JPH034796A - T細胞増殖促進因子 - Google Patents
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Abstract
め要約のデータは記録されません。
Description
wthfactor)に関する。特に、本発明は、ヘル
パーで細胞のインターロイキン2−及びインターロイキ
ン4−非依存性の生育を助けることのできるグリコプロ
ティンである哺乳動物のT細胞増殖促進因子に関する。
殖を増大させることができる。また特に本発明は、ヘル
パーT細胞増殖促進因子P40、それを含む医薬組成物
及びそれに対する抗体に関する。また本発明はヘルパー
T細胞並びにIL3−及びIL4一応答性細胞の増殖を
誘導するための方法に関する。
の細胞を刺激するのに有用である。
カニズムを仲介及び/又は組織の生育分化を仲介するポ
リはプチド類である。サイトカイン類が癌及び/又は感
染に対する宿主の防禦を仲介していることが認識されて
きた。
IFN−α、IFN−β、及びIFN−γ)、ツウモア
ネクローシスファクター(TNF−α)、リンホトキシ
ン(TNF−β)、インターロイキン(ILL、2.3
.4.5及び6)、リューコレグリン、ナチュラルキラ
ー細胞サイト トキシツクファクター(NKCF)、)
ランスホーミング成長因子(TGF)、マクロファージ
C8F(M−C3F)、顆粒球C8F (G−C8F)
及びマクロファージ−顆粒球C8F (GM−C8F)
のようなコロニー刺激因子(C8F)及びオンコスタチ
ンMがめげられる。
作用、細胞静止作用、抗ウィルス作用、または増殖制御
活性についての独特な範囲を持っている。
トジェンによる刺激に応答して、白血球によって合成さ
れる。このことは1nマi troで観察されてきた。
清液は回収され、サイトカン活性を同定し、単離し、さ
らに特性を調べられた。最近、IL2はT細胞の生育を
制御している唯一の因子ではないことがますます明らか
になってきた。
、84:4293−4297.1987)、G、M−C
8F138: 4288−4292.1987)及び、
ヒトの系におけるILi及びIL6との混合物(Hou
s+5lau at al、。
3−656.1988)といったものは、IL2−非依
存性のT細胞の増殖を誘起することが今や示されている
。それ故に、T細胞の生育の制御は、当初考えられてい
たよりもより複雑である一方、IL2は高い活性と広範
な活性を持つT細胞増殖促進因子である。
)である。少なくとも2種のヘル/(−丁細胞が、その
機能にもとづいて同定されている。第1のタイプのTH
細胞(−1)Vi、リンクされ、抗!特異性のめる方法
でB細胞を助け、反応の早い時期に要求されるものであ
る。別のタイプのT、(T□2 ) FiIJンクされ
ていない方法でB細胞を助け、反応の遅い時期に要求さ
れるものである。
、 Immunol、。
て記載された方法を用いて、抗原刺激したマウスのリン
・ミ節からヘルパーT細胞セルラインが得られた。これ
らのセルラインは抗原存在下に培黄を始められた後、外
部から成長因子を加えることなしに、定期的に抗原及び
照射された肺臓の抗原供与細胞を与えることにより維持
された。
5及びIL6を産生したが、どんなIL2も産生じなか
った。それ故これらの細胞はMosmannユL創ユ」
!Immuno1.,136:2348−2357.1
986. によって定義された一2タイプに属するも
のである。
2種のクローンが抗原及びフィーダー細胞(feede
rcallg )の存在なしにそれ自身の培地に反応し
て増殖するということが驚くべきことに見出された。
とは異なる新規なで細胞増殖促進因子に関する。この新
しい増殖促進因子は、ヘルパーT細胞の増殖を刺激する
ための治療用化合物として有用である。
存性で且つインターロイキン4−非依存性の生育を助け
、そして好ましくけマウスまたはヒト由来のものから得
られた哺乳動物のT細胞増殖促進因子に向けられたもの
である。
またはそのフラグメントと同定されうる特性を有し、そ
してさらにIL3−及びIL4一応答性細胞の増殖を強
める能力を有するタンパク質である。またP2O、その
誘導体及びそのフラグメントを単離する方法も提供され
る。
ントを有効成分として含有する医薬組成物に関する。特
に、本発明は、P2O、その誘導体またはそのフラグメ
ントと医薬として許容される担体とを含有し、免疫系の
特定の細胞を刺激するのに有用な医薬組成物に関する。
有していてもよい。
原性フラグメントに対して特異性を有し、P2Oの診断
用アッセイに有用な抗体にも関する。
にそのフラグメントリポリペプチド部分をコードする絹
換えDNA分子及び発瑠ベクターに関し、またそれによ
り組換えP2Oの便利な源泉物(5ource )を提
供することに関する。
時間及び条件下にヘルパーT細胞を増殖有効量のP40
tたはその誘導体と共にインキュベートすることからな
るヘルパーT細胞の増殖方法にも関する。
殖刺激するに充分な時間及び条件下にP2OとIL3ま
た1IL4との混合物を哺乳動物、特にヒトに投与する
ことによりIL3−またはIL4一応答性の細胞を増殖
させる方法に関する。
る長期抗原非依存性T細胞増殖を示すグラフである。T
UC115細胞は通常の培地(ロ)、IL2で補強した
培地(20u/lrt、口)、またはTU(4158N
で補強した培地(5チφ、△)中でフィーダー細胞およ
び抗原なしに増殖する。
,51上澄液はUltrogel Ac A 54ゲ
ルf過カラム囚、TSK−フェニル疎水性相互カラム(
B)、モノーQアニオン交換カラム(C)およびCt逆
相相カラムQ))上で順次にフラクションされる。陰影
区域はP40活性を表わす。パネルAに示す分子量標準
はウシ血清アルブミン(BSA、67KDa)、天然I
L5(45KDa)および絹換え体マウスIL6 (2
2KDa)である。
る。TSI細胞(3X10”細胞/+b)は精製P40
の増大調剤量の存在下で培養される。3日後に、細胞数
はへキソサミニダーゼ濃度を測定することによって検査
される。
す。パネルAは精製P40の銀着色NaDod804/
PAGEを示す写真である。この試料は還元性条件下で
操作される。
Oの自動放射性グラフである。標準物のMrHKDa中
に与えられる。
である。
現を示すグラフである。
のアミノ醸系列およびこの系列を得るに使用した種々の
ペプチドを示す。
テインナーゼAsp−Nペプチド類の分離を示すグラフ
である。
(Q254nmおよび(至)215 nmの波長におい
て光ダイオード列検知器を使用する図8のHPLCプロ
フィルの多重波長プロットを示すグラフである。
による及び(−@によって示す2次スはクトルによるエ
ンドプロテインナーゼAsp−NSプチドD1の誘導ス
はクトル分析のグラフである。
Cm−P2OのにプチドのマイクロボーアRP−HPI
、Cの分離を示すグラフである。ノミネルAはCm−P
40エンドプロテインナーゼAap−N:プチドD3の
ニス・アウレウスv8プロテアーゼ消化からのはプチド
を示す。パネルBはCm−P2Oのチモトリプシン消化
を示す。パネルCはCm−P2Oのトリプシン消化から
のはプチドを示す。
関連合成はプチドのRP−HPLC上の溶離プロフィル
を示すグラフである。
ロイキン2(IL2)−非依存性の及びインターロイキ
ン4(IL4)−非依存性の生育を助ける、あるいは助
けることのできるタンパク質を含有する哺乳動物のT細
胞増殖促進因子に関する。本発明及びそこに含まれる方
法を用いることにより、上記T細胞増殖因子は、生理学
的に純粋である。上記T細胞増殖促進因子を含有する組
成物は生物学的に純粋であることを意味する。その組成
物は均一なT細胞増殖促進因子を含有していてもよいし
、あるいは実質的にT細胞増殖促進因子からなるもので
あってよいつ本願明細書及び特許請求の範囲において、
ヘルパーT細胞のIL2−非依存性の及びIL4−非依
存性の生育を助けるとはIL2及び/又はIL4の非存
在下に該ヘルパーT細胞を増殖させる能力を指している
。この特徴によりこれまで知られた他の増殖促進因子と
本発明の増殖促進因子が区別される。本発明に従えば、
この活性は新規なこれまで知られていないT細胞増殖促
進因子によるものである。以後、該増殖促進因子をP2
Oと言う。ここで定義するように、P2Oの誘導体とは
、当業者にとって明らかな合成または天然由来のアミノ
酸を置換したり、除去したり及び/又は挿入したりした
ものをも含む。例えば、必須でないアミノ酸の除去、す
なわちP2Oの活性に影響を及はさないアミノ酸の除去
は遺伝子工学の手法によシ得られる。
れらのフラグメントは、P40タンパク質から得られた
ペプチドであり、精製したP2Oをタンパク質分解する
ことにより装造することができる。このにプチドは、H
PLCクロマトグラフィー等のような慣用の方法で精製
され、P2Oのアミノ酸配列を決定し、P2Oの特定の
ドメインに対する抗体ヲ裂遺し、そしてT細胞の生育を
刺激するのに関係するP2Oのドメインを同定するのに
有用である。
応することのできるP2Oの一部分と定義される。その
ような誘導体のすべてが本発明の対象とするものである
。
存在下にヘルパーT細胞セルラインの長期IL2−依存
性の及びIL4−依存性の生育を助けることのできるグ
リコプロティンであり、そしてヘルパーT細胞セルライ
ン、特にネズミ及びヒトのヘルパーT細胞セルラインの
ような哺乳動物のセルラインから単離されたものである
。P2Oは知られているすべてのインターロイキン類及
びコロニー刺&因子類とは機能的に明らかに異なってい
る。P2Oは、レクチン刺・激されたマウスヘルパーT
細胞セルラインの上清液(SN)から得られ、約100
./v〜約101OU/qの比活性まで精製されるが、
−船釣には10”U/!IPの比活性まで精製され、約
30〜約40KDaの分子量(Mr )を有する塩基性
(ネズミP40p110)の単鎖タンパク質として特徴
づけられる。
−y(TUCZ15及びTUC7,51)(7)上清
液から精製することができる。簡単に言うと、その上清
液は濃縮後TSKSツーニルクロマトグラフィーカラム
Kかけられる。因子依存性のTSI細胞に対する増殖促
進活性を持ったフラクションをプールし、さらにMon
o−IQクロマトグラフィーカラムで分画し、得られた
活性を有するフラクションをCt逆相HPLCカラムに
かける。純粋なネズミP40が約35チアセトニトリル
濃度のところで溶出する。
ニアスな移動14ターンを持ち、 (if) レンズマメレクチンに結合し、それはN−
結合した糖側鎖の存在を示している という二つの観察結果が得られた。
可能部位(Asn−X−Thr motif )が同定
されたことは、この観察結果と一致している。さらに、
N−グリカナーゼ処理実験でP2OのMrが約15KD
aに減少したことは、その分子がかなりグリコジル化さ
れていることのさらなる証拠である。P40t−1安定
な分子で、その生物学的活性はNa Do d S O
a s酸性pH、lるいはアセトニトリルにさらした後
でも変化しなかった。一方、その活性は2−メルカプト
エタノールにより破壊され、そのことは分子内ジスルフ
ィド架橋は分子を適切に折り曲げて保持するのに重要な
役割をFiなしていることを示′唆している。P40V
iまたその全アミノ識配列においても公知のタンノ4り
質とは異なっている。ネズミP40及びヒ)P2OのD
NN人動列びアミノ酸配列がここに記載され、その二つ
のタンパク質はその55チに類縁性があることを示して
いる。
能的にもIL2とは異なっている。細胞溶解性T細胞ク
ローンのIL2に対する反応性が非常に強いような条件
下でP2Oは完全に細胞溶解性下細胞クローンに不活性
である;反対に、IL2がヘルパーT細胞セルラインの
長期抗原非依存性の生育を助けることができないのに対
し、その系ではP2Oは非常に活性である。今までのと
ころ、P2Oに応答したヘルパー細胞の長期の生育は、
2ケ月以上にものぼり、無制限でありうる。このような
違いに反し、ヘルパーT細胞セルラインのP2O及びI
L4に対する感受性における相互の関係は、これら二つ
の分子によるT細胞の活性化は同様に制御されているこ
とを示していることが観察される しかしながら、各種
のIL3−依存性セルライン及び細胞溶解性T細胞の生
育も刺激できるI L 4 (Mosmannet a
t、 Proe、 Natl、 Acad、 Sci
、 USA、 83 :5654−5658.198
6 :Widmer at al、−Nature、
326.795−798.1987)の活性の範囲はP
2Oのそれよりも広いものであり、それは二つの因子、
すなわちIL4及びP2O3間の機能的な重なりは単に
部分的なものであることを示している。
ルパーT細胞セルラインに特異的であるという驚くべき
発見にあるっこのことは、ヘルパーT細胞サブセットに
限定された増殖刺激メカニズムの存在を示すものである
。そのようなメカニズムは、免疫反応の過程におけるI
L2及びIL4のようなヘル、c−T細胞生成物の供給
と活性化された他のリンパ球によるそれらの消費の増大
