PT91750B - Processo para a preparacao de factor de crescimento de celulas t auxiliares - Google Patents
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Description
-3-
CAMPO DO INVENTO O presente invento está relacionado de um modo geral com um factor de crescimento de células T. Mais particularmente, o presente invento está relacionado com um factor de crescimento de células T de mamíferos que é uma glicoproteína capaz de suportar o crescimento de células T--auxiliares independente de interleucina 2 e de interleucina 4. Este factor é ainda capaz de aumentar a proliferação de células que respondem a IL3 e IL4. Ainda mais particularmente o presente invento relaciona-se com o factor de crescimento de células T auxiliares, P40, suas composições farmacêuticas e anticorpos contra ele. 0 presente invento também contempla um método para induzir a proliferação de células T auxiliares assim como de células que respondem a IL3 e IL4. O factor de crescimento de células T auxiliares aqui contemplado é útil para a estimulação de células específicas no sistema imune.
FUNDAMENTO DO INVENTO
Muitas citocinas são polipeptídeos que directa ou inderectamente medeiam os mecanismos de defesa do hospedeiro e/ou que medeiam a diferenciação do crescimento de tecidos. Têm sido encontrados citocinas que medeiam a defesa do hospedeiro contra o cancro e/ou infecção. Tais citocinas incluem os interferões (IFN-¢(,, IFN-e IFN- γ ) , factor de necrose tumoral (TNF-c^ ), linfotoxina (TNF-£), as interleucinas (ILl, 2, 3, 4, 5 e 6), leucorregulina factor citotóxico das células assassinas naturais (NKCF), factor de crescimento trans formante (TGF), factores estimuladores de colónias (CSF) tais como CSF de macrófagos (M-CSF), de granulócitos (G-CSF) e de -4- macrofagos granulócitos (G,M-CSF) e oncostatina M. Cada uma das citocinas atrás referidas tem características únicas e uma gama única de actividade anti-proliferativas, citostática, antiviral ou reguladora do crescimento. Várias citocinas são sintetizadas por leucócitos, normalmente em resposta à estimulação por mi-croorganismos, antigénios ou mitogénios. Isto tem sido observado iji vitro. Após esta estimulação em culturas celulares, o líquido sobrenadante é recuperado e a actividade de citocina identificada, isolada e ainda caracterizada. Nos últimos anos, tornou-se cada vez mais claro que a IL2 não é o único factor que controla o crescimento de células T. De facto, várias citocinas, incluindo IL4 (Fernandez-Botran e_t a_l. , Proc. Natl. Acad. Sei, USA, 83: 9689-9693, 1986; Lichtman et a_l. , Proc. Natl, Acad. Sei. USA, 84: 4293-4297, 1897), G,M-CSF (Woods et al , J. Immunol , 138: 4293-4297, 1987; Kupper et^ , J. Immu-nol, 138: 4293-4297; Kupper et al., J. Immunol., 138: 4288--4292, 1987) e num sistema humano, a combinação de IL1 e IL6 (Houssiau et a^. , Eur. J. Immunol., 18: 653-656, 1988), encontrou-se agora que induzem proliferações de células T independentes de IL2. Consequentemente, a regulação do crescimento de células T é mais complexo do que originalmente se pensava, se bem que IL2' seja um factor de crescimento de células T potente e largamente activo. A célula T auxiliar (T„) é uma Π subsérie importante das células T. Pelo menos dois tipos de células T auxiliares foram identificadas com base em critérios funcionais. Um tipo de células (T^l) auxilia as células B de um modo ligado e específico de antigénio e é necessária na fase inicial da resposta. Um outro tipo de (T^2) auxilia as células B de um modo não ligado e é necessário na fase tardia da resposta. Vários anos atrás obteve-se uma colecção de linhas de células T auxiliares a partir de módulos -5- linfáticos de ratinhos sensibilizados com antigénio usando o processo descrito por lorradin e_t . , J. Immunol. 119: 1048--1053, 1977. Estas linhas celulares foram iniciadas pela cultura na presença de antigénio e foram subsequentemente mantidas sem adição de factores de crescimento exógenos, através do fornecimento regular de antigénio e de células apresentadoras de antigénio de baço irradiado. A maior parte destas células produz grandes quantidades de IL3, IL4, IL5 e IL6 mas nenhuns IL2 e portanto pertencem ao tipo T^2 definido por Mosmann et al_. , J. Immunol. 136: 2348-2357, 1986.
De acordo com o presente invento, surpreendentemente, descobriu-se que dois clones derivados das linhas celulares atrás referidas proliferaram em resposta ao seu próprio meio condicionado na ausência de antigénio e de células de suporte do crescimento. O presente invento está relacionado com um factor de crescimento de células T distinto de outras citocinas conhecidas. O novo factor de crescimento é útili como composto terapêutico para estimular a proliferação de células T auxiliares. sumario do invento O presente invento é dirigido a um factor de crescimento de células T de mamífero que suporta o crescimento de células T auxiliares indepente de interleuci-na 2 e de interleucina 4 e de preferência obtido a partir de fontes de ratinho ou humanas.
Mais particularmente, este factor de crescimento de células T é uma proteína tendo as caracte-rísticas identificáveis de P40, seus derivados ou fragmentos -6- e ainda a capacidade de aumentar a proliferação de células que respondem a IL3 e IL4. São também proporcionados métodos para o isolamento de P40 e seus derivados e fragmentos.
Um outro aspecto do presente invento está relacionado com uma composição farmacêutica compreendendo numa quantidade eficaz de P40, um seu derivado ou fragmento e um veículo farmacêuticamente aceitável útili na estimulação de células específicas no sistema imune. Facultativamente, estas composições podem também conter IL3 ou IL4.
Ainda num outro aspecto o presente invento relaciona-se com anticorpos específicos de P40, de um seu derivado antigénio ou de um fragmento antigénio úteis em ensaios de diagnóstico de P40.
Ainda um outro aspecto do presente invento está relacionado com uma molécula de DNA recombinan-te e vectores de expressão codificadores da fracção polipeptí-dica de P40 de mamífero, de um seu derivado ou fragmentos, proporcionando assim uma fonte adequada de P40 recombinante.
Ainda um outro aspecto do presente invento contempla um método de proliferação de células T auxiliares que se caracteriza pela incubação das referidas células com uma quantidade de P40 ou de um seu derivado, eficaz para a proliferação, durante o tempo e em condições adequadas para as referidas células proliferarem.
Um outro aspecto deste invento está ainda relacionado com um método de proliferação de células que respondem a IL3 e IL4 através da administração de uma combinação de P40 e IL3 ou IL4 a um mamífero, especialmente um ser humano, durante um tempo e em condições suficientes para estimular a poliferação das referidas células. -7-
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
Fig. 1 é uma representação gráfica descrevendo o crescimento a longo termo de células T independente de antigénio induzido pelo sobrenadante (SN) ou células T auxiliares. As células TUC2.15 foram cultivadas sem células de suporte do crescimento e sem antigénio em meio normal (D), em meio suplementado com IL2 (20 U/ml, ) ou com SN de TUC2.15 (5% v/v,A ).
Fig. 2 é uma representação gráfica descrevendo a purificação de P40. O sobrenadante de TUC7.15 foi fraccionado sequenciadamente numa coluna de filtração em gel Ultragel ACA54 (A), numa coluna de interacção hidrofóbica TSK-Phenyl (B), numa coluna de permuta aniónicos Mono-Q (C) e numa coluna de fase reversa (D). A área a sombreado representa actividade de P40. Os protões de peso molecular apresentados no painel A são albumina do soro bovino (BSA, 67kDa), IL5 natural (45 kDa) e recombinante de ratinho (22 kDa).
Fig. 3 é uma representação gráfica descrevendo actividade de factor de crescimento de P40 pu- 3 rificada. Células TS1 (3 x 10 células/cavidade) foram cultivadas na presença de doses crescentes de P40 purificado. Após 3 dias, o número de células foi avaliado através de medição dos níveis de hexosaminidase.
Fig. 4 ilustra a pureza de P40 e o seu grau de glicosilação. O painel A é uma fotografia mostrando NaDodSO^/PAGE de P40 purificado corado com prata. A amostra migrou em condições redutoras. O painel S é uma autor-125 radiografia de I-P40 tratado com varias glicosilases. A Mr dos pedrões é dada em kDa.
Fig. 5 é uma ilustração gráfica da estratégia de sequenciação do gene de P40 de ratinho. -8-
Fig. 6 é uma ilustração gráfica de expressão de P40 recombinente em fibroblastos.
Fig. 7 mostra a sequência de amino-ácidos de P40 de ratinho obtido por sequenciação química e os vários peptídeos usados na obtenção desta sequência.
Fig. 8 é uma ilustração gráfica da separação dos peptídeos obtidos com endoproteínase Asp-N de Cm-P40 por RP-HPLC.
Fig. 9 é uma ilustração gráfica do perfil de HPLC da Fig. 8 em função de vários comprimentos de onda usando um detector com um arranjo de fotodíodos em comprimentos de onda de (A) 290 nm, (B) 280 nm, (C) 254 nm e (D) 215 nm.
Fig.10 é uma ilustração gráfica de uma análise espectral derivada do peptídeo Dl obtido em endoproteínase Asp-N com o espectro de ordem zero indicado por (---) e o espectro de segunda ordem indicado por (_).
Fig. 11 é uma ilustração gráfica da separação por PP-HPLC em microboro dos peptídeos de Cm-P40 obtidos por digestão com várias proteases. O painel A mostra os peptídeos da digestão com protease V8 de S_. aureus do peptídeo D3 de Cm-P40 tratado com endoproteínase Asp-N. O painel B mostra os peptídeos de uma digestão de Cm-P40 com quimotrip-sina. 0 painel C mostra os peptídeos de uma digestão de Cm--P40 com tripsina.
Fig. 12 é uma ilustração gráfica do perfil de eluição do peptídeo Dl amino-terminal bloqueado e peptídeos sintéticos relacionados em RP-HPLC. Z indica ácido piroglutâmico. -9-
DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO O presente invento está relacionado com um factor de crescimento de células T de mamífero o qual compreende uma proteína que suporta, ou é capaz de suportar, o crescimento de células T auxiliares independente ou interleucina 2 (IL2) e de interleucina 4 (IL4) na ausência de antigénio. De acordo com o presente invento e usando os métodos aqui incluídos, o referido factor de crescimento de células T está relacionado e biologicamente puro. Por biologicamente puro entende-se uma composição compreendendo o referido factor de crescimento de células T. A composição pode compreender factor de crescimento de células T homogéneo ou pode consistir essencialmente em factor de crescimento de células T. Conforme usado na especificação e reivindicações apensas, suporte do crescimento de células T auxiliares independente de IL2 e independente de IL4 refere-se à capacidade das referidas células proliferarem na ausência de IL2 e/ou IL4. Estas características distingue o presente invento do factor de crescimento de outros presentemente conhecidos. De acordo com o presente invento, esta capacidade é devida a um novo factor de crescimento de células T até agora desconhecido. Daqui em diante o referido factor de crescimento é referido como P40. Conforme aqui definido derivados de P40 incluem substituições deleções e/ou inserções de aminoácidos sintéticos e naturais como é obvio para o familiarizado com a matéria. Por exemplo, deleções de aminoácidos não essenciais, i.e., deleções de aminoácidos que não afectam a actividade de P40 são conseguidas por meio de engenharia genética.
Ainda, fragmentos de P40 são contemplados pelo presente invento. Estes fragmentos são peptí-deos obtidos a partir da proteína P40 e podem ser preparados por proteólise de P40 purificado. Os peptídeos são purificados por meios convencionais tais como cromatografia em HPLC e similares e são úteis na determinação da sequência de ami- -10- noácidos de P40 ao preparar-se anticorpos contra domínios específicos de P40 e na identificação de domínios de P40 envolvidos na estimulação do crescimento de células T.
Um derivado antigénico de P40 é definido como sendo uma fracção de P40 que é capaz de reagir com um anticorpo específico de P40. Todos estes derivados são englobados pelo presente invento.
Assim, P40 é uma proteína, e mais particularmente, uma glicoproteína, capaz de suportar o crescimento a longo-termo de linhas de células T auxiliares independente de IL2 e independente IL-4 na ausência de antigénio e é isolada a partir de linhas de células T auxiliares, especialmente linhas de mamíferos como sejam linhas de células T auxiliares humanas e de ratinho. P40 é funcionalmente distinta de outras interleucinas e factores estimuladores de colónias conhecidas. P40 é purificada a partir do sobrenadante (SN) de linhas de células T auxiliares de ratinho estimuladas com lectinas desde uma actividade especifica de cerca de 10U/ 10 8 mg até cerca de 10 U/mg, mas geralmente até cerca de 10 U/mg e caracterizado como uma proteína básica (pi 10 para P40 de ratinho) de cadeia única com uma Mr entre cerca de 30 e cerca de 40 kDa. P40 pode ser purificada a partir do fluido sobrenadante de clones (TUC2,15 e TUC7,51)de células T auxiliares de ratinho estimuladas com antigénio. Resumidamente, o fluido sobrenadante foi concentrado e aplicado a uma coluna de cromatografia de TSK-Phenyl. As fracções com actividade de factor de crescimento em células TS1 dependentes de factores foram reunidas, depois fraccionadas numa coluna de cromatografia Mono-Q e as fracções activas resultantes foram aplicadas a uma coluna de HPLC de fase inversa Cl. P40 puro de ratinho foi eluido numa concentração de aproximadamen-te 35% de acetonitrilo. -11-
Duas observações indicam que P40 é uma glicoproteína: (i) o seu padrão de migração heterogéneo em NaDodSO^/PAGE e (ii) a sua ligação a lectina de lentilhas, o que aponta para a presença de cadeias laterais de açúcar N-ligado. Consistente com esta observação, uma série de potenciais sítios de N-glicosilação (motivo Asn-X-Tre) foi identificado na determinação da sequencia proteica. Ainda, mais evidência de glicosilação extensiva da molécula foi obtida em experiências com tratamento com N-glicanase, a qual reduz a Mr de P40 para cerca de 15kDa. P40 é uma molécula estável cuja actividade biológica não é alterada após exposição a NaDodSO^, pH ácido ou acetonitrilo. Pelo contrário a sua actividade é destruída por 2-mercaptoetanol, o que sugere que as fontes dissulfureto intramoleculares desempenhem um papel importante na manutenção de um enrolamento adequado da molécula. P40 também distingue-se das proteínas conhecidas com base na sua sequência de aminoácidos completa. A sequência do DNA e de aminoácidos de P40 de ratinho e de P40 humano são aqui descritas e indicam que as duras proteínas têm 55% de homolo-gia.
Além das características estruturais distintas atrás descritas para P40 este também difere de IL2 em termos de função. P40 é totalmente inactivo em clones de células T citolíticas nas condições em que a sua resposta à IL2 é muito forte; pelo contrário IL2 não suporta o crescimento a longo termo independentemente de antigénio das linhas de células T auxiliares, enquanto que P40 é muito activo neste sistema. Até agora, o crescimento a longo termo de células auxiliares em resposta a P40 significa mais de dois meses e pode ser indefinido. Ao contrário destas diferenças, observou--se uma correlação entre a sensibilidade das linhas de células T auxiliares a P40 e a IL4, indicando que a activação de células T por estas duas moléculas é regulada de modo idêntico. No entanto, a gama de actividades de IL4, que também estimula o crescimento de uma variedade de linhas celulares dependentes de IL3 e de células T citolíticas (Mosmann et al., Proc. -12-
Natl. Acad. Sei. USA, 83: 5654-5658, 1986; Widmer et al., Nature, 326; 795-798, (1987) é mais largo do que a de P40, indicando que a sobreposição funcional entre os dois facto-res, IL4 e P40, é apenas parcial.
Uma outra vantagem do presente factor de crescimento de células T, P40, é a supreendente descoberto de P40 ser específico de linhas de células T auxiliares. Isto indica a existência de um mecanismo estimulador do crescimento restringido à sub-série de células T auxiliares. Tal mecanismo é importante na manutenção de equilíbrio entre o fornecimento de produtos de células T auxiliares tal como IL2 e IL4 e o aumento do seu consumo por outros linfócitos activados no decurso da resposta imune.
Ao investigar-se a gama de acti-vidade de P40, descobriu-se surpreendentemente que P40 aumenta a proliferação de células que respondem a IL3 ou a IL4 de modo sinergístico. Conforme aqui é usado, células que respondem a IL3 e a IL4 são células do sistema imune que proliferam em resposta a IL3 ou IL4/respectivamente. Estas células podem incluir células dependentes de IL3 ou células dependentes de IL4 mas não lhes estão limitadas. As células que respondem a IL3 incluem células T auxiliares, mastócitos, células mãe, eosionófilos, neitrófilos, monócitos , megacariócitos, basó-filos e células eritropóides. As células que respondem a IL-4 incluem células T auxiliares, células T citotóxicas activadas, macrófagos, mastócitos e células B (Smith, K.A., Biotechnolo-2^ 2: 661-667, 1989).
