HU211879A9 - Cytotoxic lymphocyte maturation factor and monoclonal antibodies directed thereto - Google Patents

Cytotoxic lymphocyte maturation factor and monoclonal antibodies directed thereto Download PDF

Info

Publication number
HU211879A9
HU211879A9 HU95P/P00267P HU9500267P HU211879A9 HU 211879 A9 HU211879 A9 HU 211879A9 HU 9500267 P HU9500267 P HU 9500267P HU 211879 A9 HU211879 A9 HU 211879A9
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
clmf
protein
ser
leu
cells
Prior art date
Application number
HU95P/P00267P
Other languages
English (en)
Inventor
Richard Anthony Chizzonite
Maurice Kent Gately
Ulrich Andreas Gubler
Jeffrey David Hulmes
Yu-Ching Eugene Pan
Frank John Podlaski
Alvin Seth Stern
Original Assignee
Hoffmann La Roche
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27412641&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=HU211879(A9) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Hoffmann La Roche filed Critical Hoffmann La Roche
Publication of HU211879A9 publication Critical patent/HU211879A9/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5434—IL-12
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

Találmányunk citokinekre vonatkozik. Találmányunk tárgya különösen olyan citokinek, amelyek az interleukin-2 (IL-2) hatását citotoxikus limfociták [pl. citokin citotoxikus limfocita érettségi faktor (CLMF)] aktiválása közben szinergizálják. Találmányunk továbbá CLML ellen irányuló monoklonális antitestekre vonatkozik.
A „citokinek” a fehérje sejt regulátorok egyik csoportjának megnevezésére szolgáló kifejezés, amelyeket ezenkívül limfokineknek, monokineknek, interleukinoknak és interferonoknak neveznek. E regulátorok a testben levő sejtek széles változataiban termelődnek. Ezek a citokinek sok fiziológiai reakcióban szerepet játszanak, sok betegség patofiziológiájában szerepelnek, és gyógyászaülag fontosak. Ezek a fehérjék heterogén csoportját képezik, és közös jellemzőik az alábbiak: molekulatömegük alacsony (<80 kDa), gyakran glikozilezett kiválasztott fehérjék; az immunitásban és a gyulladás folyamatában szerepet játszanak, éspedig a reagálás amplitúdóját és időtartamát szabályozzák; általában átmenetileg és lokálisan termelődnek, hatásukat parakrin vagy autokrin módon, nempedig endokrin úton fejtik ki. A citokinek rendkívül hatékonyak, általában pikomoláris koncentrációban hatnak; minden citokin vagy citokin csoportra specifikus, nagy affinitású sejtfelület receptorokkal kölcsönhatásba lépnek. Sejtfelülethez történő kötődésük végülis a celluláris RNS és fehérjeszintézis jellegének változásához vezet, és megváltozott sejtviselkedést idéz elő. Az egyes citokinek többszörös átlapoló sejtszabályozó hatásokat fejtenek ki.
Valamely sejtnek egy adott citokinre történő reagálása a citokin helyi koncentrációjától, az adott sejttípustól, és hatást kifejtő más sejtregulátoroktól fiigg. Ezen különböző sejtfelületreceptorokhoz kapcsolódó, szerkezetileg nemrokon fehérjék átlapoló szabályozó hatásai legalábbis részben felelősek közös fehérjék indukálásáért, amelyek DNS-ükben közös reagáló elemeket tartalmazhatnak. A citokinek kölcsönhatása a következőkben jelentkezik: előszöris egymást indukálják; másodszoris citokin sejtfelület receptorokat transzmodulálnak; harmadszor a sejtfunkciókkal additív vagy antagonista kölcsönhatásokba lépnek [Immunology Today 10; 299 (1989)].
A citokineknek neopláziák kezelésében és immunrendszer működését elősegítő szerként történő felhasználását a közelmúltban humán rekombináns interleukin-2-(rIL-2) felhasználásán alapuló vizsgálatokkal mutatták be. A természetes interleukin-2 (IL—2) a Tlimfociták által termelt és kiválasztott limfokin. Ez a glikoprotein molekula gyakorlatilag minden olyan immunválasz kiválasztásában bensőségesen résztvesz, amelyben T-sejtek szerepet játszanak. A B-sejtválaszt in vitro IL-2 jelenléte elősegíti. Az IL-2 differenciálódást elősegítő faktorként a B és T limfocita válaszok ellenőrzésében is részt vesz.
Humán rIL-2 adagolása bizonyos esetekben kifejlődött tumorok regresszióját eredményezte kísérleti állatokon [J. Exp. Med. 161; 1169-1188 (1985)] és emberen [N. Engl. J. Med. 313; 1485-1492 és N. Engl. J. Med. 316; 889-897 (1987)]. Feltételezéseink szerint az rIL-2 tumorellenes hatását in vivő rIL-2 által aktivált gazda citotoxikus effektor limfociták közvetítik [J. Immunoi. 139; 285-294 (1987)]. Ezenkívül, állatmodelleken nyert eredmények alapján feltételezhető, hogy a rIL-2 bizonyos fertőzéses betegségek kezelésében is hatásos [J. Immunoi. 135; 4160-4163 (1985) és J. Virol. 61; 2120-2127 (1987)] és kemoterápia által előidézett immunoszupresszió javításában is felhasználható [Immunoi. Lett. 10; 307-314 (1985)].
A rIL-2 klinikai felhasználását azonban különböző mellékhatások nehezítik [N. Engl. J. Med. 313; 14851492 (1985) és N. Engl. J. Med. 316; 889-897 (1987)]. A citokin-terápia hatékonysága megjavításának egyik megközelítése szerint két vagy több citokin kombinációs felhasználásával a toxicitást csökkentik. így pl. szinergetikus tumorellenes aktivitás nyerhető oly módon, hogy rIl-2-t tumoros egérnek rekombináns alfa-interferonnal (rlFN-alfa) [Cancer Rés. 48; 260-264 (1988) és Cancer Rés. 48; 5810-5817 (1988)] vagy rekombináns tumor nekrózis faktor alfa-val [Cancer Rés. 47; 39483953 (1987)] együtt adnak be. Minthogy az IL-2 tumorellenes hatását feltehetően gazda citotoxikus effektor limfociták közvetítik, igény mutatkozott olyan új citokinek azonosítása és izolálása iránt, amelyek rIL-2-vel citotoxikus limfociták in vitro aktiválása közben szinergetikus kölcsönhatásba lépnek. Ezek az új citokinek rIL-2-vel együtt in vivő beadva a várakozás szerint tumorellenes szerként alkalmazhatók.
Találmányunk tárgya ennek megfelelően CLMF kiválasztására képes sejtek által termelt és szintetizált, citotoxikus limfocita érettségi fehérje (CLMF) elnevezésű új citokin. E sejtek példáiként emlős sejteket, különösen humán limfoblasztoid sejteket említünk meg. Alacsony koncentrációjú IL-2 jelenlétében a CLMF a limfokin aktivált ölő (killer) sejtek (LAK) citolitikus aktivitását szinergetikusan indukálja. A CLMF továbbá T-sejtnövekedés stimulálására is képes.
Találmányunk tárgya továbbá eljárás CLMF lényegében tiszta formában történő izolálására, amely eljárás az alábbi lépéseket tartalmazza:
a) B limfoblasztoid sejteket (pl. NC-37 sejteket) stimulálunk oly módon, hogy ezek a sejtek citokineket termeljenek és egy felülúszó folyadékba válasszanak ki;
b) a stimulált sejtek által kiválasztott felülúszó folyadékot összegyűjtjük;
c) a felülúszó folyadékot fehérjefrakciókra választjuk szét;
d) minden egyes fehérjefrakciót CLMF jelenlétére vizsgálunk;
e) a T-sejtnövekedést stimuláló frakciókat megtartjuk; nevezetesen azokat a frakciókat, amelyek a fehérjefrakciók T-sejt stimuláló aktivitásáért felelős aktív fehérjét tartalmazzák;
f) az aktív fehérjét - nevezetesen a citolitikus limfocita érettségi faktort (CLMF) - lényegében tiszta formában izoláljuk.