との間のバランスを維持するのに重要である。
P2OはIL3−またはIL4一応答性細胞の増殖を相
乗的に増加せしめることを見出した。ここで使用されて
いるIL3−及びIL4一応答性細胞とVilL3また
はIL4のそれぞれに反応して増殖する免疫系の細胞の
ことである。
4−依存性細胞をあげることができるが、これらのもの
に限定されるものではない。IL3一応答性細胞として
はヘル、、E −T細胞、幹細胞、マスト細胞、好酸球
、好中球、単球、巨核細胞(msgakaryoeyt
es )、好塩基球、エリトロボイド細胞(eryth
ropoid ce目1)があげられる。
細胞障害性T細胞、マクロファージ、マスト細胞及びB
細胞があげられる( Smi th、 K、 A、、
Bjotschnolog7+ 1 ;661−667
.1989)。
L4で刺激された細胞の増殖性に関し、強い相乗効果が
存在する。
サイトカインP40及びIL3の混合物またiiP 4
0及びIL4の混合物は、そのサイトカインのいずれか
一つの刺激効果以上の約4〜40の範囲のファクターだ
けチミジンの取込みを刺激することができる。一般的に
、P2O及びIL3の間の相乗作用、あるいはP2O及
びIL40間の相乗作用は、投与量に依存しまたセルラ
インに依存している。これらのタンパク質及び与えられ
たセルラインに関して、P2Oのこの場合の至適投与j
#は、至適P40の投与量の約1−25チの範囲で、I
L4のこの場合の至適投与tは、至適IL4の投与量の
約5−30%の範囲で、IL3のこの場合の至適投与f
#は、至適IL3の投与量の約70−100%の範囲で
ある。この相乗作用はさらにIL3−及びIL4一応答
性細胞、特にヘルパーT細胞の増殖金刺激するための方
法を提供し、そして免疫不全症の治療、特にAIDSの
ような特定の免疫細胞の増殖からあるいは免疫細胞の一
般的な増殖からでさえ利益をうる病気あるいは病状の治
療に有用である。
加えて生物学的に純粋なP2Oを含むことも本発明の範
囲内のものである。本発明に従って、抗原するいはフィ
ーダを要求しないベル4T細胞セルラインからの上清液
(SN)はP2Oを含有している。この5Nij、抗原
あるいはフィーダ細胞の必要なしに細胞の増殖を誘起す
ることができる。
は抗−IL46るいは抗−IL2レセプター抗体のいず
れによっても阻止されない。このことは上記活性は直接
的にもあるいは間接的にもこれら分子によっては仲介さ
れていないことを示すものである。上記SN中の活性成
分は、本発明によってP2Oであることが示された。そ
の5NFi試験細胞、TSIに活性である。それは約1
0−6〜約1O−2(v/v )の範囲の希釈度で、一
般的には約10−s〜約1O−4(v/v )の範囲の
希釈度で最大増殖活性の半分の値を示す。
40は生物学的に純粋な状態及び均一が組成物及びヘテ
ロジーニアスな組成物のうちで活性である。ここにおい
て具体的に示すなら、SN液はP2Oのヘテロジーニア
スな組成物の状態のものである。均一な組成物をここで
具体的に示すなら、P2O、その活性な誘導体またはそ
の活性なフラグメント等の均一な調製物を含有する医薬
組成物をあげることができる。
パー細胞の増殖を刺激するのに有用であると思われるっ
好ましい具体例において、P2Oは特に哺乳動物のTベ
ル/ミー細胞のある種のサブセットを刺激するのに有用
である。
刺激することのできる新しいそして有用な治療化合物で
ある。
疫妥協性の患者の場合のようなある袴のTヘルパー細胞
サブセットに欠陥を有するヒト患者にとって重要である
。本発明の数多くの利点のうち、P2Oによるヘル、4
T細胞の増殖は多くの量の他のサイトカインを生成
させるという付加的な効果を有するということをも注意
すべきである。したがって、本発明はまたヘルパーT細
胞の増殖を起こすのに充分な時間及び条件下に、増殖有
効量のP2O、その活性誘導体またはその活性フラグメ
ントを投与することからなる免疫不全症の治療方法を提
供する。本発明に従って、ヘルパーT細胞の増殖に必要
な時間は約2日間から約7日間の範囲である。
そのある種のサブセットを増殖させるのに充分な時間及
び条件下に、P2O、その活性誘導体またはその活性フ
ラグメントを含有する医薬組成の増殖有効量を哺乳動物
に投与することからなる哺乳動物におけるヘルパーT細
胞、及び好ましくはそのある種のサブセットの増殖を誘
起し維持する方法にも関する。加えて、哺乳動物におい
てヘルパーT細胞、及び好ましくはそ゛のある種のサブ
セットの増殖を誘起し維持する方法は、本発明では、P
2Oをコードする核酸分子をT細胞に導入し、該核酸分
子を該細胞中で細胞内だが染色体外で発現させるかある
いは続いての該細胞のゲノムへのインテグレーションす
ることをも含むものであるっこの場合、該核酸分子は第
二の核酸分子(例、各種ウィルス)によダ該T細胞に運
ばれたり、該細胞に移されたりする。第一の核酸分子は
発現のための適切なシグナルを含有するように操作され
る。即ち、本発明に従えば、哺乳動物においてTヘルパ
ー細胞を増殖するための方法は、医薬として許容される
第二の核酸担体分子中に含まれるP2Oをコードする第
一の核酸分子を投与して、該第−の核酸分子をT細胞に
入れ、有効量のP2Oが産生されるよう該第−の核酸分
子を発現させる方法で該第−の核酸分子を染色体外で維
持するか、あるいは該ターゲットのゲノム中にインテグ
レーテッドすることを包含している。直接または間接に
P2Oまたはその誘導体をコードするヌクレオチド配列
は、核酸分子により意味付けられている。核酸分子はこ
こにおいてRNAまたはDNAを意味すると定義される
。
動物の免疫妥協性疾患の治療において優れた効果のある
治療活性を示すことが意図されている。このようにP2
Oを含有する治療用組成物の活性成分は、特定の病気に
よって違う治療用量で投与された時ヘルパーT細胞増殖
活性を示す。例えば、約0.5μm〜約200011Q
/kf体重/日が投与される。投与法は至適の治療応答
を与えるようにされることができる。例えば、数個に分
けられた投与物が毎日投与されることができたり、ある
いは投与fは治療状態の種度に応じて減らすこともでき
るう実際に利点をもたらすように決めて、その活性化合
物を経口、静脈内(水溶性の場合)、筋肉内、皮下内、
経鼻、皮肉経由あるいは坐剤経由のような便利の良い方
法で投与することができる。投与経路により、P2Oを
含有する活性成分は、物質に被覆され、該活性成分を不
活性化する酵素、酸及びその他の天然の条件の作用から
該活性成分を保護することが必要とされうる。
裂することのできる酵素によって胃腸管内でそして酸加
水分解によって胃の中で破壊されることを起こさせうる
。非経口投与以外によりP2Oを投与するためには、P
2Oはその不活性化を阻止する物質で被うされるかその
物質と共に投与されるべきである。例えば、P40t−
を賦形剤に入れて投与されるか、あるいは酵素阻害剤と
一緒に投与されるか、あるいはりボゾームに入れて投与
されることができる。本発明で使用される賦形剤として
はレゾルジノニル類、ポリオキシエチレンオレイルエー
テル及びn−ヘキサデシルポリエチレンエーテルのよう
な非イオン性界面活性剤があげられる。酵素阻害剤とし
ては膵臓トリプシンインヒビタージイソプロピルフルオ
ロホスフェート(DFP)及びトラジロールがあげられ
る。リポゾームとしては水中油中水滴型のP40乳剤並
びに通常のりボゾーム剤があげられる。
ができる。分散剤もまたグリセロール、液状ポリエチレ
ングリコール類及びそれらの混合物、及び油中で製造さ
れることができる。通常の保存及び使用条件のもとでは
、これら調製物は微生物の生育を阻止するための保存剤
を含有している。
の場合)または分散剤及び無菌の注射用溶液または分散
散剤をすぐに調製しうるような無菌の粉剤があげられる
。あらゆる場合において、その形態は無菌でなければな
らず、また容易に注射しうるような流動性がかければ々
らない。そわは製造及び保存条件下で安定でなければ々
らず、細菌及びカビのような微生物による汚染に対して
守られていなければならない。その担体としては、例え
ば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリ七ロー
ル、プロピレングリコール、液状ポリエチレングリコー
ル等)、適当なそれらの混合物及び植物油を含む溶媒あ
るいは分散媒であることができる。適当な流動性は、例
えばレシチンのようなコーティングを使用したり、分散
剤において所要の粒子径を維持するようにしたり、界面
活性剤を使用したりして保つことができる。微生物の作
用から守るためには各種の抗菌剤及び抗カビ剤、例えば
パラベン類、クロロブタノール、フェノール、ソルビン
酸、チメロサール等によりなされることができる。多く
の場合、等張剤、例えば糖類あるいは塩化ナトリウムを
含むことが好ましいであろう。注射用組成物の吸収を延
ばすためには、吸収遅延化剤、例えばアルミニウムモノ
ステアレート及びゼラチンの組成物として使用されるこ
とによシなされることができる。
挙された他の各種の成分を含んだ適当な溶媒に入れ、必
要に応じ無菌−過することにより製造される。一般に、
分散剤は、各種の殺菌された活性成分を、基本的な分散
媒質及び上で列挙したものから選ばれた他の必要とされ
る成分を含有する無菌媒体中に入れることにより製造さ
れる。無菌の注射用溶液剤調製用の無菌粉末剤の場合、
好ましい製造法としては減圧乾燥及び凍結乾燥法があげ
られ、それらによりその前段階の無菌−過された溶液か
ら活性成分と所要の付加成分とからなる粉末を与える。
活性化合物は、例えば不活性な希釈剤と共にあるいは同
化しうる可食担体と一緒に経口的に投与されることがで
きるか、あるいはハードまたはソフトゼラチンカプセル
の中に入れることができるか、あるいは錠剤に圧縮する
ことができるか、あるいは直接に食品の中に入れること
もできる。
補形剤の中に入れられそして経口摂取しうる錠剤、バッ
カル錠剤、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸
濁剤、シロップ剤、ウェハー剤、等の形態で使用するこ
とができる。そのような組成物及び調製物は少なくとも
1チの活性化合物を含むべきでおる。組成物及び調製物
のバーセンテイジはもちろん変えることができ、便利に
はそのユニット重量の約5〜約80%の間にあることが
できるうそのように治療上役に立つ組成物における活性
化合物の量は、適当な投与量が得られるようなものであ
る。本発明に従った好ましい組成物及び調製物は経口投
与ユニット形態のものが約10μf〜1000μVの活
性化合物を含むように製造される。
なものを含むことができる: グラガカントガム(gum gragacanth )
、 トラガカントガム、7’lj’/7、トウモロコシ
デンプン、またはゼラチンのような結合剤;リン酸二カ
ルシウムのような補形剤;トウモロコシデンプン、ジャ
ガイモデンプン、アルギン酸等のような崩壊剤;ステア
リン烹マグネシウムのような滑沢剤;ショ糖、乳抛また
はサッカリンのような甘味剤が添加することができるか
、あるいはペパーミント、ウィンターグリーン油または
チエリーフレーバー剤のようなフレーバー剤が添加され
ることができる。投与ユニット形態がカプセル剤の場合
、上記のタイプの物質に加えて液状担体を含むことがで
きる。
か、あるいはその投与ユニットの物理的形態を変えるた
めにあってよい。例えば、錠剤、丸剤またはカプセル剤
はシェラツク、糖あるいはその両方で被櫟されることが
できる。
してショ糖、保存剤としてメチル及びプロピル/ミラベ
ン類、色素、及びチェリーまたはオレンジフレーバーの
ような7レーパー剤を含有することができる。もちろん
、投与ユニット形態を製造するのに用いられるどんな物
質も医薬として純粋で使用量において実質的に無毒で力
ければからない。
れることもできる。
ニット形態に非経口用組成物を製剤化することは特に有
用である。ここで用いられる投与ユニット形態としては
、治療されるべき浦乳動物対象体に単一の投与しうるよ
うに適合された物理的に分けられたユニットがあげられ
る;事前に決められた素の活性物質を含有する各ユニッ
トは、所要の医薬担体と共に所望の治療効果が生ずるよ
うに計算されているつ本発明の新規な投与ユニット形態
′f、%定化するためには、(IL)活性物質の独特の
特性及びもたらされる特定の治療効果、及びことに′3
?いて詳細に開示したように身体の健康を損なっている
疾病状態を有する生存対象体における病気の治療のため
そのような活性物質を配合するような分野に固有の制限
によって及び直接にそれに依存してなされる。
ト形態のもとて適当な医薬として許容される担体と共に
その有効量を利用し易く、効果的な投与がなしつるよう
に配合される。ユニット剤形は、例えば0.5μm〜約
2000ηの範囲の量で主要活性化合物を含有すること
ができる。
200011F/−担体の範囲で存在している。補足的
な活性成分を含有している組成物の場合には、その投寿
#F′i該成分を投与する場合の通常の用量及び方法を
参考にして決められる。
いがなるそしてすべての溶媒、分散媒体、コーテング剤
