID n 1 décrit dans l'exemple 2 a été généré par-PCR au moyen des oli~nnl~rléotides sp~ifillues su~
o (i) TAATACGACTCACTATAGGATCCGACCCCGGCCTCCAGCA
(ii) GCAATTAACCCTCACTAAAGAATTCCCGATGTGTGGGGAGG
Ces oli~nnucléotides col,cs~>olldelll Ic~ iv~ ent aux positiQnc 124 et 1104 sur la céqllenre SEQ ID n 1.
Le produit de cette ~n~plific~ti~n a ensuite été sous cloné dans le vecteur d'eAplc~ion d'E.coli p&EX-2 lSmith et John~on, Gene 67 (1988) 31] de manière à
peilllellr~ son eA~I~s~ion sous forme d'une protéine de fusion avec la ~hlt~thic-n-S-félase (GST-GR33). La plole,lle de fusion ainsi produite a ensuite été purifiée et utilisée comme ~nti~n~ pour pr~ar~ des anticorps chez le lapin. Pour cela, les lapins ont été ;~ nieé~c avec 50-100 ~g d'~nti.~n~ en présence d'adjuvant complet de Freund. Après 3 s~ c, une nouvelle injection a été faite avec 50 llg d'~ntiE~ne~
mais sans adjuvant co...pl~t de Freund. Après 2 inje~tir~n~ les sérums ont été
collectec et conselv~s conE~
6.2. Mise en évidence de séquence. homologues Des membranes ~..~ oso...AlPs ont été préparées selon la technique décrite 25 par Mi~h~ et al. [J. Ne~r~ el". 42 (1984) 397] et solubilisées en présence de 0,5 % de sodium-déoxy hc~l~te Environ 50 ~g de protéines ainsi obtenllPs ont étésoll"lises à une analyses électrophorétique sur gel SDS à 10 ~o. Les protéines ont ensuite été transférées sur nitrocellulose et mises en contact avec les anticorps p,~parés en 6.1. ci dessus. Les anticorps liés ont ensuite été révélés au moyen du 30 système de détection ECL (Ame~h~m).
, 2~ 381S~ 16 Comme il app&~ sur la figure 6, cette étude a permis de mettre en évidence dans les m~mhr~n~s ~ osc!~n~l~ dirre~nls polypeptides col,.p~n~ll tout ou partie de la séquence peptidique SEQ ID n 1 et ayant des poids molec~ ires de 35 kDa, 69-70 kDa, 97-98 kDa et 110 kDa environ.
5 7. I~olement et cara~élisalion d'un clone ~énomique humain codant ~our un polypeptide GR33.
Cet exemple décrit l'i~olem~nt et la ca~a~ ,.l;on d'un clone génomique h11m~in codant pour un polypeptide GR33. Ce clone a été obtenu par criblage d'une banque hllm~ine en utili~nt comme sonde l'ADNc H500 radiomarqué.
Le clone hllm~in de la figure 2 a été obtenu par criblage d'une banque g~nomique h.. Ai~ con~huile dans le vecteur lambda EMBL3 (Clontech). Cette banque conti~nt des inserts gi~nomiques de 13 kb environ insérés dans le site SalI du vecteur lambda EMBL3. Cette banque a été criblée avec l'ADNc H500 préalablement marqué au 32p par la technique du "random priming" [Feinberg et Voge1~tçin, 15 Analytical Bio~h~mi~y 132 (1984) 6]. L'hybri(latic)n a été réalisée dans les conditions de strin~nre élevée suivdllles: hybridation à 65C, 3-4 x SSC, 5 x Denhardt's, rinçage à 65C, 0,1 x SSC, 1 % SDS. Environ 2.105 clones de la banque ont ainsi été analysés. Un clone positif a été isolé et purifié. Le pl~cmide ainsi obtenu (AE17) porte un insert g~nomique de 12 kb environ, dont une carte de restriction est 20 plésenlée sur la figure 3. La séquence codant pour le polypeptide GR33 est située dans le fragment 3' HindIII-PstI de 6,5 kb du pl~mide ~E17.

