JPH1070986A - ヒトＴｈ１特異的タンパク質及びこれをコードする遺伝子、並びにこれに関連する形質転換体、組換えベクター及び抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】ヘルパーＴ細胞のサブセットである、Ｔｈ１と
Ｔｈ２との分布の極性化における知見に基づく、免疫関
連疾患の病勢や病型の特定手段を提供すること。 【解決手段】ヒトＴｈ１にのみ特異的な遺伝子をサブト
ラクション法により調製・特定し、この遺伝子を組み込
んだ組換えベクターとこの組換えベクターで形質転換さ
れた形質転換体、この形質転換体等に由来する上記遺伝
子がコードするヒトＴｈ１特異的タンパク質、さらには
このヒトＴｈ１特異的タンパク質を抗原とする抗体を調
製して、これらの遺伝子，タンパク質及び抗体等を、Ｔ
ｈ１とＴｈ２との分布の極性化の特定手段や是正手段と
して用いること。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、Ｔｈ１特異的タン
パク質及びこれをコードする遺伝子に関する技術分野に
属する発明である。より詳細には、アトピー性疾患の発
症，エイズの劇症化等に深く関わるヘルパーＴ細胞群に
おけるバランスの変化を迅速かつ簡便に特定する手段と
して用いることができるヒト１型ヘルパーＴ細胞にのみ
特異的なタンパク質及びこれをコードする遺伝子に関す
る。また、本発明はこの遺伝子を組み込んだ遺伝子発現
用組換えベクター，このベクターで形質転換した形質転
換体に関する技術分野に属する発明である。さらに、本
発明は上記のＴｈ１特異的タンパクを抗原とするポリク
ローナル抗体及びモノクローナル抗体とこれを産生する
ハイブリドーマに関する技術分野に属する発明である。

【０００２】

【従来の技術】近年、免疫学は驚くべき進歩を見せ、そ
の医学分野における貢献は多大である。免疫学は、感染
免疫，腫瘍免疫，アレルギー，アナフィラキシー等のど
のような免疫反応でも、その促進と抑制の中心的役割を
果たしているのは、マクロファージやリンパ球等が産生
するサイトカインであることを既に明らかにしている。
Mosmann とCoffman らは、マウス脾細胞から樹立した長
期培養可能なＣＤ４⁺Ｔ細胞クローンを、その産生する
サイトカインの違いから異なる２つのサブセットに分類
した（Mosmann,T.R.,et al.,J.Immunol., 136 ,2348(19
86) ）。

【０００３】すなわち、主にＩＬ−２，ＩＦＮ−γ及び
ＴＮＦ−βを産生する「Ｔ−helper１（Ｔｈ１）」と、
主にＩＬ−４，ＩＬ−５，ＩＬ−６，ＩＬ−１０及びＩ
Ｌ−１３を産生する「Ｔ−helper２（Ｔｈ２）」とに分
類した。ヒトにおいては、当初このようなヘルパーＴ細
胞のサブセットの存在は疑問視されていたが、現在では
その存在が明らかに認められている（Romagnani,S., Im
munology Today 12,256(1991) 等) 。

【０００４】現在、これらのマウスやヒトのヘルパーＴ
細胞サブセットＴｈ１，Ｔｈ２の性状や機能がますます
明らかになりつつあり、多くの免疫反応の調節にあずか
る中心細胞としての生物的意義が注目されている。ま
た、多くの感染症や免疫学的疾患では、患者リンパ球の
Ｔｈ１／Ｔｈ２サブセットの分布において、そのいずれ
かに極端に偏る極性化が起こり、この極性化がその疾患
の病勢や病型に反映していることが示唆されている。

【０００５】例えば、Mycobacterium 感染症において
は、Mycobacterium に対する免疫反応がＤＴＨ（遅延
型）反応を主とした型をとっている場合はＴｈ１優位で
あり、慢性化し進行型を呈する場合にはＴｈ２優位にな
ること、ＨＩＶ感染症においては、Ｔｈ１型のサイト
カインの産生は長期間の非進行性患者に多く、Ｔｈ２へ
の極性化が起こると症状は進行又は劇症化すること及び
アトピー性疾患の患者においては、Ｔｈ２への極性化
が起こると症状が悪化すること等が現在明らかになりつ
つある。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】そこで、本発明が解決
すべき課題は、上記のＴｈ１／Ｔｈ２サブセットの分布
の極性化（以下、Ｔｈ１／Ｔｈ２インバランスという）
における知見に基づいた、免疫関連疾患の病勢や病型の
特定手段を提供することにある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題に
ついて鋭意検討を行った。その結果、Ｔｈ１に特異的な
タンパク質とこれをコードする遺伝子及びＴｈ２に特異
的なタンパク質とこれをコードする遺伝子をそれぞれ特
定，調製することができれば、これを基にして所望する
免疫関連疾患の病勢や病型の特定手段を提供し得ること
を見出し本発明を完成した。本願は、上記遺伝子の内、
ヒトＴｈ１に特異的なタンパク質及びこれをコードする
遺伝子に関連するものである。

【０００８】すなわち、本発明者は本願において、以下
に掲げる発明を提供するものである。

【０００９】請求項１において、配列番号６で表される
アミノ酸配列のヒトＴｈ１特異的タンパク質を提供す
る。

【００１０】請求項２において、配列番号６で表される
アミノ酸配列の一部のアミノ酸が欠失，置換若しくは付
加されたアミノ酸配列からなり、かつ前記請求項１記載
のヒトＴｈ１特異的タンパク質と実質的に同一の生物学
的活性を有するヒトＴｈ１特異的タンパク質を提供す
る。

【００１１】請求項３において、配列番号６で表される
アミノ酸配列をコードする塩基配列を含むヒトＴｈ１特
異的遺伝子を提供する。

【００１２】請求項４において、配列番号５で表される
塩基配列のヒトＴｈ１特異的遺伝子を提供する。

【００１３】請求項５において、配列番号５で表される
塩基配列の一部の塩基が欠失，置換若しくは付加された
塩基配列からなり、かつストリンジェントな条件下で配
列番号５で表される塩基配列のＤＮＡとハイブリダイズ
し、さらに配列番号６で表されるアミノ酸配列を有する
ヒトＴｈ１特異的タンパク質と実質的に同一の生物学的
活性を有するヒトＴｈ１特異的タンパク質をコードする
ヒトＴｈ１特異的遺伝子を提供する。

【００１４】請求項６において、前記請求項３乃至請求
項５のいずれかの請求項記載のヒトＴｈ１特異的遺伝子
を含有する遺伝子発現用組換えベクターを提供する。

【００１５】請求項７において、前記請求項６記載の遺
伝子発現用組換えベクターで形質転換され、かつこの組
換えベクターに含まれているヒトＴｈ１特異的遺伝子が
発現している形質転換体を提供する。

【００１６】請求項８において、前記請求項１又は請求
項２記載のヒトＴｈ１特異的タンパク質の全部若しくは
一部を免疫原とし、かつヒトＴｈ２特異的タンパク質と
の間においては免疫反応を示さないポリクローナル抗体
を提供する。

【００１７】請求項９において、前記請求項１又は請求
項２記載のヒトＴｈ１特異的タンパクのいずれかの部分
をその抗原決定基とし、かつヒトＴｈ２特異的タンパク
質との間においては免疫反応を示さないモノクローナル
抗体を提供する。

【００１８】請求項１０において、その免疫原が前記請
求項６記載の組換えベクターである請求項９記載のモノ
クローナル抗体を提供する。

【００１９】請求項１１において、前記請求項１０記載
のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを提供
する。

【００２０】

【発明の実施の形態】以下、本発明の実施の形態につい
て説明する。ヒトＴｈ１に特異的な遺伝子〔以下、本発
明Ｔｈ１遺伝子という。この本発明Ｔｈ１遺伝子には、
特に断らない限り本発明の技術的範囲に入るべきヒトＴ
ｈ１特異的遺伝子（後述する）が含まれる。〕の由来と
なるヒトＴｈ１とは、上記の通り、ヒトヘルパーＴ細胞
のサブセットの一つである。

【００２１】このヒトＴｈ１は、以下のような特徴を有
するヘルパーＴ細胞のサブセットである。 ヒトＴｈ１は、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−βを産生する
が、ＩＬ−４及びＩＬ−５を産生しない。 ヒトＴｈ１は、ＩＬ−２及びＩＬ−１２に反応してよ
く増殖し、ＩＬ−４の存在により誘導が抑制される（こ
れに対して、他方のサブセットのヒトＴｈ２は、同様に
ＩＬ−２に反応して増殖するが、ヒトＴｈ１とは逆にＩ
Ｌ−４に反応して増殖する。また、ＩＦＮ−γの存在に
より誘導が抑制される）。 ヒトＴｈ１の表面マーカーは、現在ヒトＴｈ２と明確
に区別できる表面マーカーは見出されておらず、ヒトＴ
ｈ１はヒトＴｈ２と同様に、ＣＤ４４^bright，ＣＤ４５
ＲＢ^dull，ＬＥＣＡＭ−１^dullの表現型を有する。 ヒトＴｈ１は、ヒトＴｈ２と異なり、ＩｇＥ産生誘導
活性は認められず、むしろこれを自ら産生するＩＮＦ−
γによって抑制する。 ヒトＴｈ１は、抗原特異的ＤＴＨを誘起する。 ヒトＴｈ１は、細胞内寄生性の細菌や原虫に対して一
定条件のもと抵抗性を示す。

【００２２】本発明Ｔｈ１遺伝子は、例えばこのような
特徴を有するヒトＴｈ１クローンを樹立し、このクロー
ンからヒトＴｈ１のｃＤＮＡライブラリーを調製して得
ることができる。

【００２３】Ａ．ヒトＴｈ１クローンの樹立 所望するヒトＴｈ１クローンを樹立する前提として、こ
のクローンを含むことが知られているＣＤ４⁺ Ｔ細胞集
団を調製する。この調製方法は、通常公知の方法、例え
ば"Gianfranco, F.D.P.,et al.,J.Clin. Invest.,88,34
6(1991)"に記載されている方法に従って調製することが
可能である。

【００２４】より具体的には、例えばヒトの全血から末
梢血単核球を分離して、これを種々のＴ細胞活性化因子
により刺激をして、所望するＣＤ４⁺ Ｔ細胞集団を調製
することができる。Ｔ細胞活性化因子としては、例えば
インゲンマメ由来の植物凝集素（ＰＨＡ）等の非特異的
Ｔ細胞活性化因子；ＩＬ−２，ＩＬ−４，ＩＬ−１２等
のサイトカイン；ＰＰＤ，ダニ抽出液等の刺激抗原等を
挙げることができる。

【００２５】この調製過程を経た後、後述するＣＤ４⁺
Ｔ細胞の単離工程に先立ち、予めＣＤ４⁺ Ｔ細胞以外の
要素、例えばＣＤ８⁺ Ｔ細胞等を除去する工程に付する
ことが好ましい。この除去工程としては、例えば抗ＣＤ
４抗体を結合した磁気ビーズを用いてＣＤ４⁺ Ｔ細胞の
みを濃縮する方法等を挙げることができる。