Existe portanto um forte sinergis-mo relativamente do crescimento de células estimuladas com P40 e IL3 ou P40 e IL4. Num ensaio de incorporação de timidi-na que mede a proliferação celular, a combinação de citocinas P40 e IL3 ou P40 e IL4, pode estimular a incorporação de ti-midina por um factor de varia de aproximadamente 4 até 40 acima do efeito estimulador de qualquer uma das citocinas. Em ge- -13-
ral, o sinergismo entre P40 e IL3 ou P40 e IL4, é dependente de dosagem e dependente da linha celular. Para estas proteínas e para uma determinada linha celular, as doses sub-ópti-mas de P40 variam entre cerca de 1-25% das doses óptimas de P40, as doses sub-óptimas de IL4 variam entre cerca de 5-30% das doses óptimas de IL-4 e perto das doses óptimas de de IL3 variam entre 70-100% das doses óptimas de IL3. Este sinergismo proporciona um outro método para estimular a proliferação de células que respondem a IL3 e a IL4, especialmente células T auxiliares e é terapêuticamente útilino tratamento de deficiências imunes, especialmente as doenças ou condições patológicas que beneficiam da proliferação de células imunes específicas tais como AIDS ou mesmo da proliferação generalizada de células imunes.
Está dentro do âmbito do presente invento incluir P40 biologicamente puro além das suas composições homogéneas e heterogéneas. Assim, de acordo com o presente invento, o sobrenadante (SN) de uma linha de células T auxiliares não requerendo antigénio ou células de suporte contem P40. Este SN é capaz de induzir a proliferação celular sem qualquer necessidade adicional de antigénio ou células de suporte. Conforme descrito no Exemplo 1, a actividade de pro-lifaração não é inibida por anticorpos anti-receptores de IL4 ou de IL2, indicando que a referida actividade não é mediada directa ou indirectamente por estas moléculas. O ingrediente activo no SN atrás referido mostrou-se ser de acordo com o presente invento, P40. O SN é activo nas células testadas, TS1, induzidas em metade da proliferação máxima em diluições —6 —2 que variam entre cerca de 10 e cerca de 10 (v/v) e geral- -5 -4 mente variando entre cerca de 10 e cerca de 10 (v/v).
Assim, de acordo com o presente invento, o nosso factor de crescimento de células T, P40, é activo na forma biologicamente pura e em composição homogéneas e heterogéneas. Conforme aqui exemplificado, o fluído SN é uma forma de composição heterogénea de P40. As composições homogéneas são aqui exemplificadas para incluir composições farmacêuticas contendo -14-
preferações homogéneas de P40, seus derivados ou fragmentos activos e similares. 0 factor de crescimento de células T, P40 , está aqui considerado como sendo útil na estimulação da proliferação de células T auxiliares em mamíferos. Numa realização preferida, P40 é particularmente útil na estimulação de certas sub-séries de células T auxiliares em mamíferos. Assim, P40 é um composto terapêutico novo e útil capaz de estimular células especificas dentro das células imunes. Por exemplo, isto é particularmente importante para pacientes humanos portadores de defeitos em certas sub-séries de células T auxiliares como pode ser o caso com vários pacientes tendo AIDS ou pacientes imunocomprometidos. Deverá notar-se também que de entre as muitas vantagens do presente invento, a proliferação de células T auxiliares por P40 terá o efeito adicional de permitir a produção de quantidades crescentes de outras citocinas. Assim, o presente invento também contempla um método de tratamento de deficiência imune compreendendo a administração de uma quantidade eficaz na proliferação de P40, um seu derivado activo ou um seu fragmento, durante um período de tempo e em condições suficientes para efectuar a proliferação de células T auxiliares. De acordo com o presente invento, o tempo necessário para a proliferação de células T auxiliares varia entre cerca de dois dias e cerca de sete dias.
Deste modo, o presente invento inclui um método para a indução e manutenção da proliferação de células T auxiliares, e de preferência certas sub-séries delas, num mamífero, o qual se caracteriza pela administração ao referido mamífero de uma quantidade eficaz para a proliferação de uma composição farmacêutica contendo P40, um seu derivado activo ou um seu fragmento, durante um tempo e em condições suficientes para as referidas células proliferarem.
Em adição, neste invento está englobado um método para a indução e manutenção da proliferação de células T auxiliares e -15- de preferência determinadas sub-séries delas, num mamífero, no qual uma molécula de ácido nucleico codificadora de P40 é introduzida numa célula T de modo a que a referida molécula de ácido nucleico seja expressa intracelularmente, mas extra-cromossómicamente relativamente à superfície da referida célula ou após integração no genoma da referida célula. Neste caso, a molécula de ácido nucleico é levada para a referida célula T e transferida para a referida célula por uma segunda molécula de ácido nucleico (e.g., vários vírus). A primeira molécula de ácido nucleico é manipulada de modo a conter os mais adequados para a expressão. Ou seja de acordo com o presente invento é considerado um método para a proliferação de células T auxiliares num mamífero compreendendo a administração de uma primeira molécula de ácido nucleico codificadora de P40, a referida molécula de ácido nucleico estando contida numa segunda molécula de ácido nucleico veículo farmacêuticamente aceitável de modo a que a referida primeira molécula de ácido nucleico entre uma célula T e seja mantida extracromos-sómicamente ou se integre no genoma da referida célula alvo de modo a que a referida primeira molécula de ácido nucleico seja expressa para produzir uma quantidade eficaz de P40. Por molécula de ácido nucleico pretende-se significar a sequência de nucleotídeo que codifica, directa ou indirectamente P40 ou um seu derivado. Uma molécula de ácido nucleico éaqui definida para significar RNA ou DNA.
Os ingredientes activos de uma composição farmacêutica contendo P40 são englobados para representarem actividade terapêutica excelente e eficaz, por exemplo, no tratamento de doenças de mamíferos imunocomprome-tidos. Assim os ingredientes activos das composições terapêuticas contendo P40 apresentam actividade estimuladora de proliferação de células T quando administrados em quantidades terapêuticas dependente da doença particular. Por exemplo podem ser administrados entre cerca de 0,5 ug e cerca de 2000 mg por quilograma de peso de corpo por dia. O regime de dosagem pode ser ajustado para proporcionar uma resposta terapêutica -16- óptima. Por exemplo, várias doses divididas podem ser admini£ tradas diáriamente ou a dose pode ser proporcionalmente reduzida conforme indicado pelas exigências da situação terapêutica. Uma vantagem prática decisiva é que o composto activo seja administrado de modo conveniente como seja simplesmente pelas vias oral, intravenosa (quando solúvel em água), intramuscular, subcutânea, intranasal, intradérmica ou por supositórios. Dependendo da via de administração, os ingredientes activos que contêm P40 podem ter necessariamente de ser revestidos com um material para proteger os referidos ingredientes da acção de enzimas, ácidos e outras condições naturais que possam inactivar os referidos ingredientes. Por exemplo, a baixa lipofilicidade de P40 pode permitir que seja destruída no trato gastrointestinal por enzimas capazes de clivar ligações peptídicas e no estômago por hidrólise ácida. Para administrar P40 por outras vias além da parentérica, P40 deverá ser revestido com um material que existe ou evite a sua inac-tivação ou administração com èle. Por exemplo, P40 pode ser administrado num adjuvante, coadministrado com inibidores de enzimas ou em lipossomas. Os adjuvantes aqui contemplados incluem resorcinóis, tensioactivos não iónicos tais como éter de polioxietileno-oleílo e éter de n-hexadecil-polietileno.
Os inibidores de enzimas incluem inibidor da tripsina pancreá-tica, diisopropilfluorofosfato (DFP) e trasilol. Os lipossomas incluem emulsões de P40 em água em óleo em água assim como lipossomas convencionais.
Os compostos activos podem também ser administrados parentéricamente ou intraperitonealmente.
As dispersões podem também ser preparadas em glicerol, poli-etilenoglicóis líquidos e suas misturas e em óleos. Em condições normais de armazenamento e utilização estas preparações contêm um preservativo para evitar o crescimento de microor-ganismos.
As formas farmacêuticas adequadas a injecção incluem soluções aquosas estéreis (quando solúveis em água) ou dispersões e pos estereis para a preparaçao extemporânea de soluções ou dispersões injectáveis estéreis.
Em todos os casos a forma deve estar estéril e deve estar fluída até ao ponto que exista seringabilidade fácil. Ela deve ser estável nas condições de fabrico e armazenamento e deve ser preservada contra a acção contaminante de microorga-nismos tais como bactérias e fungos. O veículo pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo glicerol, propilenoglicol polie-tilenoglicol líquido e similares) suas misturas adequadas e óleos vegetais. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, através da utilização de um revestimento tal como leati-na, através da manutenção do tamanho de partículas necessário no caso da dispersão e através do uso de tensioactivos. A prevenção da acção de microorganismos pode ser efectuada através de vários agentes antibacterianos e antifungicos, por exemplo parabenos clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal e similares. Em muitos casos será preferível incluir agentes iso-tócnicos, por exemplo, açucares ou cloreto de sódio. A absorção prolongada das composições injectáveis pode ser levada a efeito através da utilização nas composições de agentes que retardem a absorção, por exemplo monostearato de alumínio e gelatina.
As soluções injectáveis estéreis são preparadas através da incorporação de compostos activos na quantidade necessária no solvente adequado com vários outros ingredientes enumerados atrás, conforme necessário, seguido de esterificação por filtração. Geralmente as dispersões são preparadas através da incorporação de vários ingredientes activos esterilizados num veículo estéril que contenha o meio básico de dispersão e os outros ingredientes necessários de entre os enumerados atrás. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injectáveis estéreis, os métodos preferidos de preparação são a técnica de secagem sob vácuo e de lio- filização que dão um pó do ingrediente activo mais qualquer ingrediente adicional pretendido da sua solução préviamente -18- esterilizada por filtração.
Quando P40 é adequadamente protegido como descrito atrás, o composto activo pode ser administrado oralmente, por exemplo, com um diluente inerte ou com um veículo comestível assimilável pode ser encerrado dentro de cápsulas de gelatina duras ou moles ou pode ser comprimido em comprimidos ou pode ser incorporado directamente com os alimentos da dieta. Para administração terapêutica oral, o composto activo pode ser incorporado com excipientes e usado na forma de comprimidos ingeríveis, comprimidos bucais, pastilhas ,,cápsulas, elixires, suspensões, xaropes, bolachas e similares. Tais composições e preparações deverão conter pelo menos 1% do composto activo. A percentagem das composições e preparações pode, certamente, ser variada e pode adequadamente estar entre cerca de 5 e cerca de 80% do peso da unidade. A quantidade de composto activo em tais composições terapêuticamente úteis é de modo a obter-se uma dosagem adequada. As composições ou preparações preferidas de acordo com o presente invento são preparadas de modo a que uma unidade de dosagem oral contenha entre cerca de 10 ug e 1000 ug do composto activo.
Os comprimidos, pastilhas, pílulas, cápsulas e similares podem também conter o seguinte: um ligan-te como seja goma tragacanta, acácia, amido de milho ou gelatina; excipiente tais como fosfato dicálcio; um agente desin-tegrante como seja amido de milho, amido de batata, ácido al-gínico e similares; um lubrificante como seja estearato demag-nésio; e um agente edulcorante como seja sacarose, lactose, ou sacarina pode ser adicionado ou um agente aromatizante como seja hortelã pimenta, óleo de pírola ou aroma de cereja. Quando a forma de dosagem unitária é uma cápsula, ela pode conter, além dos materiàis do tipo atrás descrito, um veículo liquido. Vários outros materiais podem estar presentes como revestimentos ou mesmo para modificar a forma física da unidade de dosagem. Por exemplo, comprimidos, pílulas ou cápsulas podem ser -19- revestidos com goma-laca, açúcar ou ambos. Um xarope ou elixir pode conter o composto activo, sacarose como agente adul-corante, metil e propilparabenos como preservativos, um corante e aromatizante como seja o aroma de cereja ou de laranja. Certamente, qualquer material usado na preparação de qualquer forma de dosagem unitária deverá ser farmacêuticamente puro e substancialmente não tóxico nas quantidades empregues. Em adição, o composto activo pode ser incorporado em preparações e formulações de libertação prolongada. É especialmente vantajoso formular composições parenterais na forma de dosagem unitária para facilidade de administração e uniformidade de dosagem. A forma de dosagem unitária como aqui é usado refere-se a unidades fisicamente discretas adequadas como dosagens unitárias para os mamíferos serem tratados; cada unidade contendo uma quantidade predeterminante de material activo calculado para produzir o efeito terapêutico pretendido me associação com o veículo farmacêutico necessário. A especificação para as novas formas de dosagem unitária do invento são ditadas e directa-mente dependentes de (a) características únicas do material activo e efeito terapêutico particular a ser conseguido e (b) limitação inerentes ao modo de fazer formulações com tal material activo para o tratamento de doenças em seres vivos tendo uma doença em que a saúde do corpo está ameaçada conforme aqui descrito detalhadamente. 0 principal ingrediente activo é formulado para administração conveniente e eficaz em quantidades eficazes com um veículo adequado farmacêuticamente aceitável na forma de dosagem unitária conforme aqui divulgado atrás. Uma forma de dosagem unitária pode, por exemplo, conter o principal composto activo em quantidades que variam de 0,5 ug até cerca de 2000 mg. Expresso em proporções, o composto activo está geralmente presente entre cerca de 10 ug e cerca de 2000 mg/ml de veículo. No caso de composições contendo ingredientes activos suplementares, as dosagens são determina- -20- das por referência a dose é modo habituais de administração dos referidos ingredientes.
Conforme aqui usado "veículo farmacêuticamente aceitável" inclui todos os solventes meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifungi-cidas, agentes isotónicos e que retardam a absorção e similares. A utilização de tais meios e agentes para substâncias farmacêuticas activas é bem conhecidas. Constitui excepção a utilização de qualquer meio ou agente convencional que seja incompatível com o ingrediente activo nas composições terapêuticas. Nas composições podem ser também incorporados ingredieri tes activos suplementares.
Um outro aspecto deste invento contempla o uso de P40 com IL3 ou IL4 num método para estimular a proliferação de células que respondam a IL3 ou IL4 e um método de tratamento de imunodeficiência. Tais métodos são realizados de acordo com os métodos terapêuticos que envolvem apenas P40 e como aqui descrito, De modo semelhante, são proporcionadas composições farmacêuticas contendo P40 e IL3 ou P40 e IL4 de acordo com as que contêm apenas P40. Ainda em relação a isto IL3 e IL4 podem ser adquiridas comercialmente e usadas em quantidades terapêuticamente eficazes. As quantidades terapêuticamente eficazes de P40 quando usadas em conjunção com IL3 ou IL4 são as mesmas usadas com P40 sozinho.
De modo idêntico as quantidades farmacêuticamente activas de IL3 ou IL4 podem ser semelhantes às de P40 sozinho. As composições preferidas de P40 e IL3 de acordo com o presente invento são preparadas de modo a que uma forma de dosagem unitária contenha cada uma das proteínas numa quantidade que varia entre cerca de 0,5 ug e cerca de 2000 mg. As composições preferidas de P40 e IL4 são igualmente preparadas de modo a que uma forma de dosagem unitária contenha cada uma das proteínas numa quantidade que varia entre cerca de 0,5 ug e cerca de 2000 mg. Nestas composições, a quantidade relativa de P40 para IL3 ou IL4 pode variar ou ser a mesma. -21- O presente invento também está relacionado com anticorpos contra P40 , seus derivados ou fragmentos. Tais anticorpos são considerados úteis no desenvolvimento de ensaios de detecção (imunoensaios) para P40, especialmente durante o controle do regime terapêutico e na purificação de P40. Os anticorpos podem ser monoclonais ou policlo-nais. Em adição, está dentro do âmbito deste invento incluir quaisquer segundos anticorpos (monoclonais ou policlonais) dirigidos contra os primeiros anticorpos descritos atrás. O presente invento contempla ainda a utilização destes segundos anticorpos em ensaios de detecção e, por exemplo, no controle do efeito de uma preparação farmacêutica administrada. Ainda, está dentro do âmbito do presente invento incluir anticorpos contra regiões glicosiladas de P40 e contra quaisquer moléculas complexadas com o referido P40. Assim, de acordo com este invento, um anticorpo contra P40 engloba anticorpos contra P40, ou suas partes antigénicas, e contra quaisquer moléculas associadas (e.g. regiões glicosiladas, regiões lipidicas, moléculas transportadoras e similares). Ο P40, ou suas partes, aqui considerados são purificados, conforme exemplificado no Exemplo 3, depois utilizados na produção de anticorpos. Os anticorpos policlonais e monoclonais são obtidos por imunização com P40, seus derivados, polipeptídeos ou fragmentos e qualquer um dos tipos é utilizável para imunoensaios. Os métodos para a obtenção de ambos os tipos de soros são bem conhecidos dentro da área. Os soros policlonais são os menos preferidos, mas são relativamente fáceis de preparar através da injecção de um animal adequado de laboratório com uma quantidade eficaz de P40 purificado ou suas partes, colheita do soro do animal e isolamento de soros específicos por qualquer uma das técnicas imunoadsorventes conhecidas. Se bem que os anticorpos produzidos por corte deste método sejam utiláveis em virtualmente qualquer tipo de imunoensaio, eles são geralmente menos favorecidos devido à potencial heterogeneidade do produto. -22- A utilização de anticorpos mono-clonais no presente imunoensaio é particularmente preferida devido a capacidade de os produzir em grandes quantidades e à homogeneidade do produto. A preparação de linhas celulares de hibridoma para a produção de anticorpos monoclonais derivados da fusão de uma linha celular imortal e de linfócitos sensibilizados contra a preparação imunogénica pode ser feita por técnicas conhecidas que são do conhecimento dos entendidos na matéria (Ver por exemplo, Douillard, J. Y. e Hoffman, T., "Basic Facts About Hybridomas" em Compendium of Immunology, Vol. II, L. Schwartz (Ed.) (1981); Kohler, G. e Milstein, C., Nature, 256: 495-497 (1975 ); European Journal ou Immunology 6^: 511-519 (1976), Koprowski et al., Patente U.S. 4 172 124, Koprowski et al ., Patente U.S. 4 196 265 e Wands, Patente U.S. 427 145, os ensinamentos dos quais são aqui incluídos como referência.
