BG60933B2

BG60933B2 - Цитотоксичен лимфоцитен фактор на съзряване и многоклонални антитела срещу него

Info

Publication number: BG60933B2
Application number: BG98632A
Authority: BG
Inventors: Richard Chizzonite; Maurice Gately; Ulrich Gubler; Jeffrey Hulmes; Yu-Ching Pan; Frank Podlaski; Alvin Stern
Original assignee: F. Hoffmann- La Roche Ag
Priority date: 1989-12-22
Filing date: 1994-03-01
Publication date: 1996-06-28
Also published as: DE69034247T2; JP2002167400A; CA2032653C; HU211879A9; JP3375949B2; NZ236545A; ATE368112T1; JPH05294999A; CA2032653A1; DK0790309T3; DK0790255T3; DE69034244T2; IE904694A1; ATE163675T1; EP0433827A3; EP0790309A1; EP0790308A1; ATE366311T1; EP0790255A2; IE990006A1

Abstract

Цитокиновият протеин, наречен цитотоксичен лимфоцитен фактор на съзряване (сlмf), се произвежда и синтезира от човешки в лимфобластоидна клетъчна линия. Сlмf синергитично индуцира в присъствие на ниски концентрации на il-2 цитолитичната активност налимфокинактивирани килърни клетки (lас) и стимулира растежа на т-клетки. Изобретението се отнася и до клонирани гени, клониращи сlмf протеини и технипроизводни, до рекомбинантни вектори, включващи полинуклеотид, кодиращ смlf протеин, до микроорганизми, трансформирани с рекомбинантните вектори, до антитела, насочени към посочените протеини, и до процеси за получаване на протеините, векторите и антителата. Изобретението се отнася също до методи застимулиране на lас клетки, т клетки или естествени килърни клетки, използващи сlмf протеина.

Description

(54) ЦИТОТОКСИЧЕН ЛИМФОЦИТЕН ФАКТОР НА СЪЗРЯВАНЕ И

МОНОКЛОНАЛНИ АНТИТЕЛА СРЕЩУ НЕГО

Настоящето изобретение се отнася до областта на цитокините , в частност, до тези цитокини, които в синергизъм с интерлевкин-2 (IL-2), активират цитотоксичните лимфоцити, такива като цитокин Цитотоксичен Лимфоцитен

Фактор на съзряване (CMLF). Настоящето изобретение се отнася също така до моноклонални антитела срещу него.

Цитокин” е термин за група от белтъчни клетъчни регулатори, различно наричани лимфокини, монокини, интерлевкини и интерферони, които се продуцират от различни клетки в тялото. Тези цитокини играят важна роля в много физиологични отговори, включени в патофизиологията на редица заболявания, и имат терапевтична способност. Те са хе терогенна група протеини, имащи следните общи характеристики. Те са секретирани протеини с ниско молекулно тегло Q 80 kDa), които често са гликозилирани;те са включени в имунитета и възпаленията,където те регулират амплитудата и продължителността на отговора; и обикновенно се произвеждат временно и локално, действувайки по-скоро по паракринен или автокринен, отколкото по ендокринен начин.Цитокините са изключително мощни, обикновено' действуващи в пикомоларни концентрации; и взаимодействуват с високоафинитетни повърхностни клетъчни рецептори, специфични за всеки цитокин или група цитокини. Тяхната клетъчна свързваща повърхност предимно води до промяна в модела на клетъчната РНК и белтъчния синтез и до промяна на клетъчното поведение. Отделни цитокини имат множество застъпващи се клетъчно-регулаторни действия.

Отговорът на клетката към даден цитокин зависи от локалната концентрация на цитокйа, от клетъчния тип, върху който той реагира, и от други клетъчни регулатори, на които той е изложен същевременно. Застъпващите се регулаторни действия на тези структурно несвързани белтъци, които се свързват към различни повърхностни клетъчни рецептори, са поне частично обяснени чрез индукция на общи белтъци, които могат да имат общи елементи на отговор в тяхната ДНК.

Цитокините взаимодействуват комплексно: първо, взаимно се индуцират; второ, трансмодулират цитокинови клетъчни повърхностни рецептори, и трето, чрез синергитични, допълнителни, или антагонистични взаимодействия върху клетъчната структура.[Immunology Today 10:299 (1989)]Голямата полза от цитокините при лечението на неоплазия и като имунозасилващи агенти бе демонстрирана напоследък в изследвания, използуващи човешки рекомбинантен интерлевкин-2 (rIL-2). Природният интерлевкин-2 (IL-2) е лимфокин, който се произвежда и секретира от Т-лимфоцити. Тази гликопротеинова молекула пряко се включва в индукцията на почти целия имунен отговор, при който играят роля Т-клетките. Отговорите на В клетките in vitro също са засилени от присъствието на IL-2. IL-2 е бил също така въвлечен като диференцирано индуциращ фактор под контрола на В и Т лимфоцитни отговори.

Прилагането на човешки rIL-2 е показало при някои случай достигане на регресия на установени тумори в двете експериментални животни [J. Exp . Med. 161:1169-1188 (1985)] и при човек [N. Engl. J. Med. 315:1485-1492 (1985) and Ν. Engl. J. Med. 516:889-897 (1987)]. Предполага се, че антитуморните ефекти на rIL-2 са медиирани от цитотоксичните ефекторни лимфоцити на гостоприемника, които са активирани от rIL-2 in vivo [J. Immunol. 159:285-294 (1987)]. В допълнение, резултатите от животински модели водят до предположение, че rIL-2 биха могли също така да имат стойност при лечението на някои инфекциозни заболявания [J. Immunol. 155: 4160-4165 (1985) and J. Virol. 61:2120-2127 (1987)] и при усъвършенствуването на хемотерапевтично-индуцирана имуносупресия [Immunol. Lett. 10:507-514 (1985)].

Обаче, клиничното използуване на rIL-2 е силно затруд нено от сериозните странични ефекти, които той може да предизвика [N. Engl. J. Med. 515:1485-1492 (1985) and N. Engl. J. Med. 516:889-897 (1987)]. Един начин _{( за} подобряване ефикасността на цитокиновата терапия, като същевременно се намалява токсичността, е да се използуват два или повече цитокина в комбинация. Например, синергитична антитуморна активност е била показана като резултат, когато rIL-2 се прилага върху тумор-носеща мишка заедно с рекомбинантен интерферон алфа (rIFR alpha) [Cancer Res. 48:260-264 (1988) and Cancer Res. 48:5810-5817 (1988)] или c рекомбинантен тумор некрозис фактор алфа (rTNF alpha) [Cancer Res. 47:5948-5955 (1987)]. Тъй като се предполага, че антитуморните ефекти на IL-2 се медиират от цитотоксичните ефекторни лимфоцити на гостоприемника, би представлявало интерес да се идентифицират и да се изолират нови цитокини, които синергират с rIL-2, за активиране цитотоксичните лимфоцити in vitro. Тези нови цитокини също така биха били полезни като антитуморни агенти, когато се прилагат в комбинации с rIL-2) in vivo. '

И така, настоящето изобретение осигурява нов цитокинов протеин наречен цитотоксичен фактор на съзряване (CLMF), кой- който се произвежда и синтезира от клетки'» способни да секретират CLMF. Примери за такива клетки са клетки от бозайници, в частност човешки лимфобластоидни клетки. При наличие на ниски концентрации на IL-2, CLMF синергитично индуцира цитолитичната активност на клетки на лимфокин активиран килър (LAC). CMLF е също така способен да стимулира растежа на Тклетките.

Настоящето изобретение обхваща процеса за изолиране на CLMF в значително чиста форма, който процес включва следните етапи :

а/ стимулиране на В лимфобластоидни клетки, като NC-37 клетките, за да произвеждат и секретират цитокини в супернатантната течност;

Ь/ отделяне на супернатантната течност, произведена от стимулираните клетки;

с/ разделяне на супернатантната течност на отделни белтъчни фракции;

d/ изследване на всяка белтъчна фракция за наличие на CLMF;

е/ запазване на белтъчните фракции, способни да стимулират Т-клетъчния растеж, като посочените фракции съдържат един активен протеин, който е отговорен за стимулиращата активност на белтъчните фракции върху Т-клетките;

f/ изолиране на посочения активен протеин в значително чиста форма, като посоченият протеин представлява Цитолитичен Лимфоцитен Фактор на съзряване (CLMF).

Полученият по този начин CLMF е свободен от други цитокинови протеини. Природният CLMF представлява 75 килодалтонов (kDa) хетеродимер, състоящ се от две полипептидни субединици, 40 kDa субединица и 35 kDa субединица, които са свързани заедно чрез една или повече дисулфидни връзки. Настоящето изобретение също така осигурява нуклеотидната последователност на CLMF гена и амино киселинната последователност на CLMF протеина, кодиран от посочения ген. На осно вата на информацията от тази последователност, могат да се приготвят производни на природния CLMF, които производни на CLMF протеина да притежават CLMF активност. Следователно, настоящето изобретение се отнася до протеин съдържащ Цитотоксичен Лимфоцитен фактор на съзряване (CLMF) в значително чиста форма, или протеин, който изразява CLMF активност и съдържа биологично активен участък от амино киселинната последователност на CLMF, или който притежава амино киселинна последователност на CLMF както и други амино киселини или протеини, съдържащи аналогични на CLMF последовтелности, или негови биологично активни фрагменти, чиито протеини експресират CLMF активност.

Горните етапи на процеса е/ и f/ могат да се използуват за пречистване на CLMF от всякаква течнот или флуид, които съдържат CLMF заедно с други протеини. Настоящето изобретение се отнася също така до белтъчни фракции, притежаващи CLMF активност, и които са способни да стимулират растежа на Т-клетките, до значително пречистен активен CLMF протеин, получен по горе описания процес, до изолираните, клонирани гени, кодиращи 40 kDa-та субединица и/или 35 kDa-та субединица, до вектори, съдържащи тези гени, до клетки-гостоприемници, трансформирани с векторите, съдържащи посочените гени, и до CLMF протеини и производни, приготвени в така 9 трансформираните клетки-гостоприемници. Освен това настоящето изобретение се отнася до метод за стимулиране на LAC клетките и Т-клетките, който метод включва третиране на тези клетки с CLMF самостоятелно или с IL-2. По-нататък, насто ящето изобретение се отнася ло изолирани поликлонални или моноклонални антитела, способни да се свържат към CLMF.

Моноклоналните антитела, приготвени срещу частично пречистен препарт на CLMF, се идентифицират и охарактеризират чрез 1: имунопреципитация на I-маркиран CLMF, 2: имуноизтощение на CLMF биоактивността, 3: western blotting на CLMF, 4: инхибиране на I-CLMF, свързан към клетъчния му рецептор и 5: неутрализация на биоактивността. Идентифицират се двадесет хибридоми, секретиращи анти-CLMF антитела. Установи се, че антителата имунопреципитират *** I-маркиран CLMF и имуноизтощават CLMF биоактивността, както е оценена от изследванията на Т-клетъчната пролиферация и LAK-клетъчната индукция. Western blot анализът показва, че всяко антитяло се свързва към 70 kDa-хетеродимер и към една от субединиците. Всяко от горе споменатите 20 анти-CLMF моноклонални антитела е специфично за CLMF и в частност за 40 kDa-вата субединица на CLMF. Разработва се CLMF рецептор-свързващо изследване за установяване способността на отделни антитела да инхибират свързания към неговия клетъчен рецептор CLMF. Изследването

Л 2 S’ измерва свързването на I-маркирания CLMF към РНА-активираните PBL бластни клетки, в присъствие или отсъствие на всяко антитяло. От изпробваните 20 антитела са установени 112 антитела, които инхибират над 60% свързването на Iмаркирания CLMF към бластните клетки. Две инхибиторни антитела, viz. 7В2 и 4А1, неутрализират CLMF биоактивността, докато едно неинхибиращо антитяло 8ЕЗ не неутрализира CLMF активността. Тези данни потвърждават, че антителата, които блокират свързването на I-маркирания CLMF към клетъчните му рецептори, неутрализират CLMF биоактивността, доколкото е оценена от изследванията на Т-клетъчната пролиферация и LAKклетъчното инхибиране. Способността на специфичните към 40 kDa-ова субединица на CLMF антитела да неутрализират CLMF биоактивността означава, че детерминантите върху 40 kDa-вата суб-единица са нужни за свързването към CLMF клетъчния рецептор .

Моноклоналните анти-CLMF антитела, съгласно настоящето изобретение, осигуряват мощни аналитични, диагностични и терапевтични агенти за имуноафинитетното пречистване на природния и рекомбинантния човешки CLMF, развитието на имуноизследването на човешки CLMF, идентифицирането на активния сайт на 40 kDa субединица на CLMF и могат да бъдат използувани за терапевтично третиране на пациенти, нуждаещи се от селективна : имуносупресия на цитотоксичните Т-клетки, както и при трансплантации. Моноклоналните антитела, които разпознават различни епитопи от човешки CLMF, могат да се използуват като реагенти при чуствителното двуетапно имуноизследване, за измерване количествата CLMF в биологични флуиди, в супернатанти от клетъчни култури и в човешки клетъчни екстракти.

Така, настоящето изобретение се отнася също до моноклонални антитела срещу CLMF, които показват многоброини удобства, включващи, но не ограничаващи се с :

. Използуване на моноклоналните антитела като афинитетни реагенти за пречистването на природния или рекомбинентния CLMF;

2. Използуване на моноклоналните антитела като реаген- ти за конфигуриране на ι имуноизследванията с ензим и изотопнитеι имуноизследвания, за измерване природния или рекомбкнантния CLMF в биологичните флуиди, супернатантите от клетъчни култури, клетъчни екстракти и върху плазмените мембрани на човешки клетки, и като реагент при изследванията за скриниране на лекарства;

3. Използуване на моноклоналните антитела като реагенти при конструирането на чувствително двустепенно имуноизследване, за измерване на CLMF в биологични флуиди, супернатантите от клетъчни култури и човешки клетъчни екстракти.

4. Използуване на моноклоналните антитела като реагенти за идентифициране детерминантите на 40 kDa субединица, които преципитират при свързване към 35 kDa субединица, и които преципитират при свързване към CLMF клетъчния рецептор;

5. Използуване на интактните IgG молекули, Fab фрагментите или хуманизираните IgG молекули от инхибиторните моноклонални антитела, като терапевтични средства за селективно блокиране пролиферацията d и активацията на цитотоксичните Т-клетки, както и при трансплантации.

КРАТКО ОПИСАНИЕ НА СХЕМИТЕ

Фигура 1. представлява графика на супернатантния разтвор, получен от култивираните NC37 лимфобластоидни клетки, приложени върху Nu-Gel P-SP колона, показваща белтъчната фракция, притежаваща TGF активност, която е елуирана със солеви градиент.

Фигура 2. представлява графика на материала, съдържащ TGF активност, получен при разделянето, показано на фигура 1, като се елуира със солеви градиент през В1ие-В-агарозна колона;

Фигура 3. показва графика на материала, съдържащ TGF активност, получен от разделянето, показано на фигура 2, като се елуира с градиент на NaCl през Mono Q колона;

Фигура 4 показва SDS-полиакриламиден гел електрофорезен (SDS-PAGE) анализ на фракциите 50-45, 48 и 50, получени от етапа, илюстриран на фигура 3. Цифрите от лявата страна, например 44 и 68, се отнасят до действителцота молекулно тегло на стандартни протеини от 44 и 68 kDa на ивица S.;

Фигура 5 показва профила на елуиране през Vydac дифенилова колона на фракция 38 от Mono Q хроматографското разделяне (обратно-фазова HPLC), показана на фигура 3;

Фигура 6 показва SDS-PAGE анализ на белтъчната чистота на белтъчни фракции 85-90, получени в; процеса на отделяне, изобразен на фигура 51

Фигура 7 показва SDS-PAGE анализ на фракции 87 ц 88 от обратно-фазовото HPLC отделяне при не-редуциращи (ивица А; без JB -меркаптоетанол) и редуциращи (ивица В; в присъствие на -меркаптоетанол) условия, показвайки CLMF със 75.000 молекулно тегло, разделен на две субединици от 40 kDa и 35 kDa. Останалите ивици в гела, показан на тази фигура, съдържат стандартни протеини, включващи 44 и 68 kDa маркерен протеин;

Фигура 8 показва профила на елуиране на протеините от супернатантния разтвор от NC-37 клетки, приложени на Nu-Gel P-SP колона и елуирани със солеви градиент;

Фигура 9 представлява Blue-B-агарозна колона с профил на елуиране със солеви градиент на активните фракции, получени чрез Nu-Gel P-SP колонно елуиране, показано на фигура 8;

Фигура 10 представлява профил на елуиране със солеви градиент през Mono-Q колона на активните фракции,получени от елуирането, показано на фигура 9]

Фигура 11 представлява образец на елуиране през Vydac дифенилна колона на активни фракции *59 и 40, получени от Mono-Q хроматографирането, показано на фигура 10;

Фигура 12 показва SDS-PAGE анализ при условия на редукция на активните фракции, получени при процеса на разделяне, показан на фигура 11;

Фигура 13 представлява схематична диаграма, изобразяваща отделянето на 40 kDa субединица от 35 kDa субединица на CLMF цитокина.

Фигура 14 представлява схематична диаграма, изобразяваща определянето на амино., киселинния състав , N-крайната последователност, протеолитичноторазграждане и пълното секвениране на 40 kDa субединица на CLMF цитокина;

Фигура 15 представлява отделянето на трипсиновите пептиди от разградената 40 kDa субединица на CLMF цитокина:

Фигура 16 показва разделянето на протиолитичните пептиди от разградената с протеаза от Staphylococcus aureus V8 40 kDa CLMF субединица ;

Фигура 17 представлява таблица обобщаваща информацията за белтъчната структура, получена от анализа на протеолитичните пептиди на 40 kDa субединица на CLMF. Използуват следните съкращения и символи :

N-t - N-крайно секвениране на интактен протеин

Тг - трипсинови пептиди от карта НР2383, номерирани по фракционния номер

V8 - V8 протеазни пептиди от карта НР2412, номерира -ни по фракционния номер ~ - означава възможен сайт на глмкозилиране; кути

-йките означават потенциални сайтове;

Фигура 18 показва SDS-PAGE анализ на фракция 39 от Моno-Q FPLC профил на елуиране, показан на фигура 3. Пътека А: стандартни протеини без -меркаптоетанол; пътека В: фракция 39 без β -меркаптоетанол; пътека С: фракция 39 с β -меркаптоетанол; пътека D: стандартни протеини с β -меркаптоетанол;

Фигура 19 се отнася до пречистването на 35 kDa субединица чрез обратно-фазова HPLC и изобразява модела на елуиране през Vydac С-18 колона на фракции 39 на Mono-Q хроматография, която се редуцира в 5“Х> β -меркаптоетанол;

Фигура 20 показва SDS-PAGE гел анализ при не-редуциращи условия на фракциите, които флуоресцентно положителни от профила на елуиране на Vydac С-18 колона, показан на фигура 19. S: = белтък-стандарт; F: = преминаващия поток; числата се отнасят до номера на фракцията;

Фигура 21 изобразява модела на елуиране на трипсиновото смилане на фракции 36 и 37 от Mono Q хроматографиране през

YMC ODS колона*,

Фигура 22 показва оцветената PVDF мембрана с цапаните ивици, съдържащи CNBr разграден CLMF преди (фигура 22 В) и след (фигура 22 А) изрязване на области от около 29, 25, 14, 12 и 9 kDa, съответно. Областите съдържат CNBr фрагментите, притежаващи следните последователности :

I (Р?) -P-K-N-L-Q-L-K-P-L-K-N-7-V-(Q? )- (нова последователност от 40 kDa протеин)

II ?-Q-K-A-(R?)-Q-T-L-E-F-Y-P-?-T- (нова последователност започваща при остатък No 30 от 35 kDa протеин)

III V-V-L-T-7-D-T-P-E-E-D-G-I-Т- (започва при остатък No 24 от 40 kDa протеин)

IV V-D-A-V-(H?)-K-L-K-Y-E-?-Y-T-?-?-F-F-I- (започва при остатък No 190 от 40 kDa протеин) забележка: приема се или е известно, че горните последователности се предхождат от Met остатък;

Фигура 23 показва обратно-фазово HPLC разделяне на пептидните фрагменти, получени чрез разцепване на CLMF с CNBr:

Фигура 24 показва SDS-PAGE на чист CLMF и свободна, несвързана 40 kDa субединица от CLMF, пречистена чрез афинитетна хроматография, използувайки моноклоналното антитяло 7В2, ковалентно свързано към агарозна смола, ивица, д_: маркерни протеини за молекулно тегло; ивица В: изходен материал; ивица 0. преминаващ поток; ивица D: кисел елуат; лъивица е- елуат с калиев тиоцианат;

Фигура 25 а, Ь, с и d показва ДНК последователността и произтичащата амино киселинна последователност на 40 kDa субединица на човешки CLMF,*

Фигура 26 а, Ь и с показва ДНК последователността и предполагаемата амино киселинна последователност на 55 kDa субединица на CLMF;

Фигура 27 изобразява инхибирането на CLMF биоактивността чрез серум от плъхове, имунизирани с CLMF и от неимунизирани плъхове (контроли);

Фигура 28 показва SDS-PAGE анализ на имунопреципитати на Ι-CLMF с моноклонални антитела 4А1 ( ивица . 1 ), 4D1 ( ивица 2), 8Е5 ( ивица 5) и 9С8 ( ивица _t 4), чврз контролно антитяло ( ивица 5), чрез имунен серум от плъх ( ивици 6 и 8) и нормален серум от плъх ( ивици 7 и 9)· От лявата страна е отбелязано молекулното тегло в kd.a;

Фигура 29 показва имуноизтощение на CLMF биоактивността (TGF активност) чрез моноклонални анти-CLMF антитела (аCLMF)ζ

Фигура 50 показва имуноизтощение на CLMF биоактивността (LAK индуцирана активност) чрез моноклонални анти-CLMF антитела (a-CLMF);

Фигура 51 показва Western blot анализ на реактивността на моноклоналните антитела (mAbs) 7В2, 4А1 , 8Е5, 6А5, 9F5 и 2А5, и поликлонални анти-CLMF антитела от плъх (RS1 ) с CLMF 75 kDa хетеродимера. NRS: = нормален серум от плъх;

Фигура 52 показва Western blot анализ на реактивността на моноклонални и плъши поликлонални анти-CLMF антиантитела с CLMF 40 kDa субединица. На ивици г. от 1 до 18 се използуват следните mAbs : 4А1,4D1, 7B2, 7A1 , 2A3, 1C1, 8E4, 8A2, 8E3 , 1B8, 4A6, 6A2, 8C4, 9F5, 6A3, 9C8, 8A1 и 22E7, съответно. На ивица 19 се използува контролно антитяло, на ивица 20 фузионен плъши серум, а на ивица 21 - нормален плъши серум;

Фигура 33 показва свързването на I-CLMF към РНА-активирани лимфоцитни лимфобласти от периферна кръв (PBL);

Фигура 34 показва инхибирането на I-CLMF, свързващ към РНА-активирани PBL бластни клетки чрез плъши анти-CLMF серум. Данните са изложени като количеството (¾ свързан) ^Si-CLMF, свързващ се към клетките в присъствие на означените концентрации на серума, отнесено към общото специфично свързване в отсъствие на серум;

Фигура 35 показва инхибирането на свързването на Iег

CLMF към РНА-активирани PBL бластни клетки чрез супернатанти на моноклонално антитяло. Данните са представени като % инхибиране на свързвания I-CLMF към клетките, в присъствие на 1:1 разреждане на супернатантата, отнесено към общото специфично свързване, в отсъствие на супернатанта на антитяло;

Фигура. 36 показва инхибирането на свързването на ICLMF към РНА-активирани PBL бластни клетки чрез различни концентрации на пречистени моноклонални антитела. Данните се изразяват като количеството (% срш свързан) на '’I-CLMF, свързан към клетките, в присъствие на посочените концентрации на антитяло, отнесено към общото специфично свързване, в отсъствие на антитяло;

Фигура 37 показва Western blot анализ на реактивността на заешко поликлонално анти-CLMF антитяло със 75 kDa CLMF (нередуцирана) и с 55 kDa CLMF субединицата (редуцирана). Антитялото се приготвя срещу синтетичен пептиден фрагмент от 55 kDa CLMF субединицата. ’ ивиците от 1 до 5 са без -меркаптоетанол; ивици от 6 до 10 са с /3 -меркаптоетанол.