【００２６】上記誘導過程を経た後、ＣＤ４⁺ Ｔ細胞ク
ローンを単離する。この単離方法も通常公知の方法、例
えば限界希釈法に従ってこの単離を行うことができる。
より具体的には、例えばＰＨＡ及びＩＬ−２を添加した
培地で、細胞をウエル当り０．５〜１０細胞となるよう
に９６穴マイクロプレートに播き、３〜４日毎にＩＬ−
２添加培地で培地交換を続け、増殖が認められた（通常
２〜４週間）細胞について表面マーカーを調べ、ＣＤ４
陽性のクローンのみを選択して、対象となるＣＤ４⁺ Ｔ
細胞クローンとすることができる。このようにして単離
したＣＤ４⁺ Ｔ細胞クローンの中から所望のヒトＴｈ１
クローンを選択・調製することができる。

【００２７】ＣＤ４⁺ Ｔ細胞クローンからのヒトＴｈ１
クローンの選択は、既に知られているヒトＴｈ１とヒト
Ｔｈ２の性質の違いに基づき行われる。すなわち、例え
ば抗ＣＤ３抗体の刺激に応答してＩＦＮ−γを産生する
がＩＬ−４を産生しないクローンをヒトＴｈ１クローン
として選択することができる（これに対して、逆にＩＬ
−４を産生するがＩＦＮ−γを産生しないクローンはヒ
トＴｈ２として選択される）。

【００２８】Ｂ．ヒトＴｈ１に特異的なｃＤＮＡの調製 ヒトＴｈ１のｃＤＮＡとヒトＴｈ２のｃＤＮＡには、双
方に共通する遺伝子配列と、各々において特異的な遺伝
子配列が存在することが予想される。このような状況
下、所望するヒトＴｈ１に特異的なｃＤＮＡを調製する
には、ヒトＴｈ１のｃＤＮＡ集団からヒトＴｈ２のｃＤ
ＮＡと共通なものを除去する、いわゆるサブトラクショ
ン法を用いるのが有利である。

【００２９】このサブトラクション法としては、例えば
デービスらの方法（Davis,M.M.,etal.,Proc. Natl. Aca
d. Sci. U.S.A.,81, 2194(1984)）を挙げることができ
る。この方法はサブトラクションの対象となる一方の素
材のｃＤＮＡと、他方の素材の大過剰のpoly（Ａ）⁺ Ｒ
ＮＡをハイブリダイズさせて、ハイブリダイズせずに残
ったｃＤＮＡをプローブとして、上記一方の素材のｃＤ
ＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、上
記一方の素材に特異的なｃＤＮＡクローンを得る方法で
ある。

【００３０】この方法は、大量のpoly（Ａ）⁺ ＲＮＡを
必要とするという点が、poly（Ａ）⁺ ＲＮＡの素材を大
量に入手することが困難な場合においては実施すること
が困難であるという欠点がある。そこで、比較的少量の
ｐｏｌｙ（Ａ）⁺ ＲＮＡを出発材料としてサブトラクシ
ョンを行うために、ＰＣＲ法を導入する方法も既に報告
されている〔例えば、gene expression screen法（Wan
g,Z. and Brown,D.D.,Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A.,88,
11505(1991)) 等〕。この方法は、上記の方法における
出発材料のｃＤＮＡを一度ＰＣＲ法で増幅することを特
徴とする方法であるが、上記サブトラクション操作とＰ
ＣＲによる増幅操作を繰り返すことで稀少なｍＲＮＡを
クローニングできるという利点を有する方法である。

【００３１】本発明においては、一般的に正常のＣＤ４
⁺ Ｔ細胞クローンの大量培養が困難であり、ｃＤＮＡの
鋳型となるｍＲＮＡを大量に確保することが困難である
故、上記のサブトラクション法のうち、例えば上記「ge
ne expression screen法」を用いることが好ましい。

【００３２】より具体的には、通常公知の方法（例え
ば、ｐｏｌｙ（Ａ）⁺ ＲＮＡを鋳型として、逆転写酵素
を用いる方法）でヒトＴｈ１クローン及びヒトＴｈ２ク
ローン由来のｃＤＮＡを調製して、ＰＣＲ法を用いてこ
れらのｃＤＮＡを増幅する。このｃＤＮＡの増幅に際し
ては、ＰＣＲ法による増幅に適した長さのｃＤＮＡ断片
を得るために、予め制限酵素処理や超音波処理をｃＤＮ
Ａに施すことが好ましい。

【００３３】また、ＰＣＲ法による増幅に必要なＰＣＲ
プライマーとして、例えば、ヒトＴｈ１及びヒトＴｈ２
それぞれに異なった塩基配列を有する特異的なプライマ
ーを使用することができる。この特異的なプライマー
は、通常化学合成により調製される。この方法による
と、サブトラクション操作の後にヒトＴｈ１由来のｃＤ
ＮＡのみが増幅され、微量に混入し得るヒトＴｈ２由来
のｃＤＮＡの増幅を最小限に止め得るという点で有利で
ある。

【００３４】この場合は、予めこのＰＣＲ用プライマー
がアニールし得る配列を含んだリンカーを上記ｃＤＮＡ
断片の両端に結合させる必要がある。このため、上記断
片化処理においては、このリンカーが結合し得る末端を
有するｃＤＮＡ断片を提供する制限酵素を用いることが
好ましい。

【００３５】ＰＣＲリンカーを結合した後のヒトＴｈ１
クローン及びヒトＴｈ２クローン由来のｃＤＮＡ断片群
より、ある程度の長さを有する断片をアガロースゲル電
気泳動等の分別手段により選別し、この選別したｃＤＮ
Ａ断片群をＰＣＲ法により増幅し、この増幅済断片をサ
ブトラクションの出発材料とすることができる。

【００３６】このようにして調製したｃＤＮＡ断片群の
うち、ヒトＴｈ１クローン由来のｃＤＮＡ断片群から、
ヒトＴｈ１及びヒトＴｈ２に共通する塩基配列を有する
ｃＤＮＡを除いたｃＤＮＡ断片群を選別して、所望する
本発明Ｔｈ１遺伝子を含んだ遺伝子ライブラリーを調製
することができる。

【００３７】この選別方法は、例えば一定量のヒトＴｈ
１クローン由来のｃＤＮＡ断片群に過剰量の標識したヒ
トＴｈ２クローン由来ｃＤＮＡ断片群をハイブリダイズ
させて、この標識に基づいてヒトＴｈ２クローン由来ｃ
ＤＮＡ断片とハイブリダイズしたｃＤＮＡを除去して、
残りの断片をヒトＴｈ１にのみ特異的な遺伝子配列に基
づいたｃＤＮＡ断片として扱う方法を採ることができ
る。

【００３８】ここで用いる標識は、上記選別方法を行う
ことが可能である限り特に限定されないが、可能な限り
標識及び除去が簡便な手段を用いることが好ましいこと
は勿論である。かかる点より、例えばビオチンでｃＤＮ
Ａ断片を標識して、標識されたｃＤＮＡ断片をストレプ
トアビジンに吸着させる手法等を用いることが有利であ
る。

【００３９】なお、上記の手段により選別されたヒトＴ
ｈ１にのみ特異的な遺伝子配列に基づいたｃＤＮＡ断片
を、さらにＰＣＲ法によって増幅させて再び上記の選別
手段を行う過程を繰り返すことによって、所望するｃＤ
ＮＡ断片を濃縮・増幅することができる。

【００４０】このようにして調製した、ｃＤＮＡ断片を
用いて、本発明Ｔｈ１遺伝子を含んだ遺伝子ライブラリ
ーを得ることができる。かかる遺伝子ライブラリーの調
製工程については、通常公知の方法を用いることができ
る。

【００４１】すなわち、上記ｃＤＮＡ断片を適切な遺伝
子導入用ベクターに組み込み、これを選択した遺伝子導
入用ベクターに応じた宿主に導入することにより所望す
る遺伝子ライブラリーを調製することができる。なお、
この遺伝子導入用ベクターにｃＤＮＡ断片が組み込まれ
たか否かは、このベクターが保有する，例えばlac Ｚ遺
伝子活性によるカラーセレクション等によって確認する
ことができる。

【００４２】ここで用いる導入用ベクターは、特に限定
されず、例えばプラスミドとしては、pBluescript,ｐＵ
Ｃ１８，ｐＢＲ３２２，ｐＢＧＰ１２０，ｐＰＣφ１，
ｐＰＣφ２，ｐＰＣφ３，ｐＭＣ１４０３，ｐＬＧ２０
０，ｐＬＧ３００，ｐＬＧ４００等を；λファージとし
ては、λｇｔ１０，λＺＡＰII等を挙げることができる
が、取扱いの簡便さから上記lac Ｚ遺伝子をマーカーと
して保有するプラスミドを用いることが好ましい。具体
的には、上記導入用ベクターのうち、pBluescript,ｐＵ
Ｃ１８，ｐＢＧＰ１２０等を選択することが好ましい。
なお、この遺伝子ライブラリーの調製工程を市販の遺伝
子ライブラリー調製用キットを用いて行うことも可能で
ある。

【００４３】Ｃ．本発明Ｔｈ１遺伝子の単離 上記のようにして調製した遺伝子ライブラリーから、直
接ＤＮＡを抽出して、それらのうちのいくつかの塩基配
列を決定して、それらの塩基配列から本発明Ｔｈ１遺伝
子を有するクローンを選別することも可能であるが、予
めさらにクローンを選別して確実に本発明Ｔｈ１遺伝子
を有するクローンを特定することが好ましい。

【００４４】かかる選別方法としては、通常公知の方法
を用いることができる。たとえば、上記のごとく調製し
た、ヒトＴｈ１に特異的な遺伝子に基づく遺伝子ライブ
ラリー及び別に調製したヒトＴｈ２に特異的な遺伝子に
基づく遺伝子ライブラリーに由来する遺伝子を調製し、
これに標識を施して標識プローブとして、ヒトＴｈ１に
特異的な遺伝子に基づく遺伝子ライブラリーのレプリカ
とハイブリダイズさせて、ヒトＴｈ１に特異的な遺伝子
のプローブとはハイブリダイズするが、ヒトＴｈ２に特
異的な遺伝子のプローブとはハイブリダイズしないクロ
ーンを選別して、このクローンを本発明ヒトＴｈ１を保
有するクローンとして、後述する本発明Ｔｈ１遺伝子の
塩基配列を決定する対象とすることができる。

【００４５】なお、さらに慎重を期するために、例えば
ヒトＴｈ１及びヒトＴｈ２の全ＲＮＡ又はpoly（Ａ）⁺
ＲＮＡを用いたノーザンブロッティング法を用いて発現
するｍＲＮＡのパターンを比較して、後述する本発明Ｔ
ｈ１遺伝子の塩基配列を決定する対象となるクローンを
決定付けることもできる。