、抗菌剤及び抗カビ剤1等張剤及び吸収遅延化剤等があ
げられる。医薬活性物質に対してそのような媒体及び試
薬を用いることt−1tM該分野においてよく知られて
いることである。
ない場合を除いて、その治療用組成物におけるそれらの
使用が含まれる。補足的な活性成分もまたその組成物の
中に入れられることができる。
増殖を刺激する方法及び免疫不全症を治療する方法にお
いてP2OをIL3またはIL4と一緒に使用すること
にも関する。そのような方法はP2Oのみに関係し、そ
して本明細書で記載されている治療法に沿って行われる
。同様に、P2O及びIL3、またflP40及びIL
4を含有している医薬組成物は、P40単独を含む組成
物に沿って提供される。さらにこの点に関し、IL3及
びIL4t′i、市販のものを手に入れることができ、
治療上有効な量を用いることができる。IL3またはI
L4と一緒に用いられた場合のP2Oの医薬として有効
なilは、P2Oを単独で用いた場合と同じである。同
様に、IL3またはIL4の医薬として有効な量はP4
0単独で与えられたものと同様のものであることができ
る。本発明に従ったP2O及びIL3の好ましい組成物
は、ユニット剤形が約0.5μV〜約2000■の範囲
の量の各タンパク質を含むように製造される。P2O及
びIL4の好ましい組成物は同様にして、ユニット剤形
が約05μ2〜約200 Qil!の範囲の量の各タン
パク質を含むように製造される。これらの組成物におい
て、P2OのIL3またはIL4に対する相対量は変え
られることができるし、同じであることもできる。
ントに対する抗体に関する。そのような抗体は、特に治
療方法をモニターする間及びP2Oの精製においてP2
Oを検知アッセイ(イムノアッセイ)を開発するに有用
である。
であってもよい。加えて、上記した第一の抗体に向けら
れたどんな第二抗体(モノクローナルあるいはポリクロ
ーナル)も包含することが本発明の範囲内である。本発
明はさらに検知アッセイにおいて及び例えば投与された
医薬組成物の効果をモニターする場合にこれら第二抗体
を使用することにも関する。さらに、本発明の範囲内に
は、P2Oのグリコジル化領域及び該P40と複合して
いるいかなる分子に対する抗体をも包含される。したが
って、本発明に従えば、P2Oに対する抗体は、P2O
、その抗原性の部分に対する、そしてあらゆる結合分子
(例、グリコジル化領域、リピド領域、キャリヤー分子
等)に対する抗体を包含していここで対象としているP
2Oまたはその部分は、実施例3に具体的に示されてい
るようにして精製され、次に抗体産生に用いられる。ポ
リクローナル抗体及びモノクローナル抗体は共にP2O
、その誘導体、そのポリペプチドまたはそのフラグメン
トで免疫することによシ得られ、そしていずれのタイプ
のものもイムノアッセイに利用できる。両方のタイプの
血清を得る方法は当該分野においてよく知られている。
九P40またはその部分の有効量を適当な実験動物に注
射し、次にその血清を動物から集め、公知の免疫吸着法
によって特異血清を単離することにより比較的容易に製
造される。この方法で製造された抗体は、実質上いかな
るタイプのイムノアッセイにも利用できるが、−船釣に
はその生成物の力価が不均一なことからそれらはその好
適性がおちる。
量に産生でき、その生成物が均一なことから特に好まし
い。
作とされたリンパ球細胞とを融合することにょシ誘導さ
れたモノクローナル抗体産生のためのハイプリドーマセ
ルラインの製造法は当業者によく知られた方法によって
行われることができる。(参照、例えば、Douill
ard、 J、 Y。
acts About Hybri−do、mas、J
Com endium of Immunolo
gy、 Mol。
81) ; Kohler、 G、andMilate
in、C,、Nature 256: 495−49
7 (1975);European Journal
of Immunology、 6:511−
519 (1976)、 Koprowski et
al、、 米国特許4.172,124、Kopr
owski et al、、 米国特許4.196,
265及びWander米国特許4,271,145)
。
。
抗体産生に用いる動物の選択はそのリンパ球と融合する
ことができる適皇彦無限増殖させつるセルラインが利用
できるか否かによる。ハイブリドーマ技術においてはマ
ウス及びラットが選択動物とされて来ており、好ましく
使用される。適当か無限増殖させうるヒト(または非ヒ
ト)セルラインが入手しうるならば、感作された977
4球源としてヒトもまた使用できる。本発明の目的のな
めには、選ばれた動物は約II?〜約20ηの精製P4
0またはその部分を注射されることができる。通常注射
する物質はフロイント完全アジパント(Freund’
a’ complete adjuvant )中に懸
濁化される。免疫増強する注射もまた必要とされうる。
試験することにより行うことができる。リンパ球は、無
菌的に感作動物の肺臓またはリンパ節から取シ出すこと
により得られ、融合される。別の方法としては、例えば
CoReading、J、Immunol、Meth
、、53:261−291.1982に記載されている
ように in vitroでリンパ球を刺激あるいは免
疫することができる。
、生育性の均一度、生育培地の成分に対する代謝欠損及
び良好な融合頻度のような多くの基準のいずれかにより
ハイブリダイゼーションプロトコール用の特定のセルラ
インを選択することがなされる。
)の間でのそれは、s!!4をまたがったものの融合よ
シもより好ましい。ミエローマイミノグロブリン(免疫
グロブリン)を分泌する能力を欠いた選択された変異株
を含む数種のセルラインが利用可能である。これらに含
まれるものとしては、次なるマウスミニローミセルライ
ンがあげられる:MPC1,−X45−6TG、P3−
NSI−1−Ag4−1、X63−Ag3.653のよ
うなP3−X63−Ag8、またはその変異株、5P2
−0−A[14(すべてBALB/eから誘導)、Y3
−’Ag1.2.3(ラット)及びU2O5(ヒト)。
1n−Barr)ウィルスまたはセンダイ(5anda
l )ウィルスのようなウィルス、あるいはポリエチレ
ングリフールのいずれによっても起こさせることができ
る。ポリエチレングリコール(PEG)は哺乳動物の体
細胞を融合させるのに最も有用な試薬である。PEG自
体は細胞に対し有毒であり、各種の濃度がその融合を試
みる前に生存に有効かどうかを試験すべきである。PE
Gの分子量の範囲として1jlooO〜6000tで変
えることができる。食塩液または無血清培地で約20%
〜約70 % (W/W)まで希釈した時良好な結果が
得られる。PEGに37℃で約30秒間さらすことが、
ネズミ細胞を使用した本発明の場合には好ましい。高す
ぎる温度(即ち、約45℃)は避けられ、融合に先だっ
て融合系の各成分は37℃に前もってインキュハートさ
れると至適結果が得られる。リッツξ球細胞と腫瘍細胞
との間の比率は肺臓細胞間の細胞融合をさけるように決
められ、約1:1〜約1:10の範囲が良好な結果を与
える。
てミエローマセルラインから分離することができる。最
も一般的で好ましい方法は、ヒポキサンチングアニンホ
スホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRT)欠損で
ある腫瘍細胞を選び、そしてそれはアミノプテリン含有
培地中では生育できないが、ハイブリッド細胞のみはそ
こで生育でき、そしてその培地は一般的にはヒポキサン
チン1.10−’M、アミノプテリンlXl0’−’M
及びチミジン3X10−11Mからなり、一般にHAT
培地として知られているものである。融合混合物は、融
合の24時間して後にすぐさまHAT含有培養培地中で
生育させることができる。通常2週間HAT培地中で保
持し、次に通常の培養培地あるいはヒポキサンチン、チ
ミジン含有培地のいずれかの中に入れられる。
存在につき試験される。抗ah固体支持体に結合され、
推定される抗体を含有するノ・イブリドーマの上清と反
応させられるというアッセイ法を用いてノ・イブリドー
マ抗体の検知が行われることができる。各種の指示薬を
用いた「サンドイッチ(sandwich ) J法に
よって抗体の存在を測定することができる。はとんどの
−船釣な方法がノ・イブリッドの生育中に分泌する抗体
濃度の範囲内で使用されるのに充分に感度が良い。
ッドのクローニングを行うことができる。クローニング
は液相中での細胞限界希釈法によっであるいは半固体ア
ガロース中で生育する単一の細胞を直接選択することK
より行うことができる。限界希釈法のためには、細胞F
!!!渭液は一連の希釈をうけ、統計的に各ウェル当り
ただ一つの細胞となるようにされる。アガロース法のた
めには、ハイブリッドは、フィダー細胞を含有する下層
の上に置かれた半固体の上層にまかれる。上層からコロ
ニーはひろい出され、ウェルに移すことができる。
中で生育させられ、いろいろな濃度の抗体を含んだ上清
液を与えることができる。よシ高濃のものを得るために
は、バイブリドは動物に移植され、炎症性の腹水を得る
ことができる。抗体を含有する腹水は腹腔内注射後8−
12日後に収穫されることができる。腹水は高濃度の抗
体を含有しているが、その炎症性腹水はモノクローナル
抗体とイムノグロブリンの両方を含んでいる。次に例え
ば親和クロマトグラフィーにより抗体の精製が行われる
ことができる。
るP2Oあるいはそれに特異性を有する抗体の存在は、
どんなタイプのイムノアッセイ法においても上記したよ
うにして製造された抗体、すなわちモノクローナル抗体
あるいViポリクローナル抗体のいずれかを用いて測定
することができる。広範なイムノアッセイ法が、米国特
許4.016゜043;同4,424,279及び同4
,018,653を参照してわかるように利用できる。
ている分析法で、本発明においてはその使用が好ましい
。多くのサンドイッチアッセイ法の変法が存在し、その
すべては本発明に含まれうる。簡単に言うと、その典型
的なアッセイ法は、非標識抗体を固体基質に固定化し、
測定されるべき検体をその結合分子と接触させる。抗体
−抗原の第二の複合体を形成するに充分な時間で適当な
インキュベートの後、検知しうるシグナルを生成するこ
とのできる梗識分子で標識された第二抗体を加えて、次
にインキュ、、J−トし、抗体−抗原−標識化抗体(例
、抗体−P2O−抗体)の第三の複合体を形成させるに
充分な時間置く。すべての未反応物質を洗滌除去し、抗
原の存在を標識分子が作り出すシグナルを観測すること
により測定する。その結果f″ii簡単視性のシグナル
の観察による定性的なものであるか、あるいは既知のノ
・プランを含有するコントロール検体と比較することに
よる定量的なものであることができる。上述の7セイ法
の変法は、検体と標識抗体を同時に固定化抗体に添加す
ることからなる同時アッセイ法、あるいV′ime抗体
及び測定されるべき検体を最初に一緒にインキュベート
し、次に非標識化表面に固定化された抗体に加えること
からなるリバースアッセイ法を包含している。これらの
方法は当業者によく知られており、少こしばかり変形し
て行なうことも容易になしうるものである。
明の、P2O、またはその抗原性の部分に特異性を有す
る第一抗体は固体表面に共有結合あるいは受動的に結合
している。その固体表面とは典型的にはガラスまたげポ
リマーであり、最も普通に使用されるポリマーとしては
セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチ
レン、ポリビニルクロ2イドまたはポリプロピレンであ
る。固体支持体は、管、ビーズ、ディスク、マイクロプ
レートあるいはイムノアッセイを行なうに適したその他
の表面を持つ形態であってよい。その結合法は当該分野
でよく知られておシ、一般的には不溶性担体にその分子
を交差結合させるか、共有結合させるか、物理的に吸着
させることからなる。結合した後、ポリマー・抗体複合
体は、試験検体を製造するため洗滌される。次に試験さ
れるべき検体の一定量を固相複合体に加え、25℃で抗
体中に存在するサブユニットが結合するのに充分な時間
インキュベートされる。そのインキュベーション時間は
いろいろ変えることができるが、一般的には約2−40
分の範囲である。インキュベーション後、抗体サブユニ
ット固相を洗滌し、乾燥し、次にノ・ブテン部分に特異
的な第二抗体とインキュ×−トする。第二抗体を標識分
子と結合させ、その標識分子は第二抗体が7・ブテンに
結合していることを示すのに用いられる。本明細書にお
いて使用される「標識分子(reporter mol
ecule ) jとは、その化学的な性質によって抗
原結合抗体を検知することができるような分析上固定す
ることのできるシグナルを与える分子を意味する。その
検知は定性的にも定量的にもすることができる。このタ
イプのアッセイ法において最も普通に用いられる標識分
子は、酵素、螢光色素ま六は放射性の核Sを含んだ分子
(即ち、ラジオアイソトープ)があげられる。酵素イム