ивици

1	1 у.л	CLMF
2	⁵ /^л	CLMF
5	6	CLMF
4	празна
5	празна
6	5 уМ л	предварително установени стандарти на

молекулно тегло

7	1 учл	CLMF
8	5 н л	CLMF
9	/ 6 JA Л	CLMF
10	10 л	предварително установени стандарти

молекулно тегло

Всички споменати тук публикации, както по-горе,' така и по-долу , са включени тук за справка.

CLMF активните протеини, съгласно настоящето изобретение, включват хомогенния природен CLMF протеин, така както и CLMF активните протеини, които съдържат биологично активен фрагмент от природни CLMF протеини, също както и фузионни протеини, например производни на CLMF протеина, включващи амино киселинната последователност на природния CLMF или негова частична последователност, заедно с амино киселинни по следователности, производни на други протеини. Протеините, .съгласно настоящето изобретение, притежават биологичната активност на CLMF, както е измерена при стандартни изследвания, такива като изследването на Т-клетъчния растежен фактор, както е описано в примера по-долу.

CLMF протеините, съгласно настоящето изобретение, включват също така и не срещащи се нормално в природата аналози на CLMF протеините, които притежават амино киселинна последователност, аналогична на амино киселинната последователност на CLMF или на неговите CLMF активни фрагменти. Такива аналози на CLMF протените са протеини,в които една или повече от амино киселините от природния CLMF или от неговите фрагменти са заместени или липсват без загуба на CLMF активност. Такива аналози могат да бъдат произведени по познати методи от : ^химията на пептидите, или по познати методи от рекомбинантната ДНК технология, такива като сайт насочения мутагенез. CLMF биологичната активност на всички протеини, съгласно настоящето изобретение, фрагментите и аналозите включително, може да бъде определена като се използува стандартното изследване за Т-клетъчния растежен фактор.

Съгласно настоящето изобретение, природниятCLMF се получава в чиста форма. Амино киселинните последователности на 55 kDa субединица и на 40 kDa субединица на CLMF протеина са изобразени на фигури 25 и 26. Основавайки се на тези последователности, , установени в съответствие с настоящето изобретение , могат да бъдат получени биологически активните аналози и фрагменти на CLMF протеина. Тези биологически активни протеини могат да бъдат получени по биологичен път, като се изопзуват стандартни методи от рекомбинантната ДНК технология или могат да бъдат химически синтезирани в амино киселинен синтезатор или чрез ръчен синтез използувайки добре известни методи за течен или твърдо фазов пептиден синтез. По по-

лобен начин	могат да бъдат произведени и аналози, фрагменти
и протеини,	съдържащи амино киселинна последователлност на
CLMF, заедно	с други амино киселинни последователности. Все-

ки от тези протеини могат да бъдат изследвани след това за CLMF активност.

Така, настоящето изобретение се отнася до протеин,притежаващ активност на Цитотоксичен Лимфоцитен г ' Фактор на съзряване (CLMF) в посъщество чиста форма, както CLMF протеина per se, или до производни на посочения протеин, които изразяват CLMF активност и съдържат поне част от амино киселинната последователноост на природната форма на CLMF.

Настоящето изобретение се отнася, също така до клонирани гени, кодиращи CLMF и до изолиран полинуклеотид, кодиращ протеин, както е дефиниран по-горе, който нуклеотид съдържа последователност, съответстваща на сДНК, кодираща CLMF, до рекомбинантни вектори, съдържащи полинуклеотид кодиращ CLMF протеин, до трансформирани със споменатите рекомбинантни вектори микроорганизми, до антитела насочени срещу споменатите протеини, както и до методите за изготвяне на посочените протеини, вектори и антитела. По-нататък, изобретението се отнася до методи за стимулиране на LAK клетки, Тклетки или природни килърни клетки, като се използува посо чения CLMF протеин.

Както е употребен тук, терминът полинуклеотид, съдържащ последователност, съответствуваща на сДНК, кодираща CLMF, означава, че полинуклеотидът съдържа последователност, която е хомоложна на или комплементарна на последователност в сДНК, кодираща CLMF. Степента на хомоложност или комплементарност към сДНК-το е приблизително 50% или по-висока, за предпочитане най-малко 70%, а още по- предпочитано наймалко 90%. Съответствието между CLMF последователността и сДНК може да се определи по добре известни от нивото техники, включително например, чрез директно сравняване на секвенирания материал с описаните сДНК, чрез хибридизационни експерименти, използувайки строги условия, които eg. приспособени към предполагаемата хомоложност на последователностите, с последващо разграждане с едноверижни нуклеази и чрез определяне размера на разграждане фрагменти.

Практически, настоящето изобретение използува, докато не е другояче посочено, конвенционални техники на молекулярната биология, микробиологията, рекомбинантната ДНК и имунологията, които се включват в умението на специалист в областта. Такива техники са широко обяснени в литературата. Виж например Maniatis, Fitsch & Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual (1982); DNA Cloning, volumes I and II (D.N. Glover ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames &

S.J. Higgins eds., 1984); Transcription and Translation (B.D. Harnes & S.J. Higgins eds., 1984); Animal Cell Culture ( R. I. Freshney ed., 1986); Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); the series, Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.H. Miller and M.P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory), Methods in Enzymology Vol. 154 and Vol 155 (Wu and Grossman, and Wu, eds., respectively); Immunochemical Methods in Cell Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., 1987, Academic Press, London), Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, second Edition (1987, SpringerVerlag, N.Y. ), and Hanbook of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D.M. Weir and C.C. Blackwell eds., 1986).

ДНК последователностите и ДНК молекулите, съгласно настоящето изобретение, могат да бъдат експресирани,като се използува широка гама на комбинации гостоприемник/вектор. Например, полезни вектори могат да бъдат съставени от сегменти от хромозомни, не-хромозомни и синтетични ДНК последователности. Пример за такива вектори са вирусните вектори, така както и многобройните известни произвордни на SV4O, бактериални вактори, такива като плазмиди от Е. coli, включително pCR1 , pBR322, рМВ9 и RP4, фагови ДНК, такива като многобройните производни на λ-фага, М15 и други нишковидни едноверижни ДНК-ови фаги, така както и вектори, използуващи се при дрожди, като 2уц плазмида, вектори, използуващи се в еукариотни клетки, за предпочитане вектори, използуващи се в животински клетки, като тези, съдържащи ДНК последователности, произхождащи от SV4O, аденовирус и/или ретровирус.

Употребяваните вектори могат, също така, да произхождат от комбинации на плазмиди и фагови ДНК, като плазмидите, модифицирани така, че да включват фагова ДНК или други тяхни производни.

Експресионните вектори, които могат да бъдат използу вани за изготвяне на рекомбинантни CLMF протеини се характе ризират с това, че съдържат поне една експресионна контролна последователност, която е оперативно свързана към CLMF ДНК последователността, инсер^ирана във вектора, с цел да се кон тролира и регулира експресията на клонираната CLMF ДНК последователност. Примери за такива употребявани експресионни контролни последователности са lac системата, trp системата, tac системата, trc системата, главните операторни и промоторни области на А-фага, контролната област на fd покрития протеин, гликолитичните промотори на дрождите, например промотора за

3-фосфоглицерат киназа, промоторите за дрождевата кисела фосфатаза, например Pho 5, промоторите на ^-свързващ фактор, и промотори, произхождащи θψ полимния ви — рус, аденовирус ретровирус, и саймиан вирус например ранните и късните промотори или SV4O, и други последователности, известни да контролират експресията на гените на прокариотни или еукариотни клетки и на техните вируси, така както и комбинации от посочените промоторно/опероторни по следователности.

Между такива използувани вектори са известни вектори, които правят възможна експресията на клонираните CLMF-свързани ДНК последователности в еукариотни гостоприемници, та22 кива като в животински и човешки клетки [например P.J.

Southern and Berg,

J. Mol. Appl. Genet.

327-41 (1982); S.

Subramani et al.

Mol. Cell. Biol. 1: 854-64 (1981); R.J.

Kaufmann and P. A.

Sharp ,

Mol. Cell. Biol. 159: 601-64 (1982 ) ; S. I.

Scahill et al. ,

Expression and

Characterization of The Product of Himan Immune Interferon

DNA Gene in Chinese Hamster Ovary Cells, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80: 4654-59 (1983); G. Urlaub and L.A. Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4216-20 (1989)].

Освен това, във всеки специфичен експресионен вектор, могат да бъдат избрани различни сайтове за инсертиране на CLMF-свързаните ДНК последователности на настоящето изобретение. Обикновено, тези сайтове се означават чрез рестрикционната ендонуклеаза, която ги срязва. Те са добре познати на специалистите в областта. Трябва, естествено, да се разбира, че един експресионен вектор, който се използува в настоящето изобретение, трябва да има рестрикционен ендонуклеазен сайт за инсертиране на избрания ДНК фрагмент. В замяна, векторът може да бъде присъединен към фрагмента по алтернативен път. Избраният в експресионния вектор сайт за

Т инсериране на избрания ДНК фрагмент и оперативното свързване на ДНК фрагмента към една експресионна контролна последователност, се определя от голям брой фактори, като броя на сайтовете, чувствителни към определен рестрикционен ензим, локализацията на стартовите и стоп колоните спрямо вектор ната последователност и желания метод за селекция на гостоприемниците, трансформирани с рекомбинантния вектор. Изборът на вектор и на инсерционен сайт за ДНК последователността, се определя от баланса между тези фактори, като не всички избори биха били еднакво ефективни за дадения случай.

Клетката-гостоприемник, използувана за експресията на

CLMF-свързаната ДНК	последователност, може да бъде избрана
измежду многобройни	известни гостоприемници. Примери за та-
кива гостоприемници	са прокариотните или еукариотните клет-

ки. Голям брой такива гостоприемници са предоставени от много депозитни институти, кати например the American Type Culture Collection (ATCC) или Deutsche Sammlung Fur Mikroorganismen (DSM). Примери за прокариотни клетъчни гос топриемници са бактериални щамове като Е. coli, В. subtiliis и други. Предпочитани гостоприемници са клетки от млекопитаещи, като клетъчна линия COS от бъбрек на африканска зелена маймуна, трансформирани с SV4O.

Не всички комбинации гостоприемник/ експресионен вектор функционират с еднаква ефективност при експресията на дадената последователност. Затова, специален избор на комбинацията гостоприемник/експресионен вектор, може да се извърши от специалистите в областта, след като се отдаде нужното на вече установените по-горе принципи, без да се отдалечава от обсега на изобретението. Например, изборът трябва да се основава върху баланса на много фактори. Това включва, напри мер, съвместимостта между гостоприемника и вектора, възпри емчивостта на протеините към протеолитично разграждане от ензимите на клетката гостоприемник, възможна контаминация на протеина, който ще бъде експресиран, от протеините на клет ката-гостоприемник, които трудно се отстраняват по време на пречистването, токсичност на протеините, кодирани от ДНК последователност към гостоприемника, лекота на извличане на желания протеин, експресионни характеристики на ДНК последователността и оперативно свързаната към тях експресионна контролна последователност, био-безопасност _> разходи и нагъване, форма и всички други нужни пост-експресиоини модификации на желания протеин.

Организмите гостоприемници, които съдържат експресионния вектор, включващ CLMF ДНК, обикновенно се отглеждат при условия, оптимални за растежа на организма-гостоприемник. Към края на експоненциалната фаза на растежа, когато . се мндуцира нарастването на броя на клетките з-а единица време намалява, се индуцира експресията на CLMF протеина, тоест, ДНК, кодираща протеина се транскрибира, а транскрибираната тРНК се транслира. Индукцията може да се повлияе, като се прибави индуциращ агент или депресор към хранителната среда или чрез промяна на физически параметър, например чрез промяна на температурата.

CLMF протеинът продуциран в организма-гостоприемник, може да бъде секретиран от клетката чрез специални транспортни механизми или може да бъде изолиран като се разруши клетката. Клетката може да бъде отворена чрез разрушаване _по механични начини (Charm et al., Meth. Enzymol. 22: 476-556 (1971)], чрез ензиматично третиране (например обработка с детергент, уреа или гуанидин»НС1 обработка, т.н.т.) или чрез тяхни комбинации.

При еукариотите, полипептидите, които се секретират от клетката се синтезират под формата на прекурсорна молекула. Зрелият протеин се получава , като се отцепи така-нареченият сигнален пептид. Тъй като прокариотните организми-гостоприемници не са способни да разцепят еукариотните сигнални пептиди от прекурсорните молекули, еукариотните полипептиди трябва да се експресират директно в тяхната зряла форма в прокариотните организми-гостоприемници. Транслационниятстартов сигнал AUG,който отговаря на кодона ATG на нивото на ДНК, е причина всички полипептиди да се синтезират в прокариотните организми-гостоприемници с метионинов устатък при Nкрая. В някои случаи, в зависимост от използуваната експресионна система и възможно в зависимост от полипептдда, който ше се експресира, този N-краен метионинов устатък се отцепва.

ПродуциранитбCLMF чрез ферментация на прокариотни и еукариотни клетки-гостоприемници, трансформирани с ДНК последователностите, съгласно настоящето изобретение, могат след това да бъдат пречистени до основна хомогенност чрез известни методи, такива като, например, чрез центрофугиране при различна скорост, чрез преципитация с амониев сулфат, чрез диализа (при нормално налягане или при намалено налягане), чрез препаративно изоелектрическо фокусиране, чрез препаративна гел електрофореза или чрез различни хроматографски методи, такива като гел-филтрация, високо ефективна течна хроматография (HPLC), йонообменна хроматография, обратно-фазова, хроматография и афинитетна хроматография (например върху

Sepharose Blue CL-6B или свързани c носителя моноклонални антитела, насочени срещу CLMF ).

Пречистеният CLMF протеин, съгласно настоящето изобретение, може да бъде използуван за приготвяне на LAK клетъчен и Т-клетъчен активатор и антитуморни състави и при методи за стимулиране на LAK клетки. Т-клетки или природни килърни клетки.

CLMF от настоящето изобретение, може също така да бъде анализиран,за да се определи активните сайтове за CLMF активност. Информацията от този анализ може да бъде използувана, за да се предскажат и продуцират фрагменти или пептиди, включително синтетични пептиди, притежаващи активността на CLMF. Измежду известните техники за определяне такива активни сайтове са ултравиолетова кристалография, ядрено магнитен резонанс, кръгов г дихроизъм, УВ спектроскопия и сайт специфичен мутагенез. Съответно, получените по този начин фрагменти, могат да бъдат използувани в методи за стимулиране на Т-клетки или LAK клетки.

CLMF протеините или производните, приготвени, съгласно настоящето изобретение, или фармацевтични състави, включващи CLMF протеина или производните, могат да бъдат прилагани на топлокръвни млекопитаещи за горе посочената клинична употреба. Прилагането може да се извърши по кой да е конвенционален начин на приложение на агенти, изразяващи антитуморна активност, както и чрез интралезионно или парентерално приin situ р 7 ложение, както и интравенозн&у^тГодкожно или интрамускулно.

Очевидно, нужната доза ще зависи от определените усовия на третиране, строгостта на условията, времетраенето на третирането и начина на приложение. Подходяща форма на дозировка за фармацевтична употреба, може да се получи от стерилно филтрирани, лиофилизирани протеини, възстановени преди да бъдат използувани по конвенционален начин. Включва се в умението на специалиста в областта да приготви фармацевтични състави, включващи CLMF протеин, съгласно настоящето изобретение, чрез смесване на посочения CLMF протеин със съвместими, фармацевтически приемливи материали-носители, като буфери, стабилизатори, бактериостатици и други ексципиенти и добавки, конвенционално употребявани при фармацевтични парентерални форми на дозиране. Настоящето изобретение се отнася също така до такива фармацевтични състави.

*·

Предпочитаната форма за приложение зависи от желания начин на приложение и терапевтичната апликация. Фармацевтичните състави, съдържащи CLMF протеин или производни пептиди, съгласно настоящето изобретение, също за предпочитане ще включват конвенционални фармацевтически приемливи носители и биха могли да включват други лекарствени агенти (например интерлевкин-2), носители, адюванти, ексципиенти и др. , например, човешки серумен албумин или плазмени препарати. За предпочитане съставите съгласно изобретението са под формата на единица доза и се прилагат обикновено един или повече пъти на ден. Единичната доза за предпочитане се пакетира в 1 мл-ови ампули, съдържащи ефективно количество от CLMF протеина или производните му, и при желание интерлевкин-2, в лиофилизирана форма. Ампулите, съдържащи CLMF протеина или производните, и при желание интерлевкин-2, за предпочитане се пакетират в контейнери заедно с писмени инструкции, описващи правилната употреба на фармацевтичния състав. Настоящето изобретение се отнася също така до такава единична доза, пакетирна в контейнер, за предпочитане заедно с отделна единична доза интерлевкин-2, а още по за предпочитане, заедно с подходящите инструкции. Освен това настоящето изобретение се отнася да метод за приготвяне на посочената единична доза.

С цел нашето тук описано изобретение да бъде по-пълно разбрано, са дадени следните примери. Трябва да се разбира, че тези прфимери са за илюстративни цели само и не трябва да се считат като ограничаващи настоящето изобретение по какъвто и да е начин към посочения тук най-подходящ вариант. Трябва да се отбележи, че името и доставчиците на специфичния продукт, посочени по-долу, не е задължително. Специалистът в областта е в състояние да избере алтернативни продукти от други доставчици.

ПРИМЕР

ПРЕЧИСТВАНЕ И ОХАРАКТЕРИЗИРАНЕ НА ЦИТОТОКСИЧНИЯ

ЛИМФОЦИТЕН ФАКТОР НА СЪЗРЯВАНЕ (CLNF)

Получаване на супернатантна течност, съдържаща CLMF Човешки NC-37 В лимфобластоидни клетки (ATCC CCL 214, American Type Culture Collection, Rockville, MD) се използуват за продуциране на CLMF. Тези клетки се поддържат чрез серийни пасажи в RPMI 1640 хранителна среда, към която са добавени 5¾ топлинно инактивиран (56 С, 30 мин) фетален телешки серум, 2 мМ L-глутамин, 100 единици/мл пенициллин и 100 г/мл стрептомицин (всичките хранителни среди за клетъчни култури са от Gibco Laboratories, Grand Island, NY).

Високо продуктивни сублинии на NC-37 клетките са получени чрез клониране при крайно разреждане в течни микрокултури. Всяка ямка от три Costar 3596 микропетрита (Costar Co., Cambridge, МА) получава 100 ]* л клетъчна суспенссия, съдържаща пет NC-37 клетки/мл. Хранителната среда, използувана за клонирането е смес 1:1 от свежа среда за псажите и филтрирана, кондиционирана среда от резервната (майчината) култура на родителските NC-37 клетки. Една седмица и две седмици след инициирането на културата, всяка от микрокултурите се подхранва с 50 j-л л смес 1:1 от свежа и кондиционирана хранителна среда. Между 3 и 4 седмици след инициирането на културата, съдържанието на ямките, съдържащи клонове от NC-37 клетки, се отделят и се прехвърлят в по-големи култури .

Когато броят на клетките в дадената сублиния надхвърли

1.4 х 10 , един милион клетки се стимулират да продуцират CLMF в 1 мл култури, съдържащи 3 нг/мл форбор 12- миристат 13-ацетат (РМА) (Sigma Chemicals Co., St. Louis, МО) и 100 нг/мл калциев йонофор А23187 (Sigma). Отделят се супернатантите от културите след 2 дена, диализират се срещу 50 обема Dulbecco’s фосфатен буфер във физиологичен разтвор (Gibco), като се използува Spectropor #1 тръба (Fisher Scientific) през нощта с една смяна на буфера, а след това в продължение на 4 часа срещу 50 обема RPMI 1640 среда с 50 ₍иг/мл гентамицин (и двете от Gibco) и се изследва за CLMF чрез изследването на Т клетъчния растежен фактор (виж по-долу). Идентифицират се три ^сУблинии , NC-57.89, NC-57.98 и NC57.102, които обикновено продуцират CLMF при титри >₇ 4 пъти титрите на родителската NC-57 клетъчна линия. Тъй като клетките от тези : сублинии[ продуцират CLMF при сходни титри (у 800 единици/мл), културалните супернатанти, произхождащи от трите подлинии, се обединяват,за да се използуват като изходен материал за пречистването на CLMF.

Масивната продукция на CLMF се осъществява при култивиране в колби с разклащане, на клатачка при 58 об/мин (Wheaton Cell Production Roller Apparatus Model II, Wheaton Instruments, Millville, NJ). Клетъчните суспензии; се приготвят така, че да съдържат 1-1.5 х 10 NC-57.89, NC-57.98 или

NC-57.102 клетки/мл в RPMI164O хранителна среда, с добавка на 1% Nutridoma-SP (Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN), 2 mM L-глутамин, 100 единици/мл пеницилин, 100 jo г/мл стрептомицин, 10 нг/мл РМА и 20-25 нг/мл калциев йонофор А25187. 250 до 550 мл аликвоти от клетъчните суспензии се прибавят към Falcon 5027 ролър колби за тъканни култури (Becton Dickinson, Lincoln Park, NJ), които са обгазени със смес от 5% С0₂ , 95% въздух. След това колбите се затварят плътно и се инкубират при 57С, при непрекъсното разклащане в продължение на три дена. На края на този период, културалните супернатанти се извличат. Прибавят се EDTA и фенилметилеулфонил флуорид (и двете от Boehringer

Mannheim) към културалните супернатанти при крайна концентрация от 1 мМ и 0.1 мМ, съответно, за забавяне на протеолитичното разграждане. Супернатантите се запазват при 4^С.

