CA2146766A1 - Polypeptides ayant une activite de recepteur serotoninergique (5ht2c) et utilisations - Google Patents
Polypeptides ayant une activite de recepteur serotoninergique (5ht2c) et utilisationsInfo
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Abstract
La présente invention concerne de nouveaux polypeptides désignés 5HT2C ayant une activité de récepteur sérotoninergique, le matériel génétique permettant leur expression, toute cellule recombinante exprimant ces polypeptides, et leur utilisation.
Description
214~7~6 0 94/09130 P ~ /FR93/01012 POLYPEPTIDES AYANT UNE ACTIVITE DE RECEPTEUR SEROTONINERGIQUE
(5HT2C) ET UTILISATIONS
La présente invention c~n~rne de llouvea~ poly-peptides et le m~térie1 5 génétique permett~nt leur e~,e~ion. Plus particulièft;lllellL, elle con~rne de nouveaux polypeptides ayant une activité de réceptellr sén~ ergique.
La séroto~ e est un neuromod~ te--r capable d'induire et de mo~ .r une grande variété de comportement~ tels que le sommeil, l'appétit, la locomotion, l'activité sexuelle ou encore la colLl~a~:Lion v~ ire. Il est admis que l'activité de la o serotcl~ille est médiée par son interaction avec des réce~eu,~, M~i~n~$ ~i~c~eul~
sén,L~ninergiques ou récepLe~ 5-HT (pour 5-hy~l~oxylly~L~ e). Des études de biologie moléculaire ainsi que des études ph~rm~cologiques ont révélé qu'il existait un grand nombre de sous-ty-pes de réce~leul~ 5-HT. Les récel~le~ 5-HT qui ont été
décrits jusqu'à aujourd'hui apparti~nn~nt soit à la famille des réce~eu,~ liés à des 15 canaux ioniques (récep~ell.s 5-HT3), soit à la famille des réce~,le"~s qui int~r~gi.~ nt avec des protéines G et qui po~è~lent sept r1Qm~in~s l~n~ hranaires. Par ~illellrs, l'analyse des séquences d'acides aminés a montré que les réce~eu,~ 5-HT
inter~gi~s~nt avec des protéines G peuv~ être sous-divisés en deux ~ pes ~li.ctinct~: Les réce~le~ 5HTl comprenanl les sous-types -~ rel~s 5HTlA
20 5HTlB et 5HTlD ainsi que trois réc~leul~ 5HT de drosophile; et les récepteurs 5HT2 complenant les sous-types 5HT2 et 5HTlC.
Ces réce~leuL~ ne sont sans doute pas les seuls réceptellrs 5HT PY;~ I dans la mesure où des études pharmacologiques ont révélé d'autres sous-types tels que les réceptçllrs 5HT4 ainsi que certains réceple..l~i a~a~ s au sous-type 5HTl 25 (récepLeu ~ "5HTl like"). De plus des études supplç-..~nl~ s de biologie moléclll~ire ont eg~lPmPnt révélé des hétérog~n~it~ au sein des sous-types 5HTlB/lD.
Aujourd'hui au coll~ e des autres sous-types les réce~eul~ 5HT2 n'ont été que très peu et~ s. Les réce~eu~ 5HT2 ~gi~sçnt par l'int~rmécli~ire de la 30 ph~sph~lipase C et sont responsables de nombreuses activités physiologiques de la sé .~o~ e au niveau central et périphérique. Au niveau cardiova~ ire ils interviennent dans la contraction des v~i~seallx sanguins et dans les changements de morphologie des plaquettes; au niveau du système nerveux central ils ~gi~çnt sur la 21~0766 WO 94/09130 ` PCr/FR93/01012--~n~ibili~tion des neurones aux stimuli tactiles et sur la médiation des effets h~ çinogènes de l'acide diethylamide lysergique et des phénylisopropyl~min~s a~par~;nlées.
De nombreuses études montrent que les récepteurs 5HT2 décrits à ce jour ne 5 rendent pas compte de toutes les propriétés qui leur sont attribué~es. Not~mm~nt~
certains effets de type 5HT2 de la ~érotc,~ e sur les mll~çl~ lisses périphériques sont classés comme des effets atypiques, dont les effets seraient médiés par des réce~e~
inconnus.
La présente invention résulte de la mise en évidence de nouveaux 0 polypeptides ayant une activité de récepteur sé,~.to,~mergique. Bien qu'appa,lenant à
la famille des réce~ qui inter~gi~s~nt avec des protéines G, ces nouveaux polypeptides dirrèrellt des récepteurs sérotoninergiques déjà décrits (5HTl, 5HT2, 5HT3 et 5HT4) du point de vue structural comme du point de vue pharmacologique.
Plus particulièrement, l'invention résulte de l'isolement et de la caract~?ri~tion de ces 5 nollveau~c polypeptides, de~ign~s 5HT2C, ainsi que du m~teriel génétique pennPt~nt leur expression ou leur i~entifi~ati~n- L'étude pharmacologique de ces récepteurs montre qu'ils pourraient rendre compte des effets atypiques de la sérotonille observés antérieurement.
Un premier objet de l'invention réside donc dans des polypeptides 20 comp,e,1ant tout ou partie de la séquence peptidique SEQ ID n 2 ou d'un dérivé de celle-ci.
Au sens de la présente invention, le terme dérivé désigne toute molécule obtenue par modification de nature génétique et/ou chimique de la séquence peptidique SEQ ID n 2. Par mo~iific~tion de nature génétique et/ou chimique, on~5 peut entendre toute mllt~tion~ s~lbstihltion, ~1el~tionJ ad~lition et/ou morlific~tion d'un ou plusieurs résidus. De tels dérivés peuve,~t être générés dans des buts dirîé,el,~, tels que not~mm~nt celui d'~ugment~r l'affinité du peptide pour son(ses) ligand(s), celui d'améliorer ses niveaux de production, celui d'~l1gm~nt~r sa r~si~t~nçe à des protéases, celui d'augmenter et/ou de modifier son activité, ou celui de lui conférer de 30 nouvelles propriétés pharmacocinétiques etlou biologiques. Parmi les dérivés réslllt~nt d'une addition, on peut citer par exemple les polypeptides chimères comportant une partie hétérologue supplémentaire liée à une extrêmité. Le terme dérivé comprend également les polypeptides homologues au polypeptide SEQ ID
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WO 94/0913~ PCr/FR93/01012 n 2, issus d'autres sources cellulaires et notamment de cellules d'origine h11m~ine, ou d'autres organismes, et po~é~l~nt une activité de même type. De tels polypeptides homologues peuvent être obtenus par des eA~é~iences d'hybridation comme décrit dans les exemples. En particulier, l'~Yemr1e 5 décrit un dérivé selon l'invention (forme tronquée).
P.efél~ iP11ement les polypeptides de l'invention sont des polypeptides po.~séd~nt la c~pacité de lier la sén~loi~ine. Encore plus préfé.~ ie11ement il s'agit de polypeptides ayant une activité de récepteur séf~lol~illergique. Toujours selon un mode préféré, les polypeptides de l'invention sont s~ece~lihles d'être reconn11~ par des anticorps reconn~ nt la séquence peptidique SEQ ID n 2 comp1ete.
Un mode de ré~ tion particulier de l'invention est représenLé par le polypeptide 5HT2C comprellall~ toute la séquence peptidique SEQ ID n 2. Comme indiqué dans les exemples, ce polypeptide peut être e~rrimé dans difîélcn~ typesce11t-1~ires pour former un récepteur sé~oninergique fonctionnel. Ce polypeptidecolllp.cnd 479 acides ~minés, et possède un poids mcl1ecu1~ire calculé de 56 508Daltons.
Les polypeptides de l'invention petlvenL être obtenus par expression dans un hôte cellulaire d'une séquence nucléotidique telle que décrite ci-dessous, par synthèse chimique, sur la base de la séquence SEQ ID n 2 en utiti~ant les techniques c~-nn1~es de l'homme du métier, ou par une comhin~ on de ces techniques.
Dans ce qui suit, les polypeptides de l'invention tels que définis ci-dessus sont c1ésiEnés par polypeptides 5HT2C.
La présente invention a é~ m~.nt pour objet toute séquence nucléotidique codant pour un polypeptide 5HT2C. Plus ~ ;e11em~nt il s'agit d'une séquence choisie parmi:
(a) tout ou partie de la séquence nucléotidique SEQ ID n 1 ou de son brin comrlement~ire, (b) toute séquence hybridant avec une séquence (a) et codant pour un polypeptide tel que défini précédemment, et, (c) les séquences dérivées des séquences (a) et (b) en raison de la dégénérescence du code génétique.
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Les différentes séquences nucléotidiques de l'invention peuvent être d'origine artificielle ou non. Il peut s'agir de séquences génomiques, d'ADNc, d'ARN, de séquences hybrides ou de séquences synthétiques ou semi-synthétiques. Ces séquences peuvent être obtenues par exemple par criblage de banques d'ADN (banque 5 d'ADNc, banque d'ADN génomique) au moyen de sondes élaborées sur la base de laséquence SEQ ID n 1. De telles banques peuvent être préparées à partir de cellules de différentes origines par des techniques classiques de biologie moléculaire connues de l'homme du métier. Les séquences nucléotidiques de l'invention peuvent é~lement être préparées par synthèse chimique, not~mm~n~ selon la méthode des 10 phosphoramitlit~s, ou encore par des méthodes mixtes incluant la mc~lific~tion chimique ou enzymatiqe de séquences obtenues par criblage de banques.
Les séquences nucléotidiques de l'invention peuvent être l~t~ éPs pour la production des polypeptides 5HT2C tels que définis précé~emm~nt Dans ce cas, la partie codant pour ledit polypeptide est génér~lem-qnt placée sous le contrôle de 15 signaux permettant son expression dans un hôte c~ ire. Le choix de ces signaux (promoteurs, termin~tellrs~ etc) peut varier en fonction de l'hôte ce~ ire utilisé. A
cet effet, les séquences nl~cléoti~liques de l'invention peuvent faire partie d'un vecteur, qui peut être à réplication autonome ou inté~ratif. Plus particulièrement, des vecteurs à réplic~tion ~tltonome peuven~ être pl~:par~s en 1iltili~nt des séquences à réplication 20 ~lltonc)m~ chez l'hôte choisi. S'a~i~s~nt des vecteurs intégratifs, ceux-ci peuv~nl être pf~pa~es par exemple en l~tili.~nt des séquences homologues à certaines régions du génome de l'hôte, permett~nt, par recombinaison homologue, l'intégration du vecteur.
Les hôtes c~ ires utilisables pour la production des polypeptides 5HT2C de l'invention par voie recombinante sont aussi bien des hôtes eucaryotes que 25 procaryotes. Parmi les hôtes eucalyo~es qui convienn~nt on peut citer les c~ les ~nim~les, les levures, ou les champignons. En particulier, s~ nt de levures, on peut citer les levures du genre Saccharomyces, Kl~v~,,yces, Pichia, Schw~nniomyces, ou Hansenula. S'~gi~nt de cellules ~nim~les, on peut citer les cellules COS, CHO, C127, NIH-3T3, etc. Parmi les champignons, on peut citer plus30 particulièrement Aspergillus ssp. ou Trichoderma ssp. Comme hôtes procalyotes, on préfère utiliser les bactéries suivantes E.coli, Bacillus, ou Streptomyces.
Les séquences nucléotidiques de la présente invention sont également i~ hles dans le clom~ine pharmaceutique, soit pour la réalisation de séquences ~nti~n~ utilisables dans le cadre d'une thérapie génique, soit encore pour la ~VO 94/09131} PCr/FR93/01012 ré~ tion de sondes permettant la ~1étection~ par des expériences d'hybridation, de ~ A~e~ion de récepteurs se,oLoninergiques dans des e~h~ntil1Qn~ biologiques êt la mise en évidence d'anomalies génétiques ~polymorphisme, mllt~tion~) ou d'eA~ ~ions abe,~ es.
s L'inhihition de l'expression de certains gènes par des séquences ~nti~n~ s'est avérée être une stratégie prometteuse dans le contrôle de l'activité d'un gène. Les séquences antisens sont des séquences d'ADN codant pour des ARN complém~nt~ires et, de ce fait, c~r~hles d'hybrider spécifiquement avec un ARNm donné, inhih~nt sa tr~ tion en protéine. L'invention a ainsi pour objet les séquences antisens capables d'inhiber au moins partiellemçnt la procltlction de polypeptides 5HT2C tels que définis précé~ç~ De telles séquences peuvent être con~titUçes par tout ou partiedes séquences nucléotidiques ~l~finiçs ci-avant. Il s'agit généralement de séquences ou de fr~ment~ de séquences complem~ es de séquences codant pour des peptides de l'invention. De telles séquences peuvent être obtenues à partir de la séquence SEQ
ID n 1, par fr~gment~tion, etc, ou par synthèse chimique.
