JP3238418B2 - 細胞障害性リンパ球成熟因子およびそれに対するモノクローナル抗体 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明はサイトカインの分野、特にインタ
ーロイキン−２(IL-２) と相乗的に作用して細胞障害性
リンパ球を活性化するサイトカイン、例えば細胞障害性
リンパ球成熟因子 (ＣＬＭＦ) のようなサイトカインに
関する。本発明はまたＣＬＭＦに対するモノクローナル
抗体にも関する。「サイトカイン」は一群のタンパク質
性細胞調節因子を表す術語である。これらの因子は、リ
ンフォカイン、モノカイン、インターロイキンおよびイ
ンターフェロンという様々な名称で呼ばれ、体内の広範
な種類の細胞によって生産される。これらのサイトカイ
ンは多くの生理学的応答に重要な役割を演じ、ある範囲
の疾病の病態生理学に関与し、そして治療への可能性を
有している。サイトカインは以下のように共通の性質を
有する異種タンパク質群である。すなわち、サイトカイ
ンは低分子量 (≦80kDa ) の分泌タンパク質で、グリコ
シル化されていることが多い；サイトカインは免疫およ
び炎症反応に関わり、応答の強さおよび持続時間を調節
する；サイトカインは通常一過性、局所的に生産され、
エンドクリン様式によって作用するのではなく、むしろ
パラクリン (傍分泌) 様式またはオートクリン様式で作
用する。サイトカインは非常に強力であり、一般にピコ
モル濃度で作用する；また各サイトカインまたはサイト
カイン群に特異的な細胞表面レセプターと高い親和性を
以って相互作用する。サイトカインの細胞表面への結合
によって、最終的に細胞のＲＮＡ合成およびタンパク質
合成のパターンが変化され、そして細胞の挙動が変化さ
れる。個々のサイトカインは複数の重複する細胞調節作
用を有する。

【０００２】あるサイトカインに対する細胞の応答は、
そのサイトカインの局所濃度、それが作用する細胞の種
類、および同時に露される他の細胞調節因子の如何によ
り決まる。異なる細胞表面レセプターに結合するこれら
構造的に無関係なタンパク質の調節作用の重複は、その
ＤＮＡ中に共通の応答要素を有しうる共通のタンパク質
を誘導することによって少くとも部分的に引き起こされ
る。サイトカインは、第一に互いに誘導しあい、第二に
サイトカイン細胞表面レセプターを別の状態に調節する
ことによって、そして第三に細胞機能への相乗的、相加
的、または拮抗的な相互作用によって、ネットワークの
中で相互に作用する。［Immunology Today 10:299 (198
9)］。

【０００３】新生物の治療に於いて、および免疫増強剤
としてのサイトカインの利用可能性が近年ヒト組換えイ
ンターロイキン−２ (rIL-２) を用いる研究で示されて
いる。天然のインターロイキン−２(IL-２) は、Ｔ−リ
ンパ球により生産され分泌されるリンフォカインであ
る。この糖タンパク質分子はＴ−細胞が役割を有する事
実上すべての免疫応答の誘導に密接に関与する。インビ
トロでのＢ細胞応答もIL-2の存在により増強される。ま
た IL-２は、分化誘導因子としてＢおよびＴリンパ球応
答の制御にも関係している。

【０００４】ヒトrIL-２の投与がいくつかの症例で示さ
れており、実験動物［J. Exp. Med.161:1169-1188 (198
5)］およびヒト［N. Engl. J. Med. 313: 1485-1492 (1
985)および N. Engl. J. Med. 316:889-897 (1987)］の
両者で樹立腫瘍の退行性変化を生じた。rIL-２の抗腫瘍
効果は、インビボでrIL-２により活性化される宿主細胞
障害性エフェクターリンパ球によって媒介されると考え
られる［J. Immunol.139:285-294 (1987)］。さらに、
動物モデルから得られた結果は、rIL-２がある種の感染
性疾患の治療［J. Immunol. 135: 4160-4163 (1985) お
よび J. Virol.61:2120-2127 (1987)］、および化学療
法により引き起こされた免疫抑制の改善［Immunol. Let
t. 10:307-314 (1985)］にも有効でありうることを示唆
する。

【０００５】しかしながら、rIL-２の臨床使用はそれが
惹起する可能性のある重大な副作用のために複雑な問題
となっている［N. Engl. J. Med. 313:1485-1492 (198
5) および N. Engl. J. Med. 316:889-897 (1987)］。
毒性を低下させる一方でサイトカイン療法の有効性を向
上させる一つの方法は２またはそれ以上のサイトカイン
を組合せて使用することである。たとえば、rIL-２を組
換えインターフェロンアルファ (rIFNアルファ) と一緒
に［Cancer Res. 48:260-264 (1988) および Cancer Re
s. 48:5810-5817 (1988)］、または組換え腫瘍壊死因子
アルファ (rTFNアルファ) と一緒に［Cancer Res. 47:3
948-3953 (1987) ］腫瘍担持マウスに投与した場合に、
相乗的な抗腫瘍活性が生ずることが示されている。 IL-
２の抗腫瘍効果は宿主細胞障害性エフェクターリンパ球
により媒介されると考えられるので、rIL-２と相乗作用
してインビトロで細胞障害性リンパ球を活性化する新規
サイトカインを同定し単離することは興味深いであろ
う。これら新規サイトカインはまた、インビボでrIL-２
と組み合わせて投与された場合、抗腫瘍剤としても有用
であろう。

【０００６】従って、本発明は細胞障害性リンパ球成熟
因子 (ＣＬＭＦ) と呼ばれる新規サイトカインタンパク
質を提供するものである。このタンパク質はＣＬＭＦを
分泌しうる細胞によって生産および合成される。かかる
細胞の例は哺乳動物細胞、特にヒトリンパ芽球細胞であ
る。低濃度の IL-２の存在下ではＣＬＭＦはリンフォカ
イン活性化キラー (ＬＡＫ) 細胞の細胞溶解活性を相乗
的に誘導する。ＣＬＭＦはまたＴ−細胞の増殖を刺激す
ることもできる。

【０００７】本発明は、ＣＬＭＦを実質的に純粋な形態
で単離するための方法において、以下の工程、すなわち ａ) ＮＣ−37細胞のようなＢリンパ芽球細胞を刺激して
サイトカインを生産させて上清液中に分泌させ、 ｂ) 刺激を受けた細胞によって生産された上清液を集
め、 ｃ) この上清液をタンパク質フラクションに分離し、 ｄ) 各タンパク質フラクションをＣＬＭＦの存在に関し
て検査し、 ｅ) Ｔ−細胞の増殖を刺激でき、タンパク質フラクショ
ンのＴ−細胞刺激活性の原因物質である活性タンパク質
を含有するタンパク質フラクションを保持し、 ｆ) 細胞溶解性リンパ球成熟因子 (ＣＬＭＦ) である該
活性タンパク質を実質的に純粋な形態で単離する、こと
を含んでなる方法に関する。

【０００８】このようにして得られたＣＬＭＦタンパク
質は他のサイトカインタンパク質を含有しない。天然型
ＣＬＭＦタンパク質は二つのポリペプチドサブユニット
40kDa サブユニットおよび35kDa サブユニットからなる
75キロダルトン (kDa)のヘテロダイマーであり、これら
は一またはそれ以上のジスルフィド結合を介して互いに
結合している。本発明はまたＣＬＭＦ遺伝子のヌクレオ
チド配列および該遺伝子によってコードされるＣＬＭＦ
タンパク質のアミノ酸配列をも提供する。これらの配列
情報に基づいてＣＬＭＦ活性を有する、天然型ＣＬＭＦ
タンパク質の誘導体を調製することができる。それゆえ
本発明は細胞障害性リンパ球成熟因子 (ＣＬＭＦ) を実
質的に純粋な形態で含有するタンパク質、またはＣＬＭ
Ｆ活性を示しＣＬＭＦのアミノ酸配列の生物学的に活性
な部分を含有するかあるいはＣＬＭＦのアミノ酸配列並
びに他のアミノ酸を含有するタンパク質、またはＣＬＭ
Ｆまたはその生物学的に活性なフラグメントに類似した
配列を含有しＣＬＭＦ活性を有するタンパク質に関す
る。

【０００９】上記工程ｃ) 〜ｆ) は他のタンパク質とと
もにＣＬＭＦを含有する任意の液体または流体からＣＬ
ＭＦを精製するのに用いることができる。本発明はまた
ＣＬＭＦ活性を有しかつＴ細胞増殖を刺激しうるタンパ
ク質フラクション、上記方法によって得られた実質的に
精製された活性ＣＬＭＦタンパク質、40kDa サブユニッ
トおよび／または35kDa サブユニットをコードし、単離
されクローニングされた遺伝子、これらの遺伝子を含有
するベクター、該遺伝子を含有するベクターで形質転換
された宿主細胞、およびかかる形質転換宿主細胞中に調
製されたＣＬＭＦタンパク質および誘導体にも関する。
さらに本発明はＬＡＫ細胞およびＴ−細胞ＣＬＭＦ単独
でまたは IL-２とともに処理することを含んでなるこれ
ら細胞の刺激法にも関する。さらにまた本発明はＣＬＭ
Ｆに結合しうる単離されたポリクローナルまたはモノク
ローナル抗体にも関する。

【００１０】ＣＬＭＦの部分精製標品に対して調製され
たモノクローナル抗体は以下のように同定し特性決定さ
れている、すなわち、１： ¹²⁵Ｉ−標識ＣＬＭＦの免疫
沈降反応、２：ＣＬＭＦ生物活性の免疫低下、３：ＣＬ
ＭＦのウェスタンブロッティング、４： ¹²⁵Ｉ−ＣＬＭ
Ｆのその細胞レセプターへの結合の阻害、および５：Ｃ
ＬＭＦ生物活性の中和。抗−ＣＬＭＦ抗体を分泌する20
個のハイブリドーマを同定した。Ｔ−細胞増殖アッセイ
およびＬＡＫ細胞誘導アッセイで評価してこれら抗体は
¹²⁵Ｉ−標識ＣＬＭＦを免疫沈降させそしてＣＬＭＦ生
物活性を免疫低下させることが判明した。ウェスタンブ
ロットでは抗体が70kDa ヘテロダイマーおよびサブユニ
ットの一方と結合することが示された。前記20個の抗−
ＣＬＭＦモノクローナル抗体はいずれもＣＬＭＦに対し
て特異的であり、特にＣＬＭＦの40kDa サブユニットに
対して特異的であった。個々の抗体がＣＬＭＦのその細
胞レセプターへの結合を阻害する能力を評価するため
に、ＣＬＭＦレセプター結合アッセイが開発されてい
る。このアッセイは、 ¹²⁵Ｉ−標識ＣＬＭＦのＰＨＡ活
性化ＰＢＬ芽球細胞に対する結合を各抗体の存在下およ
び非存在下で測定する。調べた20抗体のうち、12抗体が
¹²⁵Ｉ−標識ＣＬＭＦの芽球細胞への結合を60％以上阻
害することが判明した。二つの阻害抗体、すなわち７Ｂ
２および４Ａ１はＣＬＭＦ生物活性を中和するが、阻害
作用のない一抗体すなわち８Ｅ３はＣＬＭＦ生物活性を
中和しない。これらのデータから、 ¹²⁵Ｉ−標識ＣＬＭ
Ｆのその細胞レセプターへの結合を阻止する抗体は、Ｔ
−細胞増殖アッセイおよびＬＡＫ細胞誘導アッセイによ
り評価してＣＬＭＦ生物活性を中和するであろうことが
確認される。ＣＬＭＦの40kDa サブユニットに特異的な
抗体がＣＬＭＦ生物活性を中和しうることは、40kDa サ
ブユニット上の決定基がＣＬＭＦ細胞レセプターへの結
合に必要であることを示している。

【００１１】本発明のモノクローナル抗−ＣＬＭＦ抗体
は、天然型および組換えヒトＣＬＭＦのイムノアフィニ
ティ精製、ヒトＣＬＭＦイノムアッセイの開発、ＣＬＭ
Ｆの40kDa サブユニットの活性部位の同定のための強力
な分析、診断および治療上の試薬を提供し、そして移植
におけるような細胞障害性Ｔ細胞の選択的な免疫抑制を
必要とする患者の治療的処置に使用できる。ヒトＣＬＭ
Ｆ上の異なるエピトープを認識するモノクローナル抗体
を感度の高い二部位イムノアッセイに試薬として用いて
生物学的流体、細胞培養上清およびヒト細胞抽出物中の
ＣＬＭＦレベルを測定できる。

【００１２】従って、本発明はまた多数の用途を有する
ＣＬＭＦに対するモノクローナル抗体にも関する。この
用途は以下を包含するがそれに限定されない： １. 天然型および組換えヒトＣＬＭＦ精製のためのアフ
ィニティー試薬としてのモノクローナル抗体の利用； ２. 生物学的流体、細胞培養上清、細胞抽出物中、およ
びヒト細胞の原形質膜上の天然型および組換えＣＬＭＦ
を測定するためのエンザイムイムノアッセイおよびラジ
オイムノアッセイを構成するための試薬として、および
ドラッグスクリーニングアッセイのための試薬として
の、モノクローナル抗体の利用； ３. 生物学的な流体、細胞培養上清およびヒト細胞抽出
物中のＣＬＭＦ測定のための高感度の二部位イムノアッ
セイを構築するための試薬としてのモノクローナル抗体
の利用； ４. 35kDa サブユニットとの結合に関与し、ＣＬＭＦ細
胞レセプターとの結合に関与する40kDa サブユニットの
決定基を同定するための試薬としてのモノクローナル抗
体の利用； ５. 移植におけるような、細胞障害性Ｔ細胞の増殖およ
び活性化を選択的に阻止するための治療薬としての、阻
害性モノクローナル抗体の無傷のIgG 分子、Fabフラグ
メントまたは人体に適合させたIgG分子の利用。

【００１３】以下に図面について説明する。図１は培養
ＮＣ37リンパ芽球細胞から得られた上清溶液をNu-Gel P
-SP カラムにかけ、ＴＧＦ活性を含有するタンパク質フ
ラクションが塩グラジエントで溶離されることを示すプ
ロットである。図２は、図１に示される分離により得ら
れたＴＧＦ活性含有物質がブルー−Ｂ−アガロース (Bl
ue-B-Agarose) カラムを通って塩グラジエント勾配で溶
離されるプロットである。

【００１４】図３は、図２に示される分離から得られた
ＴＧＦ活性含有物質がモノ (Mono)Ｑカラムを通ってNaC
lグラジエントで溶離されるプロットである。図４は、
図３に図示した工程から得られたフラクション30から45
までと、48および50のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動 (ＳＤＳ−ＰＡＧＥ) 分析を示す。左側の数
字、すなわち44および68は、レーンＳでの標準タンパク
質の見かけの分子量、44および68kDaを指す。

【００１５】図５は、図３で示される Mono Q クロマト
グラフィー分離 (逆相ＨＰＬＣ) から得られたフラクシ
ョン38を Vydacジフェニル (Diphenyl) カラムに通した
溶離プロフィールを示す。図６は、図５に示される分離
工程から回収されたタンパク質フラクション85−90のタ
ンパク質純度のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。

【００１６】図７は、逆相ＨＰＬＣ分離から得られたフ
ラクション87および88を非還元 (レーンＡ；β−メルカ
プトエタノールなし) および還元 (レーンＢ；β−メル
カプトエタノール存在下) 条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥ分
析した結果を示し、75,000分子量のＣＬＭＦが40kDa お
よび35kDa の二つのサブユニットに分離されることを示
す。この図に示されるゲルの残りのレーンは、44および
68kDa マーカータンパク質からなる標準タンパク質を含
有する。

【００１７】図８はＮＣ37細胞からの上清溶液から得ら
れたタンパク質を Nu-Gel P-SPカラムにかけ、塩グラジ
エントで溶離した溶離パターンを示す。図９は、図８に
示されるNu-Gel P-SP カラム溶離により得られた活性フ
ラクションのブルー−Ｂ−アガロースカラム塩グラジエ
ント溶離プロフィールである。図10は、図９に示される
溶離により得られた活性フラクションのモノＱカラム塩
グラジエント溶離プロフィールである。

【００１８】図11は、図10に示されるモノＱクロマトグ
ラフィーから得られた活性フラクション39および40の、
Vydac ジフェニルカラムを通した溶離パターンである。
図12は、図11に示される分離工程から得られた活性フラ
ションの還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。

【００１９】図13は、ＣＬＭＦサイトカインの35kDa サ
ブユニットからの40kDa サブユニットの分離を表す模式
図である。図14は、ＣＬＭＦサイトカインの40kDa サブ
ユニットのアミノ酸組成の決定、Ｎ−末端配列決定、タ
ンパク分解的消化および完全な配列決定を示す模式図で
ある。

【００２０】図15は、ＣＬＭＦサイトカインの消化され
た40kDa サブユニットのトリプシン処理ペプチドの分離
を示す。図16は、スタフィロコッカス・アウレウス (St
aphylococcus aureus)Ｖ８プロテアーゼ消化を受けた40
kDa サブユニットＣＬＭＦのタンパク分解ペプチドの分
離を示す。

【００２１】図17は、ＣＬＭＦの40kDa サブユニットタ
ンパク分解ペプチドの分析から得られたタンパク質構造
に関する情報を要約したチャートである。以下のような
略号および記号が使用される： Ｎ−ｔ − 無傷のタンパク質のＮ−末端配列決定 Ｔｒ − フラクション番号を付したマップHP2383か
らのトリプシン処理ペプチド Ｖ８ − フラクション番号を付したマップHP2412か
らのＶ８プロテアーゼペプチド ∧ − ありそうなグリコシル化部位を示す；四角
で囲った部分は可能性のある部位を示す。

【００２２】図18は、図３に示される Mono Q ＦＰＬＣ
溶離プロフィールから得られたフラクション39のＳＤＳ
−ＰＡＧＥ分析を示す。レーンＡ：標準タンパク質、β
−メルカプトエタノールなし；レーンＢ：フラクション
39、β−メルカプトエタノールなし；レーンＣ：フラク
ション39、β−メルカプトエタノールあり；レーンＤ：
標準タンパク質、β−メルカプトエタノールあり。

【００２３】図19は、逆相ＨＰＬＣによる35kDa サブユ
ニットの精製に関するもので、５％β−メルカプトエタ
ノール中で還元された Mono Q クロマトグラフィーのフ
ラクション39を Vydac C-18 カラムに通して溶離したパ
ターンを示す。図20は、図19に示される Vydac C-18 カ
ラム溶離プロフィールから得られたフルオレサミン陽性
フラクションの、非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲ
ル分析を示す。Ｓ：＝標準タンパク質；Ｆ：＝フロース
ルー；番号はフラクション番号を指す。

【００２４】図21は、 Mono Q クロマトグラフィーのフ
ラクション36および37のトリプシン消化物を YMC ODSカ
ラムに通した溶離パターンを示す。図22は、染色したＰ
ＶＤＦ膜を示し、不鮮明なバンドは、それぞれ約29, 2
5,14, 12, および９kDa の領域を切り出す前 (図22Ｂ)
および後 (図22Ａ) のCNBr分解ＣＬＭＦである。これら
の領域は以下の配列を有するCNBrフラグメントを含有す
る： I (P?)-P-K-N-L-Q-L-K-P-L-K-N-?-V-(Q?)- (40kDaタンパク質由来の新配列) II ?-Q-K-A-(R?)-Q-T-L-E-F-Y-P-?-T- (35kDaタンパク質の残基番号30から始まる新配列) III V-V-L-T-?-D-T-P-E-E-D-G-I-T- (40kDaタンパク質の残基番号24から始まる) IV V-D-A-V-(H?)-K-L-K-Y-E-?-Y-T-?-?-F-F-I- (40kDaタンパク質の残基番号190から始まる) 注：上記配列にはメチオニン残基が先行することが想定
されるかまたは知られている。

【００２５】図23は、ＣＬＭＦをCNBrで分解することに
より得られたペプチドフラグメントの逆相ＨＰＬＣ分離
を示す。図24は、アガロース樹脂に共有結合されたモノ
クローナル抗体７Ｂ２を用いるアフィニティクロマトグ
ラフィーによって精製された、純粋なＣＬＭＦおよび
「遊離の」会合していない40kDa ＣＬＭＦサブユニット
のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。レーンＡ：分子量マーカー
タンパク質；レーンＢ：出発物質；レーンＣ；フロース
ルー；レーンＤ：酸溶出物；レーンＥ：チオシアン酸カ
リウム溶出物。

【００２６】図25ａ, ｂ, ｃ, およびｄは、ヒトＣＬＭ
Ｆの40kDa サブユニットのＤＮＡ配列および推定アミノ
酸配列を示す。図26ａ, ｂ, およびｃは、ＣＬＭＦの35
kDa サブユニットの cＤＮＡ配列および推定アミノ酸配
列を示す。図27は、ＣＬＭＦで免疫したラット由来の、
および非免疫ラット (対照) 由来の血清によるＣＬＭＦ
生物活性の阻害を示す。

【００２７】図28は、 ¹²⁵Ｉ−ＣＬＭＦの、モノクロー
ナル抗体４Ａ１ (レーン１) 、４Ｄ１ (レーン２) 、８
Ｅ３ (レーン３) 、および９Ｃ８ (レーン４) による免
疫沈降反応、対照抗体 (レーン５) による免疫沈降反
応、免疫ラット血清 (レーン６および８) による免疫沈
降反応、および正常ラット血清 (レーン７および９) に
よる免疫沈降反応のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。左側
にはkDa で表した分子量を示す。

【００２８】図29は、ＣＬＭＦ生物活性 (ＴＧＦ活性)
の、モノクローナル抗−ＣＬＭＦ抗体 (ａ−ＣＬＭＦ)
による免疫低下を示す。図30は、ＣＬＭＦ生物活性 (Ｌ
ＡＫ誘導活性) の、モノクローナル抗−ＣＬＭＦ抗体
(ａ−ＣＬＭＦ) による免疫低下を示す。図31は、モノ
クローナル抗体 (mAb)７Ｂ２, ４Ａ１, ８Ｅ３, ６Ａ
３, ９Ｆ５および２Ａ３とＣＬＭＦ 75kDaヘテロダイマ
ーとの反応性、およびラットポリクローナル抗−ＣＬＭ
Ｆ抗体 (ＲＳ１) と同ヘテロダイマーとの反応性に関す
るウェスタンブロット分析を示す。ＮＲＳ：＝正常ラッ
ト血清。