ИЗСЛЕДВАНЕ НА ЛИМФОКИН АКТИВИРАНА КИЛЪРНА (LAK)

КЛЕТЪЧНА ИНДУКЦИЯ (LCI)

Културалните супернатанти и хроматографските фракции се изследват за тяхната способност за синергизъм с rIL-2, за индуциране генерирането на цитолитични LAK клетки, както следва. Мононуклеарни клетки от човешка периферна кръв (РВМС) се изолират л&

следния метод. Кръв от нормални доброволни донори се вкарва в спринцовки, съдържащи достатъчно стерилен без консерванти хепарин (Sigma), за да се получи крайна концентрация от приблизително 5 единици/мл. Кръвта се разрежда 1:1 с балансиран солеви разтвор на Hanks (HBSS) без калций или магнезий (Gibco). След това разредената кръв се полага върху 15 мл аликвоти от Ficol1/натриев диатризоатен разтвор (Lymphocyte Separation Medium, Organon Teknika Corp., Durham, NC) в 50 мл Falcon 2098 центрофужни епруветки. Епруветките се центрофугират в продължение на 30 минути при стайна темпиратура, при 500 х g. След центрофугирането, клетките, плуващи във Ficoll/натриев дитриозоатния слой , се отделят и се разтварят чрез смесване с >_z 2 обема HBSS без калций или магнезий. Получената _L клетъчна суспензия, се полага след това върху 15 мл аликвоти от 20% захароза (Fisher) в RPMI 1640 среда с 1% човешки АВ серум (Irvine Scientific, Santa Ana, СА) въЪ Falcon 2098 центрофужни епруветки. Епруветките се центрофугират в продължение на 10 минути при стайна температура, при 500 х g, а супернатантните течности се изхвърлят. Клетъчните утайки се ресуспендират в 5 мл HBSS без калций или магнезий, отново се утаяват чрез центрофугиране, и накрая се ресуспендират в подходяща културална среда. Допълнително, : клетките· се отстраняват от РВМС чрез обработка с 5 мМ L-глутамат диметилов естер (Sigma), като се използуват същите условия, които са описани от Thiele et al., J. Immunol. 131: 2282-2290 (1983) за допълнително изчерпване на клектите с

L-левцин метилов естер, с изключение на това, че глутаматният естер се замества с левциновия естер.

Допълнителниятклетъчно-изпразнен РВМС, след това се фракционира чрез центрофугиране при непрекъснат Percoll плътностен градиент (Pharmacia, Piscataway, NJ), както е описано от Wong et al., Cell Immunol, 111: 59-54 (1988). Moнонуклеарните клетки, извлечени от 58, 41, 45 и 58¾ Percoll слоевете, се обединяват и се използуват като източник на LAK клетъчни прекурсори в опита. Получените клетки от Percoll градиента се промиват и суспендират в среда за тъканни култури (ТМС), съставена от смес 1:1 на RPMI 1640 и Dulbecco’s модифицирана Eagle’s среда, към която се прибавят 60 уиг/мл аргинин НС1, 10 мМ HEPES буфер, 2 мМ L-глутамин, 100 единици/мл пеницили, 1ОО у^г/мл стрептомицин (всички доставени от Gibco), 5 х Ю ⁵ М 2-меркаптоетанол (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ), 1 мг/мл декстроза (Fisher) и 5¾ човешки АВ серум (Irvine Scientific, Santa Ana, СА). Тези клетки се инкубират в 24-ямкови петрита за тъканна култура (Costar, Cambridge, МА) в 1 мл култури (7.5 х 10⁵ клетки/култури), към които се прибавя 10 М хидрокортизон натриев сукцинат (Sigma), за да се намали до минимум ендогенното производство на цитокини. Някои култури получават също човешки rIL-2 (доставен от Hoffmann-La Roche, Inc., Nutley, NJ) до крайна концентрация 5 единици/мл и/или супернатанти, които ще се изследват за CLMF активност. Всички култури се инкубират в продължение на 3-4 дни при 57 С, във влажна атмосфера с 5% CCL , 95% въздух.

В края на това инкубиране, съдържанието на всяка култура се прибира, а клетките се утаяват чрез центрофугиране и се ресуспендират в 0.5 мл свежа ТСМ. Една десета от мл аликвоти от тези клетъчни суспенсии се смесва с 0.1 мл аликвоти от Сг-маркиран К562 или Raji клетки (и двете клетъчни линии могат да бъдат цолучени от АТСС) и се изследват за тяхната литична активност в продължение на 5 часа ⁵¹Сг-освобождаване.

Методът за белязане на клетките-мишени с Сг и за осъществяване на цитолитичното изследване, е описан от Gately et al., [JNCI 69: 1245-1254 (1982)]. Процентът специфичен освободен ’^Сг се изчислява като [(е - с)/(100 - с)] х 100, където е е процента от освободения Сг от клетките-мишени инкубирани с лимфоцити, а с е процента от ³^Сг, спонтанно освободен от клетките-мишени, инкубирани сами. Общото количество освободен -^Сг се определя чрез лизис на клетките-мишени с 2% натриев додецил сулфат; виж Gately et al., JNCI

69: 1245-1254 (1982). Всички лимфоцитни популации се изследват четирикратно за литична активност.

LAK КЛЕТЪЧНО ИНДУКЦИОННО МИКРОИЗСЛЕДВАНЕ

Микроизследването за измерване < синергизма между rIL-2 и CLMF-съдържащи разтвори при индуцирането на човешки LAK клетки е същото както LAK клетъчното индукционно изследване, описано по-горе, но със следните модификации. Мононуклеарни клетки от човешка перифериална кръв, които са лишени от допълнителни клетки и фракционирани чрез Percoll градиентно центрофугиране, са описани по-горе, които се добавят към ямките на Costar 3596 микропетрита (5 х 10 клетки/ямка). Някои от ямкте получават също така rIL-2 (5 единици/мл крайна концентрация) и/или пречистен CLMF или имуно-лишени CLMFсъдържащи разтвори. Всички култури съдържат 10 М хидрокортизонов натриев сукцинат (Sigma) и се довеждат до общ обем от 0.1 мл чрез прибавяне на ТСМ с 5% човешки AB серум.

о

Културите се инкубират в продължение на 3 дена, на 37 С, след което се прибавя във всяка ямка по 1.0 мл от Сг-марки_z А раните К562 клетки (5 х 10 клетки/мл в ТСМ с 5% човешки серум). След това културите се инкубират при 37 С за едно денонощие. След това културите се центрофугират в продължение на 5 минути при 500 х g, а супернатантните разтвори се отделят, като се използува Skatron система за отделяне на супернатантата (Skatron, Sterling, VA) Количеството ³^Сг, освободено във всеки супернатантен разтвор,се измерва с гама брояч (Packard, Downer’s Grove, IL), а процента специфичен отделен ’^Сг се изчислява както е описано по-горе. Всички проби се изследват четирикратно.

ИЗСЛЕДВАНЕ НА ГЕНЕРИРАНЕ НА ЦИТОЛИТИЧЕН

Т ЛИМФОЦИТ (CTL)

Методите, използувани за генериране и измерване на литичната активност на човешки CTL,ca описани в детайли от Gately et al., в J. Immunol. 136: 1274-1282 (1986) и от Wong et al., в Cell. Immunol. 111: 39-54 (1988). Мононуклеарни клетки от периферна кръв се изолират от кръв на нормални до броволни донори, лишава се от допълнителни клетки чрез обработване с L-глутамат диметилов естер и се

Percoll градиентно центрофугиране, както е фракционира чрез описано по-горе.

Получените лимфоцити с висока плътност на границата между

45% и 58%

Percoll · слоевете се използуват като отговарящи лимфоцити в смесени лимфр.цит-туморни култури (MLTC). CTL се генерират в

MLTC в

24- ямкови петрита за тъканни култури ( Costar #3424) чрез инкубиране на Percoll градиент-производни едно с високо плътностни лимфоцити (7.5 х 10 култура) за1 х 10ⁱ УВ-облъчени меланомни клетки, например НТ144 (получени от АТСС) или с 5,.10 гама-облъчени меланомни клет ки, например НТ144 в ТСМ с 5% човешки АВ серум (1.2 мл/кул тура). За УВ-облъчването, НТ144 клетките се суспендират при плътност 11-1.5 х 1О^С клетки/мл в балансиран солеви разтвор на Hanks без фенол-ред (Gibco), съдържат 1% човешки АВ се рум. Един мл аликвоти от клетъчната суспензия се прибавят към 35 χ 10 мм пластмасови петрита за тъканни култури (Falcon #3001), и след това клетките се облъчват (960 в продължение на 5 минути), като се използува 254 нм

W/cm* лампа (модел ©

UVG-54 Mineralight lamp

Ultra-Violet Products,

Inc.,San Gabriel, СА). За гама облъчването, HT144 клетките се суспендират до плътност 1-5 х 10^ клетки/мл в ТСМ с 5% човешки АВ серум и се облъчват (10,000 rad) с помощта на излъчвател с цезиев източник (модел 143, J.L. Shephard and Associates, San Fernando, СА),. УВ или гама-облъчените HT144 клетки се центрофугират и се ресуспендират в ТМС с 5% човешки АВ серум до желаната кетъчна плътност за добавяне към MLTC. Допълнително към лимфоцитните и меланомните клетки, някои MLTC получават човешки rIL-2 и/или пречистен човешки CLMF при посочената концентрация. Хидрокортизонов натриев сукцинат (Sigma) се прибавя към MLTC до крайна концентрация 10 М (култури, съдържащи УВ-облъчени меланомни клетки) или 10’ М (култури, съдържащи гама-облъчени меланомни клетки), за да се премахне ендогенното производство на цитокини [S. Gillis et al.,m J. Immunol. 123: 1624-1631 (1979)] и за да се намали генерирането на неспецифични LAK клетки в културите [L.M. Muul and М.К. Gately, J. Immunol. 132: 1202-1207 (1984)]. Културата се инкубира при 37 С в навлажнена атмосфера с 5% CO, във въздуха, в продължение на 3 дена. На края на този период, лимфоцитите от репликиралите култури се обе диняват, центрофугират, ресуспендират в 1.2 мл ТСМ, съдържащ

5% човешки АВ серум , и се тестват за тяхната способност да лизират НТ1434 меланомни клетки, и като специфичен контрол,

К562 еритролевкемични клетки (които могат да бъдат получени от АТСС) в денонощно изследване за освобождаване на⁵¹ Сг. аликвоти—

Меланомните клетки и К562 клетките се маркират^Азг, натриев хромат, както е описано от Gately et al. , [JNCI 69: 1245-1254 (1982)]. По същия начин, измерването на лимфоцитмедиирания лизис на '’’^Cr-маркирните меланомни клетки се осъществява по начин, идентичен на този, описан от Gately et al., (ibid.) за количествения лизис на ^^УСг-маркирани К562 клетки, 0.1 мл али. квоти от лимфоцитните суспензии се смесват с 25 *4 л аликвоти от ^^Сг-маркирани К562 (2 х Ю⁵ клет ки/мл в ТСМ с 5% човешки АВ серум) в ямките на Costar 3696 half-area микротестови петрита. След денонощно инкубиране при 37° С , паничките се центрофугират в продължение на 5 минути при 1400 х g, и 50 л от културалната среда се< аспирира от всяка ямка. Количеството на Сг във всяка проба се измерва с гама-брояч (Packard), а специфичният процент освободен ^J^Cr се изчислява,както е описано по-горе. Всички опити се извършват четирикратно, а стойностите в таблицата (виж по-долу) представляват средните стойноссти + 1 S.E.M. от репликиралите проби.

ИЗСЛЕДВАНЕ НА Т-КЛЕТЪЧНИЯ РАСТЕЖЕН ФАКТОР

Способността на културалните супернатанти и хроматографските фракциии да стимулират пролифирациията на РНА-активираните човешки Т лимфобласти се измерва както следва. Човешки РВМС се изолират чрез центрофугиране при непрекъснат

Ficoll и захарозен градиент, както е описано по-горе за LCI изследването. РВМС (5 х 10 клетки/мл) се култивират при 57 С в ТСМ, съдържащ 0.1^ фитохемаглутинин-Р (РНА-Р) (Difco Laboratories, Detroit, MI). След 5 дена културите се разцепват 1:1 със свежа ТСМ, и се прибавят човешки rIL-2 към всяка култура, за да се постигне крайна концентрация от 50 единици/мл. След това културите се инкубират за допълнителни 1-2 дена, през което време клетките се отнемат, промиват се и се ресуспендират в ТСМ до 4 х 10клетки/мл. Към тази клетъчна суспензия се прибавя топлинно-инактивиран кози анти-човешки rIL-2 антисерум (крайно разреждане 1/200), за да се блокира всяка потенциална IL-2-индуцирана клетъчна пролиферация при опита. Този антисерум може да бъде приготвен, като се използуват добре известни от нивото методи или може да се получи от Genzyme Co., Boston, МА. Използуваният антисерум причинява 5016 неутрализация на 2единици/мл rIL-2 при разреждане на серума 1/20,000.

Петдесет

аликвоти от клетъчната суспенсия съдържаща анти-IL-2 антисерум се смесват с 50 у/ л аликвоти от серийни разреждания на културалните супернатанти или хроматографски фракции в ямките на Costar 5596 микропетрита. Културите се инкубират в пробължение на 1 ден при 57 С в навлажнена атмосфера с 516 СО^ във въздуха, и 50 л ³Н-тимидин (New England Nuclear, Boston, МА), 10уч кюри/мл в ТСМ, се прибавят след това във всяка ямка. След това културите се инку бират през нощта. След това културалното съдържимо се прехвърля върху стъклени фиброви филтри чрез клетъчен harvester (Cambridge Technology Inc., Cambridge, МА), и Н-тимидин инкорпорирането в клетъчната ДНК се измерва чрез течно сцинтилационно броене. Всички проби се изследват трикратно.

При пречистването на CLMF е нужно да се д&финират единиците за активност, с цел да се конструира крива на хроматографско елуиране и да се изчисли процента на получената активност и специфичната активноост на пречистения материал. За да се осъществи това, се използува частично пречистен препарат на човешки цитокини, получени чрез култивиране на РНА-активиран човешки РВМС с NC-37 клетки като стандарт. На препарта се назначава произволен титър от 2000 единици/мл. Няколко разреждания от този препарат се включват във всеки TGF или LAK индукционни изследвания. Получените резултати за стандартния препарат се използуват, за да се конструира крива на доза-отговор, от която би могло да се интерполира единица/мл от активността за всяка неизвеестна проба от тестваните разреждания. Умножаването на тези стойности по фактора на разреждане дава активността на изходната проба, изразена в единици/мл.

За изследването на неутрализацията на антителата, TGF изследването се модифицира както слледва. 25 jp л аликвоти от CLMF-съдържаща среда се смесват с 50J-* л аликвоти от серийните разреждания на антисерума или разтворите на антитела в ямките на Costar 3596 микропетритата. Смесите се инкубират в продължение на 30 минути при 37 С, след което се прибабвят към всяка ямка по 25 у* л аликвоти от суспензиите на j

РНА-активирани лимфобласти (8 х 10 /мл в ТСМ плюс 1:100 ан40

TH-rIL-2). След това културите се инкубират, бомбардират се

ТТ 3 с Н-тимидин, отделят се и се анализират за Н-тимидин инкорпориране, както е описано по-горе.

ИЗСЛЕДВАНЕ НА АКТИВИРАНЕТО НА ПРИРОДНИ

КИЛЪРНИ (NK) КЛЕТКИ j Пречистен CLMF се изследва за неговата способност да активира NK клетки, когато са добавени сами или в комбинация с rIL-2, както следва. Човешки РВМС се изолира чрез центрофугиране при непрекъснат Ficoll и захарозен градиент, както е описано по-горе,и се суспендират в RPMI 1640 среда, към която са прибавени 10% топлинно-инактивиран серум от говежди зародиш ,100 гдиници / мл мМ L-глутамин. РВМС ю⁶ мл култура (5 х пречистен / CLMF, пеницилин, 100л/мл стрептомицин и

С в 1 се инкубират през нощта при 37 клетки/култура) заедно с rIL-2 и/или при различни концентрации. След 18-20 часа, съдържанието на културите се събира и се центрофугира, а клетките се ресуспендират в същата среда, която се използува за нощните култури. Цитолитичната активност на култивираните РВМС се изследва след това при свободен Сг из следване, както е описано по-горе.

КОНЦЕНТРИРАНЕ НА КЛЕТЪЧНИТЕ СУПЕРНАТАНТНИ РАЗТВОРИ

Запазени, замр^азени, сурови, човешки CLMF супернатантни разтвори,възлизащи на 60 литра, приготвени от няколко групи индуцирани NC-37 клетки, се обединяват и концентрират 30 пъти, като се използува Pellicon Cassette System (30,000 NMWL PTTK00005; Millipore Corp., Bedford, МА). След концентриране до желания обем от приблизително 1.9 литра, се осъществява замяна на буфера с 10 мМ MES , pH доведен до 6.0 с 10 N NaOH. Концентратът се центрофугира при 10,000 х g в продъли жение на 10 минути при 4 С, а преципитата се изхвърля.

ЙОНООБМЕННА ХРОМАТОГРАФИЯ ВЪРХУ NuGel P-SP КОЛОНА

Концентираният супернатантен разтвор се прилага при скорост на потока 120 мл/час върху Nu-Gel P-SP (Separation Industries, Metuchen, NJ) колона (5x5 см), калибрирана с *г мМ MES, pH 6.0. Колоната се промива,докато се получи базовата абсорбция при 280 нм. Абсорбираните протеини се елуират след това с 500 мл солеви градиент от 0 до 0.5 М NaCl/10 мМ MES, pH 6.0 при скорост на потока 2 мл/минута (Фиг. 1).

Аликвотни количества от фракциите се изследват за Т клетъчен растежен фактор (TGF) активност. Фракциите,притежаващи TGF активност, се обединяват и диализират (Spectra/Por 7, Fisher Scientific) срещу 50 обема 20 мМ Tris/HCl, pH 7.5, с цел да се намали солевата концентрация на препарата с 50 пъти.

ЦВЕТНА АФИНИТЕТНАХРОМАТОГРАФИЯВЪРХУ BLUE

Β-ΑΓΑΡ03ΗΑ КОЛОНА

Диализираната проба се центрофугира при 10,000 х g в продължение на 10 минути при 4°С, а преципитата се изхвърля. Супернатантниятразтвор се прилага при скорост 20 мл/час върху Blue В-агарозна (Amicon, Danvers, МА) колона (2.5 х 10 см), калибрирана с 20 мМ Tris/HCl, pH 7.5. Колоната се промива със същия този буфер, докато се достигне базовата абсорбция при 280 нм. Абсорбираните протеини се елуират след това с 500 мл солеви градиент от 0 до 0.5 М NaCl/20 мМ Tris/HCl, pH

7.5 при скорост на потока 15 мл/час (фиг. 2). Аликвотни количества от фраркциите се изследват за TGF активност. Фракциите, притежаващи TGF активност,се обединяват и анализират (Spectra/Por 7, Fisher Scientific) срещу 100 обема 20 мМ Tris/HCl, pH 7.5, с цел да се намали солевата концентрация на препарата със 100 пъти.

ЙОНООБМЕННА ХРОМАТОГРАФИЯ ВЪРХУ MONO Q ХРОМАТОГРАФ

Диализираните проби се филтруват през 0.45ρ м целулозен ацетатен филтър (Nalgene Co., Rochester, NY) и филтратът се прилага при скорост 60 мл/час върху Mono Q HR 5/5 (Pharmacia LKB Biotechnology, Inc., Piscataway, NJ) колона (5 x 5 мм), калибрирана c 20 mM Tris/HCl, pH 7.5. Колоната се промива със същия този буфер, докато се достигне базовата абсорбция при 280 нм. Абсорбираните протеини се елуират след това с 1 hr линеен солеви градиент от 0 до 0.25 М NaCl/20 mM Tris/HCl, pH 7.5 при скорост 60 мл/час (фиг. 3). Аликвотни количества от фракциите се изследват за TGF активност и чистотата на протеините се преценява без редукция на SDS-PAGE [Laemmli, Nature (London) 227: 680-685 (1970)], използувайки 12% вискозни телове. Теловете се багрят със сребро [Morrissey, Anal. Biochem. 117: 1-7-510 (1981)], за да се онагледят протеините (фиг. 4). Фракции 36 и 37 са с чистота над 95% и разкриват най-ширака ивица при молекулно тегло 75,000. Фракции 38 до 41, притежаващи TGF активност, разкриват 75 kDa протеин чрез SDS-PAGE с големи контаминанти при 55,000 и 40,000 молекулно тегло.

Следователно, за да се елеминират тези контаминирани протеини, фракция 38 от предхождащата Mono Q хроматография се разреждат 1:1 об/об с 8 М уреа и се изпомпва върху Vydac дифенилна колона, като се използува обратно-фазова HPLC обогатителна техника. След това колоната се промива с 5 мл 0.1% трифлуорооцетна киселина. Елуирането на протеините се извършва с градиент от 0-70% ацетонитрил над 7 часа в 0.1% трифлуорооцетна киселина (фиг. 5). Аликвоти от фракциите се изследват за TGF активност. Чистотата на протеина на фракциите, притежаващи TGF активност се изследва чрез SDSb-PAGE при не редуциращи условия, като се използува 10% вискозен гел. Гелът се багри със сребро^за да се визуализира протеина (фиг. 6). Фракции 86 до 90 са с над 95% чистота и показват протеин с молекулно тегло 75,000. Фракции 87 и 88 се обединяват и аликвотни количества се анализират чрез SDS-PAGE при редуциращи условия (в присъствие на -меркаптоетанол) и при не-редуциращи условия (в отсъствие на β -меркаптоетанол). При редуциращите условия, CLMF с молекулно тегло 75,000 се отделя в две субединици от 40,000 и 35,000 далтона (фиг. 7).

е: w <

I I I

I

1 1	o	o	O	o	o	o
fl	ί-	1
X	ο	1		X	X	X	X	X	X
7	0	u 1	Q
X	X	X I	z	in	CO		IT)		O)
е	й	\ 1		•	•	«	.	•
X	X	□ 1		00	СЧ	1-^	00	00	in
а	h	1

I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I

c	X	— 1	V}	^4
X	X	“ 1		o	o		Γ	00
X	0	X 1	Q	¢0	Г-	СЧ	o	o
—	ί-	\ 1	Z	•	•	•
o	ο	u 1			o	o	o	o
Ό	a	X 1
o	X	1

I I

I

Дифенилни фракции 87+88 1.1 5.74 х 10 5.22 х 10 0.008 0.010

X	X a X	1 1 ~ 1	o	o	o	o	o	X
3	X	2 1	X	X	X	X	X
o	X	1						in
	4	1		o	00
	o	1	-	.	.	•	.	•
		1 1 1	v—H	<n	i—4	i—4	40	o
s	ί-	1 1 1	o	o	o	o	o	O
X	ο	1		»4	i-4	i—4	1—4	1—4
0	0	— 1
X	X	X 1	X	X	X	X	X	X
X	Д	X 1
4	X	\ 1	00	r-	o	i—4	o	o
4)	b	O 1	<n	<П	o			<34
lO	X	1	•	•	.	•	•	•
o	X	1 1 1	<N	1-^	сч	O	40	Ю
		I 1 1	O	O
X		— 1	O	rt	o	Ю	*4
0		X 1	o	σ\	σ\			in
\0		X 1	-	•
o		'-r 1	o	r-4

I I

I

	1			X			es
	1			X			m		СЧ
	1		g	Λ	-		n		rt
	1		b	X			a		1
	1		X	a	b	a	as	Γ-	00
	1 X		fl	L.	fl	co	1-.	ΓΊ	<n
	1 X	X	Ι-	a	a	1	fl
X	1 0)	X	οί	X	h	a	1	X	«
X	1 X	7	X	e	X		co	o s	O' X
E	1 X	fl	№	X	Φ	—<	1	a	a
fl	1 4	ί-	o	a	a	<u	0)	o X	o x
h	1 Φ	ο	E	h	X	o	a	c «	c fl
U	1 Ό	4	>»		0	a	—	o a	o a
	1 0	X	o	>>	X	z	»	3E -e	г o

Налага се изводът, че CLMF представлява 75 kDa хетеродимер, съставен от 40 kDA и 35 kDa субединици, свързани с дисулфидна връзка. Пълното пречистване на CLMF, което се осъществява, е показано на таблица 1 . Съдържанието на протеин от Mono Q и Vydac дифенил-пречистения материал се изчичслява на базата на амино киселинен анализ. Получава се специфична активност от 8.5 х 10’ единици/мг и 5.2 х 10^ единици/мг за Mono Q и Vydac дифенил-пречистения материал, съответно. Фактьт^че дифенил-пречиистеният протеин е с незначително по-ниска специфична активност от Mono Q-пречистения материал, може да се дължи на инактивиране или денатуриране на някои от CLMF молекулите от елуентните разтворителли при HPLC (например ацетонитрил в 0.1% трифлуороцетна киселина).