Comme indiqué ci-dessus, l'invention permet é~lçmçnt la ré~ tic-n de sondes nucléotidiques, synthétiques ou non, c~pahles de s'hydrider avec les séquences m-cleoti~liques ~l~finies ci-avant qui codent pour des polypeptides 5HT2C de vel~Lion, ou avec les ARNm correspon~l~nt De telles sondes peuvent être ~tili~s in vitro comme outil de rli~gnostic, pour la ~étection de l'expression d'un récep~
se,vlc,ninergique 5HT2C, ou encore pour la mise en évidence d'~nc-m~lie~ génétiques (mauvais épi~s~ge, polymorphisme, mllt~tion~ ponctt1~l1es, etc~. Compte tenu desactivités multiples de la sel-JLoi~ine, les sondes de l'invention pellvel-~ ainsi permettre d'identifier des affections neurologique, cardiovasculaire ou psy~hi~trique comme étant liées aux réce~Leu.~ 5HT2C. Ces sondes ~euv~l.L ég~lement être lutili~ees pour la mise en évidence et l'i~olçmçnt de séquences d'acides nucléiques homologues codant pour des polypeptides 5HT2C tels que définis précéc~.omment à partir d'autres sources c~ ires et pr~rér~ llçm~nt de cellules d'origines hl~m~in~, ainsi qu'illustré dans les exemples. Les sondes de l'invention comportent généralement au moins 10 bases, et elles peuvent co~llpolLer jusqu'à l'intégralité de la séquence SEQ ID n 1 ou de son brin complément~ire. P~ lltiellçment ces sondes sont, préalablement à leur tltili~atiQn, marquées. Pour cela, dir~érenles techniques connues de l'homme du métier peuvell~ être employées (marquage radioactif, enzymatique, etc). Les conditions 2146 ~66 WO 94/09130 PCr/FR93/01012--;; ~6 d'hybridation dans lesquelles ces sondes peuvent être lltili~ées sont indiquées dans les techniques générales de clonage ci-après ainsi que dans les exemples.
Un autre objet de l'invention con~rne les cellules recomhin~çs c~r~hle~
d'exprimer à leur surface un polypeptide 5HT2C tel que défini ci-avant. Ces cPllt~les l)ellvenL être obtenues par introduction d'une séquence nucléotidique telle que définie ci-dessus codant pour un polypeptide de l'invention, puis culture clç~Aitec C~-l]
dans des con~lition~ d'expression de ladite séquence.
Les cellules recombinées selon l'invention peuvent être aussi bien des cellules eucaryotes que procaryotes. Parmi les cellules eucaryotes qui convi~nn~nt~ on 0 peut citer les cellules ~nim~lçs, les levures, ou les champignons. En particulier, s'~ nt de levures, on peut citer les levures du genre Saccharomyces~
Kluyveromyces, Pichia, Schwanniomyces, ou Hansenula. S'~gi~s~nt de cellllles animales, on peut citer les cellules COS, CHO, C127, NIH-3T3, etc. Parmi les champignons, on peut citer plus particulièrement Aspergillus ssp. ou Trichodermassp. Comme cellules procalyoles, on préfère utiliser les bactéries suivantes E.coli, R~7C~ /c~ ou Streptomyces. Les cellules ainsi obtenues peuvent être lltili~ee~s pour mesurer la c~pacité de difrérentes mol~ctllçs à se comporter comme ligand ou comme mo~ teur de l'activité des polypeptides de l'invention. Plus particulière-"~l, elles peuvent ainsi être utili~é~?s dans un procédé de mise en évidence et d'isolement de ligands ou de m~ t~ r de l'activité des polypeptides de l'invention, et, plus p.~fé~llliellement, d'agonistes et d'antagonistes de la séro~o~ e.
Un autre objet de l'invention concerne donc un procédé de mise en évidence et/ou d'isolement de ligands des polypeptides 5HT2C de l'invention, selon lequel on réalise les étapes suivantes:
2s - on met en contact une molécule ou un mélange co--lçn~--l dirrélell~es molçclllç~ év~ntu~l1ement non-iclçntifiées~ avec une cellule recomhinee telle que décrite ci-dessus exprimant à sa surface un polypeptide de l'invention dans des conditions permettant l'interaction entre ledit polypeptide de l'invention et ladite molécule dans le cas où celle-ci possèderait une affinité pour ledit polypeptide, et, - on détecte et/ou isole les molécules liées au dit polypeptide de l'invention.
Dans tm mode particulier, ce procédé de l'invention est adapté à la mise en évidence et/ou l'isolement d'agonistes et d'antagonistes de la séroto"i,~e pour les polypeptides 5HT2C.
214676~ i ~0 94/09130 PCr/F~3/01012 Un autre objet de l'invention con-~.orne un procédé de mise en évidence etlou d'isolement de mocl~ tel~rs des polypeptides 5HT2C de l'invention, selon lequel on - réalise les étapes suivantes:
- on met en contact une molécule ou un mélange cont~n~nt différentes 5 molé~ules, éventuellement non-idçntifiçes, avec une cellule recombinée telle que décrite ci-dessus exprimant à sa surface un polypeptide de l'invention, en présence de SHT, dans des col lition~ pçrmett~nt l'interaction entre ledit polypeptide de l'invention et le 5HT, et, - on détecte et/ou isole les molécules capables de moduler l'activité du 5HT
lo sur ledit polypeptide de l'invention.
Un autre objet de l'invention confçrne l'utilisation d'un ligand ou d'un mod~ teur identifié et/ou obtenu selon le procédé décrit ci-avant comme mé~ ment. De tels ligands ou mofl~ te~lrs peuvent en effet permettre de traiter certaines affections neurologique, cardiova~clll~ire ou psy~hi~triflue liées aux15 réc~lç~ ; 5HT2C.
L'invention concçrne ég~lem~?nt tout médicament co,-,~enant comme principe actif au moins une molécule ~ nt sur un polypeptide 5HT2C de l'invention. Plt:ré~.,liellement la molécule est un ligand ou un mo ~ tel~r i~çntif;é
et/ou isolé selon le procédé décrit prec~ ?mmçnt D'autres avantages de la présente invention a~aîl,ont à la lecture des exçmplçs qui suivent, qui doivent êke considérés comme illuskatifs et non limit~tif.s.
Tf~ende des fi~ures Fi~ure 1: Courbe ~c~lcl-~.d des résultats des expériences de liaison à saturation du [125Il-DOI aux membranes des celll~lçs Cos-7 ~pf;n~ t le récepteur 5HT2C.
Figure 2: Mise en évidence de séquences homologues par PCR sur des ARN totaux (10 ,ug) de dirÇéL~n~ tissus de souris: ligne 1: ARN de la lignée cçll~ ire LMTK, ligne 2: ARN d'embryons de 10 jours, ligne 3: ARN de testicules, ligne 4: ARN dela lignée cellulaire 3T6, ligne 5: ARN de la lignée cellnl~ire MBK, ligne 6: ARN de foie, ligne 7: ARN de cerveau, ligne 8: ARN de coeur, ligne 9: ARN d'intç-stin~
ligne 10: ARN de rate, ligne 11: ARN de rein, ligne 12: ARN de cerveau total.
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WO 94/09130 PCr/FR93/01012--Table 1: Profil pharmacoiogique du récepteur 5HT2C entier (N) ou tronqué (T~. Les résultats correspondent à des expériences de com~LiLion pour la liaison du [l25I]-DOI aux membranes des cellules Cos-7 exprimant le récepteur 5HT2C. Les valeurs, exprimées en pKD (-log movl) sont le résultat d'au moins trois expériences separ~es, . 5 effectuées en triple.
Techniques ~énérales de clonage Les méthodes classiquement utili~ép~s en biologie moléculaire telles que les extractions pr~aldLiv~s d'ADN pl~miAique, la centrifugation d'ADN pl~miAique en gradient de chlorure de cPsil-m, l'électrophorèse sur gels d'agarose ou d'acrylamide, la 10 purification de fragments d'ADN par électroélution, les extractions de protéines au phénol ou au phénol-chloroforme, la précipitation d'ADN en milieu salin par de l'éthanol ou de l'isopiopanol, la transformation dans Escherichia coli, etc, sont bien connues de l'homme de métier et sont abonA~mPnt APrr1tPs dans la lille~l...e ~Maniatis T. et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor 15 Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Ausubel F.M. et al. (eds), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987].
Les enzymes de restriction, la transcriptase inverse AMV, l'ADN polyl~leLase I, la polynucléotide kinase T4, l'ADN ligase T4, et les ARN polymér~P~ T3 ou 17 ont été fournies par New F.ngl~nA Biolabs (Biolabs), Bethesda Research Labc~tnrip-s 20 (BRL), Boehringer-M~nnheim ou Stratagene et sont lltili~éPs selon les reco"~
dations des fournisseurs.
Pour les ligatures, les fr~gment~ d'ADN sont séparés selon leur taille par électrophorèse en gels d'agarose ou d'acrylamide, extraits au phénol ou par un mélange phénoVchloroforme, précipités à l'éthanol puis incubés en présence de 25 l'ADN ligase du phage T4 selon les rec~ mm~n~tions du fo l".;~
Le remplissage des e~k~emi~és 5' pr~éminPnte,s est effectué par le fr~gmPnt de Klenow de l'ADN Polymérase I d'E. coli selon les spécifications du fo~ el~r. La destruction des extrémités 3' proéminentPs est ef~ectuée en présence de l'ADN
Polymérase du phage T4 utilisée selon les recomm~ntl~tion~ du fabricant. La 30 destruction des extrémités 5' proéminentPs est effectuée par un tr~itemPnt ménagé par la nucléase S1.
La mutagénèse dirigée in vitro par oligodéoxynucléotides synthétiques est effectuée selon la méthode développée par Taylor et al. [Nucleic Acids Res. 13 (1985) 8749-8764].
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~,Vo 94/09130 PCr/FR93/01012 L'amplific~ti~n enzymatique de fr~gm~nt~ d'ADN par la technique dite de PCR [~olymérase-catalyzed Chain ~e~ction, Saiki R.K. et al., ~:ciPn~e ~Q (1985) 1350-1354; Mullis K.B. et Faloona F.A., Meth. Enzym. 155 (1987) 335-350] est effectuée en lltili~nt un "DNA thermal cycler" (Perkin Elmer Cetus) selon les . 5 spécific~tion~ du fabricant.
La v~rific~tion des séquences nucléotidiques est effectuée par la mPthoc développée par Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463-5467].
Pour les expériences d'hybri~tion, les con~itiQn~ de stringence norm~lP~s sont génér~lement les suiv~-Les: hybridation: 5 x SCC en présence de 5 x Denhart's à
65C; lavage: 0,5 x SSC à 65C.
1. Isolement du récepteur 5HT2C
Les comparaisons de séquences entre les dirrén~n~ réce~leu,~
sén~o~ ergiques connus font a~a~aîLre une certaine conservation. Dans le but de mettre en évidence et d'isoler un nouveau récepteur, trois oligonucléotides dégénérés 15 corr~spon~nt aux régions tr~n~meml~ranaires VI et VII ont été prepaf~s, puis utilisés dans une série de réactions de PCR sur une prepaldLion d'ADN génomique de souris.
La séquence des oligonl~clçoti(les dégénérés est la suiv~ e:
Oligonucléotide (i) TACCTCGAGGTCGACGGTIATGTGGTG(C,T)CCITT(C,T)TT(C,T)AT
20 Oligonucléotide (ii) AGAACTAGTGGTACCCA(G,A)IGT(G,A)TAIACIA(G,A)IGG(G,A)TT
Oligonucléotide (iii) AGAACTAGTGGTACCC(G,C) (A,T) (G,A)CAIAC(G,A)TAICC(G,A,T)ATCCA
Un multicitç de clonage a été ajouté à l'e~cL.~ é 5' des oili~nm~rléotides, 25 pour permettre le sous-clonage ultérieur du fragment amplifié. Les réactions de PCR
ont été ré~ éçs de la manière suivante: 1 ,ug d'ADN génomique de souris a été
dénaturé pendant 1 minute à 94C, m~int~ml 2 minutes à 55C, puis soumis à 20 cycles d'amplification à 72C en présence de 10 unités de polymérase Taq (Cetus), de MgCl2 3 mM, et de 1 ,ug de chacun des oligonucléotides (i) et (ii). 1/lOe du produit 30 de cette réaction a ensuite été soumis à 20 cycles d'amplification supplémentaires dans les mêmes conditions, en présence de 1 ,ug de chacun des oligonucléotides (i) et =
21~676~
W O 94/09130 PC~r/FR93/01012 -(iii). Les produits ainsi obtenus ont été digérés avec les enzymes SpeI et XhoI, insérés aux sites correspondant du pl~mi(le Bluesrript (Stratagène), et séquencés. L'un des fr~gm~nt~ ainsi obtenus, p-rSe~ l une certaine homologie avec les ré,ce~e~
sé,~lonillergiques 5HT2, a été synthéti~é in vitro et marqué à son e~Ll,tmilé 5' par la 5 polynucléotide kinase, puis utilisé comme sonde pour cribler une banque de cDNA de cerveau de souris. Un clone positif a été sélectionn~ Ce clone a été ~e~i~n~ NP75.