Az ily módon kapott CLMF-fehéije más citokin fehérjéktől mentes. A természetes CLMF-fehérje 75 kilodaltonos (kDa) heterodimer, amely két polipeptid alegységből áll. Ezt a két -40 kDa és 35 kDa - alegységet egy
HU 211 879 A9 vagy több diszulfidkötés köti egymással össze. Találmányunk továbbá a CLMF gén nukleotid szekvenciájára, valamint a fenti gén által kódolt CLMF fehérje aminosavszekvenciájára vonatkozik. A fenti szekvencia információ alapján a természetes CLMF fehérjének CLMF aktivitással rendelkező származékai állíthatók elő. Találmányunk tárgya továbbá ennek megfelelően a citotoxikus limfocita érettségi faktort (CLMF) lényegében tiszta formában tartalmazó fehéije, vagy olyan fehérje, amely CLMF aktivitást fejt ki, és a CLMF aminosav szekvenciájának biológiailag aktív részét tartalmazza, vagy a CLMF aminosav szekvenciáját vagy a CLMF analóg szekvenciáját magábanfoglaló más aminosavakat vgy fehérjéket tartalmaz, vagy ezek CLMF aktivitást kifejtő biológiailag aktív ffagmense.
A fenti c)—f) lépések felhasználásával CLMF bármely olyan folyadékból vagy testnedvből tisztítható, és kinyerhető, amely a CLMF-t más fehérjékkel együtt tartalmazza.
Találmányunk tárgya továbbá
- CLMF aktivitást mutató és T-sejtnövekedés stimulálására képes fehéijefrakciók;
- a fenti eljárással kapott, lényegében tisztított aktív CLMF fehérje;
- a 40 kDa alegységet és/vagy 35 kDa alegységet kódoló izolált klónozott gének;
- a fenti géneket tartalmazó vektorok;
- a fenti géneket tartalmazó vektorok által transzformált gazdasejtek;
- a fenti transzformált gazdasejtekben termelt CLMF fehérjék és származékaik.
Találmányunk tárgya továbbá eljárás LAK-sejtek és T-sejtek stimulálására oly módon, hogy a fenti sejteket CLMF-el önmagában vagy IL-2-vel együtt kezeljük.
Találmányunk tárgya továbbá CLMF-hez történő kötődésre képes izolált poliklonális vagy monoklonális antitestek.
Részlegesen tisztított CLMF készítmény ellen irányuló monoklonális antitesteket az alábbi módszerekkel azonosítjuk, és jellemezzük:
= 125I-jelzett CLMF immunokicsapása;
= CLMF bioaktivitás immunogyengülése;
= CLMF Western biot;
= l25I-CLMF celluláris receptorához történő kötődésének gátlása;
= CLMF bioaktivitás közömbösítése.
Húsz, anti-CLMF-antitesteket kiválasztó hibridómát azonosítottunk. Azt találtuk, hogy az antitestek I25I-jelzett CLMF immunolecsapására, és a CLMF bioaktivitás immunogyengítésére képesek, a T-sejt burjánzás és LAK-sejt indukció meghatározása alapján. Western biot analízis szerint mindegyik antitest a 70 kDa heterodimerhez és az egyik alegységhez kötődik. A fentemlített húsz anti-CLMF monoklonális antitest mindegyike CLMF-el szemben specifikus, és a CLMF 40 kDa alegységével szemben különösen specifikus. Az egyes antitesteknek azt a tulajdonságát, hogy a CLMF-nek celluláris receptorához történő kötését gátolják, az általunk kifejlesztett CLMF-receptor kötődési teszt segítségével határozzuk meg. A meghatározás során mérjük a ,25I-jelzett CLMF kötődését PHA-aktivált PBL blaszt sejtekhez, az egyes antitestek jelenlétében és távollétében. A vizsgált húsz antitest közül tizenkettő 60%-nál erősebben gátolta a 125I-jelzett CLMF kötődését a blaszt sejtekhez. Két inhibitor antitest (7B2 és 4A1) a CLMF bioaktivitását közömbösíti, míg az egyik nem-inhibitor antitest (8E3) a CLMF bioaktivitást nem közömbösíti. A fenti adatok igazolják, hogy azok az antitestek, amelyek a 125I-jelzett CLMF-nek celluláris receptorához történő kötődését blokkolják, a T-sejt burjánzásos és LAK-sejt indukciós meghatározás szerint a CLMF bioaktivitást közömbösítik. A CLMF 40 kDa alegységére specifikus antitesteknek a CLMF bioaktivitását semlegesítő képessége azt jelzi, hogy a CLMF celluláris receptorhoz történő kötődéshez a 40 kDa alegységen determinánsokra van szükség.
A találmányunk szerinti monoklonális anti-CLMF antitestek értékes analitikai, diagnosztikai és gyógyászati szerek, amelyek természetes és rekombináns humán CLMF immunoaktivitásos tisztítására, humán CLMF immunotesztek kifejlesztésére, a CLMF 40 kDa alegysége aktív helyének azonosítására, továbbá a citotoxikus T-sejtek szelektív immunoszupresszióját igénylő betegek kezelésére (transzplantációknál) alkalmazhatók. A humán CLMF különböző epitópjait felismerő monoklonális antitestek érzékeny két-helyű immunotesztekben reagensként alkalmazhatók biológiai folyadékokban, sejttenyészet felülúszókban és humán sejtextraktumokban, CLMF szint mérésére.
Találmányunk tárgya továbbá CLMF ellen irányított monoklonális antitestek, amelyek - nem korlátozó jelleggel - az alábbi hatásokat fejtik ki:
1. Monoklonális antitestek felhasználása affinitás reagensként, természetes és rekombináns humán CLMF tisztítására.
2. Monoklonális antitestek felhasználása reagensként enzim-immunotesztek és radioimmunológiai tesztekhez, természetes és rekombináns CLMF mérésére biológiai folyadékokban, sejttenyészet felülúszókban, sejtextraktumokban és humán sejtek plazmamembránjain, valamint gyógyszerscreenelési tesztekben reagensként.
3. Monoklonális antitestek felhasználása reagensként érzékeny kéthelyű immunoteszt kialakításához, CLMF mérésére biológiai folyadékokban, sejttenyészet felülúszókban és humán sejtextraktumokban.
4. Monoklonális antitestek felhasználása reagensként a 40 kDa alegység determinánsainak azonosítására, amely a 35 kDa alegységhez történő kötődéskor kicsapódik, és a CLMF celluláris receptorhoz történő kötődéskor kicsapódik.
5. Intakt IgG molekulák, Fab fragmensek vagy inhibitor monoklonális antitestek humanizált IgG molekuláinak felhasználása gyógyszerként citotoxikus Tsejtek bujánzásának és aktiválódásának szelektív blokkolására (pl. transzplantációkban).
Az ábrák rövid ismertetése
Az 1. ábrán Nu-Gel P-SP oszlopra felvitt tenyészetett NC-37 limfoblasztoid sejtekből kapott felülúszó
HU 211 879 A9 oldat görbéjét ábrázoljuk, amelyen sógradiens szerint eluált, TGF-aktivitást tartalmazó fehérjefrakciót mutatunk be.
