JPH06189787A - モノクローナル抗体、ハイブリドーマおよびそれらの用途 - Google Patents
モノクローナル抗体、ハイブリドーマおよびそれらの用途Info
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- JPH06189787A JPH06189787A JP5017656A JP1765693A JPH06189787A JP H06189787 A JPH06189787 A JP H06189787A JP 5017656 A JP5017656 A JP 5017656A JP 1765693 A JP1765693 A JP 1765693A JP H06189787 A JPH06189787 A JP H06189787A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】ヒト神経成長因子２（ヒトＮＧＦ２）の生物活
性を中和し、ヒトＮＧＦ２に特異的に結合するモノクロ
ーナル抗体を提供する。 【構成】ヒトＮＧＦ２で免疫した動物の脾臓細胞とミエ
ローマ細胞株の細胞融合により、ヒトＮＧＦ２の生物活
性を中和し、ヒトＮＧＦ２に特異的に結合するモノクロ
ーナル抗体を製造した。 【効果】本発明のモノクローナル抗体は、痴呆などの疾
病薬などとして用いることができる。
性を中和し、ヒトＮＧＦ２に特異的に結合するモノクロ
ーナル抗体を提供する。 【構成】ヒトＮＧＦ２で免疫した動物の脾臓細胞とミエ
ローマ細胞株の細胞融合により、ヒトＮＧＦ２の生物活
性を中和し、ヒトＮＧＦ２に特異的に結合するモノクロ
ーナル抗体を製造した。 【効果】本発明のモノクローナル抗体は、痴呆などの疾
病薬などとして用いることができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ヒト神経成長因子２
(ヒトＮＧＦ−２)蛋白質に対するモノクローナル抗体、
ハイブリドーマ、それらの製造法およびそれらの用途に
関する。
(ヒトＮＧＦ−２)蛋白質に対するモノクローナル抗体、
ハイブリドーマ、それらの製造法およびそれらの用途に
関する。
【０００２】
【従来の技術】神経栄養因子群は、神経成長因子( nerv
e growth factor，ＮＧＦ)がレヴィーモンタルチーニ(L
evi−Monntalcini) 〔アニュアル ニューヨーク アカ
デミーオブ サイエンス（Anu. N. Y. Acad. Sci）５
５，３３０(１９５２)〕およびコーエン( Cohen )ら
〔プロシーディングス オブ ナショナル アカデミー
オブ サイエンス ユエスエー(Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ）,
４０，１０１４(１９５４)〕によって見出されて以来、
多数の因子が見い出されている。これらの因子は、神経
細胞の分化、成熟、生存、機能維持、増殖などの多様な
機能を担っているものと考えられている。これらの因子
は具体的には、先に上げたＮＧＦ以外に、脳由来神経栄
養因子（brain devived neurotrophic factor；ＢＤＮ
Ｆ，Barde Ｙ−Ａ，et al エンボ ジャーナル（ＥＭＢ
Ｏ J.）,１，５４９−５５３(１９８２)），毛様体神
経栄養因子（ciliary neurotrophic factor；ＣＮＴ
Ｆ，Watters. D. et al ジャーナル オブ ニューロケ
ミストリー（J. Neurochem）,４９，７０５−７１３，
(１９８７)などがある。また、線維芽細胞増殖因子（fi
broblast growth factor；ＦＧＦ），上皮細胞成長因子
（epidermal growth factor；ＥＧＦ），インスリン様
成長因子（insulin like growth factor；ＩＧＦ），イ
ンタロイキン６（interleukin６；ＩＬ−６）などにも
神経栄養活性のあることが認められている。
e growth factor，ＮＧＦ)がレヴィーモンタルチーニ(L
evi−Monntalcini) 〔アニュアル ニューヨーク アカ
デミーオブ サイエンス（Anu. N. Y. Acad. Sci）５
５，３３０(１９５２)〕およびコーエン( Cohen )ら
〔プロシーディングス オブ ナショナル アカデミー
オブ サイエンス ユエスエー(Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ）,
４０，１０１４(１９５４)〕によって見出されて以来、
多数の因子が見い出されている。これらの因子は、神経
細胞の分化、成熟、生存、機能維持、増殖などの多様な
機能を担っているものと考えられている。これらの因子
は具体的には、先に上げたＮＧＦ以外に、脳由来神経栄
養因子（brain devived neurotrophic factor；ＢＤＮ
Ｆ，Barde Ｙ−Ａ，et al エンボ ジャーナル（ＥＭＢ
Ｏ J.）,１，５４９−５５３(１９８２)），毛様体神
経栄養因子（ciliary neurotrophic factor；ＣＮＴ
Ｆ，Watters. D. et al ジャーナル オブ ニューロケ
ミストリー（J. Neurochem）,４９，７０５−７１３，
(１９８７)などがある。また、線維芽細胞増殖因子（fi
broblast growth factor；ＦＧＦ），上皮細胞成長因子
（epidermal growth factor；ＥＧＦ），インスリン様
成長因子（insulin like growth factor；ＩＧＦ），イ
ンタロイキン６（interleukin６；ＩＬ−６）などにも
神経栄養活性のあることが認められている。
【０００３】ヒト神経成長因子２（ＮＧＦ−２）は、ヨ
ーロッパ特許出願公開第３８６,７５２号公報にポリペ
プチド(Ｉ)として示され、また、フエブス レター（Ｆ
ＥＢＳ Letters），２６６，１８７−１９１(１９９
０)に発表されている。これと同じ因子が、Hohn ら，ネ
イチャー（Nature），３４４，３９９(１９９０）など
の文献に神経栄養因子３（neurotrophic factor；ＮＴ
−３）として発表されており、またＰＣＴ公開ＷＯ９１
／０３５６９号公報に示されている。該ヒト神経成長因
子２を、本明細書においては、ヒトＮＧＦ−２／ＮＴ−
３と略称することもある。ヒトＮＧＦ−２／ＮＴ−３に
ついては、(１)ヒトＮＧＦ−２／ＮＴ−３遺伝子は腎臓
および脳中の海馬，小脳に強く発現している。(２)成熟
動物（ラット）よりも新生仔の方が発現が強い。(３)Ｎ
ＧＦ，ＢＤＮＦが作用を示さないか弱い作用を示すよう
な神経細胞（例えば nodose ganglion 由来神経細胞）
に作用を示すことが判明している。これらのことから、
ヒトＮＧＦ−２／ＮＴ−３は神経系の発達時に重要な働
きをしていると考えられる。またＮＴ−３などの神経栄
養因子の活性が通常より強く作用しすぎた場合、痴呆症
などの疾病を誘発する可能性も示唆されている( Y. Uch
ida ら，ニューロン（Neuron）７：３３７(１９９
１)）。それらの治療薬の一つとしてヒトＮＧＦ−２／
ＮＴ−３の活性を阻害するモノクローナル抗体が考えら
れるが、現在までその可能性は、認められていない。ま
た、そられの疾病を診断する手段の一つとして体液中の
ヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３濃度を測定することが考えられ
るが、このような測定系は未だ得られていない。
ーロッパ特許出願公開第３８６,７５２号公報にポリペ
プチド(Ｉ)として示され、また、フエブス レター（Ｆ
ＥＢＳ Letters），２６６，１８７−１９１(１９９
０)に発表されている。これと同じ因子が、Hohn ら，ネ
イチャー（Nature），３４４，３９９(１９９０）など
の文献に神経栄養因子３（neurotrophic factor；ＮＴ
−３）として発表されており、またＰＣＴ公開ＷＯ９１
／０３５６９号公報に示されている。該ヒト神経成長因
子２を、本明細書においては、ヒトＮＧＦ−２／ＮＴ−
３と略称することもある。ヒトＮＧＦ−２／ＮＴ−３に
ついては、(１)ヒトＮＧＦ−２／ＮＴ−３遺伝子は腎臓
および脳中の海馬，小脳に強く発現している。(２)成熟
動物（ラット）よりも新生仔の方が発現が強い。(３)Ｎ
ＧＦ，ＢＤＮＦが作用を示さないか弱い作用を示すよう
な神経細胞（例えば nodose ganglion 由来神経細胞）
に作用を示すことが判明している。これらのことから、
ヒトＮＧＦ−２／ＮＴ−３は神経系の発達時に重要な働
きをしていると考えられる。またＮＴ−３などの神経栄
養因子の活性が通常より強く作用しすぎた場合、痴呆症
などの疾病を誘発する可能性も示唆されている( Y. Uch
ida ら，ニューロン（Neuron）７：３３７(１９９
１)）。それらの治療薬の一つとしてヒトＮＧＦ−２／
ＮＴ−３の活性を阻害するモノクローナル抗体が考えら
れるが、現在までその可能性は、認められていない。ま
た、そられの疾病を診断する手段の一つとして体液中の
ヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３濃度を測定することが考えられ
るが、このような測定系は未だ得られていない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】ヒトＮＧＦ２／ＮＴ−
３は、痴呆などの疾病と関与しており、したがって、ヒ
トＮＧＦ２／ＮＴ−３の過剰な活性を阻害することがこ
れらの治療薬となる可能性がある。また、ヒトＮＧＦ２
／ＮＴ−３はそれ自体が神経損傷の際の治療薬となる可
能性がある。この際、ヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３を医薬品
として開発する上でヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３を定量する
ことは不可欠となる。さらに、痴呆症などの過剰なヒト
ＮＧＦ２／ＮＴ−３活性に起因する疾病においても血中
ヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３量を追跡することによって該疾
病を診断することが可能となる。ヒトＮＧＦ２／ＮＴ−
３は、体液中には微量にしか存在せず、感度の高い測定
法が必要である。
３は、痴呆などの疾病と関与しており、したがって、ヒ
トＮＧＦ２／ＮＴ−３の過剰な活性を阻害することがこ
れらの治療薬となる可能性がある。また、ヒトＮＧＦ２
／ＮＴ−３はそれ自体が神経損傷の際の治療薬となる可
能性がある。この際、ヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３を医薬品
として開発する上でヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３を定量する
ことは不可欠となる。さらに、痴呆症などの過剰なヒト
ＮＧＦ２／ＮＴ−３活性に起因する疾病においても血中
ヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３量を追跡することによって該疾
病を診断することが可能となる。ヒトＮＧＦ２／ＮＴ−
３は、体液中には微量にしか存在せず、感度の高い測定
法が必要である。
【０００５】
【課題を解決するための手段】上記実状にかんがみ、本
発明者らは高感度のヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３蛋白質の測
定を可能ならしめ、かつヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３蛋白質
の作用を中和するモノクローナル抗体を作製し、これに
基づいてさらに研究した結果、本発明を完成した。
発明者らは高感度のヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３蛋白質の測
定を可能ならしめ、かつヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３蛋白質
の作用を中和するモノクローナル抗体を作製し、これに
基づいてさらに研究した結果、本発明を完成した。
【０００６】本発明は、(１)、次の(i)〜(iv)の特徴 (i)分子量：約１４万〜１６万、 (ii)免疫グロブリンクラス：ＩgＧ、 (iii)ヒト神経成長因子（ＮＧＦ）２の生物活性を中和
しうる、 (iv)ヒト神経成長因子（ＮＧＦ）と交差反応しない を有する抗ヒト神経成長因子２特異モノクローナル抗
体； (２)ヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３で免疫した哺乳動物の脾臓
細胞と、同種または異種のリンパ球様細胞とからなるク
ローン化されたハイブリドーマ； (３)上記(２)項のクローン化されたハイブリドーマを液
体培地中または哺乳動物の腹腔内で増殖し、モノクロー
ナル抗体を生成、蓄積せしめ、これを採取することを特
徴とする、上記(１)項のモノクローナル抗体の製造法； (４)上記(１)項のモノクローナル抗体を用いることを特
徴とするヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３蛋白質の精製法；およ
び (５)上記(１)項のモノクローナル抗体を用いることを特
徴とするヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３蛋白質の検出または定
量法である。
しうる、 (iv)ヒト神経成長因子（ＮＧＦ）と交差反応しない を有する抗ヒト神経成長因子２特異モノクローナル抗
体； (２)ヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３で免疫した哺乳動物の脾臓
細胞と、同種または異種のリンパ球様細胞とからなるク
ローン化されたハイブリドーマ； (３)上記(２)項のクローン化されたハイブリドーマを液
体培地中または哺乳動物の腹腔内で増殖し、モノクロー
ナル抗体を生成、蓄積せしめ、これを採取することを特
徴とする、上記(１)項のモノクローナル抗体の製造法； (４)上記(１)項のモノクローナル抗体を用いることを特
徴とするヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３蛋白質の精製法；およ
び (５)上記(１)項のモノクローナル抗体を用いることを特
徴とするヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３蛋白質の検出または定
量法である。
【０００７】本発明でいうヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３は、
本蛋白質自体、該蛋白質活性を有するムテインあるいは
該蛋白質活性を有する誘導体を含む。本発明において、
免疫原として用いられるヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３として
は、ヒト由来のものが好ましいが、同一または類似の配
列を有する他の哺乳動物由来のものも用いることができ
る。該哺乳動物としては、マウス、ラット、サル、ブ
タ、ウシ、ヒツジ、ウマなどが挙げられる。またヒトＮ
ＧＦ２／ＮＴ−３蛋白質として、脳や腎臓などにの各種
臓器から抽出される得るものが挙げられるが、遺伝子組
み換え技術により製造されたヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３蛋
白質は、均質な抗体を得るうえで有利であり、とりわけ
好ましく用いられる。ヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３活性を有
するポリペプチドとしては、具体的には、例えば〔図２
４〕（配列表：配列番号１０。ただし、そのＣ末端にＸ
＝Ｈ又はＴhrが付加。）で示されるアミノ酸配列を有す
るポリペプチド(Ｉ)（ＥＰ−３８６,７５２，特開平３
−２０４ ８９７にポリペプチド(Ｉ)として記載された
ペプチド）や、その生物学的もしくは免疫学的活性に必
要な一部分のアミノ酸配列からなるフラグメントでもよ
い。上記フラグメントとしては、例えばポリペプチド
(Ｉ)のアミノ末端から５個のアミノ酸残基を欠くフラグ
メント（ヨーロッパ特許公 開第４９９９９３号公報）
やカルボキシル末端部の数個のアミノ酸残基を欠くフラ
グメントなどが挙げられる。さらに該ポリペプチド(Ｉ)
の構成アミノ酸残基の一部が欠損しているか他のアミノ
酸に置換されたものでもよい。また上記ＮＧＦ−２／Ｎ
Ｔ−３活性物質は、ポリエチレングリコール誘導体な
ど、化学修飾されたものでもよい。とりわけ、本発明に
おいては、上記ポリペプチド(Ｉ)として示されるアミノ
酸配列を有するヒトＮＧＦ−２／ＮＴ−３を用いるのが
好ましく、この場合そのアミノ末端にさらにメチオニン
残基（Met）を有するものと有さないものとの混合物で
あってもよく、またアミノ末端にMetを有さずチロシン
（Tyr）で始まるもの（日本特願平４−２９２０９）で
もよい。
本蛋白質自体、該蛋白質活性を有するムテインあるいは
該蛋白質活性を有する誘導体を含む。本発明において、
免疫原として用いられるヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３として
は、ヒト由来のものが好ましいが、同一または類似の配
列を有する他の哺乳動物由来のものも用いることができ
る。該哺乳動物としては、マウス、ラット、サル、ブ
タ、ウシ、ヒツジ、ウマなどが挙げられる。またヒトＮ
ＧＦ２／ＮＴ−３蛋白質として、脳や腎臓などにの各種
臓器から抽出される得るものが挙げられるが、遺伝子組
み換え技術により製造されたヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３蛋
白質は、均質な抗体を得るうえで有利であり、とりわけ
好ましく用いられる。ヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３活性を有
するポリペプチドとしては、具体的には、例えば〔図２
４〕（配列表：配列番号１０。ただし、そのＣ末端にＸ
＝Ｈ又はＴhrが付加。）で示されるアミノ酸配列を有す
るポリペプチド(Ｉ)（ＥＰ−３８６,７５２，特開平３
−２０４ ８９７にポリペプチド(Ｉ)として記載された
ペプチド）や、その生物学的もしくは免疫学的活性に必
要な一部分のアミノ酸配列からなるフラグメントでもよ
い。上記フラグメントとしては、例えばポリペプチド
(Ｉ)のアミノ末端から５個のアミノ酸残基を欠くフラグ
メント（ヨーロッパ特許公 開第４９９９９３号公報）
やカルボキシル末端部の数個のアミノ酸残基を欠くフラ
グメントなどが挙げられる。さらに該ポリペプチド(Ｉ)
の構成アミノ酸残基の一部が欠損しているか他のアミノ
酸に置換されたものでもよい。また上記ＮＧＦ−２／Ｎ
Ｔ−３活性物質は、ポリエチレングリコール誘導体な
ど、化学修飾されたものでもよい。とりわけ、本発明に
おいては、上記ポリペプチド(Ｉ)として示されるアミノ
酸配列を有するヒトＮＧＦ−２／ＮＴ−３を用いるのが
好ましく、この場合そのアミノ末端にさらにメチオニン
残基（Met）を有するものと有さないものとの混合物で
あってもよく、またアミノ末端にMetを有さずチロシン
（Tyr）で始まるもの（日本特願平４−２９２０９）で
もよい。
【０００８】本発明において免疫原として用いるヒトＮ
ＧＦ２／ＮＴ−３の好ましい例としては、〔図２４〕に
おいてＸ＝Ｔhrであるものや、〔図２４〕においてＸ＝
Ｔhrであるペプチドのアミノ末端から５個のアミノ酸残
基を欠くフラグメントが挙げられる。ヒトＮＧＦ２／Ｎ
Ｔ−３蛋白質または蛋白複合体を用いて免疫するに際
し、免疫する哺乳動物は、羊、山羊、兎、モルモット、
ラット、マウス等の実験動物が使われるが、モノクロー
ナル抗体を得るためには、ラット、マウスが好ましく、
特にマウスが好適である。免疫方法は、例えばマウスを
免疫する場合、皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内、皮内等
のいずれのルートからでも可能であるが、主として皮
下、腹腔内、静脈内に（とりわけ皮下）注入するのが好
ましい。また、免疫間隔、免疫量等も可変度は高く、種
々の方法が可能であるが、例えば２週間隔で約２〜６回
免疫し、最終免疫後、約１〜５回、好ましくは約２〜４
日後に摘出した脾臓細胞を用いる方法がよく用いられ
る。免疫量は１回にペプチド量として、マウス当り約
０.１μg以上、好ましくは約１０μg〜３００μg用いる
ことが望ましい。又、脾臓を摘出する前に、部分採血を
行い、血中の抗体価の上昇を確認した上で、脾臓細胞を
用いる融合実験を行うことが望ましい。
ＧＦ２／ＮＴ−３の好ましい例としては、〔図２４〕に
おいてＸ＝Ｔhrであるものや、〔図２４〕においてＸ＝
Ｔhrであるペプチドのアミノ末端から５個のアミノ酸残
基を欠くフラグメントが挙げられる。ヒトＮＧＦ２／Ｎ
Ｔ−３蛋白質または蛋白複合体を用いて免疫するに際
し、免疫する哺乳動物は、羊、山羊、兎、モルモット、
ラット、マウス等の実験動物が使われるが、モノクロー
ナル抗体を得るためには、ラット、マウスが好ましく、
特にマウスが好適である。免疫方法は、例えばマウスを
免疫する場合、皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内、皮内等
のいずれのルートからでも可能であるが、主として皮
下、腹腔内、静脈内に（とりわけ皮下）注入するのが好
ましい。また、免疫間隔、免疫量等も可変度は高く、種
々の方法が可能であるが、例えば２週間隔で約２〜６回
免疫し、最終免疫後、約１〜５回、好ましくは約２〜４
日後に摘出した脾臓細胞を用いる方法がよく用いられ
る。免疫量は１回にペプチド量として、マウス当り約
０.１μg以上、好ましくは約１０μg〜３００μg用いる
ことが望ましい。又、脾臓を摘出する前に、部分採血を
行い、血中の抗体価の上昇を確認した上で、脾臓細胞を
用いる融合実験を行うことが望ましい。
【０００９】上記脾臓細胞とリンパ球様細胞との細胞融
合は例えば摘出したマウスの脾臓細胞を、ヒポキサンチ
ン−グアニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損
（ＨＧＰＲＴ-）や、チミジンキナーゼ欠損（ＴＫ-）の