F~UILLE DE REhAPLACE~MEN~
ISA/EP

W O 93/25679 P(~r/FR93/00557 21381Sl LISTE DE SEQUENCES
(1) INFORMATION GENERALE:
(i) DEPOSANT:
(A NOM: RHONE-POULENC RORER S.A.
(Bl RUE: 20, avenue Raymond ARON
(C VILTT~': ANTONY
(E PAYS: FRANCE
(F CODE POSTAL: 92165 (ii) TITRE DE L' INVENTION: Nouveaux polypeptides ayant une activite de recepteur NMDA, acides nucleiques codant pour ces polypeptides et utilisations.
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 1 (iv) FORME T-T-~TRT-T' PAR ORDTNA~uR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk 20 (B) ORDTN-A~uR: IBM PC compatible (C) ~Y~.IE D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.25 (OEB) (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 1:
ti) CARACTERISTIQUES DE LA ~:Q~
(A) LON~u~uK: 1200 paires de bases (B) TYPE: acide nucleique (C) NOMBRE DE.BRINS: double (D) CONFIGURATION: 1in~ire (ii) TYPE DE MOTT~'C~T~T~': ADNc (vi) ORIGINE:
(B) SOUCHE: Rat (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPT.~M~NT: 211..1û77 (D) AUTRES RENSEIGNEMENTS: /product= "Recepteur GR33 de rat"
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
AllCCGGGCA GCCTAGG~AG AGCCAGTCGG CCCAGGCCCC l~ lGCC TGGCCTCAGC 60 CGAAGAAGGG GAGGAGGAGC CC~rCGCAGG ATG AAG GAT CGG ACT CAG GAG CTG 234 Met Lys Asp Arg Thr Gln Glu Leu Arg Ser Ala Lys Asp Ser Asp Asp Glu Glu Glu Val Val His Val Asp Arg Asp His Phe Met Asp Glu Phe Phe Glu Gln Val Glu Glu Ile Arg Gly Cys Ile Glu Lys Leu Ser Glu Asp Val Glu Gln Val Lys Lys Gln 2~3815 1 18 His Ser Ala Ile Leu Ala Ala Pro Asn Pro Asp Glu Lys Thr Lys Gln Glu Leu Glu Asp Leu Thr Ala Asp Ile Lys Lys Thr Ala Asn Lys Val :j CGG TCC AAG TTG AAA GCG ATC GA~iCAG AGC ATT GAG CAG GAA GAG GGG 522 Arg Ser Lys Leu Lys Ala Ile~G`lu Gln Ser Ile Glu Gln Glu Glu Gly Leu Asn Arg Ser Ser Ala Asp Leu Arg Ile Arg Lys Thr Gln His Ser Thr Leu Ser Arg Lys Phe Val Glu Val Met Thr Glu Tyr Asn Ala Thr Gln Ser Lys Tyr Arg Asp Arg Cys Lys Asp Arg Ile Gln Arg Gln Leu Glu Ile Thr Gly Arg Thr Thr Thr Asn Glu Glu Leu Glu Asp Met Leu Glu Ser Gly Lys Leu Ala Ile Phe Thr Asp Asp Ile Lys Met Asp Ser Gln Met Thr Lys Gln Ala Leu Asn Glu Ile Glu Thr Arg His Asn Glu Ile Ile Lys Leu Glu Thr Ser Ile Arg Glu Leu His Asp Met Phe Val Asp Met Ala Met Leu Val Glu Ser Gln Gly Glu Met Ile Asp Arg Ile Glu Tyr Asn Val Glu His Ser Val Asp Tyr Val Glu Arg Ala Val Ser Asp Thr Lys Lys Ala Val Lys Tyr Gln Ser Lys Ala Arg Arg Lys Lys Ile Met Ile Ile Ile Cys Cys Val Val Leu Gly Val Val Leu Ala Ser Ser Ile Gly Gly Thr Leu Gly Leu

Claims (29)

REVENDICATIONS

1. Polypeptide comprenant tout ou partie de la séquence peptidique SEQ ID
n°1 ou d'un dérivé de celle-ci.

2. Polypeptide selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il possède la capacité de lier le glutamate.

3. Polypeptide selon la revendication 2 caractérisé en ce qu'il possède une activité de récepteur NMDA.

4. Polypeptide selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisé en ce qu'il peut être reconnu par des anticorps reconnaissant la séquence peptidique complète SEQ ID n°1.

5. Polypeptide selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisé en ce qu'il comprend toute la séquence peptidique SEQ ID n°1.

6. Polypeptide selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisé en ce qu'il comprend la séquence peptidique présentée sur la figure 1.

7. Polypeptide selon la revendication 4 caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les polypeptides ayant un poids moléculaire de 35 kDa, 69-70 kDa, 97-98 kDa et 110 kDa décrits sur la figure 6.