A 2. ábrán az 1. ábrán feltüntetett elválasztásból kapott, TGF-aktivitást tartalmazó anyag görbéjét mutatjuk be, Blue-B-agaróz oszlopon keresztül só-gradiens szerint történő eluálás mellett.
A 3. ábrán a 2. ábrán feltüntetett elválasztásból kapott, TGF-aktivitást tartalmazó anyag görbéjét mutatjuk be, Mono Q oszlopon keresztül nátrium-klorid gradienssel történő eluálás mellett.
A 4. ábrán a 3. ábrán feltüntetett lépésből kapott 30-45., 48. és 50. frakció SDS-poliakrilamid-gél elektroforézis (SDS-PAGE) analízisét tüntetjük fel. A baloldalon levő számok (44 és 68) a 44 és 68 kDa standard fehérje látszólagos molekulatömegére hivatkoznak, az
S-pályán.
Az 5. ábrán a 3. ábrán feltüntetett Mono Q kromatográfiás elválasztából (fordított fázisú HPLC) nyert
38. frakció eluálási profilját mutatjuk be, Vydac-difenil oszlopon.
A 6. ábrán az 5. ábrán feltüntetett elválasztási eljárásból kinyert 85-90. fehérjefrakció fehérjetisztaságának SDS-PAGE analízisét mutatjuk be.
A 7. ábrán a nem-redukáló (A-pálya, beta-merkapto-etanol nélkül) és redukáló (B-pálya; beta-merkaptoetanol jelenlétében) körülmények között végzett fordított fázisú HPLC elválasztás során nyert 87. és 88. frakció SDS-PAGE analízisét mutatjuk be.
Látható, hogy a 75 000 molekulatömegű CLMF két alegységre (40 kDa és 35 kDa) válik szét. Az ábrán feltüntetett gélben levő maradék pályák a 44 és 68 kDa markerfehérjét magukbanfoglaló standard fehérjéket tartalmazzák.
A 8. ábrán a Nu-Gel P-SP oszlopra felvitt és sógradiens szerint eluált NC-37 sejtekből nyert felülúszó oldat fehérjéinek eluálási profilját tüntetjük fel.
A 9. ábrán a 8. ábrán feltüntetett Nu-Gel P-SP oszlop-eluálásból nyert aktív frakciók Blue-agarose oszlop só-gradiens szerinti eluálási profilját mutatjuk be.
A 10. ábrán a 9. ábrán feltüntetett eluálásból nyert aktív frakciók Mono-Q-oszlop só-gradiens eluálási profilját mutatjuk be.
All. ábrán a 10. ábrán feltüntetett Mono Q kromatografálásból nyert 39. és 40. aktív frakció eluálási profilját mutatjuk be, Vydac difenil-oszlopon.
A 12. ábrán a 11. ábrán feltüntetett elválasztási eljárásból nyert aktív frakciók redukáló körülmények között végzett SDS-PAGE analízisét mutatjuk be.
A 13. ábrán feltüntetett sematikus diagrammon a 40 kDa alegységnek a CLMF citokin 35 kDa alegységétől történő elválasztását mutatjuk be.
A 14. diagrammon a CLMF citokin 40 kDa alegysége aminosavösszetételének meghatározását, N-terminális szekvenciálását, proteolitikus emésztését és teljes szekvenciálását tüntetjük fel.
A 15. ábrán a CLMF citokin emésztett 40 kDa alegysége triptikus peptidjeinek elválasztását mutatjuk be.
A 16. ábrán Staphylococcus auereus V8 proteáz által emésztett CLMF 40 kDa alegység proteolitikus peptidjeinek elválasztását mutatjuk be.
A 17. ábrán a CLMF 40 kDa alegysége proteolitikus peptidjeinek analízise során nyert információkat foglaljuk össze, a fehéije szerkezetére vonatkozóan. Az alkalmazott rövidítések és szimbólumok jelentése a következő:
N-t-N-terminális szekvenciálás az érintetlen fehérjén; Tr-HP2383 térképből származó triptikus peptidek, frakciószámmal megszámozva;
V8-HP2412 térképről származó V8 proteáz peptidek, a frakciószámmal megszámozva;
- a valószínű glikozilezési helyeket jelzi; a bekeretezett helyek potenciális helyeket jelölnek.
A 18. ábrán a 3. ábrán feltüntetett Mono Q FPLC eluálási profilból nyert 39. frakció SDS-PAGE analízisét mutatjuk be.
A-pálya = standard fehéijék, beta-merkapto-etanol nélkül;
B-pálya = 39. frakció, beta-merkapto-etanol nélkül;
C-pálya = 39. frakció, beta-merkapto-etanol jelenlétében;
D-pálya = standard fehérjék, beta-merkapto-etanol jelenlétében.
A 19. ábra a 35 kDa alegység fordítottfázisú HPLC tisztítására vonatkozik, és az 5% beta-merkapto-etanolban redukált Mono Q kromatográfia 39. frakciójának Vydac C-18 oszlopon történő eluálását ábrázoljuk.
A 20. ábrán a 19. ábrán feltüntetett Vydac C-18 oszlop eluálásból nyert fluoreszcamin pozitív frakciók nemredukáló körülmények között végzett SDS-PAGE gél-analízisét mutatjuk be:
S = fehérjestandard; F = átfolyás; a számok a frakciószámra vonatkoznak.
A 21. ábrán a Mono Q kromatográfia 36. és 37. frakciója triptikus emésztésének eluálási profilját mutatjuk be, YMC ODS oszlopon.
A 22. ábrán színezett PVDF membránt mutatunk be, az elmosódott sávokkal, amelyek a CNBr által hasított CLMF-t tartalmazzák, a kb. 29, 25, 14, 12 és 9 kDa tartományok kivágása előtt (22B ábra) és után (22A ábra). A tartományok az alábbi szekvenciáknak megfelelő CNBr fragmenseket tartalmazzák.
I (P?)-P-K-N-L-Q-L-K-P-L-K-N-?V-(Q?)(új szekvencia a 40 kDa fehérjétől)
II ?-Q-K-A-(R?)-Q-T-L-E-F-Y-P-?-T(a 35 kDa fehérje 30. sz. maradékánál kezdődő új szekvencia)
III V-V-L-T-7-D-T-P-E-E-D-G-I-T(a 40 kDa fehérje 24. sz. maradékánál kezdődik)
IV V-D-A-V-(H?)-K-L-K-Y-E-?-Y-T-?-?-F-F-I(a 40 kDa fehérje 190 sz. maradékánál kezdődik)
Megjegyzés: feltételezett vagy ismert, hogy a fenti szekvenciákat egy Met maradék előzi meg.
A 23. ábrán a CLMF-nek CNBr-el történő hasítása után kapott peptidfragmensek fordítottfázisú HPLC szétválasztását mutatjuk be.
A 24. ábrán tiszta CLMF és agarózgyantához kovalensen kapcsolódó monoklonális 7B2 antitest felhasz4
HU 211 879 A9 nálásával végzett affinitáskromatográfiával tisztított CLMF „szabad” nemasszociált 40 kDa alegysége SDS-PAGE-ét mutatjuk be.
A-pálya = molekulatömeg marker fehérjék;
B-pálya = kiindulási anyag;
C-pálya = átfolyás;
D-pálya = savas eluátum;
E-pálya = kálium-tiocianátos eluátum.
A 25 a„ b„ c. és d. ábrán a humán CLMF 40 kDa alegysége DNS szekvenciáját és következtetett aminosavszekvenciáját mutatjuk be.
A 26 a„ b. és c. ábrán a CLMF 35 kDa alegysége cDNS szekvenciáját és következtetett aminosav szekvenciáját mutatjuk be.