【００４６】このようにして調製したクローンにおける
本発明Ｔｈ１遺伝子の塩基配列の決定手段は通常公知の
方法を用いて行うことができる。例えば、マキサム−ギ
ルバート法（Maxam,A.M.,and Gilbert,W.,Proc.Natl.Ac
ad.Sci.U.S.A.,74,560(1977)），ゲノミック・シークエ
ンス法（Church,G.M. and Gilbert,W.,Proc.Natl.Acad.
Sci.U.S.A.,81,1991(1984)），マルチプレックス法（Ch
urch,G.M. and Kieffer-Higgins,S.,Science,240,185(1
988)），サイクルシークエンス法（Murray,V.,Nucleic
Acids Res.,17,8889(1989)），ジデオキシ法（Sanger,
F.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,74,5463(197
7)）等の方法を用いて、所望する本発明Ｔｈ１遺伝子の
塩基配列を決定することができる。なお、これらの原理
を応用した塩基配列自動解析装置を用いて、この塩基配
列を決定することも勿論可能である。

【００４７】上記のごとくして決定された本発明Ｔｈ１
遺伝子の塩基配列を基にして、この本発明Ｔｈ１遺伝子
そのものを入手することができる。すなわち、上記と同
様に調製した本発明Ｔｈ１遺伝子の出所となるヒトＴｈ
１のｃＤＮＡを鋳型とし、上記のごとく決定された本発
明Ｔｈ１遺伝子の５’末端側と３’末端側の配列を含む
ＤＮＡ断片をプライマーとして、前出のＰＣＲ法によ
り、本発明Ｔｈ１遺伝子を大量に増幅させて入手するこ
とができる。

【００４８】また、上記のごとく塩基配列を決定したヒ
トＴｈ１遺伝子断片そのものをプローブとして、ヒトＴ
ｈ１から作出したｃＤＮＡの遺伝子ライブラリーから本
発明Ｔｈ１遺伝子を有するクローンを選別して、本発明
Ｔｈ１遺伝子の全長を入手する伝統的な手法を用いるこ
とも可能である。

【００４９】さらに、ホスファイト−トリエステル法
（Ikehara,M.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,81,5
956(1984) ）等の通常公知の方法を用いて本発明Ｔｈ１
遺伝子を化学合成することも可能であり、これらの化学
合成法を応用したＤＮＡシンセサイザーを用いて本発明
Ｔｈ１遺伝子を合成することも可能である。

【００５０】なお、このようにして製造する本発明Ｔｈ
１遺伝子の塩基配列の一部を改変して、この塩基配列の
一部の塩基が欠失，置換若しくは付加された塩基配列か
らなる改変遺伝子（この本発明Ｔｈ１遺伝子に対する相
同性は、概ね７０％以上である）の存在を本発明者は認
識し、このような改変遺伝子にも本発明の技術的範囲は
及ぶものである。

【００５１】この本発明の技術的範囲が及び得るヒトＴ
ｈ１遺伝子は、ストリンジェントな条件下｛系における
ＤＮＡ同士のハイブリッドが形成しにくい条件〔具体的
には、系の温度（高い程ハイブリッドしにくい）や塩濃
度（低い程ハイブリッドしにくい）や、ホルムアミド等
の変性剤の濃度（高い程ハイブリッドしにくい）等に依
存する〕のことをいう。｝で配列番号５（後述する）で
表される塩基配列のＤＮＡとハイブリダイズし、さらに
配列番号６（後述する）で表されるアミノ酸配列を有す
るヒトＴｈ１特異的タンパク質と実質的に同一の生物学
的活性を有するヒトＴｈ１特異的タンパク質をコードす
るヒトＴｈ１特異的遺伝子である。

【００５２】ここにいう「実質的に同一」とは、その生
物学的活性が比較の対象となるヒトＴｈ１特異的タンパ
ク質の生物学的活性と質的及び／又は量的に同一性を有
することを意味する。具体的なヒトＴｈ１特異的タンパ
ク質の生物学的活性については後述する。

【００５３】この遺伝子改変法として、通常公知の方
法、例えばいわゆるサイト−スペシフィックミュータジ
ェネシス（Site-Specific Mutagenesis)（Mark,D.F.,et
al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A., 81,5662(1984) ）等
の方法を用いて、所望の遺伝子改変を行うことができ
る。

【００５４】このようにして入手した本発明Ｔｈ１遺伝
子を用いて、疾患の局所におけるＴｈ１／Ｔｈ２バラン
スのチェックを行うことができる。すなわち、疾患の局
所のｍＲＮＡを抽出して、例えばＲＴ−ＰＣＲ法（"PCR
Protocols, A Guide to Methods and Applications" I
nnis, M.A.,et al.,ed.,Academic Press,San Diego,199
0 ）を用いて、この組織における本発明Ｔｈ１遺伝子の
発現の程度を測定して、疾患の局所におけるＴｈ１／Ｔ
ｈ２バランスのチェックを行うことができる。

【００５５】このＴｈ１／Ｔｈ２バランスをチェックす
ることにより、上記従来技術の欄に記載したごとく、Ｔ
ｈ１／Ｔｈ２インバランスが重大な要素となる疾患、例
えばＨＩＶ感染症，アレルギー疾患，各種の感染症等の
症状の推移等をより確実に把握することができる。

【００５６】なお、このＴｈ１／Ｔｈ２バランスのチェ
ックは、後述するヒトＴｈ１のポリクローナル抗体又は
モノクローナル抗体を用いて行うことも勿論可能である
が、ここに示したチェック手段は、これらの抗体を用い
ることが困難な局面、例えば目的のタンパク質の発現量
が極微量である場合等に際して有効なチェック手段であ
る。

【００５７】Ｄ．本発明ヒトＴｈ１タンパク質の製造：
さらに、このようにして入手した、本発明Ｔｈ１遺伝子
を用いて、組換えヒトＴｈ１特異的タンパク質（以下、
本発明ヒトＴｈ１タンパク質という。この本発明ヒトＴ
ｈ１タンパク質には、特に断らない限り上記の改変遺伝
子から翻訳され得るヒトＴｈ１特異的タンパク質が含ま
れ、勿論これらの改変遺伝子から翻訳され得る改変タン
パク質は、改変されていないヒトＴｈ１特異的タンパク
質と実質的に同一の生物学的活性を有する。）を製造す
ることができる。この本発明ヒトＴｈ１タンパク質は、
上記本発明Ｔｈ１遺伝子を利用して、通常公知の一般的
な遺伝子組換え技術に従って製造することができる。

【００５８】より具体的には、本発明Ｔｈ１遺伝子が発
現可能な形態の遺伝子発現用ベクターに本発明Ｔｈ１遺
伝子を組み込み、この遺伝子発現用ベクターの性質に応
じた宿主にこの組換えベクターを導入して形質転換し、
この形質転換体を培養等することにより所望の本発明ヒ
トＴｈ１タンパク質を製造することができる。

【００５９】ここで用いる遺伝子発現用ベクターは、通
常発現しようとする遺伝子の上流域にプロモーター，エ
ンハンサー，及び下流域に転写終了配列等を保有するも
のを用いるのが好適である。

【００６０】また、本発明Ｔｈ１遺伝子の発現は、直接
発現系に限らず、例えばβ−ガラクトシダーゼ遺伝子，
グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ遺伝子やチオレ
ドキシン遺伝子を利用した融合タンパク質発現系とする
こともできる。

【００６１】かかる遺伝子発現用ベクターとしては、例
えば宿主を大腸菌とするものとしては、ｐＱＥ，ｐＧＥ
Ｘ，ｐＴ７−７，ｐＭＡＬ，ｐＴｒｘＦｕｓ，ｐＥＴ，
ｐＮＴ２６ＣII等を例示することができる。また、宿主
を枯草菌とするものとしては、ｐＰＬ６０８，ｐＮＣ
３，ｐＳＭ２３，ｐＫＨ８０等を例示することができ
る。

【００６２】また、宿主を酵母とするものとしては、ｐ
ＧＴ５，ｐＤＢ２４８Ｘ，ｐＡＲＴ１，ｐＲＥＰ１，Ｙ
Ｅｐ１３，ＹＲｐ７，ＹＣｐ５０等を例示することがで
きる。

【００６３】また、宿主を哺乳動物細胞又は昆虫細胞と
するものとしては、ｐ９１０２３，ｐＣＤＭ８，ｐｃＤ
Ｌ−ＳＲα２９６，ｐＢＣＭＧＳＮｅｏ，ｐＳＶ２ｄｈ
ｆｒ，ｐＳＶｄｈｆｒ，ｐＡｃ３７３，ｐＡｃＹＭ１，
ｐＲｃ／ＣＭＶ，ｐＲＥＰ４，ｐｃＤＮＡＩ等を例示す
ることができる。

【００６４】これらの遺伝子発現ベクターは、本発明ヒ
トＴｈ１タンパク質を発現させる目的に応じて選択する
ことができる。例えば大量に本発明ヒトＴｈ１タンパク
質を発現させることを企図する場合には、宿主として大
腸菌，枯草菌又は酵母等を選択し得る遺伝子発現ベクタ
ーを選択するのが好ましく、少量でも確実に活性を有す
るように本発明ヒトＴｈ１タンパク質を発現させること
を企図する場合には、哺乳動物細胞や昆虫細胞を宿主と
して選択し得る遺伝子発現ベクターを選択するのが好ま
しい。

【００６５】なお、上記のように既存の遺伝子発現ベク
ターを選択することも可能であるが、目的に応じて適宜
遺伝子発現ベクターを作出して、これを用いることも勿
論可能である。なお、これらの遺伝子発現用ベクターも
本発明の技術的範囲に入るものである。

【００６６】本発明Ｔｈ１遺伝子を組み込んだ上記遺伝
子発現用ベクターの宿主細胞への導入及びこれによる形
質転換法は、一般的な方法、例えば宿主細胞が大腸菌や
枯草菌である場合には、塩化カルシウム法やエレクトロ
ポレーション法等を；宿主が哺乳動物細胞や昆虫細胞の
場合はリン酸カルシウム法，エレクトロポレーション法
又はリポソーム法等の手段により行うことができる。

【００６７】このようにして得られる形質転換体を常法
に従い培養することにより、所望する本発明ヒトＴｈ１
タンパク質が蓄積される（このような形質転換体も本発
明の技術的範囲に含まれる。）。かかる培養に用いられ
る培地は、宿主の性質に応じて適宜選択することができ
るが、例えば宿主が大腸菌である場合には、ＬＢ培地や
ＴＢ培地等が、宿主が哺乳動物細胞の場合には、ＲＰＭ
Ｉ１６４０培地等を適宜用いることができる。

【００６８】この培養により得られる培養物からの本発
明ヒトＴｈ１タンパク質の単離及び精製は、常法に従い
行うことが可能であり、例えば培養物を、本発明ヒトＴ
ｈ１タンパク質の物理的及び／又は化学的性質を利用し
た各種の処理操作を用いて行うことが可能である。

【００６９】具体的には、タンパク沈澱剤による処理，
限外濾過，ゲル濾過，高速液体クロマトグラフィー，遠
心分離，電気泳動，特異抗体を用いたアフィニティクロ
マトグラフィー，透析法等を単独で又はこれらの方法を
組み合わせて用いることができる。このようにして、本
発明ヒトＴｈ１タンパク質を単離、精製することが可能
である。