【００２９】図32は、モノクローナルおよびラットポリ
クローナル抗−ＣＬＭＦ抗体のＣＬＭＦ 40kDaサブユニ
ットとの反応性に関するウェスタンブロット分析を示
す。レーン１から18までは以下のmAbsが用いられた：そ
れぞれ、４Ａ１, ４Ｄ１, ７Ｂ２, ７Ａ１, ２Ａ３, １
Ｃ１, ８Ｅ４, ８Ａ２, ８Ｅ３, １Ｂ８, ４Ａ６, ６Ａ
２, ８Ｃ４, ９Ｆ５, ６Ａ３, ９Ｃ８, ８Ａ１, および
22Ｅ７。レーン19には対照抗体を、レーン20には融合ラ
ット血清を、そしてレーン21には正常ラット血清が用い
られた。

【００３０】図33は、 ¹²⁵Ｉ−ＣＬＭＦの、ＰＨＡ−活
性化末梢血液リンパ球 (ＰＢＬ) リンパ芽球との結合を
示す。図34は、ＰＨＡ−活性化ＰＢＬ芽細胞に対する
¹²⁵Ｉ−ＣＬＭＦの結合の、ラット抗−ＣＬＭＦ血清に
よる阻害を示す。データは、血清非存在下での全特異的
結合と比較した場合の、指示濃度の血清の存在下におけ
るその細胞に対する ¹²⁵Ｉ−ＣＬＭＦ結合の量 (結合
％) で表わす。

【００３１】図35は、ＰＨＡ−活性化ＰＢＬ芽球細胞に
対する ¹²⁵Ｉ−ＣＬＭＦの結合の、モノクローナル抗体
上清による阻害を示す。データは、抗体上清非存在下で
の全特異的結合と比較した場合の、 1：1 希釈上清存在
下におけるその細胞に対する¹²⁵Ｉ−ＣＬＭＦ結合の％
阻害で表わす。図36は、ＰＨＡ−活性化ＰＢＬ芽球細胞
に対する ¹²⁵Ｉ−ＣＬＭＦの結合の、様々な濃度の精製
モノクローナル抗体による阻害を示す。データは、抗体
非存在下での全特異的結合と比較した場合の、指示濃度
の抗体存在下におけるその細胞に対する ¹²⁵Ｉ−ＣＬＭ
Ｆ結合の量 (cpm 結合％) で表わす。

【００３２】図37は、ウサギポリクローナル抗−ＣＬＭ
Ｆ抗体と75kDa ＣＬＭＦ (非還元)との反応性、および3
5kDa ＣＬＭＦサブユニット (還元) との反応性に関す
るウエスタンブロット分析を示す。35kDa ＣＬＭＦサブ
ユニットの合成ペプチドフラグメントに対する抗体を調
製した。レーン１から５まではβ−メルカプトエタノー
ルを用いなかった；レーン６から10まではβ−メルカプ
トエタノールを用いた。レーン １ １μl ＣＬＭＦ ２ ３μl ＣＬＭＦ ３ ６μl ＣＬＭＦ ４ ブランク ５ ブランク ６ ５μl 予備染色分子量標準物 ７ １μl ＣＬＭＦ ８ ３μl ＣＬＭＦ ９ ６μl ＣＬＭＦ 10 10μl 予備染色分子量標準物 本文中で述べた上記および下記のすべての刊行物は、参
照としてここにとり込まれる。

【００３３】本発明のＣＬＭＦ活性タンパク質には、均
質な天然型ＣＬＭＦタンパク質、並びに天然型ＣＬＭＦ
の生物学的に活性なフラグメントを含有するＣＬＭＦ活
性タンパク質が包含される。さらに本発明には、組換え
ＣＬＭＦタンパク質並びに融合タンパク質、すなわち天
然型ＣＬＭＦのアミノ酸配列あるいはその部分配列を他
のタンパク質由来のアミノ酸配列とともに含有するＣＬ
ＭＦタンパク質誘導体が包含される。本発明のタンパク
質は以下の実施例で説明するＴ−細胞増殖因子アッセイ
のような標準的アッセイにより測定してＣＬＭＦの生物
学的活性を有する。

【００３４】本発明のＣＬＭＦタンパク質にはまた、Ｃ
ＬＭＦのアミノ酸配列またはそのＣＬＭＦ活性フラグメ
ントに類似したアミノ酸配列を有する、天然に存在しな
いＣＬＭＦ類似タンパク質も包含さる。かかるＣＬＭＦ
類似タンパク質は、天然型ＣＬＭＦまたはそのフラグメ
ントの一またはその以上のアミノ酸が、ＣＬＭＦ活性を
失うことなく置換または欠失したタンパク質である。か
かる類似体はペプチド化学に知られた方法または組換え
ＤＮＡ技術に知られた方法 (例えば特定部位の突然変位
誘発) によって作成できる。フラグメントおよび類似体
を含む本発明のすべてのタンパク質のＣＬＭＦ生物活性
は標準的なＴ−細胞増殖因子アッセイを用いて測定でき
る。

【００３５】本発明によれば、天然型ＣＬＭＦが精製型
で得られる。ＣＬＭＦタンパク質の35kDa サブユニット
および40kDa サブユニットのアミノ酸配列を図25および
図26に示す。本発明に従って得られたこれらの配列に基
づいて、ＣＬＭＦタンパク質の生物活性類似体およびフ
ラグメントを得ることができる。これらの生物活性タン
パク質は組換えＤＮＡ技術の標準的方法を用いて生物学
的に生成させることができるしあるいはアミノ酸シンセ
サイザーで、またはよく知られた液相または固相ペプチ
ド合成法を用いたマニュアル合成によって化学的に合成
することができる。同様な方法で、類似体、フラグメン
ト、およびＣＬＭＦのアミノ酸配列を他のアミノ酸とと
もに含有するタンパク質を生産することもできる。次
に、これらタンパク質のすべてをＣＬＭＦ活性について
調べることができる。

【００３６】このように、本発明は、実質的に純粋な形
態の細胞障害性リンパ球成熟因子 (ＣＬＭＦ) 活性を有
するタンパク質 (例えばＣＬＭＦタンパク質それ自体)
、または天然型ＣＬＭＦのアミノ酸配列の少なくとも
一部を含有する、ＣＬＭＦ活性を有する前記タンパク質
誘導体に関する。本発明はまたＣＬＭＦをコードするク
ローニングされた遺伝子、および上記で定義されたタン
パク質をコードし、ＣＬＭＦをコードする cＤＮＡに相
当する配列を含有する、単離されたポリヌクレオチド、
ＣＬＭＦタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含
有する組換えベクター、該組換えベクターで形質転換さ
れた微生物、上記タンパク質に対する抗体、並びに上記
タンパク質、ベクターおよび抗体を調製する方法に関す
る。さらに本発明は上記ＣＬＭＦタンパク質を用いるＬ
ＡＫ細胞、Ｔ−細胞またはナチュラルキラー細胞の刺激
方法にも関する。

【００３７】ここで用いられる「ＣＬＭＦをコードする
cＤＮＡに相当する配列を含有するポリヌクレオチド」
なる用語は、そのポリヌクレオチドがＣＬＭＦをコード
するcＤＮＡ内の配列と相同のまたはそれと相補的な配
列を含有することを意味する。 cＤＮＡに対する相同性
または相補性の度合は約50％またはそれ以上で、好まし
くは少なくとも約70％そしてさらに好ましくは少なくと
も約90％である。下記の方法を包含する当業上知られた
技法によって、すなわち例えば配列決定された試料と記
載された cＤＮＡとの直接比較によって、配列の推定相
同性に適する緊縮条件を用いたハイブリッド形成実験
後、一本鎖ヌクレアーゼを用いる消化によって、そして
消化されたフラグメントの分子量決定によって、ＣＬＭ
Ｆ配列と cＤＮＡ間の対応関係を決定できる。

【００３８】本発明の実施には、特に指示しない場合に
は、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡおよび免疫学
の、当業者の技術範囲内にある慣用の技法が用いられよ
う。かかる技法は文献に十分に説明されている。例えば
Maniatis, Fitsch & Sambrook, MOLECULAR CLONING ;
A LABORATORY MANUAL (1982); DNA CLONING, VOLUMESI
AND II (D. N Glover 編, 1985); OLIGONUCLEOTIDE SYN
THESIS (M. J. Gait編, 1984); NUCLEIC ACID HYBRIDIZ
ATION (B. D. Hames & S. J. Higgins 編, 1984); TRAN
SCRIPTION AND TRANSLATION (B. D. Harnes & S. J. Hi
ggins 編, 1984); ANIMAL CELL CULTURE (R. I. Freshn
ey編, 1986); IMMOBILIZED CELLS ANDENZYMES (IRL Pre
ss, 1986); B. Perbal, A PRACTICAL GUIDE TO MOLECUL
AR CLONING (1984); the series, METHODS IN ENZYMOLO
GY (Academic Press, Inc.);GENE TRANSFER VECTORS FO
R MAMMALIAN CELLS (J. H. Miller および M. P. Calos
編, 1987, Clod Spring Harbor Laboratory), Methods
in Enzymology Vol.154 および Vol.155 (それぞれ Wu
および Grossman, および Wu, 編, );IMMUNOCHEMICAL
METHODS IN CELL AND MOLECULAR BIOLOGY (Mayer およ
び Walker,編,1987, Academic Press, London), Scope
s, PROTEIN PURIFICATION: PRINCIPLESAND PRACTICE,
第２版 (1987, Springer-Verlag, N. Y.), および HAN
DBOOK OFEXPERIMENTAL IMMUNOLOGY, VOLUMES I-IV (D.
M. Weirおよび C. C. Blackwell編, 1986) 参照。

【００３９】非常に種々な宿主／ベクターの組合せを用
いて、本発明のＤＮＡ配列およびＤＮＡ分子を発現する
ことができる。たとえば、有用なベクターは、染色体
性、非染色体性および合成によるＤＮＡ配列のセグメン
トからなることができる。かかるベクターの例にはウイ
ルスベクター (例えばSV40の様々な知られた誘導体) 、
細菌性ベクター (例えば pCR1, pBR322, pMB9 およびRP
４を含むイー・コリ (E.coli) 由来のプラスミド) 、フ
ァージＤＮＡ (例えばファージλ、Ｍ13および他の繊維
状一本鎖ＤＮＡファージの種々の誘導体) 、ならびに酵
母に於て有用なベクター (例えば２μプラスミド) 、真
核細胞に於て有用なベクターがあり、より好ましくは動
物細胞に於て有用なベクター (例えばSV40、アデノウイ
ルスおよび／またはレトロウイルス由来のＤＮＡ配列を
含有するベクター) がある。また有用ベクターは例えば
修飾によりファージＤＮＡを含有するプラスミドまたは
それらの他の誘導体のように、プラスミドとファージＤ
ＮＡとの組合せから誘導することもできる。

【００４０】組換えＣＬＭＦタンパク質の調製に使用で
きる発現ベクターは、クローン化ＣＬＭＦ ＤＮＡ配列
の発現を制御および調節するためにベクター内に挿入さ
れた、ＣＬＭＦ ＤＮＡ配列に機能的に連結し少なくと
も一種の発現制御配列を含有することを特徴とする。有
用な発現制御配列の例としては、 lac系、 trp系、 tac
系、 trc系、λファージの主要オペレーターおよびプロ
モーター領域、fdコートタンパク質の制御領域、酵母の
解糖プロモーター (例えば、３−ホスホグリセリン酸キ
ナーゼのプロモーター) 、酵母の酸ホスファターゼのプ
ロモーター (例えば、Pho5) 、酵母α−接合因子プロモ
ーター、およびポリオーマウイルス、アデノウイルス、
レトロウイルスおよびシミアンウイルス由来のプロモー
ター (例えば、SV40の初期および後期プロモーター) 、
および原核または真核細胞およびそれらのウイルスの遺
伝子の発現を制御することが知られている他の配列、な
らびに上記プロモーター／オペレーター配列の組合せ、
がある。

【００４１】かかる有用な発現ベクターの中で、動物お
よびヒト細胞のような真核生物宿主内でクローン化ＣＬ
ＭＦ−関連ＤＮＡ配列の発現を可能にするベクターが知
られている［例えば P. J. Southern および P. Berg,
J. Mol. Appl. Genet. 1: 327-41 (1982); S. Subraman
i ら, Mol. Cell. Biol. 1: 854-64 (1981); R. J. Kau
fmann および P. A. Sharp. Mol. Cell. Biol. 159: 60
1-64 (1982); S. I. Scahillら, "Expression and Char
acterization of The Product of A Human Immune Inte
rferon DNA Gene in Chinese Hamster Ovary Cells", P
roc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80: 4654-59 (1983);
G. Urlaubおよび L. A. Chasin, Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA. 77: 4216-20 (1989) ］。

【００４２】さらに、各々の特異的発現ベクターの内部
で、本発明のＣＬＭＦ−関連ＤＮＡ配列を挿入するため
に種々の部位を選ぶことができる。これらの部位は通常
それを切断する制限エンドヌクレアーゼによって示され
る。それらは当業者によってよく認識されている。本発
明で有用な発現ベクターは、選ばれたＤＮＡフラグメン
トを挿入するための制限エンドヌクレアーゼ部位を有す
る必要がないことは、当然理解されるべきである。その
代わりに、別の方法によってベクターをフラグメントに
結合させることができる。選択されたＤＮＡフラグメン
トを挿入するためおよびそのＤＮＡフラグメントを発現
制御配列に機能的に結合させるために発現ベクター内で
選ばれる部位は、特定の制限酵素の作用を受ける部位の
数、ベクター配列に関する開始および終止コドンの位
置、および組換えベクターで形質転換された宿主を選択
するための望ましい方法のような種々のファクターによ
って決定される。ベクターおよびＤＮＡ配列挿入部位の
選択は、これらのファクターのバランスによって決ま
り、すべての選択が特定の場合に同じように有効である
わけではない。

【００４３】ＣＬＭＦ関連ＤＮＡ配列の発現に用いられ
る宿主細胞は種々の知られた宿主から選択できる。かか
る宿主の例としては原核または真核細胞がある。かかる
宿主の多くが、the American Type Culture Collection
(ATCC) またはthe DeutscheSammlung fur Mikroorgani
smen(ＤＳＭ) のような種々の寄託機関から入手可能で
ある。原核細胞宿主の例には、E.コリ、バチルス・スブ
チリス（B. subtilis)およびその他のような細菌菌株あ
る。好ましい宿主はSV40で形質転換されたアフリカミド
リザル腎細胞系統ＣＯＳような哺乳動物細胞である。

【００４４】必ずしもすべての宿主／発現ベクターの組
合せ物が所定のＤＮＡ配列の発現に等しく有効に機能す
るわけではない。しかしながら当業者は、本発明の範囲
から逸脱することなしに本文に記載の原則を十分考慮の
上で、宿主／発現ベクターの組合せについて個々に選択
できる。例えば、その選択は多数のファクターのバラン
スに基づいてなされねばならない。これらには例えば、
宿主とベクターの適合性、宿主細胞酵素によるタンパク
分解に対するタンパク質の感受性、精製過程で除去する
ことが困難な、宿主細胞により発現されるタンパク質の
混入可能性、ＤＮＡ配列によってコードされるタンパク
質の宿主に対する毒性、所望のタンパク質の回収の容易
さ、ＤＮＡ配列およびそれに機能的に結合された発現制
御配列の発現特性、生物学的安全性、コスト、および所
望のタンパク質の折りたたみ構造、形態、またはその他
の任意の必要な発現後修飾が包含される。

【００４５】ＣＬＭＦ ＤＮＡを含有する発現ベクター
を有する宿主生物は通常宿主生物の増殖に最適の条件下
で増殖される。対数増殖期の終了に向かって単位時間当
りの細胞数増加が低下したところで、ＣＬＭＦタンパク
質の発現が誘導される、すなわちそのタンパク質をコー
ドするＤＮＡが転写され、そして転写されたｍＲＮＡが
翻訳される。増殖培地に誘導物質または抑制解除物質を
添加することによって、あるいは物理的パラメーターを
変化させること、例えば温度変化によって誘導を行うこ
とができる。

【００４６】宿主生物内で生成されたＣＬＭＦタンパク
質は特別の輸送メカニズムによって細胞から分泌される
ことが可能であり、または細胞を破壊することによって
これを単離することができる。機械的手段［Charm ら、
Meth. Enzymol. 22:476-556(1971)］、酵素処理（たと
えばリゾチーム処理）または化学的手段（たとえば界面
活性剤処理、尿素またはグアニジン・HCl 処理、な
ど）、またはそれらの組合せによって細胞を破壊でき
る。

【００４７】真核生物では、細胞から分泌されるポリペ
プチドは前駆体分子の形で合成される。成熟ポリペプチ
ドは、いわゆるシグナルペプチドを除去することにより
生じる。原核宿主生物は真核生物性のシグナルペプチド
を前駆体分子から切断できないので、真核生物性ポリペ
プチドは原核宿主生物では直接それらの成熟形として発
現される必要がある。翻訳開始シグナルＡＵＧは、ＤＮ
ＡレベルではＡＴＧコドンに対応するが、これによって
あらゆるポリペプチドが原核宿主生物においてＮ−末端
メチオニン残基をともない合成される。ある種の場合に
は、使用する発現系によって、そしておそらくは発現さ
れるポリペプチドによっては、このＮ−末端メチオニン
残基は切り離される。

【００４８】本発明のＤＮＡ配列で形質転換された原核
生物および真核生物宿主の発酵によって生産されるＣＬ
ＭＦを次に知られた方法によって実質的に均質となるま
で精製することができる。この方法には例えば、異なる
速度での遠心分離、硫酸アンモニウム沈澱、透析（常圧
または減圧下）、調製用等電点電気泳動、調製用ゲル電
気泳動、または種々のクロマトグラフィー法例えば、ゲ
ル濾過、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、
イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィ
ーおよびアフィニティークロマトグラフィー（例えば S
epharose BlueCL-6B またはＣＬＭＦに対して生成され
たキャリアー結合モノクローナル抗体）がある。

【００４９】本発明の精製ＣＬＭＦタンパク質はＬＡＫ
細胞およびＴ細胞アクチベーターおよび抗腫瘍組成物の
調製に、またＬＡＫ細胞、Ｔ−細胞またはナチュラルキ
ラー細胞を刺激する方法において使用できる。本発明の
ＣＬＭＦを分析し、ＣＬＭＦ活性に関する活性部位を決
定することもできる。この分析から得られた情報を用い
て、ＣＬＭＦ活性を有するフラグメントまたはペプチド
（合成ペプチドを含む）を予測し生成させることができ
る。かかる活性部位を決定するための既知の技法には、
Ｘ線結晶学、核磁気共鳴、円偏光二色性、ＵＶ分光法、
および特定部位の突然変異誘発がある。したがって、こ
のようにして得られたフラグメントはＴ細胞またはＬＡ
Ｋ細胞を刺激する方法において用いることができる。

【００５０】本発明により調製されたＣＬＭＦタンパク
質または誘導体、あるいはＣＬＭＦタンパク質または誘
導体を含有する医薬組成物は上記の臨床上の使用のため
に温血哺乳動物に投与することができる。投与は、抗腫
瘍活性を示す薬剤の任意の慣用の投与様式、例えば静脈
内、皮下または筋肉内のいずれかによる病変内または非
経口投与であることができる。明らかに、必要とされる
用量は処置される個々の状態、症状の重さ、治療の継続
期間および投与方法によって変化しよう。医薬用として
適した剤形は、慣用法での使用に先立って再構成される
滅菌濾過し凍結乾燥したタンパク質から得ることができ
る。また、本発明によるＣＬＭＦタンパク質を適合性の
ある製剤上許可できる担体物質（例えば緩衝剤、安定化
剤、制菌剤、および医薬品として非経口剤形に慣用に用
いられる他の賦形剤および添加物）と混合することによ
って、該ＣＬＭＦタンパク質を含有する医薬組成物を調
製することも当業者の技術範囲内にある。本発明はかか
る医薬組成物にも関する。

【００５１】好ましい投与形態は意図される投与様式お
よび治療上の適用の如何によって異なる。本発明のＣＬ
ＭＦタンパク質またはペプチド誘導体を含有する医薬組
成物にはまた好ましくは慣用の製剤上受容されうる担体
が包含されようしそして他の薬剤（例えば、インターロ
イキン−２）、担体、アジュバント、賦形剤など、例え
ばヒト血清アルブミンまたは血漿製剤が包含されうる。
本発明の組成物は単位量の形態でありそして通常一日に
一回ないしそれ以上これを投与するのが好ましい。単位
量は、ＣＬＭＦタンパク質または誘導体の有効量、およ
び所望の場合はインターロイキン−２の有効量を凍結乾
燥形態で含有する１mlバイアル中に封入されるのが好ま
しい。ＣＬＭＦタンパク質または誘導体および所望の場
合はインターロイキン−２を含有するバイアルは、その
医薬組成物の正しい使用法を記載した使用説明書ととも
に容器に包装するのが好ましい。また、本発明は好まし
くは別の単位量のインターロイキン−２と一緒、最も好
ましくは適当な使用説明書と一緒に容器に包装されたか
かる単位量にも関する。さらに、本発明はかかる単位量
の調製方法にも関する。

【００５２】ここに説明した本発明がよりよく理解され
るよう、以下に実施例を示す。これらの実施例は説明目
的のためのみであることが理解されるべきであり、そし
て本発明はそこに詳述される詳細な実施態様に限定され
るものとして解釈されるべきではない。以下に述べる特
定の製品名および供給者は、これを強制することを意味
するものではないことに注意されたい。当業者は他の供
給者から代替製品を選択しうる。