A 27. ábrán a CLMF bioaktivitás gátlását mutatjuk be, CLMF-vel immunizált patkányok széruma és nemimmunizált patkányok széruma (kontroll) által.
A 28. ábrán az 125I-CLMF-nek monoklonális 4A1 antitestek (1. pálya), 4D1 (2. pálya), 8E3 (3. pálya) és 9C8 monoklonális antitestek (4. pálya), kontroll antitestek (5. pálya), immun patkányszérum (6. és 8. pálya) és normál patkányszérum (7. és 9. pálya) által történő immunolecsapásainak SDS-PAGE analízisét mutatjuk be. Baloldalon a molekulatömeget adjuk meg, kDaban.
A 29. ábrán CLMF bioaktivitás (TGF aktivitás) monoklonális anti-CLMF antitestek (a-CLMF) által történő immunogyengítését mutatjuk be.
A 30. ábrán a CLMF bioaktivitás (LAK indukciós aktivitás) monoklonális anti-CLMF antitestek (aCLMF) által történő immunogyengítését mutatjuk be.
A 31. ábrán a 7B2, 4A1, BE3, 6A3, 9F5 és 2A3 monoklonális antitesteknek (mAbs) és patkány poliklonális anti-CLMF antitesteknek (RS1) CLMF 75 kDa heterodimerrel mutatott reakciókészségének Western biot analízisét mutatjuk be. NRS = normál patkányszérum.
A 32. ábrán monoklonális és patkány poliklonális anti-CLMF antitesteknek CLMF 40 kDa alegységgel mutatott reakcióképességének Western biot analízisét tüntetjük fel. Az 1-18. pályán az alábbi mAb-et alkalmazzuk: 4A1, 4D1, 7B2, 7A1, 2A3, 1C1, 8E4, 8A2, 8E3,1B8, 4A6, 6A2, 8C4, 9F5, 6A3,9C8, 8A1, illetve 22E7. A 19. pályán kontroll antitestet, a 20. pályán fúziós patkány szérumot és a 21. pályán normál patkányszérumot alkalmazunk.
A 33. ábrán 125I-CLMF-nek PHA-aktivált perifériás vér limfocita (PBL) limfoblasztokhoz történő kötődését mutatjuk be.
A 34. ábrán 125I-CLMF PHA-aktivált PBL blast sejtekhez történő kötődésének patkány anti-CLMFszérum által történő gátlását mutatjuk be. Az eredményeket a megjelölt szérumkoncentráció jelenlétében kapott l25I-CLMF sejtkötődés mennyiségében (%-os kötődés) fejezzük ki, a szérum nélkül mért teljes specifikus kötődéssel összehasonlítva.
A 35. ábrán 125I-CLMF PHA-aktivált PBL blastsejtekhez történő kötődésének monoklonális antitest felülúszók állal történő gátlását mutatjuk be. Az eredményeket a felülúszó 1:1 arányú hígításának jelenlétében mért 125I-CLMF sejtkötődés %-os gátlásában fejezzük ki, az antitest felülúszó nélkül mért teljes specifikus kötődéssel összehasonlítva.
A 36. ábrán a 125I-CLMF PHA-aktivált PBL-blast sejtekhez történő kötődésének különböző koncentrációjú tisztított monoklonális antitestek által történő gátlását mutatjuk be. Az eredményeket a megadott koncentrációjú antitest jelenlétében mért 125ICLMF sejtkötődés mennyiségében (5 cpm megkötött) fejezzük ki, az antitest nélkül mért teljes specifikus kötődéssel összehasonlítva.
A 37. ábrán nyúl poliklonális anti-CLMF antitestnek 75 kDa CLMF-el (nem redukált) és 35 kDa CLMF alegységgel (redukált) mutatott reakciókészségének Western biot analízisét mutatjuk be. Az antitestet a 35 kDa CLMF alegység szintetikus peptidfragmense ellen készítjük el. Az 1-5. pálya beta-merkapto-etanol nélkül, míg a 6-10. pálya beta-merkapto-etanol jelenlétében került felvételre.
Pályák:
1 μΐ CLMF
3 μΐ CLMF
Ó^CLMF
Vak
Vak
5 μΐ előszínezett molekulatömeg standard
1 μΐ CLMF
3 μΐ CLMF
6 μΐ CLMF
10 μΙ előszínezett molekula standard
A leírásban megemlített valamennyi publikáció (supra és infra) referenciaként a jelen szabadalmi leírás részét képezi.
A találmányunk szerinti CLMF aktív fehérjék homogén természetes CLMF fehérjéket és a természetes CLMF biológiailag aktív fragmensét tartalmazó CLMF aktív fehérjéket egyaránt magukban foglalnak. Találmányunk továbbá rekombináns CLMF fehérjékre és fúziós fehérjékre is kiterjed, azaz olyan CLMF fehérjeszármazékokra, amelyek a természetes CLMF aminosav szekvenciáját vagy részleges szekvenciáját tartalmazzák, más fehérjékből leszármaztatott aminosavszekvenciákkal együtt. A találmányunk szerinti fehérjék CLMF biológiai aktivitással rendelkeznek; ezt standard módszerekkel (pl. T-sejtnövekedés faktor teszt) a példákban leírt módon határozzuk meg.
A találmányunk szerinti CLMF fehérjék körébe tartoznak az olyan, a természetben elő nem forduló CLMF analóg fehérjék, amelyek a CLMF vagy aktív fragmense aminosav szekvenciájával analógok. Az ilyen CLMF analóg fehérjék olyan fehéijék, amelyekben a természetes CLMF vagy fragmense egy vagy több aminosavát a CLMF aktivitás elvesztése nélkül helyettesítéssel vagy törléssel megváltoztatták. Az ilyen analógok a peptidkémia ismert módszereivel vagy ismert rekombináns DNS technológia módszerekkel (pl. helyreirányított mutagenézis) állíthatók elő. A találmányunk szerinti valamennyi fehérje, valamint a
HU 211 879 A9 fragmensek és analógok CLMF biológiai aktivitása standard T-sejtnövekedő faktor tesztekkel határozható meg.
Találmányunk értelmében a természetes CLMF-et tiszta formában nyeljük. A CLMF fehérje 35 kDa alegység és 40 kDa alegység aminosav szekvenciáját a
25. és 26. ábrán tüntetjük fel. A fenti szekvenciák alapján a CLMF fehérje biológiailag aktív analógjai és fragmensei állíthatók elő. Ezek a biológiailag aktív fehérjék rekombináns DNS technológia standard módszereivel biológiailag készíthetők, vagy aminosavszintetizátorban vagy kézi szintézissel jólismert folyékony vagy szilárdfázisú peptid szintézis módszerekkel kémiailag állíthatók elő. Hasonlóképpen, a CLMF aminosavszekvenciáját és más aminosavakat tartalmazó analógok, fragmensek és fehéijék is előállíthatók. Valamennyi fenti fehérje CLMF aktivitásra tesztelhető.
Találmányunk tárgya tehát ennek megfelelően citotoxikus limfocita érettségi faktor (CLMF) aktivitással rendelkező fehérje lényegében tiszta formában (pl. CLMF fehérje önmagában), vagy a fenti fehérje olyan származéka, amely CLMF aktivitást fejt ki, és a CLMF természetes formája aminosav szekvenciáját legalább részben tartalmazza.
Találmányunk tárgya továbbá
- CLMF-t kódoló klónozott gének;
- a fenti fehérjét kódoló izolált polinukleotidek, amelyek a CLMF-t kódoló cDNS-nek megfelelő szekvenciát tartalmazzák;
- CLMF fehérjét kódoló polinukleotidet tartalmazó rekombináns vektorok;
- a fenti rekombináns vektorokkal transzformált mikroorganizmusok;
- a fenti fehérjék ellen irányított antitestek;
- eljárás a fenti fehérjék, vektorok és antitestek előállítására.