様なマーカーを持った適切な同種または異種（好ましく
は同種）のミエローマ〔例、Ｐ３−Ｘ６３−Ａg・８Ｕ
１（市森他 ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソ
ッド（J. Immunol. Methods）８０，５５(１９８５))〕
等の、リンパ球様細胞株との間で融合させる。例えばケ
ラーおよびミルスタインらの方法〔ネイチャー (Natur
e) ２５６：４９５(１９７５)〕に準じて融合させるこ
とにより製造される。すなわち、たとえばミエローマ細
胞と脾細胞とを約１:５の割合で、たとえばイスコフ培
地とハムＦ−１２培地を１：１に混合した培地（以下Ｉ
Ｈ培地と称する。）に懸濁させ、センダイウイルス、ポ
リエチレングリコール(ＰＥＧ)等の融合剤を用いて融合
させる。もちろんジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)その
他の融合促進剤を加えることも可能である。ＰＥＧの平
均分子量は、ふつう約１,０００〜９,０００、時間は約
０.５〜３０分、濃度は約１０％〜８０％等が用いられ
るが、好ましい条件の一例として、ＰＥＧ ６,０００を
約３５〜５５％で約４〜１０分処理することにより、効
率よく融合させることが出来る。融合細胞は、ヒポキサ
ンチン−アミノプテリン−チミジン培地〔ＨＡＴ培地；
ネイチャー，２５６，４９５(１９７５)〕等を用いて、
選択的に増殖させることが出来る。
合は例えば摘出したマウスの脾臓細胞を、ヒポキサンチ
ン−グアニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損
（ＨＧＰＲＴ-）や、チミジンキナーゼ欠損（ＴＫ-）の
様なマーカーを持った適切な同種または異種（好ましく
は同種）のミエローマ〔例、Ｐ３−Ｘ６３−Ａg・８Ｕ
１（市森他 ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソ
ッド（J. Immunol. Methods）８０，５５(１９８５))〕
等の、リンパ球様細胞株との間で融合させる。例えばケ
ラーおよびミルスタインらの方法〔ネイチャー (Natur
e) ２５６：４９５(１９７５)〕に準じて融合させるこ
とにより製造される。すなわち、たとえばミエローマ細
胞と脾細胞とを約１:５の割合で、たとえばイスコフ培
地とハムＦ−１２培地を１：１に混合した培地（以下Ｉ
Ｈ培地と称する。）に懸濁させ、センダイウイルス、ポ
リエチレングリコール(ＰＥＧ)等の融合剤を用いて融合
させる。もちろんジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)その
他の融合促進剤を加えることも可能である。ＰＥＧの平
均分子量は、ふつう約１,０００〜９,０００、時間は約
０.５〜３０分、濃度は約１０％〜８０％等が用いられ
るが、好ましい条件の一例として、ＰＥＧ ６,０００を
約３５〜５５％で約４〜１０分処理することにより、効
率よく融合させることが出来る。融合細胞は、ヒポキサ
ンチン−アミノプテリン−チミジン培地〔ＨＡＴ培地；
ネイチャー，２５６，４９５(１９７５)〕等を用いて、
選択的に増殖させることが出来る。
【００１０】増殖して来た細胞の培養上清を対象に、目
的とする抗体産生があるか否かをスクリーニングをする
が、この抗体価のスクリーニングは次の様に行うことが
出来る。即ち、この場合には、まず第１段階として免疫
したペプチドに対する抗体産生の有無を、ラジオイムノ
アッセイ(ＲＩＡ)法またはエンザイムイムノアッセイ
(ＥＩＡ)法等の方法で調べることが出来る。これらの方
法については種々の変法も可能である。好ましい測定法
の一例として、ＥＩＡを用いる方法について述べる。セ
ルロースビーズ等の担体に、例えばウサギ抗マウスイム
ノグロブリン抗体を常法に従ってカプリングさせてお
き、これに測定したい培養上清や、マウスの血清を加
え、一定時間、定温（約４〜４０℃を示す。以下におい
ても同様。）で反応させる。この後、反応物をよく洗っ
た後、酵素で標識したペプチド（酵素とペプチドを常法
に従いカプリングさせた後精製）を加え、一定時間、定
温で反応させる。反応物をよく洗った後、酵素基質を加
え、一定時間、定温で反応させ、その後、生成発色物を
吸光度または蛍光度等で測定することが出来る。
的とする抗体産生があるか否かをスクリーニングをする
が、この抗体価のスクリーニングは次の様に行うことが
出来る。即ち、この場合には、まず第１段階として免疫
したペプチドに対する抗体産生の有無を、ラジオイムノ
アッセイ(ＲＩＡ)法またはエンザイムイムノアッセイ
(ＥＩＡ)法等の方法で調べることが出来る。これらの方
法については種々の変法も可能である。好ましい測定法
の一例として、ＥＩＡを用いる方法について述べる。セ
ルロースビーズ等の担体に、例えばウサギ抗マウスイム
ノグロブリン抗体を常法に従ってカプリングさせてお
き、これに測定したい培養上清や、マウスの血清を加
え、一定時間、定温（約４〜４０℃を示す。以下におい
ても同様。）で反応させる。この後、反応物をよく洗っ
た後、酵素で標識したペプチド（酵素とペプチドを常法
に従いカプリングさせた後精製）を加え、一定時間、定
温で反応させる。反応物をよく洗った後、酵素基質を加
え、一定時間、定温で反応させ、その後、生成発色物を
吸光度または蛍光度等で測定することが出来る。
【００１１】増殖して来た細胞の培養上清について、ヒ
トＮＧＦ２／ＮＴ−３蛋白質に対する中和活性のスクリ
ーニングは次の様に行うことができる。即ち、この場合
には、ヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３蛋白質によって細胞生存
あるいは神経突起伸長が誘導される細胞を用いて中和活
性を調べればよい。該細胞としては神経細胞などを用い
ることが可能であり、ヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３蛋白質の
添加効果を阻害するかどうかを、神経突起を伸長した細
胞の細胞数を測定することによって知ることができる。
細胞数は、直接細胞数を測定すればよい。
トＮＧＦ２／ＮＴ−３蛋白質に対する中和活性のスクリ
ーニングは次の様に行うことができる。即ち、この場合
には、ヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３蛋白質によって細胞生存
あるいは神経突起伸長が誘導される細胞を用いて中和活
性を調べればよい。該細胞としては神経細胞などを用い
ることが可能であり、ヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３蛋白質の
添加効果を阻害するかどうかを、神経突起を伸長した細
胞の細胞数を測定することによって知ることができる。
細胞数は、直接細胞数を測定すればよい。
【００１２】選択培地で増殖を示し、免疫に用いたペプ
チドに対する抗体活性、中和活性の見られたウエルの細
胞は、限界稀釈法等によりクローニングを行うことが望
ましい。クローン化された細胞の上清について同様にス
クリーニングを行い中和活性の高いウエルの細胞を増や
すことにより、免疫したペプチドと反応性を示すモノク
ローナル抗体産生ハイブリドーマクローンが得られる。
このようにしてクローン化されたハイブリドーマを、液
体培地中で増殖させる。具体的には例えば、液体培地た
とえばＲＰＭＩ−１６４０〔Moore, G. E., et. al. ジ
ャーナル・オブ・アメリカン・メディカル・アソシエー
ション（J. Am.Med. Assoc.）１９９，５４９(１９６
７)〕に約０.１〜４０％の牛血清を加えた培地等で約２
〜１０日間、好ましくは約３〜５日間培養することによ
り、培養液から該モノクローナル抗体を得ることができ
る。また、哺乳動物の腹腔内に接種し、細胞を増殖さ
せ、腹水を採取することにより抗体を取得することが出
来る。このためには、例えばマウスの場合、ミネラルオ
イル等を前もって接種したＢＡＬＢ／c等のマウスに約
１×１０4〜１×１０7個、好ましくは約５×１０5〜２
×１０6個のハイブリドーマを腹腔内に接種し、約７〜
２０日後、好ましく は約１０〜１４日後に腹水液を採
取する。腹水に生成蓄積した抗体は、例えば硫安分画、
ＤＥＡＥ−セルロースカラムクロマトグラフィー等によ
り、容易にモノクローナル抗体を純粋な免疫クロブリン
として単離することが出来る。
チドに対する抗体活性、中和活性の見られたウエルの細
胞は、限界稀釈法等によりクローニングを行うことが望
ましい。クローン化された細胞の上清について同様にス
クリーニングを行い中和活性の高いウエルの細胞を増や
すことにより、免疫したペプチドと反応性を示すモノク
ローナル抗体産生ハイブリドーマクローンが得られる。
このようにしてクローン化されたハイブリドーマを、液
体培地中で増殖させる。具体的には例えば、液体培地た
とえばＲＰＭＩ−１６４０〔Moore, G. E., et. al. ジ
ャーナル・オブ・アメリカン・メディカル・アソシエー
ション（J. Am.Med. Assoc.）１９９，５４９(１９６
７)〕に約０.１〜４０％の牛血清を加えた培地等で約２
〜１０日間、好ましくは約３〜５日間培養することによ
り、培養液から該モノクローナル抗体を得ることができ
る。また、哺乳動物の腹腔内に接種し、細胞を増殖さ
せ、腹水を採取することにより抗体を取得することが出
来る。このためには、例えばマウスの場合、ミネラルオ
イル等を前もって接種したＢＡＬＢ／c等のマウスに約
１×１０4〜１×１０7個、好ましくは約５×１０5〜２
×１０6個のハイブリドーマを腹腔内に接種し、約７〜
２０日後、好ましく は約１０〜１４日後に腹水液を採
取する。腹水に生成蓄積した抗体は、例えば硫安分画、
ＤＥＡＥ−セルロースカラムクロマトグラフィー等によ
り、容易にモノクローナル抗体を純粋な免疫クロブリン
として単離することが出来る。
【００１３】本発明のモノクローナル抗体は、免疫原の
ポリペプチドのみならず、ヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３蛋白
質と高感度に特異的に結合する。さらにヒトＮＧＦ２／
ＮＴ−３蛋白質に対する中和活性を示す。たとえば、後
述の実施例で得られたモノクローナル抗体３Ｗ３は、４
０ng／mlのＮＴ−３存在下における後根神経節由来神経
細胞の生存および神経突起伸長を、１μg／ml添加によ
り抑制する。また、本発明のモノクローナル抗体とペル
オキシダーゼ標識化抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳ
Ａ法により、０.５ng／mlのＮＴ−３蛋白質を定量でき
る。このように、本発明のモノクローナル抗体は、ヒト
ＮＧＦ２／ＮＴ−３蛋白質に対し高感度に結合すること
から、ヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３蛋白質の測定試薬、ヒト
ＮＧＦ２／ＮＴ−３蛋白質の精製用試薬として極めて有
用である。
ポリペプチドのみならず、ヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３蛋白
質と高感度に特異的に結合する。さらにヒトＮＧＦ２／
ＮＴ−３蛋白質に対する中和活性を示す。たとえば、後
述の実施例で得られたモノクローナル抗体３Ｗ３は、４
０ng／mlのＮＴ−３存在下における後根神経節由来神経
細胞の生存および神経突起伸長を、１μg／ml添加によ
り抑制する。また、本発明のモノクローナル抗体とペル
オキシダーゼ標識化抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳ
Ａ法により、０.５ng／mlのＮＴ−３蛋白質を定量でき
る。このように、本発明のモノクローナル抗体は、ヒト
ＮＧＦ２／ＮＴ−３蛋白質に対し高感度に結合すること
から、ヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３蛋白質の測定試薬、ヒト
ＮＧＦ２／ＮＴ−３蛋白質の精製用試薬として極めて有
用である。
【００１４】本発明のモノクローナル抗体を用いた測定
法ではヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３蛋白質を０.５ng／mlま
で測定可能である。このことは、極微量しか存在しない
生体内ヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３を測定する上で極めて画
期的なことである。ヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３過剰産生に
より引き起こされる疾病としては、痴呆症などの中枢系
疾病が考えられる。これらの場合において過剰産生され
るヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３量を測定する事によりこれら
の疾病を予知することができる。この際、生体でのヒト
ＮＧＦ２／ＮＴ−３産生量は極く微量なのでできる限り
高感度の定量法が必要である。さらにヒトＮＧＦ２／Ｎ
Ｔ−３により症状が改善されると考えられる疾病として
神経損傷などを治療する際にも有効である。本発明のモ
ノクローナル抗体は、ヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３の１個〜
５個のアミノ酸残基を欠失しているムテインにも高感度
に結合すめため該ムテインを治療薬として用いる際、生
体内該ムテイン量を追跡する手段として用いることがで
きる。また、前述した様に一部の痴呆はヒトＮＧＦ２／
ＮＴ−３の過剰な活性により発症していると考えられて
いる。本発明のモノクローナル抗体には強い中和活性が
あるため生体内の余分なヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３を除去
し、抗痴呆の活性を発揮するので本発明のモノクローナ
ル抗体を痴呆症治療剤として温血動物（例、ヒト，イ
ヌ，ネコ）に投与することができる。
法ではヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３蛋白質を０.５ng／mlま
で測定可能である。このことは、極微量しか存在しない
生体内ヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３を測定する上で極めて画
期的なことである。ヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３過剰産生に
より引き起こされる疾病としては、痴呆症などの中枢系
疾病が考えられる。これらの場合において過剰産生され
るヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３量を測定する事によりこれら
の疾病を予知することができる。この際、生体でのヒト
ＮＧＦ２／ＮＴ−３産生量は極く微量なのでできる限り
高感度の定量法が必要である。さらにヒトＮＧＦ２／Ｎ
Ｔ−３により症状が改善されると考えられる疾病として
神経損傷などを治療する際にも有効である。本発明のモ
ノクローナル抗体は、ヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３の１個〜
５個のアミノ酸残基を欠失しているムテインにも高感度
に結合すめため該ムテインを治療薬として用いる際、生
体内該ムテイン量を追跡する手段として用いることがで
きる。また、前述した様に一部の痴呆はヒトＮＧＦ２／
ＮＴ−３の過剰な活性により発症していると考えられて
いる。本発明のモノクローナル抗体には強い中和活性が
あるため生体内の余分なヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３を除去
し、抗痴呆の活性を発揮するので本発明のモノクローナ
ル抗体を痴呆症治療剤として温血動物（例、ヒト，イ
ヌ，ネコ）に投与することができる。
【００１５】本モノクローナル抗体の毒性は低い。本モ
ノクローナル抗体を投与する際の１日投与量は、約１０
０μg／Kg〜１０mg／Kgである。本発明のモノクローナ
ル抗体を投与するにあたっては、それ自体あるいは適宜
の薬理的に許容され得る担体、賦形剤，希釈剤（これら
の例、水，生理食塩水）と混合し、注射剤などの剤型で
非経口的に投与することができる。また、非経口製剤、
たとえば注射剤を製造する際には、等張化剤（例、ブド
ウ糖，Ｄ−ソルビトール，Ｄ−マンニトール，塩化ナト
リウムなど），防腐剤（例、ベンジルアルコール，クロ
ロブタノール，パラオキシ安息香酸メチル，パラオキシ
安息香酸プロピルなど），緩衝剤（例、リン酸塩緩衝
液，酢酸ナトリウム緩衝液など）などを適宜配合するこ
とができる。ヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３蛋白質の検出、定
量法としては、たとえば、担体上に保持されたヒトＮＧ
Ｆ２／ＮＴ−３抗体、および担体上に保持された抗体と
は抗原決定部位を異にする抗ヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３抗
体に標識剤を直接結合させた結合物を用いてヒトＮＧＦ
２／ＮＴ−３蛋白質を測定する免疫化学的測定法により
行なうことができる。なかでも、酵素免疫測定法により
行なうのが好ましい。
ノクローナル抗体を投与する際の１日投与量は、約１０
０μg／Kg〜１０mg／Kgである。本発明のモノクローナ
ル抗体を投与するにあたっては、それ自体あるいは適宜
の薬理的に許容され得る担体、賦形剤，希釈剤（これら
の例、水，生理食塩水）と混合し、注射剤などの剤型で
非経口的に投与することができる。また、非経口製剤、
たとえば注射剤を製造する際には、等張化剤（例、ブド
ウ糖，Ｄ−ソルビトール，Ｄ−マンニトール，塩化ナト
リウムなど），防腐剤（例、ベンジルアルコール，クロ
ロブタノール，パラオキシ安息香酸メチル，パラオキシ
安息香酸プロピルなど），緩衝剤（例、リン酸塩緩衝
液，酢酸ナトリウム緩衝液など）などを適宜配合するこ
とができる。ヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３蛋白質の検出、定
量法としては、たとえば、担体上に保持されたヒトＮＧ
Ｆ２／ＮＴ−３抗体、および担体上に保持された抗体と
は抗原決定部位を異にする抗ヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３抗
体に標識剤を直接結合させた結合物を用いてヒトＮＧＦ
２／ＮＴ−３蛋白質を測定する免疫化学的測定法により
行なうことができる。なかでも、酵素免疫測定法により
行なうのが好ましい。
【００１６】上記測定方法において用いられる担体上に
保持された抗体における担体としては、例えば、ゲル粒
子（例、アガロースゲル〔例，セファロース４Ｂ、セフ
ァロース６Ｂ（ファルマシア・ファインケミカル社(ス
ウェーデン)製）〕、デキストランゲル〔例、セファデ
ックスＧ−７５、セファデックスＧ−１００、セファデ
ックスＧ−２００(ファルマシア・ファインケミカル社
(スウェーデン)製)〕、ポリアクリルアミドゲル〔例、
バイオゲルＰ−３０、バイオゲルＰ−６０、バイオゲル
Ｐ−１００（バイオラッド・ラボラトリーズ社(米国)
製〕、セルロース粒子〔例、アビセル(旭化成製)、イオ
ン交換セルロース（例、ジエチルアミノエチルセルロー
ス、カルボキシメチルセルロース）〕、物理的吸着剤
〔例、ガラス（例、ガラス球、ガラスロッド、アミノア
ルキルガラス球、アミノアルキルガラスロッド）、シリ
コン片、スチレン系樹脂（例、ポリスチレン球、ポリス
チレン粒子）、イムノアッセイ用プレート（例、ヌンク
社(デンマーク)製）〕、イオン交換樹脂｛例、弱酸性陽
イオン交換樹脂〔例、アンバーライトＩＲＣ−５０（ロ
ーム・アンド・ハース社(米国)製）、ゼオカープ２２６
（パームチット社(西ドイツ)製）〕、弱塩基性陰イオン
交換樹脂〔例、アンバーライトＩＲ−４Ｂ、ダウエック
ス３（ダウケミカル社(米国)製）〕｝などが挙げられ
る。
保持された抗体における担体としては、例えば、ゲル粒
子（例、アガロースゲル〔例，セファロース４Ｂ、セフ
ァロース６Ｂ（ファルマシア・ファインケミカル社(ス
ウェーデン)製）〕、デキストランゲル〔例、セファデ
ックスＧ−７５、セファデックスＧ−１００、セファデ
ックスＧ−２００(ファルマシア・ファインケミカル社
(スウェーデン)製)〕、ポリアクリルアミドゲル〔例、
バイオゲルＰ−３０、バイオゲルＰ−６０、バイオゲル
Ｐ−１００（バイオラッド・ラボラトリーズ社(米国)
製〕、セルロース粒子〔例、アビセル(旭化成製)、イオ
ン交換セルロース（例、ジエチルアミノエチルセルロー
ス、カルボキシメチルセルロース）〕、物理的吸着剤
〔例、ガラス（例、ガラス球、ガラスロッド、アミノア
ルキルガラス球、アミノアルキルガラスロッド）、シリ
コン片、スチレン系樹脂（例、ポリスチレン球、ポリス
チレン粒子）、イムノアッセイ用プレート（例、ヌンク
社(デンマーク)製）〕、イオン交換樹脂｛例、弱酸性陽
イオン交換樹脂〔例、アンバーライトＩＲＣ−５０（ロ
ーム・アンド・ハース社(米国)製）、ゼオカープ２２６
（パームチット社(西ドイツ)製）〕、弱塩基性陰イオン
交換樹脂〔例、アンバーライトＩＲ−４Ｂ、ダウエック
ス３（ダウケミカル社(米国)製）〕｝などが挙げられ
る。
【００１７】担体に抗体を保持させるには、公知の常套
手段を応用し得るが、例えば、“代謝”、第８巻(１９
７１年)、第６９６頁に記載されているブロムシアン
法、グルタールアルデヒド法などが挙げられる。また、
より簡便な方法として物理的に担体表面に吸着させても
よい。標識剤を結合させた抗体における標識剤として
は、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが
挙げられるが、酵素を陽いるのが好ましい。酵素として
は、安定で比活性の大きなものが好ましく、ペルオキシ
ダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシ
ダーゼ、グルコースオキシダーゼ等を用いることができ
るが、ペルオキシダーゼが好ましい。ペルオキシダーゼ
としては、種々の起源のものを用いることができるが、
その例としては、例えば西洋わさび、パイナップル、イ
チジク、甘諸、ソラマメ、トウモロコシなどから得られ