【００５３】

【実施例】細胞障害性リンパ球成熟因子（ＣＬＭＦ）の精製および
特性決定 ＣＬＭＦを含有する上清液の生産 ヒトＮＣ−37Ｂリンパ芽球細胞 (ATCC CCL 214, Americ
an Type Culture Collection, Rockville, MD)を、ＣＬ
ＭＦの生産に使用した。この細胞を、５％熱不活化（56
℃、30分）ウシ胎児血清、２mM L−グルタミン、 100単
位／mlペニシリンおよび 100μg/mlストレプトマイシン
を補添したRPMI1640培地中で、連続継代によって維持し
た（細胞培養培地はすべて、GIBCO Laboratories, Gran
d Island, NYから入手した）。

【００５４】生産性のより高いＮＣ−37細胞の亜系は液
体微量培養での限界希釈クローニングによって誘導し
た。３個のCostar3596マイクロプレート（Costar Co.,
Cambridge, MA)の各ウェルに、ＮＣ−37細胞を５細胞／
ml含有する細胞懸濁液 100μlを入れた。クローニング
に用いた培地は新鮮な継代培地、および親ＮＣ−37細胞
の貯蔵培養物由来の濾過した馴化培地の 1：1 混合物で
ある。培養開始の１週間および２週間後、微量培養物の
各々に新鮮培地および馴化培地の 1：1 混合物50μl を
供給した。培養開始後３週間および４週間の間に、ＮＣ
−37細胞クローンを含有するウェルの内容物を収集して
もっと大量の培養に移した。

【００５５】所定の亜系の細胞数が1.４×10⁶ を越えた
ところで、百万個の細胞を刺激して、３ng／mlホルボー
ル12−ミリステート13−アセテート（ＰＭＡ)(Sigma Ch
emical Co., St. Louis, MO)および 100ng／mlカルシウ
ムイオノフォアＡ23187(Sigma)を含有する１ml培養物中
にＣＬＭＦを生産させた。二日後に培養物から上清を集
め、例えばSPECTROPOR^R ♯１チューブ類 (Fisher Scien
tific)を用いて約50容量のダルベッコリン酸緩衝食塩水
(Gibco) に対して一晩、緩衝液を一回交換して透析した
後、50μg/mlゲンタマイシンを有する50容量の RPMI 16
40培地（ともにGibco 製）で４時間透析し、そしてＴ細
胞増殖因子アッセイ（下記参照）によってＣＬＭＦを調
べた。親ＮＣ−37細胞系により生産される力価の４倍以
上の力価でＣＬＭＦを常に生産する三つの亜系、ＮＣ-3
7.89、ＮＣ-37.98、およびＮＣ−37.102が同定された。
これらの３亜系からの細胞はＣＬＭＦを同様の力価（≧
800 単位／ml）で生産するので、これら３亜系から得ら
れた培養上清をプールしてＣＬＭＦ精製のための出発物
質として用いた。

【００５６】ＣＬＭＦの大量生産は約38rpm に設定した
回転装置(Wheaton Cell ProductionRoller Apparatus M
odel II, Wheaton Instruments, Millville, NJ) 上で
回転瓶培養で行った。１％ヌトリドーマ (Nutridoma)-S
P (Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis,
IN)、２mM L−グルタミン、 100単位／mlペニシリン、
100μg/mlストレプトマイシン、10ng/ml ＰＭＡおよび
20−25ng／mlカルシウムイオノフォアＡ23187 を添加し
た RPMI 1640培地中に１−1.５×10⁶ ＮＣ-37.89、ＮＣ
-37.98またはＮＣ-37.102 細胞／mlを含有する細胞懸濁
液を調製した。この細胞懸濁液の250 から350ml 部分
を、すでに５％ CO₂ 、95％空気の混合物で満たされたF
alcon 3027 組織培養回転瓶 (Becton Dickinson, Linco
ln Park,NL) に加えた。つぎに、この回転瓶にしっかり
と蓋をしそして３日間連続回転させながら37℃でインキ
ュベートした。この期間の終了時に培養上清を集めた。
タンパク質の分解を遅らせるために、ＥＤＴＡおよびフ
ェニルメチルスルホニルフルオライド（ともに Boehrin
ger Mannheim製）を最終濃度がそれぞれ１mMおよび0.１
mMとなるようにこの培養上清に加えた。この上清を４℃
で保存した。

【００５７】リンフォカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細
胞誘導（ＬＣＩ）アッセイ 培養上清およびクロマトグラフィーフラクションをそれ
らがrIL-２と相乗的に作用して細胞溶解性ＬＡＫ細胞の
生成を誘導する能力に関し以下のように調べた。ヒト末
梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）を下記方法で単離した。十
分に無菌の防腐剤の入っていないヘパリン(Sigma) を最
終濃度約５単位／mlとなるように含有する注射器内に正
常な自発提供者から血液を採った。その血液を、カルシ
ウムもマグネシウムも含まないハンクス平衡塩類溶液
（ＨＢＳＳ)(GIBCO)で 1：1 希釈した。次に、この希釈
した血液を50ml Falcon 2098遠心管内の15mlフィコール
／ジアトリゾエート・ナトリウム(Lymphocyte Separati
on Medium, Organon TeknikaCorp., Durham, NC) 上に
積層させた。この遠心管を 500×ｇで室温で30分遠心し
た。遠心後、フィコール／ジアトリゾエート・ナトリウ
ム層上に浮遊する細胞を集め、カルシムもマグネシウム
も含まない２倍容以上のＨＢＳＳと混合することにより
希釈した。次に、得られた細胞懸濁液をFalcon 2098 遠
心管内の、１％ヒトＡＢ血清(Irvine Scientific, Sant
a Ana, CA)を補添した RPMI 1640培地中における20％ス
クロース (Fisher) の15ml上に積層した。この遠心管を
500×ｇで室温で10分間遠心し、上清液を捨てた。細胞
ペレットを、５mlのカルシウムおよびマグネシウムを含
まないＨＢＳＳ中に再懸濁し、遠心分離により再びペレ
ットとし、そして最終的に適当な培地に再懸濁した。ロ
イシンエステルに代えてグルタミン酸エステルに置き換
える以外は、Ｌ−ロイシンメチルエステルによる補助細
胞除去に関するThieleら、J. Immunol. 131:2282-2290
(1983) の記載と同じ条件を用いて、５mM L−グルタミ
ン酸ジメチルエステル(Sigma) で処理することにより補
助細胞をＰＢＭＣから除去した。

【００５８】補助細胞を欠失ＰＢＭＣをWongら、Cell I
mmunol. 111:39-54(1988) 記載のようにして不連続パー
コール密度グラジエント（Pharmacia, Piscataway, NJ)
での遠心によってさらに分画した。38, 41, 45および58
％パーコール層から回収された単核細胞をプールし、ア
ッセイに於けるＬＡＫ細胞前駆体の供給源として用い
た。パーコールグラジエントから回収された細胞を洗浄
し、そして0.1mM 非必須アミノ酸、60μg/mlアルギニン
HCl 、 10mM ＨＥＰＥＳ緩衝液、２mM L−グルタミン、
100単位／mlペニシリン、 100μg/mlストレプトマイシ
ン（すべてGIBCOから入手可能）、５×10^-5M ２−メル
カプトエタノール(Fisher Scientific, Fair Lawn, N
J)、１mg／mlデキストロース(Fisher)、および５％ヒト
ＡＢ血清 (Irvine Scientific, Santa Ana, CA) を添加
した、 RPMI 1640およびダルベッコ改変イーグル培地の
1：1 混合物からなる組織培養培地（ＴＣＭ) に懸濁し
た。これら細胞を24−ウェル組織培養プレート(Costar,
Cambridge, MA) 中で、１ml培養物(7.5×10⁵ 細胞／培
養）としてインキュベートした。この培養物には、内因
性サイトカイン生産を最小限にするために10^-4M コハク
酸ヒドロコルチゾンナトリウム（Sigma)を添加した。ま
た一部の培養物には最終濃度５単位／mlでヒトrIL-２(H
offmann-La Roche, Inc., Nutley, NJ）、および／また
はＣＬＭＦ活性についてアッセイ予定の上清を加えた。
すべての培養物を３−４日間、37℃で、５％CO₂ 、95％
空気の加湿でインキュベートした。

【００５９】このインキュベーションの終了時に、各培
養物の内容物を集め、細胞を遠心によりペレットとし、
そして0.５mlの新鮮なＴＣＭに再懸濁した。この細胞懸
濁液の１／10mlを、⁵¹Cr−標識K562またはRaji細胞（二
つの細胞系ともにATCCから入手できる）の0.1ml と混合
しそして５時間の⁵¹Cr放出アッセイで、その溶解活性を
調べた。標的細胞を⁵¹Crで標識し、細胞溶解アッセイを
行うための方法は、Gatelyら、［JNCI 69:1245-1254(19
82) ］に記載されている。特異的⁵¹Cr放出パーセントは
［（ｅ−ｃ）／(100−ｃ）］×100 として算出された。
ここでｅはリンパ球とインキュベートした標的細胞から
の⁵¹Cr放出のパーセンテージでありそして、ｃは単独で
インキュベートされた標的細胞から自然発生的に放出さ
れた⁵¹Crのパーセンテージである。放出可能な全⁵¹Cr
は、２％ドデシル硫酸ナトリウムで標的細胞を溶解する
ことにより測定された。Gatelyら、JNCI 69:1245-1254
(1982) 参照。すべてのリンパ球集団を４重で溶解活性
についてアッセイした。

【００６０】ＬＡＫ細胞誘導ミクロアッセイ：ヒトＬＡ
Ｋ細胞の誘導に於けるrIL-２およびＣＬＭＦ−含有溶液
の間の相乗作用を測定するためのミクロアッセイは、前
記のＬＡＫ細胞誘導アッセイと同様であるが、以下のよ
うな改変を加えた。前記のようにして予め補助細胞を除
去しパーコールグラジエント遠心によって分画されたヒ
ト末梢血液単核細胞を Costar 3596マイクロプレートの
ウェルに加えた（５×10⁴ 細胞／ウェル）。一部のウェ
ルにはさらにrIL-２（最終濃度５単位／ml）および／ま
たは精製ＣＬＭＦまたは免疫低下ＣＬＭＦ−含有溶液を
加えた。すべての培養物は10^-4M コハク酸ヒドロコルチ
ゾンナトリウム(Sigma) を含有しておりそして５％ヒト
ＡＢ血清を含有するＴＣＭの添加により全量を0.１mlと
した。培養物を３日間37℃でインキュベートし、次に0.
1ml の⁵¹Cr−標識K562細胞（５％ヒトＡＢ血清を添加し
たＴＣＭ中、５×10⁴ 細胞／ml）を各ウェルに加えた。
次に培養物を37℃で一夜インキュベートした。これに続
き培養物を 500×ｇで５分間遠心し、Skatron 上清収集
システム(Skatron, Sterling, VA) を用いて上清溶液を
集めた。各上清溶液中に放出された⁵¹Crの量をガンマカ
ウンター(Packard,Downer's Grove, IL) で計測し、そ
して特異的⁵¹Cr放出％を前記のようにして算出した。す
べての試料を４連でアッセイした。

【００６１】細胞溶解性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）生成アッ
セイ ヒトＣＴＬの溶解活性を生じさせ、測定するために用い
られる方法は、GatelyらによりJ. Immunol. 136: 1274-
1282(1986)に、およびWongらによりCell. Immunol. 11
1:39-54(1988)に詳細に記載されている。前記のように
してヒト末梢血液単核細胞を正常な自発提供者の血液か
ら単離し、Ｌ−グルタミン酸ジメチルエステルで処理す
ることにより補助細胞を除去しそしてパーコールグラジ
エント遠心によって分画した。45％と58％パーコール層
の間の界面から回収した高密度リンパ球を混合リンパ球
−腫瘍培養物（ＭＬＴＣ）に於ける応答リンパ球として
使用した。パーコールグラジエントで得られた高密度リ
ンパ球 (7.５×10⁵ ／培養物）を１×10⁵ ＵＶ照射メラ
ノーマ細胞例えばHT144 (ATCC より入手可）と一緒に、
または５×10⁴ ガンマ線照射メラノーマ細胞例えばHT14
4 と一緒に５％ヒトＡＢ血清（1.２ml／培養物）添加Ｔ
ＣＭ中でインキュベートすることにより24ウェル組織培
養プレート (Costar♯3424) 内のＭＬＴＣ中にＣＴＬを
生成させた。ＵＶ照射には、HT144 細胞を１％ヒトＡＢ
血清を含有する、フェノールレッドを含まないハンクス
平衡塩類溶液(GIBCO) に１−1.５×10⁶ 細胞／mlの密度
で懸濁した。細胞懸濁液の１mlを35×10mmプラスチック
組織培養皿 (Falcon♯3001) に加え、次に、細胞を254n
m ＵＶ光 (UVG-54型 MINERALIGHT灯、Ultra-violet Pro
ducts, Inc., San Gabriel, CA) を用いて照射した(960
μW ／cm² 、５分間）。ガンマ線照射には、 HT144細胞
を１−５×10⁶ 細胞／mlの密度で、５％ヒトＡＢ血清添
加ＴＣＭに懸濁し、そしてセシウム線源照射装置(143
型、J. L. Shepherd and Associates, San Fernando, C
A)を用いて照射した（10,000ラド) 。ＵＶ−またはガン
マ線−照射HT144 を遠心し、そして５％ヒトＡＢ血清を
含有するＴＣＭ中にＭＬＴＣへの添加に望ましい細胞密
度で再懸濁した。リンパ球およびメラノーマ細胞に加え
て、一部のＭＬＴＣにはヒトrIL-２および／または精製
ヒトＣＬＭＦを指示された濃度で加えた。内因性サイト
カイン生産を抑制し［S. Gillisら、J. Immunol. 123:1
624-1631 (1979)］そして培養物中の非特異的ＬＡＫ細
胞の生成を減少させるために［L. M. MuulおよびM. K.
Gately, J. Immunol. 132:1202-1207 (1984)］、コハク
酸ヒドロコルチゾンナトリウム(Sigma) を最終濃度10^-4
M (ＵＶ照射メラノーマ細胞を含有する培養物）または
10^-5M （ガンマ線照射メラノーマ細胞を含有する培養
物）となるようＭＬＴＣに添加した。培養物を37℃で、
空気中５％CO₂ の加湿環境中６日間インキュベートし
た。この期間の最後に、同型培養物から得られたリンパ
球をプールし、遠心し、５％ヒトＡＢ血清を含有するＴ
ＣＭ１、２mlに再懸濁し、そして一夜の⁵¹Cr放出アッセ
イでHT144メラノーマ細胞を溶解させる能力について調
べた。特異性の対照としてK562赤白血病細胞（ATCCから
入手しうる）を用いた。

【００６２】Gatelyら［JNCI 69:1245-1254 (1982)］記
載のようにしてメラノーマ細胞およびK562細胞を⁵¹Cr−
クロム酸ナトリウムで標識した。同様に、神経膠腫標的
細胞の溶解を定量するための、Gatelyらの記載（上記）
と同じ方法で、⁵¹Cr標識メラノーマ細胞のリンパ球を介
した溶解を測定した。⁵¹Cr標識K562細胞の溶解をアッセ
イするには、Costar 3696 「ハーフエリア」マイクロテ
ストプレートのウェル内で、0.１mlのリンパ球懸濁液を
25μl の⁵¹Cr標識K562（５％ヒトＡＢ血清含有ＴＣＭ
中、２×10⁵ 細胞／ml）と混合した。37℃で一夜インキ
ュベート後、プレートを1400×ｇで５分間遠心し、培養
培地の50μl を各ウェルから吸引した。各試料中の⁵¹Cr
量をガンマカウンター(Packard) で測定し、そして特異
的⁵¹Cr放出％を前記のようにして算出した。すべてのア
ッセイを４連で行い、表（下記参照）中の値は同型試料
の平均値±1 S.E.M.を表す。

【００６３】Ｔ細胞増殖因子（ＴＧＦ）アッセイ 培養上清およびクロマトグラフィーフラクションがＰＨ
Ａ−活性化ヒトＴリンパ芽球の増強を刺激する能力を以
下のように測定した。ＬＣＩアッセイについて前記した
ようにして、不連続フィコールおよびスクロースグラジ
エントでの遠心によって、ヒトＰＢＭＣを単離した。Ｐ
ＢＭＣ（５×10⁵ 細胞／ml）を0.１％フィトヘマグルチ
ニン−Ｐ（ＰＨＡ−Ｐ)(Difco Laboratories, Detroit,
MI)含有ＴＣＭ中37℃で培養した。３日後、その培養物
を新鮮なTCM で 1：1 に割り、ヒトrIL-２を各培養物に
最終濃度50単位／mlとなるよう加えた。つぎにこの培養
物をさらに１から２日間インキュベートした時点で、細
胞を集め、洗浄しそして４×10⁵ 細胞／mlでＴＣＭ中に
再懸濁した。アッセイに於けるあらゆるありうる IL-２
誘導細胞増殖を阻止するために、この細胞懸濁液に熱不
活化ヤギ抗−ヒトrIL-２抗血清（最終希釈度： 1／200
）を加えた。この抗血清は当業者に周知の方法を用い
て調製できるしあるいはGenzyme Co., Boston, MA から
入手することができる。用いた抗血清は 1／20,000の血
清希釈度で２単位／mlのrIL-２の50％中和を引き起こす
ことが示された。

【００６４】抗−IL-2抗血清を含有する細胞懸濁液の50
μl をCostar3596マイクロプレートのウェル内で、培養
上清の連続希釈物またはクロマトグラフィーフラクショ
ンの50μl と混合した。培養物空気中５％CO₂ の加湿環
境で１日間37℃でインキュベートした後、 ³Ｈ−チミジ
ン (New England Nuclear, Boston, MA)、ＴＣＭ中10μ
Ci／ml、50μl を各ウェルに添加した。この培養物をさ
らに一夜インキュベートした。続いて培養物の内容物を
セルハーベスター (Cambridge Technology Inc., Cambr
idge, MA) を用いてグラスファイバーフィルター上に集
め、細胞ＤＮＡへの ³Ｈ−チミジンの取り込みを液体シ
ンチレーション計数によって測定した。すべての試料を
３連でアッセイした。

【００６５】ＣＬＭＦ精製に際して、クロマトグラフィ
ー溶離プロフィールを作成しそして精製された試料の活
性回収パーセントおよび比活性を算出するためには活性
の単位を定義することが必要であった。このために、Ｐ
ＨＡ−活性化ヒト、ＰＢＭＣをＮＣ−37細胞と同時培養
することにより生成されたヒトサイトカインの部分精製
標品を標準物として使用した。その標品に2000単位／ml
の自由裁量力価を割り当てた。それぞれのＴＧＦまたは
ＬＡＫ誘導アッセイにはこの標品のいくつかの希釈物を
包含させた。標準標品について得られた結果を用いて、
用量−応答曲線を作成し、この曲線から検査した希釈度
での各未知試料の活性単位／mlを挿入できた。これらの
値に希釈倍率を乗じることによって単位／mlで表された
もとの試料の活性が得られた。

【００６６】抗体中和実験には、ＴＧＦアッセイをを以
下のように改変した。ＣＬＭＦ含有培地の25μl を COS
TAR 3596マイクロプレートのウェル内で抗血清の連続希
釈物または抗体溶液の50μl と混合した。この混合物を
37℃で30分間インキュベートし、次にＰＨＡ−活性化リ
ンパ芽球(1：100 抗−rIL-２を加えたＴＣＭ中、８×10
⁵ ／ml）の懸濁液25μl を各ウェルに加えた。この培養
物を前記のようにしてさらにインキュベートし、 ³Ｈ−
チミジンでパルスし、細胞を集め、そして ³Ｈ−チミジ
ンの取り込みを分析した。

【００６７】ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞活性化アッ
セイ 単独添加時またはrIL-２と組み合わせて添加した場合の
精製ＣＬＭＦのＮＫ細胞活性化能を以下のようにして調
べた。ヒトＰＢＭＣを前記のようにして不連続フィコー
ルおよびスクロースグラジエント上の遠心によって単離
しそして10％熱不活化ウシ胎児血清、 100単位／mlペニ
シリン、 100μg/mlストレプトマイシン、および２mM L
−グルタミンを添加した RPMI 1640培地に懸濁した。こ
のＰＢＭＣを種々の濃度のrIL-２および／または精製Ｃ
ＬＭＦと１ml培養液（５×10⁶ 細胞／培養物）中37℃で
一夜インキュベートした。18−20時間後、培養液の内容
物を集め、遠心し、細胞を一夜培養に用いたと同じ培地
に再懸濁した。次に、培養されたＰＢＭＣの細胞溶解活
性を前記⁵¹Cr放出アッセイで評価した。

【００６８】細胞上清溶液の濃度 誘導ＮＣ−37細胞の数バッチから調製された全部で60リ
ッターの凍結保存粗製ヒトＣＬＭＦ上清溶液をプール
し、そして Pellicon Cassette System (30,000NMWL PT
TK00005; Millipore Corp., Bedford, MA) を用いて30
倍に濃縮した。所望容量約1.９リッターまで濃縮した
後、10N NaOHで, pH6.０に調製した10mM MESと緩衝液交
換した。この濃縮物を４℃で10分間10,000×ｇで遠心し
て沈澱を捨てた。

【００６９】NuGel P-SPカラムでのイオン交換クロマト
グラフィー 濃縮した上清溶液を10mM MES, pH6.0 で平衡化した Nu-
Gel P-SP (SeparationIndustries, Metuchen, NJ)カラ
ム（５×５cm）に毎時120ml の流速でかけた。280nm で
監視したベースライン吸光度が得られるまでカラムを洗
浄した。つぎに、吸着されたタンパク質を０から0.５M
NaCl／10mM MES, pH6.0 の500ml 塩グラジエントを用い
毎分２mlの流速で溶離した（図１）。フラクションの一
部をとってＴ細胞増殖因子（ＴＧＦ）活性についてアッ
セイした。ＴＧＦ活性を有するフラクションをプールし
そして試料の塩濃度を50分の１に低下させるために、50
容量の20mMトリス-HCl、pH7.5 で透析した(Spectra/Por
7, Fisher Scientific)。