【００７０】なお、上記の本発明Ｔｈ１遺伝子発現系に
おいて、宿主として患者自身から分離したＴ細胞又は骨
髄細胞等を本発明Ｔｈ１遺伝子で形質転換して、この形
質転換体を患者に戻すことにより、いわゆる遺伝子治療
に利用することが可能である。この場合の発現用ベクタ
ーとしては、例えばレトロウイルスやアデノウイルス等
のウイルスベクター等を挙げることができる。

【００７１】この形質転換細胞を用いて行う遺伝子治療
は、Ｔｈ２優位のＴｈ１／Ｔｈ２インバランスに陥って
いることが重大な原因となる疾病の患者に対して行うこ
とができる。具体的には、例えばＨＩＶ感染者，慢性化
した感染症患者，癌患者や即時型アレルギー疾患患者等
に上記形質転換細胞を投与して、これによりこれらの疾
患の重大な原因となっているＴｈ２優位のＴｈ１／Ｔｈ
２インバランスを、投与した形質転換細胞にヒトＴｈ１
タンパク質を患者の体内で発現させることにより遺伝子
治療を行うことができる。

【００７２】Ｅ．本発明ヒトＴｈ１タンパク質に対する
抗体の製造：本発明は、上記本発明ヒトＴｈ１タンパク
質に対する抗体にも関する。すなわち、本発明ポリクロ
ーナル抗体は、ヒトＴｈ１タンパク質を免疫抗原として
免疫した動物に由来する免疫血清から製造することがで
きる。

【００７３】ここで使用される免疫抗原としてのヒトＴ
ｈ１タンパク質は、特に限定されるものではなく、上記
のごとく調製される本発明Ｔｈ１遺伝子（その塩基配列
の一部を改変したものも含む）がコードする本発明ヒト
Ｔｈ１タンパク質を用い得ることは勿論のこと、本発明
Ｔｈ１遺伝子の一部断片がコードする本発明ヒトＴｈ１
タンパク質断片や本発明ヒトＴｈ１タンパク質に直接酵
素処理等を施して、又は化学合成して得られる本発明ヒ
トＴｈ１タンパク質の部分ペプチドをも本発明ポリクロ
ーナル抗体を製造する上での免疫抗原とすることができ
る。

【００７４】また、免疫動物と同種・同系統の動物由来
の細胞株を、ヒトＴｈ１タンパク質（本発明ヒトＴｈ１
タンパク質を含む）又はその一部をコードする遺伝子を
組み込んだ発現ベクターを導入して形質転換して、この
形質転換細胞をその免疫動物に移植することにより本発
明ポリクローナル抗体を調製することができる。すなわ
ち、形質転換細胞を移植した動物の体内で、持続的に上
記ヒトＴｈ１タンパク質がその形質転換細胞で作られ、
それに対する抗体が産生されて、これを本発明ポリクロ
ーナル抗体とすることもできる（Nemoto,T.,et al.,Eu
r.J.Immunol.,25,3001(1995) ）。

【００７５】さらに、上記ヒトＴｈ１タンパク質を発現
する発現ベクターを直接動物に筋注や皮下注等の手段で
投与することにより、その動物内で上記ヒトＴｈ１タン
パク質を継続的に産生させて、上記の形質転換細胞を移
植した場合と同様に本発明ポリクローナル抗体を製造す
ることができる（Raz,E.,el al.,Proc.Natl.Acad.Sci.
U.S.A.,91,9519(1994) ）。

【００７６】一方、本発明モノクローナル抗体は、本発
明ポリクローナル抗体の場合と同様の方法で、免疫した
動物の免疫細胞と動物の骨髄腫細胞とのハイブリドーマ
を作出し、これによりヒトＴｈ１を認識する抗体を産生
するクローンを選択し、このクローンを培養することに
より製造することができる。

【００７７】また、免疫される動物も特に限定されるも
のではなく、マウス，ラット等を広く用いることができ
るが、モノクローナル抗体を製造する場合には、細胞融
合に用いる骨髄腫細胞との適合性を考慮して選択するこ
とが望ましい。免疫は一般的方法により、例えば上記免
疫抗原を免疫の対象とする動物に静脈内，皮内，皮下，
腹腔内注射等で投与することにより行うことができる。

【００７８】より具体的には、上記免疫抗原を所望によ
り通常のアジュバントと併用して、免疫の対象とする動
物に２〜１４日毎に上記手段により数回投与し、ポリク
ローナル抗体製造のための免疫血清又はモノクローナル
抗体製造のための免疫細胞、例えば免疫後の脾臓細胞を
得ることができる。

【００７９】モノクローナル抗体を製造する場合、この
免疫細胞と細胞融合する他方の親細胞としての骨髄腫細
胞としては、既に公知のもの、例えばＳＰ２／０−Ａｇ
１４，Ｐ３−ＮＳ１−１−Ａｇ４−１，ＭＰＣ11−４
５，６．ＴＧ１．７（以上、マウス由来）；２１０．Ｒ
ＣＹ．Ａｇ１．２．３（ラット由来）；ＳＫＯ−００
７，ＧＭ１５００６ＴＧ−Ａ１２（以上、ヒト由来）等
を用いることができる。

【００８０】上記免疫細胞とこの骨髄腫細胞との細胞融
合は、通常公知の方法、例えばケーラーとミルシュタイ
ンの方法（Kohler,G. and Milstein,C.,Nature,256,495
(1975)）等に準じて行うことができる。

【００８１】より具体的には、この細胞融合は、通常公
知の融合促進剤、例えばポリエチレングリコール（ＰＥ
Ｇ），センダイウイルス（ＨＶＪ）等の存在下におい
て、融合効率を向上させるためにジメチルスルホキシド
等の補助剤を必要に応じて添加した通常の培養培地中で
行い、ハイブリドーマを調製する。所望のハイブリドー
マの分離は、通常の選別用培地、例えばＨＡＴ（ヒポキ
サンチン，アミノプテリン及びチミジン）培地で培養す
ることにより行うことができる。すなわち、この選別用
培地において目的とするハイブリドーマ以外の細胞が死
滅するのに十分な時間をかけて培養することによりハイ
ブリドーマの分離を行うことができる。このようにして
得られるハイブリドーマは、通常の限界希釈法により目
的とするモノクローナル抗体の検索及び単一クローン化
に供することができる。

【００８２】目的とするモノクローナル抗体産生株の検
索は、例えばＥＬＩＳＡ法，プラーク法，スポット法，
凝集反応法，オクタロニー法，ＲＩＡ法等の一般的な検
索法に従い行うことができる。このようにして得られる
ヒトＴｈ１タンパク質を認識する所望のモノクローナル
抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培地で継代培
養することが可能であり、さらに液体窒素中で長時間保
存することもできる（本発明の技術的範囲には、このハ
イブリドーマも含まれる。）。

【００８３】このハイブリドーマからの所望のモノクロ
ーナル抗体の採取は、このハイブリドーマを常法に従っ
て培養して、その培養上清として得る方法や、ハイブリ
ドーマをこのハイブリドーマに適合性が認められる動物
に投与して増殖させ、その腹水として得る方法等を用い
ることができる。

【００８４】なお、インビトロで免疫細胞をヒトＴｈ１
タンパク質又はその一部の存在下で培養し、一定期間後
に上記細胞融合手段を用いて、この免疫細胞と骨髄腫細
胞とのハイブリドーマを調製し、抗体産生ハイブリドー
マをスクリーニングすることで所望するモノクローナル
抗体を得ることもできる（Reading,C.L.,J.Immunol.Met
h.,53,261(1982) ；Pardue,R.L.,et al.,J.Cell Biol.,
96,1149(1983））。

【００８５】さらに、免疫原として本発明ヒトＴｈ１タ
ンパク質を用いることなしに、免疫原として直接本発明
Ｔｈ１遺伝子又はその一部を用いて所望するモノクロー
ナル抗体を製造することも可能である。すなわち、本発
明Ｔｈ１遺伝子で直接動物を免疫して（この免疫の際に
は、この遺伝子を含む遺伝子発現用組換えベクターを免
疫原として用いることができる）、その遺伝子免疫動物
の免疫細胞又は免疫血清を用いることによって、ヒトＴ
ｈ１タンパク質を特異的に認識するモノクローナル抗体
を製造することができる。この遺伝子免疫を利用した方
法の詳細については、後述の実施例において記載する。

【００８６】また、上記で得られるポリクローナル抗体
及びモノクローナル抗体は、更に塩析，ゲル濾過法，ア
フィニティクロマトグラフィー等の通常の手段により精
製することができる。このようにして得られるポリクロ
ーナル抗体及びモノクローナル抗体は、ヒトＴｈ１タン
パク質に特異反応性を有する抗体である。

【００８７】上記ポリクローナル抗体及びモノクローナ
ル抗体は、体内のＴｈ１／Ｔｈ２バランスをチェックす
る手段として用いることができる。すなわち、上記抗体
をＥＬＩＳＡ，ＲＩＡ，免疫組織化学的手法，フローサ
イトメトリーによる解析，ウエスタンブロット法等に用
いることによって、検体中のヒトＴｈ１量を特定するこ
とにより、体内のＴｈ１／Ｔｈ２バランスをチェックし
て、上記従来技術の欄に記載したごとく、Ｔｈ１／Ｔｈ
２インバランスが重大な要素となる疾患、例えばＨＩＶ
感染症，アレルギー疾患，各種の感染症等の症状の推移
等をより確実に把握することができる。

【００８８】また、上記のようにして得られるポリクロ
ーナル抗体及びモノクローナル抗体は、例えばＴｈ１が
優位のＴｈ１／Ｔｈ２インバランスを是正する抗体とし
て用いることができる。

【００８９】なお、動物由来の抗体においては、そのま
ま人間に投与する場合に抗原性が認められ、そのままヒ
トに投与するのには適さない面がある。そのために、動
物由来のモノクローナル抗体の遺伝子の可変領域をクロ
ーニングして、この可変領域の遺伝子とヒト型の抗体の
遺伝子の定常領域の遺伝子と結合させて、この融合遺伝
子を発現させて融合抗体を製造することができる（Clac
kson,T.,et al.,Nature,352 ,624(1991)）。

【００９０】この技術を上記モノクローナル抗体につい
て適用することも可能である。すなわち、動物由来の上
記モノクローナル抗体の可変領域とヒト型の抗体の定常
領域とが融合した融合抗体を、例えばＴｈ１が優位のＴ
ｈ１／Ｔｈ２インバランスを是正する抗体として用いる
こともできる。