るペルオキシダーゼが挙げられ、特に西洋わさびから抽
出されたホースラディッシュ ペルオキシダーゼ（hors
eradish peroxidase）（ＨＲＰ）が好ましい。
手段を応用し得るが、例えば、“代謝”、第８巻(１９
７１年)、第６９６頁に記載されているブロムシアン
法、グルタールアルデヒド法などが挙げられる。また、
より簡便な方法として物理的に担体表面に吸着させても
よい。標識剤を結合させた抗体における標識剤として
は、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが
挙げられるが、酵素を陽いるのが好ましい。酵素として
は、安定で比活性の大きなものが好ましく、ペルオキシ
ダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシ
ダーゼ、グルコースオキシダーゼ等を用いることができ
るが、ペルオキシダーゼが好ましい。ペルオキシダーゼ
としては、種々の起源のものを用いることができるが、
その例としては、例えば西洋わさび、パイナップル、イ
チジク、甘諸、ソラマメ、トウモロコシなどから得られ
るペルオキシダーゼが挙げられ、特に西洋わさびから抽
出されたホースラディッシュ ペルオキシダーゼ（hors
eradish peroxidase）（ＨＲＰ）が好ましい。
【００１８】ペルオキシダーゼと抗体を結合するにあた
り、抗体分子としてのＦab’のチオール基を利用するた
めに、あらかじめペルオキシダーゼにマレイミド基を導
入したものを用いると好都合である。マレイミド基をペ
ルオキシダーゼに導入する方法としては、ペルオキシダ
ーゼのアミノ基を介してマレイミド基を導入することが
できる。そのためには、Ｎ−サクシニミジル−マレイミ
ド−カルボキシレート誘導体を用いることができ、好ま
しくは、Ｎ−（γ−マレイミドブチルオキシ）サクシイ
ミド（ＧＭＢＳと略称することもある）などがよい。従
って、マレイミド基とペルオキシダーゼとの間に一定の
基が入っていることとなってもよい。
り、抗体分子としてのＦab’のチオール基を利用するた
めに、あらかじめペルオキシダーゼにマレイミド基を導
入したものを用いると好都合である。マレイミド基をペ
ルオキシダーゼに導入する方法としては、ペルオキシダ
ーゼのアミノ基を介してマレイミド基を導入することが
できる。そのためには、Ｎ−サクシニミジル−マレイミ
ド−カルボキシレート誘導体を用いることができ、好ま
しくは、Ｎ−（γ−マレイミドブチルオキシ）サクシイ
ミド（ＧＭＢＳと略称することもある）などがよい。従
って、マレイミド基とペルオキシダーゼとの間に一定の
基が入っていることとなってもよい。
【００１９】ＧＭＢＳをペルオキシダーゼに反応させる
には、両者をpＨ６ないし８の緩衝液中で約１０ないし
５０℃の温度で約１０分ないし２４時間反応させること
によって行われる。該緩衝液としては、たとえば、pＨ
７.０の０.１Ｍリン酸緩衝液などが挙げられる。このよ
うにして得られたマレイミド化ペルオキシダーゼは、た
とえばゲルクロマトグラフィーなどにより精製すること
ができる。該ゲルクロマトグラフィーを行う際に用いら
れる担体としては、例えば、セファデックスＧ−２５
〔ファルマシア・ファインケミカル社(スウェーデン)
製〕、バイオゲルＰ−２〔バイオラッド・ラボラトリー
ズ社(米国)製〕などが挙げられる。
には、両者をpＨ６ないし８の緩衝液中で約１０ないし
５０℃の温度で約１０分ないし２４時間反応させること
によって行われる。該緩衝液としては、たとえば、pＨ
７.０の０.１Ｍリン酸緩衝液などが挙げられる。このよ
うにして得られたマレイミド化ペルオキシダーゼは、た
とえばゲルクロマトグラフィーなどにより精製すること
ができる。該ゲルクロマトグラフィーを行う際に用いら
れる担体としては、例えば、セファデックスＧ−２５
〔ファルマシア・ファインケミカル社(スウェーデン)
製〕、バイオゲルＰ−２〔バイオラッド・ラボラトリー
ズ社(米国)製〕などが挙げられる。
【００２０】マレイミド化ペルオキシダーゼと抗体分子
との反応は、両者を緩衝液中で約０℃ないし４０℃の温
度で、約１ないし４８時間反応させることにより行うこ
とができる。該緩衝液としては、たとえば、pＨ６.０の
５mＭエチレンジアミン四酢酸ナトリウム塩を含む０.１
Ｍリン酸緩衝液などが挙げられる。このようにして得ら
れたペルオキシダーゼ標識抗体は、たとえばゲルクロマ
トグラフィーなどにより精製することができる。該ゲル
クロマトグラフィーを行う際に用いられる担体として
は、例えば、セファデックスＧ−２５〔ファルマシア・
ファインケミカル社(スウェーデン)製〕、バイオゲルＰ
−２〔バイオラッド・ラボラトリーズ社(米国)製〕など
が挙げられる。さらに、ペルオキシダーゼにチオール基
を導入し、マレイミド化された抗体分子と反応させても
良い。ペルオキシダーゼ以外の酵素を抗体に直接結合さ
せるには、ペルオキシダーゼの場合に準じて行うことが
でき、また、自体公知のグルタルアルデヒド法、過ヨウ
素酸法、水溶性カルボジイミド法などが用いられる。
との反応は、両者を緩衝液中で約０℃ないし４０℃の温
度で、約１ないし４８時間反応させることにより行うこ
とができる。該緩衝液としては、たとえば、pＨ６.０の
５mＭエチレンジアミン四酢酸ナトリウム塩を含む０.１
Ｍリン酸緩衝液などが挙げられる。このようにして得ら
れたペルオキシダーゼ標識抗体は、たとえばゲルクロマ
トグラフィーなどにより精製することができる。該ゲル
クロマトグラフィーを行う際に用いられる担体として
は、例えば、セファデックスＧ−２５〔ファルマシア・
ファインケミカル社(スウェーデン)製〕、バイオゲルＰ
−２〔バイオラッド・ラボラトリーズ社(米国)製〕など
が挙げられる。さらに、ペルオキシダーゼにチオール基
を導入し、マレイミド化された抗体分子と反応させても
良い。ペルオキシダーゼ以外の酵素を抗体に直接結合さ
せるには、ペルオキシダーゼの場合に準じて行うことが
でき、また、自体公知のグルタルアルデヒド法、過ヨウ
素酸法、水溶性カルボジイミド法などが用いられる。
【００２１】本発明の測定系における被検試料として
は、尿、血清、血漿、髄液等の体液、あるいは、動物細
胞や菌体の抽出液またはその培養上清が挙げられる。本
発明の測定方法の例として、標識剤がペルオキシダーゼ
の場合について以下に具体例に説明するが、ペルオキシ
ダーゼに限定されるものではない。 まず、：担体に保持された抗体に、測定すべきヒトＮ
ＧＦ２／ＮＴ−３蛋白質含有の分析対象物を加えて抗原
抗体反応を行った後、これに、前記で得られたペルオキ
シダーゼと抗ヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３蛋白質抗体との結
合物を加えて反応させる。 ：で得られた反応生成物にペルオキシダーゼの基質
を加え、生じた物質の吸光度もしくは蛍光強度を測定す
ることにより上記の反応生成物の酵素活性を知る。 ：上記〜の操作を既知量のヒトＮＧＦ２／ＮＴ−
３蛋白質の標準溶液に対してあらかじめ行い、ヒトＮＧ
Ｆ２／ＮＴ−３蛋白質と吸光度もしくは蛍光強度との関
係を標準曲線として作成しておく。 ：未知量のヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３蛋白質を含む分析
対象物（被検試料）について得られた吸光度もしくは蛍
光強度を標準曲線にあてはめ、分析対象物中のヒトＮＧ
Ｆ２／ＮＴ−３蛋白質の量を測定する。
は、尿、血清、血漿、髄液等の体液、あるいは、動物細
胞や菌体の抽出液またはその培養上清が挙げられる。本
発明の測定方法の例として、標識剤がペルオキシダーゼ
の場合について以下に具体例に説明するが、ペルオキシ
ダーゼに限定されるものではない。 まず、：担体に保持された抗体に、測定すべきヒトＮ
ＧＦ２／ＮＴ−３蛋白質含有の分析対象物を加えて抗原
抗体反応を行った後、これに、前記で得られたペルオキ
シダーゼと抗ヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３蛋白質抗体との結
合物を加えて反応させる。 ：で得られた反応生成物にペルオキシダーゼの基質
を加え、生じた物質の吸光度もしくは蛍光強度を測定す
ることにより上記の反応生成物の酵素活性を知る。 ：上記〜の操作を既知量のヒトＮＧＦ２／ＮＴ−
３蛋白質の標準溶液に対してあらかじめ行い、ヒトＮＧ
Ｆ２／ＮＴ−３蛋白質と吸光度もしくは蛍光強度との関
係を標準曲線として作成しておく。 ：未知量のヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３蛋白質を含む分析
対象物（被検試料）について得られた吸光度もしくは蛍
光強度を標準曲線にあてはめ、分析対象物中のヒトＮＧ
Ｆ２／ＮＴ−３蛋白質の量を測定する。
【００２２】ヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３蛋白質の精製のた
めには、精製した本発明の抗体を例えば活性化したアガ
ロースゲルビーズの様な適切な担体に常法に従ってカプ
リングさせた後、カラムに充め、培養上清或いは破さい
した菌体等の粗ヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３蛋白質を含む試
料を抗体アフィニティカラムにかけ、吸着させた後、洗
浄し、その後例えばＫＳＣＮ（チオシアン酸カリウム）
の様なカオトロピック試薬、或いはヒトＮＧＦ２／ＮＴ
−３の失活のない程度の弱酸性条件で溶出させる方法等
により、効率よく精製できる。抗体カラムの作製は、例
えばハイブリドーマを接種した腹水等から純粋に精製し
た本発明のモノクローナル抗体を適切な担体とカプリン
グさせることにより、以下の様な方法によって実施でき
る。
めには、精製した本発明の抗体を例えば活性化したアガ
ロースゲルビーズの様な適切な担体に常法に従ってカプ
リングさせた後、カラムに充め、培養上清或いは破さい
した菌体等の粗ヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３蛋白質を含む試
料を抗体アフィニティカラムにかけ、吸着させた後、洗
浄し、その後例えばＫＳＣＮ（チオシアン酸カリウム）
の様なカオトロピック試薬、或いはヒトＮＧＦ２／ＮＴ
−３の失活のない程度の弱酸性条件で溶出させる方法等
により、効率よく精製できる。抗体カラムの作製は、例
えばハイブリドーマを接種した腹水等から純粋に精製し
た本発明のモノクローナル抗体を適切な担体とカプリン
グさせることにより、以下の様な方法によって実施でき
る。
【００２３】用いる担体は、カプリングの後にヒトＮＧ
Ｆ２／ＮＴ−３蛋白質が特異的に効率よく吸着され、そ
の後適切な溶出が可能なものであればどの様なものでも
よく、該担体としては、たとえばアガロース、セルロー
スまたはアクリルアミドのポリマーが挙げられ、その一
例としての蛋白の一級アミンが結合し易い様に活性化さ
れたポリアクリルアミドゲルルビーズ、例えばアフィゲ
ル−１０（バイオラド社製）などが以下に述べる様な方
法で好都合に用いられる。アフィゲル−１０と抗体との
反応は、約０.００１〜１Ｍ、好ましくは約０.１Ｍのバ
イカーボネート等の緩衝液中で反応を行う。反応条件は
約０℃〜２０℃、約１０分〜２４時間、種々のpＨが可
能であるが、好ましくは、約４℃、約４時間、pＨ約３
〜１０の条件が用いられる。混合するアフィゲル−１０
と抗体の量比は、アフィゲル１mlに対し抗体量が約５０
mg位迄は多ければ多い程多くの抗体がつくので、この範
囲内でいくらでもよいが、結合効率およびアフィニティ
ーカラムクロマトグラフィーにおける精製効率を考慮し
て約１０〜３０mgの抗体が好都合に用いられる。この様
にしてできた抗体−担体結合物は、反応に用いた緩衝液
でよく洗った後、数日放置するか、もしくは最終濃度約
０.０５〜０.１０Ｍのエタノールアミン・塩酸，グリシ
ン等の一級アミンを有する化合物を加え約４℃で約１〜
４時間反応させる，あるいは１〜５％牛血清アルブミン
（ＢＳＡ）等のタンパク質を４℃一夜反応させる等の方
法により、残存する未反応の活性基をブロックした後、
適切なカラムにつめることにより、抗体カラムとして使
用できる。
Ｆ２／ＮＴ−３蛋白質が特異的に効率よく吸着され、そ
の後適切な溶出が可能なものであればどの様なものでも
よく、該担体としては、たとえばアガロース、セルロー
スまたはアクリルアミドのポリマーが挙げられ、その一
例としての蛋白の一級アミンが結合し易い様に活性化さ
れたポリアクリルアミドゲルルビーズ、例えばアフィゲ
ル−１０（バイオラド社製）などが以下に述べる様な方
法で好都合に用いられる。アフィゲル−１０と抗体との
反応は、約０.００１〜１Ｍ、好ましくは約０.１Ｍのバ
イカーボネート等の緩衝液中で反応を行う。反応条件は
約０℃〜２０℃、約１０分〜２４時間、種々のpＨが可
能であるが、好ましくは、約４℃、約４時間、pＨ約３
〜１０の条件が用いられる。混合するアフィゲル−１０
と抗体の量比は、アフィゲル１mlに対し抗体量が約５０
mg位迄は多ければ多い程多くの抗体がつくので、この範
囲内でいくらでもよいが、結合効率およびアフィニティ
ーカラムクロマトグラフィーにおける精製効率を考慮し
て約１０〜３０mgの抗体が好都合に用いられる。この様
にしてできた抗体−担体結合物は、反応に用いた緩衝液
でよく洗った後、数日放置するか、もしくは最終濃度約
０.０５〜０.１０Ｍのエタノールアミン・塩酸，グリシ
ン等の一級アミンを有する化合物を加え約４℃で約１〜
４時間反応させる，あるいは１〜５％牛血清アルブミン
（ＢＳＡ）等のタンパク質を４℃一夜反応させる等の方
法により、残存する未反応の活性基をブロックした後、
適切なカラムにつめることにより、抗体カラムとして使
用できる。
【００２４】上記した抗体カラムで精製するに際して
は、たとえばヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３蛋白質含有試料を
中性付近の緩衝液、たとえばリン酸緩衝液やトリス・塩
酸緩衝液に溶解して抗体カラムに吸着させる。次にカラ
ムを同じ緩衝液で洗浄したのち、ヒトＮＧＦ２／ＮＴ−
３蛋白質を溶出する。溶出液としては、弱酸性溶液たと
えば酢酸溶液，ポリエチレングリコールを含む溶液，試
料に比べ抗体により結合し易いペプチドを含む溶液、高
濃度塩溶液などおよびこれらを組合せた溶液などが用い
られ、ヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３蛋白質の分解をあまり促
進しないものが好ましい。
は、たとえばヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３蛋白質含有試料を
中性付近の緩衝液、たとえばリン酸緩衝液やトリス・塩
酸緩衝液に溶解して抗体カラムに吸着させる。次にカラ
ムを同じ緩衝液で洗浄したのち、ヒトＮＧＦ２／ＮＴ−
３蛋白質を溶出する。溶出液としては、弱酸性溶液たと
えば酢酸溶液，ポリエチレングリコールを含む溶液，試
料に比べ抗体により結合し易いペプチドを含む溶液、高
濃度塩溶液などおよびこれらを組合せた溶液などが用い
られ、ヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３蛋白質の分解をあまり促
進しないものが好ましい。
【００２５】カラム溶出液は、常法により緩衝液で中和
する。必要により再度上記の抗体カラムによる精製操作
を行うことができる。このようにして、実質的にパイロ
ジェンもエンドトキシンも含まない、実質的に純粋なヒ
トＮＧＦ２／ＮＴ−３蛋白質が得られる。本発明の実質
的に純粋なヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３蛋白質としては、蛋
白質含量としてヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３蛋白質を９０％
（w／w）以上であるもの、さらに好ましくはヒトＮＧＦ
２／ＮＴ−３蛋白質を９５％（w／w）以上であるものが
挙げられる。
する。必要により再度上記の抗体カラムによる精製操作
を行うことができる。このようにして、実質的にパイロ
ジェンもエンドトキシンも含まない、実質的に純粋なヒ
トＮＧＦ２／ＮＴ−３蛋白質が得られる。本発明の実質
的に純粋なヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３蛋白質としては、蛋
白質含量としてヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３蛋白質を９０％
（w／w）以上であるもの、さらに好ましくはヒトＮＧＦ
２／ＮＴ−３蛋白質を９５％（w／w）以上であるものが
挙げられる。
【００２６】本願発明明細書および図面において、塩基
やアミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−Ｉ
ＵＢ Commission on Biochemical Nomenclature によ
る略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくもの
であり、その例を次にあげる。またアミノ酸に関して光
学異性体がありうる場合は、特に明示しなければＬ体を
示すものとする。 ＤＮＡ デオキシリボ核酸 Ａ アデニン Ｃ シトニン Ｇ グアニン Ｔ チミン Ａla ：アラニン Ａrg ：アルギニン Ａsn ：アスパラギン Ａsp ：アスパラギン酸 Ｃys ：システイン Ｇln ：グルタミン Ｇlu ：グルタミン酸 Ｇly ：グリシン Ｈis ：ヒスチジン Ｉle ：イソロイシン Ｌeu ：ロイシン Ｌys ：リジン Ｍet ：メチオニン Ｐhe ：フェニールアラニン Ｐro ：プロリン Ｓer ：セリン Ｔhr ：スレオニン Ｔrp ：トリプトファン Ｔyr ：チロシン Ｖal ：バリン
やアミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−Ｉ
ＵＢ Commission on Biochemical Nomenclature によ
る略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくもの
であり、その例を次にあげる。またアミノ酸に関して光
学異性体がありうる場合は、特に明示しなければＬ体を
示すものとする。 ＤＮＡ デオキシリボ核酸 Ａ アデニン Ｃ シトニン Ｇ グアニン Ｔ チミン Ａla ：アラニン Ａrg ：アルギニン Ａsn ：アスパラギン Ａsp ：アスパラギン酸 Ｃys ：システイン Ｇln ：グルタミン Ｇlu ：グルタミン酸 Ｇly ：グリシン Ｈis ：ヒスチジン Ｉle ：イソロイシン Ｌeu ：ロイシン Ｌys ：リジン Ｍet ：メチオニン Ｐhe ：フェニールアラニン Ｐro ：プロリン Ｓer ：セリン Ｔhr ：スレオニン Ｔrp ：トリプトファン Ｔyr ：チロシン Ｖal ：バリン
【００２７】後述の参考例９で得られた形質転換体ＣＨ
Ｏ−Ｎ２−１は、平成３年１月２２日から財団法人発酵
研究所(ＩＦＯ)に受託番号ＩＦＯ ５０３０７として寄
託されており、また該形質転換体は平成３年１月２９日
から通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所(ＦＲ
Ｉ)に寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−３２５５として寄託さ
れている。後述の実施例２で得られたマウス３Ｗ３細胞
は、平成４年５月１５日からＩＦＯに寄託番号ＩＦＯ
５０３７０として寄託されており、また該細胞は平成４
年７月１５日からＦＲＩに受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−３
９３２として寄託されている。以下に、参考例および実
施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発
明はこれらに限定されるものではない。
Ｏ−Ｎ２−１は、平成３年１月２２日から財団法人発酵
研究所(ＩＦＯ)に受託番号ＩＦＯ ５０３０７として寄
託されており、また該形質転換体は平成３年１月２９日
から通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所(ＦＲ
Ｉ)に寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−３２５５として寄託さ
れている。後述の実施例２で得られたマウス３Ｗ３細胞
は、平成４年５月１５日からＩＦＯに寄託番号ＩＦＯ
５０３７０として寄託されており、また該細胞は平成４
年７月１５日からＦＲＩに受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−３
９３２として寄託されている。以下に、参考例および実
施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発
明はこれらに限定されるものではない。
【００２８】 参考例１ ヒトＮＧＦ発現ベクターの構築(１) ヒト白血球ＤＮＡより作製されたλＥＭＢＬ３ゲノムラ
イブラリー〔クロンテック(Clontech)社〕を大腸菌ＮＭ
５３８に感染させたのち、軟寒天プレート上に約３×１
０4クローンずつ撒いた。プラークをナイロンメンブラ
ン(アマシャム社、ハイボンド-Ｎ)上に移した後、０.５
Ｎ ＮaＯＨ−１.５Ｍ ＮaＣl溶液に６分間浸し、ファー
ジＤＮＡを変性させた後、０.５Ｍトリス・塩酸(pＨ８.
０)−１.５Ｍ ＮaＣl溶液に６分間浸した。本メンブラ
ンを２×ＳＳＣ溶液に浸し、風乾後８０℃、２時間処理
することによりＤＮＡをメンブランに固定した。一方、
既知〔アルリッチ(Ullrich, A.)ら、ネイチャー(Natur
e)３０３，８２１(１９８３)〕のヒトＮＧＦ遺伝子を参
考にしてヒトβＮＧＦをコードするＤＮＡ(０.３８kb)
を化学合成し、これをＤＮＡラベリングキット(ニッポ
ンジーン社)を用いて32Ｐで標識したものをプローブと
した。
イブラリー〔クロンテック(Clontech)社〕を大腸菌ＮＭ
５３８に感染させたのち、軟寒天プレート上に約３×１
０4クローンずつ撒いた。プラークをナイロンメンブラ
ン(アマシャム社、ハイボンド-Ｎ)上に移した後、０.５
Ｎ ＮaＯＨ−１.５Ｍ ＮaＣl溶液に６分間浸し、ファー
ジＤＮＡを変性させた後、０.５Ｍトリス・塩酸(pＨ８.