【００７０】ブルーＢ−アガロースカラム上の色素アフ
ィニティークロマトグラフィー 透析した試料を４℃および10,000×ｇで10分間遠心し、
沈降物を棄てた。上清溶液を20mMトリス／HCl, pH7.5で
平衡化したブルーＢ−アガロース (Amicon, Danvers, M
A ) カラム (2.５×10cm) に毎時20mlの流速で注いだ。
カラムを、 280nmで監視したベースライン吸光度が得ら
れるまで、この同じ緩衝液で洗浄した。次に、吸収され
たタンパク質を毎時15mlの流速で０−0.５M NaCl／20mM
トリス／HCl, pH7.5の塩グラジエント500ml で溶離した
(図２) 。フラクションの一部分ずつをＴＧＦ活性につ
いてアッセイした。ＴＧＦ活性を含有するフラクション
をプールし、調製物の塩濃度を 100分の一に減少させる
ために 100容量の20mMトリス／HCl, pH7.5で透析 (Spec
tra/Por 7, Fisher Scientific) した。

【００７１】モノＱクロマトグラフィー上でのイオン交
換クロマトグラフィー 透析した試料を0.45μm のセルロースアセテートフィル
ター (Nalgene Co., Rochester. NY) で濾過し、そして
濾液を20mMトリス／HCl, pH7.5で平衡化したモノＱ HR
5/5 (Pharmacia LKB Biotechnology, Inc., Piscatawa
y, NJ) カラム (５×50mm) に毎時60mlの流速で注い
だ。カラムを、280nm で監視したベースライン吸光度が
得られるまでこの同じ緩衝液で洗浄した。次に、吸収さ
れたタンパク質を毎時60mlの流速で０−0.25M NaCl／20
mMトリス／HCl, pH7.5の１時間の直線状塩グラジエント
を用いて溶離した。フラクションの一部分ずつをＴＧＦ
活性についてアッセイしタンパク質純度を12％スラブゲ
ルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ［Laemmli, Nature (Londo
n) 227：680-685 (1970)］により還元なしに評価した。
ゲルはタンパク質を可視化するために銀染色［Morrisse
y, Anal, Biochem. 117:307-310 (1981)］した (図４)
。フラクション36および37は純度95％以上であり、分
子量75,000で主要バンドを示した。ＴＧＦ活性を含有す
るフラクション38−41はＳＤＳ−ＰＡＧＥによれば75KD
a のタンパク質を示し、分子量55,000および40,000で大
きな混入物がある。

【００７２】したがって、これら混入タンパク質を排除
するために前記モノＱクロマトグラフィーフラクション
38を８M 尿素で 1：1 v/v に希釈し、そして逆相ＨＰＬ
Ｃ濃縮技術を用いて Vydacジフェニルカラムにポンプで
注入した。カラムを続いて0.１％トリフルオロ酢酸５ml
で洗浄した。タンパク質の溶離は0.１％トリフルオロ酢
酸中の７時間以上にわたる０−70％アセトニトリルのグ
ラジエントで達成された (図５) 。フラクションの一部
分ずつをＴＧＦ活性についてアッセイした。ＴＧＦ活性
を含有するフラクションのタンパク質純度を10％スラブ
ゲルを用い非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価
した。このゲルを銀染色してタンパク質を可視化した
(図６) 。フラクション86−90は95％以上の純度を有
し、分子量75,000のタンパク質を示した。フラクション
87および88をプールして一部分を還元条件下 (β−メル
カプトエタノールの存在下) および非還元条件下 (β−
メルカプトエタノールの非存在下) でＳＤＳ−ＰＡＧＥ
により分析した。還元条件下においては、分子量75,000
のＣＬＭＦは40,000および35,000ダルトンの２個のサブ
ユニットに分離された (図７) 。したがって、ＣＬＭＦ
はジスルフィドにより結合した40KDa および35KDa サブ
ユニットから成る75KDa ヘテロダイマーであることが結
論づけられた。

【００７３】達成されたＣＬＭＦの全体としての精製を
第１表に示す。モノＱ精製された物質および Vydacジフ
ェニル精製物質のタンパク質含有量をアミノ酸分析に基
づいて計算した。

【００７４】

【表１】 モノＱ精製物質およびVydacジフェニル精製物質につい
てはそれぞれ8.5×10⁷単位／mgおよび5.２×10⁷ 単位／
mgの比活性が得られた。ジフェニル精製タンパク質がモ
ノＱ精製物質よりも比活性が少し低いという事実はＣＬ
ＭＦ分子の幾分かがＨＰＬＣ溶離溶媒 (すなわち 0.1％
トリフルオロ酢酸中のアセトニトリル)中で不活性化す
るかまたは変性することによるのであろう。

【００７５】化学的特性決定 均質なＣＬＭＦを調製できることにより、天然に存在す
るＣＬＭＦタンパク質のアミノ酸組成の決定および部分
的配列分析が初めて可能になった。モノＱ精製ＣＬＭＦ
の10−20ピコモルを加水分解にかけ、そのアミノ酸組成
を決定した (第２表) 。プロリン、システインおよびト
リプトファンは測定されなかった (ND)。ヒスチジンの
定量はトリスと関連した、His(＊) と共に溶出される大
きな人工産物のためできなかった。

【００７６】ジフェニル精製ＣＬＭＦの５−30ピコモル
を過ギ酸での前処理を伴うかまたは伴わずして加水分解
にかけた。このようにしてトリプトファンを除く完全な
アミノ酸組成が得られた (第３表) 。アミノ末端配列決
定をモノＱ精製ＣＬＭＦ 100ｐモルについての自動エド
マン分解により試みた。初めの22サイクルのデータはＣ
ＬＭＦのヘテロダイマー構造から予想されるように二つ
の配列が存在することを示した。これらの結果は下記の
ように要約されうる： サイクル 1 2 3 4 5 6 7 8 アミノ酸 I/? W/? E/L L/P K/V K/A D/T V/P サイクル 9 10 11 12 13 14 15 16 アミノ酸 Y/D V/P V/G E/M L/F D/P W/? Y/L サイクル 17 18 19 20 21 22 アミノ酸 P/H D/H A/S P/Q G/? E/? 第 ２ 表 アミノ酸 モル ％ アスパラギン酸またはアスパラギン 11.8 トレオニン 7.8 セリン 8.4 グルタミン酸またはグルタミン 14.9 プロリン ND グリシン 6.2 アラニン 7.6 システイン ND バリン 6.9 メチオニン 2.0 イソロイシン 4.6 ロイシン 9.0 チロシン 3.7 フェニルアラニン 4.0 ヒスチジン * リジン 9.3 アルギニン 5.4 トリプトファン ND 第 ３ 表 アミノ酸 モル ％ アスパラギン酸またはアスパラギン 10.8 トレオニン 7.2 セリン 8.9 グルタミン酸またはグルタミン 13.1 プロリン 3.8 グリシン 4.7 アラニン 5.9 システイン 2.9 バリン 6.2 メチオニン 1.9 イソロイシン 4.2 ロイシン 9.4 チロシン 3.6 フェニルアラニン 3.7 ヒスチジン 1.8 リジン 7.7 アルギニン 4.4 トリプトファン ND

【００７７】逆相ＨＰＬＣ クロマトグラフィー系は先に Stern, A.S.および Lewi
s, R.V. (1985) によりResearch Methods in Neurochem
istry, Eds. Marks, N. and Rodnight, R. (Plenum, Ne
w York) Vol. 6, 153-193に記載されている。フルオレ
サミン (Polysciences, Inc., Warrington, PA) を用い
た自動蛍光検出系によりカラム流出物中のタンパク質を
監視した［Stein, S. および Moschera, J. (1981) Met
hods Enzymol. 78: 435-447 ］。逆相ＨＰＬＣは Vydac
C18またはジフェニルカラム (4.６×20mm, The Sep/a/
ra/tions Group, Hesperia, CA) を用いて行った。タン
パク質は 0.1％ＴＦＡ中のアセトニトリルグラジエント
を用いて溶離した。

【００７８】タンパク質分析 アミノ酸分析は検出のためにフルオレサミンとのカラム
後反応を用いる器具で行った［Pan, Y. -C. E., および
Stein, S. (1986) 、Methods of Protein Microcharac
terization (Shively, J.E., Ed.), pp. 105-119, Huma
na Press, Clifton, NJ］。

【００７９】配列分析は Applied Biosystems Inc. Mod
el 470A ガス相シークエンサー (Foster City, CA)［He
wick, R.M., Hunkapillar, M.W., Hood, L.E.,および D
reyer, W.J., J. Biol. Chem. 256:7990-7997 (1981)］
を用いて行った。フェニルチオヒダントイン (ＰＴＨ)
アミノ酸誘導体は ABI Model 120A PTH アナライザーを
用いて "オン−ライン" で同定した。

【００８０】ＣＬＭＦのサブユニットの部分的アミノ酸
配列の決定 ＣＬＭＦの40KDa サブユニットの精製 全部で39.1リットルの NC-37細胞の保存された上清溶液
をプールして、 Pellicon Cassette系を用いて約 2.4リ
ットルまで濃縮し、−20℃にて保存した。解凍後、この
濃縮物を清澄化するために、調製物を遠心して沈降物を
捨てた。

【００８１】上清溶液を Nu-Gel P-SPカラムに注ぎ、タ
ンパク質を塩グラジエントを用いて溶離した (図８) 。
ピークＴＧＦ活性を測定しそして活性フラクションをプ
ールして透析し、調製物の塩濃度を50分の一に減少させ
た。粒子を取り除くために遠心した後、この物質をブル
ーＢアガロースカラムに注いだ。タンパク質を塩グラジ
エントを用いて溶離した (図９) 。ピークＴＧＦ活性を
測定しそして活性フラクションをプールして透析し、調
製物の塩濃度を 100分の一に減少させた。濾過後この物
質をモノＱカラムに注いだ。タンパク質を塩グラジエン
トを用いて溶離した (図10) 。フラクションの一部分ず
つをＴＧＦ活性に関してアッセイした。

【００８２】先のモノＱクロマトグラフィーのフラクシ
ョン39および40をプールし、８M 尿素で 1：1 v/v に希
釈しそして濃縮技術を用いて Vydacジフェニルカラムに
ポンプで注いだ。次にカラムを 0.1％トリフルオロ酢酸
５mlで洗浄した。タンパク質の溶離は、 0.1％トリフル
オロ酢酸中の７時間にわたる０−70％アセトニトリルの
グラジエントを用いて達成された (図11) 。フラクショ
ンの一部分ずつをＴＧＦ活性に関してアッセイした。Ｔ
ＧＦ活性を含有するフラクションのタンパク質純度を還
元条件下、すなわちβ−メルカプトエタノールの存在下
のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価した (図12) 。フラクシ
ョン94−97は純度90％以上の40,000ダルトンサブユニッ
トを含有していた。

【００８３】ＣＬＭＦのサブユニットのアミノ末端配列
の決定 ＣＬＭＦの40,000ダルトンサブユニットの高度濃縮調製
物を調製できることにより、その部分的配列分析が可能
となった。

【００８４】アミノ末端配列決定はジフェニル精製40,0
00ダルトンサブユニット20ｐモルを自動化エドマン分解
にかけることにより試みた。結果は下記のように要約で
きる。 サイクル 1 2 3 4 5 6 7 アミノ酸 I W E L K K D サイクル 8 9 10 11 12 13 14 アミノ酸 V Y V V E L D サイクル 15 16 17 18 19 20 21 アミノ酸 W Y P D A P G サイクル 22 23 アミノ酸 E M 75,000ダルトンＣＬＭＦの配列分析およびＣＬＭＦの4
0,000ダルトンサブユニットの配列分析に関連して、Ｃ
ＬＭＦの35,000ダルトンサブユニットのアミノ末端配列
を推定できる。35,000ダルトンサブユニットおよび40,0
00ダルトンサブユニットのアミノ末端配列は下記のよう
に要約できる： 35,000ダルトンサブユニット：

【００８５】

【化５】 40,000ダルトンサブユニット：

【００８６】

【化６】 上記において？は未決定または "最前の当て推量" 残基
を示す。

【００８７】ＣＬＭＦの40KDa サブユニット内部アミノ
酸配列セグメントの決定 ＣＬＭＦを前記のようにして精製した。40,000ダルトン
サブユニットを Matsudaira ［J. Biol. Chem. 262: 10
035-10038 (1987)］記載の方法により35,000ダルトンサ
ブユニットから分離精製した。ＣＬＭＦの50μg (20mM
トリス pH7.5：0.15M NaCl 500μl 中) を２×濃縮の試
料緩衝液 200μl で希釈した［Laemmli,Nature 227: 68
0-685 (1970) ］。試料を 400μl に濃縮しそしてジス
ルフィド結合を18μl のβ−メルカプトエタノールの添
加により切断し続いて 105℃に６分間さらした。

【００８８】試料を12％ポリアクリルアミドを含有する
ミニゲル (1.０mm厚さ) に負荷し、Laemmli(上記) に従
い電気泳動した。電気泳動の後、ゲルをトランスファー
緩衝液(10mM ３−シクロヘキシルアミノ−１−プロパン
スルホン酸、10％メタノール、pH11.0) に５分間浸して
トリスおよびグリシンの量を減少させた。この間、ポリ
ビニリデンジフルオライド (ＰＶＤＦ) 膜 (Immobilon;
Millipore; Bedford,MA)を 100％メタノールですす
ぎ、トランスファー緩衝液中に保存した。ＰＶＤＦ膜２
枚および数枚のブロット用紙を重ねたゲルをブロット装
置に組み立て、トランスファー緩衝液中 0.5Amp で30分
間電気泳動により溶離した。ＰＶＤＦ膜を脱イオン H₂O
中で５分間洗浄した。ブロットしたもののへりをＰＶ
ＤＦ膜から切り取り、50％メタノール中の 0.1％クーマ
シーブルーＲ-250で５分間染色し、続いて50％メタノー
ル、10％酢酸中で５−10分間室温にて汚れを落とした。
続いて40,000ダルトンの染色バンドを未染色ブロットの
相当する領域と一致させ、40,000サブユニットを未染色
ＰＶＤＦから切り取った。

【００８９】クーマシーブルー染色した40,000ダルトン
サブユニットのＮ−末端を配列決定し、Ｎ末端が先に決
定されたものと一致することを確認した (前記参照) 。
この方法により、40,000ダルトンのタンパク質はＣＬＭ
Ｆの40,000サブユニットであることが同定された。ＰＶ
ＤＦ結合40,000ダルトンサブユニットの５％をそのアミ
ノ酸組成について分析した (第４表) 。ブロットした4
0,000ダルトンサブユニットの残る95％をBauw, ら、［P
roc. Natl. Acad. Sci. USA 86:7701-7705 (1989) ］
の方法によりトリプシンでフラグメント化した。タンパ
ク質を担持する膜を約３×３mmの断片に切り、エッペン
ドルフチューブに集めた。続いてそれらをメタノール中
の２％ポリビニルピロリドン (40,000ダルトン) 溶液 3
00μl 中に浸した。30分後、クエンチング混合物を同量
の蒸留水で希釈しそしてさらに５−10分間インキュベー
トした。次に上清溶液を捨て、膜片を 300μl の水で４
回そして 300μl の100mM トリスHCl (pH8.5) で１回洗
浄した。２μg のトリプシンを含有するこの緩衝液 200
μl を添加した。試料を振盪しそして37℃で４時間イン
キュベートした。続いて上清溶液を第２のエッペンドル
フチューブに移し、膜片をさらに88％(v/v) の蟻酸 100
μl で１回そして脱イオン水 100μl で３回洗浄した。
洗浄液全てを第２のエッペンドルフチューブの消化混合
物に加えた。プールされた消化物中に含有される生じた
ペプチドをYMC C-18カラム (2.６×50mm； Morris Plai
ns,NJ) 上の狭口径ＨＰＬＣ (HP1090A, Hewlett Packar
d) により分離した。

【００９０】 第 ４ 表 アミノ酸 残基 No. アスパラギン酸またはアスパラギン 27.9 (28) トレオニン 20.7 (23) セリン 24.6 (34) グルタミン酸またはグルタミン 44.6 (35) プロリン ND (14) グリシン 16.3 (15) アラニン 16.2 (14) システイン ND (10) バリン 20.9 (23) メチオニン 2.5 (2) イソロイシン 10.3 (12) ロイシン 22.9 (22) チロシン 12.9 (12) フェニルアラニン 9.9 (9) ヒスチジン 5.2 (5) リジン 24.5 (26) アルギニン 12.5 (12) トリプトファン ND (10) 注記：結果は２回の分析の平均を示す。プロリン、シス
テインおよびトリプトファンは測定されなかった(ND)。
カッコ内の値は、クローン化40,000ダルトンサブユニッ
トの配列分析から推定されたタンパク質の第１次構造に
基づいた40,000ダルトンサブユニットの理論上のアミノ
酸組成を示す。

【００９１】上記操作は図13および図14に概略的に示さ
れる。消化された40,000ダルトンサブユニットのトリプ
シン処理ペプチドマップを図15に示す。ペプチドを直線
状グラジエントのアセトニトリルで溶離した。配列決定
されたピークを、そのフラクション番号に従い番号をつ
ける。これらのペプチドのアミノ酸配列を第５表に示
す。

【００９２】多くのトリプシン処理ペプチドを無傷の4
0,000ダルトンサブユニットの全領域から回収した (第
５表) 。Ｎ末端ヘキサペプチド (フラクション no.60)
を高い収率で回収した。カルボキシ末端ペプチド (フラ
クション no.72) を回収しそして、最後の２個のアミノ
酸は配列決定により明確に確認されたわけではないが、
予測されたＣ末端ペプチドの完全長である。これは、恐
らくCys およびSer 残基が、特にそれらが、ペプチドの
末端に存在する場合充分に検出されないという事実によ
るのであろう。４個のありうる Asn結合炭水化物部位が
cＤＮＡ配列から予測できる。これらの部位のうち２個
を含有する２本のペプチドを配列決定した。ペプチド 1
96−208(フラクション no.70) を配列決定した場合、残
基 200でピークが検出されなかった。このことはこのAs
n (cＤＮＡにより予測) が確かにグリコシル化されてい
ることを示している。ペプチド 103−108(フラクション
no.52) は残基 103にて Asnを生じた。したがって、こ
の部位はグリコシル化されていない。

【００９３】フラクション no.55のフェニルイソチオシ
アナート (ＰＴＨ) 配列分析［Hewickら, J. Biol. Che
m. 256: 7990 (1981) ］において見られた未知のピーク
は残基no.148に相当する位置で検出された。その部位は
もしそれが修飾されているのでなければ配列分析により
通常検出されない Cys基であると予測される。上記ＰＶ
ＤＦトランスファー操作をＣＬＭＦの第２の50μg 分量
で反復した (操作概要については図13および図14参照)
。

【００９４】 第 ５ 表 ＰＶＤＦから離れたトリプシン処理40KDa ＣＬＭＦペプチド フラクション 残 基 Ｎ−末端配列 no. no. 52 103-108 N-K-T-F-L-R 55 139-157 G-S-S-D-P-Q-G-V-T-^*-G-A-A-T-L-S-A-E-R 55 & 57 267-279(?) V-F-T-D-K-T-S-A-T-V-I-?-R 57 52-58 T-L-T-I-Q-V-K 57 218-228 N-L-Q-L-K-P-L-K-N-S-R 60 1-6 I-W-E-L-K-K 67 288-? A-Q-D-R-Y-Y-S-S- 67 85-102(?) K-E-D-G-I-W-S-T-D-I-L-K-D-Q-K-E-P- 70 196-208 L-K-Y-E-?-Y-T-S-S-F-F-I-(R?) 71 85-96(?) K-E-D-G-I-?-S-T-D-I-L-K 72 288-306(?) A-Q-D-R-Y-Y-S-S-S-W-E-?-A-S-V-P-?-? 78 71-85 (G?)-G-E-V-L-S-H-S-L-L-L-(L?)-H-K-K しかしながら、ブロットされた40,000ダルトンサブユニ
ットをタンパク質分解酵素、スタフィロコッカス・アウ
レウス (Staphylococcus aureus)Ｖ８プロテアーゼ (エ
ンドプロティナーゼ Endoproteinase Glu-C, Boehringe
r Mannheim, Indianapolis, IN) でフラグメント化し
た。膜片を20μg のＶ８を用い37℃で、６時間消化し
た。ペプチドを88％(v/v) ギ酸で抽出しそして相分離カ
ラム (２×150mm, C８ S３, Queensferry, England, U
K) で分離した (図16) 。アセトニトリルの直線状グラ
ジエントでペプチドを溶離した。配列決定されたピーク
をそれらのフラクション番号に従い番号を付けた。これ
らのペプチドのアミノ酸配列を第６表に示す。

【００９５】 第 ６ 表 ＰＶＤＦより離れたＶ８(Glu-C) 40KDa ペプチド フラクション no. 残 基 no. Ｎ−末端配列 47 1-3 I-W-E 54 4-12 L-K-K-D-V-Y-V-V-E 57 13-22 L-D-W-Y-P-D-A-P-G-E 57 45-59 V-L-G-S-G-K-T-L-T-I-Q-V-K-(E?) ４本のペプチドを含有するペプチドの三大ピーク (フラ
クションNo.47, 54 および57) を配列決定した。４本の
ペプチド全てが40KDa サブユニットのアミノ末端領域か
らのものであった。このことはタンパク質のＮ末端がＶ
８消化を最も受けやすいことを示している。

【００９６】図17はＣＬＭＦの40,000ダルトンサブユニ
ットのタンパク質構造決定を要約して示す。

【００９７】ＣＬＭＦの35,000ダルトンサブユニットの
アミノ末端の直接配列決定還元 (β−メルカプトエタノ
ールの存在下) および非還元 (β−メルカプトエタノー
ルの非存在下) 条件下 (図18) でのモノＱフラクション
39のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析 (図３参照) では、40,000ダ
ルトン分子量 "混入物" は "遊離" の40,000ダルトンＣ
ＬＭＦサブユニット (すなわち35,000ダルトンサブユニ
ットと無関係) であることが示される。この推測を指し
示す証拠は、還元なし (図18、レーンＢ) では、主に7
5,000ダルトンＣＬＭＦがいくらかの40,000ダルトンタ
ンパク質と共に存在する。還元後 (図18、レーンＣ) で
は、75,000ダルトンＣＬＭＦがなくなって35,000ダルト
ンサブユニットおよび濃縮された40,000ダルトンバンド
が生じる。