【００９１】

【実施例】以下、実施例等により本発明を具体的に記載
するが、この実施例により本発明の技術的範囲が限定し
て解釈されるべきものではない。

【００９２】〔実施例１〕 本発明Ｔｈ１遺伝子の製造
等 （１）ヘルパーＴ細胞クローンの調製 健常人の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）１０⁶ 細胞／mlに、
ヒトＴｈ１細胞を主に誘導するために、ＰＨＡ（ＥＹラ
ボラトリーズ社製）１μg/ml，ｒＩＦＮ−γ（ジエンザ
イム社製）５０ng/ml 及びｒＩＬ−１２（Ｒ＆Ｄシステ
ムズ社製）５ng/ml を添加して５日間培養した。一方、
ヒトＴｈ２を主に誘導するために、ＰＢＭＣにダニ抽出
液（鳥居薬品製）２％（v/v)，ｒＩＬ−４（ジエンザイ
ム社製）２０ng/ml 及び抗ＩＦＮ−γ抗体（ジエンザイ
ム社製）を５μg ／mlを添加して５日間培養した。５日
後、各々の培養にｒＩＬ−２（塩野義製薬製）を４０Ｕ
/ml 添加して、さらに７〜１０日間培養した。

【００９３】次に、この培養集団の中から、ＣＤ４⁺ Ｔ
細胞を分離するために、抗ＣＤ４抗体を結合した磁気ビ
ーズ（ダイナル社製）を吸着させた後、磁石上でビーズ
と結合した細胞を回収した。次に、磁気ビーズ分離用試
薬（ダイナル社製）で、磁気ビーズからＣＤ４⁺ Ｔ細胞
を解離させ、ＣＤ４⁺ Ｔ細胞を得た。次いで、この純化
したＣＤ４⁺ Ｔ細胞集団をＰＨＡ０．５μg/ml及びｒＩ
Ｌ−２を４０Ｕ／ml添加した、１５％牛胎児血清添加Ｒ
ＰＭＩ１６４０で、細胞をウエル当り０．５細胞となる
ように９６穴マイクロプレートに播き、３〜４日毎に上
記と同様のＩＬ−２添加培地で培地交換を続け、増殖が
認められた細胞について表面マーカーを蛍光抗体法を用
いて調べ、ＣＤ４に対して陽性のクローンのみを選択し
て、対象となるＣＤ４⁺ Ｔ細胞クローンとした（Gianfr
anco, F.D.P.,et al.,J.Clin. Invest. ,88,346(1991)
）。

【００９４】次に、個々のＣＤ４⁺ Ｔ細胞クローンの細
胞のタイプを調べるために、上記ＣＤ４⁺ Ｔ細胞クロー
ン（６×１０⁵cells／３００μl ／ウエル）を、抗ＣＤ
３抗体（ＯＫＴ３：オーソファーマスーティカル社製）
をコートした４８ウエルプレートで２４時間培養し、そ
の培養上清中のＩＬ−４及びＩＦＮ−γの濃度をそれぞ
れのモノクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡで測定し
た。その結果、ＩＦＮ−γを産生するがＩＬ−４を産生
しないものをヒトＴｈ１クローンとした。その結果を第
１表に示す。

【００９５】

【表１】

【００９６】（２）サブトラクトｃＤＮＡライブラリー
の調製 上記（１）において得たヒトＴｈ１クローン（２Ｐ１
５）及びＴｈ２クローン（２Ｐ２６）よりそれぞれｐｏ
ｌｙ（Ａ）⁺ ＲＮＡをオリゴｄＴラテックス（日本ロシ
ュ製）を用いて常法により調製した。次いで、これらの
ｐｏｌｙ（Ａ）⁺ＲＮＡを鋳型にして、オリゴ（ｄＴ）
プライマー（ファルマシア製）及びＭＭＬＶ逆転写酵素
（ファルマシア製）を用いて、それぞれのｃＤＮＡを約
３００ngを調製した。次に、それぞれのｃＤＮＡを、Ｐ
ＣＲ法による増幅工程に処するに適した鎖長にするため
に、制限酵素Ａｌｕ I（東洋紡績製）８４Ｕ及び同Ｒｓ
ａ I（東洋紡績製）４８Ｕで、３７℃で５時間消化し、
それぞれに異なるＰＣＲ用のリンカー（Balzer,H.J.,an
d Baumlein,H.,Nucleic Acids Res.,22 ,2853(199
4)）：

【００９７】ヒトＴｈ１用リンカー：５’−ＣＴＣ Ｔ
ＴＧ ＣＴＴ ＧＡＡ ＴＴＣ ＧＧＡ ＣＴＡ−３’
（配列番号１） ３’−ＡＣＡＣ ＧＡＧ ＡＡＣ ＧＡＡ ＣＴＴ Ａ
ＡＧ ＣＣＴ ＧＡＴ−５’（配列番号２）

【００９８】ヒトＴｈ２用リンカー：５’−ＡＧＴ Ｔ
ＡＣ ＡＣＧ ＴＣＴ ＡＧＡ ＡＴＧ ＧＣＴ−３’
（配列番号３） ３’−ＡＴＡＧ ＴＣＡ ＡＴＧ ＴＧＣ ＡＧＡ Ｔ
ＣＴ ＴＡＣ ＣＧＡ−５’（配列番号４）

【００９９】を結合した後に、アガロース電気泳動によ
り分子量が０．２Kbp から２Kbp のｃＤＮＡ断片のみを
分取した。次に、このようにして得られた２Ｐ１５由来
及び２Ｐ２６由来のｃＤＮＡ断片を、それぞれ特有のＰ
ＣＲ用プライマー：

【０１００】ヒトＴｈ１用プライマー：５’−ＣＴＣ
ＴＴＧ ＣＴＴ ＧＡＡ ＴＴＣ ＧＧＡ ＣＴＡ−
３’（配列番号１） ヒトＴｈ２用プライマー：５’−ＡＧＴ ＴＡＣ ＡＣ
Ｇ ＴＣＴ ＡＧＡ ＡＴＧ ＧＣＴ−３’（配列番号
３）

【０１０１】を用いてＰＣＲにより増幅した（熱サイク
ル：９４℃１分；５０℃１分；７２℃２分；を３０
回）。このＰＣＲにより得られたＰＣＲ産物をサブトラ
クションの出発材料とした。

【０１０２】すなわち、ヒトＴｈ１（２Ｐ１５）由来の
上記ＰＣＲ産物（５μg ）に大過剰量のビオチン標識ヒ
トＴｈ２（２Ｐ２６）由来のＰＣＲ産物（１００μg ）
〔ＤＮＡ（100 μg ) に光反応性ビオチン（100 μg )
（ベクターラボラトリーズ社製）を加え、氷中で冷しな
がら、１６０Ｗサンランプ下約１５cmの所に静置し、１
５分間照射した。その後、未反応ビオチンをブタノール
抽出で除去し、この操作を再度繰り返した後、トリス・
ＥＤＴＡ緩衝液（ＴＥ）に溶解してビオチン標識を完了
した。〕を加え、１００℃で熱変性してそれぞれを１本
鎖とした後に両者をハイブリダイズさせた。次いで、フ
リーの２Ｐ２６由来のｃＤＮＡ及び２Ｐ１５由来のｃＤ
ＮＡとハイブリダイズした２Ｐ２６由来のｃＤＮＡを、
系にストレプトアビジン（ライフテクノロジーズ製）を
１００μg 添加して、これに吸着させて、フェノール・
クロロホルム抽出により除去した。この操作により、２
Ｐ１５由来のｃＤＮＡから２Ｐ２６由来のｃＤＮＡと共
通の塩基配列を持つｃＤＮＡが差し引かれ、２Ｐ１５に
対して特異的なｃＤＮＡを濃縮するサブトラクションが
完了した。

【０１０３】次いで、この濃縮した２Ｐ１５に対して特
異的なｃＤＮＡについて、上記のＰＣＲ増幅及びサブト
ラクションを再度繰り返し、２Ｐ１５に対して特異的な
ｃＤＮＡをさらに濃縮した後、再度上記と同様のＰＣＲ
増幅を行い、約３μg のｃＤＮＡを得た。このようにし
て得た２Ｐ１５に対して特異的なｃＤＮＡを、プラスミ
ドｐBluescript SK(-)（ストラタジーン社製）にクロー
ニングしてサブトラクトｃＤＮＡライブラリーを調製し
た。次いで、このサブトラクトｃＤＮＡライブラリーの
一部で大腸菌（Ｅ．coli JM109株）を形質転換した。

【０１０４】（３）本発明Ｔｈ１遺伝子断片の単離 上記（２）で得た２Ｐ１５由来のサブトラクトｃＤＮＡ
及び同様の方法により得られた２Ｐ２６由来のサブトラ
クトｃＤＮＡを、それぞれランダムプライミング法を用
いた市販の³²Ｐ標識用キット（宝酒造製）を用いて標識
し、これらを放射性プローブとした。一方、上記（２）
において調製した２Ｐ１５由来のｃＤＮＡライブラリー
の一部で形質転換した大腸菌をプレートに播き、生育し
てきたコロニーについて２組のレプリカフィルターを作
製した。この２組のレプリカフィルターに対して、上述
の２種の放射性プローブをハイブリダイズさせ、０．１
×ＳＳＣで洗浄後、オートラジオグラフィーでプローブ
中のｃＤＮＡと相同なｃＤＮＡを含む大腸菌コロニーを
同定した。

【０１０５】この方法で、約２１００のコロニーをスク
リーニングした結果、「２Ｐ２６由来のサブトラクトｃ
ＤＮＡプローブでは陽性シグナルを与えず、２Ｐ１５由
来のサブトラクトｃＤＮＡプローブに対してのみ陽性シ
グナルを与える」コロニーを３２０個認めた。この３２
０個のｃＤＮＡクローンについて、コロニーハイブリダ
イゼーション法により、相互の異同を検討した結果、相
互にハイブリダイズしない独立した３３個のクローンを
得た。次に、この３３個のクローンについて、全ＲＮＡ
を用いたノーザンブロッティングにより、２Ｐ１５と２
Ｐ２６との間でのｍＲＮＡの発現の差を検討した。その
結果、２Ｐ２６には殆ど発現しておらず、２Ｐ１５にの
み発現が顕著であるクローンを１４種得た。

【０１０６】次に、この１４種のクローンのｃＤＮＡに
ついて、さらにヒトＴｈ１に対する特異性を確認するた
めに、複数のヒトＴｈ１クローン細胞及びヒトＴｈ２ク
ローン細胞との間でのｍＲＮＡの発現の差を、上記ノー
ザンブロッティング法により検討した。その結果、ヒト
Ｔｈ１クローン細胞にのみ共通に発現が認められるいく
つかのｃＤＮＡクローンを得た。そのうちの１つのクロ
ーン（Ｔ４８）の上記ノーザンブロッティング解析の結
果を第１図に示す。

【０１０７】この第１図において、Ｔ４８ｍＲＮＡが上
記２つのヒトＴｈ１クローン（１Ｐ０４及び２Ｐ１５）
に共通に発現していることが明らかになった（レーン１
及びレーン２に対応する）。なお、Ｔ４８ｍＲＮＡはヒ
トＴｈ２クローン（２Ｐ２６及びＫＮＤ４）のいずれに
も発現していなかった（レーン３及びレーン４に対応す
る）。