ノアッセイの場合には、酵素は一般的にはグルタルアル
デヒドまたは過ヨウ素酸塩を用い、第二抗体に結合され
る。しかしながら容易に認められるように、広範な様々
な結合法があp、それは当業者が容易に用いることので
きるものである。一般的に使用される酵素としては、ホ
ースラデイシュぼルオキシダーゼ、グルコースオキシダ
ーゼ、β−ガラクトシダーゼ及びアルカリ性ホスファタ
ーゼ等があげられる。その特定の酵素と共に使用される
基yとしては相当する酵素によって加水分解され、検知
しうる色の変化を生ぜしめるようなものが一般的に選ば
れる。例えば、p−ニトロフェニルホスフェートはアル
カリ性ホスファターゼコンジュゲートと共に用いるのに
適している;はルオキシダーゼコンジュゲートに対して
は、1.2−フェニレンジアミン、5−アミノサリチル
醗あるいはトリジン(tolldine )が一般的に
用いられる。上記した着色性基質よりもむしろ螢光性生
成物を与える螢光原基質を用いることも可能である。あ
らゆる場合において、酵素標識抗体は第一の抗体ハプテ
ン複合体中に加えられ、結合させ、次に過剰の試薬は洗
滌し除去される。適当な基質を含有する溶液を次に抗体
−抗原−抗体の三つの成分からなる複合体に加えられる
。基質は第二抗体に結合した酵素と反応し、定性的か可
視性のシグナルを与え、そしてそのシグナルは通常分光
測光によりさらに定量的に測定されることができ検体中
に存在するノ・ブテン量の指標を与えることができる。
r)ような螢光化合物を抗体の結合能を変化させること
なくその抗体に化学的に結合させることができる。特定
の波長の光を照射することによシ活性化され;螢光色素
標識抗体は光エネルギーを吸収し、分子の励起状になり
、光学顕微鏝て目視により検知できるfFIII的な色
の光を放射する。EIAにおいては、螢光標識された抗
体は、第一の抗体−ハブテン複合体に結合させることが
できる。結合しなかった試薬を洗い流した後、残ってい
る三つの成分からなる複合体を適当な波長の光にさらし
、そして観察される螢光は対象ハプテンの存在を示すこ
とになる。螢光免疫分析法及びEIA法は共に当該分野
において確立され、特に本願方法において好ましい。し
かしながら、ラジオアイソトープ、化学発光分子あるい
は生物発光分子のような標識分子もまた使用することが
できる。所要の目的に合致するように改変することは当
業者にとって容易なことであろう。またこれらの方法は
、本発明のP2Oを直接にあるいは間接に(即ち抗体を
通(〜て)検知するのに使用しつることも明らかである
。
抽出物、組織液)、11. vttroのセルカルチャ
ー上清液及び細胞溶解液中のP2Oの迅速かつ便利なア
ッセイ用キットにも関する。そのキットは仕切られてお
り、P2Oまたはその抗原性成分に対する抗体を含有す
るように適合された第一の容器及び、P2Oまたにその
抗原性成分に対する第二抗体全含有するように適合され
た第二の容器を受は入れられ、そして該第二抗体は上記
したように検知しうるシグナルを与えることのできる標
識分子と結合している。
するように適合せられた第三の容器が提供される。目的
とするキットを具体的に使用する場合には、P2Oにつ
いて試験されるべき検体は、もしP2Oが存在する場合
、P2Oが該第−の容器中に入っている抗体と結合する
に充分な時間及び条件で第一の容器の内容物と接触せし
められる。非結合物質を除去(例、無菌リン酸塩緩衝化
塩液で洗滌することにより)した後、その第二の複合体
を第二の容器の内容物と接触せしめる。第一の容器の抗
体がP2Oに結合したなら、第二の容器の抗体を第二の
複合体に結合させ、第三の複合体を形成させ、該第二抗
体は標識分子で標識されており、測定されるとその第三
の複合体を検知しうる。
る組換え核酸または単離された核酸であって、本明細書
で定義されるこれら分子はDNAまたViRNAである
ものに関する。具体的には組換え核酸分子は相補的DN
A(cDNA)でおる。哺乳動物のP2O、好ましくは
ネズミ及びヒトP40、をコードしているcDNA分子
、あるいは塩基の欠失、挿入あるいけ置換、またはヌク
レオチド配列または化学的な組成(例、メチル化及びグ
リコジル化)に関してのその他の変性を含むその領域又
はその部分を含んだものが本発明の範囲内のものである
。cDNAによってコードされたP2Oは本明細書では
組換えP2Oに相当する。さらに、本発明の別の具体例
においては、ゲノムのP40遺伝子に向けられたもので
、それは全遺伝子をコードしているコスミドのような組
換えクローンあるいは哺乳動物のP40遺伝子のエクソ
ン、イントロンあるいはいずれかの領域をコードしてい
るサブクローンを包合することができる。遺伝子のその
ようなサブ領域をコードしている組換えDNAはP40
遺伝子の存在を検知するためのハイブリダイゼーション
プローブとして有用である。
方法はManltis et al、、 1982.
MolecularCIonin@: A Lab
oratory Manual、 Co1d S r
inにあり、例えば広く利用することのできる組換えD
NA技術の中の多くの実験室マニュアルのうちのいずれ
かのものである。簡単に述べると、ポリアデニル化され
たmRNAが刺激を受けたヘルパーT細胞から得られ、
アガロースゲル上で分画される。任意に、m RN A
の一部分iXenopusLaev1g 卵母細胞に
注入し、翻訳させ、本明細書の中で得られた方法を用い
て・P2Oの活性をアッセイし、P40活性の分子に翻
訳されているrn RN Aフラクションを濃縮するこ
とができる。別の方法としては、濃縮されていないmR
NAを鋳として用いてcDNAを合成する。c DNA
クローンのライブラリーをベクターpBR322のPs
t 1部位(ホモポリマーティリング管用いる)にある
いは各種の別のベクター(例、Okayama−Ber
g cDNAクローニングベクター、Messing
eDNA クローニングベクター等)中に構築する。上
記ライブラリー中のベクターにある特定のcDNA分子
を次に、P2Oの中に含1れるアミノ酸配列に基づいて
、少なくとも該配列の部分をコードするようにデザイン
された特定のオリゴヌクレオチドを用いて選別す。特に
有用なものは臭化シアン処理して得られたネズミP40
の内部部分アミノ酸配列であり、それは次のものである
: N)Tl−Ala Gly Asn Thr Leu
Ser Phe Leu Lys Ser LauLe
u Gly Thr Phe Gin Lys Thr
Glu。
特にP2Oまたはその誘導体をコードしているc D
N Aクローンを同定するのに有用である。かくして、
ポリ(AビRNA1!コンカナバリンA (Con A
)で24時間刺激した後のネズミへルノξ−T細胞セル
ラインTUC7,51から製造され、eDNA合成の鋳
型として用いられた。cDNAをpUC8ベクターの
BamHl 部位にクローン化し、E、Co11をト
ランスフオームし、次にアミノ酸配列FQKTEMQに
相当する6 4− fold degeneratep
roHeを用いてスクリーニングし、次にアミノ酸配列
ENLKDDPに相当する1 28− fold de
generateprobeを用いてスクリーニングす
ることができる(プローブの正確な配列については実施
例9を参照)。得られたポジティブのクローンは他の哺
乳動物のゲノムP40遺伝子及びeDNAを単離するの
に有用である。例えば、ネズミのcDNAクローンはヒ
トのゲノムライブラリー、あるいは他の哺乳動物のゲノ
ムライブラリーをスクリーニングするのに用いられ、全
ゲノム遺伝子または少くとも一つのそのエクソンのいず
れかを同定しうる。この方法で遺伝子のほんの一部が単
離されるだけなら、遺伝子の残シの部分は[クロモシー
マルウオーキング法(Chromosomalwalk
ing ) jによって新しいクローンを用いて単離さ
れることができる。さらにゲノムクローンは特にcDN
Aクローン及びその反対のもの、特に同じ種属からのも
のを単離するのに有用である。かくしてネズミcDNA
クローンは、ネズミゲノムP40遺伝子を単離するのに
使用される。
るアミノ酸配列と共に下に示される: −18−10 eLeuA1aSsrValLeuLeuPheSer
Ssr5’ CAGACTCCCGTCAACATGT
TCGTGACATACATCCTTGCCTCTGT
TTTGCTCTTCAGTTCT0 y11*ArgAspThrAinTyrLeu11e
G1uCATCAGAGACACCAATTACCTT
ATTGAA00 CTGACCAATGCCACACAGAAATCAA
GACTCTTGCCTGTTTTCCATCGGGT
GAAAAGGATACIO 00 aSe rLeuLeuGlyThrPheGl nL
ysThrACCATGGC’AGGCAACACAC
TGTCATTTCTGAAGAGTCTCCTGGG
GACGTTCCAGAAGAC人00 ACAGATGCTATTTATTCTATTTATT
GAATGAAGAAATAAACTAAGCTATT
CT3′ 00 ヒ)P2OのeDNA配列が相当するアミノ酸配列と共
に以下に示される: −18 MET LEU LEU ALA MET VA
L LEU THRSERALA LEU LEU
LEU CYS SERVAL ALACCGCT
GTCAAG ATG CTT CTG GCCATG
GTCCTT ACCTCT GCCCTG CT
CCTG TGCTCCGTG GCAl
10GLY GLN GLY CYS PRO
T)TRLEU ALA GLY TI、E LEU
ASP ILE ASN PI(E I、EU
ILE ASN L、YS 八5ETGGCCAG G
GG TGT CCA ACCTTG GCG GGG
ATCCTG GACATCAACTTCCTCAT
CAACAAG ATG20
3
0GLN GLU ASP PROALA SERLY
S CYS lTl5 CYS SERALA ASN
VAL THRSERCYS LEU CYS LE
UCAG GAA GAT CCA GCT TCCA
AG TGCCACTGCAGT GCT AAT G
TG ACCAGT TGT CTCTGT TTG4
0
50GI、Y ILE PR
OSERASP ASN CYS THRARG PR
OCYS PHE SERGL、U ARG LEU
SERGL’N MET THIζGGCATT CC
CTCT GACAACTGCACCAGA CCA
TGCTTCAGT GAG AGA CTG TCT
CAG ATG ACC6070 ASN THRTT(RMET GLN T)TRAR
G TYRPROLEU ILE PHE SERAR
G VAL LYS LYS SERVAL Gl、U
AAT ACCACCATCGAA ACA AGA
TACCCA CTG ATT TTCAGT CGG
GTG AAA AAA TCA GTT GAA8
0
90VAL LEU LYS
ASN ASN LYS CYS PROTYRPIE
SERCYS GLU GLN PROCYS AS
N GLN TT(RTHI七GTA CTA AAG
AACAACAAG TGT CCA TAT TT
T TCCTGT GAA CAG CCA TGCA
ACCAA ACCACGloo
110ALA GLY ASN ALA LEU T
)TRPRE LEU LYS SERLEU LEt
J GLU ILE PHE GLN LYS GLU
LYS 11.1ETGCA GGCAACGCG
CTG ACA TTT CTG AAG AGT C
TT CTG GAA ATT TTCCAG AAA
GAA AAG ATG2g ARG GI、Y MET ARG GLY
LYS ILEAGA GGG ATG AGA G
GCAAG ATA TGAAGATGAAATATT
ATTTATCCTATTTATTAAATTTAAA
AA2 22 82 42 02 62 22 85 一旦同定されたなら、組換えP2Oの全部または一部を
コードしているeDNAまたは組換えDNAは発現ベク
ターにライゲートされる。更なる遺伝子操作が通常の手
法に従って使用される特定の宿主におけるcDNAの発
現を最大にするように行われる。従って、P40Vi該
e D N A配列を複製しうる発現ベクターに挿入し
、得られた組換え分子を適当な宿主にトランスホームし
、次にその分子の合成に必要な条件のもとてトランスフ
オームされた宿主を培養生育させることによF) in
vltroで合成することができる。本明細書で定義
され死損換え分子は、所望のポリはプチドの挿入された
部分の下流のプロモーター、原核細胞のレプリコンまた
は真核細胞のレプリコン及び抗生物質に対する抵抗性の
ような選択用マーカーをコードする核酸配列を包含して
いる。プロモーターは該ポリペプチドの発現に影響を与
えることのできる所望ポリペプチドをコードするDNA
K操作可能に結合させられている特定の核酸配列からな
っている。同様に、プロモーターはエンハンサ−1転写
ターミネータ−ポリ(A)シグナル等のような要素を含
む遺伝子の発現に影響することのできる他の遺伝子エレ