【００９８】先のモノＱクロマトグラフィーのフラクシ
ョン39を４Ｍ尿素の存在下に５％β−メルカプトエタノ
ール中で還元しそして95℃で５分間加熱した。試料を濃
縮法を用いVydac C-18カラムにポンプで注ぎ、続いてカ
ラムを 0.1％トリフルオロ酢酸５mlで洗浄した。タンパ
ク質の溶離は 0.1％トリフルオロ酢酸中５時間にわたる
０−70％アセトニトリルのグラジエントを用いて達成し
た (図19) 。フルオレサミン陽性フラクションのタンパ
ク質純度を10％スラブゲルを用い非還元条件下のＳＤＳ
−ＰＡＧＥにより評価した。ゲルを銀染色してタンパク
質を可視化した(図20) 。フラクション 112−117 は純
度95％以上である分子量35,000での拡散バンドを示し
た。フラクション39中に存在する40,000ダルトンサブユ
ニットおよび任意の他のタンパク質はC-18カラムに結合
したままであった。これらのタンパク質は (40,000ダル
トンサブユニットを含めて) 42％ギ酸／40％１−プロパ
ノールの溶液で最終的に溶離された。

【００９９】均質な35,000サブユニットが調製できるこ
とでＣＬＭＦタンパク質のアミノ酸組成の決定および分
子量が低い方のサブユニット部分配列分析が可能になっ
た。35KDa サブユニットの約１μg を加水分解にかけ、
そしてそのアミノ酸組成を決定した (第７表) 。プロリ
ン、システインおよびトリプトファンは測定されなかっ
た (ND) 。

【０１００】 第 ７ 表 アミノ酸 モル ％ アスパラギン酸またはアスパラギン 10.9 トレオニン 6.7 セリン 8.3 グルタミン酸またはグルタミン 14.9 プロリン ND グリシン 6.1 アラニン 7.7 システイン ND バリン 6.3 メチオニン 2.9 イソロイシン 4.5 ロイシン 10.9 チロシン 3.2 フェニルアラニン 4.4 ヒスチジン 2.3 リジン 5.6 アルギニン 5.5 トリプトファン ND アミノ酸配列決定をC-18精製35KDa サブユニット 100ｐ
モルについて自動エドマン分解により試みた。はじめの
20サイクルからのデータにより、前記した推定により得
られた配列が確認された。さらに、アミノ酸21−26の他
に第２のアミノ酸が得られた。これらの結果は下記のよ
うに要約できる： サイクル 1 2 3 4 5 6 7 アミノ酸 ? N L P V A T サイクル 8 9 10 11 12 13 14 アミノ酸 P D P G M F P サイクル 15 16 17 18 19 20 21 アミノ酸 ? L H H S Q N サイクル 22 23 24 25 26 アミノ酸 L L R A V したがって、35,000ダルトンサブユニットのアミノ末端
配列は下記のように要約できる： 35,000ダルトンサブユニット：

【０１０１】

【化７】 上記において？は未決定残基を示す。

【０１０２】ＣＬＭＦのトリプシン処理フラグメント配
列の決定 ＣＬＭＦの最初の精製からのモノＱフラクション36およ
び37をプールした (約100ｐモル／1.7ml)。30μl 試料
を取り出し、残りの量をヘリウム気流の下 200μl まで
減少させた。0.１Ｍ重炭酸アンモニウムの 100μl を加
えた。トリプシン (Worthington Biochemical Corp., F
reehold, NJ)切断を37℃で20時間、基質対酵素比率 2：
1 で行った。生じたペプチドフラグメントを還元しそし
てカルボキシメチル化した。これは 0.1M トリス-HCl,
pH8.５／６M グアニジン-HCl 160μl を加えることによ
り達成された。容量をヘリウム気流の下 200μl まで減
少させそしてジチオトレイトール (50mg／ml) ４μl を
加えた。混合物を37℃で４時間インキュベートした。ジ
スルフィド結合の還元的切断後、［¹⁴Ｃ］ヨード酢酸
(４μモル) を加え、生じた溶液を室温で暗中10分間イ
ンキュベートした。

【０１０３】生じたペプチドフラグメント S-5 120オン
グストローム ODSカラム (2.６×50mm, YMC, Inc., Mor
ris Plains, NJ) での逆相ＨＰＬＣ (図21) により単離
した。ペプチドはピリジンでpH4.０に調整した0.９M 酢
酸中の１−プロパノールグラジエントを用いて溶離し
た。フラクション46中にみられるペプチドのアミノ酸配
列は Asp-Ile-Ile-Lys-Pro-Asp-Pro-Pro-Lysであること
が判明した (自動エドマン分解により決定) 。

【０１０４】ＣＬＭＦの内部アミノ酸配列セグメントの
決定 ＣＬＭＦを先に記載したようにして精製した。タンパク
質約80μg を10％トリクロロ酢酸を用いて沈降させた。
沈降物を70％(v/v) 水性ギ酸中に室温で溶解させた。少
量の70％ギ酸中の、メチオニン残基より約50倍モル過剰
の臭化シアン (CNBr) を攪拌下に加え、そしてこの混合
物を酸素を含まないヘリウムの下室温で48時間、暗中で
インキュベートした。この混合物を15容量の水で希釈
し、２等分しそしてヘリウム気流の下に乾燥した。酸お
よび副生物を完全に除去するために、さらに水を加えた
後乾燥を繰り返した。

【０１０５】フラグメント化したＣＬＭＦの一部分 (約
40μg ) を４％β−メルカプトエタノールを含有する50
μl の Laemmli試料緩衝液［Laemmli, Nature 227: 680
-685(1970)］で溶解させ続いて 105℃に６分間さらし
た。試料を17.5％ポリアクリルアミドを含有するミニゲ
ル (1.０mm厚) の３ウェルに負荷し、そしてLaemmli(上
記) に従い電気泳動した。

【０１０６】電気泳動の後、ゲルをトランスファー緩衝
液(10mM ３−シクロヘキシルアミノ−１−プロパンスル
ホン酸、10％メタノール、pH11.0) 中に30分間浸した。
この間にポリビニリデンジフルオライド (ＰＶＤＦ) 膜
(Immobilon; Millipore; Bedford, MA)を 100％メタノ
ールですすぎ、トランスファー緩衝液中に保存した。Ｐ
ＶＤＦ膜２枚を重ね、ブロット用紙でサンドイッチした
ゲルをブロット用装置に組み立てそしてトランスファー
緩衝液中0.5Ampで30分間電気泳動した。ＰＶＤＦ膜を脱
イオン H₂O 中で５分間洗浄しそして50％メタノール中
の 0.1％クーマシーブルーＲ-250で５分間染色し、次に
50％メタノール、10％酢酸中で、室温で５−10分間よご
れを落とした。数多くの不鮮明なバンドが観察された
(図22Ｂ参照) 。

【０１０７】膜の５領域を、ＣＬＭＦ CNBr 消化物を含
有する最後の３レーンにまたがるように切り取った。こ
れらの領域を配列決定した。ＣＬＭＦのCNBrフラグメン
トから得た配列の要約を図22Ａに示す。フラグメントＣ
ＬＭＦの第２の部分 (約40μg ) を６M グアニジンHCl
、0.1Mトリス／HCl 、0.５M NaOH、pH8.0 を含有する
約 400−500 μl の88％ギ酸中に溶解させた。試料をギ
酸でpH4.0に調整した。ペプチドフラグメントをVydac C
₄カラム (4.６×20mm, The Sep/a/ra/tions Group, Hes
peria, CA) 上の逆相ＨＰＬＣ (第23図) により単離し
た。ペプチドを４時間にわたる 0.1％ＴＦＡ中の直線状
グラジエントアセトニトリルを用いて溶離した。これら
のピークのうちひとつを配列決定し、このペプチドのア
ミノ酸配列は： フラクション No. Ｎ−末端配列 47 V-D-A-V-H-K-L-K-Y-E-?-Y-T-S-(S?) -F-F-I-R-D-I-I-K-P- (40KDaサブユニットの残基番号190から開始) であった。

【０１０８】上記配列には Met基が前にあることが想定
されるかまたは知られている。"?"で印された残基は "
最善の当て推量" 残基を示す。

【０１０９】アフィニティクロマトグラフィーを用いる
ＣＬＭＦの精製およびその40,000ダルトンサブユニット アフィニティクロマトグラフィー樹脂は、下記にその調
製が記載されているモノクローナル抗体７Ｂ２を活性化
アガロースに共有結合させることにより調製した。同様
に、下記に概略を示した精製は抗体をシリカまたは薄い
ミクロ細孔膜に共有結合させることによっても実施でき
よう。活性化アガロースは下記のようにして調製した。 １. 100mlのセファロースCL-6B を 100mlの H₂O で３回
洗浄した。 ２. H₂O 中の１％メタ過ヨウ素酸ナトリウム 100mlを
樹脂に加え、懸濁液を室温で60分振盪した。 ３. 樹脂を冷H₂Oで充分に洗浄した。

【０１１０】７Ｂ２の活性アガロースへの共有結合は下
記のようにして行われた。 １. 上記のようにして調製された活性化アガロース９ml
をリン酸緩衝食塩水、pH7.4 中の７Ｂ２ (約 3.9mg／m
l) ７mlに懸濁した。 ２. シアノボロハイドライド50.2mgをゲル懸濁液に加え
これを４℃で一夜振盪した。 ３. ゲル懸濁液を濾過し、そしてシアノボロハイドライ
ド50.2mgを含有する７mlの 1.0M エタノールアミン、pH
7.0 に加えた。

【０１１１】上記樹脂 (約 2.6mg IgG／mlゲル) １mlを
カラムに充填し、そしてリン酸緩衝食塩水で充分に洗浄
した。75KDa ＣＬＭＦタンパク質および付加的に主な混
入タンパク質を含有するモノＱクロマトグラフィーから
のフラクションをプールして（約 3.5×10⁶U ＴＧＦ活
性) 、ＰＢＳで充分に透析した。この調製物を７Ｂ２セ
ファロースカラムに室温で毎時５mlの速度で注いだ。カ
ラムを、 280nmで監視してベースライン吸光度が得られ
るまでリン酸緩衝食塩水 (pH7.4)で洗浄した。続いて吸
着されたタンパク質を 0.2Ｎ酢酸、0.15M NaClを用いる
pH約３で溶離した。フラクションの一部分ずつをＴＧＦ
活性についてアッセイした。出発活性の約76％が酸溶出
物中に回収された。

【０１１２】タンパク質純度は10％スラブゲルを用い、
還元なしにＳＤＳ−ＰＡＧＥ［Laemmli, Nature 227: 6
80-685 (1970) ］により評価した。ゲルを銀染色してタ
ンパク質を可視化した［Morrissey, Anal. Biochem. 11
7:307-310 (1981)］。酸溶出物は純粋ＣＬＭＦおよび
「遊離の」連合していない40KDa ＣＬＭＦサブユニット
を含有する (図24) 。

【０１１３】ＣＬＭＦの pＩの測定 プールしたモノＱフラクション36および37の30μl (図
３参照) を、予め成形したアンフォリン(ampholine) Ｐ
ＡＧプレートゲル、 pH3.5−9.5 (Pharmacia LKB Biote
chnology) にスポットしてＣＬＭＦの pＩを測定した。
pＩ標準マーカーに基づけば、１本の大きなバンドが p
Ｉ4.8 に、そして１本の小さなバンドがpH5.2 に観察さ
れた。 pH 測定に基づけばこれらのバンドの pＩは、そ
れぞれ4.２および4.６である。

【０１１４】精製ＣＬＭＦの生物学的活性 精製されたＣＬＭＦはＴ細胞増殖因子アッセイにおいて
ヒトＰＨＡ活性化リンパ芽球の増殖を刺激した (第８
表) 。モノＱカラムから回収された精製ＣＬＭＦのＴ細
胞増殖因子活性を５つの別々の実験においてヒトリンフ
ォカインの標準調製物のそれと比較し、そして精製ＣＬ
ＭＦの比活性が8.５±0.９×10⁷ 単位／mgタンパク質で
あることが判明した。ジフェニルＨＰＬＣから得られた
精製ＣＬＭＦをＴＧＦアッセイにおいて標準リンフォカ
イン調製物と比較したひとつの実験においては、5.２×
10⁷ 単位／mgタンパク質の比活性が観察された。精製Ｃ
ＬＭＦおよびヒトrIL-２の最適下限濃度を、ＴＧＦアッ
セイにおいて組合せて検査した場合、付加的増殖が観察
され、rIL-２単独により生ずる最大増殖まで達した。し
かしながら、rIL-２により生じた増殖は中和性ヤギ抗−
ヒト IL-２抗血清の存在下で完全に阻害されるがＣＬＭ
Ｆは影響されなかったという点で、ＣＬＭＦによる増殖
と区別できた。

【０１１５】細胞障害エフェクター細胞を活性化する精
製ＣＬＭＦの能力を４日間ＬＡＫ細胞誘導アッセイおよ
び一夜ＮＫ細胞活性化アッセイの両方において調査し
た。ＬＣＩアッセイにおいては、 800単位／mlの高濃度
の精製ＣＬＭＦは IL-２の非存在下ではほとんど活性を
有さなかった (第９表) 。しかしながら、両サイトカイ
ンの存在下に生成された溶解活性がどちらかのサイトカ
イン単独を含有する培養物中で観察された溶解活性の合
計より有意に大きかったので、ＣＬＭＦはＬＡＫ細胞誘
導を生じるのに低濃度のヒトrIL-２と相乗作用した (第
９表) 。rIL-２の存在下において、精製ＣＬＭＦは３単
位／mlの低濃度であった。

【０１１６】 第 ８ 表 精製ヒトＣＬＭＦはヒトＰＨＡ−活性化リンパ芽球の増殖を刺激する 添加サイトカイン ヒトCLMF^C ヒトrIL-２ PHA活性化リンパ芽球による³H-チミジン 実 験 (u/ml) (u/ml) とり込み (平均 cpm＋1 S.E.M.) １^a 0 0 10,607 ± 596 500 0 70,058 ± 1,630 100 0 60,377 ± 1,927 20 0 36,018 ± 321 4 0 24,996 ± 669 0.8 0 17,765 ± 790 ２^b 0 0 9,976 ± 374 200 0 60,980 ± 1,713 50 0 38,817 ± 884 12.5 0 18,885 ± 2,132 3.1 0 13,648 ± 731 0 16 80,041 ± 5,835 0 4 21,282 ± 1,145 0 1 11,241 ± 898 50 4 62,050 ± 2,408 12.5 4 40,628 ± 2,196 3.1 4 31,144 ± 3,754 a 実験１の全ての培養物はヤギ抗−ヒトrIL-２を含有
した。

【０１１７】b 実験２の培養物はどれでもヤギ抗ヒトr
IL-２を含有しなかった。 c モノＱＦＰＬＣで精製されたヒトＣＬＭＦ。 第 ９ 表 精製ヒトＣＬＭＦは４日間培養物におけるリンフォカイン活性キラー(LAK) 細胞 の生成においてヒトrIL-２と相乗作用する 添加サイトカイン： 下記からの特異的⁵¹Cr放出^a ％ ヒトCLMF^b ヒトrIL-２ (u/ml) (u/ml) K562 Raji 0 0 3 ± 1.7 -1 ± 0.5 800 0 7 ± 0.3 1 ± 0.1 200 0 5 ± 1.1 1 ± 0.4 50 0 4 ± 3.0 0 ± 0.9 0 5 10 ± 2.4 2 ± 0.8 800 5 41 ± 4.0 11 ± 0.8 200 5 42 ± 1.9 11 ± 0.3 50 5 36 ± 2.7 9 ± 0.8 12.5 5 28 ± 2.1 7 ± 0.7 3.1 5 19 ± 0.8 5 ± 0.3 0.8 5 14 ± 1.2 3 ± 0.8 a 値は４組測定の平均±はS.E.M.を示す。K562およびR
ajiの自然発生的⁵¹Cr放出値は、それぞれ16％および14
％であった。

【０１１８】b モノＱＦＰＬＣで精製されたヒトＣＬ
ＭＦ。 ４日間ＬＡＫ誘導アッセイにおける結果と対照的に、精
製ＣＬＭＦはそれ自体で一夜アッセイにおけるヒトＮＫ
細胞の活性化に効果があった (第10表) 。このアッセイ
においてＣＬＭＦは 1.6単位／mlの低濃度で活性であっ
た。ＣＬＭＦをヒトrIL-２と組合わせて検査した場合、
２つのサイトカインがいっしょで、やっとＮＫ活性の増
強に付加的作用を有した (第10表) 。

【０１１９】 第 10 表 精製ヒトＣＬＭＦは一夜培養物中のナチュラルキラー(NK)細胞の活性を生じる 下記のエフェクター／標識比率での 添加サイトカイン： Raji細胞 からの特異的⁵¹Cr放出^a ％ ヒトCLMF^b ヒトrIL-２ (u/ml) (u/ml) 20/1 5/1 0 0 10 ± 0.6 5 ± 0.4 40 0 31 ± 0.4 14 ± 0.5 8 0 23 ± 2.1 12 ± 0.4 1.6 0 15 ± 0.3 10 ± 0.6 0.3 0 12 ± 1.2 9 ± 0.2 0 1 13 ± 0.4 6 ± 0.5 40 1 33 ± 2.0 17 ± 0.5 8 1 26 ± 0.8 13 ± 1.9 1.6 1 19 ± 1.1 11 ± 2.1 0.3 1 16 ± 1.0 10 ± 1.5 0 5 20 ± 1.3 13 ± 0.6 40 5 23 ± 2.0 12 ± 1.5 8 5 29 ± 1.1 16 ± 0.7 1.6 5 27 ± 1.2 13 ± 0.8 0.3 5 24 ± 1.8 13 ± 1.2 0 25 38 ± 1.4 19 ± 0.7 a 各値は４組測定の平均±1 S.E.M.を示す。自然発生
的⁵¹Cr放出は９％であった。

【０１２０】b モノＱＦＰＬＣにより精製されたヒト
ＣＬＭＦ。 非特異的なＮＫ／ＬＡＫ細胞の溶解活性を増強するその
能力に加えて、ＣＬＭＦはまだインビトロにおいて特異
的なヒト細胞溶解性Ｔリンパ球 (ＣＴＬ) 応答を促進し
た。ＣＬＭＦは弱い免疫原性のガンマ照射 HT144メラノ
ーマ細胞に対する特異的同種ＣＴＬ応答を増大した (第
11表) 。低濃度のrIL-２と組み合わせると、ＣＬＭＦま
たはＵＶ照射された HT144メラノーマ細胞に対する特異
的同種ヒトＣＴＬ応答をも促進 (第11表) したが添加サ
イトカイン非存在下では検出可能なＣＴＬ応答を全く惹
起しなかった。これらの研究において生成された細胞溶
解性エフェクター細胞の特異性は、それらが⁵¹Cr標識 H
T144メラノーマ細胞を実質的に溶解させるが、K562細胞
はほとんどまたは全然溶解させないその能力により示さ
れた。それとは対照的に、ヒドロコルチゾンの非存在下
で同じ実験で低密度のリンパ球をrIL-２とインキュベー
トすることにより生成したＬＡＫ細胞は HT144メラノー
マ細胞よりもずっと大きな度合いでK562細胞を溶解させ
た。これらアッセイにおいて生じた細胞溶解性エフェク
ター細胞の特異性および同定をさらに考察するために、
かかるものを第11表に示す［Gatelyら、J. Immunol. 13
6:1274-1282 (1986)を参照］。

【０１２１】

【表２】 a 両方の実験において、二組の培養物の含有物をプー
ルし、洗浄し、1.2ml ＴＣＭ中に再懸濁し、そして希釈
なしおよび 1：5 希釈で溶解活性をアッセイした。実験
１においては、示されたデータは細胞溶解アッセイにお
いて、約 4：1 のリンパ球：標的比率に相当するリンパ
球の 1：5 希釈物を用いて得られた。実験２において
は、有意な溶解はリンパ球を希釈しないで溶解アッセイ
に加えた場合にのみ見られ、これらのデータは表に示さ
れている。 HT144細胞からの自然発生的⁵¹Cr放出は実験
１および２においてそれぞれ25％および31％であり、そ
してK562では実験１および２においてそれぞれ18％およ
び27％であった。

【０１２２】b パーコールフラクション４は45％およ
び58％パーコール層間の界面から回収された高密度リン
パ球を含有したが、パーコールフラクション１＋２は35
％および38％、および38％および41％パーコール層間の
界面から収集された低密度リンパ球を含有した。パーコ
ールフラクション４はＣＴＬ前駆体を含有したがＬＡＫ
前駆体をほとんど含有しなかった。一方フラクション１
＋２はＬＡＫ細胞前駆体に富んでいた。

【０１２３】c ＨＴ_UVおよびＨＴγは、それぞれＵＶ
照射またはγ照射された HT144メラノーマ細胞を示す。
我々の結果は、精製ヒトＣＬＭＦがそれ自体で活性化ヒ
トＴリンパ球を増殖させ、ヒトＮＫ細胞の細胞溶解活性
を増大させそしてヒトＣＴＬ応答を増大させたことを示
す。ＣＬＭＦのこれらの活性は IL-２のそれらと類似し
ており、このことは IL-２と同様にＣＬＭＦがインビボ
で単一の治療剤として使用された場合に免疫増強および
抗腫瘍作用を有するにちがいないことを示唆している。
明らかに、ＣＬＭＦはまた腫瘍浸潤リンパ球から由来し
うるように、［Topalianら、J. Immunol. 142: 3714-37
25 (1989) ］ＮＫ／ＬＡＫ細胞および活性化Ｔ細胞のイ
ンビトロにおける増殖を刺激するのに利用できよう。さ
らに精製ＣＬＭＦは培養物中においてヒトＬＡＫ細胞を
生成させるのに低濃度のrIL-２と相乗作用しそしてイン
ビトロで特異的ＣＴＬ応答を促進するのにrIL-２と付加
的にかまたは相乗的に作用した。これらの結果は、rIL-
２と組合せてＣＬＭＦを使用することによりさらに最適
の抗腫瘍療法を構成できようことを示唆している。