ЛеХИМИЧЕСКО ОХАРАКТЕРИЗИРАНЕ

Способността да се приготви хомогенен CLMF дава възможност за първи път да се определи амино киселинния състав и частичен секвенционен анализ на срещащия се в природата CLMF протеин. Между 10 и 20 пикомола от Mono Q-пречистения CLMF се подлагат на хидролиза, и се определя неговия амино киселинен състав(таблица 2). Не се определят (ND) пролин, цистеин и триптофан. Количественото определлялне на хистидин не е възможно поради големия артефактен пик, свързан с Tris, който се елуира заедно с His (*).

Между 5 и 30 пикомола дифенил-пречиистен CLMF се подлагат на хидролиза със и без предварителна обработка с пер мравчена киселина. Така се получава пълния амино киселинен състав (таблица 3), с изключение на триптофана.

Определянето на амино-краяната последователност се осъществява чрез автоматично Edman разграждане на 100 пикомола Mono Q-пречистен CLMF. Данните от първите 32 цикъла показват

наличие на две последователности, както може да се	очаква от
хетеродимерната структура се сумират както следва:	на CLMF.	Тези	резултати	могат	да
Цикъл	1 2	3 4	5	6	7	8

Амино киселина	I/?	W/?	E/L	L/P K/V	К/А	D/T	V/P
Цикъл	9	10	1 1	12	13	14	15
Амино киселина	Y/D	V/P	V/G	Е/М	L/F	D/P	W/?
Цикъл	1 6	17	18	19	20	21	22
Амино киселина	Y/L	Р/Н	D/H	A/S	P/Q	G/?	Е/?

ТАБЛИЦА 2

Амино киселина	Мол Ί>
Аспартат или Аспаргин	11 .8
Треонин	7.8
Серин	8.4
Глутамат или Глутамин	14.9
Пролин	ND
Глицин	6.2
Аланин	7.6
Цистеин	ND
	**
Валин	6.9
Метионин	2.0
Изолевцин	4.6
Левцин	9.0
Тирозин	5.7
Фенилаланин	4.0
Хистидин	*
Лизин	9.3
Аргинин	5.4
Триптофан	ND

ТАБЛИЦА 3

Амино киселина	Мол %
Аспартат или Аспаргин	10.8
Треонин	7.2
Серии	8.9
Глутамат или Глутамин	13.1
Пролин	3.8
Глицин	4.7
Аланин	5.9
Цистеин	2.9
Валии	6.2
Метионин	1 .9
Изолевцин	4.2
Левцин	9.4
Тирозин	3.6
Фенилаланин	3.7
Хистидин	1 .8
Лизин	7.7
Аргинин	4.4
Триптофан	ND

ОБРАТНО ФАЗОВА HPLC

Хроматографската система е описана по-рано от Stern, A.S. and Lewis, R.V. (1985) in Research Methods in Neurochemistry, Eds. Marks, N. and Rodnight, R. (Plenum, New York) Vol. 6, 155-195- Автоматизирана система за флуоресцентна детекция, използуваща флуорескамин (Polysciences, Inc., Warrington, РА) изследва протеина от изтичащия поток на колоната [Stein, S. and Moschera, J. (1981) Methods Enzymol. 78: 455-447]. Провежда се обратно-фазова HPLC, като се използува Vydac С18 или дифенилна колони (4.6 х 20 мм, The Sep/а/га/tions Group, Hesperia, СА). Протеините се елуират с ацетонитрилен градиент в 0.1% TFA.

ПРОТЕИНЕН АНАЛИЗ

Амино киселинният анализ се провежда върху един инструмент, който използува пост-колонна реакция с флуорескамин при детекцията [Pan, Y.-C.E., and Stein, S. (1986) in Methods of Protein Microcharacterization (Shively, J.E.), pp. 105-119, Humana Press, Clifton, NJ].

Секвенционният анализ се осъществявa, като се използува Applied Biosystems Inc. Model 470A газово-фазов секвенатор (Foster City, СА) [Hewick, R.M., Hunkapillar, M.W. , Hood, L.E., and Dreyer, W.J., J. Biol. Chrem. 256: 7990-7997 (1981)]. Идентифицират се on line фенилтиохидантоинови ( PTH) амино киселинни производни, c ABI модел 120A PTH анализатор.

ОПРЕДЕЛЯНЕ НА ЧАСТИЧНИТЕ АМИНО КИСЕЛИННИ ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТИ НА СУБЕДИНИЦИТЕ НА CLMF

ПРЕЧИСТВАНЕ НА 40 kDa СУБЕДИНИЦА НА CLMF

Запазени супернатанти разтвори от NC-37 клетки, възлизащи на 39.1 литра се обединяват и се концентрират до приблизително 2.4 литра, като се използува Pellicon Cassette System и се съхраняват при -20° С. За да се избистри този концентрат след размразяване, препаратът се центрофугира, а преципитатът се изхвърля.

Супернатантниягразтвор се прилага на Nu-Gel P-SP колона и протеинът се елуира със солеви градиент (фиг. 8). Определя се пикът на TGF активността и активните фракции се обединяват и диализират, с цел да се намали концентрацията на соли в препарата с 50- пъти. Този материал, след центрофугиране за да се отстранят частиците, се прилага на Blue-B-Агарозна колона. Протеинът се елуира със солеви градиент (фиг. 9). Определя се пикът на TGF активността и активните фракции се обединяват и диализират, с цел да се намали концентрацията на соли в препарата със 100 пъти. След филтрация, този материал се прилага на Mono Q колона. ПротеинвГ се елуира със солеви градиент (фиг. 10). Аликвотни количества от фракциите се изследват за TGF активност.

Фракции 39 и 40 от предхождащата Mono Q хроматография се обединяват и се разреждат 1:1 об/об с 8 М уреа и се изпомпват върху Vydac дифенилна колона, като се използува обо гатителна техника. След това колоната се промива с 5 мл 0.1% трифлуороцетна киселина. Елуирането на протеините се извършва с градиент на ацетонитрил от 0-70% над 7 часа в 0.1% трифлуороцетна киселина (фигл 11). Аликвотни количества от фракциите се изследват за TGF активност. Чистотата на протеина на фракциите, притежаващи TGF активност се изследват чрез SDS-PAGE при редуциращи условия, например в присъствие на -меркаптоетанол (фиг. 12). Фракциите от 94 до 97 съдържат 40,000 далтона субединицата с > 90% чистота.

ОПРЕДЕЛЯНЕ НА АМИНО-КРАЙНИТЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТИ

НА СУБЕДИНИЦИТЕ НА CLMF

Способността да се приготвя високо обогатен препарат на 40,000 далтоновата субединица от CLMF дава възможност да се осъществи нейния частичен секвенционен анализ.

Определянето на амино крайната последователност се извършва чрез автоматиччно Edman разграждане на 20 пикомола от дифенил-пречистената 40,000 далтона субединица. Резултатите могат да се сумират както следва:

Цикъл 1234567

Амино I W Е L К К D киселина (продължение )

Цикъл	8	9	10	11	1 2	13	14
Амино	V	Y	V	V	Е	L	D
киселина
Цикъл	15	16	17	18	19	20	21
Амино	W	Y	Р	D	А	Р	G
киселина
Цикъл	22		25
Амино	Е		М
киселина
Като се	има прадвид	секвенционния	анализ на	75,000	дал-

тона CLFM и секвенционния анализ на 40,000 далтона субединицата на CLFM, може да се направи заключение за амино крайната последователност на 35,000 далтона субединицата на CLFM. Амино крайните последователности на 55,000 далтона субединицата и 40,000 далтона субидиницата могат да се сумират както следва:

35,000 далтона субединица:

NH-- ?- ?- Leu- Pro- Vai- Ala- Thr(?)- Pro- Asp- ProGly- Met- Phe- Pro- ?- Leu- His- His- Ser(?)- Gln40,000 далтона субединица:

NH. - lie- Trp- Glu- Leu- Lys- Lys- Asp- Vai- Tyr- Val23

Vai- Glu- Leu- Asp- Trp- Tyr- Pro- Asp- Ala- Pro- Gly23

Glu- Metкъдето ? представлява неопределен или best-guessed остатък .

ОПРЕДЕЛЯНЕ НА АМИНО КИСЕЛИННАТА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ НА

ВЪТРЕШНИТЕ СЕГМЕНТИ НА 40 kDA СУБЕДИНИЦАТА НА CLMF •г*

CLMF се пречиства, както е описано по-горе. 40,000 далтона субединицата се отделя и пречиства от 35,000 далтона субединицата по метода, описан от Matsudaira [J. Biol.Chem.,262: 10035-10038 (1987)]. Петдесет микрограма

CLMF (в 500л 20 мМ Tris, pH 7.5; 0.15 М NaCl) се разреждат в 200 Λ* л 2 х концентрирана буферна проба [Laemmli,

Nature 227: 680-685 (1970)]. Пробата се концентрира до 40(^,, и дисулфидните връзки се разграждат чрез прибавянетоо на 18^/

-меркаптоетанол, с последващо излагане на 105 С, в продължение на 6 минути.

Пробата се нанася върху минигел (1.0 мм дебелина), съдържащ 12% полиакриламид, и се подлага на електрофореза, съгласно Laemmli (supra). След електрофорезата, теловете се на появат в трансферен буфер (10 мМ З-Циклохексиламино-1-пропансулфонова киселина, 10% метанол, pH 11.0) в продължение на 5 минути, за да се намали количеството на Tris и глицин. В това време поливинилиденова дифлуоридна (PVDF) мембрана (Immobilon; Millipore; Bedford, МА) се изплаквасъс 100% метанол и се съхранява в трансферен буфер. Гелът, подсилен с два листа PVDF мембрана и няколко листа попивателна хартия, се монтира в blotting апарат и се подлага на електроелуиран в продължение на 30 минути при 0.5 атм. в трансферен буфер. PVDF мембраната се промива с дейонизирана Н^О, в продължение на 5 минути. Края на петното се изрязва от PVDF мембраната и се оцветява с 0.1% Coomassie blue R-250 в 50% метанол, в продължение на 5 минути, а после се премахва оцветителя в 50% метанол, 10% оцетна киселина за 5-10 минути при стайна температура. 40,000 далтона оцветената ивица се съединява със съответната област на неоцветеното· петно (blot) и

40,000 субединицата се изрязва от неоцветения PVDF.

N-крайщата на оцветената с Coomassie blue 40,000 далтона субединица се секвенират, за да потвърдят, че N-краяг се съединява с един предварително определен (виж по-горе). Чрез този метод,

40,000 далтона протеина се идентифицира като

40,000 субединицата на CLMF.

Пет процента от PVDF, свързващ 40,000 субединицата се анализират за нейния амино киселинен състав (табрлица 4).

Оставащите 95% от нахапаната 40,000 далтона субединица се фрагментират с трипсин, съгласно процедурата на Bauw, et al., [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 7701-7705 (1989)]. Мем браната, носеща протеина, се нарязва на парченца с големина приблизително 3 на 3 мм, и се поставят в епруветка на Епендорф. След това се потопяват в 300р л 2% поливинилпиролидонов (40,000 далтона) разтвор в метанол. След 50 минути, потиснатата смес се разрежда с равнен обем дистилирана вода, след което се инкубира за 5-10 минути. Супернатантниятразтвор се изхвърля, след това, а парченцата от мембраната се промиват четирикратно с 300уЧ л вода и веднъж с 300уЧ л Tris НС1 (pH 8.5). Прибавят се двеста миикролитра от този буфер, съдържащ 2у^ г трипсин. Пробата се разбърква и инкубира в продължение на 2 часа, при 37°С. Супернатантниятразтвор се пре хвърля след това във втора епруветка на Епендорф и парченцата от мембраната се промиват еднократно със 100у^ л 88% (об/ об) мравчена киселина и трикратно със 100л дейонизирана вода. Всичките промивни разтвори се прибавят към сместа от разтвори във втората епруветка на Епендорф. Получените пептиди, съдържащи се в обединения разтвор, се разделят чрез тясно отворна HPLC (НРЮ90Ар Hewlett Packard) върху YMC С-18 колона (2.6 х 50 мм; Morris Plains, NJ).

ТАБЛИЦА 4

Амино киселина	Остатък	No
Аспартат или Аспаргин	27.9	(28)
Треонин	20.7	(23)
Серин	24.6	(34)

(продължение )

Глутамат или	Глутамин	44.6	(35)
Пролин		ND	(14)
Глицин		16.3	(15)
Аланин		16.2	(14)
Цистеин		ND	(Ю)
Валин		20.9	(23)
Метионин		2.5	(2)
Изолевцин		10.3	(12)
Левцин		22.9	(22)
Тирозин		12.9	(12)
Фенилаланин		9.9	(9)
Хистидин		5.2	(5)
Лизин		24.5	(26)
Аргинин		12.5	(12)
Триптофан		ND	(Ю)
Забележка:	Резултатите представляват	средното от дв

анализа. Пролин, цистеин и триптофав не се определят (ND). Стойностите в скоби представляват теоритичния амино киселинен състав на 40,000 далтона субединицата, основавайки' се на първичната структура на протеина, изведена от секвенционния анализ на клонирана 40,000 далтона субединица.

Горе описаната процедура е показана схематично на фигури 13 и 14.

Трипсиновата пептидна карта на смляната 40,000 далтона субединица (таблица 5). N-крайният хексапептид (фракция No 60) се получава с голям добив. Карбокси-крайният пептид (фракция No 72) се получава и представлява цялата дължина на предсказания С-краен пептид, въпреки че последните две аминокиселини не са потвърдени със сигурност чрез секвениране. Това вероятно се дължи на факта, че Cys и Ser остатъци не се улавят добре, по-специално когато се случат на края на пептида. Четири потенциални Asn-свързани въглехидратни сайта могат да бъдат предсказани от сДНК последователността. Два пептида, съдържащи два от тези сайта се секвенират. Когато се секвенира пептид 196-208 (фракция No 70), не се открива пик при остатък 200, което показва, че този Asn (предсказан от сДНК-το) е всъщност гликозилиран. Пептид 103-108 (фракция No 52) донася Asn при остатък 103. Следователно, този сайт не е гликозилиран.

Един неизвестен пик, видим на фенилизотиоцианатния (РТН) секвенционен анализ [Hewick et al., J. Biol. 256: 7990 (1981)] от фракция No 55 се открива при позицията, отговаряща на остатък No 148. Предсказано е, че сайтът е Cys остатък, който нормално не се открива чрез секвенционен анализ, докато не е модифициран.

Горната PVDF трансферна процедура се повтаря с втори аликвот от 50 уч Ъ от CLMF (виж фигури 13 и 14 за подчертаната процедура). Все пак нахапаната 40,000 далтона субединица се фрагментира с протеолитичния ензим, Staphylococcus aureus V8 протеаза (ендопротеиназа Glu-C, Boehringer Mennheim, Indianapolis, IN). Парченцата от мембраната се смилат в про58

ТАБЛИЦА 5

Трипсинови 40 kDa CLMF пептиди извън PVDF

фракция No	остатък No	N-крайна последователност
52	103-108	N-K-T-F-L-R
55	139-157	G-S-S-D-P-Q-G-V-T-*-G-A-A- T-L-S-A-E-R
55 & 57	267-279(7)	V-F-T-D-K-T-S-A-T-V-I-7-R
57	52-58	T-L-T-I-Q-V-K
57	218-228	N-L-Q-L-K-P-L-K-N-S-R
60	1 -6	I-W-E-L-K-K
67	288-7	A-Q-D-R-Y-Y-S-S-
67	85-102(7)	K-E-D-G-I-W-S-T-D-I-L-K-D- Q-K-E-P-
70	196-208	L-K-Y-E-?-Y-T-S-S-F-F-I-(R?)
71	85-96(7)	K-E-D-G-I-7-S-T-D-I-L-K
72	288-306(7)	A-Q-D-R-Y-Y-S-S-S-W-E-7-AS-V-P-7-?
78	71 -85	(G?)-G-E-V-L-S-H-S-L-L-L- (L?)-H-K-K

дължение на 6 часа при 37^VC с 20 у г от V8. Пептидите се екстрахират с 88% (об/об) мравчена киселина и се разделят на Фазово Сепарационна колона (2 х 150 мм, С8 S3,

Queensferry, England, UK) (фигура 16). Пептидите се елуират с линеен градиент на ацетонитрил. Секвенираните пикове се номерират в съответствие на тяхните фракционни номера. Амино киселинната последователност на тези пептиди е показана на таблица 6.

ТАБЛИЦА 6

V8 (Glu-C) 40 kDa пептид извън PVDF

фракция No	остатък	No N-крайна последователност
47	1-5	I-W-E
54	4-12	L-K-K-D-V-Y-V-V-E
57	15-22	L-D-W-Y-P-D-A-P-G-E
57	45-59	V-L-G-S-G-K-T-L-T-I-Q-V-K-(Е?)

Секвенират се три главни пептидни пика (фракции 47, 54 и 57), съдържащи четири пептида. Всичките четири пептида са от амино-крайната област на 40 kDa субединица, показвайки, че N-краятна протеина е по-чувствителен към νβ-смилане.

Фигура 17 обобщава структурното определяне на протеина но 40,000 далтона субединицата на CLMF.

НАСОЧЕНО ОПРЕДЕЛЯНЕ НА АМИНО-КРАЙНАТА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ НА 35,000 ДАЛТОНА СУБЕДИНИЦАТА НА CLMF

SDS-PAGE анализ на Mono Q фракция 39 (виж фиг. 3) при редуциращи (в присъствие на β-меркаптоетанол) и не-редуциращи (в отсъствие на -меркаптоетанол) условия (фиг. 18) показва, че с 40,000 далтона молекулярно тегло контаминанта е свободен 40,000 далтона CLMF субединица (например несвързан с 35,000 далтона субединицата). Очевидното при това заключение е, че без редукция (пътека В, фиг. 18) преди всичко 75,000 далтона CLMF присъства с част от 40,000 далтона протеин. След редукция, (пътека С, фиг. 18), 75,000 далтона CLMF дава 35,000 далтона субединицата и една обогатена 40,000 далтона ивица.

Фракция 39 от предходната Mono Q хроматография се редуцира в 5% -меркаптоетанол, в присъствие на 4 М уреа и се о

загрява в продължение на 5 минути при 95 С. Пробата се изпомпва върху Vydac С-18 колона, като се използува обогатителна техника, след което колоната се промива с 5 мл 0.1% трифлуороцетна киселина. Елуирането на протеините се осъществява с градиент от 0-70% на ацетонитрил над 5 часа в 0.1% трифлуороцетна киселина (фиг. 19). Протеиновата чистота на фракциите, които са флуорескамин положителни, се определя чрез SDS-PAGE при не-редуциращи условия, като се използува 10% вискозен гел. Гелът се оцветява със сребро, за да се визуализира протеина (фиг. 20). Фракции 112 до 117 показват дифузна ивица при 35,000 молекулно тегло, която е с над 95% чистота. 40,000 далтона субединицата и всички други присъстващи протеини във фракция 39 остават свързани към С-18 колоната. Тези протеини (включително и 35,000 далтона субединицата) накрая се елуират с разтвор на 42% мравчена киселина/40% 1-пропанол.

Способността да се приготви хомогенна 35,000 субединица, дава възможност за определянето на амино киселинния състав и частичен секвенционен анализ на субединицата CLMF протеин с по-ниско молекулно тегло. Приблизително 1 jг от 35 kDa субединицата се подлагат на хидролиза и амино киселинният му състав се определя (фиг 7). Не се определят (ND) пролин, цистеин и триптофан.

ТАБЛИЦА 7

Амино киселина

Мол %

Аспартат или Аспаргин10.9

Треонин6.7

Серии8.3

Глутамат или Глутамин14.9

ПролинND

Глицин6.1

Аланин7.7

ЦистеинND

Валин6.3

Метионин2.9

(продължение)
Изолевцин	4.5
Левцин	10.9
Тирозин	5.2
Фенилаланин	4.4
Хистидин	2.3
Лизин	5.6
Аргинин	5.5
Триптофан	ND

Определяне на амино крайна последователност се извършва чрез Edman разграждане на 100 пикомола от С-18 пречистената 35 kDa субединица. Данните от първите 20 цикъла потвърждават последователността, получена чрез дедукция, както е описано по-горе. След това втората амино киселина се получава чрез добавяне към амино киселини от 21 до 26. Тези резултати могат да се обобщат както следва:

Цикъл 1 234567

Амино ? N L Ρ V А Т киселина (продължение )

Цикъл	15	16	17	18	19	20	21
Амино	?	L	Н	Н	S	Q	N
киселина
Цикъл	22	23	24	25	26

Амино киселина

Следователно амино крайната последователност на 35,000 далтона субединицата може да се обобщи както следва:

35,000 далтона субединица:

ь ло

NHj- ?- Asn- Leu- Pro- Vai- Ala- Thr- Pro- Asp- ProGly- Met- Phe- Pro- ?- Leu- His- His- Ser- Gin- Asn2 5' 2 G

Leu- Leu- Arg- Ala- Vai където ? представлява неопределен остатък.

ОПРЕДЕЛЯНЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА НА ТРИПСИНОВИЯ

ФРАГМЕНТ НА CLMF

Mono Q фракциите 36 и 37 от първоначалното пречистване на CLMF се събират заедно (приблизително 100 пикомола/1.7 мл). Проба от 50 J*· л се отделя и обема на останалото се намалява до 200 л под хелиев поток. Прибавят се 100 микролитра 0.1 М амониев бикарбонат. Разцепването на трипсина (Worthington Biochemical Corp., Freehold, NJ) се осъществява ο

при субстрат-към-ензим отнасяне 2:1 (тег/тег) при 57 С, в продължение на 20 часа. Получените пептидни фрагменти се ре дуцират и карбоксиметилират. Това се извършва чрез прибавяне на 160л 0.1 М Tris-HCl, pH 8.5 / б М гуанидин-НС1. Обемът се намалява до 200уи л под хелиев поток и се прибавят 4л дитиотреитол (50 мг/мл). Сместа се инкубира при 57° С, в продължение на 4 часа. След редукционно разцепване на дисулфидните връзки се прибавят [С]йодооцетна киселина (4уч мола), а полученият разтвор се инкубира на тъмно при стайна температура, в продължение на 10 минути.