メントによってRき換えたり強められたりすることがで
きる。
の使用は遺伝子の発現に使用されたベクター及び宿主の
系に依存するものでらる。これらの要素のいずれが必要
かけ当業者によって容易に決定される。プロモーターは
遺伝子の発現を制御するためのDNA配列のエレメント
で、特にそれらは転写の開始部位を特定化している。原
核細胞系プロモーターで有用なものは伴プロモーター、
trpプロモーター、ラムダのPL及びpRプロモータ
ー及びT7ポリメラーゼプロモーターがあげられる。真
核細胞系のプロモーターとして特に本発明で有用なもの
は、ウィルス由来のプロモーターで、SV40後期プロ
モーター、Mo1ony 白血血病つィルスLTR1
酵母プロモーターあるいは遺伝子工学におけるプロモー
ターを含めた遺伝子の発明を制御するようにデザインさ
れたプロモーターあるいはその改変物のようなものがあ
げられる。遺伝子の発現をコントロールするということ
は所望の発現しRルを得るためにポジティブあるいはネ
ガティブに(即ち、遺伝子発現のスイッチをオンにした
りオフにすること)遺伝子を制御する能力を含むもので
ある。
製しうる発現ベクター、適合性の宿主及びベクターを製
造したり使用したりするためのよく知られた方法を利用
することができる。組換えDNA技術は遺伝子工学の多
くの標準的な実験マニュアルのうちに見つけることがで
きる。
チドを移送するのに役立つシグナル配列を必要とするこ
とができる。また、ポリペプチドは超音波、圧力による
破壊あるいはトルエン処理のようないろいろな方法で宿
主細胞を溶解して取り出すことができる。本発明の宿主
は、原核細胞(例、大腸菌(Egcherichia
call )、バチルス属(Bacillus gp
、)、シュードモナス属(Pgeudo−monas
sp、)及び真核細胞(例、哺乳動物細胞、酵母、真菌
培養物(fungal cultures ) 、昆
虫細胞及び植物カルチャー)からなる群から選ぶことが
できる。当業者はヌクレオチド及びトリプレットヌクレ
オチド(コドン)の欠失、置換及び付加をしてアミノ酸
配列を与えることヲかしうることをも理解しよう。その
ような変性もすべて本発明の範囲内であり、部位指定変
異形成法←site−directedmutagen
esis technlque ) によって製造
することができる。
P40はグリコジル化されていることもできるしまたし
ていないこともできる。一般に真核細胞、例えば哺乳動
物のT細胞等はグリコジル化された組換えP2Oを与え
る。原核細胞、例えば大p!!5菌等のような細菌はタ
ンパク質をグリコジル化しない。それゆえ、グリコジル
化された組換えP2O及びグリコジル化されていない組
換えP2Oが本発明に含まれる。
生物及び培養細胞にも関する。組換え微生物及び培養細
胞は哺乳動物のP2O、その誘導体またはそのフラグメ
ントをコードする複製可能な発現ベクターを所望の細胞
または微生物に導入することによりトランスフオームあ
るいはトランスフェクトしたり、わるいはウィルスまた
はバクテリオファージ粒子を感染させることにより作ら
れる。トランスフオームの方法は当業者によりよく知ら
れており、バクテリア細胞の場合CaC11処理や電気
刺激により、そして真核細胞の場合CaPO4共沈法、
プロトプラスト融合法や電気刺激によることがあげられ
るが、これに限定されるものではない。ベクターとして
ウィルスまたはバクテリオファージを用いて直接感染さ
せる方法も使用することができる。これらの方法のより
詳細な手法は組換えDNA技術の標準的な実験室マニュ
アルのうちに見出すことができる。
る。
ラインにも関する。本明細書で定義したように、P2O
3るいはそれを含有する組成物は、永代抗原非依存性T
ヘルパー細胞セルラインの増殖を刺激し、そのセルライ
ンはP2Oを含んだ培地中で3〜4日置きに植えついで
保持される。特に本発明はTSI、すなわちTU(41
5がら誘導されたその因子依存性のセルラインの一つに
関する。
る。
びBCLI以外の殆んどの細胞系に対して、10%(v
/v)ウシ胎児血清(Fe2)、50Plβ−メルカプ
トエタノール、0.55mML−アルギニン、0.24
mML−アスパラギン及び1.25mML−グルタミン
を補ったダルベコ修飾イーグル培地を用いた。
、 Proc。
79−9683゜1986、 記載の外因性増殖促進
因子無しで安定化し保持した。系TUC2及びTUC7
Uキーホールリンブトヘモシアニンで免疫化したC57
BL/6ネズミ(マウス)から誘導した。系TUC5は
ヒトトランスフェリンで免疫化後の同一の系統から得ら
れる。TUCl 3ViアロスはシフイックB A L
B/C抗−C57B/6系である。個々のクローンは
コンカナバリンAで促進したネズミ牌、[#l胞で条件
付けした1 0 % (v/v)培地を存在させた制限
稀釈でそれぞれの系から誘導し、そしてTUCx、y(
但しXは系統を示す番号であり、yはクローンの番号で
おる。これらのクローンを親細胞系と同様に外因性増殖
促進因子無しで実質的に発展させて保持した。D B
A/2起源の同系統のP815肥満細1mに対して直接
対向する細胞系T細胞クローンはMaryanskl
et at、 Eur、 Immunol、 12:4
01−406.1982.記載のように5od(v/v
)混合リンパ球培地を用いて保持する。増殖促進因子検
定に用いるには、T細胞をLymphoprep (N
yeomed AS。
心分離し、洗浄して5X104セル/ウエルで培養する
。増殖は3日後、メチル標識〔3H〕−チミジン(0,
5uCI/ウエル)!用いる6hrパルスで測定する。
C2,15及びTUC7,51細胞を2X10’細胞/
+dK調節し、2−3日、0.5%(v/v) F C
S及びコンカナバリンA (Con A、 5μy/
−)を含む培地中で培養する。上澄液(SN)Fi、i
o、ooof、で20m1nの遠心分離で蒐集する。培
養に用いる時、粗SNに0.1Mメチル−D−マンノシ
ドを補う。
15SN中で培養、増殖促進因子検定に用いる前に細胞
を洗ってSNを無くし、試験すべき試料の逐次稀釈で3
X10”細胞/ウェルに培養。3日後、Landegr
en J、 Immunol。
. の方法で細胞増殖をヘキソサミニダーゼの比色測
定で測定する。405nmで最大値の半分の吸光度を与
える稀釈をIU/−の活性と任意的にきめる。
上工:2027−2032.1978)金100U/−
のヒト組換えIL−2DAI (Ihl@et al、
Adv、 Viral 0ncol。
5 (Palaclosat al、 J、 EXT
l、 Med、 152 :1036−1047.1
980)をIL3の源としてWE)TI−3SNの11
500 (v/v)で7TD1をI L6 (Van
5nlek at al、 5upra )の源として
TUCZ15SNの17500稀釈で増殖させる。
法で行ない、増殖はへキソサミニダーゼ測定かチミジン
包含かで測定、インビボハツセツジBCLI細胞(Sl
avinet at、 Nature 272 :
624−626.1978)は小部分を凍結し、使用直
前に解答、BCLIの増殖は104細胞/セルで種付け
した7日後の培養でのチミジン包含で測定。
2)は文献の通りである。ヒト組換え体顆粒球コロニー
促進因子(G−C8F)及びネズミ組換え体顆粒マクロ
ファーショロニー促進因子(GM−C3F)はDeLa
marter et al。
に記載されている。血小板誘導増殖促進因子(PDGF
)はHe1dlnat al、 Proe、 Nat
l、 Acad、 Sci、 USA 76 :37
22−3726.1979に記載されている。表皮増殖
因子(EGF)はBoehringer Mannhs
lm (Fed、 Rap。
IL6314 : 266−268.1985 )、組
換え体ヒト IL2(Devos et al、 Nu
cl、’ Ac1dRRes、 11 : 4307−
4323)及び精製ネズミI L3 (Ih1s旦畦、
J。
2受容体抗体5A2 (Moreau at al、
Eur、 J、 Immunol。
吸着とゲルrit行なう。ゲルー過カラムからの活性フ
ラクションをプールし、10−’ (v/v)稀釈のT
ween20の存在でAm1con YM−i o膜
の限外Paで濃縮し、0.1Mリン酸ナトリウムでpH
7,0に緩衝したI M Na!S 04に移し、同一
緩衝液で平衡化したT S K −Ph5nylカラム
(LKB。
0分洗浄後、リン酸ナトリウム緩衝液(0,1M pH
7,0)とエチレングリコールの1:1混合物の線形勾
配を用いて0.6m/minで溶維を始める。活性フラ
クションは更に、20mMエタノールアミン−HCl
pH9,5,20mMNaC1及び10”” (v/v
) Tween 20で平衡化したMonoQ カラム
(Pharmaeia Fine Chemicals
、 Uppsala。
ln )の30 min線形勾配で0.8 tri、/
rninで展開。プールした活性フラクションを濃縮
、o、o s % (w/v)のトリフルオロ酢酸(T
FA)を含むようにし、CC125n細孔サイズTSK
TMS−250HPLCカラム(I、KB)に注入
。
TFA中のアセトニトリルの0−35 % (w/v)
勾配で展開、次の60m1nは35−36チの狭い勾配
で展開。流速は0.8 yd /rn inとし;1
minフラクションを10 fitのI M NH4H
COsと5μtのTwesn 20 (1% (v/v
)水)の入ったEppendorf管に集め凍結乾燥、
全タンパク質をNeuhoff et al。
l、 Chem、 36旦:1657−1670.1
979に従ったベンゾキサンチンを用いる螢光分析法で
測定。最終生成物純度は12%(w/v)アクリルアミ
ドゲル中のNaDodSO4/PAGEで査定、LKB
(Bromma、Sweden )垂直ゲル装置を用
いて等電果中を実施。物質をカラムから、Tween
20 (10−’、/、)及び10mMリン酬ナトリウ
ムpH7,0を含む130mM NaC1中での一晩培
養で回収、業者(Pharmacia。
レンチアルレクチン−セファロース上のアフィニティー
クロマトグラフィーを行なう。
モデル120A)付のApplied Biosygt
emssequsncar (モデル、477A)で自
動アミノ酸配列分析を実施、Slmpson at a
t、 Bioch@rn、 Intarnat。
pson ビ と略称)記載の方法に従いガス相シー
ケンサ−のガラス綾維試料デスク上でP2O(〜10μ
f)のその場でのシアノゲンプロマイド開裂を実施、以
下のデータベースと配列を比@: Protein 5
equer+ce database of FIR
。
earch Foundation(release
15.0. Decamber 1987) ;
5triss−Prot Protein 5equ
ence Data Bank version5 (
September 1987. Compiled
by A、 Ba1roch。
ical Bioehemi−stry I)epa
rtment、 1211 Geneva 4.
P+witzr−1and ) ; G、 B、 tr
an8Protein Data Ba5eRelea
se 1.0 (August 1987) com
piled fromGENBANK releas
e 50.Oby J、Coventry。
5titute of MedlcalResear
ch、 Parkville 3050 Au5tr
alta; andPG trans Prots
In Data Ba5e release
38.0(December 1985)GENBA
NK、In5tit。
抗原と抗原存在細胞を必要とするC57B1/6ヘル、
c−T細胞系である。支持細胞及び抗原無しでこれら細
胞を増殖しようという企図で、Con Aで刺戟後得ら
れた1 0 S (v/v)の自己移植性上澄液(SN
)を培地に供給後、このSNは抗原又は支持細胞を更に
必要どせずに細胞増殖を誘発できることが驚くべきこと
には見出される。この増殖促進因子活性は抗−IL4又
は抗−IL−2受容体抗体(表2)のいずれでも阻害さ
れず、活性はそれらの分子から直接的にも間接的にも媒
介されないことを示している。
依存性細胞系の発生を促進し、これは1 ’gy (v
/v) S Nを補った培地中で3−4日毎の分割培養
で保たれる(図1)、IL2についてこの方法で抗原非
依存性細胞系を誘起しようという企図は現在まで成功し
7ていない。第2のヘルツクーT細胞クローン、TUC
7,51も自己移植性SN中での培養で抗原非依存性細
胞系を生じる。これら2細胞系の因子活性は、TUC,
7,51SNがTUC4152胞の増殖をサポートし又
その逆も可能かので、みかけ上回−である。
15から誘導された因子依存性細胞系、をえらぶ。この
選択は。
低濃度のSNに応答し、最大値の半分の増殖が10−5
及び1o−4(v/v )の稀釈で得られるという観察
にもとづく。TSI検定の特異性をきめるために、精製
した増殖促進因子又は粗5N1fr:変えて細胞を培!