【０１２４】ヒトＣＬＭＦの40KDa サブユニットをコー
ドする cＤＮＡのクローニング １) 細胞培養およびポリＡ⁺ ＲＮＡの単離 ＮＣ37細胞 (サブクローン98) を前記のようにしてロー
ラーボトルで増殖させそしてＰＭＡおよびカルシウムイ
オノフォアを用いて15.5時間誘導した。細胞を収穫し、
約5.25×18⁸ 細胞を含有する1.11ｇの冷凍細胞ペレット
にした。培養物の一部を３日間継続し、その時点でのＣ
ＬＭＦ活性のバイオアッセイ力価は2,200 単位／mlであ
り、このことはＲＮＡを単離するために収穫した細胞が
ＣＬＭＦ活性を確かに産生していたことを示している。
標準操作により凍結細胞から全ＲＮＡを単離し、そして
ポリＡ⁺ ＲＮＡをアフィニティクロマトグラフィーによ
り得た。ポリＡ⁺ ＲＮＡの収率はＲＮＡ投入量の総量と
比較して 2.5％(w/w) であった。 ２) cＤＮＡライブラリーの確立 上記ポリＡ⁺ ＲＮＡの２μg を、プライマーとして150n
g のランダムヘキサマーを用いて cＤＮＡに逆転写し
た。ラムダgt10にライブラリーを確立し、そして1.５×
10⁵ クローンを増幅させてスクリーニングした。 ３) 40KDa ＣＬＭＦサブユニット cＤＮＡに特異的なＤ
ＮＡプローブを生成させるためのＰＣＲの使用 精製40KDa タンパク質のＮ末端配列の一部は IWELKKDVY
VVELDWYPDAP...である。混合プライマーＰＣＲで使用す
るための２本のプライマーを設計しそして標準操作によ
り合成した。正方向のプライマーは上記配列におけるア
ミノ酸 ELKKDに相当するコード鎖として設計されこのも
のはその配列にありうる全てのコドンを含有し、そして
EcoRl部位および安定性を付加する３個の付加的な塩基
を包含する5'末端伸張部分を有した。正方向のプライマ
ーの配列は従って、 5' ctc gaattc gaa/g c/ttn aaa/g
aaa/g ga、すなわち64の異なる配列を有する23マーで
ある。逆方向のプライマーは40KDa 配列のＮ末端の部分
的アミノ酸配列 YPDAPに相当するアンチセンス鎖を表す
ように同じ方法で設計された。逆方向のプライマーは従
って配列 5' ctc gaa ttc ngg ngc a/gtc ngg a/gta を
有し、 256の異なる配列を含有する24マーである。記号
ｎは４種のありうる塩基 a, g, cまたはｔの任意のひと
つを表わす。従ってこれらプライマーは72塩基対長さの
アンプリコンを特定する。サブクローニングするための
付着末端を生成させるために EcoRlで切断した後は、ア
ンプリコンの寸法は64塩基対まで低下する。誘導された
細胞および対照として誘導されていない細胞からのポリ
Ａ⁺ ＲＮＡを用いて、上記２項記載のようにしてＰＣＲ
に使用するための一本鎖 cＤＮＡを生成させた。これら
cＤＮＡのどちらかひとつの40ngを10mMトリス-HCl pH8.
3／50mM KCl／1.5mM MgCl₂ ／0.01％ゼチラン／４種の
ヌクレオチド 200μM ずつ／10単位のTaq ポリメラーゼ
／各プライマー 250ｐモルずつ、の 100μl 中で正およ
び逆方向プライマーを用いて増幅した。ＰＣＲのパラメ
ーターは下記のとおりであった：最初の変性は95℃で７
分間であった。低緊縮アニーリングは、２分間以上37℃
にさまし、37℃で２分間インキュベートし、 2.5分以上
72℃に加熱し、72℃で 1.5分間伸張させ、95℃で１分間
以上加熱し、そして95℃で１分間変性させることにより
行った。この低緊縮アニーリングサイクルをもう１回繰
り返した。その後、30回の標準サイクルを下記のように
して実施した：95℃で１分間、55℃で２分間、72℃で２
分間。最後の伸張は72℃で10分間行った。全試料の10％
を４％アガロースゲルにかけ、染色しそして分析した。
予想した寸法を有するアンプリコンは誘導された cＤＮ
Ａが増幅されている試料においてのみ検出できた。試料
の残りはフェノールで抽出し、エタノールを用いる沈降
により濃縮しそして42μl の水に再溶解させた。この試
料を50μl 中の制限酵素EcoRl 60単位を用い37℃で２時
間消化した。続いて試料を６％ポリアクリルアミドゲル
にかけそして64bpアンプリコンをゲルから切り出して標
準操作により溶離した。ＤＮＡアンプリコンを標準操作
によりブルースクリプトSK＋プラスミドの EcoRl部位に
サブクローンした (Stratagene, La Jolla, CA) 。E.コ
リ株DH５ (ATCCより取得可能) の形質転換により得られ
たコロニーを取りそして64bp挿入物の存在について分析
した (ブルースクリプトSK＋プラスミドと適合しうる他
のE.コリ株も使用できる) 。２個の陽性候補を配列決定
してクローン化されたアンプリコンの配列を決定した。
この分析により正しいフラグメントが増幅されたことが
明らかである。なぜなら推定アミノ酸配列は、精製40KD
a タンパク質の部分的アミノ末端アミノ酸配列と正確に
一致するからである。次にこの情報を用いて cＤＮＡラ
イブラリーのスクリーニングに使用できる54bp長オリゴ
ヌクレオチドプローブを設計した。下記の配列を有する
２本のオリゴを設計した。すなわち 5' gag cta aag aa
a gat gtt tat gtc gtagaa ttc gat および 5' agg ggc
atc cgg ata cca atc caa ttc tac gac ata.これらの
２本のオリゴは下記の構造を形成するのに部分的に相補
的である。

【０１２５】 5' gagctaaagaaagatgtttatgtcgtagaattggat 3' 3' atacagcatcttaacctaaccataggcctacgggga 5' かかる構造はクレノウフラグメントおよび標識されたヌ
クレオチドを用いて標識でき、従って cＤＮＡライブラ
リーのスクリーニングのための高い比活性を有するプロ
ーブが得られる。 ４) cＤＮＡライブラリーのスクリーニング 増幅されたライブラリーからの全部で３×10⁵ クローン
を下記条件下で６個の二組のフィルターでスクリーニン
グした。５×ＳＳＣ／10×デンハード／100 μg ／mlの
変性ウシ胸腺ＤＮＡ／20％ホルムアミド／0.１％／ＳＤ
Ｓ／1.５×10⁶cpm の標識54マー、の50mlを37℃で17時
間。次にフィルターを２×ＳＳＣ中で42℃で30分間洗浄
し、乾燥しそしてＸ−線フィルムにさらした。増感スク
リーンを用いて一夜露出させた後、陽性の可能性のある
16検体を取り、第２回のスクリーニングによりさらに分
析した。10個の再度ハイブリダイズしたファージを単離
し、それらのＤＮＡを調製した。これら10単離体のうち
８個は EcoRl切断により0.８Kbおよび0.６Kb長の２本の
フラグメントを遊離し、内部に EcoRl部がありうること
を示しており、同一のように見えた。ブロットし、スク
リーニングプローブとハイブリダイズすると0.６Kbフラ
グメントだけがハイブリダイゼーションを示した。ふた
つのフラグメントを前記したブルースプリプトSK＋プラ
スミドのEcoRｌ 部位に別々にサブクローンしそして完
全に配列決定した。この分析により、両フラグメントが
一列に整列すると天然に存在する内部EcoRl 部位を有す
る約1.４Kb長のひとつの連続した cＤＮＡを形成するこ
とが示された。なぜなら両フラグメントは翻訳されると
精製40KDa タンパク質から実際に単離されているトリプ
シン消化ペプチドをコードする読み取り枠の存在を示し
たからである。 cＤＮＡから推定した40KDa サブユニッ
トの完全な配列を図25に示す。この cＤＮＡは328 アミ
ノ酸からなるひとつのオープンリーディングフレームを
コードする。このタンパク質は開始 Metで始まり、古典
的疎水性シグナルペプチドをつくる別の21アミノ酸が続
く。成熟精製40KDa サブユニットのＮ末端すなわち IWE
LKKD... がシグナル配列のすぐ後に続く。成熟タンパク
質はしたがって 306アミノ酸から成る。推定タンパク質
配列は４個のありうるＮ結合グリコシル化部位を含有
し、そのうち２個は単離され配列決定されたトリプシン
消化ペプチド中に存在する。これらの２部位のうちの一
方はインビボで炭水化物側鎖結合に用いられる。成熟非
グリコシル化タンパク質の計算上の分子量は34,699であ
り、 pＩは5.24である。相当するｍＲＮＡは2.4Kb 長で
あり、そして誘導された細胞のみから定常状態ＲＮＡで
ノーザンブロットで検出できる。

【０１２６】ヒトＣＬＭＦの35KDa サブユニットをコー
ドする cＤＮＡのクローニング 細胞培養、ｍＲＮＡの単離および cＤＮＡライブラリー
の確立は40KDa サブユニットのクローニングに関して先
に記載されたと同様にして行われた。

【０１２７】35KDa サブユニット cＤＮＡに特異的なＤ
ＮＡプローブの生成への混合プライマーＰＣＲの使用 精製35KDa サブユニットのＮ末端部分配列は ?NLPVATPD
PGMFP?LHHSQNLLRAV...である。混合プライマーＰＣＲに
用いるための２本のプライマーは標準操作により生成さ
れた。正方向のプライマーは上記配列中のアミノ酸 DPG
MFに相当するコード鎖として設計され、その配列にあり
うる全てのコドンを含有しそしてEcoRl部位および安定
性を付加する３個の付加的塩基を含む5'末端伸長部分を
有した。この正方向プライマーの配列は従って 5' CTC
GAA TTC GAT/C CCN GGN ATC TT -3'、すなわち32の異な
る配列を有する23マーであった。逆方向プライマーは同
じ方法で設計され、Ｎ末端部分配列のアミノ酸 NLLRAに
相当するアンチセンス鎖を示すものであった。この逆プ
ライマーは配列 5' CTC GAA TTC NGC NCG/T NAA/GNAA/G
A/GTT を有する、すなわち 4,096の異なる配列を有す
る24マーを有した。両プライマー配列において、Ｎは４
塩基の全てを表す。２本のプライマーは従ってアンプリ
コン塩基長を特定した。 EcoRlで切断してサブクローニ
ングするための付着末端を生成させた後にはアンプリコ
ン寸法は61塩基に低下する。ヒトゲノムＤＮＡの約３μ
g を10mMトリスHCl pH8.３／50mM KCl／1.5mM MgCl₂ ／
0.01％ゼラチン／４種のヌクレオチドをそれぞれ 200μ
M ／2.５単位の Taqポリメラーゼ／64ｐモルの正方向お
よび 2,048ｐモルの逆方向プライマー (２種のプライマ
ーの非常に異なる複雑さを補うために) の50μl 中で正
および逆方向プライマーを用いて増幅させた。ＰＣＲサ
イクルパラメーターは下記のとおりであった。最初の変
性は95℃で７分間。低緊縮アニーリングは２分以上37℃
にさまし、37℃で２分間インキュベートし、2.５分以上
72℃に加熱し、1.５分間72℃て伸張させ、１分以上95℃
に加熱し、そして95℃で１分間変性させることにより行
った。この低緊縮アニーリングサイクルをもう１回繰り
返した。その後、40回の標準サイクルを下記のように行
った。すなわち95℃で１分間、55℃で２分間そして72℃
で３分間。最後の伸張を72℃で10分間行った。試料の約
20％を６％ポリアクリルアミドゲルにかけ、臭化エチジ
ウムでゲルを染色した後に予想された寸法のアンプリコ
ンが検出された。試料の残りをフェノールで抽出し、エ
タノール沈降により濃縮しそして水17μl 中に再溶解し
た。試料を20μl 中の EcoRl酵素20単位を用いて37℃で
60分間消化した。試料を続いて８％ポリアクリルアミド
ゲルで分画し、そして61塩基対アンプリコンをゲルから
切り出して標準操作により溶離した。ＤＮＡアンプリコ
ンを標準操作によりブルースクリプトプラスミドSK＋
(Stratagene, La Jolla, CA) の EcoRl部位にサブクロ
ーンした。E.コリ株DH５の形質転換により得られたコロ
ニーを61塩基対挿入物の存在に関して分析した。２候補
を配列決定してサブクローンされたアンプリコンの配列
を決定した。２個のクローンのうち１個は正しい配列を
含有していた。なぜならこの配列を翻訳すると精製タン
パク質から予想されるアミノ酸配列を生じたからであ
る。この情報に基づき、下記の配列を有する２本の合成
オリゴヌクレオチドを設計した。

【０１２８】 5' gatccgggaatgttcccatgccttcaccactccc 3' 3'gtacggaagtggtgagggttttggaggatgcccga 5' かかる構造は放射性標識ヌクレオチドを用いることによ
りライブラリースクリーニング用に非常に高い比活性に
までクレノウフラグメントで標識できる。

【０１２９】cＤＮＡライブラリーのスクリーニング 増幅16時間ライブラリーから計10⁶ のクローンを40個の
二通りのフィルター上で上記プローブを用いて下記条件
の下でスクリーニングした。５×ＳＳＣ 400ml／20％ホ
ルムアミド／10×デンハード／100ug ／ml変性ウシ胸腺
ＤＮＡ／0.１％ＳＤＳ／3.８×10⁷ cpm 標識プローブの
存在下で一夜37℃。次にフィルターを40℃で２×ＳＳＣ
中で洗浄し、スクリーンを用いて一夜Ｘ線フィルムに曝
露した。陽性の可能性のある６検体をこの第１段階のス
クリーニングで拾い上げ、前記した第２段階のプラーク
ハイブリダイゼーションにより分析した。１つのクロー
ンを選択して最終的に分析した。ファージＤＮＡを調製
すると、このクローンは約0.８Kbおよび0.３Kbの大きさ
の２つのEcoRI フラグメントを含有することが解った。
この２つのフラグメントを別個に、ブルースクリプトSK
＋プラスミド中にサブクローンし、配列決定した。この
分析により、２つのフラグメントは一列に整列させると
天然に存在する内部 EcoRI部位を有する総長約1.１Kbの
連続する一つの配列を形成していることが示された。35
kDa ＣＬＭＦサブユニットの cＤＮＡの完全な配列およ
び推定アミノ酸配列を図26に示す。この cＤＮＡは１番
目の開始 Metで始まる219 アミノ酸オープンリーディン
グフレームをコードしている。続く21アミノ酸は標準的
疎水性シグナル配列を構成する。シグナルペプチドのす
ぐ後には、成熟35kDa タンパク質のＮ末端が配列 RNLPV
AT... で始まっている。精製した35kDa タンパク質は配
列 ?NLPVAT... を示した。即ち、成熟35kDa タンパク質
は３つのありうるＮ結合グリコシル化部位および７つの
Cys 残基を含有する197 アミノ酸からなる。成熟非グリ
コシル化タンパク質の分子量計算値は、22513 であり、
pＩは6.09である。相当するｍＲＮＡは長さ1.４Kbであ
り、少なくとも６時間ＣＬＭＦに関して誘導された細胞
からのＲＮＡにおいてのみ検出可能である。

【０１３０】ＣＯＳ細胞内での生物学的に活性な組み換
えＣＬＭＦの発現 ＣＬＭＦの２つのサブユニットを以下の通り操作して哺
乳類細胞内で発現させた。

【０１３１】49kDa サブユニット 40kDa ＣＬＭＦサブユニットの完全長 cＤＮＡを構成す
る２個のEcoRI フラグメントをpBC12 ［B. Cullen, Met
h. Enzymology 152: 684-703 (1987) 参照］と同様の発
現ベクターに連結したが、今回は cＤＮＡ発現はSV40初
期プロモーター／エンハンサーを用いて行なった。相互
に正しい方向で２個の挿入物を有するクローンを、40kD
a cＤＮＡ中の内部EcoRI 部位を包含する合成オリゴヌ
クレオチドを用いるコロニーハイブリダイゼーションに
より選択した。このオリゴヌクレオチドは以下の配列、
即ち、5' CTG AAG CCA TTA AAG AAT TCT CGG CAG GTG
3'を有していた。これを標準的な方法を用いてキナーゼ
処理することにより標識した。次に正方向プライマーと
してSV40初期プロモータの配列に特異的なプライマー
を、そして逆方向プライマーとして40kDa cＤＮＡ配列
位置 851−868 に相当するオリゴヌクレオチドを用い
て、ポリメラーゼ連鎖反応方法により、ベクターに対す
る挿入部分の適正な方向についてクローンを分析した。
正しい方向を有するクローンは885bp のＰＣＲアンプリ
コンを生じよう。試験した20クローン中の８つが予測し
たフラグメントを生じ、そして１つを選択してさらに調
べた。

【０１３２】35kDa サブユニット 35kDa サブユニットの完全長 cＤＮＡを、λgt10におけ
るEcoRI 部位の左および右に位置するプライマーを用い
て、ＰＣＲによりもとのλファージの外で増幅させた
(プライマーはNew England Biolab Articles No. 1231
および1232) 。得られたＰＣＲアンプリコンはブルース
クリプトプラスミドSK＋のEcoRI 部位に連結されたブラ
ント末端であり、そしてこのＤＮＡを増殖させた。ＤＮ
Ａ配列決定では、プラスミド内の cＤＮＡ挿入物の方向
は、ｍＲＮＡの5'末端に相当する cＤＮＡの末端がポリ
リンカー中のClaI部位に近接していることが示された。
従って挿入物はClaIで切断し、Ｔ4 ＤＮＡポリメラーゼ
でこの末端を充填し、そして二次的に NotＩで切断する
ことにより遊離された。生成するフラグメントをゲル精
製し、そしてブルースクリプトベクターに基づきかつSV
40初期プロモーターを含有する発現プラスミド中にサブ
クローンし、挿入された cＤＮＡを発現させた。使用し
た発現プラスミドの部位は cＤＮＡの5'末端のブラント
エンド PstＩ部位および3'末端の NotＩ部位であった。
１つのクローンを選択し、40kDa 構成物に関して上記し
たようなＰＣＲ法によりその構造を確認した後さらに調
査に用いた。

【０１３３】ＣＯＳ細胞における２種類の cＤＮＡ発現 40kDa および30kDa サブユニットの発現構成物に関する
ＤＮＡをCullen［Meth. Enzymology 152: 684 (1987)］
記載のＤＥＡＥデキストラントランスフェクション法
(７×10⁵ 細胞／塗布皿；１μg ＤＮＡ／皿) により直
径６cmのプレート上でＣＯＳ細胞 (ATCCより入手可能)
に導入した。トランスフェクション24時間後、ウシ胎児
血清のかわりに１％ヌトリドーマ (Nutridoma)を含有す
る標準組織培養用培地を細胞に与え、上清を40時間後に
回収し、0.45μのフィルターで濾過した。

【０１３４】35kDa ＣＬＭＦサブユニットまたは40kDa
ＣＬＭＦサブユニットをコードするcＤＮＡまたは両方
の cＤＮＡでトランスフェクションしたＣＯＳ細胞の培
養物の上清をＣＬＭＦ活性についてＴ細胞増殖因子アッ
セイにより検査した (第13表) 。表に示されるとおり、
サブユニット cＤＮＡの１方のみでトランスフェクショ
ンされたＣＯＳ細胞は生物学的に活性なＣＬＭＦを培養
液中に放出しなかった。しかしながら、両方のサブユニ
ット cＤＮＡトランスフェクションされたＣＯＳ細胞は
生物学的に活性なＣＬＭＦを産生した。二重にトランス
フェクションされたＣＯＳ細胞の培養液により誘導され
たリンパ芽球増殖の量を、精製ＮＣ−37−由来ＣＬＭＦ
で誘導された増殖量と比較することにより、培養液中の
ＣＬＭＦ濃度は 374単位／mlと推定された。８×10⁷ 単
位／mgＣＬＭＦタンパクなる比活性推定に基づけばこの
結果は二重にトランスフェクションされたＣＯＳ細胞の
培養物から得られた液体は組み換えＣＬＭＦを約4.７ng
／ml含有していることが示唆される。