Ao contrário dos novos policlonais, a escolha do animal para a produção de anticorpos monoclonais está dependente da disponibilidade de linhas imortais adequadas capazes de se fundirem com os seus linfócitos. 0 ratinho e o rato têm sido os animais de eleição na tecnologia de hi-brodomas e são preferêncialmente usados. Os seres humanos podem também ser utilizados como fontes de linfócitos sensibilizados se se dispuser de linhas celulares humanas (ou não humanas) imortalizadas adequadas. No caso do presente invento, o animal escolhido pode ser injectado com cerca de 1 mg a cerca de 20 mg de P40 purificado ou suas partes. Geralmente o material a injectar é emulsionado em adjuvante completo de Freund. Podem ser igualmente necessárias injecções de memória. A de-tecção da produção de anticorpos pode ser efectuada testando os anti-soros com antigénio adequadamente marcado. Os linfócitos podem ser obtidos através da remoção do baço ou de nódulos linfáticos de animais sensibilizados em condições de esterilidade e fazendo a fusão. Como alternativa os linfócitos podem ser estimulados ou imunizados in vitro, como descrito, por exemplo, em C. Reading, J. Immunol. Meth,, 53; 261-291, 1982. -23-
Foram desenvolvidas uma série de linhas celulares adequadas a fusão e a escolha de qualquer linha particular para os protocolos de hibridação é orientada por qualquer um de uma série de critérios tais como velocidade, uniformidade das características de crescimento, deficiência do seu metabolismo para um componente do meio de crescimento e potencial para uma boa frequência de fusão.
Os híbridos intra-espécies, particularmente entre estirpes semelhantes, funcionam melhor do que as fusões inter-espécies. Existem disponíveis várias linhas celulares, incluindo mutantes seleccionados quanto à per-da da capacidade para secretar imunoglubulinas de mieloma. Entre estas estão incluídas as seguintes linhas de mieloma de ratinho: MPC^-X45-6TG, P3-NSl-l-Ag4-l. P3-X63-Ag8 ou seus mutantes tais como X63-Ag8T653, SP2-0-Agl4 (todos derivados de BALB/C), Y3-'Agl.2.3 (rato) e U266 (humano). A fusão celular pode ser induzida por vários vírus, tais como vírus Epstein-Barr ou Sendai ou polietilenoglicol. O polietilenoglicol (PEG) é o agente mais eficaz para a fusão de células somáticas de mamífero. 0 próprio PEG pode ser tóxico para as células e várias concentrações deverão ser testadas relativamente aos efeitos sobre a viabilidade antes de se testar a fusão. A gama de peso molecular do PEG pode variar entre 1000 e 6000. Dá melhores resultados quando diluído para cerca de 20% a 70% (p/p) em soro fisiológico ou meio sem soro. A exposição ao PEG a 37°C durante cerca de 30 segundos é preferida no caso presente, utilizando células de ratinho. São evitadas temperaturas extremas (i.e., cerca de 455C) e a pré-incubação de cada componente do sistema de fusão a 37ãC antes da fusão dá resultados óptimos. A proporção entre linfócitos e células malignas é optimizada para evitar a fusão celular entre as células do baço e uma gama de cerca de 1:1 a cerca de 1:10 dá bons resultados. -24-
As células fundidas em êxito podem ser separadas da linha celular de mieloma por qualquer técnica conhecida na área. O método mais comum e conhecido é escolher uma linha celular maligna que é deficiente em Hypoxanthi-ne Guanine Phosphorilosyl Transferase (HGPRT), que não crescerá num meio contendo aminopterina usado para permitir apenas o crescimento de híbridos e que é geralmente composto por hi- -4 -5 -5 poxantina 1x10 M, aminopterina 1 x 10 Me timidina 3x10 M, vulgarmente conhecido como meio HAT. A mistura de fusão pode ser cultivada em meio de cultura contendo HAT imediatamente após a fusão 24 horas mais tarde. Os esquemas de alimentação geralmente incluem manutenção em meio HAT durante duas semanas e depois fornecimento de meio de cultura regular ou meio contendo hipoxantina, timidina.
As colónias que se desenvolvem são então testadas quanto à presença de anticorpos que reconhecem a preparação antigénica. A detecção de anticorpos de hibridoma pode ser efectuada usando um ensaio em que o antigénio é ligado a um suporte sólido e deixado reagir com os sobrenadantes de hibridoma contendo anticorpos putativos. A presença de anticorpos pode ser detectada por técnicas de "sanduíche" usando uma veriedade de indicadores. A maior parte dos métodos normais são suficientemente sensíveis para usar na gama de concentrações de anticorpo secretado durante o crescimento dos híbridos. A clonagem dos híbridos pode ser efectuada após 21-23 dias de crescimento celular em meio selec-cionado. A clonagem pode ser efectuada por diluição limite das células em fase líquida ou por selecção directa de células isoladas crescendo em agarose semi-sólida. Para a diluição limite as suspensões de células não diluídas seriadamente para dar uma probabilidade estatística de ter apenas uma célula por poço. Para a técnica de agarose, os hibridos são semeados numa camada de agar semi-sólido superficial, sobre uma camada subjacente contendo células de suporte. As colónias da camada su- -25- perior podem ser aplicadas e eventualmente transferidas para cavidades.
Os híbridos secretores de anticorpos podem ser cultivados em vários frascos de cultura de tecidos dando sobrenadantes com concentrações veriáveis de anticorpos. Para se obter concentrações mais altas, os híbridos podem ser transferidos para animais para se obter ascites inflamatórias. As ascites contendo anticorpos podem ser colhidos 8-12 dias após injecção intraperitoneal. As ascites contêm uma concentração mais elevada de anticorpos mas incluem monoclo-nais e imunoglobulinas das ascites inflamatórias. A purificação de anticorpos pode ser então conseguida por exemplo por cromatografia de afinidade. A presença do P40 aqui considerado ou de anticorpos específicos contra o mesmo no soro, tecido ou extracto de tecido de um paciente, pode ser detectado utilizando anticorpos preparados como atrás, monoclonais ou poli-clonais, virtualmente em qualquer tipo de imunoensaio. Existe uma larga gama de técnicas de imunoensaio como se pode ver pela referência às Patentes U.S. Nos. 4.016.042; 4.424.279 e 4.018.653. Isto certamente inclui ensaios de sítio único ou de dois sítios, ou "sanduiche", dos tipos não competitivo, assim como ensaios de ligação competitiva tradicionais. Os ensaios de sanduiche estão entre os ensaios mais úteis e mais vulgarmente usados e são os preferidos para usar no presente invento. Existe uma série de variações da técnica de ensaio tipo sanduiche e todas elas são englobadas pelo presente invento. Resumidamente num ensaio típico, um anticorpo são marcado é imobilizado num substrato sólido e a amostra a ser testada colocada em contacto com a molécula ligada. Após um período adequado de incubação, durante um período de tempo suficiente para permitir a formação de um complexo secundário anticorpo--antigénio, um segundo anticorpo, marcado com uma molécula re pórter capaz de produzor um sinal detectável, é então adicionado e incubado, dando tempo suficiente para a formação de um -26-
complexo terciário de anticorpo-antigénio-anticorpo marcado (e.g., anticorpo-P40-anticorpo). Qualquer material que não reagiu é removido por lavagem e a presença do antigénio é determinada pela observação de um sinal produzido pela molécula repórter. Os resultados podem ser qualitativos, por simples observação do sinal visivel ou podem ser quantificados por comparação com uma amostra testemunha contendo quantidades conhecidas de hapteno. Variações do-ensaio incluem—um-ensaio simultânea em que amostra e anticorpo marcado são adicionados simultâneamente ao anticorpo marcado ou um ensaio inverso em que o anticorpo marcado e amostra a testar são primeiro incubados em conjunto e depois adicionados ao anticorpo não marcado ligados à superfície. Estas técnicas são bem conhecidas dos familiarizados com a matéria e pequenas variações são práticamente óbvias. —p No ensaio tipo sanduíche típico uns primeiro anticorpos tendo especificidade para P40 ou suas partes antigénicas, englobado neste invento, é ligado covalen-te ou passivamente a uma superfície sólida. A superfície sólida é tipicamente vidro ou um polímero, os polímeros mais vulgarmente usados são a celulose, poliacrilamida, "nylon", polistireno, cloreto de polivinilo ou polipropileno. Os suportes sólidos podem ser na forma de tubos, esferas, discos, ou microplacas ou qualquer outra superfície adequada para a realização de um imunoensaio. Os processos de ligação são bem conhecidos e geralmente consistem em ligação cruzada, ligação covalente ou absorção física da molécula ao veículo insolúvel. Após ligação, o complexo polímero-anticorpo é lavado em preparação para a amostra a testar. Uma pequena quantidade da amostra a testar é então adicionada ao complexo de fase sólida e incubado a 252C durante um período de tempo suficiente para permitir a ligação de qualquer subunidade presente no anticorpo. 0 período de incubação variará, mas normalmente estará na gama de aproximadamente 2-40 minutos. Após o período de incubação a fase sólida com anticorpo é lavada e seca e incubada com um segundo anticorpo específico para uma fracção do -2 7- hapteno. O segundo anticorpo é ligado a uma molécula repórter que é usada para indicar a ligação do segundo anticorpo ao hap-teno. Por "molécula repórter", conforme usado na presente especificação, pretende-se significar uma molécula que pela sua natureza química, proporciona um sinal analiticamente identificável que permite a detecção do anticorpo ligado a antigé-nio. A detecção pode ser qualitativa ou quantitativa. As moléculas repórter mais vulgarmente usadas neste tipo de ensaio são enzimas, fluoróforos ou moléculas contendo radionuclidos (i.e., radioisótopos). No caso de um imunoensaio com enzima, uma enzima é conjugada com o segundo anticorpo geralmente por meio de glutaraldeído ou periodato. Como será fácilmente reconhecido, no entanto, existe uma grande variedade de diferentes técnicas de conjugação diferentes que podem ser fácilmente realizadas pelos familiarizados com as técnicas. Enzimas normalmente usados incluem peroxidase de reíbano silvestre, glucose-oxidase, JJ-galactosidase e fosfatase alcalina, entre outra. Os substractos a serem usados com as enzimas específicas são geralmente escolhidas para a produção de uma alteração de côr detectável quando de hidrólise pelo correspondente enzima. Por exemplo p-nitrofenil-fosfato é adequado para utilizar com conjugados de fosfatose alcalina; para conjugados de peroxidase são normalmente usados 1,2-fenilenodiamina, ácido 5-amino-salicilico ou tolidina. E também possível empregar substratos fluorogénicos, os quais dão um produto fluorescente em vez dos substratos cromogénicos referidos atrás. Em todos os casos, o anticorpo marcado com enzima é adicionado ao complexo primeiro anticorpo-hapteno, deixado ligar e depois o excesso de reagente é removido por lavagem. Uma solução contendo o substrato adequado é então adicionados do complexo ternário do anticorpo-antigénio-anticorpo. 0 substrato reagirá com a enzima ligado ao segundo anticorpo, dando um sinal visual qualitativo o qual pode ser ainda quantificado, geralmente por espetrofotometria, para dar uma indicação da quantidade de hepteno que está presente na amostra. -28-
Como alternativa, compostos fluorescentes tais como fluoresceína e rodamina, podem ser quími- \ camente acoplados a anticorpos sem alteração da sua capacidade de ligação. Quando activados por iluminação com luz de um determinado comprimento de onda, o anticorpo marcado com fluoro-cromo adsorve a emergir da luz, induzindo um estado de excitação na molécula, seguido da emissão da luz num côr caracterís-tica visualmente detectável com um microscópio de luz. Tal como em EIA, o anticorpo com marca fluorescente é deixado ligar ao primeiro complexo anticorpo-hapteno. Após remoção por lavagem do reagente não ligado, o restante complexo ternário é então exposto à luz do comprimento de onda adequado, a fluorescência observada indica a presença do hepteno com interesse. As técnicas de imunofluorescência e ETA entre ambas muito bem estbelecidas e são particularmente preferidas para o presente método. No entanto, podem também ser empregues outras moléculas repórter, tais como radioisótopio, moléculas quimiolumi -nescentes ou bioluminescentes. Será fácilmente aparente para o técnico especializado na área como variar o processo para atin gir o fim necessário. Também será aparente que o descrito pode ser usado para detectar directa ou indirectamente (i.e. via anticorpos) ο P40 deste invento.
Assim, o presente invento é também dirigido para um "Kit" para um ensaio rápido e conveniente de P40 em fluídos do corpo de mamífero (e.g. soro, extractos de tecidos, fluídos de tecido), nos sobrenadantes das culturas de células in vitro e nos lisados celulares. O "Kit" é comparti -mentado para receber com primeiro recipiente adaptado para conter um anticorpo contra P40 ou contra um seu componente an-tigénico e um segundo recipiente adaptado para conter um segun do anticorpo contra P40 ou contra um seu componente antigénico o referido segundo anticorpo sendo marcado com uma melécula re_ porter capaz de dar um sinal detectável como aqui descrito atrás. Se a molécula repórter fôr uma enzima então é proporcio nado um segundo recipiente adaptado para conter um substrato da referida enzima. Numa exemplificação da utilização do refe- -29-
rido "Kit”, uma amostra a ser tratada quanto à presença de P40 é posta em contacto com o conteúdo do primeiro recipiente durante um certo periodo de tempo e em condições tais que P40 se presente, se liga aos anticorpos contidos no referido primeiro recipiente. Após remoção do material não ligado (e.g. por lavagem com tampão de fosfatos salino) o complexo secundário é posto em contacto com o conteúdo do segundo recipiente. Se os anticorpos do primeiro recipiente se tiverem ligado a P40, então os anticorpos do segundo recipiente ligam-se ao complexo secundário para formar um complexo terciário e uma vez que os referidos segundos anticorpos são marcados com uma molécula repórter, quando sujeitos a meios de detecção, detec-ta-se o complexo ternário.
Um outro aspecto deste invento está relacionado com um ácido nucleico recombinante ou uma molécula de ácido nucleico isolada, a referida molécula aqui definida como sendo DNA ou RNA sodificador de P40 ou de partes dele. Numa realização a molécula de ácido nucleico recombinante é DNA complementar (cDNA). É considerado como dentro do âmbito do presente invento incluir a molécula de cDNA codificada de P40 de mamífero, de preferência P40 de ratinho ou humano, ou regiões ou partes dela incluindo qualquer deleção, inserção ou substituição de bases ou qualquer outra alteração relativamente à sequência de nucleótideos ou composição quimica (e.g. me-tilação e glicosilação). P40 codificado por cDNA é referido co mo P40 recombinante. Ainda, uma outra realização deste invento é dirigida ao gene genónico de P40, o qual pode incluir clones recombinantes tais como cosmídeos codificadores de todo o gene ou subclones codificadores de exões intrões ou qualquer região do gene de P40 de mamífero. DNA recombinante codificador de tais sub-regiões do gene são úteis como sondas de hibrida-ção para detectar a presença de genes de P40.
Os métodos considerados úteis na obtenção de cDNA de P40 recombinante estão contidos em Mamia-tis et al., 1982, em Molecular Cloning: A Laboratory Manual, -30-
Cold Spring Harbor Laboratory, New York, pág 1-545, por exemplo, ou qualquer um dos milhentos manuais de laboratório sobre tecnologia de DNA recombinante que existam disponíveis. Resu -midamente, mDNA poliadenilado é obtido a partir de células T auxiliares estimuladas e fraccionado em géis de agarose. Facul tativamente, pequenas quantidades de mRNA podem ser injectadas em oócitos de Xenopus laevis para tradução e testados quanto à actividade de P40 usando os métodos aqui descritos para a tradução de fracções enriquecidas da mRNA obtendo-se moléculas activas de P40. Como alternativa, mRNA não enriquecido é usado como molde para a síntese de cDNA. As bibliotecas de clones de cDNA são construídas no sítio Pstl do vector pBR322 (usando caudas de homopolímeros) ou numa variedade de outros vectores (e.g. os vectores de clonagem de cDNA de Okayama-Berg, vectores de clonagem de cDNA de Messing e similares). As moléculas de cDNA específicas num vetor na referida biblioteca são en -tão seleccionadas usnado oligonucleotídeos especificamente pro jectados, baseados nas sequências de aminoácidos contidas em P40, para codificar pelo menos parte da referida sequência. É particularmente útil a sequência de aminoácidos parcial interna de P40 de ratinho obtida após tratamento com brometo de cia nogénio que inclui:
Nf^-Ala Gli Asn Tre Leu Ser Fen Leu Lis Ser Leu Leu Gli Tre Fen Glu Lis Tre Glu.