Találmányunk tárgya továbbá eljárás LAK-sejtek, T-sejtek vagy természetes ölő (killer) sejtek stimulálására, a fenti CLMF-fehérjék felhasználásával.
A leírásban használt „CLMF-t kódoló cDNS-nek megfelelő szekvenciát tartalmazó polinukleotid” kifejezés azt jelenti, hogy a polinukleotid a CLMF-t kódoló cDNS szekvenciájával homológ vagy komplementer szekvenciát tartalmaz. A cDNS-hez viszonyíott homológja vagy komplementeritás kb. 50% vagy ennél nagyobb érték, előnyösen legalább 70%, különösen előnyösen legalább 90%. A CLMF szekvenciák és a cDNS közötti megfelelőség az irodalomból ismert módszerekkel határozható meg, így pl. az alábbi eljárásokkal: a szekvenciáit anyag közvetlen összehasonlítása a leírt cDNS-ekkel; hibridizációs kísérletek szekvenciák feltételezett homológiájának megfelelő körülmények felhasználásával, majd emésztés egyszálú nukleázokkal és az emésztett fragmensek nagyságának meghatározása.
A jelen találmány gyakorlatában a molekuláris biológia, mikrobiológia, rekombináns DNS és immunológia a szakember által jólismert szokásos módszereit alkalmazzuk, feltéve, hogy mást nem közlünk. Ezeket a módszereket az irodalom részletesen ismerteti, lásd pl. az alábbi irodalmi helyek: Maniatis, Fitsch & Sambrook, MOLECULAR CLONNING; a laboratory manual (1982); DNA CLONING, VOLUMES I AND II (D. N. Glover ed., 1985); OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS (M. J. Gait ed., 1984); NUCLEIC ACID HYBRBDIZATION (B. D. Hames & S. J. Higgins eds., 1984);TRANSCRIPTION AND TRANSLATION (B. D. Harnes & S. J. Higgins eds., 1984); ANIMALCELL CULTURE (R. I. Freshney ed., 1986); IMMOBILIZED CELLS AND ENZYMES (IRL Press, 1986); B. Perbal, A PRACTICAL GUIDE TO MOLECULAR CLONING (1984); the series, METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.); GENE TRANSFER VECTORS FÓR MAMMALIAN CELLS (J. H. Miller és Μ. P. Caos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory), Methods in Enzymology Vol. 154 és Vol. 155 (Wu és Grossman, és Wu, eds., respectively); IMMUNOCHEMICAL METHODS IN CELL AND MOLECULAR BIOLOGY (Mayer és Walker, eds., 1987, Academic Press, London), Scopes, PROTEIN PURIFCATION: PRINCIPLES AND PRACTICE, second Edition (1987, Springer-Verlag, N. Y.), és HANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY, VOLUMES I-IV (D. M. Weir és C. C. Blackwell eds., 1986).
A találmányunk szerinti DNS-szekvenciák és DNSmolekulák a gazda/vektor kombinációk széles változataival fejezhetők ki. így pl. hasznos vektorok kromoszómás, nem-kromoszómás és szintetikus DNS-szekvenciák szegmenseiből állhatnak. Az ilyen vektorok pl. virális vektorok, mint pl. az SV40 különböző ismert származékai; bakteriális vektorok, pl. E-coli-ből származó plazmidok, mint pl. pCRI, pBR322, pMB9 és RP4; fág DNS-ek, mint pl. a φ fág különböző származékai, M13 és más szálas szerkezetű egyszálú DNS fágok; élesztőkben felhasználható vektorok, pl. 2 μ plazmid; eukarióta sejtekben, különösen állati sejtekben felhasználható vektorok, pl. SV40 adenovírusból és/vagy retrovírusból leszármaztatott DNS szekvenciák lehetnek. További hasznos vektorok a plazmidok és fág DNS-ek kombinációiból származtathatók le, mint pl. fág DNS-t vagy származékait tartalmazó módosított plazmidok.
A rekombináns CLMF fehérjék előállítására felhasznált kifejező vektorokat az jellemzi, hogy legalább egy kifejező kontroll szekvenciát tartalmaznak, amely a klónozott CLMF DNS szekvencia ellenőrzése és szabályozása céljából a vektorba beillesztett CLMF DNShez működőképesen kapcsolódik. A fenti hasznos kifejező kontroll szekvenciáik példáiként az alábbiakat soroljuk fel: lac rendszer, trp rendszer, tac rendszer, trc rendszer, fág λ fő operátor és promotor tartomány, fd bevonó fehérje kontroll tartománya, élesztő glikolitikus promotorjai (pl. 3-fosz-foglicerát kináz promotor) és az élesztő savas foszfatáz promotorai (pl. Pho 5), élesztő alfa faktorok promotorai, valamint poliomavírusból, adenovírusból, retro-vírusból és majomvírusból leszármaztatható promotorok (pl. korai és késői promotorok vagy SV40) és prokarióta vagy eukarióta sejtek és vírusaik génjei kifejezésének szabályozására ismert más szekvenciák, továbbá a fenti promotor/operátor szekvenciák kombinációi.
HU 211 879 A9
A hasznos kifejező vektorok közé tartoznak olyan ismert vektorok, amelyek klónozott CLMF-rokon DNS szekvenciák kifejezését eukarióta sejtekben (pl. állati és emberi sejtek) lehetővé teszik [pl. P. J.Southem és P. Berg, J. Mól. Appl. Génét. 1; 327—41 (1982); S. Subramani és tsai; Mól. Cell. Bioi. 1; 854-64 (1981); R. J. Kaufmann és P. A. sharp, Mól. Cell. Bioi. 159; 601-64 (1982); S. I. Scahill és tsai: „Expression and Characterization of The Product Of A Humán Immuné Interferon DNA Gene in Chinese Hamster Ovary Cells”, Proc. Natl. Acad. Sci. I.S.A. 80: 4654-59 (1983); G. Urlaub és L. A. Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77; 4216-20(1989)].
Mindegyik specifikus kifejező vektoron belül különböző helyek választhatók ki a találmányunk szerinti CLNF-rokon DNS szekvenciák beillesztésére. Ezeket a helyeket általában a restrikciós endonukleázok hasítás útján jelölik meg. Ezeket a helyeket a szakember könnyen felismeri. Megjegyezzük azonban, hogy a találmányunk szerinti kifejező vektorok természetesen nem tartalmaznak szükségszerűen restrikciós endonukleáz helyet, a kiválasztott DNS-fragmens beillesztésére. A vektor a fragmenshez más módszerekkel is kapcsolható. A kifejező vektorban a kiválasztott DNS fragmens beillesztésére kiválasztott helyet és a DNS-fragmensnek a kifejező kontroll szekvenciához kapcsolódó működőképes kötődését több tényező határozza meg, pl. a meghatározott restrikciós enzimmel szemben érzékeny helyek száma, a vektor szekvenciának megfelelő start és stop-kodonok elhelyezkedése, és a rekombináns vektorral transzformált gazdaszervezet kiválasztásának módszere. A vektort és a DNS-szekvencia beillesztési helyét a fenti tényezők összehangolt mérlegelésével választjuk ki; megjegyezzük, hogy nem minden kiválasztás egyformán hatékony minden megadott esetben.