【０１３５】

【表３】 抗ＣＬＭＦハイブリドーマおよび抗体 抗ＣＬＭＦハイブリドーマの調製、特性決定および精製 ルイスラット (Charles River Laboratories, Wilmingt
on, MA) を同量のフロインド完全アジュバント (Gibco)
と混合した部分精製ＣＬＭＦで腹腔内経路 (i.p.) によ
り初回免疫した。第14表の計画に従って、フロインド不
完全アジュバント (Gibco)と混合したＣＬＭＦのブース
ター免疫をラットに腹腔内注射した。活性化された脾臓
細胞を調製する為に、ラット１匹に、細胞融合４日前か
ら開始して連続２日間、部分精製ＣＬＭＦを静脈注射し
た (第14表) 。脾臓細胞をこのラットから単離し、そし
てＮＳＯ細胞［Galfre等、 Meth. Enzymol. 73: 3-46
(1981) ］と 1：1 の比 (脾臓細胞：ＮＳＯ細胞) で35
％ポリエチレングリコール (PEG 4000, E. Merck) を用
いて融合させた。ハイブリドーマ細胞融合における融合
相手として適するその他の細胞をＮＳＯ細胞の代わりに
使用することもできる。融合した細胞を15％ウシ胎児血
清 (ＦＢＳ) 、グルタミン (２mM) 、β−メルカプトエ
タノール (0.１ml) 、ゲルタマイシン (50μg ／ml) 、
ＨＥＰＥＳ (10mM) および15％ P388D1 細胞上清 (p388
D1細胞はATCCより入手可能) を補添したＩＭＤＭ［Isco
ve等、J. Exp. Med. 147: 923-933 (1978)］中、48ウェ
ルプレートに５×10⁴ 細胞／ウエル／mlの細胞密度で塗
布した。ハイブリドーマ上清を次の４アッセイ、即ち
１) ¹²⁵Ｉ−標識ＣＬＭＦによる免疫沈降、２) ＣＬＭ
Ｆ生物活性の免疫低下、３) ＣＬＭＦを用いたウエスタ
ンブロット、および４) ＰＨＡ活性化ＰＢＬ芽細胞への
¹²⁵Ｉ−ＣＬＭＦ結合の阻害により、特異的ＣＬＭＦ抗
体に関してスクリーニングした。抗ＣＬＭＦ抗体を分泌
するハイブリドーマ細胞系を限界希釈法によりクローニ
ングした。抗体は大規模ハイブリドーマ培養物または腹
水液から、製造者の指示書に従い架橋アガロースに結合
されたプロテインＧ上のアフィニティークロマトグラフ
ィーにより精製した (Gammabind G, Genex, Gaithersbu
rg, MD) 。

【０１３６】 第 14 表 免 疫 化 計 画： 日 程 CLMF(10^-8単位／mg) 総タンパク質 比活性 純 度 単位 μg (μg) (U/mg) (％) 3/28/89 1×10⁴ 0.1μg 15 6.7×10⁵ 6.7 4/10/89 1.2×10⁴ 0.1μg ? 6 ×10⁵ 0.6 5/3/89 第１回採血 5/18/89 2.2×10⁵ 2μg 75 2.9×10⁶ 2.9 6/7/89 第２回採血 6/29/89 6.3×10⁴ 0.63μg 83 7.5×10⁵ 0.75 7/21/89 1.2×10⁵ 1.2μg 24 5×10⁶ 5.0 8/2/89 第３回採血 10/19/89 2.1×10⁶ (i.v.) 10/20/89 2.1×10⁶ (i.v.) 10/23/89 融 合

【０１３７】ＣＬＭＦ特異的なモノクローナル抗体の単
離および同定 部分精製ＣＬＭＦで免疫したラットから第３回採血で単
離された血清 (第14表) はＴＧＦアッセイで測定してＣ
ＬＭＦ生物活性 (５単位／ml) を中和した (図27) 。こ
の中和は、過剰のＣＬＭＦ(200単位／ml) を添加するこ
とにより阻止でき、このことは抗血清による中和がＣＬ
ＭＦに対して特異的であることを示している (図27) 。
正常なラットの血清はＣＬＭＦ生物活性を中和しなかっ
た (図27) 。このラットから単離した脾臓細胞をＮＳＯ
細胞と融合させ、そして得られたハイブリドーマを、
¹²⁵I-標識ＣＬＭＦの免疫沈降によりＣＬＭＦ特異的抗
体について最初にスクリーニングした。

【０１３８】放射性ヨウ素化された部分精製ＣＬＭＦ標
品は主にＣＬＭＦ 75kDaヘテロダイマーを含有し、少量
の遊離ＣＬＭＦ 49kDaサブユニット、および約92kDa お
よび25kDa の２種類の別のタンパク質を含有していた
(図28) 。¹²⁵Ｉ−標識ＣＬＭＦ標品はＴＧＦアッセイに
おいてＣＬＭＦ生物活性を保持しており、このことは標
識化操作がＣＬＭＦ分子の配置を有意に変化させなかっ
たことを示している。ＣＬＭＦ免疫化ラット血清は、75
kDa のヘテロダイマーおよび遊離の40kDa サブユニット
(レーン６および８、図28) を免疫沈降させたのに対
し、正常ラット血清はこれらの放射性標識タンパク質を
免疫沈降させなかった (レーン７および９、図28) 。４
種類の別々のモノクローナル抗体もまた、75kDa ヘテロ
ダイマーおよび遊離の40kDa サブユニットを免疫沈降さ
せ (図28) たが、92kDa および25kDa の標識タンパク質
は免疫沈降させなかった。免疫沈降アッセイにより抗Ｃ
ＬＭＦ抗体を産生するハイブリドーマ20個が同定された
(第15表) 。ＳＤＳ／ＰＡＧＥおよびオートラジオグラ
フィーにより判定して全抗体が放射性標識75kDa ヘテロ
ダイマーおよび遊離の40kDa サブユニットを免疫沈降さ
せた (図28中において４種の代表的な抗体についてのデ
ータを示す) 。

【０１３９】

【表４】 1. ウエスタンブロット：N.R.は非還元、Red は還元Ｓ
ＤＳ／ＰＡＧＥ。ウエスタンブロットに関しては、５％
75kDa ヘテロダイマーおよび95％遊離40kDa サブユニッ
トを含有するＣＬＭＦ試料を10％ＳＤＳ／ＰＡＧＥ上で
分離し、ウエスタンブロットは方法に記載のとおり調製
した。ブロットは、強陽性(++)、陽性(+)、弱陽性(+/-)
および陰性(-) として採点した。

【０１４０】2. ＣＬＭＦレセプター結合アッセイ：Ｐ
ＨＡ活性化ＰＢＬ芽への放射性標識ＣＬＭＦの結合を60
％以上阻止した場合にその抗体を阻害作用ありとみなし
た。 3. ＴＧＦアッセイにより査定したＣＬＭＦ生物活性の
中和： 200μg ／mlで50％以上増殖を阻止した場合にそ
の抗体を中和作用ありとみなした。結果は陽性(+) また
は陰性(-) で示した。

【０１４１】4. ND：測定せず。 免疫沈降アッセイで特異的なＣＬＭＦ抗体を先ず同定し
た後に、ＴＧＦおよびＬＡＫ細胞誘導アッセイにより評
価して抗体のＣＬＭ生物活性免疫低下能を試験した。漸
増量のＣＬＭＦは、細胞分裂中の芽細胞への ³Ｈ−チミ
ジンの取り込みにより測定してＴＧＦアッセイにおける
ＰＢＬ芽の増殖を用量依存的に増大させる (図29) 。固
定化された抗ＣＬＭＦ抗体によるＣＬＭＦ活性の免疫低
下は、用量依存的様式で起る (図29) 。ハイブリドーマ
上清溶液の一部分 (0.４mlおよび0.１ml) により、培地
のＣＬＭＦ活性50および 200単位／mlが完全に失われよ
う。上清溶液0.025ml により、50単位／mlは完全に失わ
れようが、 200単位／mlは約50％しか失われないであろ
う。ハイブリドーマ上清の0.0062mlは50および 200単位
／mlのＣＬＭＦに対する低下作用が更に小さかった。抗
-IL-１レセプター抗体上清溶液の一部分 (0.４ml) はＣ
ＬＭＦ生物活性の免疫低下を全く示さなかった。

【０１４２】漸増量のＣＬＭＦはまた、ＬＡＫ細胞誘導
マイクロアッセイにおける⁵¹Crの放出により測定してＬ
ＡＫ細胞による標的細胞の溶解を用量依存的に増大させ
た (図30) 。固定化された抗ＣＬＭＦもまた、ＬＡＫ細
胞誘導アッセイにおいてＣＬＭＦ活性を用量依存的様式
で低下させる。これらのデータにより、放射性標識され
た部分精製ＣＬＭＦ標品からの75kDa 標識タンパク質を
免疫沈降させる抗体がＣＬＭＦに特異的であることが確
認される。このデータはまた、放射性標識75kDa タンパ
ク質がＣＬＭＦ生物活性の原因タンパク質であることを
示している。

【０１４３】モノクローナル抗体アッセイ法 ＣＬＭＦの精製および ¹²⁵ＩによるＣＬＭＦの標識化 ＣＬＭＦを前記したようにしてヒト末梢血液リンパ球
（ＰＢＬ）またはＮＣ−37細胞から調製した細胞上清か
ら部分精製した。この部分精製ＣＬＭＦをヨードゲン法
の変法により、 ¹²⁵Ｉで標識した。ヨードゲン(Pierce
Chemical Co.) を濃度0.５mg／mlでクロロホルムに溶解
し、そのうち0.１mlを12×75のホウケイ酸塩ガラスチュ
ーブに入れた。クロロホルムを窒素気流下に蒸発させヨ
ードゲンをガラスチューブ底部の中心で乾燥させた。こ
の被覆されたチューブを真空下に室温（ＲＴ）でデシケ
ーター中に保存した。放射性標識するには、0.５〜1.0m
Ciの¹²⁵Ｉ−Na(Amersham)を、トリス−ヨウ素化緩衝液
（25mMトリスHCl pH7.5, 0.4M NaCl, 1mM EDTA)50mlを
含有するヨードゲン被覆チューブに加えそして室温で４
分間インキュベートした。活性化された ¹²⁵Ｉ溶液をＣ
ＬＭＦ0.05〜0.１ml（0.125M NaCl.20mMトリスHCl pH7.
５中、約５μg)を含有する1.５mlチューブに移し、この
反応混合物を室温で更に８分間インキュベートした。イ
ンキュベーション終了時に、ヨードゲン停止緩衝液（ダ
ルベッコリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）中10mg／mlチロ
シン10％グルセロール. pH7.４）0.05mlを添加し、30秒
間反応させた。次に混合物をトリス−ヨウ素化緩衝液1.
０mlで希釈し、BioRad BioGel P10DG (BioRad Laborato
ries) 脱塩カラムに注いでクロマトクラフィーを行なっ
た。カラムをトリス−ヨウ素化緩衝液で溶離し、標識タ
ンパク質のピーク量を含有するフラクション（１ml）を
合わせてトリス−ヨウ素化緩衝液中0.25％ゼラチンで１
×10⁸ cpm/mlまで希釈した。ＴＣＡ沈殿可能な放射能
（10％トリクロロ酢酸最終濃度）は代表的には総放射能
の95％をこえていた。比放射能は 6000cpm/fモル〜10,0
00cpm/fモルの範囲であった。

【０１４４】ＣＬＭＦの免疫低下：ハイブリドーマ培養
上清または精製されたモノクローナル抗体のＣＬＭＦ免
疫低下能を以下のとおり調べた。ヤギ抗−ラットIgG-ア
ガロースビーズ (Sigma Chemical Co. St. Louis. MO)
を１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ)(Sigma)を添加した
ＰＢＳ(Gibco)(ＰＢＳ／ＢＳＡ溶液）10mlで３回洗浄し
た。洗浄後、ビーズを最終濃度50％vol/vol でＰＢＳ／
ＢＳＡ中に再懸濁した。ビーズ懸濁液の一部分（0.２m
l）を指示量のモノクローナル抗体またはハイブリドー
マ上清溶液とともに1.５mlのエッペンドルフチューブに
加えた。ハイブリドーマ維持培地［0.１％ウシ胎児血清
（ＦＢＳ) , 10％ Nutridoma-SP (Boehringer-Mannhei
m) および２mM L−グルタミンを添加したlscove変性ダ
ルベッコ培地（ＩＭＤＭ) ］を添加することにより各混
合物の容量を1.４mlとし、次のこの混合物を血液学／化
学ミキサー上室温で２時間インキュベートした。このイ
ンキュベート後、チューブをBeckman 微量遠心器12で遠
心分離し（セッティング５で1.５分）、上清を捨てた。
ビーズを再度、ＰＢＳ／ＢＳＡで３回洗浄し、次に５％
ヒトＡＢ血清および指示濃度の精製ヒトＣＬＭＦを含有
する組織培養培地（ＴＣＭ）１ml中に再懸濁した。次に
チューブをミキサー上４℃で一夜インキュベートした。
これに続きビーズを微量遠心器で遠心することにより除
去し、得られた免疫低下上清溶液の残存ＣＬＭＦ活性
を、ＴＧＦアッセイまたはＬＡＫ細胞誘導に関するマイ
クロアッセイにおいて測定した。

【０１４５】免疫沈降アッセイ：免疫沈降反応には、0.
05〜0.５mlのハイブリドーマ上清、希釈抗血清または精
製IgG を、アガロースに結合されたヤギ抗ラットIgG の
50％懸濁液 (Sigma Chemical Co.) 0.１mlを含有する1.
５mlの微量遠心管に入れた。アッセイ容量をＲＩＰＡ緩
衝液 (50mM NaPO₄ , pH7.5, 150mM NaCl.１％トリトン-
X 100, １％デオキシコール酸, 0.１％ＳＤＳ, １％Ｂ
ＳＡおよび5mM ＥＤＴＡ）を用いて0.５mlとし、この混
合物を室温で２時間、回転ミキサー上でインキュベート
した。12,000×ｇで１分間遠心分離することによりビー
ズをペレット化し、次に ¹²⁵I ＣＬＭＦを含有するＲＩ
ＰＡ緩衝液１ml (１×10⁵ cpm)中に再懸濁した。次にこ
の混合物を４℃で16時間、回転ミキサー上でインキュベ
ートした。このインキュベーションに続きビーズを遠心
分離してペレットとなしそしてＢＳＡを含有しないＲＩ
ＰＡで２回洗浄した。次にビーズを0.125MトリスHCl pH
6.８＋10％グリセロールで１回洗浄した。５％β−メル
カプトエタノール添加および無添加の２×サンプル緩衝
液(Laemmli, 前記）10μl を添加し、95℃で３分間加熱
することにより、固相抗体に結合された ¹²⁵Ｉ−ＣＬＭ
Ｆを遊離させた。免疫沈降 ¹²⁵Ｉ−ＣＬＭＦを10％また
は12％ポリアクリルアミドゲル上のＳＤＳ−ＰＡＧＥに
より分析し、オートラジオグラフィーで可視化した。

【０１４６】ＣＬＭＦレセプター結合アッセイ：ハイブ
リドーマ上清溶液、精製IgG または抗血清の、 ¹²⁵Ｉ−
ＣＬＭＦがＰＨＡ−活性化ヒトＴリンパ芽球に結合する
のを阻害する能力を以下のとおり測定した。培養上清、
精製IgG または抗血清の連続希釈物0.１mlづつを、 ¹²⁵
Ｉ−ＣＬＭＦ (１×10⁵ cpm)を含有する結合緩衝液 (Ｒ
ＰＭＩ−１６４０， ５％ FBS, 25mM HEPES pH7.4) 0.
025ml づつと混合した。この混合物を室温で１時間、軌
道振盪器上でインキュベートし、次に活性化芽細胞 (５
×10⁷ 細胞／ml) 0.025ml を各チューブに添加した。混
合物を室温で更に１時間インキュベートした。非特異的
結合は、アッセイ中に10nM未標識ＣＬＭＦを含めること
により測定した。インキュベーションは２通りまたは３
通りで行なった。細胞結合放射能はアッセイ内容物を油
状混合物 (Thomasシリコーン液6428-R15(A. H. Thomas)
とシリコーン油AR 200(Gallard-Schlessinger)の１：２
混合物）0.１mlを通して４℃で90秒間10,000×ｇで遠心
分離することにより、遊離¹²⁵Ｉ−ＣＬＭＦから分離し
た。細胞ペレットを含有する先端部分を切り出し、ガン
マカウンターで細胞結合放射能を測定した。

【０１４７】ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動
（ＳＤＳ／ＰＡＧＥ）およびウエスタンブロッティン
グ：免疫沈降させた ¹²⁵Ｉ−標識タンパク質および部分
精製ＣＬＭＦを、５％β−メルカプトエタノール添加ま
たは無添加のLaemmli 試料緩衝液(２％ＳＤＳ, 125mM
トリスHCl, pH6.8, 10％グリセロール, 0.025％ブロモ
フェノールブルー）で処理し、３分間95℃で加熱しそし
て7.５％または12％の成形済みゲル (BioRad Laborator
ies)上のＳＤＳ／ＰＡＧＥにより分離した。免疫沈降さ
せた ¹²⁵Ｉ−標識タンパク質については、ゲルを25％イ
ソプロビルアルコール＋10％酢酸中の0.２％クーマシー
ブリリアントブルーで染色し、10％メタノール＋10％酢
酸で汚れを落とし、乾燥しそしてオートラジオグラフィ
ーにより分析した。ウエスタンブロットするには、ＳＤ
Ｓ／ＰＡＧＥで分離したタンパク質を、10mMトリスHCl
pH8.3, 76.8mM グリシン, 20％メタノールおよび0.01％
ＳＤＳ中、100Vで16時間、ニトロセルロース膜 (0.２
μ) に移動させた。ニトロセルロース膜を、３％ゼラチ
ン、トリスHCl pH7.5, 0.15M NaCl 中37℃で１時間ブロ
ックし、次にＡＢ緩衝液 (１％ウシ血清アルブミン, 50
mMリン酸ナトリウムpH6.5,0.5M NaCl, 0.05％ツイーン2
0）で希釈したハイブリドーマ上清溶液または精製抗体
を用いて４℃で16時間探索した。洗浄緩衝液（ＰＢＳ,
0.05％ツイーン20）で洗浄した後、ニトロセルロースス
トリップをＡＢ緩衝液で希釈した、ペルオキシダーゼに
結合したヤギ抗−ラットIgG 抗体 (Boehringer Mannhei
m Biochemicals) と室温で２時間インキュベートした。
ニトロセルロース膜を洗浄緩衝液で洗浄し、４−クロロ
−１−ナフトール (0.15％ H₂O₂, 0.5M NaCl, 50mM ト
リスHCl, pH7.5中0.５mg／ml）と室温で30分間インキュ
ベートすることにより、結合された抗体を可視化した。
蒸留水で十分洗浄することにより、反応を停止させた。

【０１４８】モノクローナル抗体による結合ＣＬＭＦサ
ブユニットの同定：ＣＬＭＦは40kDa および35kDa のサ
ブユニットからなる75kDa ヘテロダイマータンパク質で
ある。ウエスタンブロット分析を用いて、モノクローナ
ル抗ＣＬＭＦ抗体が40kDa または35kDa のサブユニット
を認識するかどうか調べた。高度精製75kDa ＣＬＭＦヘ
テロダイマーを非還元型ＳＤＳ／ＰＡＧＥにより分離し
そしてニトロセルロース膜に移行させた（図31）。更
に、約95％の遊離40kDa サブユニットおよび５％の75kD
a ヘテロダイマーよりなる精製ＣＬＭＦを非還元型およ
び還元型両方のＳＤＳ／ＰＡＧＥにより分離し、そして
タンパク質をニトロセルロース膜に移行させた（図3
2）。非還元75kDa ＣＬＭＦヘテロダイマー（図31）、
非還元40kDa サブユニット（図32、上部パネル）、およ
び還元40kDa サブユニット（図32、下部パネル）を含有
する個々のニトロセルロースストリップを、モノクロー
ナル抗−ＣＬＭＦ抗体、対照モノクローナル抗体、ラッ
ト抗−ＣＬＭＦ血清および対照ラット血清を用いて探索
した。モノクローナル抗−ＣＬＭＦ抗体およびラットポ
リクローナル抗−ＣＬＭＦ抗体は非還元75kDa ＣＬＭＦ
を含有するストリップ上の約75kDa ヘテロダイマーに特
異的に結合するが、対照抗体標品はこの結合活性を示さ
ない（図31）。全てのモノクローナルおよびラットポリ
クローナル抗−ＣＬＭＦ抗体は非還元40kDa サブユニッ
ト（図32、上部パネル）を認識する。しかしながら、ラ
ットポリクローナル抗血清および３種類のモノクローナ
ル抗体、８Ｅ３，９Ｆ５および22Ｅ７のみが還元40kDa
サブユニットタンパク質に結合する（図32、下部パネ
ル）。これらのデータは、全てのモノクローナル抗体が
ＣＬＭＦの40kDa サブユニットに特異的であることを示
している。

【０１４９】ＰＨＡ活性化リンパ芽球上のＣＬＭＦレセ
プターの同定：前出のデータはモノクローナル抗−ＣＬ
ＭＦ抗体が ¹²⁵Ｉ標識ＣＬＭＦを免疫沈降させ、ＣＬＭ
Ｆ生物活性を免疫低下させ、そしてＣＬＭＦの40kDa サ
ブユニットに結合することを示した。しかしながら、ハ
イブリドーマ上清溶液中に存在する抗体がＴＧＦまたは
ＬＡＫ細胞誘導アッセイにおいてＣＬＭＦ生物活性を中
和する能力については、対照抗体を含有する上清溶液の
非特異的阻害作用ゆえに直接試験できなかった。IL-2モ
ノクローナル抗体を用いる我々の先の研究では、IL-2レ
セプター担持細胞への ¹²⁵I-IL-2の結合を阻止する抗体
はIL-2の生物活性も中和することが示されている。レセ
プター結合アッセイはハイブリドーマ上清溶液または他
の物質の添加によっては通常影響を受けないため、抗Ｃ
ＬＭＦ抗体の阻害／中和活性を評価するためにＣＬＭＦ
レセプター結合アッセイが開発された。ＣＬＭＦレセプ
ター結合アッセイは ¹²⁵Ｉ−標識ＣＬＭＦおよびＰＨＡ
−活性化末梢血液リンパ芽球により構成した（図33）。
ＰＨＡ−活性化リンパ芽球への ¹²⁵Ｉ−ＣＬＭＦの結合
は飽和可能かつ特異的であった（図33）。平衡結合デー
タをスカッチャードプロット分析 (Scatchard; Ann. N.
Y. Acad. Sci. 51:660-672 (1949)参照）したところ、
レセプターへの ¹²⁵Ｉ−ＣＬＭＦ結合の見かけの解離定
数は約200pMであり、そして各リンパ芽球は約 700〜800
個のレセプターを有することが示された。ＣＬＭＦで
免疫化されたラットの血清がＣＬＭＦ生物活性の中和を
示したため、これをリンパ芽球への ¹²⁵Ｉ−ＣＬＭＦ結
合を阻害する能力について試験した（図34）。ラット免
疫血清は約1/500 の希釈度で ¹²⁵Ｉ−標識ＣＬＭＦ結合
を50％阻止したが、対照ラット血清はこの希釈度では何
ら阻害作用を示さなかった。確立されたレセプター結合
アッセイの特異性を用いて、ハイブリドーマ上清溶液を
リンパ芽球への ¹²⁵Ｉ−ＣＬＭＦ結合を阻害する抗体に
関して調べた。