【０１０８】ｃＤＮＡクローンＴ４８のＤＮＡの塩基配
列の解析を、蛍光ターミネーターを用いたジデオキシタ
ーミネーション法により（パーキンエルマーシータス社
のキットを用いた）行った。その結果、クローンＴ４８
は、新規の塩基配列を有するＤＮＡを有していた。そこ
で、次にクローンＴ４８が有する上記遺伝子と相同の塩
基配列を含む遺伝子（本発明Ｔｈ１遺伝子）の全長につ
いてのクローニングを行った。

【０１０９】（４）本発明Ｔｈ１遺伝子のクローニング 所望のｃＤＮＡの全長をクローニングするために、Ｔ４
８ｍＲＮＡの発現が高い細胞からλファージｃＤＮＡラ
イブラリーを調製した。すなわち、上記２Ｐ１５細胞よ
り全ＲＮＡを抽出し、オリゴ（ｄＴ）ラテックス（日本
ロシュ製）を用いて、ｐｏｌｙ（Ａ）⁺ ＲＮＡを常法に
より精製した。次に、市販のｃＤＮＡクローニングキッ
ト（ライフテクノロジー社製）を用いて、２本鎖ｃＤＮ
Ａを合成し、λｇｔ２２ＡファージのＳａｌ I／Ｎｏｔ
I サイトにクローニングした。これに引続き、市販の
キット（ストラタジーン社製）を用いて、インビトロで
上記λファージにおけるパッケージングを完了した。こ
のパッケージング産物を大腸菌Ｙ１０９０ｒ^- 株に感染
させ、約２×１０⁵ 個の組換えλファージを得た。次
に、上記（３）により得た新規のｃＤＮＡ断片をランダ
ムプライミング法を用いた市販の³²Ｐ標識用キット（宝
酒造製）を用いて標識し、これを放射性プローブとし
て、プラークハイブリダイゼーション法によりλファー
ジライブラリーのスクリーニングを行った。

【０１１０】その結果、１３の陽性クローンを見出し、
これらの陽性ｃＤＮＡクローンのうち、最も長いインサ
ートＤＮＡを持つクローン３つをプラスミドｐBluescri
pt SK(-)（ストラタジーン社製）のＥｃｏＲＶ／Ｎｏｔ
I サイトにサブクローニングした。上記（３）と同様
の蛍光ターミネーターを用いたジデオキシターミネーシ
ョン法による塩基配列解析の結果、上記３つの陽性クロ
ーンのｃＤＮＡの互いに重複する部分の塩基配列は完全
に一致しており、同一の遺伝子に由来するクローンであ
ることが確認された。これらの３つの陽性クローンのう
ち、最も長いｃＤＮＡを有するクローンＴ４８−４をＴ
４８と称し、以下に用いた。

【０１１１】（５）本発明Ｔｈ１遺伝子の構造 クローンＴ４８に取り込まれたｃＤＮＡは１１５３bpの
鎖長であり、ノーザンブロッティングで測定されたｍＲ
ＮＡの長さ（１．４kbp ）にほぼ近いものであった。そ
して、その３’端に、ｐｏｌｙ（Ａ）付加シグナル及び
逆転写反応で用いたオリゴｄＴの相補配列と思われる１
５個のＡ（アデニン）を有していた。

【０１１２】また、最も長いオープンリーディングフレ
ームは、５’端より７９番目のＡＴＧより始まり、７４
８番目のＴＧＡで終わり、２２３アミノ酸残基よりなる
タンパク質をコードしていると予測された。その開始コ
ドン付近の塩基配列（ＴＣＧＣＣＡＴＧＡ）は、Ｋｏｚ
ａｋのコンセンサス配列（ＣＣＡ（Ｇ）ＣＣＡＴＧＧ：
Kozak,M.,Nucleic Acids Res.,15,8125(1987) ））とほ
ぼ相同であった。

【０１１３】以上の点より、クローンＴ４８は、ｍＲＮ
Ａの３’端から始まり、コーディング領域全長を経て
５’側の非翻訳領域の一部に達するほぼ全長を含んでい
ると判断された。このクローンＴ４８の有するｃＤＮＡ
配列を有する遺伝子を本発明Ｔｈ１遺伝子とし、その配
列を配列番号５に示す。また、この塩基配列がコードす
ると推定されるアミノ酸配列を配列番号６に示す。

【０１１４】なお、このアミノ酸配列を一文字法で表す
と以下のようになる。『MKFVPCLLLVTLSCLGTLGQAPRQKQGS
TGEEFHFQTGGRDSCTMRPSSLGQGAGEVWLRVDCRNTDQTYWCEYRGQP
SMCQAFAADPKPYWNQALQELRRLHHACQGAPVLRPSVCREAGPQAHMQQ
VTSSLKGSPEPNQQPEAGTPSLRPKATVKLTEATQLGKDSMEELGKAKPT
TRPTAKPTQPGPRPGGNEEAKKKAWEHCWKPFQALCAFLISFFRG 』
〔上記アミノ酸配列において、Ａ：アラニン，Ｖ：バリ
ン，Ｌ：ロイシン，Ｉ：イソロイシン，Ｐ：プロリン，
Ｆ：フェニルアラニン，Ｗ：トリプトファン，Ｍ：メチ
オニン，Ｇ：グリシン，Ｓ：セリン，Ｔ：トレオニン，
Ｃ：システイン，Ｑ：グルタミン，Ｎ：アスパラギン，
Ｙ：チロシン，Ｋ：リシン，Ｒ：アルギニン，Ｈ：ヒス
チジン，Ｄ：アスパラギン酸，Ｅ：グルタミン酸，をそ
れぞれ示す。〕

【０１１５】また、本発明遺伝子を大腸菌（Ｅ.coli K1
2-JM109 株）に組み込み、この形質転換体は、Ｔ４８
ｃＤＮＡとして、工業技術院生命工学研究所に寄託番号
ＦＥＲＭ Ｐ−１５６１８として寄託されている。

【０１１６】（６）インビトロにおける本発明Ｔｈ１遺
伝子の転写及び翻訳 市販のキット（ストラタジーン社製）を用いて、本発明
Ｔｈ１遺伝子を鋳型として、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを
用いてＲＮＡを合成した。続いて³⁵Ｓメチオニンの存在
下に、市販のウサギ網状赤血球抽出物（プロメガ バイ
オテク社製）を用いてインビトロ翻訳を行った。次い
で、その翻訳産物をレムリ（Laemmli ）の方法に従い、
ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動で分析した。その結
果、予測された分子量である２５Kdと近似した分子量を
有する単一のタンパク質が作られていることを確認した
（第２図）。

【０１１７】（７）ｍＲＮＡ発現の組織特異性 本発明Ｔｈ１遺伝子由来のｍＲＮＡ発現の組織特異性を
調べるために、種々の組織に由来する細胞株の全ＲＮＡ
についてのノーザンブロッティング解析を行った。その
結果、用いたいずれの細胞株でも本発明Ｔｈ１遺伝子由
来のｍＲＮＡの発現が確認できなかった（第３図）。従
って、本発明Ｔｈ１遺伝子の発現は、Ｔｈ１細胞を含む
特定の細胞に限定されることが明らかになった。

【０１１８】〔実施例２〕大腸菌リコンビナント本発明
ヒトＴｈ１タンパク質の製造 （１）大腸菌用本発明Ｔｈ１遺伝子発現ベクターの作製 本発明Ｔｈ１遺伝子の全長（配列番号５）を含むプラス
ミドＤＮＡ（pBiuescript SK(-), 上記Ｔ４８ ｃＤＮ
Ａから単離した）を鋳型にして、ＢａｍＨＩサイト及び
エンテロキナーゼ認識切断部位をコードする塩基配列を
含むセンスプライマー〔５’−ＣＧＡ ＧＧＡ ＴＣＣ
ＧＡＴ ＧＡＣ ＧＡＴ ＧＡＣ ＡＡＡ ＣＡＧ
ＧＣＣ ＣＣＧ ＡＧＡ ＣＡＡ ＡＡＧ ＣＡＡ−
３’（配列番号７）〕及びＨｉｎｄIII サイトを含むア
ンチセンスプライマー〔５’−ＣＣＡ ＡＣＡ ＡＧＣ
ＴＴＡ ＣＣＡ ＧＧＣ ＣＴＴ ＣＴＴ ＣＴＴ
ＴＧＣ ＴＴＣ−３’（配列番号８）〕を用いて本発明
ヒトＴｈ１タンパク質のＮ末端側から１９アミノ酸残基
及びＣ末端側から２０アミノ酸残基を除いた中心部分に
相当する遺伝子領域をＰＣＲ法を用いて増幅した。

【０１１９】このＰＣＲは、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ
（ストラタジーン社製）を用いて９６℃・３０秒，６０
℃・１分，７６℃・３分を１サイクルとした熱サイクル
を１０サイクル行った。このＰＣＲによって得られたＰ
ＣＲ産物を、フェノール／クロロホルム抽出及びエタノ
ール沈澱により精製した後、制限酵素（ＢａｍＨＩとＨ
ｉｎｄIII ）で消化し、この消化物をアガロース電気泳
動で精製した。得られた精製ＤＮＡをｐＱＥ３０（ＱＩ
ＡＧＥＮ社製）のＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄIII サイトに挿
入し、所望する大腸菌用の発現プラスミドｐＱＥ／Ｔ４
８を得た。

【０１２０】（２）リコンビナント本発明ヒトＴｈ１タ
ンパク質の製造 リコンビナント本発明ヒトＴｈ１タンパク質を得るため
に、まず上述の大腸菌用の発現プラスミドｐＱＥ／Ｔ４
８で大腸菌Ｍ１５を形質転換した。次に、得られた形質
転換体をＴＢ培地２０ml中で３７℃で一晩振盪培養を行
った。得られた振盪培養物を１l のＴＢ培地に接種し、
さらに３７℃での培養を継続した。６００nmでの吸光度
が１．０になった時点で、終濃度０．２mMになるように
ＩＰＴＧ（シグマ社製）を添加し、さらに３時間の振盪
培養を継続した。得られた培養物に遠心処理を施して集
菌した後、得られた菌体を溶解液（8M Urea ，100mM Na
H₂PO₄ ，10mMTris-HCl pH8.0）４０mlに懸濁し、これを
室温で１時間攪拌した。攪拌後、菌体の溶解物を遠心処
理（10000 ×g ,15 分,4℃）した後、この遠心上清に予
め溶解液で平衡化したＮｉ−ＮＴＡagarose （ＱＩＡＧ
ＥＮ社製）１６mlを添加し、これを室温で１．５時間攪
拌した。

【０１２１】反応後のＮｉ−ＮＴＡagarose を上述の溶
解液及び洗浄液（溶解液のｐＨを６．３に調整した溶
液）でよく洗浄した後、カラムに充填し、計１００mlの
０〜３００mMのイミダゾール濃度勾配洗浄液で溶出し、
これを２mlずつ分画した。溶出ピークに相当する分画を
集めた後、透析によりＵｒｅａを段階的に除去し、最後
に５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．３），１５０mM
ＮａＣｌ，１０％ グリセロール緩衝液で透析して、
所望するリコンビナント本発明ヒトＴｈ１タンパク質を
得た。上記のようにして製造したリコンビナント本発明
ヒトＴｈ１タンパク質を、還元下でＳＤＳポリアクリル
アミド電気泳動により解析した結果を第４図に示す。