Sequências oligonucleotídicas basea das na sequência de aminoácidos anterior são particularmente úteis na identificação de clones de cDNA codificadores de P40 ou seus derivados. Assim, pode-se preparar RNA poli(A)t a pai: tir de uma linha de células T auxiliares de ratinho TUC7.51 após 24 horas de estimulação com concanavalina A (Con A) e usa das como molde na síntese de cDNA. O cDNA pode ser clonado no sítio BamHI do vector pUC8, usado para transformar E. coli à sequência de aminoácidos FQKTEMQ e subsequentemente com uma -31- sonda degenerada 128 vezes correspondendo à sequância de ami-noácidos ENLKDDP (ver Exemplo 9 para a sequência exacta das sondas). Os clones positivos resultantes são úteis para isolar outros genes de P40 genómicos de mamíferos de cDNA. Por exemplo o clone de cDNA de ratinho é usado para fazer o despiste de uma biblioteca genómica humana ou outra biblioteca-genómica de mamífero, para identificar todo o gene genómico ou pelo menos um seu exão. Se apenas uma fracção do gene fôr isolado por este método, o restante do gene pode ser isolado por "passeio cromossómico" ("chromosomal Walking") com o novo clone. Ainda, um clone genómico é particularmente útili para isolar um clone de cDNA e vice-versa, especialmente a partir da mesma espécie. Assim, o clone de cDNA de ratinho é usado para isolar o gene genómico de P40 de ratinho. A sequência de cDNA codificadora de P40 de ratinho está descrito em baixo com a correspondente sequência de aminoácidos: -32- -18 -10
MetLeuValThrTyrlleLeuAlaSerValLeuLeuPheSerSer 5 1 CAGACTCCCGTCAACATGTTGGTGACATACATCCTTGCCTCTGTTTTGCTCT7CAGTTCT 1 10
ValLeuGlyGlnArç:ysSerThrThrTrpGlylleArçAspThrAsnTvrLeui1eGlu GTGCTGGGCCAGAGÃtrCaAGCACCACATCGGGCATCAGAGACACCAATTÃCCTTATTCAA 100 20 _30 γ
AsnLeuLysAspAspProProSerLystydSeiGysSerGlyAsnValThrSerty^Leu AATCTGAAGGATGATCCACCGTCAAAAjrGuAGdTGu.AGCGGCAACGTGACCAGCITG JTTG 50 40
CysLeuSerValProThrAspAspCyí ThrThrPrcGycTyrArqGluGlyLèuLeuGln TGTiGTCTCCGTCCCAACTGATGAIlTGjACCACACCGfrGdTACAGGCAGGGACTGTTACAG Y 200
€0 TO
LeuThrAsnAlaThrGlnLysSerArgLeuLeuProValPheHlsArçValLysArçIle CTGACCAATGCCACACAGAAATCAAGACTCTTGCCTGTTTXCCATCGGGTGAAAAGGATA 300 80 γ 90 γ
ValGluValLeuLysAsnlleThrfcydProSerPheSeiCysGluLysPrcCysAsnGln GTTGAAGTCCTAAAGAACATCACqTGTpCGTCCTTTTCqTGgGAAAAGCC^TGgAACCAG
100 110 ThrKetAlaGlyAsnThrLeuSerPheLeuLysSerLeuLeuGlyThrPheGlnLysThr ACCATGGCAGGCAACACACTGTCATTTCTGAAGAGTCTCCTGGGGACGTTCCAGAAGACA 400 120 126
GluMetGlr.ArgGlnLysSerArgPro
GAGATGCAAAGGCAGAAAAGCCGACCATGAAGACAGATGCTATTTATTCTATTTATTCAA TTTACAAAACCTCCCCTCCTTAACTGTTACACTGAAGAAATAAACTAAGCTATTCT 3 ' 500 A sequência de cDNA com a correspondente sequência de aminoacidos.de P40 humano está descrita abaixo:
cia -II MCT IXU Ltu ALA M£T VAL LEU THR SER ALA LEU LEU LEU CTS SER VAL ALA CCGCTGTCAAG ATG CTT CTG GCC ATG GTC CTT ACC TCT GCC CTG CTC C7G TGC TCC GTG GCA GLY X GLN GLY cts PRO THR LEU ALA GLY 1LE 10 LEU ASP ILE ASN PHE LEU ILE ASN 1 LYS KET GGC CAG GGG TGT CCA ACC TTG GCG GGG ATC CTG GAC ATC AAC TTC CTC ATC AAC AAG ATG 122 20 GLN GLU ASP FRO ALA SER LYS CYS H1S CYS 20 SER ALA ASN VAL THR SER CYS LEU CYS LEU CAG GAA GAT CCA GCT TCC AAG TGC CAC TGC AGT GCT AAT GTG ACC AGT TGT CTC TGT TTG 102 40 CLY ILE FAO SER ASP ASN CYS THR ARG PRO 50 CYS PHE SER GLU ARG LEU SER GLN KET THR GGC ATT CCC TCT GAC AAC TGC ACC AGA CCA TGC TTC AGT GAG AGA CTG TCT CAG A7G ACC 242 40 ASN THR THR KET GLN THR ARG TYR PRO LEU 70 ILE PHE SER ARG VAL LYS LYS SCR VAL GLU AAT ACC ACC ATG CAA ACA AGA TAC CCA CTG ATT TTC AGT CGG CTG AAA AAA TCA GTT GAA 302 80 VAL LEU LYS ASN ASM LYS CYS PRO TYR PHE 90 SER CYS GLU GLN PRO CYS ASN GLN THR THR GTA CTA AAG AAC AAC AAG TCT CCA TAT TTT TCC TGT GAA CAG CCA TGC AAC CAA ACC ACG 342 100 ALA GLY ASN ALA LEU THR PHE LEU LYS SER 110 LEU LEU GLU ILE PHE CLM LYS GLU LYS KET GCA GGC AAC GCG CTG ACA TTT CTG AAG AGT CTT CTG GAA ATT TTC CAG AAA CAA AAG ATG 422 AAG GLY HET AAG GLY LYS. 124 ;lc 9 AGA GGG ATG AGA GGC AAG ATA TGAAGATGAAATATTATTTATCCTATTTA7TAAATTTAAAAA 465
Uma vez identificados, os cDNAs ou DNAs recombinantes codificando a totalidade ou parte de P40 recombinante são ligados aos vectores de expressão. Por rotina faz-se manipulação genética adicional para optimizar a expressão do cDNA no hospedeiro particular empregue. Assim, P40 pode ser sintetizado i_n vitro através da inserção da referida sequência de cDNA num vector de expressão replicável, transformação de molécula de DNA recombinante num hospedeiro adequado e depois cultura ou crescimento do hospedeiro tranfor-mado em condições necessárias à síntese da molécula. A molécula recombinante aqui definida deverá compreender uma sequên^ cia de ácido nucleico codificador de um polipeptídeo pretendido, inserido a jusante de um promotor, um replicão eucarióti-co ou procariótico e uma marca adequada, como seja a resistên-a um antibiótico. -34-
Um promotor consiste numa sequência de acido nucleico específica que está operacionalmente ligada ao DNA codificadora do polipeptídeo pretendido que é capaz de efectuar a expressão do referido polipeptídeo. Igualmente, o promotor pode ser substituído ou aumentado por quaisquer outros elementos genéticos capazes de efectuar a expressão genética, incluindo elementos tais como estimuladores, terminadores da transcrição, sinais de poli(A) e similares. Estes três últimos elementos não são sempre necessários e a sua utilização dependerá do vector e do sistema hospedeiro usado na expressão genética. A necessidade de qualquer um destes elementos pode ser fácilmente determinado por alguém familiarizado com a matéria. Os promotores são elementos da sequên cia de DNA para controle da expressão dos genes, em particular eles especificam os sítios de iniciação da transcrição. Os promotores procarióticos que são úteis incluem o promotor lac, o promotor trp, os promotores e PR de lambda e o promotor da polimerase de T7. Os promotores eucarióticos são especialmente úteis no invento e incluem promotores de origem virai, tais como o promotor tardio de SV40 e LTR do vírus da leucémia de Moloney, promotores de levedura e quaisquer promotores ou arriações de promotores destinados a controlar a expressão dos genes incluindo promotores obtidos por engenharia genética. O controle da expressão de genes inclui a capacidade para regular um gene tanto positiva como negativamente (i.e., ligando ou desligando a expressão dos genes) para se obter o nível de expressão pretendido.
Alguém que esteja familiarizado com a matéria tem à sua disposição muitas hipótese de vectores de expressão replicáveis, hospedeiros compatíveis e métodos bem conhecidos para fazer e usar os vectores. Os vectores de DNA recombinante são encartados em qualquer um de um vasto número de manuais de laboratório sobre engenharia genética. A molécula recombinante pode também precisar de uma sequência sinal para facilitar o transpor- -35- te do polipeptídeo sintetizado para o ambiente extracelular. Como alternativa o polipeptídeo pode ser recuperado lisando primeiro a célula hospedeira através de uma variedade de técnicas tais como sonicação, desintegração por pressão ou tratamento com tolueno. Os hospedeiros considerados de acordo com o presente invento podem-se seleccionar do grupo compreendendo procariotas (e.g., Escherichia coli, Bacillus sp., Pseudo-monas sp.) e eucariotas (e.g., células de mamíferos, culturas de leveduras e de fungos, células de insectos e culturas vegetais). O técnico também reconhecerá gue uma determinada sequência de aminoácidos pode sofrer deleções, substituições e adições de nucleotídeos (codões). Tais variações estão todas consideradas dentro do âmbito do presente invento e podem ser preparadas pela técnica de mutagénese dirigida. Em adição, dependendo do hospedeiro que expressa P40 recombinante, o referido P40 pode ser ou não glicosilado. Geralmente as células eucarióticas, por exemplo células T de mamífero e similares proporcionam P40 recombinate glicosilado. As células procarió ticas, por exemplo bactérias tais como Escherichia coli e similares não glicosilam proteínas. Portanto tanto P40 glicosilado como não glicosilado estão incluídos no presente invento.
Ainda, num outro aspecto do pre -sente invento proporciona microorganismos transformantes e c<ê lulas em cultura contendo os presentes vectores de expressão. Os microorganismos transformantes e células em cultura^são feitos através da introdução do vector de expressão replicá -vel codificador de P40 de mamífero, um seu derivado ou um seu fragmento, na célula ou microorganismos pretendidos por tran£ formação ou transfecção ou infecção de partículas virais ou bacteriofágicas. Os processos para a transformação são bem conhecidas e incluem mas não estão limitados a tratamento com CaCl2 e elctroporação para células bacterianas e coprecipita-ção com CaPO^, fusão de protoplastos e-•'electroporação para células eucarióticas. A infecção directa pode ser usada quando os vectores são vírus ou bacteriof agos. Os métodos detalha_ % -36-
dos para estas técnicas podem ser encontrados em manuais de laboratório convencionais sobre tecnologia de DNA recombinan-te. O invento contempla ainda qualquer método para a incorporação de DNA num organismo hospedeiro.
Um outro aspecto do presente invento relaciona-se com linhas de células T auxiliares que produzem P40. Conforme aqui definido, P40 ou composições compreendendo o mesmo, estimulam o desenvolvimento de linhas permanentes de células T auxiliares independentes de antigénio as quais são mantidas por subcultura de 3 em 3 ou de 4 em 4 dias em meio com P40. Mesmo mais particularmente, o presente invento é dirigido a TS1, uma das quatro linhas celulares dependentes de factores derivadas de TUC2.15.
Os exemplos que se seguem ilustram melhor o presente invento. EXEMPLO 1
Materiais e Métodos
Meio
Meio de Eagle modificação de Dul-becco suplementado com 10% (v/v) de soro fetal bovino (FCS), B-mercaptoetanol 50 uM, L-arginina 0,55 mM, L-aspargina 0,24 mM e L-glutamina 1,25 mM foram usados para a maior parte das linhas celulares excepto para 7TD1 e BCLl as quais foram cultivadas em meio de Iscove. -37-
Clones e linhas de células T
As linhas de células T auxiliares foram estabelecidos e mantidas na ausência de factores de cres cimento exógeno como descrito por Van Smick et ad., Proc. Natll Acad. Sei. USA 83: 9679-9683, 1986. As linhas TUC2 e TUC7 são derivados de ratinhos C57BL/6 imunizados com hemociamina de lapa. A linha TUC5 foi obtida a partir da mesma estirpe de ratinhos mas após imunização com transferrina humana. TLJCB é uma linha celular alospecífica de BALB/C anti-C57B/6. Os clones individuais foram obtidos a partir destas linhas por diluição limite na presença de 10% (v/v) de meio condicionado por células do baço de rato estimuladas com concanavalina A e foram designadas TUCx.y (onde x representa o número da linha e y o número do clone). Estes clones foram subsequentemente expandidos e mantidos sem factores de crescimento exogénos tal como as linhas celulares parentais. Os clones de células T citolí-ticas de origem DBA/2 dirigidos contra mastocitoma singeneico P815 foram mantidos com 50% (v/v) de meio de cultura de linfó-citos misturados como descrito por Maryanski et a^., Eur, J. Immunol. 12: 401-406, 1982. Para usar em ensaios de factor de crescimento, as células T foram separadas das células de suporte por centrifugação sobre uma camada de Lymphoprep (Nycomed 4 AS, Oslo, Norway) lavadas e incubadas a 5 x 10 celulas/poço.
As proliferações foram medidas no dia 3 após um pulso de 6 h 3 com metil-( H)-timidina (0,5 uCi/davidade).
Preparação de Sobrenadantes de células T auxiliares Células TUC2.15 e TUC7.51, obtidas a partir de culturas estimuladas 2 semanas atrás com antigénio e células de suporte, foram ajustadas a 2 x 10^ células/ml e -38- incubadas durante 2-3 dias em meio contendo 0,5% (v/v) de FCS e concanavalina A (ConA, 5 ug/ml). Os sobrenadantes (SN) foram colhidos por centrifugação a 10 000 x g durante 20 minutos. Quando usados para cultura, os SN brutos são suplementados com metil- -D-manosido 0,1 M.
Ensaio de factor de crescimento de TS1 Células TS1 dependentes de factor foram cultivadas em 1% (v/v) de SN de TUC2.15. Antes de serem usadas no ensaio do factor de crescimento as células foram levadas para remover SN e cultivadas a uma densidade de 3 x 10^ células/cavidade em 200 ul com diluições seriadas de amostras a serem testadas. Após 3 dias, o crescimento celular foi medido por determinação colorimétrica dos níveis de hexosaminida-ses de acordo com Landegren J. Immunol. Methods 67: 379-388, 1984. A diluição que dá metade da absorvência máxima a 405 nm foi arbitráriamente designada como uma U/ml de actividade.
Outras linhas celulares CTLL-2 (Gillis ejt al_. ,J. Immunol. 120: 2027-2032, 1978) foi cultivada com 100 U/ml de IL-2 re-combinante humana DA-1 (Ihle et al^, Adv. Virol. Oncol. 4^ 95--137, 1984), Ea3.15 (Palacios e_t ai^. , J. Exp. Med. 152: 1036- -1047, 1980) com 10% (v/v) de SN de WEHI como fonte de IL3 e 7TD1 com uma diluição a 1/500 de SN de TUC2.15 como fonte de -39- IL6 (Van Snick elt al^ , supra) . Os ensaios usando estas linhas celulares foram efectuadas como descrito para a linha TS1 e as proliferações foram medidas por determinações de hexosami-nidase ou por incorporação de timidina. As células BCLl passadas _in vivo (Slavin et_ a^. , Nature 2 72; 624-626, 1978) foram congeladas em pequenas quantidades e descogeladas imediatamente antes de serem usadas. A proliferação de BCLl foi medida por incorporação de timidina em culturas com 7 dias semeadas 4 com 10 celulas/cavidade.
Citocinas e factores de crescimento ILip humana, natural e purificada (Van Damme ej: ad. , Nature 314: 266-268, 1989) , IL2 recombinan-te humana (Devos £t al., Nucl. Acids Res. 11: 4307-4323) e IL3 de ratinho purificado (Ihle et_ a_l. , J. Immunol 12 9; 2431-2436, 1982) são como descritas. O factor estimulador de colónias de granulócitos (G-CSF) recombinante humano e o factor estimulador de colónias de granulócitos-macrófagos (GM-CSF) recombinante de ratinho foram descritos por DeLamarter et. al_. , Embo J. 4_: 2575-2581, 1985. O factor de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) foi descrito por Heldin et al^. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 76: 3722-3726, 1979. O factor de crescimento epidérmico (EGF) foi adquirido à Boehringer Nannhein (Fed. Rep. Germany), IL4, IL5 e IL6 de ratinho foram purificadas como descrito por Van Snick, supra e Vink et_ a_l. , Eur, J. Immunol 18 607-612, 1988. -40-
Anticorpos O anticorpo 11B11 anti-IL4 (Ohara et al., Nature 315:~ 333-336, 1985) e o anticorpo 5A2 anti-re-ceptor de IL2 (Moreau ejt al_. , Eur. J. Imtnunol. 17; 929-939, 1982) são como descritos.
Purificação do factor de crescimento TS1 A adsorção a ácido silicico e filtração em gel foi efectuado como descrito (Van Snick supra).