A CLMF-rokon DNS szekvencia kifejezésére szolgáló gazdasejtet nagyszámú ismert gazdaszervezetből választhatjuk ki. Gazdaszervezetként prokarióta vagy eukarióta sejtek alkalmazhatók. Sok megfelelő gazdaszervezet különböző letétbehelyező intézményekből szerezhető be, pl. American Type Culture Collection (ATCC) vagy a Deutsche Sammling für Mikroorganismen (DSM). A prokarióta sejtszervezetek közül a baktériumtörzseket (pl. E. coli, B. subtilis stb.) említjük meg. Gazdaszervezetként előnyösen emlőssejtek alkalmazhatók pl. SV40 transzformált afrikai zöldmajom vesesejtvonal COS.
Az adott DNS szekvencia kifejezésére nem minden gazda/kifejező vektor kombináció alkalmazható azonos hatékonysággal. A szakember azonban a megfelelő gazda/kifejező vektor kombinációt a jelen szabadalmi leírásban közölt elvek figyelembevételével, találmányunk oltalmi körétől való eltérés nélkül minden további nélkül ki tudja választani. így pl. a kiválasztás számos tényező figyelembevételén alapul. Ezek a tényezők pl. a gazda és vektor kompatibilitása, a fehérjének a gazdasejt enzimek proteolitikus lebontásával szemben mutatott érzékenysége, a gazdasejt által kifejezendő fehérje nehezen eltávolítható lehetséges szennyezései, a DNS szekvencia által kódolt fehérjének a gazdaszervezettel szemben kifejtett toxicitása, a kívánt fehérje kinyerésének egyszerűsége, a DNS szekvencia és a működőképesen hozzácsatlakozó kontroll szekvencia kifejező jellemzői, biológiai biztonság, költségek, hajtogatás, a kívánt fehérje kifejezés után szükséges egyéb módosításai.
A CLMF DNS-t tartalmazó kifejező vektort magábanfoglaló gazdaszervezetet általában a gazdaszervezet növekedése szempontjából optimális körülmények között tenyésztjük. Az exponenciális növekedés vége felé, amikor az időegység alatt sejtszámnövekedés csökken, a CLMF fehérje kifejezését indukáljuk, azaz a fehérjét kódoló DNS-t átírjuk, és az átírt mRNS-t lefordítjuk. Az indukciót oly módon végezhetjük el, hogy a táptalajhoz valamely inducert vagy derepreszszort adunk, vagy valamely fizikai paramétert megváltoztatunk, pl. a hőmérsékletet megváltoztatjuk.
A gazdaszervezetben termelt CLMF fehérjét a sejt speciális transzport mechanizmus segítségével kiürítheti vagy a fehérje a sejt feltörésével izolálható. A sejt mechanikai eszközökkel [Charm és tsai: Meth. Enzmol. 22; 476-556 (1971)], enzimes kezeléssel (pl. lizozimes kezelés) vagy kémiai úton (pl. detergens kezelés, karbamid vagy guanidin-hidrokloridos kezelés stb.) vagy a fenti módszerek kombinációjával törhető el.
Eukariótákban, a sejtekből kiválasztott polipeptidek prekurzor molekula formájában szintetizálódnak. Az érett polipeptid az ún. szignál peptid hasításával keletkezik. Minthogy prokarióta gazdaszervezetek az eukarióta szignál peptideknek a prekurzor molekulából történő hasítására nem képesek, az eukarióta polipeptideket prokarióta gazdaszervezetekben közvetlenül érett formájukban kell kifejezni. A transzlációs start szignál AUG - amely a DNS szintjén a kodon ATGnek felel meg azt eredményezi, hogy prokarióta gazdaszervezetekben kizárólag az N-terminuson metionin-maradékot tartalmazó polipeptidek képződnek. Bizonyos esetekben - a felhasznált kifejező rendszertől és valószínűleg a kifejezendő polipeptidtől függően ez az N-terminális metionin maradék lehasad.
A találmányunk szerinti DNS-szekvenciák által transzformált prokarióta és eukarióta sejtek fermentációja során termelt CLFM ismert módszerekkel lényegében homogenitás eléréséig tisztítható. így pl. az alábbi módszerek alkalmazhatók: centrifugálás különböző sebességek mellett, ammóniumszulfátos kicsapás, dialízis (normál nyomáson vagy vákuumban), preparatív izoelektromos fókuszálás, preparatív gél elektroforézis vagy különböző kromatográfiás módszerek, mint pl. gélszűrés, magas teljesítőképességű folyadékkromatográfía (HPLC), ioncserélő kromatográfia, fordítottfázisú kromatográfia és affinitás kromatográfia (pl. SepharoseR Blue CL-6B-on vagy hordozóhoz kötött CLMF ellen irányított monoklonális antitesteken).
A találmányunk szerinti tisztított fehérjét LAK-sejt és T-sejt aktivátorok és tumorellenes készítmények előállítására, és a LAK-sejtek, T-sejtek és természetes killer sejtek stimulálására szolgáló módszerekben alkalmazhatjuk.
HU 211 879 A9
A találmányunk szerinti CLMF továbbá a CLMF aktivitás szempontjából aktív helyek meghatározása céljából analizálhatók. Az analízisből nyert információ CLMF aktivitással rendelkező fragmensek vagy peptidek (beleértve a szintetikus peptideket) szerkezetének megállapítására és termelésére használhatók. Az aktív helyek meghatározására szolgáló ismert módszerek közül az alábbiakat soroljuk fel: röntgenkrisztallográfia, NMR, cirkuláris dikroizmus, UV-spektroszkópia és helyspecifikus mutagenézis. A fenti módon nyert fragmensek T-sejtek vagy LAK-sejtek stimulálására szolgáló eljárásoknál nyerhetnek felhasználást.
A találmányunk szerint előállított CLMF-fehérjéket vagy származékaikat vagy a fenti anyagokat tartalmazó gyógyászati készítményeket melegvérű állatoknak a fentemlített klinikai felhasználások során adhatjuk be. A szokásos adagolási módokat alkalmazhatjuk tumorellenes szereknek a szervezetbe történő bejuttatására, pl. intralezionális vagy parenterális adagolás, éspedig intravénás, szubkutáns vagy intramuszkuláris úton. A kívánt dózis nyilvánvalóan a kezelendő állapottól, a betegség súlyosságától, a kezelés időtartamától és az adagolás módjától függ. Előnyösen járhatunk el oly módon, hogy a sterilen szűrt liofilizált feérjét felhasználás előtt szokásos módon kiegészítjük, és végső kikészítési formára hozzuk. A szakember a találmányunk szerinti gyógyászati készítményeket oly módon állíthatja elő, hogy a találmányunk szerinti CLMF fehérjét kompatibilis gyógyászati hordozóanyagokkal (pl. pufferek, stabilizálószerek, bakteriosztatikumok) és gyógyászati parenterális adagolási formákban szokásos más adalékanyagokkal összekeverjük. Találmányunk a fenti gyógyászati készítményekre is kiterjed.
Az előnyös adagolási forma az adagolási módtól és a gyógyászati alkalmazástól függ. A találmányunk szerinti, valamely CLMF fehérjét vagy peptidszármazékot tartalmazó gyógyászati készítmények továbbá előnyösen szokásos gyógyászatilag alkalmas hordozóanyagokat és adott esetben további gyógyászati hatóanyagokat (pl. interleukin-2), hordozóanyagokat, adjuvánsokat, excipienseket (pl. humán szérumalbumint vagy plazmakészítményeket) tartalmazhatnak. A találmányunk szerinti készítmények általában dózis-egység formájában kerülnek előállításra és naponta egyszer vagy többször adagolandók. A dózisegységet előnyösen hatékony mennyiségű CLMF fehérjét vagy származékát, és kívánt esetben interleukin-2-t tartalmazó, 1 ml-es ampullákba töltjük. Az ampullák CLMF fehérjét vagy származékát, és kívánt esetben interleukin-2-t tartalmaznak, a gyógyászati készítmény helyes alkalmazását ismertető használati utasítással együtt Találmányunk tárgya továbbá valamely fenti dózisegység, amelyet előnyösen külön interleukin-2 dózisegységgel, és előnyösen megfelelő használati utasítással együtt tartányba csomagoltunk. Találmányunk továbbá a fenti dózisegységek előállítására vonatkozik.