するとII、4とTTJ(415SNだけがTSIの増
殖をサポートすることが判明した(表2)。抗−In4
抗体がTU(415SNの作用を阻害できないことから
、前述の活性は新規なT細胞増殖促進因子である。
3日IL2(1000/イ)、In4(100U/渭t
)又はTUC2,15SN (1%−IA)と、抗−I
n、2受容体抗体5A2 (30μf/−)又は抗−I
n4抗体11BI(10μf/−)と培養、チミジン包
含を第3日に測定。
養、すべての試薬は1oom範囲でテストし、最高用t
Kついての結果だけ全示す。最高用量で負のスコアーの
因子はいずれもより低い用量では作用しなかった。細胞
増殖はへキソサミニダーゼ濃度の比色分析で測定する。
の約0.10乃至約0.15を差引く。
及びTUC7,51でT細胞SNの大バッチをつくる。
54ゲルr過カラムへの塗布で濃縮する、トリプシンで
破壊される、主要増殖促進活性Vi30−40kDa領
域(図2A)の対称ピークで溶離し、P2Oと命名する
。以下の実験はP2Oの濃度がこの物質中で高いのでT
UC7,51SNで行なう。
有し、グリコジル化されており、活性の60チはレンチ
ルレクチンカラムで保持されることを示している。この
情報を一部利用して以下の精製プロトコルを用いる。ゲ
ル濾過からの活性フラクションをTSK−フェニルカラ
ム上の疎水性相互作用クロマトグラフィー(図2B)で
、次KpH9,5で平衡化したMono Qアニオン交
換カラムを通過させて分離する。この高いp)(で殆ん
どの汚染物質はカラムに保持され、一方P40はその高
いTIIで示されるように流過フラクション中に主とし
て溶離する(図2C)。最終精製は0.5チ(W/v)
TFAで平衡化したC1−カラム上の逆相クロマトグラ
フィーで行なわれるっP40Vi35%(v/v )の
アセトニトリル濃度で溶離する単一ピークで回収される
(図2D)。この精製の終りでP2Oは〜5pf/dの
濃度でTSIの最高値の半分の増殖を促進し、これは2
000倍の精製に相当する(図3)。平均して全体収率
は約5乃至約10チである。
でのNa Do d S 04 / P A G E巾
約32乃至約39のMrを有し極めてヘテロジニャスで
ある。生物学的活性は非還元ゲルの対応するフラクショ
ンから回収されるが、NaDodS04及び2−メルカ
プトエタノールへの曝露は活性の殆んどをこわす。
端配列を生じなかった。配列分析のために、(シーケン
サ−のポリブレン処理試料デスク上に不動化した)P2
Oをアシル化しくTarr、Methods of P
rotein Micro−eharacteriza
tlon [ad、J、E、5h1vely〕Huma
nPress、 pp、155−194.1986)、
次にその場でSimpson I 記載シアノゲン
プロマイド処理を行なった。
l)を得る:NH1−Ala Gly Asn Thr
Lsu Ser Ph5Leu Lys Ser L
eu Leu Gly Thr Phe Gin Ly
sThr Glu。
されている他のタンパク質と著るしい相似性を示さない
。
ジテオトレイトールで還元し、ヨード酢酸でカルボキシ
メチル化してCm−P2Oとする。(図7に示した)ポ
リペプチドをエンドプロテイナーゼAsp−N、トリプ
シン、キモトリプシン及びシアノゲンブロマイド(図7
中ではそれぞれり、’r、C及びNで示しである)に依
るCm−P2Oの開裂で配列分析用に製造した。エンド
プロテイナーゼ、^、Asp−Nのサブはプチドは5t
aphyloeoccus aurous■8プロテア
ーゼ(ハイホンで結んだSサフィックスで示す)を用い
る開裂で誘導した。図7ではアミノ醪残基を同定せず、
Xで示している。
’l’ween20、グアニジンHCI (シーケ
ンス級)及びトリフルオロ酢酸(Fs Ac OH:
99+チ級)f Pierce Chemical C
o、 (Rockford、 l1linois。
uka(Bu aha、 5w1tzerland )
から入手して使用前再結晶化、ジチオトレイトールはC
a1bloch@m (La Jolla。
(Aristar級)及び無水酢酸はB D H(Po
o Ie、 UK )から、シアンゲンブo−rイド(
Univar級)はAjax Chemical Co
。
入。他のすべての薬品は市場で入手できる最高級品であ
る。(トシルフェニルエチルクロロメタン処理)トリプ
シン及びキモトリプシンはWorthington B
iochemical Go、(New Jerse
y。
eus菌株v8プロテアーゼはMiles Co、(N
apperville、 l1linois。
ミュータントからのエンドプロテイナーゼAspN
及びN−グリカナーゼはBoehrlnger Man
nhelm GmbH(West Germany)か
ら入手した。すべての有機溶媒はHPLC級(Chro
rnar級、Mallinckrodt、 Kentu
eky、 USA)であった。
li−Q系(Mllltpore、 Inc、、 Ma
ssachusetts、 USA)から入手し、すべ
ての緩衝液に用いた。
0)の調製: P 40 0.1 % (v/v) F
gAeOH及び0.024Tween20を含む35チ
アセトニトリル水溶液の120μを中の15μm)を約
10μtに遠心分#(savantInd、 Hlck
sville、 NY)で濃縮し、0.2M)リスHC
1緩衝液、pH8,5,0,002M EDTA及び
0.02% (v/v) Tween 20を含む7.
5MグアニジンHCIで160μtに稀釈し、次に40
℃で4.5hジチオトレイトール(0,015M)で還
元した。アシル化は混合物に(最終濃度0.05Mで)
ヨード酸を添加し、暗所で25℃で30 min培養し
て行なった。25μtの2−メルカプトエタノールを添
加して反応を停止した。公知の方法(S impson
et al、、 Eur、 J、 Bioehem、
1176 :187−197゜1988、以後Sim
pgon IIと呼ぶ)の逆相高速液体クロマトグラフ
ィー(RP−HPLC)を用いて混合物からCrn−P
2Oを回収した。Cm−P40含有フラクション(60
pL)をTvaen20について0.02%(v/v)
に調節し、次に酵素消化前に(0,02%(v/v)
Tween 20を含む)適切な緩衝液で1−に稀釈し
た。
及び0.02チb/v) Tween 20 ’ft:
含む1%(w/v ) N H41(COs、pH7,
8の1−中のCm−P2O<7μf)?:0.5μFト
リプシンで37℃で16h消化した。
H4HC03、pH7,8及び0.02%(v/v)
Tween 20の1d中のCm−P2O(6μ?)を
0.6p?キモトリプシンで37℃で16h消化した。
リンリントリウム緩衝液、pH&1.0.02 To
(v/v)Tween20の1020 pf中のCm−
P 40 (15pf ) fo、7pりの新たに調製
したエンドプロテイナーゼAsp−Nで34℃で16h
消化した。
s菌株v8プロテアーゼ消化: l % (v/v)
NH4HCOs、0.02 % <v/v)Tween
20の1tnt中のエンドプロテイナーゼAap−Nは
プチドD3を0.5 pf S、 aureus V
8プロテアーゼで1:10の酵素/基質比で16h3
0℃で消化した。
で得たペプチド混合物をダイオードアレー検知器(モデ
ル1040A)を備えたHewlett−Packar
d液体クロマトグラフ(モデル1090A)上の前述の
(Simpson II )逆相HPLCで分別した。
プチドの精製に用いた;(a)Brownies RP
−300(300nm細孔径、7−μm粒子径、オクチ
ルシリカを30XZ1wi、d、又は50×l鰭1.d
、のステンレス鋼カラムに充填、Brownie@La
boratories、 5anta C1ara。
ミノアゾベンゼンスルホニルクロライド(DABS−C
I )アミノ酸はBrownls+e P T Cア
ミノ酸分析カラム(220XZOwst、d、)(Ap
plied Biosystsms、Foster C
tty。
源を示すのに用いる:!、トリプシン;CN、シアノゲ
ンブロマイド;C,キモトリプシン;D、エンドプロテ
イナーゼAsp−No5.aur@us V8を用いる
エンドプロティカーゼAsp−N4プチドのサブ消化で
得られるはプチドはハイフォン付Sサフイツカスで示す
。ペプチドは最終配列のその位置の順序で付番する。
マン分解にタンパク質配列器(シーケンサ−)を実行し
て後、配列分析を停止した。その場での生のP2Oのシ
アノケ゛ンプロマイド開裂を(Simpson 、 I
)の方法でタンパク質シーケンサ−のガラス繊維試料デ
ィスク上で行なった。シーケンサ−の配列分析中に上昇
したパックグランドは試料ディスクi50 % (v/
v) N−エチルモルホリン水溶液の30μtと無水酢
散の10μt(25℃で60分)処理して低下させた。
20倍過剰のシアノゲンブロマイドで25℃で15h処
理した。この終りで試料フィルターを30 min真空
乾燥し、配列分析を続けた。
ントイン(Pth)アミノ烹分析計(モデル120A)
=i付けたApplied Biosystemsシー
ケンサ−(モデル470A及び477A)を用いてタン
ノくり質及びはプチドの自動エドマン分解を実施した。
文献(Begg et al、、 1n−Technl
ques In Protsln Chemistr
y 、 (Hugli。
s、 0rlando F 1.。
液体クロマトグラフィに注入した、ポリブレンをキャリ
ヤーに用いた。
0 (15/’P)をエンドヲロティナーゼAsp−N
で消化し、消化物を短いミクロ内径カラム(30X2.
1m 1.d、) 、低pH(Fs Ac OH,pH
2,1)移動相及びアセトニトリル勾配を用いてRP−
)(PLOで分別した。3つの主要なはプチド含有ピー
クD1、D2及びD3(図8)を検知した。リアルタイ
ムの光ダイオード列スはクトロスコピイを用いてこれら
はプチドの分光分析を用い、ペプチドD1、D、及びD
3の吸収ス2クトルを図9に示す。ぼプチドDIの29
0 nmの大きな吸収率はトリプトファン残基の存在を
示している。D2及びD!はプチドは280 nmに高
い吸光度と290 nmで低い吸光度を有し、これはチ
ロシン含有oプチドの特徴である。ペプチドDlのトリ
プトファン残基の存在は図10に示す誘導吸光度スはク
トルで支持される。2次誘導スぼクトロスコビイによる
分解能の向上Fi290nm以外に、2mmと280±
2nmを示しこれはトリプトファン残基の特徴である。
ーゼでサブ消化し、得られた生成物を低pH(F3 A
c OH)のRP−HPLCで分別した(図11人)。
で得られたはゾチドの逆相)TPLCN製を行ない、類
似の方法で分析したつこtら消化物の逆相分別は然し複
雑な、eターンのズプチド含有ピーク(図11B及びI
IC)l、が得られなかった。1次元RP−HPLCが
らのはプチドフラクションはすべて、同一のクロマトグ
ラフ担体及びアセトニトリル勾配で異なる移動相(例え
ば未緩衝塩化ナトリウム又は20mMリン醪ナトリウム
、pH7,0)を用いて第2のクロマトグラフ工程を行
なつ六。いくつかのズプチドについては均質はプヂドが
単離できる迄に第3の工程が必要であった。この場合、
0DS−ハイパーシルカラム及び異なる有機溶媒をクロ
マトグラフィー(Simson II ) K用いた。
ヨー素化した。逐次ゲルr過とカチオン交換クロマトグ
ラフィーで1”6I−Cm−P2Oを遊離l冨sIがら
分離した。未処理”I−Cm−P2Oを2−メルカプト
エタノールで95℃で5 min還元するが又はN−グ
ルカナーゼF(at’nzyme。
−アセチルガラクトサミニダーゼ(0−グリカン−ペプ
チドヒドロ2−ゼ、Boehringer MILnn
heim )で業者指示の方法で37℃で16h消化し
たものを、SDSの存在下で10−15%勾配のポリア
クリルアミドゲル上で!気泳動させた。
、 Uppsala。
色した。
ergham。
オートラジオグラフィーで検知した。
び未還元の両状態で12%5DS−FAGΣみがけMr
32.000−39,000ダルトンの単一ブロードバ
ンドとして電気泳動しく図4レーンl及び4参照)、こ
れがモノマー状タンパク質であることを示した。エンド
−α−N−アセチルガラクトサミニダーゼ(0−グルカ
ナーゼ)処理1P40に行なっても分子量にみかけ上側
の作用もない(図4レーン3)が、N−グルカナーゼF
の処理は15.000−16,000D&へのみかけM
rの減少を起した(図4、レーン2)。0−グリカナー
ゼの影響が無いことは、P2Oが0結合したカルボハイ
ドレート鎖を有していないか又はそれらの部位が完全な
分子では接近できないことを示す。N−グリカナーゼF
はアスパラギン残基(N−結合)についたカルボハイド
レート部分を放出するので、これはP2Oがかなりの量
のN結合した糖を有するタン、Eり質コア(Mr 15
,000”−16,000)から成ることを示している
。
らの計算Mrは14,150である。計算Mrと生のP
2Oについての測定Mr (32−39kDa)の差は
、N−グルカナーゼF処理TMrが15,000−16
,000 (図4)に減少することから、N−グリコジ
ル化に帰することができる。タンパク質配列データは成
熟P40の翻訳後プロセシングの情報を与える。例えば
位置32.60.63及び96にはアミノ酸が同定され
ず且つこれらの位置V′iN−結合グリコシル化部位(
例えばAsn −Xaa−Thr/Ser )のクリテ
リア罠適しているので、これらのデータはこれら4位置
がグリコジル化アスパラギンから成ることと一致してい
る。アスパラギン残基の位置32.60.83及び96
とC0OH〜末端残基(Pro−126)の確認ViP
40cDNAクローンの配列分析で与えられた。
正確な性質は、アミノ酸分析、高速原子衝撃質量分析及
びはプチド合成の組合せで決定された。これらの分析は
ネズミP40のN−末端がピログルタミン酸らしいこと
を示した。
論拠は次の通りでおる。
たBockmlLnアミノ酸分析計(モデル6300)
上か、又はミクロ内径カラムRP−HPLCを用いるジ
メチルアミノアゾベンゼンスルホニルクロライド(DA
BS−C1)プリカラム誘導法(Simpson、
et al、、 Euro、 J 。
985 )で実施。試料は0.1チ(v/v )フェノ
ール含有6M HCIから発生した気体MCIで110
℃、24 hr真空中加水分解。
orward−geometry double−fo
cu8sing ’Jj量分析計(VG Anllyt
ical、 Manchester、 UK)にIon
Tech sMclls−field高速原子高速原
子下高速原子衝撃質量分析(Blber et 31.