L'insert porté par le clone NP75 a été séquencé sur les 2 brins en ~lt~ nt la technique des dideoxynucléotides au moyen d'oligonucléotides synthétiques. L'analyse de laséquence obtenue révèle la présence d'une phase ouverte de lecture codant pour une 0 protéine de 479 acides aminés (SEQ ID nl et 2). Par ~ r~, l'analyse d'hy~phobicité montre que cette protéine porte sept rlom~inP~ hydrophobes, une particularité rencontrée chez les membres de la famille des réce~e~ couplés à des protéines G. L'e~LIen-i~é N-terminale ccntient par ailleurs 1 site potentiel de N-glycosylation, et le ~om~ine cytopl~mique présumé conti~nt les sites c~n~n~l~ de5 ~hosphc)rylation par les protéines kinases C et A. En outre, la présence de 19 résidus s~érine ou thréonine dans les 121 acides aminés C-~ n~lx semble indiquer que cette région est impliquée dans la ~l~s~n~ihili~tit-n du récepteur par les kin~,
(5HT2C) ET UTILISATIONS
La présente invention c~n~rne de llouvea~ poly-peptides et le m~térie1 5 génétique permett~nt leur e~,e~ion. Plus particulièft;lllellL, elle con~rne de nouveaux polypeptides ayant une activité de réceptellr sén~ ergique.
La séroto~ e est un neuromod~ te--r capable d'induire et de mo~ .r une grande variété de comportement~ tels que le sommeil, l'appétit, la locomotion, l'activité sexuelle ou encore la colLl~a~:Lion v~ ire. Il est admis que l'activité de la o serotcl~ille est médiée par son interaction avec des réce~eu,~, M~i~n~$ ~i~c~eul~
sén,L~ninergiques ou récepLe~ 5-HT (pour 5-hy~l~oxylly~L~ e). Des études de biologie moléculaire ainsi que des études ph~rm~cologiques ont révélé qu'il existait un grand nombre de sous-ty-pes de réce~leul~ 5-HT. Les récel~le~ 5-HT qui ont été
décrits jusqu'à aujourd'hui apparti~nn~nt soit à la famille des réce~eu,~ liés à des 15 canaux ioniques (récep~ell.s 5-HT3), soit à la famille des réce~,le"~s qui int~r~gi.~ nt avec des protéines G et qui po~è~lent sept r1Qm~in~s l~n~ hranaires. Par ~illellrs, l'analyse des séquences d'acides aminés a montré que les réce~eu,~ 5-HT
inter~gi~s~nt avec des protéines G peuv~ être sous-divisés en deux ~ pes ~li.ctinct~: Les réce~le~ 5HTl comprenanl les sous-types -~ rel~s 5HTlA
20 5HTlB et 5HTlD ainsi que trois réc~leul~ 5HT de drosophile; et les récepteurs 5HT2 complenant les sous-types 5HT2 et 5HTlC.
Ces réce~leuL~ ne sont sans doute pas les seuls réceptellrs 5HT PY;~ I dans la mesure où des études pharmacologiques ont révélé d'autres sous-types tels que les réceptçllrs 5HT4 ainsi que certains réceple..l~i a~a~ s au sous-type 5HTl 25 (récepLeu ~ "5HTl like"). De plus des études supplç-..~nl~ s de biologie moléclll~ire ont eg~lPmPnt révélé des hétérog~n~it~ au sein des sous-types 5HTlB/lD.
Aujourd'hui au coll~ e des autres sous-types les réce~eul~ 5HT2 n'ont été que très peu et~ s. Les réce~eu~ 5HT2 ~gi~sçnt par l'int~rmécli~ire de la 30 ph~sph~lipase C et sont responsables de nombreuses activités physiologiques de la sé .~o~ e au niveau central et périphérique. Au niveau cardiova~ ire ils interviennent dans la contraction des v~i~seallx sanguins et dans les changements de morphologie des plaquettes; au niveau du système nerveux central ils ~gi~çnt sur la 21~0766 WO 94/09130 ` PCr/FR93/01012--~n~ibili~tion des neurones aux stimuli tactiles et sur la médiation des effets h~ çinogènes de l'acide diethylamide lysergique et des phénylisopropyl~min~s a~par~;nlées.
De nombreuses études montrent que les récepteurs 5HT2 décrits à ce jour ne 5 rendent pas compte de toutes les propriétés qui leur sont attribué~es. Not~mm~nt~
certains effets de type 5HT2 de la ~érotc,~ e sur les mll~çl~ lisses périphériques sont classés comme des effets atypiques, dont les effets seraient médiés par des réce~e~
inconnus.
La présente invention résulte de la mise en évidence de nouveaux 0 polypeptides ayant une activité de récepteur sé,~.to,~mergique. Bien qu'appa,lenant à
la famille des réce~ qui inter~gi~s~nt avec des protéines G, ces nouveaux polypeptides dirrèrellt des récepteurs sérotoninergiques déjà décrits (5HTl, 5HT2, 5HT3 et 5HT4) du point de vue structural comme du point de vue pharmacologique.
Plus particulièrement, l'invention résulte de l'isolement et de la caract~?ri~tion de ces 5 nollveau~c polypeptides, de~ign~s 5HT2C, ainsi que du m~teriel génétique pennPt~nt leur expression ou leur i~entifi~ati~n- L'étude pharmacologique de ces récepteurs montre qu'ils pourraient rendre compte des effets atypiques de la sérotonille observés antérieurement.
Un premier objet de l'invention réside donc dans des polypeptides 20 comp,e,1ant tout ou partie de la séquence peptidique SEQ ID n 2 ou d'un dérivé de celle-ci.
Au sens de la présente invention, le terme dérivé désigne toute molécule obtenue par modification de nature génétique et/ou chimique de la séquence peptidique SEQ ID n 2. Par mo~iific~tion de nature génétique et/ou chimique, on~5 peut entendre toute mllt~tion~ s~lbstihltion, ~1el~tionJ ad~lition et/ou morlific~tion d'un ou plusieurs résidus. De tels dérivés peuve,~t être générés dans des buts dirîé,el,~, tels que not~mm~nt celui d'~ugment~r l'affinité du peptide pour son(ses) ligand(s), celui d'améliorer ses niveaux de production, celui d'~l1gm~nt~r sa r~si~t~nçe à des protéases, celui d'augmenter et/ou de modifier son activité, ou celui de lui conférer de 30 nouvelles propriétés pharmacocinétiques etlou biologiques. Parmi les dérivés réslllt~nt d'une addition, on peut citer par exemple les polypeptides chimères comportant une partie hétérologue supplémentaire liée à une extrêmité. Le terme dérivé comprend également les polypeptides homologues au polypeptide SEQ ID
21~75~
WO 94/0913~ PCr/FR93/01012 n 2, issus d'autres sources cellulaires et notamment de cellules d'origine h11m~ine, ou d'autres organismes, et po~é~l~nt une activité de même type. De tels polypeptides homologues peuvent être obtenus par des eA~é~iences d'hybridation comme décrit dans les exemples. En particulier, l'~Yemr1e 5 décrit un dérivé selon l'invention (forme tronquée).
P.efél~ iP11ement les polypeptides de l'invention sont des polypeptides po.~séd~nt la c~pacité de lier la sén~loi~ine. Encore plus préfé.~ ie11ement il s'agit de polypeptides ayant une activité de récepteur séf~lol~illergique. Toujours selon un mode préféré, les polypeptides de l'invention sont s~ece~lihles d'être reconn11~ par des anticorps reconn~ nt la séquence peptidique SEQ ID n 2 comp1ete.
Un mode de ré~ tion particulier de l'invention est représenLé par le polypeptide 5HT2C comprellall~ toute la séquence peptidique SEQ ID n 2. Comme indiqué dans les exemples, ce polypeptide peut être e~rrimé dans difîélcn~ typesce11t-1~ires pour former un récepteur sé~oninergique fonctionnel. Ce polypeptidecolllp.cnd 479 acides ~minés, et possède un poids mcl1ecu1~ire calculé de 56 508Daltons.
Les polypeptides de l'invention petlvenL être obtenus par expression dans un hôte cellulaire d'une séquence nucléotidique telle que décrite ci-dessous, par synthèse chimique, sur la base de la séquence SEQ ID n 2 en utiti~ant les techniques c~-nn1~es de l'homme du métier, ou par une comhin~ on de ces techniques.
Dans ce qui suit, les polypeptides de l'invention tels que définis ci-dessus sont c1ésiEnés par polypeptides 5HT2C.
La présente invention a é~ m~.nt pour objet toute séquence nucléotidique codant pour un polypeptide 5HT2C. Plus ~ ;e11em~nt il s'agit d'une séquence choisie parmi:
(a) tout ou partie de la séquence nucléotidique SEQ ID n 1 ou de son brin comrlement~ire, (b) toute séquence hybridant avec une séquence (a) et codant pour un polypeptide tel que défini précédemment, et, (c) les séquences dérivées des séquences (a) et (b) en raison de la dégénérescence du code génétique.
2146~6~
Les différentes séquences nucléotidiques de l'invention peuvent être d'origine artificielle ou non. Il peut s'agir de séquences génomiques, d'ADNc, d'ARN, de séquences hybrides ou de séquences synthétiques ou semi-synthétiques. Ces séquences peuvent être obtenues par exemple par criblage de banques d'ADN (banque 5 d'ADNc, banque d'ADN génomique) au moyen de sondes élaborées sur la base de laséquence SEQ ID n 1. De telles banques peuvent être préparées à partir de cellules de différentes origines par des techniques classiques de biologie moléculaire connues de l'homme du métier. Les séquences nucléotidiques de l'invention peuvent é~lement être préparées par synthèse chimique, not~mm~n~ selon la méthode des 10 phosphoramitlit~s, ou encore par des méthodes mixtes incluant la mc~lific~tion chimique ou enzymatiqe de séquences obtenues par criblage de banques.
Les séquences nucléotidiques de l'invention peuvent être l~t~ éPs pour la production des polypeptides 5HT2C tels que définis précé~emm~nt Dans ce cas, la partie codant pour ledit polypeptide est génér~lem-qnt placée sous le contrôle de 15 signaux permettant son expression dans un hôte c~ ire. Le choix de ces signaux (promoteurs, termin~tellrs~ etc) peut varier en fonction de l'hôte ce~ ire utilisé. A
cet effet, les séquences nl~cléoti~liques de l'invention peuvent faire partie d'un vecteur, qui peut être à réplication autonome ou inté~ratif. Plus particulièrement, des vecteurs à réplic~tion ~tltonome peuven~ être pl~:par~s en 1iltili~nt des séquences à réplication 20 ~lltonc)m~ chez l'hôte choisi. S'a~i~s~nt des vecteurs intégratifs, ceux-ci peuv~nl être pf~pa~es par exemple en l~tili.~nt des séquences homologues à certaines régions du génome de l'hôte, permett~nt, par recombinaison homologue, l'intégration du vecteur.
Les hôtes c~ ires utilisables pour la production des polypeptides 5HT2C de l'invention par voie recombinante sont aussi bien des hôtes eucaryotes que 25 procaryotes. Parmi les hôtes eucalyo~es qui convienn~nt on peut citer les c~ les ~nim~les, les levures, ou les champignons. En particulier, s~ nt de levures, on peut citer les levures du genre Saccharomyces, Kl~v~,,yces, Pichia, Schw~nniomyces, ou Hansenula. S'~gi~nt de cellules ~nim~les, on peut citer les cellules COS, CHO, C127, NIH-3T3, etc. Parmi les champignons, on peut citer plus30 particulièrement Aspergillus ssp. ou Trichoderma ssp. Comme hôtes procalyotes, on préfère utiliser les bactéries suivantes E.coli, Bacillus, ou Streptomyces.