０)−１.５Ｍ ＮaＣl溶液に６分間浸した。本メンブラ
ンを２×ＳＳＣ溶液に浸し、風乾後８０℃、２時間処理
することによりＤＮＡをメンブランに固定した。一方、
既知〔アルリッチ(Ullrich, A.)ら、ネイチャー(Natur
e)３０３，８２１(１９８３)〕のヒトＮＧＦ遺伝子を参
考にしてヒトβＮＧＦをコードするＤＮＡ(０.３８kb)
を化学合成し、これをＤＮＡラベリングキット(ニッポ
ンジーン社)を用いて32Ｐで標識したものをプローブと
した。
【００２９】ＤＮＡを固定したフィルターを、標識プロ
ーブを含む、６×ＳＳＣ(１×ＳＳＣ＝０.１５Ｍ ＮaＣ
l，０.０１５Ｍクエン酸ナトリウム)，５×Denhardt'
s，０.５％ＳＤＳ，２０μg／ml変性サケ精子ＤＮＡ溶
液１０ml中で６５℃、１６時間、保温した。反応後、フ
ィルターを２×ＳＳＣ，０.１％ＳＤＳ溶液中で室温で
５分ずつ３回、１×ＳＳＣ，０.１％ＳＤＳ溶液中で、
６０℃で６０分洗浄した。洗浄したフィルターを乾燥さ
せた後、ラジオオートグラムをとり、プローブと反応す
るクローンを検索した。この方法により得られたクロー
ンλβＬＮ２１１３よりデイヴィス(Davis)らの方法〔D
avisら、アドバンスト・バクテリアル・ジェネティクス
(Advanced Bacterial Genetics)，コールド スプリン
グ ハーバー ラボラトリー（Cold Spring Harbor La
boratory）（１９８０)〕によりファージＤＮＡを抽出
した。次にλβＬＮ２１１３をＳmaＩとＡpaＩで切断
し、ヒトＮＧＦ遺伝子を含むＤＮＡ(約１kb)を切り出
し、プラスミドpBluscript II ＫＳ−(Stratagene 社，
ＵＳＡ)のＳmaＩ，ＡpaＩ部位に挿入し、プラスミドpＮ
ＧＦ１０７Ｇを得た。また、pBluescript II ＫＳ−(St
ratagene 社)のＳmaＩ，ＡpaＩ部位に同ＤＮＡ断片を挿
入することによりプラスミドpＮＧＦＰ１０８６を得
た。pＮＧＦＰ１０７６およびpＮＧＦＰ１０８６に挿入
された部分の塩基配列をシークナーゼ(United States B
iochemical Corporarion)を用いて決定した。決定され
た塩基配列はネイチャー(Nature)，３０３，８２１(１
９８３)に記載されている配列と、蛋白コード領域では
完全に一致した。上記のファージλβＬＮ２１１３ＤＮ
Ａを制限酵素Ｂgl IIで切断し、ヒトＮＧＦを含むＤＮ
Ａ断片(１.８kb)を単離した。一方、動物細胞用の発現
ベクターpＫＳＶ-１０(ファルマシア)を制限酵素Ｂgl I
Iで切断し、上記のヒトＮＧＦ遺伝子を含むＤＮＡ断片
(１.８kb)とＴ４ＤＮＡリガーゼで連結した。この反応
液を用いてエシェリヒア コリ(Escherichia coli)ＤＨ
１の形質転換を行い、アンピシリン耐性の形質転換体の
１つ〔エシェリヒア コリ(Escherichia coli)ＤＨ１／
pＭＮＧＦ１０１〕から単離したプラスミドをpＭＮＧＦ
１０１と命名した。
ーブを含む、６×ＳＳＣ(１×ＳＳＣ＝０.１５Ｍ ＮaＣ
l，０.０１５Ｍクエン酸ナトリウム)，５×Denhardt'
s，０.５％ＳＤＳ，２０μg／ml変性サケ精子ＤＮＡ溶
液１０ml中で６５℃、１６時間、保温した。反応後、フ
ィルターを２×ＳＳＣ，０.１％ＳＤＳ溶液中で室温で
５分ずつ３回、１×ＳＳＣ，０.１％ＳＤＳ溶液中で、
６０℃で６０分洗浄した。洗浄したフィルターを乾燥さ
せた後、ラジオオートグラムをとり、プローブと反応す
るクローンを検索した。この方法により得られたクロー
ンλβＬＮ２１１３よりデイヴィス(Davis)らの方法〔D
avisら、アドバンスト・バクテリアル・ジェネティクス
(Advanced Bacterial Genetics)，コールド スプリン
グ ハーバー ラボラトリー（Cold Spring Harbor La
boratory）（１９８０)〕によりファージＤＮＡを抽出
した。次にλβＬＮ２１１３をＳmaＩとＡpaＩで切断
し、ヒトＮＧＦ遺伝子を含むＤＮＡ(約１kb)を切り出
し、プラスミドpBluscript II ＫＳ−(Stratagene 社，
ＵＳＡ)のＳmaＩ，ＡpaＩ部位に挿入し、プラスミドpＮ
ＧＦ１０７Ｇを得た。また、pBluescript II ＫＳ−(St
ratagene 社)のＳmaＩ，ＡpaＩ部位に同ＤＮＡ断片を挿
入することによりプラスミドpＮＧＦＰ１０８６を得
た。pＮＧＦＰ１０７６およびpＮＧＦＰ１０８６に挿入
された部分の塩基配列をシークナーゼ(United States B
iochemical Corporarion)を用いて決定した。決定され
た塩基配列はネイチャー(Nature)，３０３，８２１(１
９８３)に記載されている配列と、蛋白コード領域では
完全に一致した。上記のファージλβＬＮ２１１３ＤＮ
Ａを制限酵素Ｂgl IIで切断し、ヒトＮＧＦを含むＤＮ
Ａ断片(１.８kb)を単離した。一方、動物細胞用の発現
ベクターpＫＳＶ-１０(ファルマシア)を制限酵素Ｂgl I
Iで切断し、上記のヒトＮＧＦ遺伝子を含むＤＮＡ断片
(１.８kb)とＴ４ＤＮＡリガーゼで連結した。この反応
液を用いてエシェリヒア コリ(Escherichia coli)ＤＨ
１の形質転換を行い、アンピシリン耐性の形質転換体の
１つ〔エシェリヒア コリ(Escherichia coli)ＤＨ１／
pＭＮＧＦ１０１〕から単離したプラスミドをpＭＮＧＦ
１０１と命名した。
【００３０】 参考例２ ヒトＮＧＦ発現ベクターの構築(２) 参考例１で得られたプラスミドpＮＧＦＰ１０７Ｇを制
限酵素ＢclＩおよびＡpaＩで切断し、ヒトＮＧＦ遺伝子
を含むＤＮＡ断片(０.８kb)を単離した。この０.８kb
ＢclＩ−ＡpaＩ断片と下記の塩基配列を有する化学合成
アダプターＳＮ１，ＳＮ２およびＳＮ３とを混合し、Ｔ
４ＤＮＡリガーゼで連結したのち、Ｂgl IIで切断する
ことによって０.８kb Ｈind III−Ｂgl II ＤＮＡ断片
が得られた。 ＳＮ１：5′-AGC TTG CCG CCA CCA TGT CCA TGT TGT TCT ACA CTC T-3′(37mer) （配列表：配列番号１） ＳＮ２：5′-GAT CAG AGT GTA GAA CAA CAT GGA CAT GGT GGC GGC A-3′(37mer) （配列表：配列番号２） ＳＮ３：5′-CAG ATC TGG GCC-3′ (12mer)（配列表：配列番号３） Bgl II ApaＩ プラスミドpＳＶ２−gpt〔サイエンス(Science)，２０
９，１４２２(１９８０)〕を制限酵素ＥcoＲＩとＨind
IIIで切断し、ＳＶ４０プロモーターを含む２.６kb Ｅc
oＲＩ−Ｈind III ＤＮＡ断片を単離した。次にプラス
ミドpＭＴＶdhfr〔ネイチャー(Nature)，２９４，２２
８(１９８１)〕よりpolyＡ付加領域を含む１.６kb Ｂgl
II−ＥcoＲＩ断片を単離した。上記のＳＶ４０プロモ
ーターを含む２.６kb ＥcoＲＩ−Ｈind III ＤＮＡ断
片、ヒトＮＧＦ遺伝子を含む０.８kb Ｈind III−Ｂgl
II ＤＮＡ断片およびpolyＡ 付加領域を含む１.６kb Ｂ
gl II−ＥcoＲＩ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼで連結し
た。この反応液を用いてエシェリヒア コリ(Escherich
ia coli)ＤＨ１の形質転換を行い、アンピシリン耐性の
形質転換体〔エシェリヒア コリ(Escherichiacoli)Ｄ
Ｈ１／pＭＮＧＦ２０１〕から単離したプラスミドをpＭ
ＮＧＦ２０１と命名した。
限酵素ＢclＩおよびＡpaＩで切断し、ヒトＮＧＦ遺伝子
を含むＤＮＡ断片(０.８kb)を単離した。この０.８kb
ＢclＩ−ＡpaＩ断片と下記の塩基配列を有する化学合成
アダプターＳＮ１，ＳＮ２およびＳＮ３とを混合し、Ｔ
４ＤＮＡリガーゼで連結したのち、Ｂgl IIで切断する
ことによって０.８kb Ｈind III−Ｂgl II ＤＮＡ断片
が得られた。 ＳＮ１：5′-AGC TTG CCG CCA CCA TGT CCA TGT TGT TCT ACA CTC T-3′(37mer) （配列表：配列番号１） ＳＮ２：5′-GAT CAG AGT GTA GAA CAA CAT GGA CAT GGT GGC GGC A-3′(37mer) （配列表：配列番号２） ＳＮ３：5′-CAG ATC TGG GCC-3′ (12mer)（配列表：配列番号３） Bgl II ApaＩ プラスミドpＳＶ２−gpt〔サイエンス(Science)，２０
９，１４２２(１９８０)〕を制限酵素ＥcoＲＩとＨind
IIIで切断し、ＳＶ４０プロモーターを含む２.６kb Ｅc
oＲＩ−Ｈind III ＤＮＡ断片を単離した。次にプラス
ミドpＭＴＶdhfr〔ネイチャー(Nature)，２９４，２２
８(１９８１)〕よりpolyＡ付加領域を含む１.６kb Ｂgl
II−ＥcoＲＩ断片を単離した。上記のＳＶ４０プロモ
ーターを含む２.６kb ＥcoＲＩ−Ｈind III ＤＮＡ断
片、ヒトＮＧＦ遺伝子を含む０.８kb Ｈind III−Ｂgl
II ＤＮＡ断片およびpolyＡ 付加領域を含む１.６kb Ｂ
gl II−ＥcoＲＩ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼで連結し
た。この反応液を用いてエシェリヒア コリ(Escherich
ia coli)ＤＨ１の形質転換を行い、アンピシリン耐性の
形質転換体〔エシェリヒア コリ(Escherichiacoli)Ｄ
Ｈ１／pＭＮＧＦ２０１〕から単離したプラスミドをpＭ
ＮＧＦ２０１と命名した。
【００３１】参考例３ ヒトＮＧＦ発現ベクターの構築 参考例２で得られたプラスミドpＭＮＧＦ２０１をＨind
IIIで切断し、ＤＮＡポリメラーゼＫlenow フラグメン
ト反応により平滑化したのち、Ｂgl IIで切断して約
０．８kb ＤＮＡ断片を分離した。一方プラスミドpＴＢ
３９９(特開昭６１−６３２８２に記載)をＥcoＲＩで切
断後、Ｋlenow フラグメント反応により平滑化したの
ち、Ｂgl IIで切断して約３.９kb ＤＮＡ断片を得た。
これら２つのＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼ反応によ
り環状化し、プラスミドpＴＢ１０５４を得た。
IIIで切断し、ＤＮＡポリメラーゼＫlenow フラグメン
ト反応により平滑化したのち、Ｂgl IIで切断して約
０．８kb ＤＮＡ断片を分離した。一方プラスミドpＴＢ
３９９(特開昭６１−６３２８２に記載)をＥcoＲＩで切
断後、Ｋlenow フラグメント反応により平滑化したの
ち、Ｂgl IIで切断して約３.９kb ＤＮＡ断片を得た。
これら２つのＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼ反応によ
り環状化し、プラスミドpＴＢ１０５４を得た。
【００３２】参考例４ ヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３発現ベ
クターの構築 (１)ヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３ cＤＮＡを有するプラスミ
ドpＨＮＴ２(ヨーロッパ特許出願公開第３８６,７５２
号公報参照)を制限酵素ＳtuＩで切断し、Ｂgl IIリンカ
ーをＴ４ＤＮＡリガーゼにより結合させた。このＤＮＡ
を制限酵素ＥcoＲＩおよびＢgl IIで切断することによ
り、ヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３ cＤＮＡを含む１.０kbの
ＤＮＡ断片を得た。一方、動物細胞用発現プラスミドp
ＴＢ３９９(Cell Struct. Funct. １２ ２０５(１９８
７))を制限酵素ＥcoＲＩおよびＢgl IIで切断し、約３.
８kbのＤＮＡ断片を得た。両ＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリ
ガーゼにより連結させプラスミドpＴＢ１０５５を得
た。次に、ハムスタージヒドロ葉酸還元酵素(ＤＨＦＲ)
cＤＮＡを有するプラスミドpＴＢ３４８(特開昭６１−
６３２８２に記載)を制限酵素ＳalＩ，Ｈind IIIで切断
し、これにプラスミドpＴＢ１０５５を制限酵素Ｓal
Ｉ，Ｈind IIIで切断することによって得られた約２.６
kb ＤＮＡ断片を連結することにより、プラスミドpＴＢ
１０５９を得た(〔図１〕参照)。
クターの構築 (１)ヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３ cＤＮＡを有するプラスミ
ドpＨＮＴ２(ヨーロッパ特許出願公開第３８６,７５２
号公報参照)を制限酵素ＳtuＩで切断し、Ｂgl IIリンカ
ーをＴ４ＤＮＡリガーゼにより結合させた。このＤＮＡ
を制限酵素ＥcoＲＩおよびＢgl IIで切断することによ
り、ヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３ cＤＮＡを含む１.０kbの
ＤＮＡ断片を得た。一方、動物細胞用発現プラスミドp
ＴＢ３９９(Cell Struct. Funct. １２ ２０５(１９８
７))を制限酵素ＥcoＲＩおよびＢgl IIで切断し、約３.
８kbのＤＮＡ断片を得た。両ＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリ
ガーゼにより連結させプラスミドpＴＢ１０５５を得
た。次に、ハムスタージヒドロ葉酸還元酵素(ＤＨＦＲ)
cＤＮＡを有するプラスミドpＴＢ３４８(特開昭６１−
６３２８２に記載)を制限酵素ＳalＩ，Ｈind IIIで切断
し、これにプラスミドpＴＢ１０５５を制限酵素Ｓal
Ｉ，Ｈind IIIで切断することによって得られた約２.６
kb ＤＮＡ断片を連結することにより、プラスミドpＴＢ
１０５９を得た(〔図１〕参照)。
【００３３】(２)上記(１)項記載のプラスミドpＨＮＴ
２に含まれるヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３遺伝子は５′上流
に同じ読み取り枠（in frame）のＡＴＧ配列が存在する
(ヨーロッパ特許出願公開第３８６,７５２号公報の第２
図参照)。このＡＴＧ配列を除くために以下の２つのＤ
ＮＡオリゴマーを合成した。 プライマー１：5′TAC AGG TGA ATT CGG CCA TGT CCA TCT TG 3′ （配列表：配列番号４） プライマー２：5′AGA GAT GCG AAT TCA TGT TCT TC 3′(配列表：配列番号５) プライマー１および２を用いて、以下の手順でポリメラ
ーゼチェーンリアクション(ＰＣＲ)を行った。プラスミ
ドpＨＮＴ２を制限酵素ＢamＨＩで切断し直鎖状にし、
フェノール抽出後、エタノールで抽出、蒸発乾固し、蒸
留水に溶解した。ＰＣＲは、ＧeneＡmpTMＤＮＡ増幅試
薬キット(パーキン・エルマー・シータスＵＳＡ)を用
い、鋳型ＤＮＡとして前述の直鎖状pＨＮＴ２を０.３n
g，プライマーとしてプライマー１,２を各１.０μＭ加
えて行った。反応は、ＤＮＡサーマルサイクラー(パー
キン・エルマー・シータス)を用い、９４℃，１分，５
５℃，２分，７２℃，３分を３０回くり返すことによっ
て行った。その結果、約０.８kbのＤＮＡ断片を得るこ
とができた。プライマー１，２には、制限酵素ＥcoＲＩ
の認識部位が存在するので、得られた断片をＥcoＲＩで
切断し、pＵＣ１１９のＥcoＲＩ部位にサブクローニン
グした。この組換えプライマーpＴＢ１３３７を 大腸菌
ＭＶ１１８４株に導入して得られる一本鎖ＤＮＡから塩
基配列を確認したところ、一塩基の誤りもなく遺伝子が
増幅されていたことがわかった。このpＴＢ１３３７を
制限酵素ＥcoＲＩおよびＡpaＩで切り出し０.２３kbの
ＤＮＡ断片を得た。上記（１）項記載のプラスミドpＴ
Ｂ１０５５を制限酵素ＥcoＲＩおよびＡpaＩで切断して
得られる約４.６kbのＤＮＡに、この０.２３kbのＤＮＡ
を連結し、プラスミドpＴＢ１３３８を得た。pＴＢ１３
３８を制限酵素ＳalＩとＨind IIIで切断し、上記
（１）項と同様の方法でハムスターＤＨＦＲ遺伝子を導
入し、発現プラスミドpＴＢ１３３９を得た(〔図２〕〜
〔図３〕参照)。このプラスミドpＴＢ１３３９上に存在
するＮＧＦ２／ＮＴ−３のプロ領域をコードするＤＮ
Ａ，ＮＧＦ２／ＮＴ−３をコードするＤＮＡおよびその
付近のＤＮＡを〔図７〕〜〔図８〕に示す（配列表：配
列番号６）。
２に含まれるヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３遺伝子は５′上流
に同じ読み取り枠（in frame）のＡＴＧ配列が存在する
(ヨーロッパ特許出願公開第３８６,７５２号公報の第２
図参照)。このＡＴＧ配列を除くために以下の２つのＤ
ＮＡオリゴマーを合成した。 プライマー１：5′TAC AGG TGA ATT CGG CCA TGT CCA TCT TG 3′ （配列表：配列番号４） プライマー２：5′AGA GAT GCG AAT TCA TGT TCT TC 3′(配列表：配列番号５) プライマー１および２を用いて、以下の手順でポリメラ
ーゼチェーンリアクション(ＰＣＲ)を行った。プラスミ
ドpＨＮＴ２を制限酵素ＢamＨＩで切断し直鎖状にし、
フェノール抽出後、エタノールで抽出、蒸発乾固し、蒸
留水に溶解した。ＰＣＲは、ＧeneＡmpTMＤＮＡ増幅試
薬キット(パーキン・エルマー・シータスＵＳＡ)を用
い、鋳型ＤＮＡとして前述の直鎖状pＨＮＴ２を０.３n
g，プライマーとしてプライマー１,２を各１.０μＭ加
えて行った。反応は、ＤＮＡサーマルサイクラー(パー
キン・エルマー・シータス)を用い、９４℃，１分，５
５℃，２分，７２℃，３分を３０回くり返すことによっ
て行った。その結果、約０.８kbのＤＮＡ断片を得るこ
とができた。プライマー１，２には、制限酵素ＥcoＲＩ
の認識部位が存在するので、得られた断片をＥcoＲＩで
切断し、pＵＣ１１９のＥcoＲＩ部位にサブクローニン
グした。この組換えプライマーpＴＢ１３３７を 大腸菌
ＭＶ１１８４株に導入して得られる一本鎖ＤＮＡから塩
基配列を確認したところ、一塩基の誤りもなく遺伝子が
増幅されていたことがわかった。このpＴＢ１３３７を
制限酵素ＥcoＲＩおよびＡpaＩで切り出し０.２３kbの
ＤＮＡ断片を得た。上記（１）項記載のプラスミドpＴ
Ｂ１０５５を制限酵素ＥcoＲＩおよびＡpaＩで切断して
得られる約４.６kbのＤＮＡに、この０.２３kbのＤＮＡ
を連結し、プラスミドpＴＢ１３３８を得た。pＴＢ１３
３８を制限酵素ＳalＩとＨind IIIで切断し、上記
（１）項と同様の方法でハムスターＤＨＦＲ遺伝子を導
入し、発現プラスミドpＴＢ１３３９を得た(〔図２〕〜
〔図３〕参照)。このプラスミドpＴＢ１３３９上に存在
するＮＧＦ２／ＮＴ−３のプロ領域をコードするＤＮ
Ａ，ＮＧＦ２／ＮＴ−３をコードするＤＮＡおよびその
付近のＤＮＡを〔図７〕〜〔図８〕に示す（配列表：配
列番号６）。
【００３４】参考例５ ヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３の生物
活性の測定 ニワトリ有精卵を３７.５℃でふ卵器で８日〜１０日揺
卵して胚発生を行った胎児から後根神経節(Dorsal root
ganglion，以下ＤＲＧ)を摘出した。ＤＲＧを０.１２
５％トリプシン−ＰＢＳ溶液で３７℃２０分処理し、ピ
ペッティングを行うことで、細胞を分散させた。これ
を、１０％牛胎児血清−ダルベッコ改変ＭＥＭ培−５０
μg／mlカナマイシンに懸濁し、３７℃，５％ＣＯ2存在
下２〜４時間培養することにより線維芽細胞等を培養シ
ャーレに付着させ、非付着細胞のみを分取した。非付着
細胞を遠心(８００rpm，５分)により集め、１０％牛胎
児血清−ダルベッコ改変ＭＥＭ培地／ハムＦ−１２培地
(混合比１：１)−１μＭサイトシンアラビノシド(Ａra
C，シグマ社，ＵＳＡ)−５０μg／mlカナマイシンを含
む培地に１００００細胞／mlとなるように再懸濁し、
０.５ml／ウェルずつ、ポリレーオルニチンコート済み
４８穴プレートに播種した。この培地にサンプルとなる
溶液を０.５〜２０μl加え、３７℃，５％ＣＯ2存在下
で３日間培養し、生存細胞数を計測した。
活性の測定 ニワトリ有精卵を３７.５℃でふ卵器で８日〜１０日揺
卵して胚発生を行った胎児から後根神経節(Dorsal root
ganglion，以下ＤＲＧ)を摘出した。ＤＲＧを０.１２
５％トリプシン−ＰＢＳ溶液で３７℃２０分処理し、ピ
ペッティングを行うことで、細胞を分散させた。これ
を、１０％牛胎児血清−ダルベッコ改変ＭＥＭ培−５０
μg／mlカナマイシンに懸濁し、３７℃，５％ＣＯ2存在
下２〜４時間培養することにより線維芽細胞等を培養シ
ャーレに付着させ、非付着細胞のみを分取した。非付着
細胞を遠心(８００rpm，５分)により集め、１０％牛胎
児血清−ダルベッコ改変ＭＥＭ培地／ハムＦ−１２培地
(混合比１：１)−１μＭサイトシンアラビノシド(Ａra
C，シグマ社，ＵＳＡ)−５０μg／mlカナマイシンを含
む培地に１００００細胞／mlとなるように再懸濁し、
０.５ml／ウェルずつ、ポリレーオルニチンコート済み
４８穴プレートに播種した。この培地にサンプルとなる
溶液を０.５〜２０μl加え、３７℃，５％ＣＯ2存在下
で３日間培養し、生存細胞数を計測した。
【００３５】参考例６ ヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３発現ベ
クターの構築 プラスミドpＨＮＴ５(pＨＮＴ２のＥcoＲＩ挿入断片の
方向が逆向き)を大腸菌ＭＶ１１８３に導入することに
より(−)鎖一本鎖ＤＮＡを常法により調製した。一方プ
ラスミドpＮＧＦＰ１０８６(参考例１参照)を用いヒト
ＮＧＦ(−)鎖一本鎖ＤＮＡを調製した。これらに対し、 oligo１；５′ＡＧＧＡＧＣＡＡＧＣＧＣＴＣＡＴＣＡＴＣＣＣＡ ３′ （配列表：配列番号７） oligo２；５′ＴＣＡＣＧＧＣＧＧＡＡＧＣＧＣＴＡＣＧＣＧＧＡＧＣＡＴ ３′ （配列表：配列番号８） を合成し、これを用いて部位特異的な塩基変異を導入
し、ＮＧＦおよびＮＧＦ２／ＮＴ−３のそれぞれに制限
酵素Ｅco４７IIIの認識部位（ＡＧＣＧＣＴ）を導入し
た。この反応は、in Vitro Mutagenesis System，Ver.