【０１２２】〔実施例３〕本発明ヒトＴｈ１タンパク質
に対するモノクローナル抗体の製造 （１）遺伝子免疫用本発明Ｔｈ１遺伝子ベクターの調製
及び同遺伝子による免疫本発明Ｔｈ１遺伝子の全長（配
列番号５）を含むプラスミドＤＮＡ（pBluescript SK
(-))で形質転換した大腸菌（Ｅ.coli K12-JM109 株）
（上記Ｔ４８ ｃＤＮＡ）を増殖させて集菌し、これか
らプラスミドＤＮＡを抽出して、制限酵素ＨｉｎｄIII
及びＮｏｔＩを用いて消化し、アガロース電気泳動でベ
クターＤＮＡを分離させて、インサートＤＮＡ（Ｔ４
８）を調製した。このようにして得たＴ４８遺伝子（開
始コドン上流７８bpからpolyＡテイルまで）を、ｐＲｃ
／ＣＭＶプラスミド（Invitrogen社製）のサイトメガロ
ウイルスプロモーターの下流にあるＨｉｎｄIII サイト
とＮｏｔI サイトとの間に挿入して、所望するＴ４８の
全長を組み込んだプラスミドＤＮＡ（ｐＲｃ／ＣＭＶ−
Ｔ４８）を得た。

【０１２３】このｐＲｃ／ＣＭＶ−Ｔ４８の生理食塩水
溶液を、８週齢ＢＡＬＢ／ｃマウス（♀）の両足大腿筋
及び尾皮内に各２０μg を（１匹１回当り６０μg ）、
３週おきに３回免疫した。特異抗体の上昇を、免疫血清
を用いて間接蛍光抗体法及びウエスタンブロッティング
法で確認後、さらに上記と同様の手順で２回追加免疫を
行った。

【０１２４】（２）ハイブリドーマの調製 最終免疫の２週間後、免疫マウスの脾臓細胞を１×１０
⁸ 個及びミエローマ細胞を３×１０⁷ 個をＲＰＭＩ１６
４０培地中で混合した。次に、この混合物に遠心を施し
て得られた細胞の混合沈澱を、ＲＰＭＩ１６４０培地で
洗浄して上清を完全に除去した後、残った細胞沈澱物
に、３７℃に保温した５０％ポリエチレングリコール
（平均分子量１５００）ＰＢＳ溶液を４５秒かけて攪拌
しながら加えて、この残った細胞沈澱物を懸濁した。細
胞を均一に懸濁しながらＲＰＭＩ１６４０培地を３０ml
加えた後、系に遠心分離を施して細胞を再び沈澱させ
た。

【０１２５】このようにして得られた細胞をＨＡＴ培地
に懸濁し、９６ウエルプレートに１ウエル当たり１×１
０⁵ 個／５０μl の濃度でまき、３７℃，５％ＣＯ₂ の
条件下でインキュベーターを用いて培養した。なお、培
養開始後５日，７日及び９日目にウエル当り５０μl の
ＨＡＴ培地を追加して栄養補給を行い、細胞を観察し
た。培養開始後１０〜１４日目には、ほとんどのウエル
に細胞増殖が見られるようになるので、それぞれの培養
上清を一定量採集して１次スクリーニングを行った。す
なわち、スライドに固定したＴ４８由来ｃＤＮＡを強制
発現させたＣＯＳ７細胞〔ｐｃＤＬ−ＳＲα／ＣＯＳ
７、調製法：１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）を含むＤＭＥ
Ｍで１８時間培養したＣＯＳ７細胞に，リポフェクチン
試薬（ライフテクノロジー社製）とＴ４８由来ｃＤＮＡ
を組み込んだｐｃＤＬ−ＳＲαプラスミドＤＮＡを含ん
だＯｐｔｉ−ＭＥＭＩ培地（ライフテクノロジー社製）
を重層し，ＣＯ₂ インキュベーター内で３７℃で６時間
培養した。次いで，培地を除いた後，１０％ＦＢＳ／Ｄ
ＭＥＭを加え、３７℃で４２時間培養した。〕と、室温
で３０分反応させた。この反応系を洗浄して、ＦＩＴＣ
標識ヤギ抗マウスＩｇＧと遮光状態で室温下、３０分間
反応させた。再び反応系を洗浄後、これにカバーグラス
をのせて蛍光顕微鏡で観察した。

【０１２６】なお、ここで用いたスライドは以下のよう
にして調製した。すなわち、Ｔ４８由来ｃＤＮＡを強制
発現させたＣＯＳ７細胞（上記）を５×１０⁵ 個/ mlの
割合で１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭに懸濁し、この懸濁物を
１２穴スポットスライドグラスに４０μl/穴で分注後、
ＣＯ₂ インキュベーター内で３７℃で３時間培養し、細
胞をスライドグラス上に付着させた。次いで、このスラ
イドをＰＢＳで軽くリンスした後、氷冷した２％パラホ
ルムアルデヒドＰＢＳ溶液で室温で１０分間処理して細
胞を固定した。次いで、再びＰＢＳでリンス後、０．１
％ＮＰ−４０／ＰＢＳ溶液で、室温下、５分間処理して
細胞膜を可溶化してこのスライドを調製した。

【０１２７】（３）モノクローナル抗体の製造 上記実施例２において、Ｔ４８由来ｃＤＮＡを組み込ん
だ細胞のみに反応したウエルについて、限界希釈法によ
る単クローンの選択及び２次スクリーニングを行った。
すなわち、単クローンの選択については、ウエル中の細
胞数を測定し、細胞が１ウエル当り０．２個になるよう
に細胞を懸濁した培地を９６ウエルプレートに分注して
培養した後、再度培養上清を用いて上記スクリーニング
を行った。なお、この操作は３回行った。また、２次ス
クリーニングは以下のように行った。

【０１２８】免疫ブロットによる方法 Ｔ４８由来ｃＤＮＡを強制発現させたＣＯＳ７細胞（前
記）を、０．５％の界面活性剤であるＮＰ−４０を含む
バッファーで溶解し、この溶解物に遠心分離を施して、
核を除いた上清をサンプルとした。次に、このサンプル
を還元及び非還元条件下で、ＳＤＳポリアクリルアミド
電気泳動で分離した。

【０１２９】電気泳動を行ったゲルからニトロセルロー
ス膜へ、この電気泳動により生じたバンドをブロットし
た後、ブロッキングバッファー（１％スキムミルク，５
％ＦＢＳ及び０．１％ツイーン２０含有ＰＢＳ）に浸
し、４℃で一晩静置した後、さらにハイブリドーマの培
養上清に浸し、室温で１時間反応させた。膜をウオッシ
ュバッファー（０．１％ツイーン２０含有ＰＢＳ）に浸
して１５分間振盪して洗浄した。３回洗浄した後、希釈
した標識二次抗体（ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウス
ＩｇＧ）と室温で１時間反応させた。ウオッシュバッフ
ァーで３回洗浄後、膜をケミルミネッセンス法により化
学発光させ、オートラジオグラフィー用フィルムに当て
てバンドを検出した。

【０１３０】フローサイトメーターによる方法（この
方法は、抗原となるタンパク質が細胞膜上に発現してい
る場合に適用可能である） Ｔ４８由来ｃＤＮＡを強制発現させたＣＯＳ７細胞を、
１０％ＦＢＳ，ＲＰＭＩ１６４０培地で適当に希釈した
ハイブリドーマ上清に浮遊させ、氷上で３０分反応させ
た。細胞をウオッシュバッファー（０．１％ＢＳＡ，
０．０５％ＮａＮ₃ 含有ＰＢＳ）で２回洗浄後、細胞を
希釈したＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体溶液中
で、氷上において３０分間反応させた。細胞をウオッシ
ュバッファーで２回洗浄後、ＰＢＳに懸濁し、フローサ
イトメーターにより蛍光を検出した。

【０１３１】上記方法により選別した本発明Ｔｈ１遺伝
子産物特異的モノクローナル抗体産生ハイブリドーマに
ついて、単クローン細胞を大量に培養し、抗体を精製す
ることによって所望する本発明ヒトＴｈ１タンパク質に
特異的なモノクローナル抗体が得られた。また、このハ
イブリドーマをＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内に投与し、
腹腔内で細胞が増殖して抗体を含む腹水が貯留した後、
採集し、抗体を精製した。これらの結果、本発明ヒトＴ
ｈ１タンパク質に対する特異的モノクローナル抗体を産
生するクローンＴＤＡ−３及びＴＦＧ−７を得ることが
できた。これらのうち、クローンＴＤＡ−３が産生する
モノクローナル抗体を用いてＴ４８由来ｃＤＮＡを強制
発現させたＣＯＳ７細胞の免疫ブロットの結果を第５図
に示す。また、同細胞のフローサイトメーターによる解
析結果を第６図に示す。

【０１３２】この本発明ヒトＴｈ１タンパク質に対して
特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ
は、Mouse Hybridoma ＴＤＡ−３及びMouse Hybridoma
ＴＦＧ−７として、通商産業省工業技術院生命工学研究
所に寄託されている（寄託番号は、Mouse Hybridoma Ｔ
ＤＡ−３がＦＥＲＭ Ｐ−１６０３３，同ＴＦＧ−７が
ＦＥＲＭ Ｐ−１６０３４，である）。

【０１３３】〔実施例４〕ポリクローナル短期培養末梢
血単核球での本発明ヒトＴｈ１タンパク質の発現 （１）ポリクローナル短期培養末梢血単核球の調製 健常人の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、ヒトＴｈ１細胞
を主に誘導するために、ＰＰＤ（日本ビー・シー・ジー
製造株式会社製）５μg/ml，r ＩＦＮ−γ ５０ng/ml
及びrＩＬ−１２ ５ng/ml を添加した１０％牛胎児血
清添加ＲＰＭＩ１６４０培地（ライフテクノロジー社
製）中で４日間培養した。その一方、主にヒトＴｈ２細
胞を誘導するために、ＰＢＭＣをダニ抽出液 １％（v/
v ），ハウスダスト抽出液（鳥居薬品製）１％（v/v
），rＩＬ−４ １００ng/ml 及び抗ＩＦＮ−γ抗体
１０μg/mlを添加した、１０％牛胎児血清添加ＲＰＭＩ
１６４０培地中で４日間培養した。４日後、各培養にr
ＩＬ−２ ５０U/mMを添加して、さらに６〜１０日間培
養した。