Jelen találmányunk további részleteit az alábbi példákban ismertetjük. Hangsúlyozzuk, hogy a példák csupán a találmány részleteinek bemutatását szolgálják, nem korlátozó jellegűek és semmiképpen sem jelentik az oltalmi körnek a példákra történő korlátozását. Megjegyezzük, hogy a példákban megadott terméknevek és gyártók nem kötelezőek. A szakember más gyártóktól származó alternatív termékeket is felhasználhat.
Példa
Citotoxikus limfocita érettségi faktor (CLMF) tisztítása és jellemzése CLMF-tartalmú felülúszó folyadék termelése
A CLMF termeléséhez humán NC37 b limfoblasztoid sejteket (ATCC CCL 214, American Type Culture Collection, Rockville, MD) alkalmazunk. A sejteket 5% hővel inaktivált (56 ’C, 30 perc) magzati borjúszérummal, 2 mM L-glutaminnal, 100 egység/ml penicillinnel és 100 pg/ml szreptomicinnel kiegészített RPMI 1640 táptalajban tartjuk (valamennyi sejttenyészet táptalajt a GIBCO Laboratories cégtől Grand Island, NY szereztük be).
Az NC-37 törzsek magasabb termelő alvonalait folyékony mikrotenyészetekben végzett határhígításos klónozással nyerjük. Három Costar 3596 mikrolemez (Costar Co., Cambridge, MA) minden mélyedésébe 100 pl, milliliterenként 5 NC-37 sejtet tartalmazó sejtszuszpenziót mérünk be. A klónozáshoz közegként friss táptalaj és az alap NC-37 sejtek szűrt kondicionált táptalajának 1:1 arányú elegyét alkalmazzuk. A tenyésztés megkezdése után 1 héttel és 2 héttel minden mikrotenyészetet a friss és kondicionált táptalaj 1:1 arányú elegyének 50 pl-ével kiegészítjük. A tenyésztés elindítása utáni 3. és 4. hét között az NC-37 sejtek kiónjait tartalmazó mélyedések tartalmát összegyűjtjük, és nagyobb tenyészetekbe visszük át.
Mihelyt egy adott alvonalban a sejtszám a 1,4x1ο6 értéket meghaladja, 1 millió sejtet stimulálunk CLMF termelés céljából 3 ng/ml phorbol-12-mirisztát-13 acetátot (PMA), (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) és 100 ng/ml kalcium-ionofor A23187-t (Sigma) tartalmazó 1 ml-es tenyészetekben. A tenyészetekből a felülúszót két nap múlva összegyűjtjük, kb. 50 térfogat Dulbecco-féle foszfát-puffer konyhasó-oldattal (GIBCO) szemben, pl. SPECTROPORr (Fischer Scientific) felhasználásával egy éjjelen át egy puffercserével dializáljuk, majd 50 térfogat RPMI 1640 táptalajjal szemben (50 pg/ml gentamicint tartalmaz; mindkettő GIBCO) 4 órán át dializáljuk, és a CLMF aktivitást az alábbiakban ismertetésre kerülő T-sejtnövekedés faktor teszt segítségével meghatározzuk. Három alvonalat NC-37,89, NC-37,98 és NC-37,102 azonosítunk; ezek rutinszerűen j4-szeres mennyiségű CLMF-t termelnek, mint a parentális NC-37 sejtvonal. Minthogy a fenti három alvonal hasonló titerrel (J800 egység/ml) termel CLMF-t, a három alegységből származó tenyészet felülúszót összegyűjtjük, és így használjuk fel kiindulási anyagként CLMF tisztításhoz.
A CLMF fő termelését forgó berendezésben, percenkénti kb. 30 fordulat mellett végezzük el (Wheaton Cell Production Roller Apparátus Model II, Wheaton Instruments, Millville, NJ). 1-1.5X106 NC-37,89, NC37,98 vagy NC-37,102 sejtet/ml tartalmazó sejtszusz8
HU 211 879 A9 penziókat készítünk 1% Nutridóma SP-el (Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN) 2 mM Lglutaminnal, 100 egység/ml penicillinnel, 100 pg/ml sztreptomicinnel, 10 mg/ml PMA-al és 20-25 ng/ml kalcium-inonofor A23187-el kiegészített RPMI 1640 táptalajban. A sejtszuszpenziók 250-350 ml-es aliquot részeit forgatott üvegekben (Becton Dickinson, Lincoln Park, NJ) 5% széndioxid és 95% levegő elegyével kezelt Falcon 3027 sejttenyészethez adunk. A forgatott üvegeket szorosan lezárjuk, és állandó forgatás közben 37 ’C-on három napon át inkubáljuk. Ezután a tenyészet felülúszókat összegyűjtjük, 1 mM, illetve 0,1 mM végső koncentrációban EDTA-t és fenilmetilszulfonilfluoridot (mindkét reagenst a Boehringer Mannheim cégtől szereztük be) adunk hozzá, a proteolitikus bontás késleltetése céljából. A felülúszókat 4 ’C-on tároljuk.
Limfokin aktivált killer (LAK) sejt indukció (LCI) teszt
Tenyészet felülúszókat és kromatográfiás frakciókat rIL-2 szinergizálására vizsgálunk, citolitikus LAKsejtek képzése céljából, a következőképpen. Humán perifériás vér mononukleáris sejteket (PBMC) a következő módszerrel izolálunk. Normál önkéntes donorok vérét megfelelő mennyiségű steril tartósítóanyagmentes heparint (Sigma) tartalmazó fecskendőkkel leveszünk, a végső koncentráció kb. 5 egység/ml. A vért 1:1 arányban kalcium- vagy magnézium-mentes (GIBCO) Hanks-féle kiegyensúlyozott sóoldattal (HBSS) hígítjuk. A hígított vért Ficoll/nátrium-diatrizoát oldat (Limfocita elválasztó táptalaj, Organon Teknika Corp., Durham, NC) 15 ml-es aliquot részei fölé rétegezzük, 50 ml-es Falcon 2098 centrifugacsövekben. A csöveket 30 percen át 500xg mellett szobahőmérsékleten centrifugáljuk. Centrifugálás után a Ficoll/nátriumdiatrizoát rétegben lebegő sejteket összegyűjtjük, és J2 térfogat, kalcium- vagy magnéziummentes HBSS-oldattal történő összekeveréssel hígítjuk. A kapott sejtszuszpenziót Falcon 2098 centrifugacsövekben 1% humán AB szérumot (Irvine Scientific, Santa Ana, CA) tartalmazó RPMI 1640 közegben 20%-os szaccharóz oldat (Fischer) 15 ml-es aliquot részei fölé rétegezzük. A csöveket szobahőmérséklet 500xg mellett 10 percen át centrifugáljuk, majd a felülúszót elöntjük. A sejtpelletet 5 ml, kalcium- vagy magnéziummentes HBSS-oldatban újraszuszpendáljuk, centrifugálással újrapelletírozzuk, majd megfelelő táptalajban újraszuszpendáljuk. A járulékos sejteket a PBMC mellől 5 mM L-glutaminsav-dimetil-észterrel végzett kezeléssel (Sigma) távolítjuk el, a Thiele és tsai: J. Immunoi. 131; 2282-2290 (1983) által L-leucin-metil-észterrel történő járulékos sejtgyengítésre leírt módszerrel, azzal az eltéréssel, hogy a leucin-észter helyett glutaminsav-észtert alkalmazunk.