As fracções activas da coluna de filtração em gel foram reunidas, concentradas por ultrafiltração numa membrana Amicon _4 YM-10 na presença de diluição 10 (v/v) de Tween 20 e trans feridas para Na2SO^ 1M tamponado para pH 7,0 com fosfato de sódio 0,1M antes da injecção numa coluna TSK-Phenyl (LKB, Brom-ma, Sweden) equilibrada no mesmo tampão. Após uma lavagem de 10 min. no tampão de partida a eluição foi efectuada a 0,6 ml/min com um gradiente linear de uma mistura a 1:1 de tampão fosfato de sódio (0,1 M, pH 7,0) e etilenoglicol. As fracções activas foram ainda fraccionadas numa coluna Mono Q (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden) equilibrada em etanolamina--HC1 20 mM pH 9,5, NaCl 20 mM e 10-^ (v/v) de Tween 20. A coluna foi desenvolvida a 0,8 ml/min com um gradiente linear de 30 min de NaCl (8 mM/min). As fracções reunidas foram concentradas e ajustadas para conter 0,05% (p/v) de ácidos tri-fluoroacético (TFA) antes da injecção numa coluna de HPLC TSK TMS-250 de 25 nm de poro (LKB). A coluna foi eluida durante os primeiros 10 min com um gradiente linear de 0 a 35% (p/v) de acetonitrilo em 0,05% (p/v) de TFA, que foi seguido de um gradiente de 35-36% durante os 60 min. seguintes. O caudal foi -41- ajustado a 0,8 ml/min; colheram-se fracções de 1 min em tubos Eppendorf contendo 10 ul de NH^HCO^ 1 M e 5 ul de Tween 20 (1% (v/v) em água) e liofilizaram-se. A proteína total foi medida fluorimétricamente com benzoxanteno segundo Nenhoff et al., Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 360: 1657-1670, 1979. A pureza do produto final foi avaliado por NaDodSO^/PAGE em géis de 12% (p/v) de acrilamida. A focagem isoeléctrica foi efectuada com um sistema de gel vertical LKB (Bromma, Sweden). O material foi recuperado dos géis por incubação durante a noite em -4 130 mM NaCl contendo Tween 20 (10 v/v) e fosfato de sódio 10 mM pH 7,0. A cromatografia de afinidade em lectina de len-tilha-Sepharose foi feita seguindo o processo descrito pelo fabricante (Pharmacia, Uppsala, Sweden).
Análise da sequência de aminoácidos A análise automática da sequência de aminoácidos foi efectuada com um sequenciador Applied Biosystems (modelo 477A) equipado com um analisador de fenil-tio-hidantoína-aminoácidos (modelo 120A). Aclivagem iri situ com brometo de cianogénio de P40 (—10 ug) foi efectuada em discos de fibra de vidro do sequênciador de fase gasosa de acordo com um processo descrito por Simpson et al., Biochem. Internat. 8_: 787-791, 1984, daqui em diante Simpson I. As comparações das sequências foram feitas com as seguintes bases de dados: Base de dados de sequências de proteínas de PIR, National Biomedical Research Foundations (release 15.d, Dezembro 1987); Swiss-Prot Protein Sequence Data Bank versão 5 (Setembro 1987, compilado por A. Bairoch, Universidade de Geneva, Medicai Biochemistry Department, 1211 Geneva 4, Switze£ land); G.B. trans Protein Data Base Release 1.0 (Agosto 1987) compilado da GENBANK release 50.0 por J. Coventry, Walter e -42-
Eliza Hall Institute of Medicai Research, Parkville 3050 Australia; e PG trans Protein Data Base release 38.0 (Dezembro 1989) GENBANK, Instit., Pasteur, Paris France. EXEMPLO 2
Deteção da actividade de factor de crescimento
de células T TUC2.15 é uma linha de células T auxiliares de (57B1/6 que necessita de antigénio e de células apresentadoras de antigénio para um crescimento a longo prazo in vitro. Numa tentativa para crescer estas células sem células de suporte e sem antigénio, descobriu-se surpreendentemente que após o suplemento do meio de cultura com 10¾ (v/v) de sobrenadante (SN) autólogo obtido após estimulação com ConA, este SN é capaz de induzir a proliferação celular sem outras necessidades de antigénio ou de células de suporte. Esta actividade de factor de crescimento não é inibida por anticorpos anti-receptor de IL4 ou IL2 (Tabela 1), indicando que actividade é mediada nem directa nem indirectamente por estas moléculas .
Além da actividade em proliferação a curto prazo, o SN também estimula fácilmente o desenvolvimento de linhas celulares permanentes independentes de antigénio, as quais são mantidas por subcultara de 3 em 3 dias ou de 4 em 4 dias em meio suplementado com 1% (v/v) de SN (Figura 1). Até à data foram infrutíferas as tentativas para derivar linhas celulares independentes de antigénio com IL2. Um segundo clone de células T auxiliares, TUC7.51 também dá origem a -43- uma linha celular independente de antigénio quando da cultura em SN autólogo. Os factores activos nas duas linhas celulares são aparentemente idênticos, uma vez que SN de TUC7.51 suportou o crescimento de células TUC2.15 e vice-versa. TS1, uma das linhas celulares dependentes de factores derivada da TUC2.15 foi seleccionada para posterior identificação do factor de crescimento. Esta escolha baseia-se na observação de que TSl cresce rápidamente, com um tempo de duplicação de 11 h e responde a concentrações muito pequenas de SN, sendo obtida metade da poliferação má- -5 -4 xima em diluições entre 10 e 10 (v/v). Para determinar a especificidade do ensaio TSl, as células foram incubadas com uma variedade de factires de crescimento purificados ou SN bruto e encontrou-se que apenas IL4 e SN de TUC2.15 suportam o crescimento de TSl (Tabela 2). Uma vez que os anticorpos anti--IL4 falharam a inibição dos efeitos do SN de TUC2.15, a acti-vidade atrás referida é um novo factor de crescimento de células T. -44-
TABELA 1
Proliferação de células T auxiliares TUC2.15 induzidas por sobrenadantes (SN) autólogo; Independência de IL2 e IL4
Anticorpos adicionais
Proliferação em resposta a IL2 IL4 SN de TUC2.15 (Kepm) nenhum 152 18 37 anti-receptor de IL2 4 16 32 anti-IL4 156 1 33
As células T auxiliares TUC2.15 4 (5 x 10 /cavidade) foram incubadas durante 3 dias com IL.2 (100 U/ml), IL4 (100 U/ml) ou SN de TUC2.15/1% v/v) na presença do anticorpo 5A2 anti-receptor de IL2 (30 ug/ml) ou do an-corpo 11B11 anti-IL4 (10 ug/ml). A incorporação de timidina foi medido no dia 3. -45-
TABELA 2
Crescimento de TS1 em resposta a vérias citocinas
Factores Dose/Diluição Crescimento celular (A405) TUC2.15 SN 1/12,500 1,96 ILl 100 U/ml 0 IL2 100 U/ml 0 IL3 100 U/ml 0,01 IL4 100 U/ml 1,36 IL5 100 U/ml 0 IL6 20 ng/ml 0 GM-CSF 10 ng/ml 0 G-CSF 4 ng/ml 0 M-CSF (fruto) 1/4 0,02 EGF 50 ng/ml 0 PDGF 4 ug/ml 0,02
As células TS1 foram incubadas durante 3 dias na presença de vários factores ou SN. Todos os reagentes foram tratados numa gama de 100 vezes mas os resultados são dados apenas para a dose mais alta. Nenhum dos factores que deram resultados vegetativos na dose mais alta tiveram qualquer efeito em doses mais baixas. O crescimento celular foi medido por determinação colorimétrica dos níveis de hexosaminidases. A absorvância (A) das culturas a 405 nm incu- -46-
badas sem factores de crescimento varia entre 0,10 e cerca de 0,15 e foi subtraída. EXEMPLO 3
Purificação do factor de crescimento de células T
Lotes grandes de SN de células T foram produzidas por estimulação de células TUC2.15 e TUC7.15 com ConA como descrito no Exemplo 1. O material activo foi concentrado por adsorção a ácido silicico e aplicado numa coluna de filtração em gel Ultrogel AcA54. A principal activi-dade promotor do crescimento que foi destruída pela tripsina elui como um pico simétrico na região de 30-40 kDa (Fig. 2A) e foi portanto designada P40. AS experimentações subsequentes foram efectuadas com SN de TUC7.15 devido às concentrações de P40 serem mais altas neste material. A caracterização preliminar do factor de crescimento indica que ele tem pl~10 e é glicosila-do, 60¾ da actividade sendo retida numa coluna de lectina de lentilha. Com base nesta informação adoptou-se o protocolo de purificação que se segue. As fracções activas do passo de filtração em gel foram ainda separadas por cromatografia de in-teracção hidrofóbica numa coluna TSK-Phenyl (Fig. 2B) seguido de passagem através de uma coluna de permuta aniónica Mono Q equilibrada a pH 9,5. A este pH elevado, a maior parte dos con-taminantes são retidos na coluna, enquanto P40 elui principalmente nas fracções do fluente, conforme esperado a partir do seu pi elevado (Fig. 2C). A purificação final foi conseguida por cromatografia da fase reversa numa coluna Cl equilibrada -47- com 0,05% (p/v) de TFA. P40 foi recuperado num único pico eluindo numa concentração de acetonitrilo de 35% (v/v) (Fig. 2D). No final desta purificação, P40 estimula metade do crescimento máximo de TS1 numa concentração de -5 pg/ml (Fig. 3), a qual corresponde a uma purificação de 2000 vezes. Em média o rendimento global varia entre cerca de 5 a cerca de 10%. A proteína purificada é muito heterogénea com uma Mr de cerca de 32 a cerca de 39 kDa em NaDodSO^/PAGE em condições redutores (Fig. 4) e não redutoras. A actividade biológica foi recuperada a partir das fracções correspondentes de um gel não reduzido, mas a exposição a NaDodSO^ e o 2-mercaptoetanol destrói a maior parte da actividade. EXEMPLO 4
Análise da sequência de aminoácidos de P40 de ratinho A degradação de Edman do P40 (- 250 pmoles) não deu a sequência N-terminal. Para análise da sequência, P40 (imobilizado em discos para amostras tratadas com polibreno do sequenciador) foi acilado (Tarr, Methods of Protein Microcharacterization /ed. J.E. Shively/ Human Press, pág. 155-194, 1986) e depois sujeito a tratamento in situ com brometo de cianogénio como descrito por Simpson I. A análise da sequência continuou então e deu a seguinte sequência de aminoácidos (100 pmoles): Ní^-Ala Gly Asn Tre Leu Ser Fen Leu Lis Ser Leu Leu Gli Tre Fen Gin His Tre Glu.
Esta sequência interna não mostra semelhanças significativa com a de outras proteínas guardadas -48- nas bases de dados apresentados no Exemplo 1. A determinação da sequência completa de aminoácidos foi conseguida por métodos químicos.
Resumidamente, antes da disgestão proteolítica a P40 nativa foi reduzida com ditiotreitol e car-boximetilada com ácido iodoacético para dar Cm-P40. Os peptí deos (indicados na Fig. 7) foram preparados para análise da sequência por clivagem de Cm-P40 com endoproteinase Asp-N, tripsina, quimotripsina e brometo de cianogénio (designada por D, T, C e N, respectivamente na Fig. 7). Os subpeptídeos da endoproteinase Asp-N foram derivados por clivagem com protea-se V8 de Staphylococcus aureus (designados com sufixos S com hifen). Na Fig. 7, os resíduos de aminoácidos não identificados estão indicados por X. A metodologia exacta da determinação da sequência de aminoácidos está descrita em baixo: A. Materiais: Tween 20, hidrocloreto de guanidino (grau de pureza Sequenal) e ácido trifluoroacético (F^AcOH; grau de pureza 99%) foram adquiridos à Pierce Chemical Co. (Rockford, Illinois, USA). O ácido iodoacético (grau de pureza "puriss") foi adquirido à Fluka (Buchs, Switzerland) e foi recristaliza-do antes de ser usado. O ditiotreitol foi da Calbiochem (La Jolla, Califórnia, USA). Cloreto de sódio (grau de pureza Aristar) e anidrido acético foram adquiridos à BDH (Poole, UK) O brometo de cianogénio (grau de pureza Univar) foi da Ajax Chemical Co. (Sydney, Australia). Todos os outros reagente foram do mais elevado grau de pureza conseguido comercialmente.
Tripsina (tratada com tosilfenile-tilclorometano) e quinotripsina foram adquiridas à Worthington Biochemical Co. (New Jersey, USA). Protease da estirpe V8 de Staphylococcus aureus foi adquirida à Miles Co. (Napperville, -49-
Illinois, USA). Endoproteinase AspN de um mutante de Pseudomo-nas fragi e N-glicanase F foram adguiridos à Boehringer Man-nheim GmbH (West Germany). Todos os solventes orgânicos foram de grau de pureza para HPLC (grau de pureza Chromar, Mallinc-Krodt, Kentucky, USA). Em todos os tampões usou-se água desio-nizada obtida de um sistema em tandem Milli-RO e Milli-Q (Millipore, Inc., Massachusetts, USA). B. Preparação de S-carboximetil-P40 (Cm-P40) de ratinho: P40 (15 ug em 120 ul de acetonitrilo aquoso a 35% contendo 0,1% (v/v) de F^AcOH e 0,02% Tween 20 foi concentrado até aproxi-madamente 10 ul por centrifugação (Savant Ind. Hicksville,
Ny), diluído até 160 ul com guanidina-HCl 7,5 M contendo tampão Tris.HCl 0,2 M, pH 8,5, EDTA 0,002 M e 0,02% (v/v) de Tween 20 e depois reduzido com ditiotreitol (0,015 M) a 40SC durante 4,5 h, A alquilação foi conseguida pela adição de ácido iodo-acético (Concentração final 0,05 M) à mistura e a incubação continuou durante 30 min. a 259C no escuro. A reacção foi parada pela adição de 25 ul de 2-mercaptoetanol. Cm-P40 foi recuperado da mistura usando um processo de cromatografia líquida de alta resolução em fase inversa (RP-HPLC) préviamente descrito (Simpson et aJ^. , Eur. J. Biochem. 1176: 187-197, '1988 daqui em diante Simpson II). A fracção contendo Cm-P40 (60 ul) foi ajustada a 0,02% (v/v) relação a Tween 20 e depois diluída para 2 ml com um tampão adequado (contendo 0,02% (v/v) de Tween 20) antes da digestão enzimática. C. Digestão com tripsina; Cm-P40 (7 ug) em 1 ml de 1% (p/v) de NA^HCO^, pH 7,8 contendo CaC^ 0,001 M e 0,02% (v/v) de Tween 20 foi diluido com 0,5 ug de tripsina durante 16 h a 37QC. D. Digestão com quimotrpsina: Cm-P40 (6 ug) em 1 ml de 1% (p/v) de NH4HCC>2, pH 7,8 e 0,02% (v/v) de Tween 20 foi digerido com 0,6 ug de quimotripsina durante 16 h a 37QC. -50-
E. Digestão com endoproteinase Asp-N: Cm-P40 (15 ug) em 1020 ul de tampão fosfato de sódio 0,05 M, pH 8,1, 0,02¾ (v/v) de Tween 20 foi digerido com 0,7 ug de preparação de endoproteinase Asp-N preparada recentemente durante 16 h a 349C. F. Disgestão com o protex da estirpe V8 de Staphylococcus aureus: O peptídeo D3 da endoproteinase Asp-N em 1 ml de 1¾ (p/v) de NH^HCl^, 0,02% (v/v) de Tween 20 foi digerido com 0,5 ug do protease V8 de S. aureus numa proporção de enzima/ /substrato de 1:10 durante 16 h a 309C. G. Purificação de polipeptídeos por instrumentação de cromato-grafia líquida de alta resolução: As misturas de peptídeos resultantes de clivagem enzimáticas foram fraccionadas por HPLC de fase inversa num cromatografo líquido Hewlett-Packard (modelo 1090A) adaptado com um detector com arranjo de diodos (modelo 1040A) como descrito (Simpson II). H. Suportes para colunas: As colunas que se seguem foram usadas para a purificação de Cm-P40 e peptídeos derivados: (a) Brownlee RP-300 (poro de 300 nm, diâmetro das partículas 7 um, octilsilica empacotada numa coluna de aço inoxidável de 30 x 2,1 mm d.i. ou 50 x 1 mm d.i., Brownlee Laboratories, Santa Clara, Califórnia, USA), (b) Aminoácido de cloreto de dimetil-aminoazobenzeno-sulfonilo (DABS-C1) foram separados e quantificados numa coluna de análise de aminoácidos PTC Brownlee (220 4 2,0 mm d.i.) (Applied Biosystems, Foster City, Califórnia, USA). I. Nomenclatura de peptídeos: Os prefixos que se seguem foram usados para designar; C, quimotripsina; D, endoproteinase Asp-N. Os peptídeos resultantes da sub-digestão dos peptídeos da endoproteinase Asp-N com protease V8 de S. aureus foram de- -51- signados por sufixos S com hifen. Os peptídeos foram numerados pela ordem das suas posições na sequência final. J. Clivagem com brometo de cianogénio: Após (10 ug) ter sido sujeito a vários ciclo de degradação de Edman no sequenciador de proteínas sem quaiquer PTH-aminoácidos detectáveis, a análise da sequência foi parada. Efectuou-se clivagem com brometo de cianogénio in situ do P40 nativo sobre discos para amostras em fibra do sequênciador de proteínas segundo um processo préviamente descrito (Simpson, I). Os níveis de fundo do sequênciador que surgiram durante a análise da sequência foram reduzidos por tratamento do disco de amostras com 30 ul de N-etil-morfolina aquosa a 50% (v/v) seguido de 20 ul de anidrido acético (60 min a 25QC). O filtro foi seco sob vácuo e depois testado com um excesso de 20 vezes de brometo de cianogénio em 70% (v/v) de ácido fórmico durante 15 h a 25QC. No final deste tempo o filtro da amostra foi seco sob vácuo durante 30 min. e continuada a análise de sequência de aminoácidos. K. Análise da sequência de aminoácidos: A degradação automática de Edman de proteínas e peptídeos foi efectuada usando se-quenciadores Applied Biosystems (modelos 470 A e 477 A) equipados com analisadores de feniltio-hidantoínas (Pth)-aminoácidos (modelo 120 A). Os derivados totais Pth-aminoácidos do sequênciador foram injectados no cromatógrafo líquido usando um sistema de transferência de amostra modificado como descrito £Begg et al., em "Techniques in Protein Chemistry", (Hugli, TE., Ed.) Academic Press, Orlando Fl, USA, a ser impresso/. Usou-se po-libreno como veículo. -52-