【０１３４】（２）本発明ヒトＴｈ１タンパク質のフロ
ーサイトメトリーによる発現解析 上述のようにして得られたポリクローナル短期培養ＰＢ
ＭＣを、ＡＩＭＶ培地（ライフテクノロジー社製）中で
１晩培養した後、モノクローナル抗体の一つ（Mouse Hy
bridoma ＴＤＡ３由来）を用いて、膜蛍光抗体法により
染色した。すなわち、上記細胞１０⁵ 個を５μg/mlのＴ
ＤＡ３を含む染色液（５％牛胎児血清，５％ヤギ血清，
１％ＢＳＡ，０．０５％アジ化ナトリウム含有ＰＢＳ）
５０μl中に浮遊させ、氷上で３０分間反応させた。反
応後、細胞を洗浄液（０．５％ＢＳＡ，０．０５％アジ
化ナトリウム含有ＰＢＳ）で２回洗浄後、フィコエリス
リン標識ヤギ抗マウスイムノグロブリン抗体（ＣＨＥＭ
ＩＣＯＮ社製）２μg/mlを含む染色液５０μl 中に浮遊
させ、氷上で３０分間反応させた。２回の洗浄の後、細
胞をフローサイトメーター（ＦＡＣＳｃａｎ：ＢＥＣＴ
ＯＮ ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ社製）により解析した。第７
図にその結果を示す。第７図において、本発明ヒトＴｈ
１タンパク質は細胞膜上に発現しているのが確認され、
その発現はＴｈ１タイプの短期培養ＰＢＭＣに優位であ
ることが確認できた。

【０１３５】

【発明の効果】本発明により、上記のＴｈ１／Ｔｈ２サ
ブセットの分布における極性化における知見に基づい
た、免疫関連疾患の病勢や病型の特定手段の重要な要素
となるヒトＴｈ１特異的遺伝子及びヒトＴｈ１特異的タ
ンパク質が提供される。また、本発明によりこのヒトＴ
ｈ１特異的遺伝子を含む遺伝子発現用組換えベクター、
この遺伝子発現用組換えベクターで形質転換された形質
転換体が提供される。さらに、本発明により上記ヒトＴ
ｈ１特異的タンパク質を抗原とするポリクローナル抗体
及びモノクローナル抗体とこれを産生するハイブリドー
マが提供される。

【配列表】

【０１３６】配列番号：１ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CTCTTGCTTG AATTCGGACT A 21

【０１３７】配列番号：２ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TAGTCCGAAT TCAAGCAAG AGCACA 25

【０１３８】配列番号：３ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 AGTTACACGT CTAGAATGGC T 21

【０１３９】配列番号：４ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 AGCCATTCTA GACGTGTAA CTGATA 25

【０１４０】配列番号：５ 配列の長さ：１１５３ 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：不明 配列の種類：ｃＤＮＡ 起源 ヒトＴｈ１遺伝子 配列 CCCTTTAAAG GGTGACTCGT CCCACTTGTG TTCTCTCTCC TGGTGCAGAG TTGCAAGCAA 60 GTTTATCAGA GTATCGCCAT GAAGTTCGTC CCCTGCCTCC TGCTGGTGAC CTTGTCCTGC 120 CTGGGGACTT TGGGTCAGGC CCCGAGGCAA AAGCAAGGAA GCACTGGGGA GGAATTCCAT 180 TTCCAGACTG GAGGGAGAGA TTCCTGCACT ATGCGTCCCA GCAGCTTGGG GCAAGGTGCT 240 GGAGAAGTCT GGCTTCGCGT CGACTGCCGC AACACAGACC AGACCTACTG GTGTGAGTAC 300 AGGGGGCAGC CCAGCATGTG CCAGGCTTTT GCTGCTGACC CCAAACCTTA CTGGAATCAA 360 GCCCTGCAGG AGCTGAGGCG CCTTCACCAT GCGTGCCAGG GGGCCCCGGT GCTTAGGCCA 420 TCCGTGTGCA GGGAGGCTGG ACCCCAGGCC CATATGCAGC AGGTGACTTC CAGCCTCAAG 480 GGCAGCCCAG AGCCCAACCA GCAGCCTGAG GCTGGGACGC CATCTCTGAG GCCCAAGGCC 540 ACAGTGAAAC TCACAGAAGC AACACAGCTG GGAAAGGACT CGATGGAAGA GCTGGGAAAA 600 GCCAAACCCA CCACCCGACC CACAGCCAAA CCTACCCAGC CTGGACCCAG GCCCGGAGGG 660 AATGAGGAAG CAAAGAAGAA GGCCTGGGAA CATTGTTGGA AACCCTTCCA GGCCCTGTGC 720 GCCTTTCTCA TCAGCTTCTT CCGAGGGTGA CAGGTGAAAG ACCCCTACAG ATCTGACCTC 780 TCCCTGACAG ACAACCATCT CTTTTTATAT TATGCCGCTT TCAATCCAAC GTTCTCACAC 840 TGGAAGAAGA GAGTTTCTAA TCAGATGCAA CGGCCCAAAT TCTTGATCTG CAGCTTCTCT 900 GAAGTTTGGA AAAGAAACCT TCCTTTCTGG AGTTTGCAGA GTTCAGCAAT ATGATAGGGA 960 ACAGGTGCTG ATGGGCCCAA GAGTGACAAG CATACACAAC TACTTATTAT CTGTAGAAGT 1020 TTTGCTTTGT TGATCTGAGC CTTCTATGAA AGTTTAAATA TGTAACGCAT TCATGAATTT 1080 CCAGTGTTCA GTAAATAGCA GCTATGTGTG TGCAAAATAA AAGAATGATT TCAGAAATAA 1140 AAAAAAAAAA AAA 1153

【０１４１】配列番号：６ 配列の長さ：２２３ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：不明 配列の種類：蛋白質 起源 ヒトＴｈ１ 配列 Met Lys Phe Val Pro Cys Leu Leu Leu Val Thr Leu Ser Cys Leu Gly 16 Thr Leu Gly Gln Ala Pro Arg Gln Lys Gln Gly Ser Thr Gly Glu Glu 32 Phe His Phe Gln Thr Gly Gly Arg Asp Ser Cys Thr Met Arg Pro Ser 48 Ser Leu Gly Gln Gly Ala Gly Glu Val Trp Leu Arg Val Asp Cys Arg 64 Asn Thr Asp Gln Thr Tyr Trp Cys Glu Tyr Arg Gly Gln Pro Ser Met 80 Cys Gln Ala Phe Ala Ala Asp Pro Lys Pro Tyr Trp Asn Gln Ala Leu 96 Gln Glu Leu Arg Arg Leu His His Ala Cys Gln Gly Ala Pro Val Leu 112 Arg Pro Ser Val Cys Arg Glu Ala Gly Pro Gln Ala His Met Gln Gln 128 Val Thr Ser Ser Leu Lys Gly Ser Pro Glu Pro Asn Gln Gln Pro Glu 144 Ala Gly Thr Pro Ser Leu Arg Pro Lys Ala Thr Val Lys Leu Thr Glu 160 Ala Thr Gln Leu Gly Lys Asp Ser Met Glu Glu Leu Gly Lys Ala Lys 176 Pro Thr Thr Arg Pro Thr Ala Lys Pro Thr Gln Pro Gly Pro Arg Pro 192 Gly Gly Asn Glu Glu Ala Lys Lys Lys Ala Trp Glu His Cys Trp Lys 208 Pro Phe Gln Ala Leu Cys Ala Phe Leu Ile Ser Phe Phe Arg Gly 223

【０１４２】配列番号：７ 配列の長さ：４５ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CGAGGATCCG ATGACGATGA CAAACAGGCC CCGAGACAAA AGCAA 45

【０１４３】配列番号：８ 配列の長さ：３３ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CCAACAAGCT TACCAGGCCT TCTTCTTTGC TTC 33

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明Ｔｈ１遺伝子由来のｍＲＮＡ発現のＴｈ
クローン選択性を示すノーザンブロッティング解析の結
果を示す電気泳動写真像等を示した図面である。

【図２】インビトロにおける本発明Ｔｈ１遺伝子の翻訳
産物の電気泳動写真像等を示した図面である。

【図３】本発明Ｔｈ１遺伝子由来のｍＲＮＡ発現の組織
特異性を示すノーザンブロッティング解析の結果を示す
電気泳動写真像等を示した図面である。

【図４】リコンビナント本発明ヒトＴｈ１タンパク質
を、還元下でＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動により
解析した結果を示した図面である。

【図５】Mouse Hybridoma ＴＤＡ−３が産生するモノク
ローナル抗体を用いてＴ４８に由来するｃＤＮＡを強制
発現させたＣＯＳ７細胞の免疫ブロットの結果を示した
図面である。

【図６】Mouse Hybridoma ＴＤＡ−３が産生するモノク
ローナル抗体を用いてＴ４８に由来するｃＤＮＡを強制
発現させたＣＯＳ７細胞のフローサイトメーターによる
解析の結果を示した図面である。

【図７】膜蛍光抗体法により染色したポリクローナル短
期培養ＰＢＭＣをフローサイトメーターにより解析した
結果を示した図面である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｑ 1/68 7823−4Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 高野 昇一 埼玉県川越市的場1361番地１ 株式会社ビ ー・エム・エル総合研究所内

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】配列番号６で表されるアミノ酸配列のヒト
   Ｔｈ１特異的タンパク質。
2. 【請求項２】配列番号６で表されるアミノ酸配列の一部
   のアミノ酸が欠失，置換若しくは付加されたアミノ酸配
   列からなり、かつ請求項１記載のヒトＴｈ１特異的タン
   パク質と実質的に同一の生物学的活性を有するヒトＴｈ
   １特異的タンパク質。
3. 【請求項３】配列番号６で表されるアミノ酸配列をコー
   ドする塩基配列を含むヒトＴｈ１特異的遺伝子。
4. 【請求項４】配列番号５で表される塩基配列のヒトＴｈ
   １特異的遺伝子。
5. 【請求項５】配列番号５で表される塩基配列の一部の塩
   基が欠失，置換若しくは付加された塩基配列からなり、
   かつストリンジェントな条件下で配列番号５で表される
   塩基配列のＤＮＡとハイブリダイズし、さらに配列番号
   ６で表されるアミノ酸配列を有するヒトＴｈ１特異的タ
   ンパク質と実質的に同一の生物学的活性を有するヒトＴ
   ｈ１特異的タンパク質をコードするヒトＴｈ１特異的遺
   伝子。
6. 【請求項６】請求項３乃至請求項５のいずれかの請求項
   記載のヒトＴｈ１特異的遺伝子を含有する遺伝子発現用
   組換えベクター。
7. 【請求項７】請求項６記載の遺伝子発現用組換えベクタ
   ーで形質転換され、かつこの組換えベクターに含まれて
   いるヒトＴｈ１特異的遺伝子が発現している形質転換
   体。
8. 【請求項８】請求項１又は請求項２記載のヒトＴｈ１特
   異的タンパクの全部若しくは一部を免疫原とし、かつヒ
   トＴｈ２特異的タンパク質との間においては免疫反応性
   を示さないポリクローナル抗体。
9. 【請求項９】請求項１又は請求項２記載のヒトＴｈ１特
   異的タンパク質のいずれかの部分をその抗原決定基と
   し、かつヒトＴｈ２特異的タンパク質との間においては
   免疫反応性を示さないモノクローナル抗体。
10. 【請求項１０】その免疫原が請求項６記載の組換えベク
    ターである請求項９記載のモノクローナル抗体。
11. 【請求項１１】請求項１０記載のモノクローナル抗体を
    産生するハイブリドーマ。