２.０（アマシャム，ＵＫ）を使用した。この結果、ヒ
トＮＧＦ遺伝子中にＥco４７III部位を有する プラスミ
ドpＴＢ１３４０，ヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３遺伝子中に
Ｅco４７III部位を有するプラスミドpＴＢ１３４１を得
た。pＴＢ１３４０を制限酵素ＫpnＩおよびＥco４７III
で切断することにより約３.０kbのＤＮＡ断片を得た。p
ＴＢ１３ ４１を制限酵素ＫpnＩおよびＥco４７IIIで切
断することにより、０.６７kbのＤＮＡの断片を得た。
両者をＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結させることによ
り、プレプロ領域がＮＧＦ，マチュア（mature）領域が
ＮＧＦ２／ＮＴ−３となるハイブリッドタンパクをコー
ドする遺伝子を持つプラスミドpＴＢ１３４２を得た。p
ＴＢ１３４２を制限酵素ＳtuＩで切断後、合成Ｂal II
リンカーを連結し、これ を制限酵素ＭluＩおよびＢｇl
IIで切断することにより０.８kbのＤＮＡ断片を 得
た。これを制限酵素ＭluＩおよびＢｇl IIでpＴＢ１０
５４（参考例３参照） を切断して得られる約４.１kbの
ＤＮＡ断片に挿入し、発現プラスミドpＴＢ１３４３を
得た（〔図４〕〜〔図６〕参照）。さらにこれをＳalＩ
およびＨind III で切断して得た約２.６kbのＤＮＡ断
片をpＴＢ３４８のＳalＩ−ＨindIII部位 に挿入するこ
とによりpＴＢ１３４４を得た(〔図４〕〜〔図６〕参
照)。該プラスミドpＴＢ１３４４上に存在するＮＧＦの
プロ領域をコードするＤＮＡ、ＮＧＦ２／ＮＴ−３をコ
ードするＤＮＡおよびその付近のＤＮＡを〔図９〕〜
〔図１０〕に示す（配列表：配列番号９）。
クターの構築 プラスミドpＨＮＴ５(pＨＮＴ２のＥcoＲＩ挿入断片の
方向が逆向き)を大腸菌ＭＶ１１８３に導入することに
より(−)鎖一本鎖ＤＮＡを常法により調製した。一方プ
ラスミドpＮＧＦＰ１０８６(参考例１参照)を用いヒト
ＮＧＦ(−)鎖一本鎖ＤＮＡを調製した。これらに対し、 oligo１；５′ＡＧＧＡＧＣＡＡＧＣＧＣＴＣＡＴＣＡＴＣＣＣＡ ３′ （配列表：配列番号７） oligo２；５′ＴＣＡＣＧＧＣＧＧＡＡＧＣＧＣＴＡＣＧＣＧＧＡＧＣＡＴ ３′ （配列表：配列番号８） を合成し、これを用いて部位特異的な塩基変異を導入
し、ＮＧＦおよびＮＧＦ２／ＮＴ−３のそれぞれに制限
酵素Ｅco４７IIIの認識部位（ＡＧＣＧＣＴ）を導入し
た。この反応は、in Vitro Mutagenesis System，Ver.
２.０（アマシャム，ＵＫ）を使用した。この結果、ヒ
トＮＧＦ遺伝子中にＥco４７III部位を有する プラスミ
ドpＴＢ１３４０，ヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３遺伝子中に
Ｅco４７III部位を有するプラスミドpＴＢ１３４１を得
た。pＴＢ１３４０を制限酵素ＫpnＩおよびＥco４７III
で切断することにより約３.０kbのＤＮＡ断片を得た。p
ＴＢ１３ ４１を制限酵素ＫpnＩおよびＥco４７IIIで切
断することにより、０.６７kbのＤＮＡの断片を得た。
両者をＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結させることによ
り、プレプロ領域がＮＧＦ，マチュア（mature）領域が
ＮＧＦ２／ＮＴ−３となるハイブリッドタンパクをコー
ドする遺伝子を持つプラスミドpＴＢ１３４２を得た。p
ＴＢ１３４２を制限酵素ＳtuＩで切断後、合成Ｂal II
リンカーを連結し、これ を制限酵素ＭluＩおよびＢｇl
IIで切断することにより０.８kbのＤＮＡ断片を 得
た。これを制限酵素ＭluＩおよびＢｇl IIでpＴＢ１０
５４（参考例３参照） を切断して得られる約４.１kbの
ＤＮＡ断片に挿入し、発現プラスミドpＴＢ１３４３を
得た（〔図４〕〜〔図６〕参照）。さらにこれをＳalＩ
およびＨind III で切断して得た約２.６kbのＤＮＡ断
片をpＴＢ３４８のＳalＩ−ＨindIII部位 に挿入するこ
とによりpＴＢ１３４４を得た(〔図４〕〜〔図６〕参
照)。該プラスミドpＴＢ１３４４上に存在するＮＧＦの
プロ領域をコードするＤＮＡ、ＮＧＦ２／ＮＴ−３をコ
ードするＤＮＡおよびその付近のＤＮＡを〔図９〕〜
〔図１０〕に示す（配列表：配列番号９）。
【００３６】参考例７ ＣＨＯ細胞の形質転換およびク
ローニング ハムスターＣＨＯ細胞(ＤＨＦＲ-)を５％牛胎児血清を
含むＨamＦ−１２培地でファルコンシャーレ(径６cm)に
４×１０5個まいた。５％ＣＯ2存在下３７℃で一晩培養
後、培地を交換し、さらに４時間培養を行い、参考例１
で得られたヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３発現プラスミドpＴ
Ｂ１０５９，pＴＢ１３３９，pＴＢ１３４４をそれぞ
れ、シャーレ一枚あたり１０μg リン酸カルシウム法
(グラハムらヴィロロジー（Virology）５２ ４５６−
４６７(１９７３))によりＣＨＯ細胞に導入した。培養
４時間後、培地を交換し一晩培養後、選択培地(５％牛
胎児血清−ダルベッコ改変ＭＥＭ−５０μg／mlカナマ
イシン−３５μg／mlプロリン)に培地を置き換え培養を
続けた。１０〜１５日後ＤＨＦＲ+となった細胞がコロ
ニーを形成したので、シングルコロニーアイソレーショ
ンを行いクローニングした。
ローニング ハムスターＣＨＯ細胞(ＤＨＦＲ-)を５％牛胎児血清を
含むＨamＦ−１２培地でファルコンシャーレ(径６cm)に
４×１０5個まいた。５％ＣＯ2存在下３７℃で一晩培養
後、培地を交換し、さらに４時間培養を行い、参考例１
で得られたヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３発現プラスミドpＴ
Ｂ１０５９，pＴＢ１３３９，pＴＢ１３４４をそれぞ
れ、シャーレ一枚あたり１０μg リン酸カルシウム法
(グラハムらヴィロロジー（Virology）５２ ４５６−
４６７(１９７３))によりＣＨＯ細胞に導入した。培養
４時間後、培地を交換し一晩培養後、選択培地(５％牛
胎児血清−ダルベッコ改変ＭＥＭ−５０μg／mlカナマ
イシン−３５μg／mlプロリン)に培地を置き換え培養を
続けた。１０〜１５日後ＤＨＦＲ+となった細胞がコロ
ニーを形成したので、シングルコロニーアイソレーショ
ンを行いクローニングした。
【００３７】参考例８ 形質転換体によるヒトＮＧＦ２
／ＮＴ−３遺伝子の発現 参考例２によって得られたＣＨＯ形質転換体の培養上清
を採取し、参考例５に示した方法で培養上清中のヒトＮ
ＧＦ２／ＮＴ−３活性を測定した。この結果、pＴＢ１
０５９，pＴＢ１３３９，pＴＢ１３４４のいずれによっ
て形質転換した場合にも生物活性が認められた。
／ＮＴ−３遺伝子の発現 参考例２によって得られたＣＨＯ形質転換体の培養上清
を採取し、参考例５に示した方法で培養上清中のヒトＮ
ＧＦ２／ＮＴ−３活性を測定した。この結果、pＴＢ１
０５９，pＴＢ１３３９，pＴＢ１３４４のいずれによっ
て形質転換した場合にも生物活性が認められた。
【００３８】参考例９ ヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３高産生
ＣＨＯ細胞株の確立 参考例７，８で示した形質転換株をそれぞれ、１００ｎ
Ｍメトトレキセートを含む選択培地(参考例７に記載)で
培養した。この培地で生存してきたクローンについて
は、更に選択培地中のメトトレキセート濃度を１μＭ，
１０μＭへと段階的に上げながら培養を続けた。その結
果、プラスミドpＴＢ１０５９によって形質転換した株
Ａ１００２，プラスミドpＴＢ１３３９によって形質転
換した株ＣＨＯ−dＮ２−１７およびＣＨＯ−dＮ２−１
９，プラスミドpＴＢ１３４４によって形質転換した株
ＣＨＯ−Ｎ２−１（ＩＦＯ ５０３０７，ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−３２５５）およびＣＨＯ−Ｎ２−３７を得た。これ
らのＮＧＦ２／ＮＴ−３の産生量)は以下のとおりであ
った。 この表において産生量は参考例５に示した生物活性測定
方法によって、マウスβＮＧＦ当量として算出した。こ
の例では、限界希釈点を０.０２ng／mlβＮＧＦ当量点
とした。
ＣＨＯ細胞株の確立 参考例７，８で示した形質転換株をそれぞれ、１００ｎ
Ｍメトトレキセートを含む選択培地(参考例７に記載)で
培養した。この培地で生存してきたクローンについて
は、更に選択培地中のメトトレキセート濃度を１μＭ，
１０μＭへと段階的に上げながら培養を続けた。その結
果、プラスミドpＴＢ１０５９によって形質転換した株
Ａ１００２，プラスミドpＴＢ１３３９によって形質転
換した株ＣＨＯ−dＮ２−１７およびＣＨＯ−dＮ２−１
９，プラスミドpＴＢ１３４４によって形質転換した株
ＣＨＯ−Ｎ２−１（ＩＦＯ ５０３０７，ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−３２５５）およびＣＨＯ−Ｎ２−３７を得た。これ
らのＮＧＦ２／ＮＴ−３の産生量)は以下のとおりであ
った。 この表において産生量は参考例５に示した生物活性測定
方法によって、マウスβＮＧＦ当量として算出した。こ
の例では、限界希釈点を０.０２ng／mlβＮＧＦ当量点
とした。
【００３９】参考例１０ ヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３の単
離 参考例６で得られた細胞株ＣＨＯ−Ｎ２−１を５％牛胎
児血清、３５μg／mlプロリン，５０μg／mlカナマイシ
ンおよび２μＭメトトレキセートを含むダルベッコ改変
培地で２×１０4細胞／cm2の濃度で播種し、５％ＣＯ2
存在下、３７℃，７日間培養した。ニワトリ胚ＤＲＧに
対する活性測定から、この培地中には、１０μg ＮＧＦ
−１当量以上の組換え型ヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３が産生
されていることがわかった。この培養液は、使用時まで
−２０℃で凍結保存した。凍結保存培養上清１リットル
を遠心８０００rpm，１５分，４℃または濾過(東洋濾紙
No.２)することで細胞残渣を除き、これを終濃度が１m
Ｍ ＥＤＴＡ，０.０５％ＣＨＡＰＳとなるように調製
し、２Ｎ酢酸でpＨ６.０に補正した。これを再び遠心又
は濾過し、不溶性画分を除き陽イオン交換樹脂に通し
た。陽イオン交換樹脂としては、Ｓ−セファロース フ
ァーストフロー(ファルマシアＬＫＢ，スウェーデン)を
０.１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液pＨ６.０−１mＭ ＥＤ
ＴＡ−０.０５％ＣＨＡＰＳで平衡化し、これを径２.６
cm高さ１０cmのカラムに詰めたものを用いた。調製済み
培養上清を４℃で６０ml／hrの流速でこのカラムを通す
ことにより、吸着を行った。吸着後、カラムを０.１Ｍ
リン酸ナトリウム緩衝液pＨ６.０−１mＭ ＥＤＴＡ−
０.０５％ＣＨＡＰＳを流速６０ml／hrで４時間洗浄
し、０.５Ｍ ＮaＣl−０.１Ｍリン酸ナトリウム(pＨ６.
０)−１mＭ ＥＤＴＡ−０.０５％ＣＨＡＰＳを流速５０
ml／hrで流すことにより溶出を行った。ヒトＮＧＦ２／
ＮＴ−３を含む画分をヨーロッパ特許出願公開第３８
６,７５２号公報の参考例１に記載の抗ポリペプチド
(Ｉ)Ｎ末ペプチド抗体を用いたウェスタンブロッティン
グにより決定し、これを集めウルトラフリー２０(ミリ
ポア，ＵＳＡ)により約２０倍濃縮した。得られた濃縮
液を２０mＭ トリス・塩酸(pＨ７.４)−０.１５Ｍ Ｎa
Ｃl−１mＭ ＥＤＴＡ−０.０５％ＣＨＡＰＳで平衡化さ
せたセファクリルＳ−１００ＨＲ(ファルマシアＬＫ
Ｂ，スウェーデン)カラム(径１.６cm×８５cm)によりゲ
ル濾過した。先に示したのと同様に、ウェスタンブロッ
ティングによりヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３画分を同定し、
この画分をウルトラフリー２０で約２０倍に濃縮した。
得られた濃縮液を逆相ＨＰＬＣにかけ、ヒトＮＧＦ−２
を精製した。即ち、この濃縮液をAsahipak ＯＤＰ−５
０（旭化成，日本，径８mm×１５０mm）カラムを通し、
０.１％トリフルオロ酢酸(ＴＦＡ)を含む０−９０％ア
セトニトリルの濃度勾配にかけ、精製ヒトＮＧＦ２／Ｎ
Ｔ−３を約６０μg得た。
離 参考例６で得られた細胞株ＣＨＯ−Ｎ２−１を５％牛胎
児血清、３５μg／mlプロリン，５０μg／mlカナマイシ
ンおよび２μＭメトトレキセートを含むダルベッコ改変
培地で２×１０4細胞／cm2の濃度で播種し、５％ＣＯ2
存在下、３７℃，７日間培養した。ニワトリ胚ＤＲＧに
対する活性測定から、この培地中には、１０μg ＮＧＦ
−１当量以上の組換え型ヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３が産生
されていることがわかった。この培養液は、使用時まで
−２０℃で凍結保存した。凍結保存培養上清１リットル
を遠心８０００rpm，１５分，４℃または濾過(東洋濾紙
No.２)することで細胞残渣を除き、これを終濃度が１m
Ｍ ＥＤＴＡ，０.０５％ＣＨＡＰＳとなるように調製
し、２Ｎ酢酸でpＨ６.０に補正した。これを再び遠心又
は濾過し、不溶性画分を除き陽イオン交換樹脂に通し
た。陽イオン交換樹脂としては、Ｓ−セファロース フ
ァーストフロー(ファルマシアＬＫＢ，スウェーデン)を
０.１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液pＨ６.０−１mＭ ＥＤ
ＴＡ−０.０５％ＣＨＡＰＳで平衡化し、これを径２.６
cm高さ１０cmのカラムに詰めたものを用いた。調製済み
培養上清を４℃で６０ml／hrの流速でこのカラムを通す
ことにより、吸着を行った。吸着後、カラムを０.１Ｍ
リン酸ナトリウム緩衝液pＨ６.０−１mＭ ＥＤＴＡ−
０.０５％ＣＨＡＰＳを流速６０ml／hrで４時間洗浄
し、０.５Ｍ ＮaＣl−０.１Ｍリン酸ナトリウム(pＨ６.