EXEMPLO 5
Purificação de peptideos por RP-HPLC em microbore
Cm-P40 (15 ug) foi digerido com endoproteinase Asp-N e o produto de digestão fraccionado por RP-HPLC numa coluna pequena de microbore (30 x 2,1 mm d.i.), empregando uma fase móvel de pH baixo (F^AcOH, pH 2,1) e um gradiente de acetonitrilo. Detectaram-se três picos principais contendo peptideos: Dl, D2, e D3 (Fig. 8). As análises espectrais destes peptideos foram efectuadas usando espectroscopia com um arranjo de fotodíodos de "real-time" e os espectros de absorção dos peptideos Dl, D2 e D3 estão apresentados na Fig. 9. A elevada absorvância a 290 mm do peptídeo Dl é indicadora da presença de um resíduo triptofano. Os peptideos D2 e D3 têm uma absorvância alta a 280 nm e uma absorção baixa a 290 nm que é caracteristica dos peptideos contendo tirosina. A presença do resíduo triptafeno no peptídeo Dl é apoiada pelo espectro de absorvância derivado mostrado na Fig. 10. O aumento da resolução por espectroscopia derivada de segunda ordem revela extremos a 29912 mm e 280 + 2 nm que são características dos resíduos de triptofeno. O peptídeo D3 foi subdigerido com protease V8 de £. aureus e o produto da digestão resultante foi fraccionado por RP-HPLC a pH baixo (F^AcOH) (Fig. 11A). A purificação por HPLC da fase inversa dos peptideos resultantes do tratamento de Cm-P40 com quimotripsina e tripsina for efectuada e analizada de modo semelhante. O fraccionamento em fase inversa destes produtos de digestão, no entanto, resultou num padrão complexo de picos contendo peptideos (Figs. 11B e 11C). Todas as fracções peptí-dicas de RP-HPLC da primeira dimensão foram sujeitas a um segundo passo cromatográfico usando o mesmo suporte cromatográ-fico e gradiente de acetonitrilo mas numa fase móvel diferente (e.g., cloreto de sódio não tamponado ou fosfato de sódio -53-
20 mM, pH 7,0). Para alguns peptídeos foi necessário um terceiro passo cromatográfico antes de se isolar um peptideo homogéneo. Nesta última situação usou-se na cromatografia uma coluna de ODS-hypersil e um solvente orgânico diferente (metanol) (Simpson II). EXEMPLO 6
Caracterização do estado de glicosilação de P40
Cm-P40 (0,5 ug) foi iodinado usan-125 do o processo do monocloreto de iodo. I-Cm-P40 foi separado 125 do I livre por filtração em gel e cromatografia de permuta 12 5 catiónica sequenciadas. I-Cm-P40, não tratado, reduzido com 2-mercaptoetanol durante 5 min a 95QC ou digerido com N-glica-nase F (Genzyme, Boston, MA, USA) ou endo-«(-N-acetilgalactto-samiaridase (O. glican-peptídeo-hidroláse, Boehringer Mannhein) durante 16 h a 372C de acordo com as instruções do fabricante, foi sujeito a electroforese num gel de gradiente de 10-15% de poliacrilamida na presença de SDS. O gel foi corado com Azul Coomassie R250 usando o sistema de electroforese Phast (Pharmacia, Uppsala, Sweden) de acordo com as instruções do fabri-125 cante, I-Cm-P40 foi detectado por autorradiografia usando Hypperfilm, MP (Amersham, Buckinghamshire, UK). P40 purificado iodinado migrou na electroforese como uma banda única de Mr aparente 32000-39000 daltons em SDS-PAGE 12% no estado não reduzido e reduzido (2--mercaptoctanol) (Ver Fig. 4, faixa 1 e 4) indicando que se trata de uma proteína monomérica. O tratamento de P40 com endo_ c(-N-acetilgalactosaminidase (O-glicanase) não tem efeito apa- -54-
rente na massa molecular (Fig. 4, faixa 3) mas o tratamento com N-glicanase F causar uma redução na Mr aparente para 15000-16000 Da (Fig. 4, faixa 2). A ausência de efeito da O-glicanase indica que P40 não contem cadeias de açúcar ligadas em O ou que estes sítios não são acessíveis na molécula intac-ta. Uma vez que N-glicanase F liberta fracções de açucares ligadas a resíduos de asperegina (ligadas em N) isto indica que P40 consiste num núcleo proteico (Mr 15000-16000) com quantidades consideráveis de açucares ligados em N. P40 de ratinho tem 126 aminoácidos. A Mr calculada a partir da sequência de aminoácidos analisada é de 14500. A diferença entre a Mr calculada e a Mr medida para ο P40 nativo (32-39kDa) pode ser atribuída à glicosilação em N uma vez que quando do tratamento com N-glicanase F a Mr é reduzida para 15000-16000 (Fig. 4). Os resultados da sequência da proteína proporcionam informação sobre o processamento pós--tradução do P40 maduro. Por exemplo, uma vez que nenhum ami-noácido foi identificado nas posições 32, 60, 83 e 96 (Fig. 10) e uma vez que estas posições são características de sítios de glicosilação ligada em N (i.e. Asn-Xaa-Tre/Ser), estes dados são consistentes com asperaginas sendo glicosiladas nestas quatro posições. A confirmação dos resíduos de asperagina nas posições 32, 60, 83 e 96 e o resíduo ($$H-terminal (Pre-126) foi conseguida por análise da sequência de um clone de cDNA de P40. -55- EXEMPLO 7
Análise do extremo N bloqueado de P40 murino A natureza do extremo N bloqueado foi determinada por uma combinação de análise de aminoácidos espectrometria de massa por bombardeamento com átomos acelerados e síntese de peptídeos. Estas análises indicaram que o extremo N do P40 de ratinho é provavelmente ácido piroglutâmico.
Seguem-se os métodos envolvidos na determinação do resíduo amino-terminal de P40 e uma discussão acerca deles: Método A. Análise dos aminoácidos: A análise dos aminoácidos foi efectuada num analisador de aminoácidos Beckman (modelo 6300) equipado com um sistema de dados modelo 7000 ou usando o processo de derivatização em pré-coluna de cloreto de dimetilami-noazobenzeno-sulfonilo (DABS-C1) usando uma coluna microboro para RP-HPLC (Simpson, et al., Eur. J. Biochem 153: 629-637, 1985). As amostras foram hidrolisadas in_ vacuo a 1102C durante 24 h com HC1 gasoso gerado a partir de HC1 6M contendo 0,1% (p/v) de fenol. B. Espectrometria de massa por bombardeamento com átomos acelerados: A espectrometria de massa por bombardeamento com átomos acelerados (Barber, et^ al. , Anal. Chem. 54: 645A-657A, 1982) foi efectuada usando um espectrómetro de massa de dupla focagem e geometria directa (VG Analytical, Manchester, UK) equipado com uma arma a átomos acelerados e campo curvo Ion -56-
Tech. A amostra foi aplicada em 2 ul de 0,1% (v/v) de F^AcOH aquoso à fase da amostra contendo 1 ul de mistura de ditio-treitil/ditioeritritol (5:1) pré-aplicado. Para o bombardeamento da amostra usou-se átomos de xenon a um potencial de 8 Kev e um potencial de descarga de 1 mA. Os varrimentos foram efectuados a 40s/decada a uma resolução de 1500. Os espectros de iões positivos foram adquiridos por análise de vários canais usando um sistema de dados VG11/250J. C. Síntese peptídica: Usou-se química de peptídeos em fase sólida de fluorenilmetoxicarbonil (Fmoc)-poliamida para sintetizar dois peptídeos correspondendo ao decapeptídeo N-terminal de P40 (peptídeo Dl da endoproteina Asp-N) com ácido glutâmi-co ou glutamina como resíduo amino-terminal. Empregaram-se os grupos protectores de cadeias laterais convencionais para Fmoc poliamida: Trp (CHO); Arg (Mtr), Mtr = 4-metoxi-2,3,6-trime-tilbenzeno-sulfonilo); Glu (OtBu); Cis (tBu). Os ésteres de pentafluorofenilo (OPfp) de todos os Fmoc-aminoácidos em dime-tilformamida com excepção de Fmoc-Arg (MtC) que foi activado como um éster de 1-hidroxibenzotriazole (HOBt) foram empregues no acoplamento sequenciado de aminoácidos activados na resina RaMPs (DuPont, NJ) Wang. A formação das ligações peptídicas está normalmente completa em 120 min desde que a concentração do éster OPfp seja 2,5 vezes superior à cromatografia da resina derivatizada e desde que um equivalente de 1-hidroxibenzo-triazole seja adicionado à mistura de acoplamento de modo a catalisar a reacção. Após finalizada a síntese, o peptídeo foi desportegido e clivado da resina por tratamento exaustivo com F^AcOH (contendo 5,4% de Tioanisol, 0,6% de 1,2-etanoditiol).
Os peptídeos sintéticos brutos e seus derivados (eg. S-carbo-ximetil-peptídeos) foram purificados por HPLC de fase reversa. Os peptídeos sintéticos puros, quando cromatografados surgiram como picos isolados em HPLC de fase inversa (coluna Brownlee RP-300 3 x 2,1 mm d.i.) e deram as proporções esperadas de aminoácidos .
Os peptídeos (30 ug em 100 ul de 0,1% F^AcOH) foram acetilados com anidrido acético por tramen-to com 6 ul de N-ètilmorfolina (Pierce, grau de pureza "seque-nal") seguido de 2 ul de anidrido acético (Fluka, grau de pureza "puriss") durante 10 min a 25°C. A formação de piroglu-tanil-peptídeos foi conseguida por tratamento do peptídeo com glutamina a 110QC durante 16 h a pH 7,8 sob azoto.
Discussão A análise dos três principais peptídeos Asp-N (D1-D3) e dos subpeptídeos de D3 obtidos com pro-tease V8 de S. aureus proporcionou 65% da sequência de amino-ácidos de P40. Dos três peptídeos, Dl, o único peptídeo contendo triptofeno estava N * -bloqueado, indicando que este peptídeo da fracção N-terminal da cadeia polipeptídica. A composição em aminoácidos do peptídeo Dl Asp-N bloqueado em N mostrou-se consistente com o peptídeo tríptico TI contendo trip-tofano com a adição N-terminal de dois resíduos extra (Gls e Arg) . A espectrometria de massa por bombardeamento com átomos rápidos (FAB-MS) do peptídeo Dl Asp-N revelou um ião molecular protonado (MH+) de massa 1248 que apenas corresponde à composição em aminoácidos deste peptídeo se o grupo bloqueador fosse assumido como sendo o ácido piroglu-tâmico. A natureza do grupo N-bloqueador foi examinada usando dois decapeptídeos sintéticos Dl com extremos tendo ácido glu-tâmico ou glutamina (Ver Fig. 7 e 12). Como se mostra na Fig. 12, o peptídeo Dl da endoproteinase Asp-N e o peptídeo sintético de piroglutamilo tiveram o mesmo comportamento em HPLC de fase inversa (tempo de retenção 20,50 + 0,2 min) e foram bem resolvidos relativamente ao peptídeo sintético de glutamilo (tempo de retenção, 22,70 + 0,2 min). Após acetilaçâo, o comportamento cromatografico de Dl e o peptídeo sintético de pi- -58-
ruglatamilo foi idêntico (nenhum aumento no tempo de retenção) enquanto que o peptídeo sintético de glutamilo acetilado apresentou uma diferença marcada no comportamento de retenção (tem po de retenção foi de 28, 97+0,2 min comparado com a forma não acetilada, 22,7o + 0,2 min). O extremo amina do P40 é provávelmente o ácido piroglutâmico uma vez que o peptídeo Dl amino-terminal da endoproteinase Asp-N se comporta exactamen-te do mesmo modo que o peptídeo sintético de piroglutanilo antes e após acetilação em HPLC de fase inversa. FAB-MS do peptídeo sintético de glutamilo deu um peso molecular de 1248 que estava perfeitamente de acordo com o obtido para o peptídeo Dl Asp-N. EXEMPLO 8
Actividade biológica de P40 purificado P40 purificado, em concentrações até 20 ng/ml, não suporta a proliferação de linhas de células mielóidas dependentes de IL3 (FDCP-1, Ea3.15 e DA-1), linfoma BCLl de células B dependente de IL5 ou o hibridoma 7TD1 de células B dependentes de IL6. Ao contrário de IL2, e até certo ponto IL4, não estimula qualquer um de seis clones de células T citolíticas testadas (Tabela 3). Pelo contrario, obse£ varam-se proliferações elevadas com algumas linhas de células T auxiliares mas não todas. Entre os clones que responderam encontram-se os clones produtores de IL2 (tipo TH^, TUC7.33) e produtores IL4 (tipo TH^, e.g., TUC2,15). Observou-se uma correlação significativa, ilustrada na tabela 3 para o clcne TUC7,51, 'entre o tempo passado em cultura e as respostas a P40 e IL4.
Comparação das actividades de factor de crescimento de células T de IL2,IL4 e P40 purificado (0 μ to Ο ο α Μ· 10 α φ μ ε φ 0 ιφ Ο Φ μ φ 4-1 -Η ι—1 ο Μ· μ α Μ to (0 'Φ U (U TJ to o c o i—I u o to (0 c
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Φ ι-Η φ -Φ 10 υ ι O CM (0 ·Η J < Τ Η - Φ Μ· Τ3 J (Π Η TJ φ Φ TI ΤΙ m ftj TI TJ *H •Η Φ φ TI τ to ο <φ C ε C0 ι—1 ι—1 Ε Ε Ο Ο υ υ φ Φ μ μ Ρ Ρ -μ -μ rH ιΗ Ρ Ρ U υ CQ U -60-
EXEMPLO 9
Clonagem e caracterização do gene P40 de ratinho
Despiste da biblioteca de cDNA.Pre parou-se cDNA de cadeia dupla de acordo com Gluber, et al_. , Gene 25: 263, 1983, usando RNA poliademilado isolado a partir de células T auxiliares produtoras de P40, TUC7-51, após uma estimulação de 24 h com ConA (2,5 ug/ml). O cDNA foi clonado no sítio BamHI de um vector pUC8 e usado para transformar E. coli estirpe DH5. Fez-se o despiste dos transformantes por hi-bridação _in situ com duas sondas oligonucleotídicas de 20-me -ros marcados nos extremos. Para o despiste inicial usou-se uma sonda degenerada 64 vezes [5 ’-TGCAT(C+T)TC(X)GT(CTT)TT(C+T)TG(G+A)AA-3'7correspondendo à sequência de aminoácidos FQKTEMQ (posições 114-120) ver texto). Os clones positivos foram subsequentemente testados com uma sonda degenerada 129 vezes CS 'GG(A+G)TC(A+G)TC(T+C)TT(X)AG(A+G)TT(CTT)TC-3 '7corresponden-do à sequência ENLKDDP (posições 17-23, ver texto). Séquência de DNA. Após subclonagem num vector M13 o DNA foi sequenciado pelo processo de didesoxi^ nucleotídeos. Obtiveram-se fragmentos adequados por digestão com do endonucleases de restrição Pstl e Ncpl usando a estratégia de sequenciação mostrada na Fig. 5.
Caracterização de cDNA e construção de vectores de expressão. Preparou-se uma biblioteca de cDNA, num vector pUC8, a partir de um clone de células T auxiliares que produz grandes quantidades de P40 após estimulação com ConA. Esta biblioteca foi despistada com duas sondas oligonucleotídicas sintetizadas com base em dados de sequência de aminoácidos seleccionadas obtidos por análise dos peptídeos -61- Ρ40. Dos 20,000 transformantes independentes, 112 hibridaram com as duas sondas. A maior parte destes clones continha inserções de cDNA com cerca de 500pb. Usando um destes cDNAs como sonda, obteve-se um sinal forte com um produto de transcrição de aproximadamente 700 nucleotídeos em transferências Nor-therm de RNA poli(A)+ isolado a partir do clone de células T auxiliares produtoras de P40, TUC7,51. RNA poli(A)+ do masto-citoma P815 que não produz actividade P40 detectável não deu qualquer sinal.
Para estabelecer que os clones se-leccionâdos continham cDNA de P40 autêntico, construi-se um vector de expressão. A inserção P40.2B4 foi clonada no sítio Bam Hl do plasmídeo pZIPnoSV(X)l (cepko, e_t al^. , Cell 37:1053 1984) e usada para transmitir fibroblastos Clone-ld (Kit, et al, Exp. Cell. Res. 31: 297, 1963). Os sobrenadantes celulares colhidos 48 h após transfecção foram testados quanto à sua actividade de factor de crescimento em células TSl dependentes de P40. Como se mostra na Fig. 6 os sobrenadantes das células trasnfectadas com cDNA de P40.2B4 (símbolos a cheio), mas não os de células com transfecção simulada (símbolos abertos), su portaram o crescimento de TSl. Este resultado indica que o cDNA de P40-2B4 contem presumivelmente toda a região codificadora de P40.