Les séquences nucléotidiques de la présente invention sont également i~ hles dans le clom~ine pharmaceutique, soit pour la réalisation de séquences ~nti~n~ utilisables dans le cadre d'une thérapie génique, soit encore pour la ~VO 94/09131} PCr/FR93/01012 ré~ tion de sondes permettant la ~1étection~ par des expériences d'hybridation, de ~ A~e~ion de récepteurs se,oLoninergiques dans des e~h~ntil1Qn~ biologiques êt la mise en évidence d'anomalies génétiques ~polymorphisme, mllt~tion~) ou d'eA~ ~ions abe,~ es.
s L'inhihition de l'expression de certains gènes par des séquences ~nti~n~ s'est avérée être une stratégie prometteuse dans le contrôle de l'activité d'un gène. Les séquences antisens sont des séquences d'ADN codant pour des ARN complém~nt~ires et, de ce fait, c~r~hles d'hybrider spécifiquement avec un ARNm donné, inhih~nt sa tr~ tion en protéine. L'invention a ainsi pour objet les séquences antisens capables d'inhiber au moins partiellemçnt la procltlction de polypeptides 5HT2C tels que définis précé~ç~ De telles séquences peuvent être con~titUçes par tout ou partiedes séquences nucléotidiques ~l~finiçs ci-avant. Il s'agit généralement de séquences ou de fr~ment~ de séquences complem~ es de séquences codant pour des peptides de l'invention. De telles séquences peuvent être obtenues à partir de la séquence SEQ
ID n 1, par fr~gment~tion, etc, ou par synthèse chimique.
Comme indiqué ci-dessus, l'invention permet é~lçmçnt la ré~ tic-n de sondes nucléotidiques, synthétiques ou non, c~pahles de s'hydrider avec les séquences m-cleoti~liques ~l~finies ci-avant qui codent pour des polypeptides 5HT2C de vel~Lion, ou avec les ARNm correspon~l~nt De telles sondes peuvent être ~tili~s in vitro comme outil de rli~gnostic, pour la ~étection de l'expression d'un récep~
se,vlc,ninergique 5HT2C, ou encore pour la mise en évidence d'~nc-m~lie~ génétiques (mauvais épi~s~ge, polymorphisme, mllt~tion~ ponctt1~l1es, etc~. Compte tenu desactivités multiples de la sel-JLoi~ine, les sondes de l'invention pellvel-~ ainsi permettre d'identifier des affections neurologique, cardiovasculaire ou psy~hi~trique comme étant liées aux réce~Leu.~ 5HT2C. Ces sondes ~euv~l.L ég~lement être lutili~ees pour la mise en évidence et l'i~olçmçnt de séquences d'acides nucléiques homologues codant pour des polypeptides 5HT2C tels que définis précéc~.omment à partir d'autres sources c~ ires et pr~rér~ llçm~nt de cellules d'origines hl~m~in~, ainsi qu'illustré dans les exemples. Les sondes de l'invention comportent généralement au moins 10 bases, et elles peuvent co~llpolLer jusqu'à l'intégralité de la séquence SEQ ID n 1 ou de son brin complément~ire. P~ lltiellçment ces sondes sont, préalablement à leur tltili~atiQn, marquées. Pour cela, dir~érenles techniques connues de l'homme du métier peuvell~ être employées (marquage radioactif, enzymatique, etc). Les conditions 2146 ~66 WO 94/09130 PCr/FR93/01012--;; ~6 d'hybridation dans lesquelles ces sondes peuvent être lltili~ées sont indiquées dans les techniques générales de clonage ci-après ainsi que dans les exemples.
Un autre objet de l'invention con~rne les cellules recomhin~çs c~r~hle~
d'exprimer à leur surface un polypeptide 5HT2C tel que défini ci-avant. Ces cPllt~les l)ellvenL être obtenues par introduction d'une séquence nucléotidique telle que définie ci-dessus codant pour un polypeptide de l'invention, puis culture clç~Aitec C~-l]
dans des con~lition~ d'expression de ladite séquence.
Les cellules recombinées selon l'invention peuvent être aussi bien des cellules eucaryotes que procaryotes. Parmi les cellules eucaryotes qui convi~nn~nt~ on 0 peut citer les cellules ~nim~lçs, les levures, ou les champignons. En particulier, s'~ nt de levures, on peut citer les levures du genre Saccharomyces~
Kluyveromyces, Pichia, Schwanniomyces, ou Hansenula. S'~gi~s~nt de cellllles animales, on peut citer les cellules COS, CHO, C127, NIH-3T3, etc. Parmi les champignons, on peut citer plus particulièrement Aspergillus ssp. ou Trichodermassp. Comme cellules procalyoles, on préfère utiliser les bactéries suivantes E.coli, R~7C~ /c~ ou Streptomyces. Les cellules ainsi obtenues peuvent être lltili~ee~s pour mesurer la c~pacité de difrérentes mol~ctllçs à se comporter comme ligand ou comme mo~ teur de l'activité des polypeptides de l'invention. Plus particulière-"~l, elles peuvent ainsi être utili~é~?s dans un procédé de mise en évidence et d'isolement de ligands ou de m~ t~ r de l'activité des polypeptides de l'invention, et, plus p.~fé~llliellement, d'agonistes et d'antagonistes de la séro~o~ e.
Un autre objet de l'invention concerne donc un procédé de mise en évidence et/ou d'isolement de ligands des polypeptides 5HT2C de l'invention, selon lequel on réalise les étapes suivantes:
2s - on met en contact une molécule ou un mélange co--lçn~--l dirrélell~es molçclllç~ év~ntu~l1ement non-iclçntifiées~ avec une cellule recomhinee telle que décrite ci-dessus exprimant à sa surface un polypeptide de l'invention dans des conditions permettant l'interaction entre ledit polypeptide de l'invention et ladite molécule dans le cas où celle-ci possèderait une affinité pour ledit polypeptide, et, - on détecte et/ou isole les molécules liées au dit polypeptide de l'invention.
Dans tm mode particulier, ce procédé de l'invention est adapté à la mise en évidence et/ou l'isolement d'agonistes et d'antagonistes de la séroto"i,~e pour les polypeptides 5HT2C.
214676~ i ~0 94/09130 PCr/F~3/01012 Un autre objet de l'invention con-~.orne un procédé de mise en évidence etlou d'isolement de mocl~ tel~rs des polypeptides 5HT2C de l'invention, selon lequel on - réalise les étapes suivantes:
- on met en contact une molécule ou un mélange cont~n~nt différentes 5 molé~ules, éventuellement non-idçntifiçes, avec une cellule recombinée telle que décrite ci-dessus exprimant à sa surface un polypeptide de l'invention, en présence de SHT, dans des col lition~ pçrmett~nt l'interaction entre ledit polypeptide de l'invention et le 5HT, et, - on détecte et/ou isole les molécules capables de moduler l'activité du 5HT
lo sur ledit polypeptide de l'invention.
Un autre objet de l'invention confçrne l'utilisation d'un ligand ou d'un mod~ teur identifié et/ou obtenu selon le procédé décrit ci-avant comme mé~ ment. De tels ligands ou mofl~ te~lrs peuvent en effet permettre de traiter certaines affections neurologique, cardiova~clll~ire ou psy~hi~triflue liées aux15 réc~lç~ ; 5HT2C.
L'invention concçrne ég~lem~?nt tout médicament co,-,~enant comme principe actif au moins une molécule ~ nt sur un polypeptide 5HT2C de l'invention. Plt:ré~.,liellement la molécule est un ligand ou un mo ~ tel~r i~çntif;é
et/ou isolé selon le procédé décrit prec~ ?mmçnt D'autres avantages de la présente invention a~aîl,ont à la lecture des exçmplçs qui suivent, qui doivent êke considérés comme illuskatifs et non limit~tif.s.
Tf~ende des fi~ures Fi~ure 1: Courbe ~c~lcl-~.d des résultats des expériences de liaison à saturation du [125Il-DOI aux membranes des celll~lçs Cos-7 ~pf;n~ t le récepteur 5HT2C.
Figure 2: Mise en évidence de séquences homologues par PCR sur des ARN totaux (10 ,ug) de dirÇéL~n~ tissus de souris: ligne 1: ARN de la lignée cçll~ ire LMTK, ligne 2: ARN d'embryons de 10 jours, ligne 3: ARN de testicules, ligne 4: ARN dela lignée cellulaire 3T6, ligne 5: ARN de la lignée cellnl~ire MBK, ligne 6: ARN de foie, ligne 7: ARN de cerveau, ligne 8: ARN de coeur, ligne 9: ARN d'intç-stin~
ligne 10: ARN de rate, ligne 11: ARN de rein, ligne 12: ARN de cerveau total.
2i~67~
WO 94/09130 PCr/FR93/01012--Table 1: Profil pharmacoiogique du récepteur 5HT2C entier (N) ou tronqué (T~. Les résultats correspondent à des expériences de com~LiLion pour la liaison du [l25I]-DOI aux membranes des cellules Cos-7 exprimant le récepteur 5HT2C. Les valeurs, exprimées en pKD (-log movl) sont le résultat d'au moins trois expériences separ~es, . 5 effectuées en triple.
Techniques ~énérales de clonage Les méthodes classiquement utili~ép~s en biologie moléculaire telles que les extractions pr~aldLiv~s d'ADN pl~miAique, la centrifugation d'ADN pl~miAique en gradient de chlorure de cPsil-m, l'électrophorèse sur gels d'agarose ou d'acrylamide, la 10 purification de fragments d'ADN par électroélution, les extractions de protéines au phénol ou au phénol-chloroforme, la précipitation d'ADN en milieu salin par de l'éthanol ou de l'isopiopanol, la transformation dans Escherichia coli, etc, sont bien connues de l'homme de métier et sont abonA~mPnt APrr1tPs dans la lille~l...e ~Maniatis T. et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor 15 Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Ausubel F.M. et al. (eds), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987].
Les enzymes de restriction, la transcriptase inverse AMV, l'ADN polyl~leLase I, la polynucléotide kinase T4, l'ADN ligase T4, et les ARN polymér~P~ T3 ou 17 ont été fournies par New F.ngl~nA Biolabs (Biolabs), Bethesda Research Labc~tnrip-s 20 (BRL), Boehringer-M~nnheim ou Stratagene et sont lltili~éPs selon les reco"~
dations des fournisseurs.
Pour les ligatures, les fr~gment~ d'ADN sont séparés selon leur taille par électrophorèse en gels d'agarose ou d'acrylamide, extraits au phénol ou par un mélange phénoVchloroforme, précipités à l'éthanol puis incubés en présence de 25 l'ADN ligase du phage T4 selon les rec~ mm~n~tions du fo l".;~
Le remplissage des e~k~emi~és 5' pr~éminPnte,s est effectué par le fr~gmPnt de Klenow de l'ADN Polymérase I d'E. coli selon les spécifications du fo~ el~r. La destruction des extrémités 3' proéminentPs est ef~ectuée en présence de l'ADN
Polymérase du phage T4 utilisée selon les recomm~ntl~tion~ du fabricant. La 30 destruction des extrémités 5' proéminentPs est effectuée par un tr~itemPnt ménagé par la nucléase S1.
La mutagénèse dirigée in vitro par oligodéoxynucléotides synthétiques est effectuée selon la méthode développée par Taylor et al. [Nucleic Acids Res. 13 (1985) 8749-8764].
21~676~
~,Vo 94/09130 PCr/FR93/01012 L'amplific~ti~n enzymatique de fr~gm~nt~ d'ADN par la technique dite de PCR [~olymérase-catalyzed Chain ~e~ction, Saiki R.K. et al., ~:ciPn~e ~Q (1985) 1350-1354; Mullis K.B. et Faloona F.A., Meth. Enzym. 155 (1987) 335-350] est effectuée en lltili~nt un "DNA thermal cycler" (Perkin Elmer Cetus) selon les . 5 spécific~tion~ du fabricant.
La v~rific~tion des séquences nucléotidiques est effectuée par la mPthoc développée par Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463-5467].
Pour les expériences d'hybri~tion, les con~itiQn~ de stringence norm~lP~s sont génér~lement les suiv~-Les: hybridation: 5 x SCC en présence de 5 x Denhart's à
65C; lavage: 0,5 x SSC à 65C.
1. Isolement du récepteur 5HT2C
Les comparaisons de séquences entre les dirrén~n~ réce~leu,~
sén~o~ ergiques connus font a~a~aîLre une certaine conservation. Dans le but de mettre en évidence et d'isoler un nouveau récepteur, trois oligonucléotides dégénérés 15 corr~spon~nt aux régions tr~n~meml~ranaires VI et VII ont été prepaf~s, puis utilisés dans une série de réactions de PCR sur une prepaldLion d'ADN génomique de souris.