【０１５０】リンパ芽球への ¹²⁵Ｉ−ＣＬＭＦ結合の阻
害度は、各ハイブリドーマ上清溶液の1/2 希釈度で測定
した（図35）。12個のハイブリドーマ上清溶液はリンパ
芽球への ¹²⁵Ｉ−ＣＬＭＦの結合を60％以上阻害した。
これらの上清溶液中に存在する抗体は阻害／中和抗体と
して分類されている。６個のハイブリドーマ上清溶液
は、 ¹²⁵Ｉ標識ＣＬＭＦの結合を40％未満しか阻害せ
ず、これらは、非阻害／非中和抗体として分類された。
対照抗体はリンパ芽球への ¹²⁵Ｉ−ＣＬＭＦの結合を約
10％阻害した。

【０１５１】３種類の阻害抗体、７Ｂ２，２Ａ３および
４Ａ１、および２種類の非阻害抗体、６Ａ３および８Ｅ
３をGammaBind G (Genex, Gaithersburg, MD) カラム上
のプロテインＧアフィニティークロマトグラフィーによ
り腹水液から精製した。抗体４Ａ１，２Ａ３および７Ｂ
２はそれぞれIC₅₀濃度0.７μg/mlおよび9.５μg/mlでリ
ンパ芽球への ¹²⁵Ｉ−ＣＬＭＦの結合を用量依存的様式
で阻害する（図36）。抗体６Ａ３および８Ｅ３は 100μ
g/mlの濃度で ¹²⁵Ｉ−ＣＬＭＦの結合を阻止しない（図
36）。これらのデータは、各抗体が阻害または非阻害性
としてはじめに分類されていることが正しかったことを
示している。

【０１５２】抗体によるＣＬＭＦ生物活性の直接中和：
ＣＬＭＦレセプター結合アッセイにより「阻害性」と分
類された抗体がＣＬＭＦ生物活性を直接中和するかどう
かを調べるため、各阻害抗体の中和活性をＴＧＦアッセ
イにより調べた（第16表）。２種類の阻害性抗体、４Ａ
１および７Ｂ２は、0.03〜１00μg/mlでＣＬＭＦ生物活
性（40単位／ml）の用量依存性中和を示し、IC₅₀濃度は
それぞれ約１μg/mlおよび80μg/mlであった。これらの
データにより、ＣＬＭＦレセプターへの ¹²⁵Ｉ−ＣＬＭ
Ｆの結合を阻害する抗体はＣＬＭＦ生物活性にも阻害す
ることが確認された。

【０１５３】

【表５】 ＣＬＭＦの35,000ダルトンサブユニットの合成ペプチド
フラグメントに対する抗体の調製 35kDa ＣＬＭＦサブユニットのNH₂ −末端配列のアミノ
酸３−13およびCOOH−末端システインを含有するペプチ
ド(L-P-V-A-T-P-D-P-G-M-F-C) を固相ペプチド法により
合成し、ＨＰＬＣにより精製し、そしてメチル化ウシ血
清アルブミン法によりキーホールリンペットヘモシアニ
ンに接合させた。ウサギ２匹をフロインド完全アジュバ
ント中のこの接合タンパク(300μg ペプチド／ウサギ）
で皮内免疫した。免疫化６週間後、ウサギに遊離のペプ
チド(100μg 、静脈内）およびＫＬＨ接合ペプチド(150
μｇ, 皮下）をＰＢＳに溶解したものをブースターとし
て与えた。７日後、採血して血清試料を調製した。ブー
スター投与および採血の作業は４〜５週おきに反復し
た。各ウサギからの第１回および第２回目の採血で得た
血清試料を合成ペプチドとの反応に関して、直接ＥＬＩ
ＳＡアッセイにより評価した。合成の遊離ペプチドを４
ng／mlおよび20ng／mlでマイクロタイタープレート上に
被覆し、プレートを洗浄し、そしてウシ血清アルブミン
でブロックした。種々の希釈度（第17表）で血清試料を
検査し、抗体の反応性を基質としてｏ−フェニレンジア
ミンを用い、第２抗体（ＨＲＰ−接合ヤギ抗ウサギIgG)
を用いて検出した。反応を停止させるために硫酸を添加
した後に、吸光度値を490nm で読み取った。その結果に
よれば、35,000ダルトンＣＬＭＦペプチドに対する抗体
は両方のウサギで産出されていた（第17表）。別の実験
において、我々は、 (ａ) 非免疫化ウサギから得た血清
はＥＬＩＳＡにおいてペプチドと反応せず、 (ｂ) 合成
ペプチドで免疫したウサギから得た血清は40,000ダルト
ンＣＬＭＦサブユニットからのペプチドフラグメントと
は反応せず、そして (ｃ) 血清試料から精製したIgG は
合成ペプチドとも反応することから、この抗体はこのペ
プチドに対して特異的であることを証明した。

【０１５４】ウサギの１匹から得た血清試料（第１回採
血）を75kDa ＣＬＭＦ及び35kDa ＣＬＭＦサブユニット
との反応性に関してウエスタンブロット分析により検査
した（図37）。部分精製ＣＬＭＦ（約 120μg/ml）をＳ
ＤＳ／ＰＡＧＥで泳動し、ニトロセルロースに移行さ
せ、そしてウサギ抗ＣＬＭＦペプチド抗血清の 1：500
希釈物で処理した。抗体反応性は、ビオチニル化ヤギ抗
−ウサギIgG およびアルカリホスファターゼ接合ストレ
プトアビジンを用いることにより検出した。抗ＣＬＭＦ
ペプチド抗体は、非還元75kDa ＣＬＭＦタンパク質およ
び還元35kDa ＣＬＭＦサブユニットの両方と反応するこ
とが判明した（図37）。

【０１５５】この実施例で生成された抗体はポリクロー
ナルであるが、同様の方法を用いてＣＬＭＦの35kDa サ
ブユニットに対するモノクローナル抗体を調製すること
もできた。この実施例で使用した合成ペプチドまたは35
kDa ＣＬＭＦサブユニットのアミノ酸配列に基づく他の
合成ペプチド（図26）をラットの免疫化に使用できた。
上記したようにして融合を行ない、ハイブリドーマ培養
物をモノクローナル抗−ＣＬＭＦ抗体の産生に関してス
クリーニングした。

【０１５６】

【表６】

【図面の簡単な説明】

【図１】上清溶液をNu-Gel P-SP カラムにかけ、ＴＧＦ
活性を含有するタンパク質フラクションが塩グラジェン
トで溶離されることを示すプロット図。

【図２】図１に示される分離により得られたＴＧＦ活性
含有物質がブルーＢ−アガロース (Blue-B-Agarose) カ
ラムを通って塩グラジェント勾配で溶離されるプロット
図。

【図３】図２に示される分離から得られたＴＧＦ活性含
有物質がモノ (Mono) Ｑカラムを通ってNaClグラジェン
トで溶離されるプロット図。

【図４】図３は図示した工程から得られたフラクション
30から45までと、48および50のＳＤＳ−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動 (ＳＤＳ−ＰＡＧＥ) 分析を示す。

【図５】図３で示されるMono Qクロマトグラフィー分離
( 逆相ＨＰＬＣ) から得られたフラクション38を Vydac
ジフェニル (Diphenyl) カラムに通した溶離フロフィー
ルを示す図

【図６】 図５で示される分離工程から回収されたタン
パク質フラクション８５−９０のタンパク質純度のゲル
電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）分析を示す写真である。

【図 6】図５に示される分離工程から回収されたタンパ
ク質フラクション85−90のタンパク質純度のＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ分析を示す図。

【図７】 逆相ＨＰＬＣ分離から得られたフラクション
８７および８８を非還元および還元条件下でゲル電気泳
動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）分析した結果を示す写真であ
る。

【図８】ＮＣ37細胞からの上清溶液から得られたタンパ
ク質を Nu-Gel P-SPカラムにかけ、塩グラジェントで溶
離した溶離パターンを示す図。

【図９】図８に示されるNu-Gel P-SP カラム溶離により
得られた活性フラクションのブルー−Ｂ−アガロースカ
ラム塩グラジェント溶離プロフィール図。

【図10】図９に示される溶離により得られた活性フラク
ションのモノQ カラム塩グラジェント溶離プロフィール
図。

【図11】図10に示されるモノＱクロマトグラフィーから
得られた活性フラクション39および40の、Vydac ジフェ
ニルカラムを通した溶離パターン図。

【図１２】 図１１に示される分離工程から得られた活
性フラクションの還元条件下でのゲル電気泳動（ＳＤＳ
−ＰＡＧＥ）分析を示す写真である。

【図13】 ＣＬＭＦサイトカインの35kDa サブユニット
からの40kDa サブユニットの分離を表す模式図。

【図14】ＣＬＭＦサイトカインの40kDa サブユニットの
アミノ酸組成の決定、Ｎ−末端配列決定、タンパク分解
的消化および完全な配列決定を示す模式図。

【図15】ＣＬＭＦサイトカインの消化された40kDa サブ
ユニットのトリプシン処理ペプチドの分離を示す図。

【図16】スタフィロコッカス・アウレウス (Staphyloco
ccus aureus)Ｖ８プロテアーゼ消化を受けた40kDa サブ
ユニットＣＬＭＦのタンパク分解ペプチドの分離を示す
図。

【図17】ＣＬＭＦの40kDa サブユニットタンパク分解ペ
プチドの分析から得られたタンパク質構造に関する情報
を要約したチャート。。

【図１８】 図３に示されるＭｏｎｏ Ｑ ＦＰＬＣ溶
離プロフィールから得られたフラクション３９のゲル電
気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）分析を示す写真である。

【図19】逆相ＨＰＬＣによる35kDa サブユニットの精製
に関するもので、５％β−メルカプトエタノール中で還
元された Mono Q クロマトグラフィーのフラクション39
を Vydac C-18 カラムに通して溶離したパターンを示す
図。

【図２０】 図１９に示されるＶｙｄａｃ Ｃ−１８カ
ラム溶離プロフィールから得られたフルオレサミン陽性
フラクションの、非還元条件下でのゲル電気泳動（ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ）分析を示す写真である。

【図21】Mono Q クロマトグラフィーのフラクション36
および37のトリプシン消化物をYMC ODSカラムに通した
溶離パターンを示す図。

【図２２】 染色したＰＶＤＦ膜を示すゲル電気泳動の
写真である。

【図23】ＣＬＭＦをCNBrで分解することにより得られた
ペプチドフラグメントの逆相ＨＰＬＣ分離を示す図。

【図２４】 アガロース樹脂に共有されたモノクローナ
ル抗体７Ｂ２を用いるアフィニティクロマトグラフィー
によって精製された、純粋なＣＬＭＦおよび「遊離」の
会合していない４０ｋＤａ ＣＬＭＦサブユニットのゲ
ル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を示す写真である。

【図25】ヒトＣＬＭＦの40kDa サブユニットのＤＮＡ配
列および推定アミノ酸配列を示す図。

【図26】ＣＬＭＦの35kDa サブユニットの cＤＮＡ配列
および推定アミノ酸配列を示す図。

【図27】ＣＬＭＦで免疫したラット由来の、および非免
疫ラット (対照) 由来の血清によるＣＬＭＦ生物活性の
阻害を示す図。

【図２８】 ^１２Ｉ−ＣＬＭＦの、モノクローナル抗体
による免疫沈降反応、対照抗体による免疫沈降反応、免
疫ラット血清による免疫沈降反応、および正常ラット血
清による免疫沈降反応のゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ）分析を示す写真である。

【図29】ＣＬＭＦ生物活性 (ＴＧＦ活性) の、モノクロ
ーナル抗−ＣＬＭＦ抗体 (ａ−ＣＬＭＦ) による免疫低
下を示す図。

【図30】ＣＬＭＦ生物活性 (ＬＡＫ誘導活性) の、モノ
クローナル抗−ＣＬＭＦ抗体 (ａ−ＣＬＭＦ) による免
疫低下を示す図。

【図３１】 モノクローナル抗体（ｍＡｂ）７Ｂ２，４
Ａ１，８Ｅ３，６Ａ３，９Ｆ５および２Ａ３とＣＬＭＦ
７５ＫＤａヘテロダイマーとの反応性、およびラット
ポリクローナル抗−ＣＬＭＦ抗体（ＲＳ１）と同ヘテロ
ダイマーとの反応性に関するウェスタンブロット電気泳
動分析を示す図。

【図３２】 モノクローナルおよびラットポリクローナ
ル抗−ＣＬＭＦ抗体のＣＬＭＦ４０ｋＤａサブユニット
との反応性に関するウェスタンブロット電気泳動分析を
示す図。

【図33】¹²⁵Ｉ−ＣＬＭＦの、ＰＨＡ−活性化末梢血液
リンパ球 (ＰＢＬ) リンパ芽球との結合を示す図。

【図34】ＰＨＡ−活性化ＰＢＬ芽細胞に対する ¹²⁵Ｉ−
ＣＬＭＦの結合の、ラット抗−ＣＬＭＦ血清による阻害
を示す図。

【図35】ＰＨＡ−活性化ＰＢＬ芽細胞に対する ¹²⁵Ｉ−
ＣＬＭＦの結合の、モノクローナル抗体上清による阻害
を示す図。

【図36】 ＰＨＡ─活性化ＰＢＬ芽細胞に対する ¹²⁵Ｉ
−ＣＬＭＦの結合の、様々な濃度の精製モノクローナル
抗体による阻害を示す図。

【図３７】 ウサギポリクロナール抗−ＣＬＭＦ抗体と
７５ｋＤａ ＣＬＭＦ（非還元）との反応性、および３
５ｋＤａ ＣＬＭＦサブユニット（還元）との反応性に
関するウエスタンブロット電気泳動分析を示す写真であ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (72)発明者 ゲイトリー，モーリス，ケント アメリカ合衆国 ニュージャージー州 07058 モントヴィル，コナー アヴェ ニュー 162 (72)発明者 ガブラー，ウルリッチ，アンドリアス アメリカ合衆国 ニュージャージー州 07028 グレン リッジ，インズ プレ イス ４ (72)発明者 ハルムス，ジェフリー，ディヴィッド アメリカ合衆国 ニュージャージー州 07456 リングウッド，ウェルチ ロー ド 23 (72)発明者 パン，ユ−チング ユーゲン アメリカ合衆国 ニュージャージー州 07058 パイン ブルック，クレーン ドライヴ 10 (72)発明者 ポドラスキー，フランク，ジョン アメリカ合衆国 ニュージャージー州 10956 ニュー シティー，ロムバーデ ィ ドライヴ 28 (72)発明者 スターン，アルヴィン，セッチ アメリカ合衆国 ニュージャージー州 07055 パセック パーク，ブルック アヴェニュー 295 (56)参考文献 Ｊ．ＥＸＰ．ＭＥＤ（1989）Ｖｏｌ. 170，ｐ．827−845 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C07K 14/47 C12N 15/00 - 15/90 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ ｅｑ

Claims (23)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 および のアミノ酸配列からなり、少なくとも５．２×１０7単
   位／ｍｇの比活性を有し、Ｔ細胞増殖因子アッセイで活
   性な細胞障害性リンパ球成熟因子（ＣＬＭＦ）タンパク
   質。
2. 【請求項２】７５ｋＤａの分子量を有するＣＬＭＦの天
   然型である請求項１に記載のタンパク質。
3. 【請求項３】第１の４０ｋＤａサブユニットおよび第２
   の３５ｋＤａサブユニットを有するヘテロダイマータン
   パク質からなり、該第１および第２のサブユニットは、
   ジスルフィド結合を介して結合している、請求項１に記
   載のタンパク質。
4. 【請求項４】ＳＤＳ−ＰＡＧＥに続く銀染色で判断し
   て、少なくとも９５％のＣＬＭＦを有する、請求項１に
   記載のタンパク質。
5. 【請求項５】アミノ酸配列： を含有しそして場合によりＮ−末端Ｍｅｔ残基を有する
   請求項１に記載のタンパク質。
6. 【請求項６】アミノ酸配列： を含有しそして場合によりＮ−末端Ｍｅｔ残基を有する
   請求項１に記載のタンパク質。
7. 【請求項７】請求項１-6のいずれかに記載のタンパク質
   をコードする単離されたポリヌクレオチド。
8. 【請求項８】 である請求項７に記載のポリヌクレオチド。
9. 【請求項９】 である請求項７に記載のポリヌクレオチド。
10. 【請求項１０】請求項１−６のいずれかに記載のタンパ
    ク質をコードするポリヌクレオチドを含有する組換えベ
    クター。
11. 【請求項１１】請求項８に記載のヌクレオチド配列を有
    する、請求項１−６のいずれかに記載のタンパク質をコ
    ードするポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
12. 【請求項１２】請求項９に記載のヌクレオチド配列を有
    する、請求項１−６のいずれかに記載のタンパク質をコ
    ードするポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
13. 【請求項１３】請求項１０−１２のいずれかに記載の組
    換えベクターで形質転換された微生物。
14. 【請求項１４】 請求項１〜６のいずれかに記載のタン
    パク質を製造するに当たり、 （ａ）該タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含
    有する組換えベクターで形質転換された微生物を、該コ
    ードされたタンパク質を発現せしめる条件下に培地中で
    培養し、そして （ｂ）発現されたタンパク質を培地から回収する、こと
    からなる方法。
15. 【請求項１５】 請求項１〜６のいずれかに記載のタン
    パク質を製造するに当たり、 （ａ）該タンパク質のサブユニットペプチドを慣用のペ
    プチド合成法により調製し、そして （ｂ）該サブユニットペプチドをペプチド結合の形成に
    好都合な条件下にカップリングさせる、 ことからなる方法。
16. 【請求項１６】 細胞障害性リンパ球成熟因子（ＣＬＭ
    Ｆ）である請求項１記載のタンパク質を実質的に純粋な
    形態で製造するに当たり、 （ａ）ＣＬＭＦを生産しうる細胞例えばリンパ芽球細胞
    を刺激してサイトカインを生成させ上清液中に分泌さ
    せ、 （ｂ）該刺激された細胞により生産された上清液を収集
    し、 （ｃ）上清液をタンパク質フラクションに分離し、 （ｄ）各タンパク質フラクションをＣＬＭＦの存在に関
    してT細胞増殖因子アッセイを用いて検査し、 （ｅ）ＣＬＭＦを含有するタンパク質フラクションを保
    持し、そして （ｆ）該ＣＬＭＦ含有タンパク質フラクションからＣＬ
    ＭＦを、該アッセイで測定したとき少なくとも５．２×
    １０7単位／ｍｇの比活性を有し、純度が少なくとも９５
    ％である形態で単離する、 ことからなる方法。
17. 【請求項１７】 前記細胞がＮＣ−３７Ｂリンパ芽球細
    胞である請求項１６記載の方法。
18. 【請求項１８】 上清液を強力なカチオン交換カラムに
    よりタンパク質フラクションに分離する請求項１６記載
    の方法。
19. 【請求項１９】 上清液をスルホプロピルカチオン交換
    樹脂によりタンパク質フラクションに分離する請求項１
    ６記載の方法。
20. 【請求項２０】 上清液を強力なカチオン交換カラムに
    よりタンパク質フラクションに分離し、そして （ａ）ＣＬＭＦ含有タンパク質フラクションを、アガロ
    ースマトリックスに共有結合されたブルーＢ染料からな
    るアガロースゲルに通し、そして （ｂ）該アガロースゲルを通って溶離されたタンパク質
    フラクションをＣＬＭＦの存在に関して検査しそしてＣ
    ＬＭＦを含有するタンパク質フラクションを保持する、 ことをさらに包含する請求項１６記載の方法。
21. 【請求項２１】 上清液を強力なカチオン交換カラムに
    よりタンパク質フラクションに分離し、ＣＬＭＦ含有タ
    ンパク質フラクションを、アガロースマトリックスに共
    有結合されたブルーＢ染料からなるアガロースゲルに通
    し、該アガロースゲルを通って溶離されたタンパク質フ
    ラクションをＣＬＭＦの存在に関して検査し、ＣＬＭＦ
    を含有するタンパク質フラクションを保持し、そして （ａ）この方法で得られたＣＬＭＦ含有タンパク質フラ
    クションを高性能液体クロマトグラフィー様式または高
    速タンパク質液体クロマトグラフィー様式で強力アニオ
    ン交換により溶離してタンパク質フラクションを得、そ
    して （ｂ）該強力アニオン交換カラムを通って溶離されたタ
    ンパク質フラクションをＣＬＭＦの存在に関して検査し
    そしてＣＬＭＦを含有するタンパク質フラクションを保
    持する、 ことをさらに包含する請求項１６記載の方法。
22. 【請求項２２】 他のタンパク質と一緒にＣＬＭＦを含
    有する培養細胞から得られた上清液から請求項１記載の
    タンパク質を製造するに当たり、 （ａ）上清液をタンパク質フラクションに分離し、 （ｂ）各タンパク質フラクションを好適なアッセイを用
    いてＣＬＭＦの存在に関して検査し、 （ｃ）ＣＬＭＦを含有するタンパク質フラクションを保
    持し、そして （ｄ）該ＣＬＭＦ含有タンパク質フラクションからＣＬ
    ＭＦを、T細胞増殖因子アッセイで測定したとき少なく
    とも５．２×１０7単位／ｍｇの比活性を有し、純度が少
    なくとも９５％である形態で単離する、 ことからなる方法。
23. 【請求項２３】 請求項１〜６のいずれかに記載のタン
    パク質を生産しうる形質転換された微生物を製造するに
    当たり、 （ａ）請求項１〜６のいずれかに記載のタンパク質をコ
    ードするポリヌクレオチドを含有する組換えベクターで
    微生物を形質転換し、 （ｂ）該形質転換された微生物を培地中で増殖させ、そ
    して （ｃ）培地から微生物を回収する、 ことからなる方法。