Получените пептидни фрагменти се изолират чрез обратнофазова HPLC (фиг. 21) върху S-5 120 A ODS колона (2.6 х 50 мм, YMC, Inc., Morris Plains, NJ). Пептидите се елуират с градиент на 1-пропанол в 0.9 М оцетна киселина, pH доведено до 4.0 с пиридин. Амино киселинната последователност на пептида, открита във фракция 46, се установява, че е.' Asp-Ile-Ile-Lys-Pro-Asp-Pro-Pro-Lys (определена чрез Edman разграждане ).

ВЪТРЕШНИТЕ СЕГМЕНТИ НА CLMF

CLMF се пречиства, както е описано по-рано. Приблизи телно 80 г от протеина се преципипират с 10% трихлороцетна киселина. Преципитатът се разтваря в 70% (об/об) водна мравчена киселина при стайна температура. Прибавя се цианоген бромид (CNBr) в приблизително 50 пъти моларен излишък спрямо метиониновите остатъци в малък обем 70% мравчена киселина, при разбъркване, и сместа се инкубира на тъмно, под без-кислороден хелий, при стайна температура, в продължение на 48 часа. Сместа се разрежда с 15 обема вода, разделя се на две равни части и се изсушават под хелиев поток. За да се премахне напълно киселината и заради продуктите, изсушаването се повтаря след допълнително прибавяне на вода.

Един от участъците (приблизително 40уи г) на фрагментирания CLMF се разтваря с 50 л Laemlli пробен буфер [Laemlli, Nature 227: 680-685 (1970)], съдържащ*4% /3-меро каптоетанол, с последващо загряване до 105 С в продължение на 6 минути. Пробата се зарежда в три ямки на минигела (1.0 мм дебелина), съдържащ 17.5% полиакриламид и се подлагат на електрофореза, съгласно Laemlli (supra).

След електрофорезата, теловете се накисват в трансферен буфер (10 мМ З-циклохексиламино-1-пропансулфонова киселина, 10% метанол, pH 11.0) в продължение на 30 минути. През това време поливинилиден дифлуоридна (PVDF) мембрана (Immobilon; Millipore; Bedford, МА) се изплаква със 100% метанол и се съхранява в трансферен буфер. Гелът, подсилен с два листа PVDF мембрани и покрит от горе и отдолу с попивателна хартия, се монтира в blitting апарат и се електроелуира в продължение на 30 минути, при 0.5 атм., в трансферен буфер.

PVDF мембраната се промива в дейонизирана вода в продължение на 5 минути и се оцветява с 0.1% Coomassie Blue R-250 в 50% метанол за пет минути, а след това се премахва багрилото в 50% метанол., 10% оцетна киселина за 5-10 минути, при стайна температура. Наблюдава се известен брой зацапани ивици (виж фиг. 22В).

Пет участъка от мембраната се изрязват през трите последни пътеки, съдържащи CLMF CNBr разтвор. Тези участъци се секвенират. Сборът от последователности , получени от CNBr фрагментите на CLMF₇е показан на фиг. 22А.

Вторият участък (приблизително 40г) от CLMF фрагмента се разтваря в приблизително 400-500 88% мравчена киселина, съдържаща 6 М гуанидин НС1, 0.1 М Tris/HCl, 0.5 М NaOH, pH 8.0. pH на пробата се довежда до pH 4.0 с мравчена киселина. Пептидните фрагменти се изолират чрез обратно-фазова HPLC (фиг. 23) върху Vydac С^ колона (4.6 х 20 мм, The Sep/а/га/tions Group, Hesperia, СА). Пептидите се елуират за

4.5 часа с линеен градиент на ацетонитрил в 0.1% TFA. Един от тези пикове се секвенира и амино киселинната последователност на този пептид е :

фракция No: N-крайна последователност

V-D-A-V-H-K-L-K-Y-E-?-Y-T-S-( S?)

-F-F-I-R-D-I-I-K-P(започва при остатък номер 190 на 40 kDa субединицата)

Приема се или е известно, че горната последователност се предхожда от Met остатък. Остатъкът,отбелязан с ?'\представлява най-подходящия остатък (best guessed).

ПРЕЧИСТВАНЕ НА CLMF И НЕГОВАТА 40.000 ДАЛТОНА СУБЕДИНИЦА, ЧРЕЗ ИЗПОЛЗУВАНЕ НА АФИНИТЕТНА ХРОМАТОГРАФИЯ

Приготвя се смола за афинитетна хроматография чрез ковалентно свързване на моноклоналното антитяло 7В2, чийто начин на приготовление е описан по-горе, към ; активирана!, агароза. Подобно, подчертаното по-нататък пречистване, може да се извърши чрез ковалентно свързване на антитялото към силициеви или тънки микропорни мембрани. Активираната агароза се приготвя както следва:

. 100 мл Sepharose CL-6B се промива трикратно със 100 мл вода.

2. 100 мл 1% натриев мета-перйодит във Н^О се прибавя към смолата и сиспензията се разклаща при стайна температура, в продължение на 60 минути.

3. Смолата се промива старателно със студена Н₂0.

Ковалентното прикрепване на 7В2 към активираната агароза се извършва както следва:

. 9 мл от активираната агароза, приготвена . както е описано по-горе, се суспендират в 7 мл от 7В2 (приблизително 3.9 мг/мл) в солеви фосфатен буфер, pH 7.4.

2. 50.2 мг цианоборохидрат се прибавят към гелната ό

суспенсия, която се разклаща през нощта при 4 С.

3. Гелната суспензия се филтрира и се прибавя към 7 мл

1.0 М етаноламин, pH 7.0, съдържащ 50.2 мг цианоборохидрид.

Един милилитър от горе описаната смола (приблизително

2.6 мг IgG/мл гел) се зареждат в колона и се промиват продължително със солеви фосфатен буфер. Фракциите от Mono Q хроматографията, съдържащи 75 kDa CLMF протеин и допълнителните най-контаминиращи протеини се обединяват (приблизително ζ

3.5 х 10 U TGF активност) и се диализират продължително срещу PBS. Този препарат се прилага на 7B2-Sepharose колоната при скорост на изтичане 5 мл/час при стайна температура. Колоната се промива със солеви фосфатен буфер (pH 7.4) докато се получи базовата абсорбция при 280 нм. Адсорбираните протеини се елуират след това с 0.2 N оцетна киселина, 0.15М NaCl, при приблизително pH 3. Аликвоти от фракциите се изследват за TGF активност. Приблизително 76% от началната активност се откриват в киселинния елуат. Чистотата на протеина се определя без редукция на SDS-PAGE [Laemlli, Nature 227: 680-685 (1970)], използувайки 10% вискозен гел. Теловете се багрят със сребро [Morrissey, Anal. Biochem. 117: 307310 (1981)],за да се визуализира протеина. Киселинният елуат съдържа чист CLMF и свободната, неасоциирана 40 kDa субединица на CLMF (фиг. 24).

ОПРЕДЕЛЯНЕ НА pl НА CLMF

Тридесет микролитра от обединените Mono Q фракции 36 и 37 (виж фег. 3) се накапват върху предварителен амфолинен PAG плосък гел, pH 3.5-9.5 (Pharmacia LKB Biotechnology) за да се определи pl на CLMF. Основавайки се на pl стандартни маркери, главната ивица се разглажда при pl 4.8, а най-малката ивица при pl 5.2. Основавайки се на pH определянето, pl на тези ивици са 4.2 и 4.6, съответно.

БИОЛИТИЧНА АКТИВНОСТ НА ПРЕЧИСТЕН CLMF

ПречистениятCLMF стимулира пролиферацията на човешки РНА-активирани лимфобласти в изследването за Т клетъчния растежен фактор (таблица 8). Активността на Т клетъчния растежен фактор на пречистения CLMF, получен от Mono Q колоната, се сравнява с тази на стандартните препарати на човешки лимфокини в пет отделни експеримента и се открива, че специфичната активност на пречистения CLMF е 8.5+, 0.9x10 единици/мг протеин. В един експеримент, при който пречистеният CLMF, получен от дифенил HPLC, се сравнява със стандартния лимфокинен препарат при TGF изследването, като се наблюдава т специфична активност от 5.2 х 10 единици/мг протеин. Когато концентрации под оптималните на пречистен CLMF и човешки rIL-2 се тестват в комбинация, при TGF изследването, се наблюдава допълнителна пролиферация (таблица 8), над максималната пролиферация, причинена само от rIL-2. Все пак, пролиферацията, причинена от rIL-2 , може да бъде разграничена от пролиферацията, дължаща се на CLMF, по това, че ранният е изцяло инхибиран в присъствие на неутрализиращ кози анти-човешки IL-2 антисерум, но крайният не е засегнат.

Способността на пречистения CLMF да активира цито токсичните ефекторни клетки се разглежда както в 4-дневно LAK клетъчно индукционно изследване, така и в денонощно NK клетъчно активационно изследване. В LCI изсследванета, пречистеният CLMF при концентрации високи до 800 единици/мл, притежава ниска активност в отсъствие на IL-2 (таблица 9). Все пак, CLMF има синергитично действие с ниските концентрации на човешки rIL-2, при причиняването на LAK клетъчна индукция, която нараства»когато литичната активност, генерирана в присъствие на двата цитокина, е значително по-голяма от сумата на литичните активности, наблюдавани в култури, съдържащи¹ само цитокин (таблица 9). В присъствие на rIL-2, пречистеният CLMF е активен при концентрации ниски до 3 единици/мл .

ТАБЛИЦА 8

Пречистеният човешки CLMF стимулира пролиферацията на човешки РНА-активирани лимфобласти

Прибавен Цитокин: ^Н-тимидин, включен опит човешки CLMF човешки rIL-2 от РНА-активирани (ед/мл) (ед/мл) лимфобласти (средно срт + 1 S.E.M.)

0	10.607	+	596
500	70.058	+	1.630
100	60.377	+	1 .927
20	36.018	+	321

(продължение )

4	0	24.996	+	669
0.8	0	17.765	+	790

0	9.976	+	374
200	60.980	+	1.713
50	38.817	+	884
12.5	18.885	+	2.132
3.1	13.648	+	731

16	80.041	+	5.835
4	21.282	+	1 .145
1	11.241	+	- 898

50	4	62.050	+	2.408
12.5	4	40.628	+_	2.196
3.1	4	31.144	+	3.754

Всички култури в експеримент 1 съдържат кози античовешки rIL-2.

Нито една от културите в експеримент 2 не съдържа кози анти-човешки rIL-2.

е

Пречистен CLMF от Mono Q HPLC.

ТАБЛИЦА 9

Пречистен човеешки CLMF, синергиращ с човешки rIL-2 при генерация от Лимфокин-активирани Килърни (LAK) клетки в 4-дневни култури

Прибавен човешки CLMF (ед/мл)	Цитокин : Ь човешки rIL-2 (ед/мл)	К5б2	^Сг >	% специфичен освободен^от Raj i
0	0	3 +	1 .7	-1 + 0.5
800	0	7 +	0.3	¹ ± °·¹
200	0	⁵ ±	1 . 1	1+0.4
50	0	4 ±	5.0	0 + 0.9
0	5	¹⁰ ±	2.4	2 + 0.8
800	5	⁴¹ ±	4.0	11 + 0.8
200	5	42 +	1 .9	11 + 0.5
50	5	36 +	2.7	9 + 0.8
12.5	5	28 +	2.1	7 + 0.7
3.1	5	¹⁹ ±	0.8	5 + 0.3
0.8	5	¹⁴ +	1.2	3 + 0.8

Стойностите представляват средно + 1 S.E.M. от четирикратно определяне. Стойностите за спонтанно освободен Сг за к562 и Raji са 16% и 14%, съответно.

Пречистен CLMF от Mono Q HPLC.

В контраст с резултатите от 4-дневното LAK индукционно изследване, пречистеният CLMF е ефективен от само себе си, при активирането на NK клетки в денонощно изследване (таблица 10). В това изследване CLMF е активен при концентрации ниски до 1.6 единици/мл. Когато CLMF се тества в комбинация с човешки rIL-2, и двата цитокина заедно имат, в най-добрия случай,ефекти при засилването на NK активността (таблица 10).

ТАБЛИЦА 10

Пречистен човешки CLMF, причиняващ активиране на

Природните Килърни (NK) клетки при денонощни култури

Прибавен Цитокин :
човешки CLMr (ед/мл)	човешки rlL- (ед/мл)
0	0
40	0
8	0
1.6	0
0.5	0
0	1
40	1
8	1

% специфичен ^г7Сг освободен от

Raji клетки при

ефектор/мишена	отношение=: 5/1
20/	'1
10	+	0.6	5	+	0.4

51	+	0.4	14	+	0.5
25	+	2.1	1 2	+	0.4

15	+	0.5	10	+	0.6

1 2	+	1 . 2	9	+	0.2

15	+	0.4	6	+	0.5

55	+	2.0	17	+	0.5
	—
26	+	0.8	15	+	1 .9

(продължение )

1.61

0.31

Ο5

405

1.65

0.35

Ο25

19	+	1 . 1	11 +2.1
	—
1 6	+	1 .0	10 + 1.5

20	+	1 .3	13 + 0.6
	*
23	+	2.0	12 + 1.5

29	+	1 . 1	16 + 0.7

27	+	1 .2	13 + 0.8
			^—*
24	+,	1 .8	13 +1.2
38	+	1 .4	19 + 0.7

Всяка стойност представлява средно + 1 S.E.M. от четирикратно определяне.

& Пречистен човешки CLMF от Mono Q HPLC.

Освен способността му да засилва литичната активност на не-специфични NK/LAK клетки, CLMF също така спомага човешкия цитолитичен Т лимфоцитен (CTL) отговор in vitro.₍CLMF засилва специфичния алогенен CTL отговор на ранните имуногенни, гама-облъчени НТ144 меланомни клетки (таблица 11). В комбинация с ниска концентрация на rIL-2, CLMF също така улеснява специфичните алогенни човешки CTL отговори на УВ-облъчени НТ144 меланомни клетки, които не предизвикват никакъв доловим CTL отговор, при отсъствие на прибавени цитокини (таблица 11). Специфичността на цитолитичните ефекторни клетки, генерирани при това изследване, се демонстрира чрез тяхната способност да причиняват същетвен лизис на 'Сг-маркирани НТ144 меланомни клетки, но със слаб или никакъв лизис на К562 клетки. В контраст на това, LAK клетките, които се генерират при същите експерименти чрез инкубиране на лимфоцити при ниска плътност с rIL-2, в отсъствие на хидрокортизон, лизират К562 клетките в много по-голяма степен, отколкото НТ144 меланомните клетки. За повече коментар върху специфичността и самоличността на цитолитичните ефекторни клетки, генерирани при опити, като тези, показани на таблица 11 [виж Gately et al., J. Immunol. 136: 1274-1282 (1986)].

Нашите резултати показват, че пречистен човешки CLMF от само себе си причинява пролиферация на активирани човешки Т лимфоцити, зесилва цитолитичната активност на човешки NK клетки и засилва човешките CTL отговори. Тези действия на CLMF, които са подобни на тези на IL-2, подсказват, че CLMF, както и IL-2, трябва да притежава имунозасилващ и антитуморен ефект, когато се използува като единствен терапевтичен агент in vivo. Ясно е, че CLMF може да бъде приложен за стимулиране in vitro растежа на NK/LAK клетките и да активира Т клетките, както и да произлиза от туморни инфилтративни лимфоцити [Topalian et al., J. Immunol. 142: 37143725 (1989)]. Освен това, пречистениятCLMF синергира с ниските концентрации на rIL-2, и причинява генерирането на човешки LAK клетки в култура и действа допълнително или синергитично с rIL-2, при улесняването на специфичните CTL отговори in vitro. Тези резултати предполагат, че употребата на CLMF в комбинация с rIL-2 може да съставя по-оптимална анти76

ПРЕЧИСТЕН ЧОВЕШКИ CLMF ЗАСИЛВА СПЕЦИФИЧНИЯ ОТГОВОР НА ЧОВЕШКИ

1	’t			»·*		я—<		cn
<N t				+ί
40 1	+ 1	+ 1	+ 1	+ /	+ 1	+ 1	+ 1
Ш 1
X 1	сп	’’Г	сч	rf	cn	\O	ΓΊ	un

1 1	x υ :	1 1 1 Tt 1	CN		СЧ	ο	ο	04			-
X 1	X I	1 ·4· 1	+ (	+ ί	+ 1	+ 1	+ 1	+ 1	+ 1	+ (	+(
φ ι	ω	1 ч-ι 1
4 ι	ι	1 Е- 1	CN	ΙΛ	<4	<η		Γ'-	ο		Ch
ο. ι		X 1	1	1	1			<Ν

0 1

1 1

—4

**

сч

Ο

1

CN 1

04

X 1

1

1 40 I

+ 1

+1

+ 1

+ l

+1

+ 1

+1

Η

Φ 1

1 —8

1 ir> |

>—>«

7 1

1

1 X 1

’f

F·^

cn

F-*

cn

o

сч

Г--

>

X 1

1

1 1

1

f

1

40

е ι

1 ft

1

Ζ

X ι

1 φ

1

ΗΜ

X ι

1 X

1

Φ I

ι υ

1 1

c*·)

Tf

X

X 1

1 X

1 ’t· I

cn

F*

CN

СЧ

«-*

X

υ ι

1 X

1 Ί- 1

+ 1

Η

ι

1

1 —¹* 1

+1

+ 1

+ »

χ

1

H i

o

r-

04

<-)

=:

1

X 1

<r>

o

r-

in

CN

СП

<*)

ζ

1

I

S

1 1

X

1

S

1

4 1

ο

1

X 1

Η->

1

X

\ 1

o

O

o

<

1

s

4 1

*4

*

1

Φ 1

Μ

1

u

1

ζ

1 t

X

1 1

_______. I

—¹

1

ς ι

X

1

CN

X 1

tn

V)

IT)

χ

1

\ 1

•

m

(-4

1

X

4 1

r-

r-~

Г'

4—<

ο

1

*-*

Φ 1

χ

1

<

1

<

1 1

HF*

t

¢3

ο I

1

X

X 1

<c

<4

O

Η

1

o

X 1

Τ'

T>

V\

,T>

_n>

X

1

X

h 1

Еч

E->

H

Еч

04

X

1

S

Φ 1

X

*T*

X

ο

i

--.

4 1

е

1

Φ

X 1

S

1

Σ

1

X

1

X

1

Η

1 1

X

1

0

1

X

1

tn

1

ω χ

1 t

X B

1 1

-r 1

-T

-Γ

-r

-Г

Ύ

-Ϊ

X

1

ft

1

o

^fo

'o

o

1 o

o

Η

1

o

S 1

г“Ч

vH

r*H

F—<

X

·· 1

X

Φ 1

o

1

ο

h 1

ft

1

Η

X 1

4

1

X

ft 1

X

1

X

>> 1

X

1

И в двата експеримента съдържанието на двойните култури се обединява, промива, ресуспендира в 1.2 мл ТСМ и се изследва за литична активност неразредено и в разреждане 1:5. В експеримент показаните данни са получени , като се използува разреждане 1 на лимфоцити в цитолитичното изследване, съответствуващо на лимфоцит: отношение на мишени приблизително 45:1

В експеримент 2 , значителен лизис се наблюдава само когато лимфицити се добавят неразредени при литичното изследване и тези данни са показани в таблицата. Спонтанното Сг освобождаване от НТ144 клетките е 25% и 31%, в експерименти 1 и 2, съответно, а за К562 е 18% и 27% в експерименти 1 и 2, съотвенто.

L * ° Percoll фракция 4 съдържа висока плътност на лимфоцитите, получени от разделната повърхност между 45% и 58% Percoll слоевете, където Percoll фракция 1+2 съдържа ниска плътност на лимфоцитите получени от разделната повърхност между 35% и 38% и между 38% и 41% Percoll слоевете. Percoll фракция 4 съдържа

CTL предшественик, но малко LAK предшественици; от друга страна, фракция 1 + 2 е богата на LAK клетъчни прекурсори.

НТ^и НТр представлявва НТ144 меланомни клетки, които са УВ-облъчени или гама-облъчени, съответно.

туморна терапия.

КЛОНИРАНЕ НА сДНК ЗА 40 kDa СУБЕДИНИЦАТА НА

ЧОВЕШКИ CLMF ) Клетъчна култура и изолиране на poly+ РНК

NC 57 клетки (субклон 98) се култивират във въртящи се колби, както е описано по-горе, и се индуцират с РМА и калциев йонофор в продължение на 15.5 часа. Клетките се отделят във вид на замразена клетъчна утайка от 1.11 грама, включваща около 5.25 х 10 клетки. Част от културата продължава да се култивира за още 3 дена, при което, биоизследвания титър за CLMF активност показвна 2200 единици/мл, което означава, че отделените клетки за изолиране на РНК, всъщност са продуцирали CLMF активността. Общата РНК се изолира от замразените клетки по стандартни процедури и ро1уА+ РНК се получава чрез афинитетна хроматография. Добивът на ро1уА+ РНК е 2.5% (тег/тег), отнесено към цялото количество от РНК.

2) Създаване на сДНК банка yU г от горната ро1уА+ РНК обратно се транскрибират в сДНК, като се използуват 150 нг произволни хексамери, като s' праймери. Създадена е банка на ламбда gt10, и 1.5 х 10 клона се амплифицират за скрининга.