La séquence des oligonl~clçoti(les dégénérés est la suiv~ e:
Oligonucléotide (i) TACCTCGAGGTCGACGGTIATGTGGTG(C,T)CCITT(C,T)TT(C,T)AT
20 Oligonucléotide (ii) AGAACTAGTGGTACCCA(G,A)IGT(G,A)TAIACIA(G,A)IGG(G,A)TT
Oligonucléotide (iii) AGAACTAGTGGTACCC(G,C) (A,T) (G,A)CAIAC(G,A)TAICC(G,A,T)ATCCA
Un multicitç de clonage a été ajouté à l'e~cL.~ é 5' des oili~nm~rléotides, 25 pour permettre le sous-clonage ultérieur du fragment amplifié. Les réactions de PCR
ont été ré~ éçs de la manière suivante: 1 ,ug d'ADN génomique de souris a été
dénaturé pendant 1 minute à 94C, m~int~ml 2 minutes à 55C, puis soumis à 20 cycles d'amplification à 72C en présence de 10 unités de polymérase Taq (Cetus), de MgCl2 3 mM, et de 1 ,ug de chacun des oligonucléotides (i) et (ii). 1/lOe du produit 30 de cette réaction a ensuite été soumis à 20 cycles d'amplification supplémentaires dans les mêmes conditions, en présence de 1 ,ug de chacun des oligonucléotides (i) et =
21~676~
W O 94/09130 PC~r/FR93/01012 -(iii). Les produits ainsi obtenus ont été digérés avec les enzymes SpeI et XhoI, insérés aux sites correspondant du pl~mi(le Bluesrript (Stratagène), et séquencés. L'un des fr~gm~nt~ ainsi obtenus, p-rSe~ l une certaine homologie avec les ré,ce~e~
sé,~lonillergiques 5HT2, a été synthéti~é in vitro et marqué à son e~Ll,tmilé 5' par la 5 polynucléotide kinase, puis utilisé comme sonde pour cribler une banque de cDNA de cerveau de souris. Un clone positif a été sélectionn~ Ce clone a été ~e~i~n~ NP75.
L'insert porté par le clone NP75 a été séquencé sur les 2 brins en ~lt~ nt la technique des dideoxynucléotides au moyen d'oligonucléotides synthétiques. L'analyse de laséquence obtenue révèle la présence d'une phase ouverte de lecture codant pour une 0 protéine de 479 acides aminés (SEQ ID nl et 2). Par ~ r~, l'analyse d'hy~phobicité montre que cette protéine porte sept rlom~inP~ hydrophobes, une particularité rencontrée chez les membres de la famille des réce~e~ couplés à des protéines G. L'e~LIen-i~é N-terminale ccntient par ailleurs 1 site potentiel de N-glycosylation, et le ~om~ine cytopl~mique présumé conti~nt les sites c~n~n~l~ de5 ~hosphc)rylation par les protéines kinases C et A. En outre, la présence de 19 résidus s~érine ou thréonine dans les 121 acides aminés C-~ n~lx semble indiquer que cette région est impliquée dans la ~l~s~n~ihili~tit-n du récepteur par les kin~,
2. Ft~-le d'homologies de séquence La séquence du récepteur 5HT2C isolé ci-dessus a été c~ p~ee avec les 20 séquences des réce~leu,~ couplés à des protéines G suiv~: 5HTlA, 5HT1B, 5HTlC et 5HT2. Ces e~éliellces ont révélé une homologie dans les domaines transmembranaires I à VII avec les réc~~ 5HT1C et 5HT2, supérieure à
l'homologie rencontrée avec les réce~leu,~ 5HTlA et 5HTlB. Ces résultats suggèrent que les récepteurs de l'invention appartiennent au sous-type 5HT2. Ceci est d'ailleurs 25 en accord avec la présence de 2 introns dans le gène codant pour le récepteur 5HT2C
(non montrés sur la séquence).
l'homologie rencontrée avec les réce~leu,~ 5HTlA et 5HTlB. Ces résultats suggèrent que les récepteurs de l'invention appartiennent au sous-type 5HT2. Ceci est d'ailleurs 25 en accord avec la présence de 2 introns dans le gène codant pour le récepteur 5HT2C
(non montrés sur la séquence).
3. Expression du récepteur 5HT2C dans les cellules Cos-7 et cara~;lé~ ion pharmacologique Le fragment d'ADNc isolé dans l'exemple 1 a été inséré dans un vecteur 30 d'expression eucaryote, qui a été utilisé pour transfecter des cellules Cos-7. Les membranes des cellules transfectées obtenues ont ensuite été préparées et testées pour leur capacité à lier certains ligands sérotoninergiques marqués.
21~67~
WO 94/09130 PCr/FW3/01012 L'ADNc codant pour le récepteur 5HT2C a été isolé sous forme d'un fragment XbaI-EcoRI de 1372 pb, puis inséré aux sites correspon~nt.~ du vecteur p513. Le vecteur p513 dérive du vecteur pSG5 [Green et al., Nucl. Acids Res. 16 (1988) 369] par ~d~iitinn d'un multisite de clonage. Le vecteur recombinant ainsi 5obtenu, désigné p513NP75 a ensuite été utilisé (10 ~g par plaque de 10 cm) pourtransfecter les cellules Cos-7 en présence de phosph~te de c~ inm 48 heures après la transfection, les cellules recomhin~ntes sont récoltées et les membranes sont préparées selon la technique décrite par Amlaiky et Caron [J. Biol. Chem. ~Q (1985) 1983].
10Des expériences de liaison à saturation et de compétition ont ensuite été
ré~ ées sur ces membranes en présence de [125I]-DOI (2200 Ci/mmole; New Fngl~nd Nuclear) et de différents composés test.
Le [125I]-DOI (dimethoxyphenyl i~opro~ylamine) a tout d'abord été utilisé
seul, pour ~çtecter l'expression du gène codant pour les récepteurs de l'invention dans 15les membranes des cellules recombin~nte~. Pour cela, 100 ,ul de s.ls~nsion membranaire (50 ,ug/ml de protéines) ont été incubés 30 .-."~ çs à 30C en ~lesell~e du ligand radioactif (50 ,ul) et de 50 ,ul de tampon Tris-HCl 50 mM (pH 7,4), NaCl 150 mM, MgCl2 10 mM, volume final: 200 ,ul. La réaction est ensuite stopée par a~ ition d'une solution glacée iso-osmotique, puis par filkation sur filtres Wh~tm~n 20GF/B, suivie de 4 rinçages dans 5 ml du tampon ci-dessus glacé. Les filtres sont ensuite séchés et la ra~ioactivité est mesurée par comptage (co~ eu~ y). La liaison non-spécifique, déterminée en présence de 10 IlM de DOI froid, représ~nt~it environ 30~ de la laison totale.
Les résultats obtenus monkent que le DOI se lie spécifiquement aux 25membranes des cellules transfectées, et non aux membranes des cç~ les témoin (kansfectées avec le pl~mi-le pSG5). Ces cellules exrrim~nt donc bien un récepteur séroLol~ine fonctionnel. De plus, l'affinité du DOI pour les cellules transfectées est élevée et la liaison est saturable (figure 1). Le KD apparen~ est de 25,8 +/- 0,54 nM, et le Bmax appa,e,l~ varie entre 14,8 et 21,0 pmoVmg de protéine, selon l'efficacité de 30kansformation.
Pour déterminer le profil pharmacologique de ce récepteur, le [l25I]-DOI lié
aux membranes a été déplacé en présence de différentes drogues sérotoninergiques(table 1). Pour cela, les membranes cellulaires sont incubées dans les c~n~litir)ns décrites ci-dessus, avec, à la place des 50 ,ul de tampon, des concenkations 35croiss~ntPs des composés à tester. Ces différentes drogues monkent l'ordre 21~7~6 WO 94/09l30 Pcr/FR93/01012--d'efflcacité de dépl~ceme-~t suivant: ritansérine > N-acétyl 5-HT > me~,y~rgide >
se~opefone = cyproheptadine > spiperone > kétansérine > L~y~ mille > 5-HI > 8 OH-DPAT (table 1). La faible affinité (relative) de ce récepteur pour la séroLol~lne co~ ,e son app~ ~enance au sous-type 5HT2. De plus, l'~qhsence de compétition par les composés ICS 205-930, MDL 72222 et q~a;~ine, qui sont spécifiques des réce~Le~ 5HT3, écarte la possihilité que les réce~Le.l.s de l'invention apparti~nn~nt à
ce sous-type.
21~67~
WO 94/09130 PCr/FW3/01012 L'ADNc codant pour le récepteur 5HT2C a été isolé sous forme d'un fragment XbaI-EcoRI de 1372 pb, puis inséré aux sites correspon~nt.~ du vecteur p513. Le vecteur p513 dérive du vecteur pSG5 [Green et al., Nucl. Acids Res. 16 (1988) 369] par ~d~iitinn d'un multisite de clonage. Le vecteur recombinant ainsi 5obtenu, désigné p513NP75 a ensuite été utilisé (10 ~g par plaque de 10 cm) pourtransfecter les cellules Cos-7 en présence de phosph~te de c~ inm 48 heures après la transfection, les cellules recomhin~ntes sont récoltées et les membranes sont préparées selon la technique décrite par Amlaiky et Caron [J. Biol. Chem. ~Q (1985) 1983].
10Des expériences de liaison à saturation et de compétition ont ensuite été
ré~ ées sur ces membranes en présence de [125I]-DOI (2200 Ci/mmole; New Fngl~nd Nuclear) et de différents composés test.
Le [125I]-DOI (dimethoxyphenyl i~opro~ylamine) a tout d'abord été utilisé
seul, pour ~çtecter l'expression du gène codant pour les récepteurs de l'invention dans 15les membranes des cellules recombin~nte~. Pour cela, 100 ,ul de s.ls~nsion membranaire (50 ,ug/ml de protéines) ont été incubés 30 .-."~ çs à 30C en ~lesell~e du ligand radioactif (50 ,ul) et de 50 ,ul de tampon Tris-HCl 50 mM (pH 7,4), NaCl 150 mM, MgCl2 10 mM, volume final: 200 ,ul. La réaction est ensuite stopée par a~ ition d'une solution glacée iso-osmotique, puis par filkation sur filtres Wh~tm~n 20GF/B, suivie de 4 rinçages dans 5 ml du tampon ci-dessus glacé. Les filtres sont ensuite séchés et la ra~ioactivité est mesurée par comptage (co~ eu~ y). La liaison non-spécifique, déterminée en présence de 10 IlM de DOI froid, représ~nt~it environ 30~ de la laison totale.
Les résultats obtenus monkent que le DOI se lie spécifiquement aux 25membranes des cellules transfectées, et non aux membranes des cç~ les témoin (kansfectées avec le pl~mi-le pSG5). Ces cellules exrrim~nt donc bien un récepteur séroLol~ine fonctionnel. De plus, l'affinité du DOI pour les cellules transfectées est élevée et la liaison est saturable (figure 1). Le KD apparen~ est de 25,8 +/- 0,54 nM, et le Bmax appa,e,l~ varie entre 14,8 et 21,0 pmoVmg de protéine, selon l'efficacité de 30kansformation.
Pour déterminer le profil pharmacologique de ce récepteur, le [l25I]-DOI lié
aux membranes a été déplacé en présence de différentes drogues sérotoninergiques(table 1). Pour cela, les membranes cellulaires sont incubées dans les c~n~litir)ns décrites ci-dessus, avec, à la place des 50 ,ul de tampon, des concenkations 35croiss~ntPs des composés à tester. Ces différentes drogues monkent l'ordre 21~7~6 WO 94/09l30 Pcr/FR93/01012--d'efflcacité de dépl~ceme-~t suivant: ritansérine > N-acétyl 5-HT > me~,y~rgide >
se~opefone = cyproheptadine > spiperone > kétansérine > L~y~ mille > 5-HI > 8 OH-DPAT (table 1). La faible affinité (relative) de ce récepteur pour la séroLol~lne co~ ,e son app~ ~enance au sous-type 5HT2. De plus, l'~qhsence de compétition par les composés ICS 205-930, MDL 72222 et q~a;~ine, qui sont spécifiques des réce~Le~ 5HT3, écarte la possihilité que les réce~Le.l.s de l'invention apparti~nn~nt à
ce sous-type.
4. Recherche de séquences homologues dans d'autres tissus La séquence nucléotidique SEQ ID n 1 a ensuite été utilisée pour la mise en évidence de séquences homologues à partir d'autres tissus par PCR.
Les tissus utilisés pour la recherche de séquences homQlogues sont les suivants d'origine murine: in~stin, coeur, cerveau, rein, rate et foie.