０)−１mＭ ＥＤＴＡ−０.０５％ＣＨＡＰＳを流速５０
ml／hrで流すことにより溶出を行った。ヒトＮＧＦ２／
ＮＴ−３を含む画分をヨーロッパ特許出願公開第３８
６,７５２号公報の参考例１に記載の抗ポリペプチド
(Ｉ)Ｎ末ペプチド抗体を用いたウェスタンブロッティン
グにより決定し、これを集めウルトラフリー２０(ミリ
ポア，ＵＳＡ)により約２０倍濃縮した。得られた濃縮
液を２０mＭ トリス・塩酸(pＨ７.４)−０.１５Ｍ Ｎa
Ｃl−１mＭ ＥＤＴＡ−０.０５％ＣＨＡＰＳで平衡化さ
せたセファクリルＳ−１００ＨＲ(ファルマシアＬＫ
Ｂ，スウェーデン)カラム(径１.６cm×８５cm)によりゲ
ル濾過した。先に示したのと同様に、ウェスタンブロッ
ティングによりヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３画分を同定し、
この画分をウルトラフリー２０で約２０倍に濃縮した。
得られた濃縮液を逆相ＨＰＬＣにかけ、ヒトＮＧＦ−２
を精製した。即ち、この濃縮液をAsahipak ＯＤＰ−５
０（旭化成，日本，径８mm×１５０mm）カラムを通し、
０.１％トリフルオロ酢酸(ＴＦＡ)を含む０−９０％ア
セトニトリルの濃度勾配にかけ、精製ヒトＮＧＦ２／Ｎ
Ｔ−３を約６０μg得た。
【００４０】こうして得られた組換え型ヒトＮＧＦ２／
ＮＴ−３をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１５％(３５.１：１)）
により分析したところ、分子量１４０００付近にほぼ単
一なバンドとして検出された〔図１１〕また、これはＥ
Ｐ−３８６,７５２の参考例１に示す抗体と反応した
〔図１２〕。〔図１１〕では、この精製過程をＳＤＳ−
ＰＡＧＥで分析し、銀染色を行った図を示し、〔図１
２〕ではＳＤＳ−ＰＡＧＥ後ウェスタンブロッティング
を行ったものを示した。〔図１１〕，〔図１２〕ともレ
ーン１はヨーロッパ特許出願公開第３８６,７５２号公
報に記載の方法で得られたポリペプチド(Ｉ)を、レーン
２は参考例５中の逆相クロマトグラフィーにかけたサン
プルを、レーン３は逆相クロマトグラフィーで素通しし
た画分を、レーン４は逆相クロマトグラフィーでアセト
ニトリルの濃度勾配をかけることによって溶出されてき
た画分(ＮＧＦ２／ＮＴ−３画分)をそれぞれ示す。
ＮＴ−３をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１５％(３５.１：１)）
により分析したところ、分子量１４０００付近にほぼ単
一なバンドとして検出された〔図１１〕また、これはＥ
Ｐ−３８６,７５２の参考例１に示す抗体と反応した
〔図１２〕。〔図１１〕では、この精製過程をＳＤＳ−
ＰＡＧＥで分析し、銀染色を行った図を示し、〔図１
２〕ではＳＤＳ−ＰＡＧＥ後ウェスタンブロッティング
を行ったものを示した。〔図１１〕，〔図１２〕ともレ
ーン１はヨーロッパ特許出願公開第３８６,７５２号公
報に記載の方法で得られたポリペプチド(Ｉ)を、レーン
２は参考例５中の逆相クロマトグラフィーにかけたサン
プルを、レーン３は逆相クロマトグラフィーで素通しし
た画分を、レーン４は逆相クロマトグラフィーでアセト
ニトリルの濃度勾配をかけることによって溶出されてき
た画分(ＮＧＦ２／ＮＴ−３画分)をそれぞれ示す。
【００４１】参考例１１ ヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３遺伝
子の動物細胞での発現(II) 参考例４で得られたプラスミドpＴＢ１０５９，pＴＢ１
３３９，および参考例１で得られたpＴＢ１３４４につ
いてサルＣＯＳ−７細胞での発現を検討した。遺伝子導
入は参考例７で示したリン酸カルシウム法により行っ
た。ただし、培地としては１０％牛胎児血清−ダルベッ
コ改変ＭＥＭ培地を用い、遺伝子導入後は、０.５％牛
胎児血清−ダルベッコ改変ＭＥＭ培地を用いた。遺伝子
導入４８時間後に培地を採集した。１００μlの培養上
清に１０μlの１００％(w／v)トリクロロ酢酸を加え冷
却(０℃ １０分)することによりタンパクを沈殿させ、
これをＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動した。Western blottin
g を常法により行い、ヨーロッパ特許出願公開第３８
６,７５２号公報の参考例１に示した抗ポリペプチド
(Ｉ)Ｎ末ペプチド抗体を用いて 組換え体を検出した。
〔図１３〕。この系ではpＴＢ１３３９が最もよく組換
え体を産生した。〔図１３〕において、レーン１はヨー
ロッパ特許出願公開第３８６,７５２号公報に記載の方
法で得られたポリペプチド(Ｉ)の、レーン２はプラスミ
ドpＴＢ１０５９によるＣＯＳ上清の、レーン３はプラ
スミドpＴＢ１３４４によるＣＯＳ上清の、レーン４は
プラスミドpＴＢ１３３９によるＣＯＳ上清の結果をそ
れぞれ示す。
子の動物細胞での発現(II) 参考例４で得られたプラスミドpＴＢ１０５９，pＴＢ１
３３９，および参考例１で得られたpＴＢ１３４４につ
いてサルＣＯＳ−７細胞での発現を検討した。遺伝子導
入は参考例７で示したリン酸カルシウム法により行っ
た。ただし、培地としては１０％牛胎児血清−ダルベッ
コ改変ＭＥＭ培地を用い、遺伝子導入後は、０.５％牛
胎児血清−ダルベッコ改変ＭＥＭ培地を用いた。遺伝子
導入４８時間後に培地を採集した。１００μlの培養上
清に１０μlの１００％(w／v)トリクロロ酢酸を加え冷
却(０℃ １０分)することによりタンパクを沈殿させ、
これをＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動した。Western blottin
g を常法により行い、ヨーロッパ特許出願公開第３８
６,７５２号公報の参考例１に示した抗ポリペプチド
(Ｉ)Ｎ末ペプチド抗体を用いて 組換え体を検出した。
〔図１３〕。この系ではpＴＢ１３３９が最もよく組換
え体を産生した。〔図１３〕において、レーン１はヨー
ロッパ特許出願公開第３８６,７５２号公報に記載の方
法で得られたポリペプチド(Ｉ)の、レーン２はプラスミ
ドpＴＢ１０５９によるＣＯＳ上清の、レーン３はプラ
スミドpＴＢ１３４４によるＣＯＳ上清の、レーン４は
プラスミドpＴＢ１３３９によるＣＯＳ上清の結果をそ
れぞれ示す。
【００４２】参考例１２ 参考例６で得られたＣＨＯ−Ｎ２−１株をそれぞれ用い
大量培養による調製を行った。調製法は参考例５を基に
し、一部以下のように改変した。培養は５％牛胎児血
清，３５μg／mlプロリン，５０μg／mlカナマイシン，
２μＭメトトレキセートを含むダルベッコ改変ＭＥＭ培
地で２×１０4細胞／cm2の濃度で播種し、５％ＣＯ2存
在下，３７℃，７日間培養した。培養上清を採集後、１
％牛胎児血清−３５μg／mlプロリン−５０μg／mlカナ
マイシン−２μＭメトトレキセートを含むダルベッコ改
変ＭＥＭ培地／ハムＦ−１２培地(１：１混合 培地)(以
下、調製培地と略す)に置き換え３〜４日間培養した。
この培養上清を 採集後、さらに調製培地で３〜４日培
養し培養上清を採集した。１２０枚の１０cmシャーレか
らこの一連の培養で５リットルの培養上清を得ることが
できた。これを２回くり返し１０リットルの培養上清を
得た。培養上清は−２０℃で保管した。参考例１０記載
の方法で培養上清を処理し、Ｓ−セファロースカラム
(径５ ×２０cm)にかけた。参考例１０に記載した方法
により活性画分を溶出し、１２ml／フラクションずつ分
画した〔図１４〕。この画分に対し、５０％飽和になる
ように硫安を加え、０℃で２時間放置し、遠心(１００
００rpm，１５分４℃，サーバルＳＳ３４ローター(ＵＳ
Ａ)）により沈殿を回収した。沈殿を４０mlの２０mＭト
リス・塩酸(pＨ７.４)１mＭ ＥＤＴＡ−０.０５％ＣＨ
ＡＰＳに溶解した。ゲル濾過を行う前に遠心（１５００
０rpm，１５分 ４℃，サーバルＳＳ ３４ローター）
し、不溶性物質を除いた。ゲル濾過は参考例６に記載の
方法で行った。ただし、カラムは径２.６cm×９０cmの
ものを用い、流速は１００ml／hr，サ ンプル量１０ml
にした〔図１５〕。溶出画分はウルトラフリー２０(ミ
リポア， ＵＳＡ)で濃縮した。これを参考例１０記載の
方法で逆相クロマトグラフィーを 行い精製した(１ml／
フラクション)〔図１６〕。これらの各ステップでの精
製過程を〔表１〕に示す。これらについてＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥで分析した図を〔図１７〕および〔図１８〕に示し
た。最終標品は、ほぼ単一のバンドを示した。以上のこ
とから、約１０リットルの培養上清から組換え標品が２
１０μg得られたことがわかった。
大量培養による調製を行った。調製法は参考例５を基に
し、一部以下のように改変した。培養は５％牛胎児血
清，３５μg／mlプロリン，５０μg／mlカナマイシン，
２μＭメトトレキセートを含むダルベッコ改変ＭＥＭ培
地で２×１０4細胞／cm2の濃度で播種し、５％ＣＯ2存
在下，３７℃，７日間培養した。培養上清を採集後、１
％牛胎児血清−３５μg／mlプロリン−５０μg／mlカナ
マイシン−２μＭメトトレキセートを含むダルベッコ改
変ＭＥＭ培地／ハムＦ−１２培地(１：１混合 培地)(以
下、調製培地と略す)に置き換え３〜４日間培養した。
この培養上清を 採集後、さらに調製培地で３〜４日培
養し培養上清を採集した。１２０枚の１０cmシャーレか
らこの一連の培養で５リットルの培養上清を得ることが
できた。これを２回くり返し１０リットルの培養上清を
得た。培養上清は−２０℃で保管した。参考例１０記載
の方法で培養上清を処理し、Ｓ−セファロースカラム
(径５ ×２０cm)にかけた。参考例１０に記載した方法
により活性画分を溶出し、１２ml／フラクションずつ分
画した〔図１４〕。この画分に対し、５０％飽和になる
ように硫安を加え、０℃で２時間放置し、遠心(１００
００rpm，１５分４℃，サーバルＳＳ３４ローター(ＵＳ
Ａ)）により沈殿を回収した。沈殿を４０mlの２０mＭト
リス・塩酸(pＨ７.４)１mＭ ＥＤＴＡ−０.０５％ＣＨ
ＡＰＳに溶解した。ゲル濾過を行う前に遠心（１５００
０rpm，１５分 ４℃，サーバルＳＳ ３４ローター）
し、不溶性物質を除いた。ゲル濾過は参考例６に記載の
方法で行った。ただし、カラムは径２.６cm×９０cmの
ものを用い、流速は１００ml／hr，サ ンプル量１０ml
にした〔図１５〕。溶出画分はウルトラフリー２０(ミ
リポア， ＵＳＡ)で濃縮した。これを参考例１０記載の
方法で逆相クロマトグラフィーを 行い精製した(１ml／
フラクション)〔図１６〕。これらの各ステップでの精
製過程を〔表１〕に示す。これらについてＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥで分析した図を〔図１７〕および〔図１８〕に示し
た。最終標品は、ほぼ単一のバンドを示した。以上のこ
とから、約１０リットルの培養上清から組換え標品が２
１０μg得られたことがわかった。
【００４３】なお、〔図１７〕は、銀染色の結果を、
〔図１８〕は、ウエスタンブロッティングの結果をそれ
ぞれ示す。〔図１７〕および〔図１８〕において、レー
ン１はヨーロッパ特許出願公開第３８６,７５２号公報
に記載の方法で得られたポリペプチド(Ｉ)０.０１μgに
ついての、レーン２はＣＨＯ−Ｎ２−１細胞培養上清１
０μgについての、レーン３はＳ−セファロース素通し
画分１０μgについての、レーン４はＳ−セファロース
溶出画分１μgについての、レーン５は硫安沈殿画分１
μgについての、レーン６はゲル濾過溶出画分０.１μg
についての、レーン７は逆相ＨＰＬＣ溶出画分０.１μg
についての結果をそれぞれ示す。なお、精製開始時は、
総タンパクの０.００１〜０.０１％程度のものが、最終
的には純度９５％以上にまで精製(効率１０4倍)されて
いることを示すためにウエスタンブロッティング〔図１
８〕と銀染色〔図１７〕を並置した。
〔図１８〕は、ウエスタンブロッティングの結果をそれ
ぞれ示す。〔図１７〕および〔図１８〕において、レー
ン１はヨーロッパ特許出願公開第３８６,７５２号公報
に記載の方法で得られたポリペプチド(Ｉ)０.０１μgに
ついての、レーン２はＣＨＯ−Ｎ２−１細胞培養上清１
０μgについての、レーン３はＳ−セファロース素通し
画分１０μgについての、レーン４はＳ−セファロース
溶出画分１μgについての、レーン５は硫安沈殿画分１
μgについての、レーン６はゲル濾過溶出画分０.１μg
についての、レーン７は逆相ＨＰＬＣ溶出画分０.１μg
についての結果をそれぞれ示す。なお、精製開始時は、
総タンパクの０.００１〜０.０１％程度のものが、最終
的には純度９５％以上にまで精製(効率１０4倍)されて
いることを示すためにウエスタンブロッティング〔図１
８〕と銀染色〔図１７〕を並置した。
【表１】
【００４４】参考例１３ 精製組換え体の生物活性(Ｉ) 参考例１２で得られた最終精製標品について、参考例５
で示した方法により生物活性を測定した。コントロール
としてマウスβＮＧＦ(和光純薬)を用いた。結果を〔図
１９〕に示す。〔図１９〕において□を黒でぬりつぶし
た印はマウスβＮＧＦの結果を、●はＮＧＦ２／ＮＴ−
３の結果をそれぞれ示す。〔図１９〕に示すようにＮＧ
Ｆ２／ＮＴ−３は、この系においてβＮＧＦよりも活性
が弱いことがわかった。
で示した方法により生物活性を測定した。コントロール
としてマウスβＮＧＦ(和光純薬)を用いた。結果を〔図
１９〕に示す。〔図１９〕において□を黒でぬりつぶし
た印はマウスβＮＧＦの結果を、●はＮＧＦ２／ＮＴ−
３の結果をそれぞれ示す。〔図１９〕に示すようにＮＧ
Ｆ２／ＮＴ−３は、この系においてβＮＧＦよりも活性
が弱いことがわかった。
【００４５】参考例１４ 精製組換え体の生物活性(II) ラットＰＣ１２細胞に対する生物活性を測定した。活性
測定法はバイオケミカル アンド バイオフィジカル
リサーチ コミュニケーションズ １７１巻１１６〜１
２２頁(１９９０年)に記載の方法により行った。この結
果を〔図２０〕に示した。〔図２０〕において、□を黒
でぬりつぶした印はマウスＮＧＦβの結果を、●はＮＧ
Ｆ２／ＮＴ−３の結果をそれぞれ示す。組換え型ＮＧＦ
２はＰＣ１２細胞に対し神経突起の伸長を惹き起こす活
性は非常に低く、マウスβＮＧＦ(和光純薬)に対して１
／１０3かそれ以下の活性であることがわかった。
測定法はバイオケミカル アンド バイオフィジカル
リサーチ コミュニケーションズ １７１巻１１６〜１
２２頁(１９９０年)に記載の方法により行った。この結
果を〔図２０〕に示した。〔図２０〕において、□を黒
でぬりつぶした印はマウスＮＧＦβの結果を、●はＮＧ
Ｆ２／ＮＴ−３の結果をそれぞれ示す。組換え型ＮＧＦ
２はＰＣ１２細胞に対し神経突起の伸長を惹き起こす活
性は非常に低く、マウスβＮＧＦ(和光純薬)に対して１
／１０3かそれ以下の活性であることがわかった。
【００４６】参考例１５ 参考例６で得られたＣＨＯ−Ｎ２−１株を、参考例１０
と同様に播種，培養した。培地を無血清培地（Cosmediu
m；コスモバイオ社）に交換し、さらに２日間培養し
た。１リッターの培養上清を１００個の１０−cm皿から
集めた。０.５mＭＰＭＳＦと１mＭのベンズアミジンを
集められた培養上清とカラムの緩衝液に加えて、参考例
１０と同様の方法でＮＧＦ２／ＮＴ−３を精製した。逆
相ＨＰＬＣによって、保持時間が２４分(Ｐ１)，２６分
(Ｐ２)および２８分(Ｐ３)の３つのピークを与えた〔図
２１〕。Ｐ２とＰ３は、ニワトリ胎児ＤＲＧ神経に対す
る生物的活性を有していたが、Ｐ１は有していなかっ
た。Ｐ２蛋白質は、ＰＡＧＥにおいて大腸菌により生産
された組換えＮＧＦ−２と同時に移動したが、Ｐ３蛋白
質はそれらより少しさらに速く移動した〔図２３〕。Ｐ
２蛋白質のみが、ウエスタン・ブロッティングにより、
抗ポリペプチド(Ｉ)Ｎ−末端ペプチド抗体(ヨーロッパ
公開第３８６,７５２号公報の参考例２で得られたもの)
を認識した〔図２２〕。〔図２２〕において、レーン
(ａ)は大腸菌形質転換体により生産されたＮＧＦ−２
を、レーン(ｂ)は逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィー〔図
２１〕で得られたフラクション２４(Ｐ１)を、レーン
(ｃ)は逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィー〔図２１〕で得
られたフラクション２６(Ｐ２)を、レーン(ｄ)は逆相Ｈ
ＰＬＣクロマトグラフィー〔図２１〕で得られたフラク
ション２８(Ｐ３)をそれぞれ示す。〔図２３〕におい
て、レーン(ｅ)は大腸菌形質転換体により生産されたＮ
ＧＦを、レーン(ｆ)は逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィー
〔図２１〕で得られたフラクション２５を、レーン(ｇ)
は逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィー〔図２１〕で得られ
たフラクション２６(Ｐ２)を、レーン(ｈ)は逆相ＨＰＬ
Ｃクロマトグラフィー〔図２１〕で得られたフラクショ
ン２７を、レーン(ｉ)は逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィ
ー〔図２１〕で得られたフラクション２８(Ｐ３)を、レ
ーン(ｊ)は逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィー〔図２１〕
で得られたフラクション２９をそれぞれ示す。
と同様に播種，培養した。培地を無血清培地（Cosmediu
m；コスモバイオ社）に交換し、さらに２日間培養し
た。１リッターの培養上清を１００個の１０−cm皿から
集めた。０.５mＭＰＭＳＦと１mＭのベンズアミジンを
集められた培養上清とカラムの緩衝液に加えて、参考例
１０と同様の方法でＮＧＦ２／ＮＴ−３を精製した。逆
相ＨＰＬＣによって、保持時間が２４分(Ｐ１)，２６分
(Ｐ２)および２８分(Ｐ３)の３つのピークを与えた〔図
２１〕。Ｐ２とＰ３は、ニワトリ胎児ＤＲＧ神経に対す
る生物的活性を有していたが、Ｐ１は有していなかっ
た。Ｐ２蛋白質は、ＰＡＧＥにおいて大腸菌により生産
された組換えＮＧＦ−２と同時に移動したが、Ｐ３蛋白
質はそれらより少しさらに速く移動した〔図２３〕。Ｐ
２蛋白質のみが、ウエスタン・ブロッティングにより、
抗ポリペプチド(Ｉ)Ｎ−末端ペプチド抗体(ヨーロッパ
公開第３８６,７５２号公報の参考例２で得られたもの)
を認識した〔図２２〕。〔図２２〕において、レーン
(ａ)は大腸菌形質転換体により生産されたＮＧＦ−２
を、レーン(ｂ)は逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィー〔図
２１〕で得られたフラクション２４(Ｐ１)を、レーン
(ｃ)は逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィー〔図２１〕で得
られたフラクション２６(Ｐ２)を、レーン(ｄ)は逆相Ｈ
ＰＬＣクロマトグラフィー〔図２１〕で得られたフラク
ション２８(Ｐ３)をそれぞれ示す。〔図２３〕におい
て、レーン(ｅ)は大腸菌形質転換体により生産されたＮ
ＧＦを、レーン(ｆ)は逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィー
〔図２１〕で得られたフラクション２５を、レーン(ｇ)
は逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィー〔図２１〕で得られ
たフラクション２６(Ｐ２)を、レーン(ｈ)は逆相ＨＰＬ
Ｃクロマトグラフィー〔図２１〕で得られたフラクショ
ン２７を、レーン(ｉ)は逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィ
ー〔図２１〕で得られたフラクション２８(Ｐ３)を、レ
ーン(ｊ)は逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィー〔図２１〕
で得られたフラクション２９をそれぞれ示す。
【００４７】Ｎ末端アミノ酸を分析したところ、Ｐ２は
成熟型ＮＧＦ２／ＮＴ−３のＮ末端配列と一致したが、
Ｐ３はＮ末端５残基欠失型ＮＧＦ２／ＮＴ−３に相当す
ることが分かった〔表２〕
成熟型ＮＧＦ２／ＮＴ−３のＮ末端配列と一致したが、
Ｐ３はＮ末端５残基欠失型ＮＧＦ２／ＮＴ−３に相当す
ることが分かった〔表２〕
【表２】
【００４８】実施例１ （免疫） 上述の参考例１２で得られたＮ末端５残基欠失型（以
下、Ｎ５欠と略称する）ヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３を生理
食塩水で溶解し等容量のフロインド完全アジュバントと
十分に懸濁させて調製した懸濁液を、ＢＡＬＢ／c マウ
ス（♀，１０週令）に皮内投与して初回免疫を行った
（抗原Ｎ５欠ヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３ ５０μg／
匹）。３週間後に、初回免疫と同様にしてフロインド不
完全アジュバントに溶かしたヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３懸
濁液を調製し、追加免疫を行った。さらに２週間ごとに
追加免疫を２回行ったのち、３週間後に、生理食塩水に
溶解したＮ５欠ヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３ ５０μgを腹
腔内投与して最終免疫を行った。
下、Ｎ５欠と略称する）ヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３を生理
食塩水で溶解し等容量のフロインド完全アジュバントと
十分に懸濁させて調製した懸濁液を、ＢＡＬＢ／c マウ
ス（♀，１０週令）に皮内投与して初回免疫を行った
（抗原Ｎ５欠ヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３ ５０μg／
匹）。３週間後に、初回免疫と同様にしてフロインド不
完全アジュバントに溶かしたヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３懸
濁液を調製し、追加免疫を行った。さらに２週間ごとに
追加免疫を２回行ったのち、３週間後に、生理食塩水に
溶解したＮ５欠ヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３ ５０μgを腹
腔内投与して最終免疫を行った。
【００４９】実施例２ (１) 細胞融合 実施例１で示した免疫マウスより、最終免疫３日後に脾
臓を摘出した細胞融合に用いる脾細胞を取得し、ＲＰＭ
Ｉ １６４０培地(日水製薬)に浮遊させた。マウス骨髄
腫細胞Ｐ３×６３Ａg ８Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）は１０％ウシ
胎児血清（ＦＥＳ，ハイクロンラボラトリーズ）を含む
ＲＰＭＩ １６４０培地で継代培養した。細胞融合はケ
ーラーおよびミルスタインらが確立した方法〔ケーラ
ー，Ｇ. およびミルスタイン，Ｃ．：ネイチャー（Natu
re）２５６，４９５(１９７５)〕に準じて行った。得ら
れた脾細胞とマウスミエローマ細胞を５：１の割合で混
合し、培地を十分に除いた後、１mlのＲＰＭＩ １６４
０培地に溶解した５０％ポリエ チレングリコール４０
００(シグマ)中で３７℃、２分間インキュベートした。
この細胞を血清無添加ＲＰＭＩ培地で洗浄したのち、Ｈ
ＡＴ（１×１０-4Ｍヒポキサンチン，４×１０-7Ｍ ア
ミノプテリン，１.６×１０-5Ｍ チミジン）添 加，１
０％ＦＥＳを含むＲＰＭＩ １６４０培地（以下ＨＡＴ
培地と称する）に 浮遊させ、９６ウエル培養プレート
の各ウエルに３×１０5個／０.１mlずつ分注した。３７
℃，７％ＣＯ2下で３日間培養したのち、さらにＨＡＴ
培地を各ウエ ルへ０.１mlずつ添加した。この条件下で
生育した細胞は雑種細胞である。
臓を摘出した細胞融合に用いる脾細胞を取得し、ＲＰＭ
Ｉ １６４０培地(日水製薬)に浮遊させた。マウス骨髄
腫細胞Ｐ３×６３Ａg ８Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）は１０％ウシ
胎児血清（ＦＥＳ，ハイクロンラボラトリーズ）を含む
ＲＰＭＩ １６４０培地で継代培養した。細胞融合はケ
ーラーおよびミルスタインらが確立した方法〔ケーラ
ー，Ｇ. およびミルスタイン，Ｃ．：ネイチャー（Natu
re）２５６，４９５(１９７５)〕に準じて行った。得ら
れた脾細胞とマウスミエローマ細胞を５：１の割合で混
合し、培地を十分に除いた後、１mlのＲＰＭＩ １６４
０培地に溶解した５０％ポリエ チレングリコール４０
００(シグマ)中で３７℃、２分間インキュベートした。
この細胞を血清無添加ＲＰＭＩ培地で洗浄したのち、Ｈ
ＡＴ（１×１０-4Ｍヒポキサンチン，４×１０-7Ｍ ア
ミノプテリン，１.６×１０-5Ｍ チミジン）添 加，１
０％ＦＥＳを含むＲＰＭＩ １６４０培地（以下ＨＡＴ
培地と称する）に 浮遊させ、９６ウエル培養プレート
の各ウエルに３×１０5個／０.１mlずつ分注した。３７
℃，７％ＣＯ2下で３日間培養したのち、さらにＨＡＴ
培地を各ウエ ルへ０.１mlずつ添加した。この条件下で
生育した細胞は雑種細胞である。
【００５０】(２) 抗体産生細胞の検索 Ｎ５欠ヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３を１０μg／ml含有する
生理食塩水０.１mlを、９６ウエル平底ＥＬＩＳＡ用プ
レート（Falcon ３９１２）各ウエルに加えて４℃に一
夜静置した。０.０５％ Tween ２０−ＰＢＳで３回洗浄
したのち、５mg／ml ＢＳＡ−０.０５％ Tween ２０−
ＰＢＳ ０.２mlを各ウエルに加え、３７℃に１時間静
置した。再び０.０５％ Tween ２０−ＰＢＳで３回洗浄
した後、０.１％ＢＳＡ−０.０５％ Tween ２０−ＰＢ
Ｓにて２倍連続段階希釈した培養上清を０.１ml／ウエ
ル加え室温に２時間静置した。０.０５％ Tween ２０−
ＰＢＳで３回洗浄後、２次抗体としてＨＲＰ標識抗マウ
スＩgＧウサギ抗体溶液（１μg／ml）０.１mlを加え室
温に１時間放置した。洗浄を５回繰り返したあと、発色
液（オルト−フェニレンジアミン １０ml，５０mＭリ
ン酸２ナトリウム・２４mＭクエン酸緩衝液（pＨ５.