5) Употреба на PCR за генериране на ДНК матрица, специфична за сДНК на 40 kDa CLMF субединицата

Частичната N-крайна последователност на пречистения 40 kDa протеин е IWELKKDVYVVELDWYPDAP

Посочени са два праймера за употреба в смесения праймер PCR и се синтезират по стандартни процедури. Правият праймер се означава като кодиращата верига, отговарящ на амино киселини ELKKD, в горната последователност, съдържащ всички възможни кодони за тази последователност, и притежаващ едно разширение при its 5’ края, включващ EcoRI сайт и три допълнителни бази, прибавящи стабилност. Последователността на правия праймер е 5’ etc gaa ttc gaa/g c/ttn aaa/g ga, т.е. 23-мер c 64 различни последователности. Обратниятпраймер се означава по същия начин, за · да представлява противоположната верига, съответствуваща на амино киселинната последователност YPDAP в часА* тичната N-краина 40 kDa последователност. Обратниятпраймер, следователно, притежава последователността 5’ etc gaa ttc ngg ngc a/gte ngg a/gta и е 24-мер, включващ 256 различни последователности. Символът η замества всяка една от четирите възможни бази a,g,c или t. Праймерите така дефинират ампликон от 72 двойки бази дължина. След срязване с EcoRI, за генериране на лепливи краища за субклониране, размерът на ампликона спада на 64 двойки бази. Едноверижната сДНК се генерира за използуване при PCR, както е описано в секция 2 по-горе, използувайки ро1уА+ РНК от индуцирани, и като контрола, неиндуцирани клетки. 40 нг от всяка една от тези сДНК се амплифицират с правия и обратния праймер в 100 л 10 ММ

Tris-HCl, pH 8.3 / 50 мМ КС1 / 1.5 мМ MgCl_z / 0.01% желатин / 200

М от всеки от четирите нуклеотида / единици Taq80 полимераза / 250 пикомола от всеки праймер. PCR параметрите са както следва: първоначално денатуриране при 95 С, в продължение на 7 минути. Слаби условия на топлинна обработка се осъществяват чрез изстудяване до 57 С, в продължение на 2 минути, инкубиране 2 минути при 57 С, затопляне до 72 С над

2.5 минути, продължаване при 72°С за 1.5 минути, затопляне о ° до 95 С над 1 минута и денатуриране при 95 С за 1 минута; този цикъл на мека топлинна обработка се повтаря веднъж. След това се провеждат 30 стандартни цикъла, както следва, о с θ

С за 1 минута, 55 С за 2 минути, 72 С за 2 минути. На края се задържа при 72”с, в продължение на 10 минути. 10% от общите проби се пускат на 4% агарозен гел, оцветяват се и се анализират. Ампликонът с очаквания размер може да се установи единствено в пробата, в която индуцираната сДНК е била амплифицирана. Останалото от пробата се екстрахира с фенол, концентрира се чрез преципитиране с етанол и отново се разтваря в 42 ли л вода. Пробата се смила с 60 единици реетрикционен ензим EcoRI в 50л, при 57 С, в продължение на 2 часа. След това пробата се пуска на 6% полиакриламиден гел и 64 Ьр ампликон се изрязва от гела и се елуира чрез стандартни процедури. ДНК ампликонът се субконира в EcoRI сайта на bluescript SK+ плазмида чрез стандартни методи (Stratagene, La Jolla, СА). Получените колонии от трансформацията на Е. coli щам DH5 (могат да се получат от АТСС) се изолират и анализират за присъствие на 64 Ьр инсърт (може да се използува друг щам Е. coli, съвместим със SK+ плазмидите). Два положителни кандидата се секвенират,за да се опре дели последователността на клонирания ампликон. Ясно е от този анализ, че е амплифициран правилния фрагмент, щом предполагаемата амино киселинна последователлност съответствува напълно на частичната амино крайна амино киселинна последователност на пречистения 40 kDa протеин. Впоследствие, · тази информация се използува.за да се означи олигонуклеотидна матрица с дължина 54 Ър, която може да се използува за скриниране на сДНК банката. Означават се два олигонуклеотида със следната последователност: 5’ gag eta aag ааа gat gtt tat gtc gta gaa ttc gat и 5’ agg ggc ate egg ata cca ate caa ttc tac gac ata . Тези два олигонуклеотида са частично комплементарни да образуват следните структури:

5’ gagctaaagaaagtgtttatgtcgtagaattggat 3’

3’ atacagcatcttaacctaaccataggcctacgggga 5’

Такава структура може да бъде маркирана, като се използува фрагмент на Klenow и да се маркират нуклеотидите така, че да се получи матрица с висока специфична активност за скринирането на сДНК банката.

4) Скрининг на сДНК банките

Скринират се общо 3 х 10^J клона от амплифициланата банка на 6 двойни филтри при следните условия: 50 мл 5 х SSC /10 х Denhardts / 100 yu г/мл денатурирана ДНК от телешки тимус / 20% формамид / 0.1% SDS / 1.5 х 10* срш маркиран 54мер при 37 С в продължение на 16 часа. След това филтрите

Ο се промиват в 2 х SSC при 42 С, в продължение на 30 минути, изсушават се и се излагат на Х-лъчи филм. След денонощно излагане с интензифициран скрининг се отделят 16 възможни положителни, след което се анализират на втори тур на скриниране. 10 рехибридизиращи фаги се изолират, а тяхната ДНК се приготвя. 8 от изолираните 10 изглеждат идентични, след EcoRI срязване остават два фрагмента от 0.8 кб и 0.6 кб дължина, означаващи възможен вътрешен EcoRI сайт. След blootting и хибридизация със скрининг матрицата, само 0.6 кб фрагмент показва хибридизация. Двата фрагмента се субклонират по отделно в EcoRI сайта на bluescript SK+ плазмида, както е описано по-горе и се секвенират изцяло. Този анализ показва, че двата фрагмента се подреждат в права линия в една цяла сДНК от около 1.4 кб дължина, със срещащия се в природата вътрешен EcoRI сайт, щом двата фрагмента след транслацията показват присъствие на четящи рамки, кодиращи за трипсинови пептиди, които действително са били изолирани от пречистения 40 kDa протеин. Пълната последователност на 40 kDa субединицата, както е предположена от сДНК, е показана на фигура 25. сДНК кодира за една отворена четяща рамка от 528 амино киселини. Протеинът започва с иницииращия Met, последван от други 21 амино киселини, които образуват класически хидрофобен сигнален пептид. N-края на зрялата, пречистена 40 kDa субединица, т.е. IWELKKD.... следва непосредствено след сигналната последователност. Така, зрелият протеин се състои от 506 амино киселини. Предполагаемата амино киселинна последователност съдържа 4 възможни N-свързани сайта на

гликозилиране, два	от които присъстват в изолираните и сек-
венирани трипсинови	пептиди. Един от тези два сайта се из-
ползува in vivo за	закрепянето на въглехидратна странична
верига. Изчисленото	моллекулно теглло на зрелия, негликози-

лиран протеин е 54699, pl е 5.24. Съответната тРНК е 2.4 кб дължина и се установява при northern blot в устойчиво състояние РНК само от индуцирани клетки.

КЛОНИРАНЕ НА сДНК КОДИРАЩА 55 kDa СУБЕДИНИЦА НА

ЧОВЕШКИ CLMF

Клетъчна култура, изолирана на тРНК и създаване на сДНК банка, се извършват, както е описано по-горе, за клонирането на 40 kDa субединицата.

Използуване на смесен праймер PCR за генериране на ДНК матрица, специфична за сДНК на 35 kDa субединицата

Частичната N-крайна последователност на пречистената 35 kDa субединица е 7NLPVATPDPGMFP7LHHSQNLLRAV.... Генерират се два праймера за използуване в смесения PCR праймер по стандартни процедури. Правият праймер се означава като кодиращата верига, съответствуваща на амино киселините DPGMF в горната последователност, съдържащ всички възможни кодони за тази последователност и притежаващ разширение при its 5’, включващо EcoRI сайт и три допълнителни бази, придаващи стабилност. Последователността на този прав праймер е 5’ СТС

GAA TTC GAT/C CCN GGN ATG TT -3’, т.е. 23-мер c 32 различни последователности. Обратниятпраймер се означава по същия начин, така че да представлява противоположната верига, съответствуваща на амино киселините NLLRA в частичната N-крайна последователност. Обратният праймер притежава последователността 5’ СТС GAA TTC NGC NCG/T NAA/G NAA/G A/GTT, т.е. 24мер с 4096 различни последователности. В последователностите на двата праймера, N замества и четирите бази. Двата праймера така дефинират ампликон с дължина 69 бази. След срязване с EcoRI за създаване на лепливи краища за субклониране, размера на ампликона спада на 61 бази. Около З^м г човешка геномна ДНК се амплифицира с прав и обратен праймер в 50 д. л мМ Tris-HCl, pH 8.3 / 50 мМ КС1 / 1.5 mM MgCl_z / 0.01¾ желатин / по 200

М от всеки от четирите нуклеотида / 2.5 единици Taq полимераза / 64 пикомола от правия , и 2048 пикомола от обратния праймер ( за да се j компенсират: ' напълно различаващите се сложности в двата праймера). Параметрите на PCR циклите са както следва : първоначално денатуриране при

С в продължение на 7 минути. Меки условия на топлинна _о обработка се създават чрез изстудяване до 37 С за 2 минути, о инкубиране при 37 С за две минути, затопляне до 72 С над 2.5 минути, продължаване при 72° С за 1.5 минути, загряване при 0с

С над 1 минута и денатуриране при 95 С за 1 минута; този цикъл на меко топлинно обработване се повтаря веднъж. След това се провеждат 40 стандартни цикъла както следва: 95 С за о® минута, 55 С за две минути и 72 С за 3 минути. Накрая се о продължава при 72 С в продължение на 10 минути. Около 20¾ от пробите се пускат на 6% полиакриламиден гел и се открива един ампликон с очаквания размер след багрене на гела с етидиев бромид. Остатъкът от пробата се екстрахира с фенол, концентрира се чрез преципитация с етанол и се разтваря отново в 17 Λι л вода. Пробата се смила _L с 20 единици EcoRI ено зим в 20 л за 60 минути, при 57 С. След това пробата се фракционира върху 8% полиакриламиден гел и ампликонъ-т с 61 нуклеотидни бази се изрязва от гела и се елуира чрез стандартни процедури. ДНК ампликонът се субклонира в EcoRI сайта на bluescript SK+ плазмида (Stratagene, La Jolla, СА) чрез стандартни процедури. Колониите, получени чрез трансформацията на Е. coli щам DH5 се анализират за присъствие на инсърта с 61 нуклеотидни двойки. Секвенират се два кандидата за определяне последователността на субклонирания ампликон. Един от двата клона съдържа правилната последователност, тъй като транслацията на тази последователност дава амино киселинната последователност, очаквана за пречистения протеин. Основавайки се на тази информация, два синтетични олигонуклеотида се означават със следните последователности:

5’ gatccgggaatgttcccatgccttcaccactccc 5’

5’ gtacggaagtggtgagggttttggaggatgcccga 5’

Такава структура може да бъде маркиране като се използува изотопнобелязани нуклеотиди с фрагмента на Klenow за много високи специфични активности за скриниране на банките.

СКРИНИРАНЕ НА сДНК БАНКА:

Общо 10⁶ клона от амплифицираната в продължение на 16 часа банка се скринират на 40 двойни филтри с горната матрица, при следните условия : 400 мл от 5 х SSC / 20% формамид /10 х Denhardts / 100 Λι ф/мл денатурирана ДНК от телешки

X т. ΰ тимус / 0.1% SDS / 3-8 η 10 cpm маркирана матрица при 37 С за през нощта. Филтрите се промиват след това в 2 х SSC при о

С и се излагат на Х-лъчи филм със срийн през нощта. Шест потенциално! положителни се отделят и анализират чрез втори тур на плакова хибридизация, както по-горе. Един клон се отделя след крайния анализ. След приготвяне на фаговата ДНК, се открива, че клонът съдържа EcoRI фрагменти от около 0.8 кб и 0.3 кб размер. Двата фрагмента се субклонират поотделно в Bluescript SK+ плазмид и се секвенират. Този анализ показва, че двата фрагмента се подреждат в една последователност от около 1.1 кб обща дължина с нормално срещащ се в природата вътрешен EcoRI сайт. Пълната последователност на сДНК и предполагаемата амино киселинна последователност за 35 kDa CLMF субединицата са показани на фигура 26. сДНК кодира за отворена четяща рамка от 219 амино киселини, започваща с инициализиращ Met при позиция 1. Следващите 21 амино киселини съставят класическа хидрофобна сигнална последователност. Непосредствено следващ сигналния пептид, N-края на зрелия 35 kDa протеин, започва с последователността : RNLPVAT.... Пречистеният 35 kDa протеин дава последователността 7NLPVAT.... Зрелият 35 kDa протеин, така се състои от 197 амино киселини, съдържащ 5 възможни N-свързани сайта на гликозилиране и 7 Cys-остатъка. Изчисленото» молекулно тегло на зрелия : негликозиран: протеин е 22513, a pl е 6.09. Съответствуващата тРНК е с 1.4 кб дължина и единствено може да се установи в РНК от клетки, които са били индуцирани за CLMF за най-малко 6 часа.

ЕКСПРЕСИЯ НА БИОЛОГИЧНО АКТИВЕН РЕКОМБИНАНТЕН

CLMF В COS КЛЕТКИ

Двете субединици на CLMF се проектират за експресия в клетки на млекопитаещи, както следва:

kDa субединица

Двата EcoRI фрагмента,съставящи пълната дължина на сДНК за 40 kDa CLMF субединица, се лигират към един експресионен вектор, подобен на рВС12 [виж b. Cullen, Meth. Enzymology 152: 684-703 (1987)], с изключение на това, че сДНК експресията се осъществява извън SV40 ранния промотор/енхансер. Клонове, съдържащи и двата инсърта в правилната ориентация един към друг, се селекционират чрез хибридизация на колонии със синтетичен олигонуклеотид, който обхваща вътрешния EcoRI сайт в 40 kDa сДНК. Този олигон^клелотид притежава следната последователност: 5’ CTG AAG CCA ТТА AAG AAT ТСТ CGG CAG GTG 3’. Бележи се с киназа, като се използува стандарна процедура. След това клоновете се анализират за правилната ориентация на инсърта спрямо вектора, по метода на верижната по лимеразна реакция, използувайки като прав праймер, праймер специфичен за последователности в SV4O ранния промотор, а като обратен праймер, един олигонуклеотид, съответстуващ на позиции No 851-868 на 40 kDa сДНК последователността. Клоновете с правилна ориентация дават PCR ампликон от 885 нуклеотидни двойки. Осем от двадесет тествани клона имат предсказания фрагмент и един се избира за по-нататъшно изследване.

kDa субединица

Пълната дължина на сДНК за 35 kDa субединицата се амплифицира извън оргиналния ламбда фаг чрез PCR, като се използуват праймери, локализирани от ляво и от дясно на EcoRI сайта в ламбда gt10 (праймерите са от New^r England Biolab Articles No. 1231 и 1232). Полученият PCR ампликон се свързва с тъп край към EcoRI сайта на bluescript SK+ плазмида и размножаващата се ДНК. Секвенирането на ДНК показва, че ориентацията на сДНК инсърта в плазмида е такава, че краят на сДНК, съответствуващ на 5’ края на тРНК, да е близо до Clal сайта в полилинкера. Така инсърта се остава чрез срязване с Clal, зеипълване на този край с Т4 ДНК полимераза и повторно срязване с Not I. Полученият фрагмент е гел-пречистен и субклониран в един експресионен плазмид, основавайки се на bluescript вектора и съдържаш SV40 ранния промотор, за да води експресията на инсерираните сДНК. Използуваните сайтове в експресионния плазмид са с тъпи краища PstI сайта при 5’ края и Not I сайта при 3’ края на сДНК. Един клон се избира за по-нататъшно изследване, след като се установи неговата структура чрез PCR, както по-горе за 40 kDa конструкта.

ЕКСПРЕСИЯ НА ДВЕТЕ сДНК В COS-КЛЕТКИ

ДНК за експресионните конструкти на 40 kDa и 55 kDa субединици се вкарват в COS клетки (могат да се получат от АТСС) в петрита със 6 см диаметър, чрез DEAE Dextran трансу фекционна процедура (7 х 10 клетки/посято блюдо; 1 jaZ ДНК на блюдо), описана от Cullen [Meth. Enzymology 152: 684 (1987)]. 24 часа след трансфекцията, клетките се подхранват със стандартна среда за тъканно култивиране, съдържаща 1% Nutridoma вместо серума от говежди зародиш, и супернатантите се събират след 40 часа и се фелтрират през 0.45уч филтър.

Течността от супернатантите от културите на COS клетките, които са били трансфектирани с сДНК, кодираща 55 kDa CLMF субединица или 40 kDa CLMF субединица или с двете сДНК, се тестват за CLMF активност при изследването за Т клетъчния растежен фактор (таблица 13). Както е показано на таблицата, COS клетките, които са били трансфектирани с сДНК само на една от субединиците, не остават биологично активен CLMF в културалната течност. Въпреки това, COS клетките, които са били трансфектирани с сДНК на двете субединици, продуцират биологично активен CLMF. Като се сравнява размера на индуцираната лимфобластна пролиферация чрез култураллната течност от двойно трансфектираните COS кретки, с размера на индуцираната пролиферация от пречистен NC-57-производен CLMF, концентрацията на CLMF активността в културалната течност въз90 лиза на 374 единици/мл. Приемайки специфична активност от 8

x 10* единици/мг CLMF	протеин, този резултат предполага, че
културалните течности	от двойно трансфектираните COS клетки
съдържа приблизително	4.7 нг/мл рекомбинантен CLMF.

АНТИ-CLMF ХИБРИДОМИ И АНТИТЕЛА

Приготвяне, охарактеризиране ипречистване на анти-CLMF хибридоми

Плъхове на

Lewis ( Charles

River

Laboraroties,

Wilmington, МА) се имунизират първоначално по интраперитонеален начин ( i . р. ) с частично пречистен CLMF, смесен с равно количество пълен адювант на Freund (Gibco). Плъховете се инжектират i.p. със спомагателна имунизация от CLMF, смесена с непълен адювант на Freund (Gibco), съгласно планът на таблица 14. За приготвянето на активирани клетки от далак, един плъх се инжектира i.v. с частично пречистен

CLMF в два последователни дни, като се започне 4 дни преди клетъчната фузия (таблица

14). Клетките от далак се изолират от този плъх и се сливат с NSO клетки; [Galfre et al., Meth. Enzymol.

73:3-46 (1981)] в съотношение 1 (клетки от далак: NSO клетки) с 35% полиетилен гликол (PEG 4000, Е. Мегск). Могат да се използуват други клетки, подходящи като партньори за фузия, при хибридомната клетъчна фузия.

Слятите клетки се посяват с плътност 5 вместо NSO клетките.

Ч х 10 клетки/ямка/мл в 48 кладенчови петрита в IMDM [Iscove et al., J. Exp. Med.

АКТИВНОСТ НА Т КЛЕТЪЧЕН РАСТЕЖЕН ФАКТОР НА РЕКОМБИНАНТНИЯ CLMF

I X I h —- I

m	0	• 1
Ф	aS	X 1
CX	c	• 1
7	Ό	W 1
	O	• 1		’ί'	σ\	ID	CD
X	e	c/з ι		ID	CN		\ο
Ф	X	1		ΟΟ	ο	*D	Γ—
7	X	·—< 1			(Ν
Q	x	, 1
ς		+ 1 1	+	+! +t+l+l
X	X	1
®	X	Е 1	Γ-	00	ο	Ο	\0
	X	ex 1	ΟΟ		Οι	00	Ch
X	ex	U 1	ID	00	ο	νΜ	Ch
X	X	1	•	•	•	•	•
4	Й	0 1		σ\	Ch	σ\	ID
X	X	X 1	«Η	Γ—	ID	<*>	Οί
X	h	4 1
X	X	Φ 1
h	X	ex 1
1	1	υ ι
Ξ	<	— 1
Τ»	X	1
	ex	1

I

Γ—	OS	Ch	o	SO in	03	o
Os	Γ—	<D		Ό Γ'	CN	Γ—·
Γ—		o		— СЧ	40

+ / + Ι	+ 1 +t	+ 1 +i	+1+1
СЧ	Os	<n	Os	x r>	X	so
<D	Tt	00	03	CN Γ-	SO	CN
Π		00	00	<4 ca	co
ID	СЧ		CD	SO r-		rf
	^-4			Ό -+	’—I

I

1

φ φ

Φ

Ф

Φ

Ф

φ

1

ς

X

X X

w*

M

X

χ

X

1

X

X X

X

I

'x.

\

4 4

4

s

·· 1

**

X

X X

X

tZ

X 1

X

*4

φ Φ

Φ

Ф

Φ

Ф

Φ

r-

X 1

X

ex ex

ft

Λ

CL

Λ

ex

ft

X 1

—

X

m m

ns

Π

m

ex

aS ι

X

s

X X

X

**4

Й

X

tz

ex ι

4

X

ex ex

ex

CL

c.

ft

o

h 1

Φ

J

X

X 1

Ш

ID

in

ft

Φ 1

SO

Ш СЧ

1П

CN

ID

<N

m

oi

ft

u

X 1

•

X 1

o

ao

1—4

»—<

—-

СУ

ffl

O 1

o

+

« 1

СЧ

o

»T*

1

c

<

1

o

ex

I

es

s

u

Xi

H

ω

»+*

22

0

ex

X-*

=1

c

o

tl-

u

s

tz

X

ft

w

X

o

X

bZ Xi

ez

Xi

X

Φ

X X

ex

22

4

Φ

0

h

ο υ

υ

Ό

Д

O

>>

m

X X

X

o

υ

X

H

X

X X

X

0

O

X

X X

X

ti-

ft

O

h

X X

X

es

X

c

1

X

Φ

X X

X

j

X

1

* 1

7

X

··

ч 4

4

Ct

o

CJ

X

r~

X 1

Φ

X

υ

φ Φ

Φ

ο-

ft

<n

X 1

h

SO \O

SO

sD

X

χ

*«

1

X 1

*

co

X

>> >>

>>

Q

а

h

o

0 1

ti-

ft.

ti-

u.

aS

o

X

o u

o

0

2Z

AZ

X

z

H 1

es

SS

X

CJ

X

Φ

X 1

►J

ft

b

ex

н-χ Um

ti-

O

o

e

X

X 1

o

u

o

U

X

aS

X

X ZE

es

+

·+

o

υ

Φ

1

X

h

ft ft

►j

ft

X

h

X 1

X

h

X

o o

o

+

X

O

Φ 1

Φ

X

φ

ft

X

ffl 1

4

X

ex

e

X X

X

h

b

7

X 1

0

o

0

o

ex

t»

o

Q Q

а

Q

Φ

so 1

aS

ex

φ

ft

X

AZ

az

AZ

ft

X 1

X

O

o

c

ex ι

K

ex

>»

>>

ex

in in

o

in

1П

o

0

X 1

X

c

X

K

o

X

H

f”> cn

+

-+

<n

O

es

X

*

I

147: 923-933 (1978)], към което е добавен 15% серум от говежди ембрион (FBS), глутамин (2 мМ), бета-меркаптоетанол (0.1 мМ), гентамицин (50у^г/мл), HEPES (10 мМ) и 15% P388D1 клетъчна супернатанта (P388D1 клетки могат да се осигурят от АТСС). Хибридомните супернатанти се скринират за специфични CLMF антитела в 4 изследвания : 1 ) имунопреципитация на ^Л251-белязан CLMF; 2) имуноизтощение на CLMF биоактивността; 3) western blotting с CLMF и 4) инхибиране на Ι-CLMF свързващ към РНА-активирани PBL бластни клетки. Хибридомните клетъчни линии, които секретират анти-CLMF антитела, се клонират чрез пределно разреждане. Антителата се пречистват от голям брой хибридомни култури или асцитните течности, чрез хроматография върху протеин G връзка за напречно омрежване на агароза, съгласно указанията на производителя (Gammabind G, Genex, Gaithersburg, MD).

ТАБЛИЦА 14

Имунизационна схема :

дата CLMF (10 едини-	Общ протеин	Спец. Активност (ед./мг)	Чистота (%) -
	ци/мг) единици J-	'Г
	1^г)
3/28/89	1x10 4		о. 1умг	15	6.7x10**	6.7
4/10/89	1.2x10 i	0.	ι уиг	?	6x1 0	0.6

5/3/8	1 -во	кървене			•
5/18/89	У			G	•
2.2x10	2умл.	75	2.9x10	2.9
6/7/89	2-ро	кървене			•
	ч			s~
6/29/89	6.3x10 ь	0.63у	83	7.5x10	0.75
7/21/89	1.2x10	1.2yuv	24	5x10	5.0
8/2/89	3-то	кървене			•
10/19/89	2.1x10**	(i.v.)			.
10/20/89	2.1x1 0^в	(i.v.)			er
10/25/89		фузия

ИЗОЛИРАНЕ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ НА МОНОКЛОНАЛНИ АНТИТЕЛА СПЕЦИФИЧНИ КЪМ CLMF

Серум, изолиран при З-тото кървене от плъх, имунизиран с частично пречистен CLMF (таблица 14), неутрализира CLMF биоактивността (5 единици/мл), както е определена от TGF изследването (фиг. 27). Това неутрализиране може да се блокира, като се добави CLMF в излишък (200 единици/мл), което показва, че неутрализирането от антисерума е специфично за CLMF (фиг. 27). Нормалният серум от плъх не неутрализира CLMF биоактивност (фиг. 27). Изолираните от този плъх клетки от далак се сливат ;с NSO клетки и получените хибридоми се скринират първоначално за CLMF-специфични антитела чрез имунопреципитация от I-белязан CLMF.