、 Anal、 Chem、。
料を2μtの0.1 % (v/v) F3 A(!O
H水溶液でジチオトレイトール/ジチオエリトリトール
(5:1)の予備印加混合物の1μtを含む試料ステー
ジに加えた08keVと1mAの放電4位のキセノン原
子を試料衝撃に用いた。走査は1,500の分解能で4
0S/デケードで実施。陽イオンスペクトルをVGII
/250Jデータシステムを用いて多重チャンネル分析
モードで得た。
末端残基として用い、P2O(エンドプロティナーゼA
sp−NペプチドDI)のN−末端デカはプテドに対応
する2個のAプチドの合成にフルオレニルメトキシカル
ボニル(Fmoc)−ポリアミド固相はプチド化学を用
いた。公知のFmoc ポリアミド側鎖保護基を使用:
Tr p(CHO) :Arg (Mtr ) 、M
tr= (4−メトキシ−2,3,6−トリメチルばン
ゼンスルホニル); Glu (OtBu); Cyg
(tBu)。
ルとして活性化されたFmoc−Arg(MtC)以外
、ジメチルホルムアミド中のすべてのFm o c−ア
ミノ酸のペンタフルオロフェニル(OPfp)エステル
をRlLMP S (Dupon t 。
プリング)に使用。0Ffpエステルの濃度を誘導され
た樹脂の濃度より2.5x倍大きくし、且つ1当量の1
−ヒドロキシベンゾトリアゾールを反応の触媒としてカ
ップリング用混合物に加えると、ぼプチド結合形成は1
20 mIn内にほぼ完了した。合成完了時に、Fs
Ac OH(5,4%チオアニソール、0.6%1.2
−エタンジチオエーテル含有)の広範な処理ではプチド
の保饅基を外し樹脂から開裂させた。粗合成ペプチド及
びその誘導体(例えばS−カルボキシメチル−にプチド
)、を逆相HPLCで精製。純合成はプチドは逆相HP
LC(Brownies RP−300力ラム30xZ
1ms。
想アミノ酸比を与えた。
)を6μtのN−エチルモルホリン(Pierc@、
5equenJ1級)で次に無水酢酸(Fluka、
puriss級)で25℃でlQmin処理して、
無水酢酸でアセチル化した。ピログルタミルベプチドの
形成はグルタミンペプチドを110℃、16 h、
pH7,8g素化で処理して完了。
びD3のS、 aursus V8プロテアーゼサブ
はプチドはP40アミノ醪配列配65チを与えた。3種
のはプチド中、Dl、単一トリプトファン−含有はプチ
ドFiN“ブロックされていて、このペプチドがポリぼ
プチド鎖のN−末端部分から誘導されたことを示してい
る。N−ブロックAsp−NペプチドD1のアミノ駿組
成は2個の余分の残基(Glk及びArg)のN−末端
付加を持つトリプトファン−含有トリプシンはプチドT
1と一致した。
FAB−MS)は質量1248のプロトン化分子イオン
(MH”)を示し、ブロッキング基逅ピログルタミン酸
であると仮定した時のこのペプチドのアミノ醪組成にだ
け対応する、N−ブロッキング基の性質をグルタミン酸
かグルタミンをアミノ末端に有する2種の合成デカペプ
チドD1を用いて検討した(図7及び12参照)。図1
2に示すように、エンドプロテイナーゼAsp−N’プ
チドD1とピログルタミル合成ぼプチドは逆相HPLC
(リテンション時間20.50±0.2m1n)上で同
時にクロマト分別され、グルタミル合成ペプチド(リテ
ンション時間22.70±0.2m1n)と良く分離さ
れた。アセチル化後も、Dl及びピログルタミル合成ぼ
プチドのクロマトグラフ特性は同一であった(リテンシ
ョン時間は増加しなかった)、一方アセチル化グルタミ
ル合成ペプチドはりテンショ特性の著るしい増加(非ア
セデル化型の2Z70+0.2m1nに比しリテンショ
ン時間ij、28.97±0.2m1nであった)を示
した。アミン末端エンドプロテイナーゼAsp−N’プ
チドD1は合成ピログルタミルぼプチドとアセチル化前
もアセチル化後も逆相HPLC上で全く同一の挙動をす
るのでP2Oのアミノ末端はピログルタミン酸であろう
。グルタミル合X OプチドのFAB−MSは1248
の分子量を与え、これはAsp−NはプチドD1で得ら
れたものと完全に一致した。
骨髄細胞系(FDCP−1、Ea3.15及びDA−1
)、IL5−依存性B細胞リンパ腫BCLIか、IL6
−依存性B細胞ハイブリドーマ7TD1かの増殖をサポ
ートしなかった。IL2と異なり、またある程度IL4
と異なり、それは試験した6種の細胞性T細胞クローン
のいずれの促進も成功しない(表3)。これに対してす
べてでは無いがいくつかのベル、4− T細胞系につい
て強力か増殖が認められる。IL2−生産性(TI(1
型、TUC7,33)及びIL4−生産性(TH,型、
例えばTU(415)クローンはレンスポンダの中にア
1出される。クローンTUC7,51について表3で示
すように培養に使用した時間とP2O及びIL4に対す
る応答の間に著るしい相関が望められる。
24h刺戟稜のP40生産性ヘルパーT細胞’l’Uc
7.51から単離したポリアデニル化RNAを用いて調
製した。eDNAをpUC8ベクターのB2LmpI部
位にクローン化しE、Co11株DHS中に形質転換し
た。トランスフォーマントを2種のエンド標識化20−
m5+rオリゴヌクレオチドプローブとのその場でのハ
イブリッド形成でスクリーニングした。描初のスクリー
ニングには64倍縮重プローブ、(位置114−120
本文参照)のFQKTEMQのアミノ酸配列に対応、C
5’ −TGCAT(C+T)TC(X)GT(C+T
)TT(C+T)TG (G+A) AA−3’ ) を用いた。陽性クローンは次に配列ENLKDDP (
位置17−23、本文参照)に対応する129倍縮重プ
ローブ (5’−GO(A+G)TC(A+G)TO(T+C)
TT(X)AG(A+G)TT(C+T)TC−3’
)でテストした。
レオチド法でDNA1配列決定した。図5に示す配列決
定計画を用い P8t 1及びNCo i制限エンドヌ
クし/アーゼを用いる消化で適切なフラグメントラ生成
させた。
刺戟後に多量のP2Oを生産するヘルパーT細胞クロー
ンからPUC8ベクター中にcDNAライブラリーをつ
くった。P40ペプチドの分析で得られた選ばれたアミ
ノ酸配列データに基づいて合成された2種のオリゴヌク
レオチドプローブを用いてこのライブラリーをスクリー
ニングした。20,000の独立トランスフォーマント
中、112m!1が2mのプローブにハイブリッド形成
した。これらのクローンの殆んどは約500bpのcD
NA挿入断片を有していた。これらeDNAの一つをプ
ローブに用いて、P40生産性ヘル/Z +−T細胞ク
ローンTUC7,51から単離したポ1バA)” RN
Aのノザンプロット中の約700ヌクレオチドの転写と
強い信号を得た。検知できるP40活性を生じないP8
15肥満細胞腫からのポ17(A)”RNAは全熱信号
を与えない。
るために発現ベクターを構成した。挿入断片P40,2
84をプラスミドpZIPneoSV(X)1 (Ce
pko、 at al、。
I部位中にりローン化し、クローン−1d9維芽細胞(
Kit、 et al、。
中にトランスフェクトした。トランスフェクション48
h後細胞上澄液を集めてP2O−依存性TSI細胞の増
殖促進因子活性をテストした。図6に示すように、P2
O,2B4cDNAをトランスフェクトした細胞の上澄
液(■)はTSIの増殖を支持するが、モソクトランス
フエクトした細胞からのもの(ロ)は支持しなかった。
ード化領域を有していることを示している。
オチド配列は決定されて、発明の詳細な説明中に示しで
ある。これは、15ヌクレオチドの5′非翻訳領域、4
32ヌクレオチドの開放読み枠及び107ヌクレオチド
の3′非翻訳領琥を持つ554個のヌクレオチドから成
る。3′−末flt′1AATAAAJ リアデニル化
信号共通配列の12ヌクレオチド下流の18アデニン残
基のストリングで終る。3′非別訳領域は配列ATTT
Aの3個のコピーを有し、これは−時的に発現する遺伝
子例えばGM−C8F、G−C8F、インターフェロン
、いくつかのインターロイキン、腫瘍え死因子及びがん
遺伝子C−fog及びC−myc (Shaw eta
t、、Ce1l 46 : 659,1986)に特命
的なものであシ;ヌクレオtド位置461−468と4
70−477でのこれらの繰返しの2つは8ヌクレオチ
ドモチーフTATTTATTの一部であり、これもその
ような分子の多くに現われる(Caput at a
l、、Proc、Natl、Acad。
ドされた予想ポリペプチドは144個の残基から成る。
配列の第1のATGFiイニシエーターコドンであると
の仮定にもとづいており、この観点は締維細胞中でのe
DNAの有効な発現、ヌクレオチド位置13のアデニン
の存在、イニシェークーATGコドンについての共通配
列との一致でサポートされ:枠内TGA翻訳終了コドン
又はヌクレオチド448−450として起こる。演縛さ
れたP404列上信号はプチドに典型的か疎水性N末端
配列で特徴付けられる。
、N末端残基に関しては若干の不確実性が残る。公知の
プロパビリティ・ウェイト・マトリックス(Von H
e1jne。
683.1986)にもとづくと、最も可能性の高い成
熟タンパク質のN−末端はGin−Arg−Cys・・
・である。これはP40ペプチドで得られた証拠と一致
する。従って成熟P40は予想相対分子質量14,15
0の126個のアミノ酸から成るであろう。
リコジル化部位の存在によって示唆されるグリコジル化
によるとみられ、そしてN−グリカナーゼ処理後の生の
タンパク質の約15 kDaと一致した、Pの配列は4
0システインの存在と、生のタンノ(り質の高いpr
(10)を説明するカチオン性残基の強い優先性で更に
特徴付けられる。
ーン管プローブとして用いてクローン化した。要約する
と、EBV不死化リン、4芽球様細胞系(CESS)か
ら単離し六5au3A−カットDNAを持つλGEMI
Iファージにヒトゲノムライブラリーを構成した。得ら
れたクローン(λT(403A1)をネズミP40cD
NAとの交叉ハイブリッド形成で単離した。
トアセテートで刺戟した末梢血液単核細胞からつくった
ポリ−A”RNAからcDNAライブラリーをつくった
。実施例10記載のヒトケ゛ツムクローンの制限フラグ
メントでライブラリーをスクリーニングした。陽性クロ
ーンの1つは実施例10記載の方法で配列決定し、その
演鐸アミノ酸配列と共にDNA配列を発明の詳細な説明
に示す。配列分析はネズミとヒトのP40アミノ酸配列
配55チ相同であることを示していたつ 実施例12 P2OとII4又はII3との相乗効果P40とII3
又はIt、4の存在下での共培養ヘルパーT細胞の増殖
促進効果を棟肘した。TUCZ15N及びTUC7,4
1細胞(5X10’/ウエル)を最適より低い量のP2
OとII4の最適より低い用量又は最適に近い用量のI
I3と共に又は無しで培養した。培養3口径細胞をトリ
チウム化チミジンでパルスした。表4の結果はP2Oと
II4又はP2OとII、3で処理したヘルツモーT細
胞は他のタンパク質のいずれかで処理した細胞の約4−
40倍多くのチミジンを包含していた。従ってそれらタ
ンパク質に応答するヘルパーT細胞系の増殖促進にP2
OとII4又はII3との間に強い相乗効果が存在する
。
は(5X104/ウエル)最適より低い量のP2Oと、
最適より低い用量のII4又は最適用量のII3と共に
又はそれ無しで培養した。培養を3日後にトリチウム化
チミジンでパルスした。
る長期抗原非依存性T細胞増殖を示すグラフである。T
UC2,15細胞は通常の培地(ロ)、II2で補強し
た培地(20U/m/、■)、またはTU(4158N
f補強した培地(5チη〜、ム)中でフィーダー細胞お
よび抗原なしに増殖する。
1上澄液はBltrogel AcA 54ゲルf過カ
ラム(A)、TSK−フェニル疎水性相互作用カラム(
B)、モノ−Qアニオン交換カラム(C)およびC1逆
相カラム(D)上で頴次にフラクションされる。陰影区
域はP40活性を表わす。
A、67KDa)、天然IL5(45KD&)および組
換え体マウスIL6 (22KDa)である。
である。TSI細胞(3X103細胞/φbHj:精製
P40の増大調剤量の存在下で培養される。3日後に、
細胞数はへキノサミニダーゼ濃度を測定することによっ
て検査される。
を示す。14ネルAは精#P40の銀着色NaDodS
O4/PAGEを示す写真である。この試料は還元性条
件下で操作される。
2Oの自動放射能グラフである。標準物のMrij、K
D&中に与えられる。
る。
示すグラフである。
のアミノ醸系列およびこの系列を得るに使用した種々の
ペプチドを示す。
ロテインナーゼAsp−N’プチド類の分離を示すグラ
フである。
54nmおよび(D)215nmの波長において光ダイ
オード列検知器を使用する図8のHPLCプロフィルの
多重波長プロットを示すグラフである。
る及び(−)によって示す2次スペクトルによるエンド
プロテインナーゼA、5p−NペプチドD1の誘導スペ
クトル分析のグラフである。
Cm−P2OのペプチドのマイクロホーアRP−HPL
Cの分離を示すグラフである。ノミネルAはCrn−P
40エンドプロテインナーゼAsp−N’プチドD3の
ニス・アウレウスv8プロテアーゼ消化からのはプチド
を示す、ノ(ネルBHCm−P40のチモトリプシン消
化を示す。)4ネルCはCm−P2Oのトリプシン消化