０）１０mlおよび１.７％過酸化水素溶液１２０μlを用
時混合調製したもの）０.１mlを加えてＨＲＰ酵素反応
を行った。６Ｎ硫酸０.０５mlを加えて酵素反応を停止
させ、波長４９２nmでの吸光度を測定した（ＥＬＩＳＡ
法）。
生理食塩水０.１mlを、９６ウエル平底ＥＬＩＳＡ用プ
レート（Falcon ３９１２）各ウエルに加えて４℃に一
夜静置した。０.０５％ Tween ２０−ＰＢＳで３回洗浄
したのち、５mg／ml ＢＳＡ−０.０５％ Tween ２０−
ＰＢＳ ０.２mlを各ウエルに加え、３７℃に１時間静
置した。再び０.０５％ Tween ２０−ＰＢＳで３回洗浄
した後、０.１％ＢＳＡ−０.０５％ Tween ２０−ＰＢ
Ｓにて２倍連続段階希釈した培養上清を０.１ml／ウエ
ル加え室温に２時間静置した。０.０５％ Tween ２０−
ＰＢＳで３回洗浄後、２次抗体としてＨＲＰ標識抗マウ
スＩgＧウサギ抗体溶液（１μg／ml）０.１mlを加え室
温に１時間放置した。洗浄を５回繰り返したあと、発色
液（オルト−フェニレンジアミン １０ml，５０mＭリ
ン酸２ナトリウム・２４mＭクエン酸緩衝液（pＨ５.
０）１０mlおよび１.７％過酸化水素溶液１２０μlを用
時混合調製したもの）０.１mlを加えてＨＲＰ酵素反応
を行った。６Ｎ硫酸０.０５mlを加えて酵素反応を停止
させ、波長４９２nmでの吸光度を測定した（ＥＬＩＳＡ
法）。
【００５１】この方法で雑種細胞の生育してきたウエル
の培養上清について１次スクリーニングを行ない、吸光
度の高かったウエル中の細胞を限界希釈法にてクローニ
ングした。クローニングに際しては、あらかじめ３７
℃，７％ＣＯ2下で一夜培養した。マウス腹腔滲出細胞
（１０4個／ウエル）をフィーダーとして用いた。さら
に、スクリーニングおよびクローニングを繰り返し、抗
Ｎ５欠ヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３抗体産生ハイブリドーマ
３Ｗ３細胞（ＩＦＯ ５０３７０、ＦＥＲＭ ＢＰ−３
９３２）を得た。上記ＥＬＩＳＡ法により３Ｗ３細胞培
養上清中の抗体価を測定すると、１２８倍希釈しても波
長４９２nmの吸収は２以上であった。クローニングされ
た細胞２０％牛胎児血清を含むＲＰＭＩ １６４０培地
に１０％となるようジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）
を加え液体窒素内に貯蔵した。
の培養上清について１次スクリーニングを行ない、吸光
度の高かったウエル中の細胞を限界希釈法にてクローニ
ングした。クローニングに際しては、あらかじめ３７
℃，７％ＣＯ2下で一夜培養した。マウス腹腔滲出細胞
（１０4個／ウエル）をフィーダーとして用いた。さら
に、スクリーニングおよびクローニングを繰り返し、抗
Ｎ５欠ヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３抗体産生ハイブリドーマ
３Ｗ３細胞（ＩＦＯ ５０３７０、ＦＥＲＭ ＢＰ−３
９３２）を得た。上記ＥＬＩＳＡ法により３Ｗ３細胞培
養上清中の抗体価を測定すると、１２８倍希釈しても波
長４９２nmの吸収は２以上であった。クローニングされ
た細胞２０％牛胎児血清を含むＲＰＭＩ １６４０培地
に１０％となるようジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）
を加え液体窒素内に貯蔵した。
【００５２】実施例３ （モノクローナル抗体の免疫グ
ロブリンクラス） 実施例２−(２)で得られた３Ｗ３細胞の培養上清を、マ
ウス抗体サブクラス検出キット（バイオラッド社）によ
り各種標品免疫グロブリンと反応させた。その結果を
〔表３〕に示す。
ロブリンクラス） 実施例２−(２)で得られた３Ｗ３細胞の培養上清を、マ
ウス抗体サブクラス検出キット（バイオラッド社）によ
り各種標品免疫グロブリンと反応させた。その結果を
〔表３〕に示す。
【表３】 表中、＋は反応陽性を、−は反応陰性を示す。〔表３〕
より、３Ｗ３細胞培養上清中の抗体は免疫グロブリンク
ラスＩgＧ1サブクラスに属する。
より、３Ｗ３細胞培養上清中の抗体は免疫グロブリンク
ラスＩgＧ1サブクラスに属する。
【００５３】実施例４ （培養上清からのモノクローナ
ル抗体の精製） 結合緩衝液（３Ｍ塩化ナトリウム、１.５Ｈグリシン(p
Ｈ８.７)）で平衡化したプロテインＡカラムに実施例２
で得られたマウス３Ｗ３細胞の培養上清と結合緩衝液を
１：１で混合したものを添着した。結合緩衝液で洗った
後、溶出緩衝液（０.１Ｍクエン酸(pＨ５)）で溶出し
た。溶出液は、１Ｍトリス(pＨ８.０）を加え中性化し
て生理的リン酸緩衝液中で透析し、精製３Ｗ３抗体を得
た。
ル抗体の精製） 結合緩衝液（３Ｍ塩化ナトリウム、１.５Ｈグリシン(p
Ｈ８.７)）で平衡化したプロテインＡカラムに実施例２
で得られたマウス３Ｗ３細胞の培養上清と結合緩衝液を
１：１で混合したものを添着した。結合緩衝液で洗った
後、溶出緩衝液（０.１Ｍクエン酸(pＨ５)）で溶出し
た。溶出液は、１Ｍトリス(pＨ８.０）を加え中性化し
て生理的リン酸緩衝液中で透析し、精製３Ｗ３抗体を得
た。
【００５４】実施例５ （ヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３中和
作用の検討） 実施例４の方法で精製した３Ｗ３抗体を用いて、Ｎ５欠
ヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３に体する中和活性を検討した。
ニワトリ有精卵を３７．５℃、ふ卵器で８〜１０日揺卵
して胚発生を行い胎児から後根神経節（Dorsal root ga
nglion, ＤＲＧ）を摘出した。ＤＲＧを０.１２５％ト
リプシン−ＰＢＳ溶液を３７℃２０分処理し、ピペッテ
ィングにより細胞を分散させた。これを、１０％牛胎児
血清−ダルベッコ改変ＭＥＭ上培地ＤＭＥＭ ５０μg／
mlカナマイシンに懸濁し、３７℃、５％ＣＯ2存在下２
〜４時間培養して線維芽細胞等を培養シャーレに付着さ
せ、非付着細胞のみを分取した。非付着細胞を遠心（８
００rpm, ５分）により集め、１０％牛胎児血清および
５０μg／mlカナマイシンおよび１μＭサイトシンアラ
ビノシド（ＡraＣ，シグマ社）を含むＤＭＥＭ／ハムＦ
−１２培地（混合比 １：１）に８×１０3細胞／mlとな
るように再懸濁し、０.５ml／ウエルずつ、ポリオルニ
チンコート済み４８穴プレートに播種した。この時、培
養液中にＮＧＦ（８ng／ml）あるいはＮ５欠ヒトＮＧＦ
２／ＮＴ−３(４０ng／ml)と共に０.５〜４μg／mlの３
Ｗ３抗体を添加し、３日間培養したのち、生存細胞数を
計測した。結果を〔図２５〕に示す。〔図２５〕におい
て、○−○はＮＧＦ（８ng／ml）添加時の、●−●はＮ
５欠ヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３（４０ng／ml）添加時の生
存細胞数を示す。
作用の検討） 実施例４の方法で精製した３Ｗ３抗体を用いて、Ｎ５欠
ヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３に体する中和活性を検討した。
ニワトリ有精卵を３７．５℃、ふ卵器で８〜１０日揺卵
して胚発生を行い胎児から後根神経節（Dorsal root ga
nglion, ＤＲＧ）を摘出した。ＤＲＧを０.１２５％ト
リプシン−ＰＢＳ溶液を３７℃２０分処理し、ピペッテ
ィングにより細胞を分散させた。これを、１０％牛胎児
血清−ダルベッコ改変ＭＥＭ上培地ＤＭＥＭ ５０μg／
mlカナマイシンに懸濁し、３７℃、５％ＣＯ2存在下２
〜４時間培養して線維芽細胞等を培養シャーレに付着さ
せ、非付着細胞のみを分取した。非付着細胞を遠心（８
００rpm, ５分）により集め、１０％牛胎児血清および
５０μg／mlカナマイシンおよび１μＭサイトシンアラ
ビノシド（ＡraＣ，シグマ社）を含むＤＭＥＭ／ハムＦ
−１２培地（混合比 １：１）に８×１０3細胞／mlとな
るように再懸濁し、０.５ml／ウエルずつ、ポリオルニ
チンコート済み４８穴プレートに播種した。この時、培
養液中にＮＧＦ（８ng／ml）あるいはＮ５欠ヒトＮＧＦ
２／ＮＴ−３(４０ng／ml)と共に０.５〜４μg／mlの３
Ｗ３抗体を添加し、３日間培養したのち、生存細胞数を
計測した。結果を〔図２５〕に示す。〔図２５〕におい
て、○−○はＮＧＦ（８ng／ml）添加時の、●−●はＮ
５欠ヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３（４０ng／ml）添加時の生
存細胞数を示す。
【００５５】Ｎ５欠ヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３存在下では
播種した４０００個の細胞のうち約１５００個が生存し
たが、３Ｗ３抗体添加により用量依存的に生存細胞数が
減少した。一方、３Ｗ３抗体は、ＮＧＦによるＤＲＧニ
ューロンの生存には影響しなかった。以上より３Ｗ３抗
体はＮ５欠ヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３の生物活性に対して
強い中和作用を示すことが判明した。
播種した４０００個の細胞のうち約１５００個が生存し
たが、３Ｗ３抗体添加により用量依存的に生存細胞数が
減少した。一方、３Ｗ３抗体は、ＮＧＦによるＤＲＧニ
ューロンの生存には影響しなかった。以上より３Ｗ３抗
体はＮ５欠ヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３の生物活性に対して
強い中和作用を示すことが判明した。
【００５６】実施例６ (１) 実施例４で得られたモノクローナル抗体３Ｗ３を
１０mg／ml以上に濃縮し、次いで０.１Ｍアセテートバ
ッファーｐＨ４.２−０.１ＭＮaＣlに対して透析した。
抗体蛋白量の１／２０量のペプシンを加え、３７℃で一
夜反応させた。反応後生成した３Ｗ３−Ｆ(ab′)2をウ
ルトロゲルＡｃＡ４４（ＬＫＢ社製、スエーデン，径１
cm×６０cm）にかけ分離した。３Ｗ３−Ｆ(ab′)2画分
を集め、セントリプレップ１０を用いて１.５mlに濃縮
し、β−メルカプトエタノールを２０mＭになるように
加え３７℃で９０分反応させた。反応後、セファデック
スＧ−２５（径０.８cm×６５cm，ファルマシア社，ス
エーデン）を充填したゲル濾過カラムによりＳＨ基を導
入した抗体画分を分取した。 (２) 西洋ワサビパーオキシダーゼ（以下ＨＲＰと略称
する，ベーリンガーマンハイム社，西ドイツ，ＥＩＡグ
レード）１０mgを１mlの０.１Ｍリン酸バッファー（ｐ
Ｈ７.０）に溶解した。Ｎ−（γ−マレイミドブチリル
オキシ）スクシンイミド（ＧＭＢＳ）２.１mgを１００
μｌのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解
し、ＨＲＰ溶液に加え室温で４５分撹拌した。その後、
セファデックスＧ−２５を充填したゲル濾過カラムによ
り、マレイミド基を導入したＨＲＰ画分を分取した。 (３) 上記(１)においてＳＨ基を導入した抗体３Ｗ３−
Ｆab′画分２mlと上記(２)においてマレイミド基を導入
したＨＲＰ画分２mlを混合し、４℃で一夜反応さ せ
た。反応後、セントリプレップ１０を用いて０.８mlに
濃縮し、ＨＲＰが導入 された抗体をウルトロゲルＡｃ
Ａ４４にかけ分離した。溶出画分のうち抗体１分子あた
りのＨＲＰ数が最も多い画分は、３ＨＲＰ／抗体であっ
た。 (４) 実施例４で得られた単クローン抗体３Ｗ３を１０
μg／mlとなるように０.１Ｍ炭酸バッファー(ｐＨ９.
５)で希釈し、イムノプレート（ヌンク社，デンマー
ク）に１００μｌ／ウエル注入し、４℃一夜静置するこ
とにより吸着させた。吸着しなかった抗体を除去した
後、ＰＢＳで３回洗浄し、ブロッキング液（ブロックエ
ース（大日本製薬社製）をＰＢＳにて４倍に希釈した
液，０.０１％メルチオレート(商標)を含む）を２００
μｌ／ウエル加え、室温４時間放置後、ブロッキング剤
を取り除き、ＰＢＳで５回洗浄後、希釈液（ブロックエ
ースをＰＢＳにて１０倍に希釈した液）で希釈したＮＧ
Ｆ２／ＮＴ−３を１００μｌ／ウエル加え、４℃一夜吸
着を行った。未反応のＮＧＦ２／ＮＴ−３を除去後、Ｐ
ＢＳで５回洗浄し、上記(３)で作製したＨＲＰ結合抗体
（ＨＲＰ−３Ｗ３−Ｆab′）を希釈液で１／４０００希
釈して１００μｌ／ウエル加え、室温で４時間反応させ
た。抗体含有液を除去後、ＰＢＳで５回洗浄し、パーオ
キシダーゼ基質（Sigma社，米国）を１００μｌ／ウエ
ル加え発色させた後、６Ｎ硫酸を５０μｌ／ウエル加え
反応を止めた。反応終了後比色定量した。〔図２６〕は
ＮＧＦ２／ＮＴ−３の検出曲線を示している。横軸は加
えたＮＧＦ２／ＮＴ−３濃度を、縦軸はＨＲＰ−３Ｗ３
−Ｆab′によって発色した吸光度を表わす。この図よ
り、上記測定系は、２７pg／mlの濃度のＮＧＦ２／ＮＴ
−３を検出できることがわかった。
１０mg／ml以上に濃縮し、次いで０.１Ｍアセテートバ
ッファーｐＨ４.２−０.１ＭＮaＣlに対して透析した。
抗体蛋白量の１／２０量のペプシンを加え、３７℃で一
夜反応させた。反応後生成した３Ｗ３−Ｆ(ab′)2をウ
ルトロゲルＡｃＡ４４（ＬＫＢ社製、スエーデン，径１
cm×６０cm）にかけ分離した。３Ｗ３−Ｆ(ab′)2画分
を集め、セントリプレップ１０を用いて１.５mlに濃縮
し、β−メルカプトエタノールを２０mＭになるように
加え３７℃で９０分反応させた。反応後、セファデック
スＧ−２５（径０.８cm×６５cm，ファルマシア社，ス
エーデン）を充填したゲル濾過カラムによりＳＨ基を導
入した抗体画分を分取した。 (２) 西洋ワサビパーオキシダーゼ（以下ＨＲＰと略称
する，ベーリンガーマンハイム社，西ドイツ，ＥＩＡグ
レード）１０mgを１mlの０.１Ｍリン酸バッファー（ｐ
Ｈ７.０）に溶解した。Ｎ−（γ−マレイミドブチリル
オキシ）スクシンイミド（ＧＭＢＳ）２.１mgを１００
μｌのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解
し、ＨＲＰ溶液に加え室温で４５分撹拌した。その後、
セファデックスＧ−２５を充填したゲル濾過カラムによ
り、マレイミド基を導入したＨＲＰ画分を分取した。 (３) 上記(１)においてＳＨ基を導入した抗体３Ｗ３−
Ｆab′画分２mlと上記(２)においてマレイミド基を導入
したＨＲＰ画分２mlを混合し、４℃で一夜反応さ せ
た。反応後、セントリプレップ１０を用いて０.８mlに
濃縮し、ＨＲＰが導入 された抗体をウルトロゲルＡｃ
Ａ４４にかけ分離した。溶出画分のうち抗体１分子あた
りのＨＲＰ数が最も多い画分は、３ＨＲＰ／抗体であっ
た。 (４) 実施例４で得られた単クローン抗体３Ｗ３を１０
μg／mlとなるように０.１Ｍ炭酸バッファー(ｐＨ９.