Радиойодираният,частично пречистен CLMF препарат съдържа предимно CLMF 75 kDa хетеродимера, малко количество свободна CLMF 40 kDa субединица и два други протеина от приблизително 92 kDa и 25 kDa (фиг. 28). I-белязаният CLMF препарат запазва CLMF биоактивността при TGF изследването, което означава, че процедурата по белязането не променя съществено конфигурацията на CLMF молекулата. Серумът от имунизиран със CLMF плъх имунопреципитира 75 kDa хетеродимер и свободната 40 kDa субединица (пътеки 6 и 8, фиг. 28), докато нормалният серум от плъх не имунопреципитира тези изотопно белязани протеини (пътеки 7 и 9, фиг. 28). Четири индивидуални моноклонални антитела също имунопреципитират 75 kDa хетеродимера и свободната 45 kDa субединица (фиг. 28), но не имунопреципитират 92 kDa или 25 kDa белязаните протеини. Имунапреципитационното изследване идентифицира двадесет хибридоми, които секретират анти-CLMF антитела (таблица 15). Всички антитела имунопреципитират изотопно белязания 75 kDa хетеродимер и свободната 45 kDa субединица, както се определя от SDS/PAGE и авторадиографията (данни показани за 4 представителни антитела на фиг. 28).

ТАБЛИЦА 15

Моноклонални анти-CLMF антитела (специфична 40 kDa субединица)

Антитяло Western Blot I-CLMF/рецепторно Неутрализация

Ред. Не ред. изследване (% инхибиране) на биоактивност

Инхибирани / Неутрализиране

7В2	-	++	95	+
2АЗ	-	++	99		+
1В8	-	+ /-	60		ND
1С1	-	++	81		ND
4А1	-	+	98		+
4С8	ND	ND	68		ND
4D1	-	+	100		ND
6А2	-	+ /-	75		ND
7А1	+ /-	++	94		ND
8А1	-	+	99		ND
8А2	-	++	83		ND
9С8	-	+	62		ND
22Е7	++	++	91		ND
Не-инхибит. /	Не-неутрал.
8ЕЗ	+	++	35		-
9F5	+	+ +	18		ND
4Аб	-	-	17		ND
6АЗ	-	+	20		-
*8С4	-	+ +	33	J	ND
8Е4	-	++	1		ND
39B3	ND	ND	46		—

контрола

1: Western blot: He ред. е не-редуциран, а Ред. е редуциран

SDS/PAGE. 3a Western blot, CLMF пробата, съдържаща 5% 75 kDa хетеродимер и 95% свободна 45 kDa субединица, се разделя на 10% SDS/PAGE и се приготвят western blots, както е описано в методите. Петната се считат за силно положителни (++), положителни (+), слабо положителни (+/-) и отрицателни (-).

2. Изследване на CLMF рецепторно свързване: Едно антитяло се счита за инхибиторно, ако блокира повече от 60% от радиобелязаното CLMF свързване към РНА активирани PBL бласти.

3. Неутрализиране на CLMF биоактивността както се определя от TGF изследването: Едно антитяло се счита неутрализиращо, ако блокира повече от 50% пролиферацията при 200^уиг/мл.

Резултатите са представени като положителни (+) или отрицателни (-) .

4. ND: Не определено.

След първоначално идентифициране на CLMF антителата в имунопреципитационното изследване, антителата се тестват за тяхната способност за имуноизтощение на CLMF биоактивността, както се изследва чрез TGF и LAK клетъчно индукционни изследвания. Увеличаването на количеството на CLMF причинява зависимо от дозата нарастване на пролиферацията на PBL бласти при TGF изследването, както се измерва чрез инкорпориране на ’^Н-тимидин в делящи се бластни клетки (фиг. 29). Имуноизтощението на CLMF активността от имобилизирани анти-CLMF антитела се осъществява по зависим от дозата начин (фиг. 29). Аликвоти (0.4 и 0.1 мл) от хибридомния супернатантен разтвор напълно изтощават 50 и 200 единици/мл от CLMF активността от културалната среда. 0.025 мл от супернатантния разтвор напълно изтощават 50 единици/мл, но само приблизително 50% от 200 единици/мл. 0.0062 мл от хибридомната супернатанта показва по-малко изтощаване от 50 и 200 единици/мл от CLMF. Аликвот (0.4 мл) от супернатантен разтвор на едно анти-IL-l рецепторно антитяло не показва имуноизтощение на CLMF биоактивността.

Нарастващи количества на CLMF също предизвикват зависимо от дозата засилване на лизиса на клетките-мишени от LAK клетките, както е измерено чрез освободения Сг при LAK клетъчното индукционно микроизследване (фиг. 30). Имобилизираните анти-CLMF антитела също изтощават по зависим от дозата начин CLMF активността при LAK клетъчното индукционно изследване (фиг. 50). Тези данни потвърждават, че антителата, които имунопреципитират 74 kDa белязания протеин от изотопно белязания частично пречистен CLMF препарат, са специфични за CLMF. Данните също така сочат, че изотопно белязаният 75 kDa протеин е отговорния за CLMF биоактивността протеин.

МЕТОДИ ЗА ИЗСЛЕДВАНЕ НА МОНОКЛОНАЛНИ АНТИТЕЛА

ПРЕЧИСТВАНЕ НА CLMF И БЕЛЯЗАНЕ НА CLMF С *^22ГТ

CLMF частично се пречиства от клетъчните супернатанти, получени от лимфоцити от човешка периферна кръв (PBLs) или NC-37 клетки, както е описано преди това. Частично пречистен CLMF се бележи с по модифициран йодогенен метод. Йодоген (Pierce Chemical Co.) се разтваря в хлороформ до концентрация 0.5 мг/мл и се прибавят 0.1 мл аликвоти към 12 х 75 боросиликатни стъклени епруветки. Хлороформьт се изпарява под поток от азот и Йодогенът се изсушава в центъра на дъното на стъклената епруветка. Покритите епруветки се съхраняват в десикатор при стайна температура под вакуум. За изотопното белязане, 0.5-1.0 mCi * I-Na (Amersham) се прибавят към облицованите с Йодоген епруветки, съдържащи 0.50 мл Tris-йодинационен буфер (25 мМ Tris-HCl pH 7.5, 0.4 М NaCl, 1 mM EDTA) и се инкубират в продължение на 4 минути при стайна температура. Активираният разтвор се прехвърля в 1.5 мл епруветка, съдържаща 0.05-0.1 мл CLMF (приблизително 5ju г в

0.125 М NaCl, 20 mM Tris-HCl pH 7.5), и реакционната смес се инкубира по-нататък в продължение на 8 минути при стайна температура. В края на инкубирането, 0.05 мл от Йодоген Стоп Буфер (10 мг/мл тирозин, 10¾ глицерол в Dulbecco’s солеви фосфатен буфер (PBS) pH 7.4) се прибавят и реагират за 30 секунди. След това сместа се разрежда с 1.0 мл Tris-Йодинационен буфер и се прилага на BioRad BioGel P1ODG (BioRad Laboratories) обезсолваша колона за хроматографиране. Колоната се елуира с Тгis-йодинационен буфер, а фракциите (1 мл), съдържащи пиковите количества от маркирания протеин,се комбинират и се разреждат до 1 х 10 срш/мл с 0.25% желатин в Тгis-йодинационен буфер. ТСА преципитационната радиоактивност (10% крайна концентрация трихлороцетна киселина) е типично в излишък от 95% от общата радиоактивност. Радиоспецифичната активност се вмества от 6000 cpm/fmol до 10,000 cpm/fmol.

ИМУН0ИЗТ0ЩЕНИЕ НА CLMF

Хибридомни културални супернатанти или пречистени моноклонални антитела се тестват за тяхната способност за имуноизтощение на CLMF, както следва. Кози антиплъши. IgG-araрозни перли (Sigma Chemical Ci., St.. Louis, МО) се промиват трикратно c '10 мл PBS (Gibco), към който е добавен 10% говежди серумен албумин (BSA) (Sigma) (PBS/BSA разтвор). След промиването, перлите се ресуспендират в PBS/BSA при крайна концентрация 50% об/об. Аликвоти (0.2 мл) от суспензията, от перли се прибавя към 1.5 мл епруветка на Епендорф, заедно с посочените количества моноклонални антитела или хибридомни супернатантни разтвори. Обема на всяка смес се довежда до

1.4 мл чрез прибавяне на хибридомна поддържаща среда [Iscove’s modification of Dulbecco’s medium (IMDM) със серум

100 от говежди зародиш (FBS), 1-% Nutridoma-SP (BoehringerMannheim), и 2 мМ L-глутамин], след което сместа а се инкубира в продължение на 2 часа при стайна температура, върху хематологично/химически миксер. След това инкубиране, епруветките се центрофугират в Beckman microfuge 12 (1.5 минути на позиция 5), а супернатантите се изхвърлят. Перлите отново се промиват трикратно с PBS/BSA и отново се ресуспендират в 1 мл среда за тъканни култури (ТСМ), съдържаща 5% човешки АВ серум и посочените концентрации човешки CLMF. След това епруветките се инкубират през нощта при 4°С на миксер. След това перлите се отделят чрез центрофугиране в микрофюж, а получените имуноизтощаващи супернатантни разтвори се изследват за остатъчна CLMF активност при TGF изслеедването или при микроизслелдването за LAK клетъчна индукция.

ИМУНОПРЕЦИПИТАЦИОННО ИЗСЛЕДВАНЕ

За имунопреципитационната реакция. 0.05 до 0-5 мл хибридомно супернатанта, разредени антисеруми или пречистен IgG, се прибавят към 1.5 мл микрофюжна епруветка, съдържаща 0.1 мл 50% < суспензия от кози анти-плъши IgG,свързан към агароза (Sigma Chemical Co.). Изследваният обем се довжда до 0.5 мл с RIPA буфер (50 мМ NaPO^ pH 7.5, 150 мМ NaCl, 1% Triton-X 100, 1% дезоксихолинова киселина, 0,1 % SDS, 1% BSA и 5 мМ EDTA) и сместа се инкубира на ротационен миксер в продължение на 2 часа при стайна температура. Перлите се утаяват чрез центрофугиране в продължение на 1 минута при 12,000 х g, след което се ресуспендират в 1 мл RIPA буфер,

101 съдържащ ^1 CLMF (1 х Ю³ срш). След това сместа се инкуо бира на ротационен миксер в продължение на 16 часа при 4 С.

След това инкубиране, перлите се утаяват чрез центрофугиране и двукратно се промиват с RIPA без BSA. След това перлите се промиват еднократно с 0.125 М Tris-HCl pH 6.8 и 10 % глицеΙ-CLMF към твърдо-фазовите антитела се рол. Свързаният освобождава чрез добавяне на (Laemmli, supra) със в продължение на 3 и без 5% ^5 минути при уи л 2 X работен буфер -меркаптоетанол и се загрява

95° С. Имунопреципитираният ^I-CLMF се анализира акриламиден гел и се чрез SDS-PAGE върху 10% или 12% поли визуализира чрез авторадиография.

CLMF РЕЦЕПТОР СВЪРЗВАЩО ИЗСЛЕДВАНЕ

Способността на хибридомните супернатантни разтвори, пречистения IgG или антисерумите да инхибират свързания ^I-CLMF към РНА-активирани Т лимфобласти, се измерва както следва: 0.1 мл аликвоти от серийно разреждане на културални супернатанти, пречистен IgG или антисеруми, се смесва с 0.025 мл аликвоти от свързващ буфер (RPMI-1640, 5% FBS, 25 mM HEPES pH 7.4), съдържащ ^’i-CLMF (1 х 10^Ь срш). Сместа, се инкубира на орбитален шейкер в продължение на 1 час при стайна температура, след което се добавят 0.025 мл активирани бластни клетки (5 х 10^ клетки/мл) към всяка епруветка.

По-нататък, сместа се инкубира в продължение на 1 час при стайна температура. Неспецифичното ¹ свързване се определя чрез включване на 10 нМ небелязан CLMF в опита. Инкубирането се осъществява двойно или тройно. Свързаната с клетките ра

102 диоактивност се отделя от свободния Ι-CLMF чрез центрофугиране на изследваното съдържание през 0.1 мл маслена смес ( 1:2 смес на Thomas Silicone Fluid 6428-R15: A.Н. Thomas, and Silicone Oil Ar 200: Gallard-Schlessinger) при 4^&C в продължение на 90 секунди при 10,000 х g. Накрайникът, съдържат клетъчната утайка се изрязва и свързаната с клетките радиоактивност се определя в гама-брояч.

SDS ПОЛИАКРИЛАМИДНА ГЕЛ ЕЛЕКТРОФОРЕЗА (SDS/PAGE)

И WESTERN BLOTTING

Имунопреципитираните I-белязани протеини и частично пречистеният CLMF се обработват с Laemmli работен буфер (2% SDS, 125 мМ Tria-HCl, pH 6.8, 10¾ глицерол, 0.025¾ бромфенол блу) със и без аптоетанол, загряват се при 95 С в про дължение на 3 минути, отделят се чрез SDS/PAGE при 7.5¾ или

12¾ предварителни гелове (BioRad Laboratories). За имунопре ципитираните ^^I-белязани протеини, теловете се оцветяват с

0.2¾ Coomassie Brilliant Blue в 25¾ изопропилов алкохол и 10¾ оцетна киселина, отделя се багрилото в 10¾ метанол и 10¾ оцетна киселина, изсушават се и се анализират чрез радиография. За western blotting, разделените чрез SDS/PAGE протеини се прехварлят на нитроцелулозна мембрана и (0.2 ) за 16 часа при 100 волта, в 10 мМ Tris-HCl pH 8.3, 76.8 мМ глицин, 20¾ метанол и 0.01¾ SDS. Нитроцелулозната мембрана се блокира за 1 час при 37° С в 3¾ желатин, Tris-HCl pH 7.5, 0.15 MNaCl, след което се проучва с хибридомни супернатантни разтвори или пречистени антитела, разредени в АВ буфер (1¾ го

103 вежди серумен албумин, 50 мМ натриев фосфат pH 6.5, 0.5 М о

NaCl, 0.05% Tween 20) в продължение на 16 часа при 4 С. След промиване с промивен буфер (PBS, 0.05% Tween 20), нитроцелулозните ленти се инкубират в продължение на 2 часа при стайна температура с кози анти-плъши IgG антитяло, свързано с пероксидаза (Boehringer Mannheim Biochemicals), разтворено в АВ буфер. Нитроцелулозната мембрана се промива с промивен буфер, а свързаното антитяло се визуализира чрез инкубиране в продължение на 30 минути при стайна температура с 4-хлоро1-нафтол (0.5 мг/мл в 0.15% Η,Ο^,Ο.5 М NaCl, 50 mM Tris-HCl, рн 7.5). Реакцията се спира чрез усърдно промиване с дистилирана вода.

А*

ИДЕНТИФИЗИРАНЕ НА CLMF СУБЕДИНИЦАТА, СВЪРЗАНА ЧРЕЗ МОНОКЛОНАЛНИТЕ АНТИТЕЛА

CLMF представлява 75 kDa хетеродимерен протеин, съставен от 40 kDa и 35 kDa субединици. Western blot анализа се използува,за да се определи дали моноклоналните анти-CLMF антитела разпознават 40 kDa или 35 kDa субединиците. Добре пречистен 75 kDa CLMF хетеродимер се отделя чрез нередуцираща SDS/PAGE и се прехвърля на нитроцелулозна мембрана (фиг.

31) . Освен това, пречистеният CLMF, който се състои от приблизително 95% свободна 40 kDa субединица и 5% 75 kDa хетеродимер, се отделя чрез не-редуцираща и редуцираща SDS/PAGE, а протеините се прехвърлят на нитроцелулозна мембрана (фиг.

32) . Индивидуални! нитроцелулозни ивици, съдържащи не-редуцирания 75 kDa CLMF хетеродимер (фиг. 31), не-редуцираната 40

104 kDa субединица (гарната част на фиг. 32) и редуцираната 40 kDa субединица (долу на фиг. 32) се изучават с моноклонални анти-CLMF антитела, контролно моноклонално антитяло, плъши анти-CLMF серум и контролен плъши серум. Моноклоналните анти-CLMF и плъшите поликлонални анти-CLMF антитела свързват се специфично към един приблизително 75 kDa хетеродимер върху ивиците, съдържащи не-редуциран 75 kDa CLMF, докато препаратите на контролното антитяло не показват такава свързваща активност (фиг. 31)· Всичките моноклоналните и плъши поликлонални анти-CLMF антитела разпознават не-редуцираната 40 kDa субединица (фиг. 32 горе). Въпреки това, само плъшия поликлонален серум и три моноклонални антитела, 8ЕЗ, 9F5 и 22Е7, се свързват към протеина на нередуцираната 40 kDa субединица (фигл 32, долу). Тези данни демонстрират, че всички моноклонални антитела са специфични за 40 kDa субединицата на CLMF.

ИДЕНТИФИЦИРАНЕ НА CLMF РЕЦЕПТОР ВЪРХУ РНА-АКТИВИРАНИ ЛИМФОБЛАСТИ

Горните данни демонстрират, че моноклоналните анти-CLMF антитела имунопреципитират I-белязания CLMF, имуноизтощават CLMF беоактивността и се свързват към 40 kDa субединицата на CLMF. Все пак, антителата, присъстващи в хибридомните супернатантни разтвори, не магат директно да бъдат тествани за тяхната способност да неутрализират CLMF биоактивността в TGF или LAK клетъчно индукционното изследване, което се дължи на неспецифичните инхибиторни ефекти на супернатан105 тните разтвори, съдържащи контролни антитела. Нашата предхождаща работа с IL-2 моноклонални антитела демонстрира, че антителата, които биха блокирали I-IL-2 свързването към IL-2 рецептор-носещите клетки, биха неутрализирали също така IL-2 биоактивността. Тъй като изследванията за рецепторното свързване обикновено са незасегнати от добавянето на хибридомни супернатантни разтвори или други вещества, изследването на CLMF рецепторното свързване се развива за оценяване на анти-CLMF антителата за инхибиторна/неутрализираща активност. Изследването за CLMF рецепторно свързване се конфигурира с I-белязан CLMF и РНА-активирани лимфобласти от периферна кръв (фиг. 53). Свързването на Ι-CLMF към РНА-активираните лимфобласти е наситено и специфично (фиг. 33). Анализът на Scatchard плот [виж Scatchard; Ann. N.Y. Acad. Sci. 51: 660-672 (1949)] на данните за равновесното свързване сочат, че явната дисоциационна константа за I-CLMF свързващ се към рецептора, е приблизително 200 рМ, и че всеки лимфобласт притежава 700-800 рецептора. Щом серумът от плъхове, имунизирани със CLMF,показва неутрализиране на CLMF биоактивността, тества се за инхибиране на Ι-CLMF свързването към лимфобластите (фиг. 54). Плъшият имунен серум блокира 50% от I-белязаното CLMF свързване при разреждане приблизително 1/500, докато контролният плъши серум не показва никакво инхибилане при това разреждане. Със специфичността на установеното изследване за рецепторното свързване, хибридомните супернатантни разтвори се тестват за антитела, които биха инхибирали Ι-CLMF свързването към лимфоблас106 тите .

Степента _На инхибиране на Ι-CLMF свързването към лимфобластите се определя при резреждане 1/2 на всеки хибридомен супернатантен разтвор (фигл 55). Дванадесет хибридомни супернатантни разтвора инхибират с повече от 60% ^^I-CLMF свързването към лимфобластите. Антителата, присъствуващи в тези супернатантни разтвори,се класифицират като инхибиторни /неутрализиращи антитела. Шест хибридомни супернатантнти разтвора инхибират -белязаното CLMF свързване с по-малко от 40% и се класифицират като не-инхибиторни/не-неутрализиращи антитела. Контролното антитяло инхибиира с приблизително 10% Ι-CLMF свързването към лимфобластите.

Три инхибиторни антитела, 7В2, 2А5 и 4А1, и две не-инхибиторни антитела, 6АЗ и /еЗ, се пречистват от асцитните течности чрез белтъчна G афинитетна хроматография върху

GammaBind G (Genex, Gaithersburg, MD) колони. Антитела 4А1 , 2А5 и 7В2 инхибират по начин зависим от дозата -CLMF свързването към лимфобластите с ICконцентрации от

г/мл и 9.5 не блокират г/мл съответно (фиг.

Ι-CLMF свързването

56). Антитела 6АЗ и при концентрации от

8ЕЗ

100 г/мл (фиг. 36). Тези данни демонстрират, че първоначалната класификация на всяко антитяло като инхибиторно или неинхи биторно, е била правилна.

ДИРЕКТНО НЕУТРАЛИЗИРАНЕ НА CLMF БИОАКТИВНОСТТА ЧРЕЗ АНТИТЕЛА

За да се определи дали антителата, определени като ин

107 хибиторни, чрез изследването за CLMF рецепторното свързване, директно ще неутрализират CLMF биоактивността, всяко инхибиторно антитяло се тества за неутрализиране на активността при TGF изследването (таблица 16). Две инхибиторни антитела, 4А1 и 7В2, демонстрират зависещо от дозата неутрализиране на CLMF биоактивността (40 единици/мл) от 0.03 до 100у^г/мл, с IC концентрации от приблизително 1 р г/мл и 80 г/мл.съответно. Тези данни потвърждават, че антителата, инхибиращи -CLMF свързването към CLMF рецептора, също биха неутрализирали и CLMF биоактивността.

ПРИГОТВЯНЕ НА АНТИТЕЛА СРЕЩУ СИНТЕТИЧЕН ПЕПТИДЕН

ФРАГМЕНТ ОТ 35.000 ДАЛТОНА СУБЕДИНИЦАТА НА CLMF

Пептид, включващ амино киселини 3-13 от NH.-крайната последователност на 35 kDa CLMF субединицата и СООН-крайния цистеин (L-P-V-A-T-P-D-P-G-M-F-C), се синтезира по твърдофазова пептидна методология, пречиства се чрез HPLC и се конюгира с кийхол лимпет хемоцианин” чрез метода на метилира ния говежди серумен албумин. Два заека се имунизират интра дермално с конюгирания (300 улг пептид/заек).

пептид във Freund’s пълен адювант

Шест седмици след имунизирането, зайсвободен пептид (100р г интравенозно) и KLH-конюгиран пептид (150 г,подкожно), ците се подпомагат със

разтворени в

PBS. Приготвят се серумни проби от кръв,взета 7 дена по-кьсно. Спомагателната и кръвоотнемащата програма се повтарят всеки 4-5 седмици.