Determinou-se a sequência de nu -cleotídeos completa da inserção de cDNA do clone P40.2B4 que está apresentada na "Descrição 5' não traduzida de 15 nucleotídeos, uma grelha de leitura aberta de 432 nucleotídeos e uma região 3' não traduzida de 107 nucleotídeos. O extremo 3' termina com um segmento de 18 resíduos de adenina situada 12 nu-clzotídeos a jusante de uma sequência do sinal de poliademila-ção AATAAA. A região 3' não traduzida contem 3 cópias da se -quência ATTTa que é característica de genes expressos transitoriamente tais como GM-CSF, G-CSF, interferões, várias inter-leucinas, factor de necrose tumoral e os oncogenes C-fos e c-myc (Shaw et al, Cell 46 : 659, 1986); duas destas repeti - -62- -62-
ções nas posições de nucleotídeos 461-468 e 470-477 são parte de um segmento de nucleotídeos TATTTATT, o qual está também presente em muitas destas moléculas (Caput e_t al_, Proc ♦ Natl. Acad.Sci USA 83: 1670, 1986), O polipetídeo previsto codificado pela inserção de cDNA do clone P40,2B4 consiste em 144 resí -duos. O cálculo deste tamanho baseia-se no pressuposto que o primeiro ATG na sequência (posição de nucleotídeo 16-18) é o cordão iniciador, num ponto de vista apoiado pela expressão eficaz do cDNA com fibroblastos e pela presença de uma adeni-na na posição de nucleotídeo 13, de acordo com a sequência consensus para um codão iniciador ATG; um codão de terminação TGA na mesma grelha de leitura surje nos nucleotídeos 448-450. A sequência P40 reduzida é caracterizada por uma sequência hi-drofóbica N-terminal típica de um petídeo sinal. Devido à presença de um extremo N bloqueado na proteína nativa, existe alguma incerteza no que respeita ao resíduo N-terminal. Com base na matrix de pesos de probabilidades descritas (Von Heijne, Nucleic Acid Res. 14 : 4683, 1986), a sequência N-terminal mais provável da proteína madura seria Gln-Arg-Cis. Isto é consistente com a evidência obtida pela análise bioquímica dos peptídeos de P40. A proteína madura P40 consistiria então em 126 aminoácidos com um peso molecular relativo previsto de 14,150. A diferença em relação à Mr medida para P40 nativa parece ser devida à glicosilação conforme sugerido pela presença de 4 potenciais sítios de glicosilação ligados em N e confirmada pela Mr de 15KDa de proteína nativa após tratamento com N-gliconase. A sequência de P40 foi ainda caracterizada pela presença de 40 cisteiras e uma forte predominância dos re síduos catiónicos, o que explica o pi elevado (10) da proteína nativa. -63- EXEMPLO 10
Isolamento do gene genómico de P40 humano O gene P40 genómico humano foi cl£ nado usando um clone de cDNA de P40 como sonda. Resumidamente, uma biblioteca genómica humana foi construída no fago^GEMII com DNA cortado com Sau3A isolado a partir de uma linha de células linfoblastóides imortalizadas com EBV (CESS). Um clone resultante (λΗ403Α1) foi isolado por hibridação cruzada com o cDNA de P40 de ratinho. EXEMPLO 11
Isolamento do cDNA de P40 humano
Construi-se uma biblioteca de cDNA com RNA poli A+ preparado a partir de células mononucleares de sangue periférico estimuladas durante 24 h com fito-hema-glutinina e acetato miristato de forbol. A biblioteca foi des pistada com um fragmento de restrição de um clone genómico hu mano descrito no Exemplo 10. Um dos clones positivos foi se -quenciado pelos métodos descritos no Exemplo 10 e a sequência de DNA com a sua sequência de aminoácidos deduzida está apresentada na "Descrição detalhada do invento". A análise da sequência indicou que as sequências de aminoácidos de P40 de ratinho e humano têm 65% de homologia.
EXEMPLO 12
Efeito sinergéstico de P40 e IL4 ou IL3
Estudou-se os efeitos proliferatjÍ vos da co-cultura de células T auxiliares na presença de P40 e IL4 ou IL3. As células TUC2.15N e TUC7.41 (5xl0^/poço) foram cultivadas com quantidades subóptinas de P40 na presença ou au sência de uma dose subóptima de IL4 ou perto da dose óptima de IL3. Após 3 dias em cultura, as células foram marcadas com ti-midina triciada. Os resultados na Tabela 4 indicam que as célu las T auxiliares tratadas com P40 e IL4 ou P40 e IL3 incorpo -ram entre 4 e 40 vezes mais timidina do que as células trata -das com qualquer uma destas proteínas por si só. Assim existe um forte sinergismo entre P40 e IL4 ou IL3 relativamente a estimulação da proliferação de linhas de células T auxiliares que respondem a estas proteínas. -65- TABELA 4
Sinergismo entre P40 e IL4 ou IL3 Células P40 (U/ml) IL4 (U/ml) IL3 (ng/ml) Incorporação de timidina (cpm) TUC2,15N 0 0 0 122 80 0 0 1296 0 20 0 4446 80 20 0 19248 0 0 3 4781 80 0 3 54366 TUC7,51N 0 0 0 120 80 0 0 4958 0 20 0 4459 80 20 0 31050 0 0 3 4354 80 0 3 72157 Células T auxiliares TUC2.15N e TUC7,51 (5xl0^/cavidade) foram cultivadas com quantidades subóptimas de P40 na presença ou absência de uma dose subóptima de IL4 ou de uma dose óptima de IL3. As culturas foram marcadas por pulsos com timidina tricia da após 3 dias
Claims (11)
- -66- REIVINDICAÇÕES: 1§. - Factor de crescimento de células T de mamífero, biologicamente puro, caracterizado por compreender uma proteína capaz de suportar o crescimento de células T independente de interleucina 2 e interleucina 4.
- 23. - Factor de crescimento de células T de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por o mamífero ser murino ou humano. 3§. - Factor de crescimento de células T de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por a referida proteína ser P40.
- 43. - Factor de crescimento de células T de acordo com a Reivindicação 3, caracterizado por a referida P40 ser uma glicoproteína.
- 53. - Factor de crescimento de células T de acordo com a Reivindicação 4, caracterizado por a referida P40 ser uma glicoproteína de cadeia única. 63. _ Factor de crescimento de células T de acordo com a Reivindicação 5. caracterizado por a referida glicoproteína ter um peso molecular de desde cerca de 30 kDa a cerca de 40 kDa. - Factor de crescimento de células T de acordo com a Reivindicação 6, caracterizado por -67- a referida glicoproteína ter uma porção proteína tendo um peso molecular de cerca de 14 kDa a cerca de 16 KDa.
- 85. - Factor de crescimento de células T de acordo com a Reivindicação 3, caracterizado por a referida P40 ser P40 murina tendo uma sequência de amino--ácidos que compreende: -18 -10 MetLeuValThrTyrlleLeuAlaSerValLeuLeuPheSerSer 1 10 ValLeuClyClnArçpy^SerThrThrTrpGlylleArgAspThrAsnTyrLeuIleClu • 100 20 _ _30 γ AsnLeuLysAspAspProProSerLyspy^3erjZy^SerGlyAsnValThrSerpy;(Leu 40 50 fCy^LeuSerVal Pr oThr AspAs;}; yjjThrThrPrcpyjfTyrArgCluClyLeuLeuCln T 200 €0 70 . ... LeuThrAsnAlaThrClnLysSerArgLeuLeuProValPheHlsAxçValLysAxglle 300 80 γ _ 90 __ ___ γ ValGluValLeuLysAsnIleThd3vsí?r©SerPheSeif5y^31uLysPrcf2y"^AsnGln 100 110 ThrHetAlaClyAsnThrLeuSerPheLeuLysSerLeuLeuGlyThrPheGlnLysThr 400 120 128 GluMetClnArgClnLysSerArgPro
- 95. - Factor de crescimento de células T de acordo com a Reivindicação 3, caracterizado por a referida P40 ser P40 murina tendo uma sequência de amino-ácidos que compreende: -68-1 10 ClnArçjJy^SecThxThrTrpClylleArgAspThrAsnTyrLeuIleClu • 100 20 _30 y AsnLeuLyiAspAspProProSerLyspyijSeijCy^SerGlyAsnValThrSe cpy^Leu 40 50 [Ty^LeuSe rVaIP roThrAspAspfTy^ThrThrPrcpy^TyrArgGluGlyLeuLeuGln T 200 60 70 ·- LeuThrAsnAlaThrGlnLysSerArçLeuLeuProValPheHlsArqValLysArglle 300 80 y 90 T ValGluValLeuLysAsnIleTh^;vii?roSerPheSeij;y:|31uLysPrc^;yij.\snGln 100 HO ThrHetAlaClyAsnThrLeuSe rPheLeuLysSerieuLeuClyThrPheGlnLysThr 400 120 126 GluMetGlnArgClnLysSerArqP ro 10â. - Factor de crescimento de células T de acordo com a Reivindicação 3, caracterizado por a referida P40 ser P40 humana tendo uma sequência de amino--ácidos que compreende: -69--10 HET LEU LEU ALA HET VAL LEU THR SER ALA LEU LEU LEU CVS SER VAL ALA 1 10 ·, ' GLY GLN GLY CYS PRO THR LEU ALA GLY 1LE LEU ASP ILE ASN PIIE LEU 1LE ASN LYS HET 20 30 GLN GLU ASP PRO ALA SER LYS CYS HIS CYS SER ALA ASN VAL TIIR SER CYS LEU CYS LEU 40 50 GLY ILE PRO SER ASP ASN CYS TKP. ARG PRO CYS PIIE SER GLU ARG LEU SER GLN HET THR 60 10 ASN THR THR HET GLN THR ARG TYR PRO LEU ILE PHE SER ARG VAL LYS LYS SER VAL GLU 60 90 VAL LEU LYS ASN ASN LYS CYS PRO TYR PHE SER CYS GLU GUI TRO CYS ASN GLN THR THR 100 .. _ . 110 ALA GLY ASN ALA LEU THR PHE LEU LYS SER LEU LEU GLU ILE ΠΙΕ GUI LYS GLU LYS HET 126 ARG GLY HET ARG GLY LYS ILE · _ Factor de crescimento de células T de acordo com a Reivindicação 3, caracterizado por a referida P40 ser P40 humana tendo uma sequência de amino--ácidos que compreende: 1 GLN GLY CYS PRO 20 GLN GLU ASP TRO ALA 40 GLY ILE PRO SER ASP 60 ASN THR THR HET GLN 60 VAL LEU LYS ASN ASN 100 ALA GLY ASN ALA LEU ARG GLY HET ARG GLY THR LEU ALA GLY ILE SER LYS CYS HIS CYS ASN CYS THR ARG PRO THR ARG TYR PRO LEU LYS CYS ΡΠΟ TYR FIÍE THR PIIE LEU LYS SER 126 LYS ILE 10 LEU ASP ILE ASN PIIE 30 SER ALA ASN VAL TIIR 50 CYS PHE SER GLU ARG 70 ILE PIIE SER ARG VAL 90 SER CYS GLU GUI ΓΠΟ 110 LEU LEU GLU ILF. ΓΙΙΓ. Ί LEU ILE ASN LYS HET SER CYS LEU CYS LEU LEU SER GLN HET THR LYS LYS SER VAL GLU CYS ASN GLN THR THR GUI LYS GLU LYS* HET -70- -70-
- 121. - Factor de crescimento de células T de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por ser capaz de aumentar a proliferação de IL3- ou IL4-células responsivas.
- 131. - Derivado activo ou fragmento activo de P40 de mamífero, caracterizado por a referida actividade ser estimulante do crescimento das células T auxiliares independente de interleucina 2 e interleucina 4.
- 141. - Fragmento proteolítico isolado, caracterizado por ser de P40 de mamífero.
- 151. - Método para a preparação de factor de crescimento de células T de mamífero, capaz de suportar o crescimento das células T auxiliares independente de interleucina 2 e interleucina 4, caracterizado por compreender o contacto de uma cultura de células T auxiliares com um antigénio ou um mitogénio durante um período de tempo esob condições suficientes para induzir a produção do referido factor e a recuperação do referido factor a partir da cultura.
- 161. - Método para a purificação de P40 de mamífero, caracterizado por compreender o contacto da cultura sobrenadante de uma linha de células T auxiliares estimuladas por antigénio ou mitogénio com uma resina hidro-fóbica de cromatografia, a identificação e a recuperação de uma primeira fracção obtida a partir daí tendo actividade P40, o contacto da referida primeira fracção com uma resina de permuta iónica de cromatografia, a identificação e a recuperação de uma segunda fracção obtida a partir daí tendo a referida actividade, o contacto da referida segunda fracção com uma resina de HPLC de fase reversa e a identificação e a recolha cjjinrocom um antigénio ou. um mitogénio durante um sob candiçoas suficientes para induzir a factor e 3. recuaeração do referido fa.ctor a c é I u. 1 a.s T au. x i 1 iares período de tempo e produção do referid o partir da cu1tura. lójí, — Método para a purificação de P4© de mamífero, caracterizada por compreender α contacto de sobrenadante de cliI tura de uma linha de células T auxiliares estimuladas por antigénio ou. mitogénio com uma resina hidrofóbica de cromatogra— fia, a identificação e a recuperação de uma primeira fracção obtida a partir daí tendo actividade Ρ4Θ, o contacto da referida primeira fracção com uma resina de cromatografia de permuta iónica, a identificação e a recuperação de uma segunda fracção obtida a partir daí tendo a referida actividade, o contacto da referida seguínda fracção com uma resina de HPLC de fase reversa e a identificação e a recolha de uma terceira fracção obtida a partir daí tendo a referida actividade, pelo que a referida terceira fracção é F'4© homogénea. 17ã. - Método de acordo com a reivindicação 16, carac-terizado por a referida resina hidrofóbica ser a resina TSK-fení-lica de cromatograf ia, a rferida. resina de permuta iónica ser resina Mono—Q de cromatograf ia e a resina de fase reversa ser Lima resina Cl de HPLC de fase reversa. lBi. - Método de acordo com a rei'/indicação 16, carac-terizado por a referida actividade ser estimulante do crescimento das células T auxiliares independente de interleucina 2 e inter-leucina 4. 19ã. - Método para a proliferação de células T auxiliares num mamífero, em que o mamífero é de preferência um ser hLimano e a proliferação de tais células é de preferência BAD ORIGINAL A -72- ' lioe f ec tuada. p-or admi π i s ΐ· p a c e x ή t- p v 0 Π O 55; 1 Pr t- P a m O s c u í a p . x π ·.- p a τ *í a ss. i j i n c r a.oe r m I Cri , m v raper i tonea i, POP SUpOSIv 6 r i o S ou ora.i j carac t erizado PO P c o m p p 0 0 π o 0 p a a o mi nisí-racbo ao rei e P 1 .•-i.—. r. \ —. #·.·. 1 . _ ffjdr.fsf x { cr PO O d? UOi0. qua.Pi í 1 Ο 0. GS G0 P -4b > d-ri um seu oerivaoo í u Ge um seu í" P aqme Π t·1-1 cíC ΐ· 1 VO ; 0 τ i c o.z pa!’ a a p roli feracão dur an te u m i-ernp o* e sob c or.d i ς bes suf i c i en t-es pa r a que as PSiepioas c e i u i as prolife P 0íVf j 0m qO0 a refe rida quantidade eficaz e desde cer ca de 10 ,ug ate cerca de 1000 .us Pop qu i iograr-i a os peso corpo r a I PO p o i a.. 20sí-. - Método para a proliferacão de C 0 1ulas que pespondefi) a i L. 0 nu m mamífero, em que o mamífero é de prefersnc i a. UiH S cr P ti U i I i 0. Π O bj a p- r o 1 i í e r a. ς ã o d e tais células é de P p 0 τ e p e n c i a u 11 yO. 1 / p:_i P 5L"ÍP:L*3 X Ί· òri o a administração ao refe pi P40 eficaz para a p 05 su fi cien tes pa ra que 0 a referida quan 11 da.i efect-uada por administração intravenosa, intramuscular, intrana-sal, intradèrmica, mtrapei caractsrizado por compreendi pó de uma quantidade de IL·: durante um tempo e soo condi d a a c e i u i as p r o i i f e r e m, tr m que cssce cerca, de 10 /jg ate cerca, oe iuuu íjg por qí- iograma de peso corporal por dia de cada um de IL.3 e Ρ40. 21s. - Ma t· ogo pa. r a. a proi ifera.ςão de c e i u 1 as que respondem a IL4 n ΟΠΐ ma Γΐί i f* cr P U j 0frl ! que o mami fero S G0 pref eré nc ia um ser humano e a proliferacão de cais c eiu1as b G0 pref e r e nc i a et ec tuaaa p^ar administração intravenosa, intramu^cular, 2ntraiid sal, intradermica, intraperitoneai, por supositôrios ou orai, caracterizsdo por compreender a administracão ao referido mamífero de uma quantidade de IL4 e P40 eficaz para a. prol i f eracão, durante um tempo e sob condicSes suficientes para que as referidas células proliferem, em que a referida qua.ntioa.de eficaz é desde cerca de 10 ;jg até cerca de 1000 ,ug por quilograma de peso corporal por dia de cada um de IL4 e P40.