Les sondes s~l-v~ es ont été lltilieées Sonde (iv): 5'-GATCCTGACTAACCGTTCTGGA-3' Sonde (v): 5'-TGCCTATTGAAATIAACCATACCA-3' La sonde (iv) correspond à la position 85 sur la SEQ ID n 1 et la sonde (v) à la position 547 (brin compl~m~nt~ire).
Les ARN totaux ont été pr~pares à partir des tissus indiqués ci-dessus selon la technique décrite par Cathala et al. (DNA i~g~ (1983). 10 ~g de ces ARN ont été
20 soumis à une transcription inverse en présence de 13 unités de ~ scLi~se inverse AMV, de 5 unités de polymérase Taq et de 1 ~g des sondes (iv) et (v), pendant 15minllt-~s à 50C, puis ~mplifiés (20, 25 et 30 cycles) (Ma,~ea~lx et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA ~9 (1992) 3020). Comme standard int~rn~, les amorces correspondant à l'ARNm du facteur d'elc-n~tic-n ribosomal EFlA on été l-tili~s, 25 dans les mêmes conditions que les sondes (iv) et (v).
Les produits ainsi obtenus ont ensuite été transférés sur filtres de nitro-cellulose et hybridés dans les conditions suivantes: La sonde utilisée pour l'hybridation avait la séquence suivante:
Sonde (vi): 5'-TGCCTGGTTATTCCTCGATGTTC-3' 30 correspondant à la position 398 sur la séquence SEQ ID n 1.
21467~6 ~'0 94/09130 PCI`/FR93/01012 L'hybridation a été réalisée dans des conditions de stringence élevées: 50C, dans un tampon phQsph~te de sodium 20 mM (pH 6,5) c~ ntenAnt 5 x SSC, 1 x Denhardt's, 0,1 ~o de SDS et 100 ~g/ml d'ARNt. Les lavages ont été effectués à 50C
dans un tampon 1 x SSC, 0,1 % SDS.
Cette étude a permis de mettre en évidence des fragments d'ADN spécifiques homologues dans l'i.~ , le coeur, les reins et le cerveau (figure 2).
Il est ent~ntll1 que les m8me expériences peuvent être répétées en l1tili.~nt d'autres tissus et not~mm~-nt des tissus d'origine hllmAine, d'autres sondes, et d'autres techniques (hybridation in situ; Northern blot, etc). Par ailleurs, les séquences homologues mises en évidence lors de ces expériences peuvent évidemment être ensuite isolées et~ou amplifiées par les techniques classiques de biologie moléculaire.
Les tissus utilisés pour la recherche de séquences homQlogues sont les suivants d'origine murine: in~stin, coeur, cerveau, rein, rate et foie.
Les sondes s~l-v~ es ont été lltilieées Sonde (iv): 5'-GATCCTGACTAACCGTTCTGGA-3' Sonde (v): 5'-TGCCTATTGAAATIAACCATACCA-3' La sonde (iv) correspond à la position 85 sur la SEQ ID n 1 et la sonde (v) à la position 547 (brin compl~m~nt~ire).
Les ARN totaux ont été pr~pares à partir des tissus indiqués ci-dessus selon la technique décrite par Cathala et al. (DNA i~g~ (1983). 10 ~g de ces ARN ont été
20 soumis à une transcription inverse en présence de 13 unités de ~ scLi~se inverse AMV, de 5 unités de polymérase Taq et de 1 ~g des sondes (iv) et (v), pendant 15minllt-~s à 50C, puis ~mplifiés (20, 25 et 30 cycles) (Ma,~ea~lx et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA ~9 (1992) 3020). Comme standard int~rn~, les amorces correspondant à l'ARNm du facteur d'elc-n~tic-n ribosomal EFlA on été l-tili~s, 25 dans les mêmes conditions que les sondes (iv) et (v).
Les produits ainsi obtenus ont ensuite été transférés sur filtres de nitro-cellulose et hybridés dans les conditions suivantes: La sonde utilisée pour l'hybridation avait la séquence suivante:
Sonde (vi): 5'-TGCCTGGTTATTCCTCGATGTTC-3' 30 correspondant à la position 398 sur la séquence SEQ ID n 1.
21467~6 ~'0 94/09130 PCI`/FR93/01012 L'hybridation a été réalisée dans des conditions de stringence élevées: 50C, dans un tampon phQsph~te de sodium 20 mM (pH 6,5) c~ ntenAnt 5 x SSC, 1 x Denhardt's, 0,1 ~o de SDS et 100 ~g/ml d'ARNt. Les lavages ont été effectués à 50C
dans un tampon 1 x SSC, 0,1 % SDS.
Cette étude a permis de mettre en évidence des fragments d'ADN spécifiques homologues dans l'i.~ , le coeur, les reins et le cerveau (figure 2).
Il est ent~ntll1 que les m8me expériences peuvent être répétées en l1tili.~nt d'autres tissus et not~mm~-nt des tissus d'origine hllmAine, d'autres sondes, et d'autres techniques (hybridation in situ; Northern blot, etc). Par ailleurs, les séquences homologues mises en évidence lors de ces expériences peuvent évidemment être ensuite isolées et~ou amplifiées par les techniques classiques de biologie moléculaire.
5. Isolement et caractérisation d'un réce~teur tron~ué SEQ ID n 2(1 177)-SEO ID n Au cours du clonage du cDNA codant pour le récepteur 5-HT2C (exemple 1), de nombreuses formes de mRNA tronqués ont été i(l~ntifiées. L'une d'entre elles, après cara.le~ ;on, s'avère coder pour un récepteur ne présPntAnt que les trois premiers domaines trans-meml.~ A;.~s [résidus 1 à 177 SEQ ID n 2, auxquels s'ajoutent les 14 acides aminés C-t~rmin~t1~ suivants: Ala Ser Pro Ser Gln Ser Leu Leu Lys Glu Ser Arg Leu Met (SEQ ID n 3)]. L'analyse de l'or~ni~Ati-)n de l'ADNgénomique montre que cet ARN provient de l'utilisation d'un dc)nne~lr alternatifd'épi~age à l'e~l,elnil~ de l'exon 2, con~ Ant à l'i~liminAtion des bases 550-568 de la séquence nucléique SEQ ID n 1. Ceci provoque un changement de phase et introduit un codon stop dans le RNA, pr~ nt une protéine tronquée après le troisième domaine trans-membranaire. Cette forme AlternAtive de mRNA, isolée en premier lieu à partir de RNA de cerveau, est exprimée dirÇérentiellement suivant les tissus. Le taux relatif d'expression du RNA tronqué par rapport au RNA complet est maximum dans le coeur de souris, où il représente plus de 50 %, alors qu'il n'est que de 15 %
dans l'intestin.
De manière in~tt~n~ e, l'analyse du profil pharmacologique de cette protéine tronquée par expression transitoire dans les cellules COS selon la méthodologie décrite dans l'exemple 3, montre que celle-ci lie la sei~ol~ine avec une affinité très voisine de celle observée pour le récepteur complet (Table 1). De plus son affinité
pour les agonistes demeure, bien que légèrement diminuée, alors que la liaison des ~14~G6 WO 94/09130 PCr/FR93/01012--antagonistes est complètement abolie, ainsi que la tr~n~cl~ction du signal intracellulaire. Le rôle physiologique de cette forme du récepteur reste inconnu, mais il semble probable qu'elle ser~e à protéger certaines cibles sensibles, telles que l'endothélium vasculaire, des stim~ tions nocives en "diluant" loc~lem~nt l'effet du 5 ligand, en l'occurrence la sérolonille.
Enfin, l'analyse plus précise, par hyhri~til n in situ, des sites d'expression du récepteur 5-HT2C au niveau du coeur de souris localise ceux-ci au niveau de l'endotheli1lm ~n(lcu ~rdial et vasculaire. Cette ~:~r~ion est aussi létec~ée au niveau de la couche interne (endoth~ lm) des ébal~ch~s cardiaques chez des embryons 10 précoces de souris (8,5 jours). ~a~h~nt que la sérolonille est impliquée dans les phénom~n~s de développement du système cardio-vasculaire chez l'embryon de poulet (Huether et al., Biog Amine 8 (1992) 421), il est possible que le récepteur 5-HT2C participe à ces phf nom~n~s De même, des observations récentes impliquent la ser~ol~ille dans la pathophysiologie des m~ coron~,;ennes: l'athérosclérose 15 corl~narienne hil."~ e est associée à une sensibilité accrue à la sé-oLon-lle de la contraction des artères con~llaires. Ce ph~nom~ne peut être atténué par la kPl~n~e. ;,-e, (Golino et al., New Engl. J. Med. 324 (1991) 641) et résulte de lésions de l'endothélium vasculaire où la sér~lo~ine est relarguée par les plaquettes. Il est ainsi probable que le réceptel-r 5-HT2C tronqué e~rrimé au niveau de l'endothélium 20 vasculaire participe à la ré~ll~ti-)n de l'effet de la sen~onille sur le système cardio-v~c~ ire autant au cours de sa dirÇér~i~r-i~tion que de sa dérégulation pathologique.
Par conséquent le développement de comros~s specifiques du récepteur 5-HT2C entier ou tronqué présente un intérêt thérapeutique dans certaines pa~hologies cardiaques hllm~in~s.
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Con~)osescellules COS NCOS T 5-HT2 5-HTlC
A~onistes N-Acétyl-5-HT 8.15 6.70 5.5 6.1 5-HT 5.90 5.93 5.5 7.5 2-Me-5-HT 5.18 < 4.0 5.2 5.8 Tl y~La,lline 6.70 4.84 6.0 7.2 1-ME-5-HT 5.60 4.22 6.3 8.4 NNdiMe-5-MeOT5.13 4.34 6.2 7.0 8-OH-DPAT 5.19 < 4.0 5.0 5.2 Quipazine5.18 4.85 6.2 6.7 ~i~mine < 4.0 < 4.0 < 4.0 < 4.0 Anta~onistes Ritanserine 8.44 < 4.0 9.3 8.6 MeLhy~ergide 7.90 < 4.0 8.6 8.6 Setoperone7.61 < 4.0 8.6 7.3 Cyproheptadine 7.65 < 4.0 8.5 7.9 Spiperone7.30 < 4.0 8.8 5.9 Ke~ se~ e6.69 < 4.0 8.9 7.0 ICS 205-9305.30 < 4.0 5.3 4.6 MDL 722224.62 < 4.0 6.7 < 5.0 Chlorpromazine < 4.0 < 4.0 < 4.0 < 4.0 21~6766 WO 94/09130 PCI~/FR93/01012--T.TST~ DE SEOU~N~
(1) INFORMATIoN ~.T~N~RAT.T':
, (i) DEPOSANT:
(A) NOM: INSERM
(B) RUE: 101 rue de Tolbiac (C) VILLE: PARIS
(E) PAYS: France (F) CODE POSTAL: 75654 (ii) TITRE DE L' INVENTION: NOUVEAUX POLY~l~l~ES AYANT UNE
ACTIVITE DE R~l~u~ SEROTONINERGIQUE, ACIDES NUCLEIQUES CODANT POUR
CES POLY~rl~ES ET UTILISATIONS.