108

ТАБЛИЦА 16

Неутрализиране на CLMF биоактивността от моноклонален анти-CLMF

съдържание CLMF⁰	на опита: Ь антитяло	общ ^Н-тимидин включен	% неутрализация
·», няма	няма	9923 + 439
CLMF	няма	25752 + 592
CLMF	4А1
	100 рлг/мл	12965 + 938	81
	J 20	12215 + 663	86
	4	12985 + 269	81
	. 8	19932 + 1016	37
	. 16	22379 + 410	21
	.03	25405 + 1093	2
CLMF	7В2
	200 у-т/мл	10763 + 878	96
	100	15083 + 406	67
	20	23690 + 1228	13
	4	25849 + 1408	0
CLMF	контрола
	200 учг/мл	27654 + 1086	0
	100	22221 + 381	22
	20	27335 + 620	0

Използува се пречистен CLMF при TGF изследването при концентрация 40 единици/мл.

Прибавят се пречистени антитела при посочената в таблицата концентрация.

^с Редукция на Н-тимидин инкорпорирането до наблюдаваната степен, се приема за 100% неутрализация, при липса на добавка на 109 цитокини.

Серумни проби от първото и второто кръвоотнемане от всеки заек се изчисляват да реагират със синтетичния пептид при директно ELISA изследване. Синтетичният, свободен пептид, се поставя в микротитърно блюдо при 4 нг/мл и 20 нг/мл, а блюдата се промиват и блокират с говежди серумен албумин. Серумните проби се тестват при различни разреждания (таблица 17), и реактивността на антителата се установява с помощта на второ антитяло (HRP-конюгиран кози анти-заешки IgG) с о-фенилендиамин, като субстрат. Стойностите на поглъщане се отчитат при 490 нм, след добавяне на H^SO^ за прекратяване на реакцията. Резултатите сочат, че антитялото е продуцирано и в двата заека срещу 55,000 далтона CLMF пептида (таблица 17). В отделни експерименти се проверява дали антитялото е специфично за пептида, щом (а) серум от неимунизирани. зайци не реагира с пептида при ELISA, (Ь) серуми от зайци, имунизирани със синтетичния пептид не реагират с пептидния фрагмент от 40.000 далтона CLMF субединицата и (с) пречистен IgG от серумните проби също реагира със синтетичния пептид.

Серумна проба от един от зайците (първо кръвоотнемане) се изследва чрез Western blot анализ за реактивност със 75 kDa CLMF и с 35 kDa CLMF субединицата (фиг. 37). Частично пречистен CLMF (приблизително 120 г/мл) се пуска на SDS/PAGE, прехвърля се върху нитроцелулоза и се обработва с разреждане 1:500 на заешки анти-CLMF пептиден антисерум. Реактивността на антителата се установява с помощта на биотинилиран кози анти-заешки IgG и конюгиран с алкална фосфатаза стрептавидин. Установява се, че анти-CLMF пептидното антитя

110 ло реагира и с нередуцирания 75 kDa CLMF протеин и с редуцираната 35 kDa CLMF субединица (фиг. 37).

Въпреки, че продуцираните в този пример антитела са поликлонални, подобно приближение може да се използува за приготвяне на моноклонални антитела за 35 kDa субединицата на CLMF. Използуваният в този пример синтетичен паптид или други синтетични пептиди, основавайки се на амино киселинната последователност на 35 kDa CLMF субединицата (фиг. 26) могат да се използуват за имунизирането на плъхове. Сливането може да се постигне и хибридомните култури да се скринират за продукцията на моноклонални анти-CLMF антитела, както е описано по-горе.

111 to to to to to to ω X a x

a ω H o £ X X X to to to to to to

X tO σ’ a n a Ό 4

X z a >-3 I z o to o to o to o

to o

I I 1 I I I I I

I I

I I I I I I

I o

0 o o fa a

X s

•ri

Ί3 > a

X a x

X fa a

a a a tri a ω O to tri to a > a tri o tri ris

I =3 m a H a

o

to

o

to

o

to

o

to

I 1 1 X 1

to

a

o

Ό

to

o

40

Ό

o

40

Ln

o

Ό

1 1

O

a “

Ln

LH

Ln

LA

1 ►- 1

-3

*T5

o -£I I

CO

U1 o tri a o

I o o

1 to 1

o

h·*

o

to

o

t—*

o

to

1 · 1

CO

•

I cn i

to

>

o

φ.

LZ1

o

Ln

to

o

04

co

o

φ.

>—*

1 1

>

a

Ln

LA

Ln

1 X 1

n

to

1 1

a

1 1

to

O

-

¹ 4J

«4

1 -S-l

X

>

a

I I I

I I to x ω

I I o

tri w

o

t-*

o

H-ь

1 · 1 1 to 1

ω *0

to a

a a

o

to

o

Ca

04

o

•

*

•

1 1

a

>

a

>

Ln

LA

Ln

o

LJ

1 X 1

X

t-

a

Ln

1 1

fa

45

a

1 »- 1

3

Ό

>

1 O 1

X

>-3

o

1 *·!

a

>

HO

I I I

I I

I a >

o r

Ξ ΕΞ «4 > tri Xi

I I x σ’ H x

o

1 > 1 1 O\ 1

1 1

x a

s t—«

o

Ln

o

to

40

o

to

•

1 1

1

>

LA

Ln

O'.

• o

00

ί У ¹

1

LA

1

1—*

Ό

I I I

o	o	o	o	o	o	o
o		ca	o		LH	o
Ln			LA			C/1

ω ₁₁₂o - v>

I I I

I I

I

I I

I

I I »!

I

I -!

I

I o v.l

U>

o .

4i

Claims

ПАТЕНТНИ ПРЕТЕНЦИИ

1. Протеин, притежаващ активност на ЦитотоксиченЛимфоцитен Фактор на съзряване (CLMF) е по същество чист вид или производен на посочения протеин, който производен проявява CLMF активност и съдържа най-малко част от амино киселинната последователност на природната форма на CLMF.
2. Протеин, съгласно претенция 1, който представлява природната форма на CLMF, с молекулно тегло 75 kDa или биологично активен негов фрагмент.
3. Протеин, съгласно претенция 1, който представлява природната форма на CLMF, с молекулно тегло 75 kDa или биологично активен негов фрагмент, при което 75 kDa CLMF полипептидът се състои от две субединици свързани с дисулфидна връзка, 35 kDa субединицата и 40 kDa субединицата.
4. Протеин, съгласно претенция 1, притежаващ следната амино киселинна последователност

Arg Asn Leu Pro Vai Ala Thr Pro Asp Pro Gly MET Phe Pro Cys Leu His His Ser Gin Asn Leu Leu Arg Ala Vai Ser Asn MET Leu Gin Lys Ala Arg Gin Thr Leu Glu Phe Tyr Pro Cys Thr Ser Glu Glu He Asp His Glu Asp lie Thr Lys Asp Lys Thr Ser Thr Vai Glu Ala Cys Leu Pro Leu Glu Leu Thr Lys Asn Glu Ser Cys Leu Asn Ser Arg Glu Thr Ser Phe lie Thr Asn Gly Ser Cys Leu Ala Ser Arg Lys Thr Ser Phe MET MET Ala Leu Cys Leu Ser Ser He Tyr Glu Asp Leu Lys MET Tyr Gin Vai Glu Phe Lys Thr MET Asn

113 (продължение )

Ala Lys Leu Leu MET Asp Pro Lys Arg Gin lie Phe Leu Asp Gin Asn MET Leu Ala Vai lie Asp Glu Leu MET Gin Ala Leu Asn Phe Asn Ser Glu Thr Vai Pro Gin Lys Ser Ser Leu Glu Glu Pro Asp Phe Tyr Lys Thr Lys He Lys Leu Cys He Leu Leu His Ala Phe Arg He Arg Ala Vai Thr He Asp Arg Vai Thr Ser Tyr Leu Asn

Ala Ser или вместо това, суб-последователност, притежаваща по избор Met остатък при N-края.

5. Протеин, съгласно претенция 1, съдържащ следната амино киселинна последователност

He Trp Glu Leu Lys Lys Asp Vai Tyr Vai Vai Glu Leu Asp Trp Tyr Pro Asp Ala Pro Gly Glu MET Vai Vai Leu Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Gly He Thr Trp Thr Leu Asp Gin Ar Ser Ser Glu Vai Leu Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr He Gin Vai Lys Glu Phe Gly Asp Ala Gly Gin Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Vai Leu Ser His Ser Leu Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asp Gly He Trp Ser Thr Asp lie Leu Lys Asp Gin Lys Glu Pro Lys Asn Lys Thr Phe Leu Arg Cys Glu Ala Lys Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp Leu Thr Thr He Ser Thr Asp Leu Thr Phe Ser Vai Lys Ser Ser Arg Gly Ser Ser Asp Pro Gin Gly Vai Thr Cys Gly Ala Ala Thr Leu Ser Ala Glu Arg Vai Arg Gly Asp Asn Lys Glu Tyr Glu Tyr Ser Vai Glu Cys Gin Glu Asp Ser Ala Cys Pro Ala Ala Glu Glu Ser Leu Pro He Glu Vai MET Vai Asp Ala Vai His Lys Leu Lys Tyr Glu Asn Tyr Thr Ser Ser Phe Phe lie Arg Asp He He Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn Leu Gin Leu Lys Pro Leu Lys Asn Ser Arg Gin Vai Glu Vai Ser Trp Glu Tyr Pro Asp Thr Trp

114 (продължение )

Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Thr Phe Cys Vai Gin Vai Gin Gly Lys Ser Lys Arg Glu Lys Lys Asp Arg Vai Phe Thr Asp Lys Thr Ser Ala Thr Vai He Cys Arg Lys Asn Ala Ser lie Ser Vai Arg Ala Gin Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp Ser Glu Trp Ala Ser Vai Pro Cys i Ser

или вместо това, суб-последователност, притежаваща по избор Met остатък при N-края.

б. Изолиран полинуклеотид, кодиращ протеин, съгласно коя да е претенция от 1 до 5.

7. Изолиран полинуклеотид, кодиращ протеин, съгласно коя да е претенция от 1 до 5, който полинуклеотид съдържа цялата или част от нуклеотидната последователност:

ATG TGT CAC CAG CAG TTG GTC ATC TCT TGG TTT TCC CTG GTT TTT CTG GCA TCT CCC CTC GTG GCC ATA TGG GAA CTG AAG AAA GAT GTT TAT GTC GTA GAA TTG GAT TGG TAT CCG GAT GCC CCT GGA GAA ATG GTG GTC CTC ACC TGT GAC ACC CCT GAA GAA GAT GGT ATC ACC TGG ACC TTG GAC CAG AGC AGT GAG GTC TTA GGC TCT GGC AAA ACC CTG ACC ATC CAA GTC AAA GAG TTT GGA GAT GCT GGC CAG TAC ACC TGT CAC AAA GGA GGC GAG GTT CTA AGC CAT TCG CTC CTG CTG CTT CAC AAA AAG GAA GAT GGA ATT TGG TCC ACT GAT ATT TTA AAG GAC CAG AAA GAA CCC AAA AAT AAG ACC TTT CTA AGA TGC GAG GCC AAG AAT TAT TCT GGA CGT TTC ACC TGC TGG TGG CTG ACG ACA ATC AGT ACT AGT TTG ACA TTC AGT GTC AAA AGC AGC AGA GGC TCT TCT GAC CCC CAA GGG GTG ACG TGC GGA GCT GCT ACA CTC TCT GCA GAG AGA GTC AGA GGG GAC AAC AAG GAG TAT GAG TAC TCA GTG GAG TGC CAG GAG GAC AGT GCC TGC CCA GCT GCT GAG GAG AGT CTG CCC ATT GAG GTC

115 (продължение )

ATG GTG GAT GCC GTT CAC AAG CTC AAG TAT GAA AAC TAC ACC AGC AGC ТТС ТТС АТС AGG GAC ATC ATC AAA CCT GAC CCA CCC AAG AAC TTG CAG CTG AAG CCA TTA AAG AAT TCT CGC CAG GTG GAG GTC AGC TGG GAG ТАС ССТ GAC ACC TGG AGT ACT CCA CAT TCC TAC TTC TCC CTG АСА ТТС TGC GTT CAG GTC CAG GGC AAG AGC AAG AGA GAA AAG ААА GAT AGA GTC TTC ACG GAC AAG ACC TCA GCC ACG GTC ATC TGC CGC ААА ААТ GCC AGC ATT AGC GTG CGG GCC CAG GAC CGC TAC TAT

AGC ТСА ТСТ TGG AGC GAA TGG GCA ТСТ GTG ССС TGC AGT.

8. Изолиран полинуклеотид, кодиращ протеин, съгласно коя да е претенция от 1 до 5 който полинуклеотид съдържа цялата или част от нуклеотидната последователност:

ATG TGT CCA GCG CGC AGC CTC CTC CTT GTG GCT ACC CTG GTC CTC CTG GAC CAC CTC AGT TTG GCC AGA AAC CTC CCC GTG GCC ACT CCA GAC CCA GGA ATG TTC CCA TGC CTT CAC CAC TCC CAA AAC CTG CTG AGG GCC GTC AGC AAC ATG CTC CAG AAG GCC AGA CAA ACT CTG GAA TTT TAC CCT TGC ACT TCT GAA GAG ATT GAT CAT GAA GAT ATC ACA AAA GAT AAA ACC AGC ACA GTG GAG GCC TGT TTA CCA TTG GAA TTA ACC AAG AAT GAG AGT TGC CTA AAT TCC AGA GAG ACC TCT TTC ATA ACT AAT GGG AGT TGC CTG GCC TCC AGA AAG ACC TCT TTT ATG ATG GCC CTG TGC CTT AGT AGT ATT TAT GAA GAC TTG AAG ATG TAC CAG GTG GAG TTC AAG ACC ATG AAT GCA AAG CTT CTG ATG GAT CCT AAG AGG CAG ATC TTT CTA GAT CAA AAC ATG CTG GCA GTT ATT GAT GAG CTG ATG CAG GCC CTG AAT TTC AAC AGT GAG ACT GTG CCA CAA AAA TCC TCC CTT GAA GAA CCG GAT TTT TAT AAA ACT AAA ATC AAG CTC TGC ATA CTT CTT CAT GCT TTC AGA ATT CGG GCA GTG ACT ATT GAC

AGC GTG ACG AGC TAT CTG ААТ GCT ТСС.

116

9. Рекомбинантен вектор, съдържаш полинуклеотид, коди-

ращ протеин, съгласно коя да е претенция от 1 до 5.

10. Рекомбинантен вектор,съдържащ полинуклеотид, ко-

диращ протеин, съгласно коя да е претенция от 1 до 5_? който включва цялата или част от нуклеотидната последователност, посочена в претенция 7.

11 . Рекомбинантен вектор, съдържащ полинуклеотид, ко-

диращ протеин, съгласно коя да е претенция от 1 до 5,който включва цялата или част от нуклеотидната последователност, посочена в претенция 8.

12. Микроорганизъм, трансформиран с рекомбинантен

вектор,съдържащ полинуклеотид, кодиращ протеин, съгласно коя да е претенция от 1 до 5.

13. Микроорганизъм, трансформиран с рекомбинантен

вектор, съдържащ полинуклеотид, кодиращ протеин, съгласно коя да е претенция ^от 1 до 5 който включва . цялата или част от нуклеотидната последователност, посочена в претенция 7.

14. Микроорганизъм, трансформиран с рекомбинантен

вектор,съдържащ полинуклеотид, кодиращ протеин, съгласно коя да е претенция от 1 до 5,който включва > цялата или част от нуклеотидната последователност, посочена в претенция 8.

15. По същественоι чисто поликлонално или моноклонално антитяло, насочено срещу CLMF. 16. Протеин, съгласно коя да е претенция от 1 до 5,

като антитуморен агент.

17. Метод за получаване . на протеин, съгласно коя да

е претенция от 1 до 5, който включва:

117 (a) Култивиране на микроорганизъм, трансформиран с рекомбинантен вектор, съдържащ полинуклеотид, кодиращ посочения протеин, в културална среда при условия, позволяващи експресията на кодирания протеин; и (b) получаване на експресирания протеин от културалната среда.

18. Метод за производство на протеин, съгласно коя да е претенция от 1 до 5, който метод включва:

(a) приготвяне на суб-единични пептиди от посочения протеин чрез конвенционални методи за белтъчен синтез; и (b) свързване на суб-единичните пептиди, при условия, благоприятствуващи образуването на пептидни връзки.

19- Метод за производство на протеин, съгласно коя да е претенция от 1 до 5, които протеин е Цитотоксичен Лимфоцитен Фактор на съзряване (CLMF) в по същество чиста форма, кой\s то метод включва:

(a) стимулиращи кетки, способни да продуцират CLMF, като лимфобластоидни клетки, които да произвеждат и секретират в супернатантната течност;

(b) събиране на супернатантната течност, произведена от стимулираните клетки;

(c) разделяне на супернатантната течност на протеинови фракции;

(d) тестване на всяка протеинова фракция за наличие на CLMF, използувайки подходящ опит;

(e) запазване на протеиновата фракция, която съдържа CLMF; и

118 (f) изолиране на CLMF от посочената CLMF-съдържаща протеинова фракция, в по същество чиста форма.

20. Метод, съгласно претенция 19, където клетките са NC-37 В лимфобластоидни клетки.

21. Метод, съгласно претенция 19, където супернатантната течност се разделя на протеинови фракции с помощта ^насилна катионообменна колона.

22. Метод, съгласно претенция 19, където супернатантната течност се разделя на протеинови фракции с помощта на сулфопропилова катионообменна смола.

25 - Метод, съгласно претенция 19, където супернатантната течност се разделя на протеинови фракции с помощта на силна катионообменна колона, който метод включва по-нататък:

(a) преминаване на протеиновите фракции, съдържащи CLMF, през агарозен гел, като посочениятагарозен гел се състои от Blue В багрило, ковалентно свързано към агарозна матрица; и (b) тестване на елюираните протеинови фракции през посочения агарозен гел за присъствие на CLMF и запазване на протеиновите фракции, които съдържат CLMF.

24. Метод, съгласно претенция 19, където супернатантната течност се разделя на протеинови фракции с помощта на силна катионообменна колона, който метод включва преминаване на протеиновите фракции, съдържащи CLMF, през агарозен гел, като посочениятагарозен гел се състои от Blue В багрило, ковалентно свързано към агарозна матрица,и тестване на елюираните протеинови фракции през посочения агарозен гел за при

119 съствие на CLMF и запазване на протеиновите фракции, които съдържат CLMF, и който процес включва по-нататък:

(a) елюиране на протеиновите фракции, съдържащи CLMF, получени по този начин, през силен анионен обменител по начина на Високо Ефективна Течна Хроматография или по начина на Бърза Протеинова Течна Хроматография, за да се получат протеиновите фракции; и (b) тестване на протеиновите фракции, елюирани през силния анионен обменнмк , за наличие на CLMF и запазване на протеиновите фракции, съдържащи CLMF.

25. Метод за производство на протеин, съгласно претенция 1, от супернатантни течности, получени от култивираните клетки, които течности съдържат CLMF заедно с други протеини, който метод включва:

(a) разделяне на супернатантните течности на протеинови фракции;

(b) тестване на всяка протеинова фракция за наличие на CLMF с помощта на подходящо изследване;

(c) запазване на протеиновата фракция, съдържаща CLMF; и (d) изолиране на CLMF от посочената CLMF-съдържаща протеинова фракция в по същество чиста форма.

26. Метод за приготвяне на трансформиран микроорганизъм, способен да продуцира протеин, съгласно коя да е претенция от 1 до 5, който метод включва:

(а) трансформиране на микроорганизъм с рекомбинантен вектор, включващ полинуклеотид кодиращ протеин, съгласно коя

120 да е претенция от 1 до 5;

(b) култивиране на трансформирания микроорганизъм в културална среда; и (c) получаване на микроорганизма от културалната среда.

27. Метод за приготвяне на антитяло, насочено срещу CLMF, който метод включва:

(a) инжектиране на протеин, съгласно коя да е претенция от 1 до 5, в топлокръвно животно, способно да предизвика имунен отговор срещу посочения протеин; и (b) извличане на антитялото от животното.

28. Фармацевтичен състав, включващ протеин,съгласно коя да е претенция от 1 до 5, и фармацевтично приемлив разредител, адюват или носител.

29. Фармацевтичен състав, включващ протеин,съгласно коя да е претенция от 1 до 5, интерлевкин-2 протеини и фармацевтично приемлив разредител, адюват или носител.

50 Приложение на протеина, съгласно коя да е претенция от 1 до 5, като антитуморен агент или за производство на лекарствено Средство за антитуморна терапия.

31 - Протеин, получен ,_{по метода>} съгласно коя да е

претенция от 17 до 25. получен по метод, 52. Трансформиран микроорганизъм, съгласно претенция 26. 53. Антитяло насочено към CLMF, получено по метод,

съгласно претенция 27.

34. Вещество или състав, включващ протеин, съгласно

121 коя да е претенция от 1 до 5, за приложение като антитуморен агент при метод за третиране, като посоченият метод включва приложение на посоченото вещество или състав.

Метод за стимулиране на LAK клетки, включващ обработване на LAK клетките с CLMF или с биологично активен фрагмент на

CLMF или с протеин, съгласно коя да е претенция от 1 до 5, и с интерлевкин-2 или с биологично активен фрагмент.

36.

Метод за стимулиране на активирани Т-клетки, включващ обработване на Т-клетките с CLMF или с биологично активен фрагмент на CLMF или с протеин, съгласно коя да е претенция от до 5.

57.

Метод за стимулиране на активирани Т-клетки, включващ:

(а) обработване на Т-клетките с CLMF или биологично активен фрагмент на CLMF или с протеин, съгласно коя да е претенция от 1 до 5; и (Ь) обработване на активираните Т-клетки с интерлевкин-2 или биологично активен фрагмент.

38.

Метод за стимулиране на Природни Килърни клетки, включващ обработване на

Природни Килърни Клетки с GLMF или биологично активен фрагмент на CLMF или с протеин, съгласно коя да е претенция от 1

39.

Нов протеин, основно описан и илюстриран тук.

Нов изолиран полинуклеотид, основно описан и илю122 стриран

Нов рекомбинантен вектор, основно описан и илюстриран

42.

Нов микроорганизъм, основно описан и илюстриран тук

45.

Ново антитяло, основно описано и илюстрирано тук.

44.

Изобретението, съгласно претенция 16, основно описано и илюстрирано тук.

45.

Метод за производство на протеин, съгласно коя да е претенция от 1 до

5, основно описан и илюстриран тук.

46.

Метод за приготвяне на трансформиран микроорганизъм,способен да продуцира протеин, съгласно коя да е претенция от 1 до

5, основно описан и илюстриран тук.

47.

Нов метод за приготвяне на антитяло, насочено срещу CLMF, основно описан и илюстриран тук.

48.

Нов фармацевтичен състав, основно описан и илюстриран тук

49.

Изобретението, съгласно претенция 30, основно описано и илюстрирано тук

50.

Нов метод за стимулиране на LAK клетки, основно описан и илюстриран тук.

Нов метод за стимулиране на активирани Т-клетки, основно описан и илюстриран тук.

52.

Нов метод за стимулиране на Природни Килърни

Клетки, основно описан и илюстриран тук.

53.

Вещество или състав за ново приложение при метод за третиране, основно описано и илюстрирано тук.