からのはプチドを示す。
関連合成はプチドのRP−HPLC上の溶離プロフィル
を示すグラフである。
SKC5C5GXVTSCLCLSVPTDDCS口w
g1rdjny e n 1kddppsk 50 60 70 8
0 90k
kCTTPCYREGLLQLTXATO
KSRLLPVFHRVKRIVEVLKXITCPS
FShrvkrivevlk cekpcxq+ma 6 FIG、7 0 0 0 0 0 0 0 Uテンション時re’l (介9 FIG、8 10 20 30 40 50 リテンンヨンI4間(ケ) 0 0 0 リテンション時間(カラ リテンション時間(→−) FIG、+2 第1頁の続き ■Int el、’ 識別記号 庁内整理番号 0発 明 者 リチャード ジエイ シンプソン オーストラリア 3121 メルボルン ビクトリア
モンド スタンレイ ストリート 42リツチ 手 続 補 正 書 手 続 補 正 書 平成1年12月6日 平成2年1 月13日 特許庁長官 吉 田 文 毅 殿 特許庁長官 吉 田 文 毅 段 1事件の表示 1、事件の表示 平成1年特許願第243287号 平成1年特許願第243287号 事件との関係 特許出願人 事件との関係 特許出願人 4代 理 人 4代 理 人 5補正の対象 願書に添付の手書き明細書の浄書 6、補正の内容 別紙のとおり、但し図面の内容の補正はない。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、ヘルパーT細胞のインターロイキン2−及びインタ
ーロイキン4−非依存性の生育を助けることのできるタ
ンパク質を含有することを特徴とする生物学的に純粋な
哺乳動物のT細胞増殖促進因子。 2、該哺乳動物がネズミまたはヒトである請求項1に記
載のT細胞増殖促進因子。 3、該タンパク質がP40である請求項1に記載のT細
胞増殖促進因子。 4、該P40がグリコプロテインである請求項3に記載
のT細胞増殖促進因子。 5、該P40が単鎖グリコプロテインである請求項4に
記載のT細胞増殖促進因子。 6、該グリコプロテインが約30KDa〜約40KDa
分子量を有する請求項5に記載のT細胞増殖促進因子。 7、該グリコプロテインが約14KDa〜約16KDa
の分子量を有するタンパク質部分を有する請求項6に記
載のT細胞増殖促進因子。 8、該P40が次なるアミノ酸配列を有するネズミP4
0:▲数式、化学式、表等があります▼ である請求項3に記載のT細胞増殖促進因子。 9、該P40が次なるアミノ酸配列を有するネズミP4
0:▲数式、化学式、表等があります▼ である請求項3に記載のT細胞増殖促進因子。 10、該P40が次なるアミノ酸配列を有するヒトP4
0:▲数式、化学式、表等があります▼ である請求項3に記載のT細胞増殖促進因子。 11、該P40が次なるアミノ酸配列を有するヒトP4
0:である請求項3に記載のT細胞増殖促進因子。 12、該タンパク質がIL3−またはIL4−応答性細
胞の増殖を増強することのできる請求項1に記載のT細
胞増殖促進因子。 13、ヘルパーT細胞のインターロイキン2−及びイン
ターロイキン4−非依存性の生育を刺激する活性を有す
る哺乳動物のP40の活性誘導体または活性フラグメン
ト。 14、哺乳動物のP40の単離されたタンパク質分解フ
ラグメント。 15、ヘルパーT細胞カルチャーを抗原またはマイトジ
エンと、ヘルパーT細胞のインターロイキン2−及びイ
ンターロイキン4−非依存性の生育を助けることのでき
る哺乳動物のT細胞増殖促進因子の産生するのを誘導す
るに充分な時間及び条件下接触せしめ、次に該因子を該
カルチャーから回収することからなることを特徴とする
該哺乳動物のT細胞増殖促進因子の製造方法。 16、抗原−またはマイトジエン−刺激されたヘルパー
T細胞セルラインの培養上清を疎水性クロマトグラフィ
ー樹脂と接触せしめ、それからP40活性を有する第1
フラクシヨンを同定回収し、該第1フラクシヨンをイオ
ン交換クロマトグラフィー樹脂と接触せしめ、次にそれ
からP40活性を有する第2フラクシヨンを同定回収し
、次ド該第2フラクシヨンを逆相HPLC樹脂と接触せ
しめ、それから該活性を有するとともに均一なP40で
ある第3フラクシヨンを同定回収することからなること
を特徴とする哺乳動物のP40の精製方法。 17、該疎水性樹脂がTSK−フェニルクロマトグラフ
ィー樹脂であり、該イオン交換樹脂がMono−Qクロ
マトグラフィー樹脂であり、該逆相の樹脂がCl逆相H
PLC樹脂である請求項16に記載の方法。 18、該活性がヘルパーT細胞のインターロイキン2−
及びインターロイキン4−非依存性の生育を刺激するも
のである請求項16に記載の方法。 19、ヘルパー−T細胞を増殖するに充分な時間及び条
件下に、増殖有効量のP40またはその活性誘導体ある
いは活性フラグメントを哺乳動物に投与することからな
ることを特徴とする哺乳動物におけるヘルパー−T細胞
を増殖する方法。 20、IL3−応答性細胞を増殖するに充分な時間及び
条件下に、増殖有効量のIL3及びP40を哺乳動物に
投与することからなることを特徴とする哺乳動物におけ
るIL3−応答性細胞を増殖する方法。 21、IL4−応答性細胞を増殖するに充分な時間及び
条件下に、増殖有効量のIL4及びP40を哺乳動物に
投与することからなることを特徴とする哺乳動物におけ
るIL4−応答性細胞を増殖する方法。 22、該細胞がヘルパーT細胞である請求項20または
21に記載の方法。 23、該哺乳動物がヒトである請求項19、20または
21のうちいずれか一つに記載の方法。 24、該P40、P40誘導体、P40フラグメント、
IL3またはIL4の有効量が約10μg〜約1000
μg/kg体重/日である請求項19、20または21
のうちいずれか一つに記載の方法。 25、該細胞の増殖が、静脈内投与、筋肉内投与、鼻腔
内投与、経皮投与、腹腔内投与、坐剤による投与または
経口投与によつてなされる請求項19、20または21
のうちいずれか一つに記載の方法。 26、P40、その活性誘導体、またはその活性フラグ
メントをコードしている核酸分子を、該核酸が有効量の
上記P40、その誘導体、またはそのフラグメントを発
現を指令している哺乳動物に投与することからなる請求
項12に記載の方法。 27、IL3またはP40をコードしている核酸を、該
核酸が有効量の上記IL3またはP40の発現を指令し
ている哺乳動物に投与することからなる請求項20に記
載の方法。28、IL4またはP40をコードしている
核酸を、該核酸が有効量の上記IL4またはP40を発
現を指令している哺乳動物に投与することからなる請求
項21に記載の方法。29、ヘルパーT細胞の増殖を起
こさしめるに充分な時間及び条件下に増殖有効量のP4
0またはその活性誘導体あるいはその活性フラグメント
を哺乳動物に投与することからなることを特徴とする哺
乳動物における免疫不全症の治療方法。 30、IL3−応答性細胞の増殖を起こさしめるに充分
な時間及び条件下に増殖有効量のIL3及びP40を哺
乳動物に投与することからなることを特徴とする哺乳動
物における免疫不全症の治療方法。 31、IL4−応答性細胞の増殖を起こさしめるに充分
な時間及び条件下に増殖有効量のIL4及びP40を哺
乳動物に投与することからなることを特徴とする哺乳動
物における免疫不全症の治療方法。 32、該細胞がヘルパーT細胞である請求項30または
31に記載の方法。 33、該哺乳動物がヒトである請求項29、30または
31のうちのいずれか一つに記載の方法。 34、該P40、P40誘導体、P40フラグメント、
IL3またはIL4の有効量が約10μg〜約1000
μg/kg体重/日である請求項29、30または31
のうちのいずれか一つに記載の方法。 35、該細胞の増殖が、静脈内投与、筋肉内投与、鼻腔
内投与、経度投与、腹腔内投与、坐剤による投与または
経口投与によつてなされる請求項29、30または31
のうちのいずれか一つに記載の方法。 36、有効成分としてP40、その活性誘導体、その活
性フラグメント、またはその原泉物を含有することを特
徴とする哺乳動物におけるヘルパーT細胞の増殖を誘起
するための医薬組成物。 37、有効成分としてIL3及びP40、またはその原
泉物を含有することを特徴とする哺乳動物におけるIL
3−応答性細胞の増殖を誘起するための医薬組成物。 38、有効成分としてIL4及びP40、またはその原
泉物を含有することを特徴とする哺乳動物におけるIL
4−応答性細胞の増殖を誘起するための医薬組成物。 39、該原泉物が、該P40、そのP40誘導体、その
P40フラグメント、該IL3または該IL4をコード
する核酸である請求項36、37または38のうちのい
ずれか一つに記載の医薬組成物。 40、該P40、そのP40誘導体、そのP40フラグ
メント、該IL3または該IL4の有効量が、約10μ
g〜約1000μg/kg体重/日である請求項36、
37または38のうちのいずれか一つに記載の医薬組成
物。 41、請求項1〜12のうちのいずれか一つに記載のT
細胞増殖促進因子に対する抗体。42、該哺乳動物のP
40がネズミP40またはヒトP40である請求項41
に記載の抗体。 43、哺乳動物P40、その抗原性の誘導体またはその
抗原性のフラグメントに対する抗体。 44、該抗体がポリクローナル抗体またはモノクローナ
ル抗体である請求項43に記載の抗体。 45、該哺乳動物のP40がネズミP40またはヒトP
40である請求項44に記載の抗体。 46、哺乳動物の組織、その組織抽出物またはその血清
と請求項41に記載の抗体とをP40−抗体複合体が形
成されるに充分な時間接触させ、次に該P40−抗体複
合体を検知手段にかけることからなることを特徴とする
哺乳動物の組織、その組織抽出物またはその血清中のP
40の検知法。 47、哺乳動物の組織、その組織抽出物またはその血清
と請求項43に記載の抗体とを、P40−抗体複合体が
形成されるに充分な時間接触させ、次に該P40−抗体
複合体を検知手段にかけることからなることを特徴とす
る哺乳動物の組織、その組織抽出物またはその血清中の
P40の検知法。 48、哺乳動物のP40、その誘導体、またはそのフラ
グメントをコードしている単離された核酸。 49、該核酸が該P40またはその誘導体のRNA、m
RNA、cDNA、組換えDNA、またはcDNAまた
はゲノムクローンをコードしている組換えDNAである
請求項48に記載の核酸。 50、該哺乳動物がネズミまたはヒトである請求項48
に記載の核酸。 51、該cDNAがネズミP40をコードする次なるヌ
クレオチド配列: ▲数式、化学式、表等があります▼ を含むものである請求項49に記載の核酸。 52、該cDNAが、ヒトP40をコードする次なるヌ
クレオチド配列: %しき% を含むものである請求項49に記載の核酸。 53、次なる配列: ▲数式、化学式、表等があります▼ を含有するネズミP40のアミノ酸配列をコードするヌ
クレオチド配列を持つ核酸。 54、次なる配列 ▲数式、化学式、表等があります▼ を含有するネズミP40のアミノ酸配列をコードするヌ
クレオチド配列を持つ核酸。 55、次なる配列: ▲数式、化学式、表等があります▼ を含有するヒトP40のアミノ酸配列をコードするヌク
レオチド配列を持つ核酸。 56、次なる配列: ▲数式、化学式、表等があります▼ を含有するヒトP40のアミノ酸配列をコードするヌク
レオチド配列を持つ核酸。 57、ネズミP40のゲノム遺伝子をコードする単離さ
れた核酸。 58、ヒトP40のゲノム遺伝子をコードする単離され
た核酸。 59、請求項48〜58のいずれか一つに記載の核酸が
、該核酸の発現を起こさせることのできるヌクレオチド
配列に操作可能に結合せしめられているものである該核
酸を含有する複製可能な発現ベクター。 60、該ベクターは原核細胞あるいは真核細胞において
複製することができるものである請求項59に記載のベ
クター。 61、請求項48〜58のいずれか一つに記載の核酸に
より形質転換された微生物または細胞。 62、請求項59に記載のベクターにより形質転換され
た微生物または細胞。 63、組換え哺乳動物P40、その誘導体またはそのフ
ラグメント。 64、該P40が生物学的に純粋なものである請求項6
3に記載の組換えP40。 65、該哺乳動物がネスミまたはヒトである請求項63
に記載のP40。 66、請求項59に記載のベクターから産生された組換
えP40。 67、哺乳動物のP40、その抗原性誘導体またはその
抗原性フラグメントに対する抗体を含有するように適合
された第1の容器及び上記第一抗体と上記P40、その
誘導体またはそのフラグメントとの抗体−抗原複合体を
検知することができ、そして標識分子で標識され、検知
可能なシグナルを与えることができる第2抗体を含有す
るように適合された第2の容器からなるP40を検知す
るための受容に適合された区画化されたキット。 68、該標識分子がラジオアイソトープ、酵素、螢光分
子、化学発光分子または生物発光分子である請求項67
に記載のキット。 69、該標識分子が酵素である請求項67に記載のキッ
ト。 70、該キットがさらに酵素に対する基質を含有するの
に適した第3の容器を含有している請求項69に記載の
キット。
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