(iii) NOMBRE DE SEQ OE NCES: 3 (iv) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Tape (B) ORDINATEUR: IBM PC compatible (C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.25 (OEB) (2) INFORMATION POUR T-~ S~O ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 1533 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: ]i n~A tre (ii) TYPE DE MOT~CUT~T~: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Souris (F) TYPE DE TISSUE: CERVEAU
(vii) SOUR OE IMMEDIATE:
(B) CLONE: NP75 (ix) CARACT~RT~TIQUE ADDITIONELLE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMpT~rFM~NT: 19..1458 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
Met Ala Ser Ser Tyr Lys Met Ser Glu Gln Ser Thr Thr Ser Glu His Ile Leu Gln Lys Thr Cys Asp His Leu Ile Leu Thr Asn Arg Ser Gly Leu Glu Thr Asp Ser Val Ala Glu Glu Met Lys 2~67~6 Gln Thr Val Glu Gly Gln Gly His Thr Val His Trp Ala Ala Leu Leu Ile Leu Ala Val Ile Ile Pro Thr Ile Gly Gly Asn Ile Leu Val Ile Leu Ala Val Ala Leu Glu Lys Arg Leu Gln Tyr Ala Thr Asn Tyr Phe Leu Met Ser Leu Ala Ile Ala Asp Leu Leu Val Gly Leu Phe Val Met Pro Ile Ala Leu Leu Thr Ile Met Phe Glu Ala Ile Trp Pro Leu Pro Leu Ala Leu Cys Pro Ala Trp Leu Phe Leu Asp Val Leu Phe Ser Thr Ala Ser Ile Met His Leu Cys Ala Ile Ser ~eu Asp Arg Tyr Ile Ala Ile Lys Lys Pro Ile Gln Ala Asn Gln Cys Asn Thr Arg Ala Thr Ala Phe Ile Lys Ile Thr Val Val Trp Leu Ile Ser Ile Gly Ile Ala Ile Pro Val Pro Ile Lys Gly Ile Glu Thr Asp Val Ile Asn Pro His Asn Val Thr Cys Glu Leu Thr Lys Asp Arg Phe Gly Ser Phe Met Val Phe Gly Ser Leu Ala Ala Phe Phe Val Pro Leu Thr Ile Met Val Val Thr Tyr Phe Leu Thr Ile His Thr Leu Gln Lys Lys Ala Tyr Leu Val Lys Asn Lys Pro Pro Gln Arg Leu Thr Arg Trp Thr Val Pro Thr Val Phe Leu Arg Glu Asp Ser Ser Phe Ser Ser Pro Glu Lys Val Ala Met Leu Asp Gly Ser His Arg Asp Lys Ile Leu Pro Asn Ser Ser Asp Glu Thr 21467~6 WO 94/09130 PCI'/FR93/01012--Leu Met Arg Arg Met Ser Ser Val Gly Lys Arg Ser Ala Gln Thr Ile Ser Asn Glu Gln Arg Ala Ser Lys Ala L'eu Gly Val Val Phe Phe Leu io TTT CTG CTT ATG TGG TGC CCC TTT TTT ATT ACA AAT CTA ACT TTA GCT 1059 Phe Leu Leu Met Trp Cys Pro Phe Phe Ile Thr Asn Leu Thr Leu Ala Leu Cys Asp Ser Cys Asn Gln Thr Thr Leu Lys Thr Leu Leu Glu Ile Phe Val Trp Ile Gly Tyr Val Ser Ser Gly Val Asn Pro Leu Ile Tyr Thr Leu Phe Asn Lys Thr Phe Arg Glu Ala Phe Gly Arg Tyr Ile Thr Cys Asn Tyr Arg Ala Thr Lys Ser Val Lys Ala Leu Arg Lys Phe Ser Ser Thr Leu Cys Phe Gly Asn Ser Met Val Glu Asn Ser Lys Phe Phe Thr Lys His Gly Ile Arg Asn Gly Ile Asn Pro Ala Met Tyr Gln Ser Pro Met Arg Leu Arg Cys Ser Thr Ile Gln Ser Ser Ser Ile Ile Leu Leu Asp Thr Leu Leu Thr Glu Asn Asp Gly Asp Lys Ala Glu Glu Gln Val Ser Tyr Ile (2) INFORMATION POUR T.~ S~O ID NO: 2:
~i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 479 acides aminés ~B) TYPE: acide aminé
~D) CONFIGURATION: 1 in~ire ~ii) TYPE DE MOLECULE: protéine (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:
Met Ala Ser Ser Tyr Lys Met Ser Glu Gln Ser Thr Thr Ser Glu His 21~67~
~0 94/09130 PC~r/FR93/01012 Ile Leu Gln Lys Thr Cys Asp His Leu Ile Leu Thr Asn Arg Ser Gly - Leu Glu Thr Asp Ser Val Ala Glu Glu Met Lys Gln Thr Val Glu Gly Gln Gly His Thr Val His Trp Ala Ala Leu Leu Ile Leu Ala Val Ile Ile Pro Thr Ile Gly Gly Asn Ile Leu Val Ile Leu Ala Val Ala Leu 15 Glu Lys Arg Leu Gln Tyr Ala Thr Asn Tyr Phe Leu Met Ser Leu Ala Ile Ala Asp Leu Leu Val Gly Leu Phe Val Met Pro Ile Ala Leu Leu Thr Ile Met Phe Glu Ala Ile Trp Pro Leu Pro Leu Ala Leu Cys Pro Ala Trp Leu Phe Leu Asp Val Leu Phe Ser Thr Ala Ser Ile Met His Leu Cys Ala Ile Ser Leu Asp Arg Tyr Ile Ala Ile Lys Lys Pro Ile 30 Gln Ala Asn Gln Cys Asn Thr Arg Ala Thr Ala Phe Ile Lys Ile Thr Val Val Trp Leu Ile Ser Ile Gly Ile Ala Ile Pro Val Pro Ile Lys Gly Ile Glu Thr Asp Val Ile Asn Pro His Asn Val Thr Cys Glu Leu Thr Lys Asp Arg Phe Gly Ser Phe Met Val Phe Gly Ser Leu Ala Ala Phe Phe Val Pro Leu Thr Ile Met Val Val Thr Tyr Phe Leu Thr Ile 45 His Thr Leu Gln Lys Lys Ala Tyr Leu Val Lys Asn Lys Pro Pro Gln Arg Leu Thr Arg Trp Thr Val Pro Thr Val Phe Leu Arg Glu Asp Ser Ser Phe Ser Ser Pro Glu Lys Val Ala Met Leu Asp Gly Ser His Arg Asp Lys Ile Leu Pro Asn Ser Ser Asp Glu Thr Leu Met Arg Arg Met Ser Ser Val Gly Lys Arg Ser Ala Gln Thr Ile Ser Asn Glu Gln Arg 60 Ala Ser Lys Ala Leu Gly Val Val Phe Phe Leu Phe Leu Leu Met Trp Cys Pro Phe Phe Ile Thr Asn Leu Thr Leu Ala Leu Cys Asp Ser Cys 21~67g~
WO 94/09130 P~/FR93/01012 -Asn Gln Thr Thr Leu Lys Thr Leu Leu Glu Ile Phe Val Trp Ile Gly Tyr Val Ser Ser Gly Val Asn Pro Leu Ile Tyr Thr Leu Phe Asn Lys Thr Phe Arg Glu Ala Phe Gly Arg Tyr Ile Thr Cys Asn Tyr Arg Ala Thr Lys Ser Val Lys Ala Leu Arg Lys Phe Ser Ser Thr Leu Cys Phe Gly Asn Ser Met Val Glu Asn Ser Lys Phe Phe Thr Lys His Gly Ile Arg Asn Gly Ile Asn Pro Ala Met Tyr Gln Ser Pro Met Arg Leu Arg 43s 440 445 Cys Ser Thr Ile Gln Ser Ser Ser Ile Ile Leu Leu Asp Thr Leu Leu Thr Glu Asn Asp Gly Asp Lys Ala Glu Glu Gln Val Ser Tyr Ile (2) INFORMATION POUR T.~ S~O In NO: 3:
( i ) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 14 acides aminés (B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: proteine (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:
Ala Ser Pro Ser Gln Ser Leu Leu Lys Glu Ser Arg Leu Met
dans l'intestin.
De manière in~tt~n~ e, l'analyse du profil pharmacologique de cette protéine tronquée par expression transitoire dans les cellules COS selon la méthodologie décrite dans l'exemple 3, montre que celle-ci lie la sei~ol~ine avec une affinité très voisine de celle observée pour le récepteur complet (Table 1). De plus son affinité
pour les agonistes demeure, bien que légèrement diminuée, alors que la liaison des ~14~G6 WO 94/09130 PCr/FR93/01012--antagonistes est complètement abolie, ainsi que la tr~n~cl~ction du signal intracellulaire. Le rôle physiologique de cette forme du récepteur reste inconnu, mais il semble probable qu'elle ser~e à protéger certaines cibles sensibles, telles que l'endothélium vasculaire, des stim~ tions nocives en "diluant" loc~lem~nt l'effet du 5 ligand, en l'occurrence la sérolonille.
Enfin, l'analyse plus précise, par hyhri~til n in situ, des sites d'expression du récepteur 5-HT2C au niveau du coeur de souris localise ceux-ci au niveau de l'endotheli1lm ~n(lcu ~rdial et vasculaire. Cette ~:~r~ion est aussi létec~ée au niveau de la couche interne (endoth~ lm) des ébal~ch~s cardiaques chez des embryons 10 précoces de souris (8,5 jours). ~a~h~nt que la sérolonille est impliquée dans les phénom~n~s de développement du système cardio-vasculaire chez l'embryon de poulet (Huether et al., Biog Amine 8 (1992) 421), il est possible que le récepteur 5-HT2C participe à ces phf nom~n~s De même, des observations récentes impliquent la ser~ol~ille dans la pathophysiologie des m~ coron~,;ennes: l'athérosclérose 15 corl~narienne hil."~ e est associée à une sensibilité accrue à la sé-oLon-lle de la contraction des artères con~llaires. Ce ph~nom~ne peut être atténué par la kPl~n~e. ;,-e, (Golino et al., New Engl. J. Med. 324 (1991) 641) et résulte de lésions de l'endothélium vasculaire où la sér~lo~ine est relarguée par les plaquettes. Il est ainsi probable que le réceptel-r 5-HT2C tronqué e~rrimé au niveau de l'endothélium 20 vasculaire participe à la ré~ll~ti-)n de l'effet de la sen~onille sur le système cardio-v~c~ ire autant au cours de sa dirÇér~i~r-i~tion que de sa dérégulation pathologique.
Par conséquent le développement de comros~s specifiques du récepteur 5-HT2C entier ou tronqué présente un intérêt thérapeutique dans certaines pa~hologies cardiaques hllm~in~s.
21~fi76~
Con~)osescellules COS NCOS T 5-HT2 5-HTlC
A~onistes N-Acétyl-5-HT 8.15 6.70 5.5 6.1 5-HT 5.90 5.93 5.5 7.5 2-Me-5-HT 5.18 < 4.0 5.2 5.8 Tl y~La,lline 6.70 4.84 6.0 7.2 1-ME-5-HT 5.60 4.22 6.3 8.4 NNdiMe-5-MeOT5.13 4.34 6.2 7.0 8-OH-DPAT 5.19 < 4.0 5.0 5.2 Quipazine5.18 4.85 6.2 6.7 ~i~mine < 4.0 < 4.0 < 4.0 < 4.0 Anta~onistes Ritanserine 8.44 < 4.0 9.3 8.6 MeLhy~ergide 7.90 < 4.0 8.6 8.6 Setoperone7.61 < 4.0 8.6 7.3 Cyproheptadine 7.65 < 4.0 8.5 7.9 Spiperone7.30 < 4.0 8.8 5.9 Ke~ se~ e6.69 < 4.0 8.9 7.0 ICS 205-9305.30 < 4.0 5.3 4.6 MDL 722224.62 < 4.0 6.7 < 5.0 Chlorpromazine < 4.0 < 4.0 < 4.0 < 4.0 21~6766 WO 94/09130 PCI~/FR93/01012--T.TST~ DE SEOU~N~
(1) INFORMATIoN ~.T~N~RAT.T':
, (i) DEPOSANT:
(A) NOM: INSERM
(B) RUE: 101 rue de Tolbiac (C) VILLE: PARIS
(E) PAYS: France (F) CODE POSTAL: 75654 (ii) TITRE DE L' INVENTION: NOUVEAUX POLY~l~l~ES AYANT UNE
ACTIVITE DE R~l~u~ SEROTONINERGIQUE, ACIDES NUCLEIQUES CODANT POUR
CES POLY~rl~ES ET UTILISATIONS.