５)で希釈し、イムノプレート（ヌンク社，デンマー
ク）に１００μｌ／ウエル注入し、４℃一夜静置するこ
とにより吸着させた。吸着しなかった抗体を除去した
後、ＰＢＳで３回洗浄し、ブロッキング液（ブロックエ
ース（大日本製薬社製）をＰＢＳにて４倍に希釈した
液，０.０１％メルチオレート(商標)を含む）を２００
μｌ／ウエル加え、室温４時間放置後、ブロッキング剤
を取り除き、ＰＢＳで５回洗浄後、希釈液（ブロックエ
ースをＰＢＳにて１０倍に希釈した液）で希釈したＮＧ
Ｆ２／ＮＴ−３を１００μｌ／ウエル加え、４℃一夜吸
着を行った。未反応のＮＧＦ２／ＮＴ−３を除去後、Ｐ
ＢＳで５回洗浄し、上記(３)で作製したＨＲＰ結合抗体
（ＨＲＰ−３Ｗ３−Ｆab′）を希釈液で１／４０００希
釈して１００μｌ／ウエル加え、室温で４時間反応させ
た。抗体含有液を除去後、ＰＢＳで５回洗浄し、パーオ
キシダーゼ基質（Sigma社，米国）を１００μｌ／ウエ
ル加え発色させた後、６Ｎ硫酸を５０μｌ／ウエル加え
反応を止めた。反応終了後比色定量した。〔図２６〕は
ＮＧＦ２／ＮＴ−３の検出曲線を示している。横軸は加
えたＮＧＦ２／ＮＴ−３濃度を、縦軸はＨＲＰ−３Ｗ３
−Ｆab′によって発色した吸光度を表わす。この図よ
り、上記測定系は、２７pg／mlの濃度のＮＧＦ２／ＮＴ
−３を検出できることがわかった。
【００５７】実施例７ ＥＩＡ法による細胞培養上清中
のＮＧＦ２／ＮＴ−３量の定量 バーキット・リンパ腫由来(Burkitt Iymphoma Namalva)
細胞、急性リンパ性白血病(acute Iymphoblastic Ieuke
mia）ＢＡＬＬ−１細胞およびプラズマ細胞白血病(plas
ma cell Ieukemia) ＡＲＨ−７７細胞をそれぞれ０.５
〜１×１０6細胞／mlとなるように、１０％ ＦＣＳを含
むＲＰＭＩ−１６４０培地で培養し、３日後の培養上清
を取得し、セントリプレップ１０（アミコン社製）にて
約１０倍に濃縮したものをサンプルとし、実施例６に記
載の方法で上清中のＮＧＦ２／ＮＴ−３濃度を測定し
た。同時に１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ−１６４０培地
を上記の方法で濃縮し、これを陰性コントロールとし
た。サンプルのＮＴ−３量測定結果を〔表４〕に示す。
のＮＧＦ２／ＮＴ−３量の定量 バーキット・リンパ腫由来(Burkitt Iymphoma Namalva)
細胞、急性リンパ性白血病(acute Iymphoblastic Ieuke
mia）ＢＡＬＬ−１細胞およびプラズマ細胞白血病(plas
ma cell Ieukemia) ＡＲＨ−７７細胞をそれぞれ０.５
〜１×１０6細胞／mlとなるように、１０％ ＦＣＳを含
むＲＰＭＩ−１６４０培地で培養し、３日後の培養上清
を取得し、セントリプレップ１０（アミコン社製）にて
約１０倍に濃縮したものをサンプルとし、実施例６に記
載の方法で上清中のＮＧＦ２／ＮＴ−３濃度を測定し
た。同時に１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ−１６４０培地
を上記の方法で濃縮し、これを陰性コントロールとし
た。サンプルのＮＴ−３量測定結果を〔表４〕に示す。
【表４】
【００５８】
【発明の効果】本発明のモノクローナル抗体は、ヒトＮ
ＧＦ２／ＮＴ−３蛋白質の生物活性を中和し、ヒトＮＧ
Ｆ２／ＮＴ−３蛋白質と高感度に特異的に結合するの
で、痴呆などの疾病の治療薬として用いることができ、
また、ヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３蛋白質の測定のための試
薬として用いることができる。
ＧＦ２／ＮＴ−３蛋白質の生物活性を中和し、ヒトＮＧ
Ｆ２／ＮＴ−３蛋白質と高感度に特異的に結合するの
で、痴呆などの疾病の治療薬として用いることができ、
また、ヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３蛋白質の測定のための試
薬として用いることができる。
【００５９】
配列番号：１ 配列の長さ：３７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列の特徴：アダプター 配列： AGCTTGCCGC CACCATGTCC ATGTTGTTCT ACACTCT 37
【００６０】配列番号：２ 配列の長さ：３７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列の特徴：アダプター 配列： GATCAGAGTG TAGAACAACA TGGACATGGT GGCGGCA 37
【００６１】配列番号：３ 配列の長さ：１２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列の特徴：アダプター 配列： CAGATCTGGG CC 12
【００６２】配列番号：４ 配列の長さ：２９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列の特徴：アダプター 配列： TACAGGTGAA TTCGGCCATG TCCATCTTG 29
【００６３】配列番号：５ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列の特徴：アダプター 配列： AGAGATGCGA ATTCATGTTC TTC 23
【００６４】配列番号：６ 配列の長さ：９６９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic ＤＮＡ 起源 生物名：ヒト 株名：細胞 配列： G AAT TCG GCC ATG TCC ATC TTG TTT TAT GTG ATA TTT CTC GCT TAT 46 Met Ser Ile Leu Phe Tyr Val Ile Phe Leu Ala Tyr -135 -130 CTC CGT GGC ATC CAA GGT AAC AAC ATG GAT CAA AGG AGT TTG CCA GAA 94 Leu Arg Gly Ile Gln Gly Asn Asn Met Asp Gln Arg Ser Leu Pro Glu -125 -120 -115 GAC TCG CTC AAT TCC CTC ATT ATT AAG CTG ATC CAG GCA GAT ATT TTG 142 Asp Ser Leu Asn Ser Leu Ile Ile Lys Leu Ile Gln Ala Asp Ile Leu -110 -105 -100 AAA AAC AAG CTC TCC AAG CAG ATG GTG GAC GTT AAG GAA AAT TAC CAG 190 Lys Asn Lys Leu Ser Lys Gln Met Val Asp Val Lys Glu Asn Tyr Gln -95 -90 -85 -80 AGC ACC CTG CCC AAA GCT GAG GCT CCC CGA GAG CCG GAG CGG GGA GGG 238 Ser Thr Leu Pro Lys Ala Glu Ala Pro Arg Glu Pro Glu Arg Gly Gly -75 -70 -65 CCC GCC AAG TCA GCA TTC CAG CCA GTG ATT GCA ATG GAC ACC GAA CTG 286 Pro Ala Lys Ser Ala Phe Gln Pro Val Ile Ala Met Asp Thr Glu Leu -60 -55 -50 CTG CGA CAA CAG AGA CGC TAC AAC TCA CCG CGG GTC CTG CTG AGC GAC 334 Leu Arg Gln Gln Arg Arg Tyr Asn Ser Pro Arg Val Leu Leu Ser Asp -45 -40 -35 AGC ACC CCC TTG GAG CCC CCG CCC TTG TAT CTC ATG GAG GAT TAC GTG 382 Ser Thr Pro Leu Glu Pro Pro Pro Leu Tyr Leu Met Glu Asp Tyr Val -30 -25 -20 GGC AGC CCC GTG GTG GCG AAC AGA ACA TCA CGG CGG AAA CGG TAC GCG 430 Gly Ser Pro Val Val Ala Asn Arg Thr Ser Arg Arg Lys Arg Tyr Ala -15 -10 -5 1 GAG CAT AAG AGT CAC CGA GGG GAG TAC TCG GTA TGT GAC AGT GAG AGT 478 Glu His Lys Ser His Arg Gly Glu Tyr Ser Val Cys Asp Ser Glu Ser 5 10 15 CTG TGG GTG ACC GAC AAG TCA TCG GCC ATC GAC ATT CGG GGA CAC CAG 526 Leu Trp Val Thr Asp Lys Ser Ser Ala Ile Asp Ile Arg Gly His Gln 20 25 30 GTC ACG GTG CTG GGG GAG ATC AAA ACG GGC AAC TCT CCC GTC AAA CAA 574 Val Thr Val Leu Gly Glu Ile Lys Thr Gly Asn Ser Pro Val Lys Gln 35 40 45 50 TAT TTT TAT GAA ACG CGA TGT AAG GAA GCC AGG CCG GTC AAA AAC GGT 622 Tyr Phe Tyr Glu Tyr Arg Cys Lys Glu Ala Arg Pro Val Lys Asn Gly 55 60 65 TGC AGG GGT ATT GAT GAT AAA CAC TGG AAC TCT CAG TGC AAA ACA TCC 670 Cys Arg Gly Ile Asp Asp Lys His Trp Asn Ser Gln Cys Lys Thr Ser 70 75 80 CAA ACC TAC GTC CGA GCA CTG ACT TCA GAG AAC AAT AAA CTC GTG GGC 718 Gln Thr Tyr Val Arg Ala Leu Thr Ser Glu Asn Asn Lys Leu Val Gly 85 90 95 TGG CGG TGG ATA CGG ATA GAC ACG TCC TGT GTG TGT GCC TTG TCG AGA 766 Trp Arg Trp Ile Arg Ile Asp Thr Ser Cys Val Cys Ala Leu Ser Arg 100 105 110 AAA ATC GGA AGA ACA TGAATTGGCA TCTCTCCCCA TATATAAATT ATTACTTTAA 821 Lys Ile Gly Arg Thr 115 ATTATATGAT ATGCATGTAG CATATAAATG TTTATATTGT TTTTATATAT TATAAGTTGA 881 CCTTTATTTA TTAAACTTCA GCAACCCTAC AGTATATAGG CTTTTTTCTC AATAAAATCA 941 GTGTGCTTGC CTTCCCTCAG GCAGATCT 969
【００６５】配列番号：７ 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列の特徴：リンカー 配列： TCACGGCGGA AGCGCTACGC GGAGCAT 27
【００６６】配列番号：８ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列の特徴：リンカー 配列： AGGAGCAAGC GCTCATCATC CCA 23
【００６７】配列番号：９ 配列の長さ：９２３ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic ＤＮＡ および ｃＤＮＡ 起源 生物名：ヒト 株名：細胞 配列： TAG CTT GCC GCC ACC ATG TCC ATG TTG TTC TAC ACT CTG ATC ACA GCT 48 Met Ser Met Leu Phe Tyr Thr Leu Ile Thr Ala -125 -120 TTT CTG ATC GGC ATA CAG GCG GAA CCA CAC TCA GAG AGC AAT GTC CCT 96 Phe Leu Ile Gly Ile Gln Ala Glu Pro His Ser Glu Ser Asn Val Pro -115 -110 -100 -95 GCA GGA CAC ACC ATC CCC CAA GTC CAC TGG ACT AAA CTT CAG CAT TCC 144 Ala Gly His Thr Ile Pro Gln Val His Trp Thr Lys Leu Gln His Ser -90 -85 -80 CTT GAC ACT GCC CTT CGC AGA GCC CGC AGC GCC CCG GCA GCG GCG ATA 192 Leu Asp Thr Ala Leu Arg Arg Ala Arg Ser Ala Pro Ala Ala Ala Ile -75 -70 -65 GCT GCA CGC GTG GCG GGG CAG ACC CGC AAC ATT ACT GTG GAC CCC AGG 240 Ala Ala Arg Val Ala Gly Gln Thr Arg Asn Ile Thr Val Asp Pro Arg -60 -55 -50 CTG TTT AAA AAG CGG CGA CTC CGT TCA CCC CGT GTG CTG TTT AGC ACC 288 Leu Phe Lys Lys Arg Arg Leu Arg Ser Pro Arg Val Leu Phe Ser Thr -45 -40 -35 CAG CCT CCC CGT GAA GCT GCA GAC ACT CAG GAT CTG GAC TTC GAG GTC 336 Gln Pro Pro Arg Glu Ala Ala Asp Thr Gln Asp Leu Asp Phe Glu Val -30 -25 -20 -15 GGT GGT GCT GCC CCC TTC AAC AGG ACT CAC AGG AGC AAG CGC TAC GCG 384 Gly Gly Ala Ala Pro Phe Asn Arg Thr His Arg Ser Lys Arg Tyr Ala -10 -5 1 GAG CAT AAG AGT CAC CGA GGG GAG TAC TCG GTA TGT GAC AGT GAG AGT 432 Glu His Lys Ser His Arg Gly Glu Tyr Ser Val Cys Asp Ser Glu Ser 5 10 15 CTG TGG GTG ACC GAC AAG TCA TCG GCC ATC GAC ATT CGG GGA CAC CAG 480 Leu Trp Val Thr Asp Lys Ser Ser Ala Ile Asp Ile Arg Gly His Gln 20 25 30 GTC ACG GTG CTG GGG GAG ATC AAA ACG GGC AAC TCT CCC GTC AAA CAA 528 Val Thr Val Leu Gly Glu Ile Lys Thr Gly Asn Ser Pro Val Lys Gln 35 40 45 50 TAT TTT TAT GAA ACG CGA TGT AAG GAA GCC AGG CCG GTC AAA AAC GGT 576 Tyr Phe Tyr Glu Thr Arg Cys Lys Glu Ala Arg Pro Val Lys Asn Gly 55 60 65 TGC AGG GGT ATT GAT GAT AAA CAC TGG AAC TCT CAG TGC AAA ACA TCC 624 Cys Arg Gly Ile Asp Asp Lys His Trp Asn Ser Gln Cys Lys Thr Ser 70 75 80 CAA ACC TAC GTC CGA GCA CTG ACT TCA GAG AAC AAT AAA CTC GTG GGC 672 Gln Thr Tyr Val Arg Ala Leu Thr Ser Glu Asn Asn Lys Leu Val Gly 85 90 95 TGG CGG TGG ATA CGG ATA GAC ACG TCC TGT GTG TGT GCC TTG TCG AGA 720 Trp Arg Trp Ile Arg Ile Asp Thr Ser Cys Val Cys Ala Leu Ser Arg 100 105 110 AAA ATC GGA AGA ACA TGAATTGGCA TCTCTCCCCA TATATAAATT ATTACTTTAA 775 Lys Ile Gly Arg Thr 115 ATTATATGAT ATGCATGTAG CATATAAATG TTTATATTGT TTTTATATAT TATAAGTTGA 835 CCTTTATTTA TTAAACTTCA GCAACCCTAC AGTATATAGG CTTTTTTCTC AATAAAATCA 895 GTGTGCTTGC CTTCCCTCAG GCAGATCT 923
【００６８】配列番号：１０ 配列の長さ：１１８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Ｔｙｒ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｈｉｓ Ａｒｇ Ｇｌｙ
Ｇｌｕ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｃｙｓ Ａｓｐ Ｓｅｒ １６ ５
１０ １５ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｓｅｒ
Ｓｅｒ Ａｌａ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｇｌｙ ３２ ２０ ２５
３０ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｉｌｅ
Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｖａｌ ４８ ３５ ４０
４５ Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｃｙｓ
Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ａｌａ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｌｙｓ ７４ ５０ ５５
６０ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｌｙｓ
Ｈｉｓ Ｔｒｐ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｌｙｓ ９０ ６５ ７０
７５ ８０ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ａｒｇ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｔｈｒ
Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｖａｌ １０６ ８５ ９０
９５ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｔｈｒ
Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｓｅｒ １２２ １００ １０５
１１０ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ａｒｇ
１１８ １１５
Ｇｌｕ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｃｙｓ Ａｓｐ Ｓｅｒ １６ ５
１０ １５ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｓｅｒ
Ｓｅｒ Ａｌａ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｇｌｙ ３２ ２０ ２５
３０ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｉｌｅ
Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｖａｌ ４８ ３５ ４０
４５ Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｃｙｓ
Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ａｌａ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｌｙｓ ７４ ５０ ５５
６０ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｌｙｓ
Ｈｉｓ Ｔｒｐ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｌｙｓ ９０ ６５ ７０
７５ ８０ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ａｒｇ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｔｈｒ
Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｖａｌ １０６ ８５ ９０
９５ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｔｈｒ
Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｓｅｒ １２２ １００ １０５
１１０ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ａｒｇ
１１８ １１５
【図１】は、参考例４で得られた、プラスミドｐＴＢ１
０５９の構築図を示す。
０５９の構築図を示す。
【図２】は、参考例４で得られた、プラスミドpＴＢ１
３３９の 構築図を示す。
３３９の 構築図を示す。
【図３】は、参考例４で得られた、プラスミドpＴＢ１
３３９の 構築図を示す。
３３９の 構築図を示す。
【図４】は、参考例６で得られた、プラスミドpＴＢ １
３４４の構築図を示す。
３４４の構築図を示す。
【図５】は、参考例６で得られた、プラスミドpＴＢ １
３４４の構築図を示す。
３４４の構築図を示す。
【図６】は、参考例６で得られた、プラスミドpＴＢ １
３４４の構築図を示す。
３４４の構築図を示す。
【図７】は、参考例４で得られた、プラスミドｐＴＢ１
３３９上に存在するＮＧＦ２／ＮＴ−３のプロ領域をコ
ードするＤＮＡ、ＮＧＦ２／ＮＴ−３をコードするＤＮ
Ａおよびその付近のＤＮＡ配列を示す。
３３９上に存在するＮＧＦ２／ＮＴ−３のプロ領域をコ
ードするＤＮＡ、ＮＧＦ２／ＮＴ−３をコードするＤＮ
Ａおよびその付近のＤＮＡ配列を示す。
【図８】は、参考例４で得られた、プラスミドｐＴＢ１
３３９上に存在するＮＧＦ２／ＮＴ−３のプロ領域をコ
ードするＤＮＡ、ＮＧＦ２／ＮＴ−３をコードするＤＮ
Ａおよびその付近のＤＮＡ配列を示す。
３３９上に存在するＮＧＦ２／ＮＴ−３のプロ領域をコ
ードするＤＮＡ、ＮＧＦ２／ＮＴ−３をコードするＤＮ
Ａおよびその付近のＤＮＡ配列を示す。
【図９】は、参考例６で得られたプラスミドpＴＢ１３
４４上 に存在するＮＧＦのプロ領域をコードするＤＮ
Ａ，ＮＧＦ２／ＮＴ−３をコードするＤＮＡおよびその
付近のＤＮＡ配列を示す。
４４上 に存在するＮＧＦのプロ領域をコードするＤＮ
Ａ，ＮＧＦ２／ＮＴ−３をコードするＤＮＡおよびその
付近のＤＮＡ配列を示す。
【図１０】は、参考例６で得られたプラスミドpＴＢ１
３４４上 に存在するＮＧＦのプロ領域をコードするＤ
ＮＡ，ＮＧＦ２／ＮＴ−３をコードするＤＮＡおよびそ
の付近のＤＮＡ配列を示す。
３４４上 に存在するＮＧＦのプロ領域をコードするＤ
ＮＡ，ＮＧＦ２／ＮＴ−３をコードするＤＮＡおよびそ
の付近のＤＮＡ配列を示す。
【図１１】は、参考例１０で得られた、ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅの結果を示す。
Ｅの結果を示す。
【図１２】は、参考例１０で得られた、ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅの結果を示す。
Ｅの結果を示す。
【図１３】は、参考例１１で得られた、ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅの結果を示す。
Ｅの結果を示す。
【図１４】は、参考例１２で得られた、ＣＨＯ−Ｎ２−
１株の培養上清のＳ−セファロースカラムの溶出画分を
示す。
１株の培養上清のＳ−セファロースカラムの溶出画分を
示す。
【図１５】は、参考例１２で得られた、ゲル濾過の溶出
画分を示す。
画分を示す。
【図１６】は、参考例１２で得られた、逆相クロマトグ
ラフィーの結果を示す。
ラフィーの結果を示す。
【図１７】は、参考例１２で得られた、各精製過程にお
ける生成物についてのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。
ける生成物についてのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。
【図１８】は、参考例１２で得られた、ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅの結果を示す。
Ｅの結果を示す。
【図１９】は、参考例１３で得られた、生物活性の測定
結果を示す。
結果を示す。
【図２０】は、参考例１４で得られた、生物活性の測定
結果を示す。
結果を示す。
【図２１】は、参考例１５で得られた、逆相ＨＰＬＣク
ロマトグラフィーの結果を示す。
ロマトグラフィーの結果を示す。
【図２２】は、参考例１５で得られた、ウエスタン・ブ
ロッティングの結果を示す。
ロッティングの結果を示す。
【図２３】は、参考例１５で得られた、ＰＡＧＥの結果
を示す。
を示す。
【図２４】は、ヒトＮＧＦ−２のアミノ酸配列を示す。
【図２５】は、実施例５で得られた、本発明のモノクロ
ーナル抗体３Ｗ３抗体の、ニワトリＤＲＧニューロンの
生存に対する阻害活性を示すグラフである。
ーナル抗体３Ｗ３抗体の、ニワトリＤＲＧニューロンの
生存に対する阻害活性を示すグラフである。
【図２６】は、実施例６で得られた、ＮＧＦ２／ＮＴ−
３の検出曲線を示すグラフである。
３の検出曲線を示すグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 8310−2Ｊ Ｎ 8310−2Ｊ 33/577 Ｂ 9015−2Ｊ // Ｃ１２Ｎ 15/06 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/20 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (5)
- 【請求項１】次の(i)〜(iv)の特徴 (i)分子量：約１４万〜１６万、 (ii)免疫グロブリンクラス：ＩgＧ、 (iii)ヒト神経成長因子（ＮＧＦ）２の生物活性を中和
しうる、 (iv)ヒト神経成長因子（ＮＧＦ）と交差反応しない、 を有する抗ヒト神経成長因子２特異モノクローナル抗
体。 - 【請求項２】ヒト神経成長因子２で免疫した哺乳動物の
脾臓細胞と、同種または異種のリンパ球様細胞とからな
るクローン化されたハイブリドーマ。 - 【請求項３】請求項２記載のクローン化されたハイブリ
ドーマを液体培地中または哺乳動物の腹腔内で増殖し、
モノクローナル抗体を生成、蓄積せしめ、これを採取す
ることを特徴とする、請求項１記載のモノクローナル抗
体の製造法。 - 【請求項４】請求項１記載のモノクローナル抗体を用い
ることを特徴とするヒト神経成長因子２蛋白質の精製
法。 - 【請求項５】請求項１記載のモノクローナル抗体を用い
ることを特徴とするヒト神経成長因子２蛋白質の検出ま
たは定量法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP01765693A JP3519096B2 (ja) | 1992-07-02 | 1993-02-04 | モノクローナル抗体、ハイブリドーマおよびそれらの用途 |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17575892 | 1992-07-02 | ||
| JP19110692 | 1992-07-17 | ||
| JP28871692 | 1992-10-27 | ||
| JP4-175758 | 1992-10-27 | ||
| JP4-288716 | 1992-10-27 | ||
| JP4-191106 | 1992-10-27 | ||
| JP01765693A JP3519096B2 (ja) | 1992-07-02 | 1993-02-04 | モノクローナル抗体、ハイブリドーマおよびそれらの用途 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06189787A true JPH06189787A (ja) | 1994-07-12 |
| JP3519096B2 JP3519096B2 (ja) | 2004-04-12 |
Family
ID=27456817
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|---|---|---|---|
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| JP2009263396A (ja) * | 1998-02-27 | 2009-11-12 | Trustees Of The Univ Of Pennsylvania | ワクチン、免疫療法剤およびそれらの使用法 |
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| US9260514B2 (en) | 2003-07-15 | 2016-02-16 | Amgen Inc. | Methods of treating conditions caused by increased expression of nerve growth factor (NGF) or increased sensitivity to NGF using anti-NGF neutralizing antibodies as selective NGF pathway inhibitors |
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-
1993
- 1993-02-04 JP JP01765693A patent/JP3519096B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009263396A (ja) * | 1998-02-27 | 2009-11-12 | Trustees Of The Univ Of Pennsylvania | ワクチン、免疫療法剤およびそれらの使用法 |
| US7601818B2 (en) | 2003-07-15 | 2009-10-13 | Amgen, Inc. | Human anti-NGF neutralizing antibodies as selective NGF pathway inhibitors |
| US7795413B2 (en) | 2003-07-15 | 2010-09-14 | Amgen, Inc. | Nucleic acids encoding human anti-NGF neutralizing antibodies as selective NGF pathway inhibitors |
| US8106167B2 (en) | 2003-07-15 | 2012-01-31 | Amgen Inc. | Human anti-NGF neutralizing antibodies as selective NGF pathway inhibitors |
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| US9260514B2 (en) | 2003-07-15 | 2016-02-16 | Amgen Inc. | Methods of treating conditions caused by increased expression of nerve growth factor (NGF) or increased sensitivity to NGF using anti-NGF neutralizing antibodies as selective NGF pathway inhibitors |
| WO2010058517A1 (ja) * | 2008-11-20 | 2010-05-27 | 明治乳業株式会社 | ＩｇＧおよび／またはＩｇＧのＦｃ断片を含む神経細胞刺激剤 |
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| WO2010079850A3 (en) * | 2009-01-12 | 2010-11-04 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | Agent for prophylaxis or treatment of cancer |
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| CN111514279B (zh) * | 2020-06-16 | 2023-07-18 | 温州医科大学附属第二医院（温州医科大学附属育英儿童医院） | 神经营养因子3在制备治疗男性性腺功能减退症的药物中的应用 |
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