8. Séquence nucléotidique codant pour un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 7.

9. Séquence selon la revendication 8 caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi:
(a) tout ou partie de la séquence nucléotidique SEQ ID n°1 ou de son brincomplémentaire, (b) toute séquence hybridant avec une séquence (a) et codant pour un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 7, et, (c) les séquences dérivées des séquences (a) et (b) en raison de la dégénérescence du code génétique.

10. Séquence selon la revendication 9 caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi les séquences génomiques, d'ADNc, d'ARN, les séquences hybrides ou les séquences synthétiques ou semi-synthétiques.

11. Séquence selon la revendication 9 caractérisée en ce qu'elle comprend la séquence donnée sur la figure 1.

12. Séquence selon l'une des revendications 8 à 11 caractérisée en ce que la partie codant pour ledit polypeptide est placée sous le contrôle de signaux permettant son expression dans un hôte cellulaire.

13. Oligonucléotide antisens capable d'inhiber au moins partiellement la production de polypeptide selon l'une des revendications 1 à 7.

14. Oligonucléotide selon la revendication 13 caractérisé en ce qu'il est constitué par tout ou partie d'une séquence nucléotidique selon la revendication 9.

15. Sonde nucléotidique capable de s'hydrider avec une séquence selon la revendication 8 ou avec l'ARNm correspondant.

16 Sonde selon la revendication 15 caractérisée en ce qu'elle comporte au moins 10 bases.

17. Sonde selon la revendication 15 caractérisée en ce qu'elle comporte l'intégralité de la séquence SEQ ID n°1 ou de la séquence présentée sur la figure 1 ou de leur brin complémentaire.

18. Utilisation d'une sonde selon l'une des revendications 15 à 17 pour la détection de l'expression d'un récepteur GR33 ; ou pour la mise en évidence d'anomalies génétiques (mauvais épissage, polymorphisme, mutations ponctuelles, etc); ou pour identifier des affections neurologique, cardiovasculaire ou psychia-trique comme étant liées aux récepteurs GR33; ou encore pour la mise en évidence et l'isolement de séquences d'acides nucléiques homologues codant pour des polypeptides GR33.

19. Anticorps ou fragment d'anticorps dirigé contre un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 7.

20. Cellule recombinée capable d'exprimer à sa surface un ou plusieurs polypeptides selon l'une des revendications 1 à 7.

21. Cellule selon la revendication 20 caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi les cellules eucaryotes ou procaryotes.

22. Procédé de mise en évidence et/ou d'isolement de ligands des polypeptides tels que définis dans les revendications 1 à 7, caractérisé en ce que l'on réalise les étapes suivantes:
- on met en contact une molécule ou un mélange contenant différentes molécules, éventuellement non-identifiées, avec une cellule recombinée selon la revendication 20 exprimant à sa surface un polypeptide tel que défini dans les revendications 1 à 7 ou avec une préparation membranaire d'une telle cellule dans des conditions permettant l'interaction entre ledit polypeptide et ladite molécule dans le cas où celle-ci possèderait une affinité pour ledit polypeptide, et, - on détecte et/ou isole les molécules liées au dit polypeptide.

23. Procédé selon la revendication 22 pour la mise en évidence et/ou l'isolement d'agonistes ou d'antagonistes du glutamate pour les polypeptides de l'invention.

24. Procédé de mise en évidence et/ou d'isolement de modulateurs des polypeptides tels que définis dans les revendications 1 à 7, caractérisé en ce que l'on réalise les étapes suivantes:
- on met en contact une molécule ou un mélange contenant différentes molécules, éventuellement non-identifiées, avec une cellule recombinée selon la revendication 20 exprimant à sa surface un polypeptide tel que défini dans les revendications 1 à 7 ou avec une préparation membranaire d'une telle cellule, enprésence de glutamate, dans des conditions permettant l'interaction entre leditpolypeptide et le glutamate, et, - on détecte et/ou isole les molécules capables de moduler l'activité du glutamate sur ledit polypeptide.

25. Utilisation d'un ligand ou d'un modulateur identifié et/ou obtenu selon le procédé des revendications 22 à 24 comme médicament.

26. Médicament comprenant comme principe actif au moins une molécule agissant sur un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 7.

27. Médicament selon la revendication 26 caractérisé en ce que la molécule est un ligand identifié et/ou isolé selon le procédé des revendications 22 ou 23, ou un modulateur identifié et/ou isolé selon le procédé de la revendication 24.

28. Vecteur comprenant une séquence nucléotidique selon l'une des revendications 8 à 12.

29. Composition pharmaceutique comprenant un vecteur selon la revendication 28.