(iii) NOMBRE DE SEQ OE NCES: 3 (iv) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Tape (B) ORDINATEUR: IBM PC compatible (C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.25 (OEB) (2) INFORMATION POUR T-~ S~O ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 1533 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: ]i n~A tre (ii) TYPE DE MOT~CUT~T~: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Souris (F) TYPE DE TISSUE: CERVEAU
(vii) SOUR OE IMMEDIATE:
(B) CLONE: NP75 (ix) CARACT~RT~TIQUE ADDITIONELLE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMpT~rFM~NT: 19..1458 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
Met Ala Ser Ser Tyr Lys Met Ser Glu Gln Ser Thr Thr Ser Glu His Ile Leu Gln Lys Thr Cys Asp His Leu Ile Leu Thr Asn Arg Ser Gly Leu Glu Thr Asp Ser Val Ala Glu Glu Met Lys 2~67~6 Gln Thr Val Glu Gly Gln Gly His Thr Val His Trp Ala Ala Leu Leu Ile Leu Ala Val Ile Ile Pro Thr Ile Gly Gly Asn Ile Leu Val Ile Leu Ala Val Ala Leu Glu Lys Arg Leu Gln Tyr Ala Thr Asn Tyr Phe Leu Met Ser Leu Ala Ile Ala Asp Leu Leu Val Gly Leu Phe Val Met Pro Ile Ala Leu Leu Thr Ile Met Phe Glu Ala Ile Trp Pro Leu Pro Leu Ala Leu Cys Pro Ala Trp Leu Phe Leu Asp Val Leu Phe Ser Thr Ala Ser Ile Met His Leu Cys Ala Ile Ser ~eu Asp Arg Tyr Ile Ala Ile Lys Lys Pro Ile Gln Ala Asn Gln Cys Asn Thr Arg Ala Thr Ala Phe Ile Lys Ile Thr Val Val Trp Leu Ile Ser Ile Gly Ile Ala Ile Pro Val Pro Ile Lys Gly Ile Glu Thr Asp Val Ile Asn Pro His Asn Val Thr Cys Glu Leu Thr Lys Asp Arg Phe Gly Ser Phe Met Val Phe Gly Ser Leu Ala Ala Phe Phe Val Pro Leu Thr Ile Met Val Val Thr Tyr Phe Leu Thr Ile His Thr Leu Gln Lys Lys Ala Tyr Leu Val Lys Asn Lys Pro Pro Gln Arg Leu Thr Arg Trp Thr Val Pro Thr Val Phe Leu Arg Glu Asp Ser Ser Phe Ser Ser Pro Glu Lys Val Ala Met Leu Asp Gly Ser His Arg Asp Lys Ile Leu Pro Asn Ser Ser Asp Glu Thr 21467~6 WO 94/09130 PCI'/FR93/01012--Leu Met Arg Arg Met Ser Ser Val Gly Lys Arg Ser Ala Gln Thr Ile Ser Asn Glu Gln Arg Ala Ser Lys Ala L'eu Gly Val Val Phe Phe Leu io TTT CTG CTT ATG TGG TGC CCC TTT TTT ATT ACA AAT CTA ACT TTA GCT 1059 Phe Leu Leu Met Trp Cys Pro Phe Phe Ile Thr Asn Leu Thr Leu Ala Leu Cys Asp Ser Cys Asn Gln Thr Thr Leu Lys Thr Leu Leu Glu Ile Phe Val Trp Ile Gly Tyr Val Ser Ser Gly Val Asn Pro Leu Ile Tyr Thr Leu Phe Asn Lys Thr Phe Arg Glu Ala Phe Gly Arg Tyr Ile Thr Cys Asn Tyr Arg Ala Thr Lys Ser Val Lys Ala Leu Arg Lys Phe Ser Ser Thr Leu Cys Phe Gly Asn Ser Met Val Glu Asn Ser Lys Phe Phe Thr Lys His Gly Ile Arg Asn Gly Ile Asn Pro Ala Met Tyr Gln Ser Pro Met Arg Leu Arg Cys Ser Thr Ile Gln Ser Ser Ser Ile Ile Leu Leu Asp Thr Leu Leu Thr Glu Asn Asp Gly Asp Lys Ala Glu Glu Gln Val Ser Tyr Ile (2) INFORMATION POUR T.~ S~O ID NO: 2:
~i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 479 acides aminés ~B) TYPE: acide aminé
~D) CONFIGURATION: 1 in~ire ~ii) TYPE DE MOLECULE: protéine (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:
Met Ala Ser Ser Tyr Lys Met Ser Glu Gln Ser Thr Thr Ser Glu His 21~67~
~0 94/09130 PC~r/FR93/01012 Ile Leu Gln Lys Thr Cys Asp His Leu Ile Leu Thr Asn Arg Ser Gly - Leu Glu Thr Asp Ser Val Ala Glu Glu Met Lys Gln Thr Val Glu Gly Gln Gly His Thr Val His Trp Ala Ala Leu Leu Ile Leu Ala Val Ile Ile Pro Thr Ile Gly Gly Asn Ile Leu Val Ile Leu Ala Val Ala Leu 15 Glu Lys Arg Leu Gln Tyr Ala Thr Asn Tyr Phe Leu Met Ser Leu Ala Ile Ala Asp Leu Leu Val Gly Leu Phe Val Met Pro Ile Ala Leu Leu Thr Ile Met Phe Glu Ala Ile Trp Pro Leu Pro Leu Ala Leu Cys Pro Ala Trp Leu Phe Leu Asp Val Leu Phe Ser Thr Ala Ser Ile Met His Leu Cys Ala Ile Ser Leu Asp Arg Tyr Ile Ala Ile Lys Lys Pro Ile 30 Gln Ala Asn Gln Cys Asn Thr Arg Ala Thr Ala Phe Ile Lys Ile Thr Val Val Trp Leu Ile Ser Ile Gly Ile Ala Ile Pro Val Pro Ile Lys Gly Ile Glu Thr Asp Val Ile Asn Pro His Asn Val Thr Cys Glu Leu Thr Lys Asp Arg Phe Gly Ser Phe Met Val Phe Gly Ser Leu Ala Ala Phe Phe Val Pro Leu Thr Ile Met Val Val Thr Tyr Phe Leu Thr Ile 45 His Thr Leu Gln Lys Lys Ala Tyr Leu Val Lys Asn Lys Pro Pro Gln Arg Leu Thr Arg Trp Thr Val Pro Thr Val Phe Leu Arg Glu Asp Ser Ser Phe Ser Ser Pro Glu Lys Val Ala Met Leu Asp Gly Ser His Arg Asp Lys Ile Leu Pro Asn Ser Ser Asp Glu Thr Leu Met Arg Arg Met Ser Ser Val Gly Lys Arg Ser Ala Gln Thr Ile Ser Asn Glu Gln Arg 60 Ala Ser Lys Ala Leu Gly Val Val Phe Phe Leu Phe Leu Leu Met Trp Cys Pro Phe Phe Ile Thr Asn Leu Thr Leu Ala Leu Cys Asp Ser Cys 21~67g~
WO 94/09130 P~/FR93/01012 -Asn Gln Thr Thr Leu Lys Thr Leu Leu Glu Ile Phe Val Trp Ile Gly Tyr Val Ser Ser Gly Val Asn Pro Leu Ile Tyr Thr Leu Phe Asn Lys Thr Phe Arg Glu Ala Phe Gly Arg Tyr Ile Thr Cys Asn Tyr Arg Ala Thr Lys Ser Val Lys Ala Leu Arg Lys Phe Ser Ser Thr Leu Cys Phe Gly Asn Ser Met Val Glu Asn Ser Lys Phe Phe Thr Lys His Gly Ile Arg Asn Gly Ile Asn Pro Ala Met Tyr Gln Ser Pro Met Arg Leu Arg 43s 440 445 Cys Ser Thr Ile Gln Ser Ser Ser Ile Ile Leu Leu Asp Thr Leu Leu Thr Glu Asn Asp Gly Asp Lys Ala Glu Glu Gln Val Ser Tyr Ile (2) INFORMATION POUR T.~ S~O In NO: 3:
( i ) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 14 acides aminés (B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: proteine (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:
Ala Ser Pro Ser Gln Ser Leu Leu Lys Glu Ser Arg Leu Met
Claims (25)
1. Polypeptide comprenant tout ou partie de la séquence SEQ ID n° 2.
2. Polypeptide selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il possède la capacité de lier la sérotonine.
3. Polypeptide selon la revendication 2 caractérisé en ce qu'il possède une activité de récepteur sérotoninergique.
4. Polypeptide selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisé en ce qu'il peut être reconnu par des anticorps reconnaissant la séquence SEQ ID n° 2 complète.
5. Polypeptide selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisé en ce qu'il comprend toute la séquence peptidique SEQ ID n° 2 ou le polypeptide SEQ ID n°
2(1-177)-SEQ ID n° 3.
2(1-177)-SEQ ID n° 3.
6. Séquence nucléotidique codant pour un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 5.
7. Séquence selon la revendication 6 caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi:
(a) tout ou partie de la séquence nucléotidique SEQ ID n° 1 ou de son brin complémentaire, (b) toute séquence hybridant avec une séquence (a) et codant pour un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 5, et, (c) les séquences dérivées des séquences (a) et (b) en raison de la dégénérescence du code génétique.
(a) tout ou partie de la séquence nucléotidique SEQ ID n° 1 ou de son brin complémentaire, (b) toute séquence hybridant avec une séquence (a) et codant pour un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 5, et, (c) les séquences dérivées des séquences (a) et (b) en raison de la dégénérescence du code génétique.
8. Séquence selon la revendication 7 caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi les séquences génomiques, d'ADNc, d'ARN, les séquences hybrides ou les séquences synthétiques ou semi-synthétiques.
9. Séquence selon l'une des revendications 6 à 8 caractérisée en ce que la partie codant pour ledit polypeptide est placée sous le contrôle de signaux permettant son expression dans un hôte cellulaire.
10. Séquence antisens capable d'inhiber au moins partiellement la production de polypeptide selon l'une des revendications 1 à 5.
11. Séquence selon la revendication 10 caractérisé en ce qu'elle est constituée par tout ou partie d'une séquence nucléotidique selon la revendication 7.
12. Sonde nucléotidique capable de s'hydrider avec une séquence selon la revendication 6 ou avec l'ARNm correspondant.
13. Sonde selon la revendication 12 caractérisée en ce qu'elle comporte au moins 10 bases.
14. Sonde selon la revendication 13 caractérisée en ce qu'elle comporte l'intégralité de la séquence SEQ ID n° 1 ou de son brin complémentaire.
15. Sonde selon la revendication 13 caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi les sondes (i), (ii), (iii), (iv), (v) et (vi).
16. Utilisation d'une sonde selon l'une des revendications 12 à 15 pour la détection de l'expression d'un récepteur sérotoninergique 5HT2C; ou pour la mise en évidence d'anomalies génétiques (mauvais épissage, polymorphisme, mutations ponctuelles, etc); ou pour identifier des affections neurologique, cardiovasculaire ou psychiatrique comme étant liées aux récepteurs 5HT2C; ou encore pour la mise en évidence et l'isolement de séquences d'acides nucléiques homologues codant pour des polypeptides 5HT2C.
17. Cellule recombinée capable d'exprimer à sa surface un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 5.
18. Cellule selon la revendication 17 caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi les cellules eucaryotes ou procaryotes.
19. Procédé de mise en évidence et/ou d'isolement de ligands des polypeptides tels que définis dans les revendications 1 à 5, caractérisé en ce que l'on réalise les étapes suivantes:
- on met en contact une molécule ou un mélange contenant différentes molécules, éventuellement non-identifiées avec une cellule recombinée selon la revendication 17 exprimant à sa surface un polypeptide tel que défini dans les revendications 1 à 5 dans des conditions permettant l'interaction entre ledit polypeptide et ladite molécule dans le cas où celle-ci possèderait une affinité pour ledit polypeptide, et, - on détecte et/ou isole les molécules liées au dit polypeptide.
- on met en contact une molécule ou un mélange contenant différentes molécules, éventuellement non-identifiées avec une cellule recombinée selon la revendication 17 exprimant à sa surface un polypeptide tel que défini dans les revendications 1 à 5 dans des conditions permettant l'interaction entre ledit polypeptide et ladite molécule dans le cas où celle-ci possèderait une affinité pour ledit polypeptide, et, - on détecte et/ou isole les molécules liées au dit polypeptide.
20. Procédé selon la revendication 19 pour la mise en évidence et/ou l'isolement d'agonistes ou d'antagonistes de la sérotonine.
21. Procédé de mise en évidence et/ou d'isolement de modulateurs des polypeptides tels que définis dans les revendications 1 à 5, caractérisé en ce que l'on réalise les étapes suivantes:
- on met en contact une molécule ou un mélange contenant différentes molécules, éventuellement non-identifiées, avec une cellule recombinée selon la revendication 17 exprimant à sa surface un polypeptide tel que défini dans les revendication 1 à 5, en présence de 5HT, dans des conditions permettant l'interaction entre ledit polypeptide et le 5HT, et, - on détecte et/ou isole les molécules capables de moduler l'activité du 5HT
sur ledit polypeptide.
- on met en contact une molécule ou un mélange contenant différentes molécules, éventuellement non-identifiées, avec une cellule recombinée selon la revendication 17 exprimant à sa surface un polypeptide tel que défini dans les revendication 1 à 5, en présence de 5HT, dans des conditions permettant l'interaction entre ledit polypeptide et le 5HT, et, - on détecte et/ou isole les molécules capables de moduler l'activité du 5HT
sur ledit polypeptide.
22. Ligand ou modulateur d'un polypeptide tel que défini dans les revendications 1 à 5, susceptible d'être obtenu selon les procédés des revendications 19 à 21.
23. Utilisation d'un ligand ou modulateur identifié et/ou obtenu selon les procédés des revendications 19 à 21 comme médicament.
24. Médicament comprenant comme principe actif au moins une molécule agissant sur un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 5.
25. Médicament selon la revendication 24 caractérisé en ce que la molécule est un ligand ou un modulateur identifié et/ou isolé selon le procédé des revendications 19 à 21.
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