Γ BAD ORIGINAL U-—2'2â, — Método de acordo com as Reivindicações 2vS ou 21, raracterizado por as referidas célu.ia.s serem células T auxiliares . 23*. — Método de acordo com a Reivindicação 19, carac— terizado por compreender a. administração de uma molécula de ácido nucleico codificadora de Ρ4Θ, de um seu derivado, ou de um seu fragmento activo, ao referido mamífero, em que a referido ácido nucleico dirige a. expressão de uma quantidade eficaz da referida P4Ô, do referido derivado ou do referido fragmento. 24§. — Método de acordo· com a Reivindicação 2Θ, carac— terizado por compreender a administração >de um ácido nucleico codificador de IL3 ou Ρ4θ, ao referido mamífero, em que o referida ácido nucleico dirige a. expressão de uma quantidade eficaz do referido IL3 ou do referido Ρ4Θ. 25*. - Método de acordo com a Reivindicação 21, carac-terizado por compreender a administraçao de um ácido nucleico codificador de IL4 ou Ρ4Θ, ao referido mamífero, em qu.e o referido ácido nucleico dirige a expressão de uma quantidade eficaz do referido IL4 ou do referido P40. 26*. - Método para o tratamento da imuno—deficiência num mamífero, em que o mamífero é de preferência um ser humano e a. proliferação de tais células é de preferéncia efectuada por administração intravenosa, intramuscular, intranasal, intradér— mica, intraperitoneal, por supositórios ou oral, caracterizado por compreender a administração ao referido mamífero de uma quantidade de P4€», de um seu derivado, ou de um seu fragmento activo, eficaz para proliferação durante um tempo e sob condições suficientes para efectuar a proliferação das referidas células T auxiliares, em que a referida quantidade eficaz é desde cerca de BAD ORIGINAL 0Iv ;.jg a.T. O I 0. . é cerca de 1000 /jg por qui 1 ogrsma de peso '27 ~ . — Método tratamento cie imuno-def iciènc num ma. mi fero, em que o me. m i f e r o e de preferencia uni ser ríuma.no e a proliferação de tais células é de preferência efeciuada por administração intravenosa, intramuscular, intranasal, intrader-mica, intraperitoneal , por supositórios ou oral, cara.cterizado por conipreender a acm i n isc-e.ção ao rerer igo mami τ ero de uma quantidade de IL3 e F'4õ sficsz de prol i fereção durante um tempo e condições suficientes para efectuar a proliferação de células que respondem a 11.-0, em que a reTerida quant-idaoe ei ιcaz é casca cerca de 10 ;jg até cerca, de 1000 ;jg por quilograma de peso corporal por dia de cada um ca IL3 e P40. 2oé. - nêtodo para o tratamento de imuno-efieiencia num mami í ero , em que o ms.mi τ ero é de pref erénc ia. um se)* nums.no e a P Γ Oi I Τ5Γ 3. ção de tais c é 1 u í as £ Ge preferencia 0 í 0C Í-U3.03 ρο r c.Gíil X Π .1 3 ΐ· Γ ação mtra.ve: nos a , ι n t- rumo i 1' f ι ΐ ι f · r a * ι c* - ai , mtraoér- ro i c a., ι n t- raparitonea1 , por sup o31 vór ι o3 οu o r 3. ι ; carac terizaco por c omp-reender Λ admmistaçâo ao Γ6Τ tf r ι o o mamife ro de orre q u a n c· ι o a o e d e IL4 e P4u aiícaz par 3. 3. p r O i 1 f era. ção durante um tempo e condiç ões su f ι c i en tes pa. r a. pt Pr t-ue r a p· r o 11 f e r a ç ão Oe células que respondem a IL4, em que a referida quantidade eficaz è desde cerca. de 10 pg até cerca de 1000 ;jg por quilograma de peso corporal por dia de cada um de IL4 e P40. 29=5. - Método de acordo com a Rei vindi cação 27 ou 28, cara.c ter izado por as referidas células serem células f auxiliares . açSo de uma composição oe cêxuxas I auxi1iares 30d. - Processo para a prep farmacêutica para induzir a proliferação de células BAD ORIGINAL 0mamife ros, c aractsrizado pur i η c 1 U 1 Γ i t a referida composição a. quant i d a o e eficaz de P40 um seu der i vado activo, um seu aqmento , ou. uma sua fo í t Ltí <j θ um v e í c u. lo farmaceuticaments e i t á. v e 1 31*» -- Ftdcssíq para a preparação da uma composição •farmacêutica para induzir a proliferação de células que respondem a IL3 em mamíferos, caracterizado por se incluir na referida composição uma quantidade eficaz de IL3 e P40, ou uma. sua. fonte, e um veículo farmaceuticamente aceitável. 32*. - Processo para a preparação de uma composição farÍTiãcêutica para induzir a prol íf a? ^ cl W «rrí i-> de células que respondem a IL3 em mamíferos, caracterizado por se i n c 1 u. i r na re f e rida composição uma quantidade eficaz de IL4 e P4Õ, ou uma sua. fonte, e um veículo farmaceuticsmente aceitável. Process; d a preparação um; CDiTipuSIij a D farmacêutica de acordo com a Reivindicação 30, 31 ou 32, caracte-rizado por a referida fonte ser um ácido nucleico que codifica o referido Ρ4Θ, o referido derivado P40, o referido fragmento P40, il: 34*. - Processo para a preparação de uma composição farmacêutica de acordo com a Reivindicação 30, 31 ou 32, caracte-rizado por a quantidade eficaz do referido P4-0, do referido derivado P40, do referido fragmento P40, da referida IL3 ou da referida IL4 ser de cerca, de 10 pg a cerca de 1000 pq por kg de peso corporal e por dia. 35*. - Anticorpo, caracterizado por ser contra o factor de crescimento de células T de acordo com qualquer uma das ifeivindicaçSes 1 a. 12. bad 0B>g,NAL36â. — Anticorpo de acordo caractsrizado por ο P40 de mamífero humano» com a Rsivindicaçao P4Q fnuri.no ou ._·· ·_.>, P40 Je 37:5- - Anticorpo caracterizado por ser contra u F40 um mamífero, um seu derivado antipénico ou. um seu fragmento an tiqen icd„ 3BÊ. — Anticorpo de acordo com a Reivindicação 37 caracterizado por o referido anticorpo ser policlonal ou monoclo-nal . de acordo com a Reivindicação 38 um mamífera ser F40 mu.rino ου. P40 39§. - Anticorpo caracterizado por o F4C' de humano. 40â. - Método para a imunodetecção de Ρ40 num tecido, e::tracta de tecido ou. sora de um mamífera, caracterizado por compreender o contacto do referido tecido, eiítrac to de tecido ou o referiria sara com um anticorpo de acordo com a Reivindicação 35., num imunoensaio, de modo a formar o complexo de anticorpo e P4ú e a sujeição do referida complexo de anticorpo e Ρ4Θ a meios de detecção. 41â. - Método para a imunodetecção de P40 num tecido, extracto de tecido ou soro de um mamífero, caracterizado por compreender o contacto do referido tecido, extracto de tecido ou α referido soro com um anticorpo de acordo com a Reivindicação 37, num imunoensaio, de modo a formar o complexo ds anticorpo e F40 e a sujeição do referido complexo de anticorpo e Ρ4Θ a meios de detecção BAD ORIGINAL' 3. isolado nucleico que codifica. P40 de um mamífero, um sau der do.ou um seu fragmento, ero que o mamífero ê de preferencia um humana ou murino, caracterizado por compreender a identitic de um clone de cDNA que codifica o referido P40 de maméfero referido derivado, ou. o referido fragmento por hibridação com •sonda al igonuc leotídica que codifica pelo menos uma sequência amino—ácidosda do referido Ρ4Θ, do referido derivado* ou referida fragmento, ou com uma sonda que codificai um gene de de mamífero, de um seu derivdo ou de um seu fragmento, preparação a partir daí do referido ácido nucleico isolado. , o uma de do Ρ4Θ e a 43s. - Processo para. a. preparação de um ácido de acordo com a Reivindicação 42, caracterizado por α nucleico referida ácido nucleico ser um RNA, um mftNA, um cDNA,um DNA recombinante um DNA recombinamte que codifica um cDNA ou um clone genómico do referido P4u ou de um seu derivado. 44£. — Processo para acordo com a Reivindicação 42, ter uma sequência nucleotídica compreende: pftpnÇeO de arac ter i z ado que codific pot o referido η|\| 3 ° Ρ4Θ »Γίη0 qL, BAD OBIGIWAL CÈ 5 ' CACA: .Λ W «.Ο , , Λ W A λ. · Aw « · · Λ · » «#ΛΑ ICO c Λα - «. « WA>A<rfWn « υΛ· wmAmmW « «300 c • · WAA ΛΛΛ^ΑΛμΛ» yn AW AA.AwAo . W · teA · . . « . ij A/> <^A*J «»·«···· WWVMA·· W * . * «Aw/W\WAtaA •sOO CA A Λ^ΛΛΛΛ* 5C0 A« · «v , 3 * a preparação de um ácido nucleico 42, caracterizado por o referido ídica que codific a. ο P40 hu.mano 45s. - Processo para e acordo com a Reivindicação DNA ter uma sequência, núcleot. ae compreende: BADomeiNM- á CCCCTGTCAAG ATG CTT C7G GCC ATG GTC CTT ACC TCT CCC CTG CTC CTG TGC TCC CTG OCA 62 GGC CAG GCG TGT CCA ACC TTG CCG CGG ATC CTG GAC ATC AAC TTC CTC ATC AAC AAG ATG 122 CAG GAA GAT CCA GCT TCC AAG TGC CAC TCC AGT CCT ΑΛΤ CTG ACC AGT TCT CTC TCT TTG 1B2 GCC ATT CCC TCT GAC AAC TGC ACC ACA CCA TGC TTC AGT GAG ACA CTC TCT CAC ATG ACC 2<2 AAT ACC ACC ATG CAA ACA AGA TAC CCA CTG ATT TTC AGT CCG GTG ΑΛΑ ΑΛΑ TCA CTT CAA 302 GTA CTA AAG AAC AAC AAG TCT CCA ΤΛΤ TTT TCC TCT CAA CAG CCA TGC AAC CAA ACC ACG 3£2 CCA CCC AAC CCG CTG ACA TTT CTG AAG AGT CTT CTC CAA ATT TTC CAC ΛΛΛ CAA AAG ATG <22 AGA GCG A7G ACA GGC AAG ATA TGAACATGAAATATTATTTATCCTATTTATTAAATTTAAAAA «8S46â. - Processo de acordo com a Laracterizado por o referido ácido nucleico ap sequancia nucleotídica que codifica uma sequência de de F'4t·;· murino que compreende:BAD ORIGINAL1 10 ClnArçfTyqie tThrThrTrpCly1leArqAspThrAsnTyrLeu IleClu • 100 20 _ _30 γ _ AsnLeuLysAspAspProProSerLyipyqãeq-y qãerClyAsnValTíirSerpy qLeu 40 _ 50 ]:·/qLeuSer Vai ProThr AspAi qCyqThzThrPrcpyqryrArçCluClyLeuLcuCln T 200 60 70 -- Le uThr AsnAl iTíi r ClnLy sSc rArpLeuLeuP r oVa lPhe Hi s Αχς’/a 1 Lys Ar q 11 e 300 80 y _ 90 _ _ γ ValCIuValLeuLyrAsnI lcThaCvaProSerPfieSeqly qlluLy sPraly HsnCln 100 110 Tíir^ct AlaClyAsnT::7l.tuSc rPí-.eLeuLysSerLcuLeuClyTíirPheClnLysThr 400 120 126 CluMecClnArqClnLysSerArqPro IO uma C idos 47§. - Processa de acordo com a ReivindicaçSo csracterizado por o referido ácido nucleice apresentar sequência nuc leotídica. que codifica uma sequência de aminaá de F‘40 murina que compreende:bad orig|NAL 1 -1 λ ΚΕΤ LEU CLY CLM CLY CYS PRO 20 CL» CLU ASP PRO ALA 40 cly ile γρο sra as? ¢0 ASM THR THR MET CL'.I 00 VAI· LEU LYS ASM ASM 100 ALA CLY ASM ALA LEU ARC CLY MET ARC CLY LEU ALA MET VAL LEU THR LEU ALA CLY 1LE SER LYS CYS HIS CYS ASM CYS TliP ARC F?0 THR ARC TYR FPO LEU lys cys rno tyr πιε THR PllE LEU LYS SER 126 . LYS 1LE THR SER ALA LEU LEU 10 LEU ASP ILE ASM ΓΙΙΕ 20 SER ALA ASM VAL THR SO CYS PllE SER CLU ARC Y0 1LE PllE SER ARC VAL 90 SER CYS CLU CLM rno no LEU LEU CLU ILE rtiE LEU CYS SER VAL ALA < · LEU JLE ASM LYS MTT SER CYS LEU CYS LEJ LEU SER CLM MET THR LYS LYS SER VAL CLU CYS ASM CLll THR THR. CU1 LYS CLU LYS MET com a Rsividicação 42, nucleicc apresentar uma sequência aminoácidos de 48§. - Processo de acordo caracterizado por o referido ácido sequência nucleotídica que codifica uma P4<.;> humano que compreende; BAD ORIGINAL Aι ίο : ι CLU CLY CYS PRO TIIR LEU ALA CLY ILE LCU ASP ILE ASM ΓΙΙΓ. LCU ILE ASM LIS HCT 20 30 CLU CLU ASP PRO ALA SER LYS CYS HIS CYS SER ALA ASU VAL TIIR SCn CYS LCU CYS LCU 40 50 CLY 1LE PRO SER ASP ASII CYS TIIR ABC PRO CYS PIIE SER CLU AnC LEU SER CUl HCT 7HR C0 10 ASII TIIR TIIR HCT CLII THR ARG TYR PRO LEU 1 LE PIIE SER ARC VAL LYS LYS SCR VAL CLU 60 9» VAL LEU LYS ASU ASU LYS CYS PRO TYR ΓΙΙΕ SER CYS CLU CU' PRO CYS ASU CUl TIIR THR 100 110 ALA CLY ASN ALA LEU TIIR PIIE LEU LYS SER LEU LEU CLU I LE ΓΙΙΓ. Cl U LYS CLU LYS'HET 126 ARC CLY HET ARC CLY LYS 1 LE 49§ Processa de acordo com a Reivindicação ceracterize.do por o referido ácido sequericia nucleotidica que codifica uma P4u humano qu.e compreende; nucleico apresentar Ξ-equãncia aminoá.c ido uma de BAD ORIGINAL - ^___ -1 10 Cl n Ac ç£TyqSe rThrThrTrpClyIleAxqAspThrAanTyrLeuIleClu 100 20 _ 30 T _ AsnLeuLysAsoAspProProSe r Ly ipyqãeq-y ^5crClyAsnVa lTíirSe rpy qLeu _ 40 _ 50 [TT^LeuSerV4lProThrAspA=3;yqinrThrPrcpyqryrArqCluClyLeuLcuCln T 200 60 30 ··· LeuTísrAsivAlaThrClnLysSer AxqLeuLeuProV4lPh«HlsArq'.'4 ILy sArql 1« 300 80 γ _ 90 _ _ T Va1CIuValLe uLysAsnlleThaCvaProSerPheSe aly qiluLysPraly aAsnGln 100 110 Al-iClyAsnTnrLíuScíP^eLeuLysScricuLeuClyThrPheClnLysThr 400 120 126 GluttetClnArqClnLysSe rArqPro 50d. - Processo de acorda com a Reivindicação 42, caracterizado por se preparar o ácido nucleico isolado que codifica u.m gene genómico para ο P40 murino. 51*. - Processo de acordo com a Reivindicação 42, caracterizado por se preparar o ácida nucleico isolado que codifica um gene genómico para d P4# humano. 52*. - Vector de expressão replicável caracterizado por compreender o ácido nucleico de acordo com qualquer uma das Reivindicações 42-51 em que o referido ácido nucleico está operacionalmente ligado à sequência nucleotídica capaz de efec-tuar a expressão do referido ácido nucleico. b*D 0R'g'NM·teri zado por o referido vector ser capaz de replius^ão num e lí cario 13. O Li p Γ o C 3 r i O 13. a / 54â. — Microrganismo ou célula, caracterizado por ser transformado por um ácido nucleico de acordo com qualquer uma das Reivindicações- 42-51 . 55¾. - Microrganismo ou célula, caracterisado por ser transformado por um vector de acordo com a Reivindicação 52. 56¾. - Processo de acordo com a Reivindicação 16, caracterizado por se preparar F'40 recombinante de um mamífero, de preferlncia de um ser humane ou murino, ou um seu derivado ou um seu fragmento. a preparação de P40 recombinante 56, caracterizado por o referido 57¾. - Processo para de acorda com a Reivindicação P40 ser biologicamente puro. 58â. - Processo para a preparação de Ρ4Θ recombinante, caracterizado por o referida Ρ40 ser produzido a partir de um vector de acordo com a Reivindicação 52. 59¾. - Equipamento compartimenta 1izado para detecção de P40 caracterizado par estar adaptado para receber: um primeiro recipiente adaptado para conter um anticorpo contra ο Ρ4Θ de um mamífero, um seu derivado antigénico ou um seu fraqmento antiqé— nica; um segundo recipiente adaptado para conter um segundo anticorpo, em que o segundo anticorpo é capaz de dstectar um complexo anticorpo—antigénio do referido primeiro anticorpo com o referido Ρ40, seu derivado ou seu fragmento, estando o referido BAD ORIGINAL Jj segundo -anticorpo marcado cofn u.nia malécu. 1 a repórter e capai de fornecer um sinal detestável„ 60é, - Equipamento de acorda com a. Reivindicação 59, caracterizado par a molécula repórter ser um radioisótopo, uma encima, uma molécula, fluorescente, uma molécula qu.imioluminescen-te ou uma molécula bioluminescents. ólâ. - Equipiamento de acordo com a Reivindicação 60, caracterizado por a molécula repórter ser uma encima. 62â. - Equipamento de acorda com a Reivindicação 61, caracterizado par compreender um terceira recipiente adaptado piara conter um substrato para a. encima. Lisboa, 19 de Setembro de 1939VICTCfl C03D@N( 10-A 1,* 1200 LISBOA BAD ORIGinml.
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