A járulékos sejtekben legyengített PBMC-t nem folyamatos Percoll sűrűség gradiens szerint végzett centrifugálással továbbfrakcionáljuk [Pharmacia, Piscataway, NJ Wong és tsai: Cell Immunoi. 111; 39-54 (1988)]. A 38, 41, 45 és 58%-os Percoll-rétegből kinyert mononukleiáris sejteket összegyűjtjük, és a teszt során LAK-sejt prekurzor forrásként használjuk fel. A Percoll gradiensből kinyert sejteket mossuk, és olyan szövettenyészettáptalajban (TCM) szuszpendáljuk, amely RPMI 1640 és 0,1 mM nemesszenciális aminosavakat, 60 pg/ml anginin-hidrokloridot, 10 mM HEPES puffért, 2 mM L-glutamint, 100 egység/ml penicillint, 100 μ/ml sztreptomicint (valamennyi terméket a GIBCO cégtől szereztük be), 5xl0-5 M 2-merkaptoetanolt (Fischer Scientific, Fair Lawn, NJ), 1 mg/ml dextrózt (Fischer) és 5% humán AB szérumot (Irvine Scientific, Santa Ana, CA) tartalmazó Dulbecco-féle módosított Eagle-táptalaj 1:1 arányú elegyéből áll. Ezeket a sejteket 24-mélyedéses szövettenyészet lemezekben (Costar, Cambridge, MA) 1 ml-es tenyészetekben (7,5x10'5 sejt/tenyészet) szuszpendáljuk, amelyekhez az endogén citokin termelés minimalizálása céljából 10*4 M hidrokortizon-nátrium-szukcinátot (Sigma) adtunk. Néhány tenyészethez humán rIL-2-t (szállító cég: Hoffmann-La Roche, Inc., Nutley, NJ) 5 egység/ml végső koncentrációban és/vagy a CLMF aktivitás meghatározása céljából felülúszót is adtunk. Az összes tenyészetet 5% széndioxidból és 95% levegőből álló nedves atmoszférában 37 ’C-on 3-4 napon át inkubáljuk.
Az inkubálás végén minden tenyészet tartalmát összegyűjtjük, a sejteket centrifugálással pelletírozzuk és 0,5 ml friss PCM-ben újraszuszpendáljuk. Ezen sejtszuszpenziót 0,1 ml-es aliquot részeit 51Cr-jelzett K562 vagy Raji sejtek (mindkét sejtvonalat az ATCC-től szereztük be) 0,1 ml-es aliquot részeivel összekeverjük, és lítikus aktivitásukat 5 órás 51Cr leadásos teszt során meghatározzuk. A 51Cr segítségével történő célsejt jelzéses módszert és a citolitikus tesztet Gately és tsai írták le [JNCI 69; 1245-1254 (1982)]. A specifikus 51Cr leadás %-os értékét a ,,[(e-c)/(100-e]”xl00 egyenlet segítségével határozzuk meg, ahol e = a limfocitákkal inkubált célsejtekből felszabaduló 5lCr%-os értéke, és c = az önmagukban inkubált célsejtekből spontán felszabaduló 51Cr%-os értéke. A felszabadult 51Cr teljes mennyiségét a célsejtek 2% nátrium-dodecil-szulfáttal végzett lízisével határozzuk meg [Gately és tsai: JNCI 69; 1245-1254 (1982)]. Valamennyi limfotikus populáció lítikus aktivitását négy ismétléses kísérletsorozatban határozzuk meg.
LAK-sejt indukció mikmteszt
Az rIL-2 és CLMF-tartalmú oldatok közötti, humán LAK-sejt indukcióhoz vezető szinergizmus mérésére szolgáló mikrotesztet a fentiekben leírt LAK-sejt indukciós teszthez hasonlóan végezzük el, az alábbi módosításokkal. Humán perifériás vér monoklonális sejtek járulékos sejttartalmát lecsökkentjük, és frakcionált Percoll gradiens szerinti centrifugálással frakcionáljuk, a fentiekben leírt módon. Az ily módon nyert sejteket Costar 3596 mikrolemezek mélyedéseibe adagoljuk (5X104 sejt/mélyedés). Néhány mélyedéshez rIL-2-t (végső koncentráció 5 egység/ml) és/vagy tisztított CLMF-t vagy immunolegyengített CLMF-tartalmú oldatot is adunk. Valamennyi tenyészet 104 M hidrokortizon-nátrium-szukcinátot (Sigma) tartalmaz; a
HU 211 879 A9 végső térfogatot 5% humán AB-szérumot tartalmazó TCM hozzáadásával 0,1 ml-re állítjuk be. A tenyészeteket 37 C-on 3 napon át inkubáljuk, majd mindegyik mélyedéshez 0,1 ml 51Cr-jelzett K562 sejtet adunk (5xl04 sejt/ml, 5% humán AB szérumot tartalmazó TCM-ben. A tenyészeteket egy éjjelen át 37 °C-on inkubáljuk, majd 5 percen át 500xg mellett centrifugáljuk, és a felülúszó oldatokat Skatron felülúszót összegyűjtő rendszer (Skatron, Sterling, VA), felhasználásával összegyűjtjük. Az egyes felülúszó oldatokban a felszabadított 5lCr mennyiségét gamma számlálóval (Packard, Downer's Grove, IL) meghatározzuk, és specifikus 5lCr felszabadulást a fentiekben leírt módon kiszámítjuk. Minden mintát négy ismétléses tesztben vizsgálunk.
Citolitikus T-limfocita (CTL) generációs teszt A humán CTL lítikus aktivitásának kifejlesztésére és mérésére szolgáló módszereket [Gately és tsai: J. Immunoi. 136; 1274-1282 (1986) és Wong és tsai: Cell. Immunoi. 111; 39-54 (1988)] írta le. Normál önkéntes donorok véréből humán perifériás vér mononukleáris sejteket izolálunk, a járulékos sejtek mennyiségét L-glutaminsav-dimetil-észteres kezeléssel csökkentjük, majd a fentiekben leírt módon Percoll gradiens centrifugálással frakcionáljuk. A 45% és 80% Percoll rétegek közötti határfelületről kinyert nagysűrűségű limfocitákat használjuk fel responder limfocitaként vegyes limfocita-tumor tenyészetekben (MLTC). A CTL-t 24-mélyedéses sejttenyészet lemezeken (Costar 3424) Percoll-gradiensből leszármaztatott nagysűrűségű limfocitákkal (7,5x1ο5 sejt) és lxlO5 UV besugárzott melanóma sejtekkel (pl. HT144; ATCC-től szereztük be) vagy 5x10“* gamma besugárzott melanóma sejtekkel (pl. HT144 TCM-ben, 5% humán AB-szérumot tartalmaz, 1,2 ml/tenyészet) történő inkubálással képezzük. Az UV-besugárzáshoz HT144 sejteket 1l,5xlO6 sejt/ml sűrűség mellett Hank-féle kiegyensúlyozott sóoldatban szuszpendálunk, fenolvörös (GIBCO) nélkül, 1% humán AB-szérum jelenlétében. A sejtszuszpenziók 1 ml-es aliquot részeit 35x10 mm-es műanyag sejttenyészet edényekbe (Falcon 3001) mérjük be, és a sejteket 354 mm UV fény felhasználásával (UGV-54 MINERALIGHT* lámpa, Ultra-viola Products, Inc,, San Gábriel, CA) BESUGÁROZZUK (960 Mw/CM2 5 percen át). A gamma-besugárzáshoz HT144 sejteket l,5xl06 sejt/ml sűrűség mellett 5% humán AB-szérumot tartalmazó TCM-ben szuszpendálunk, és cézium-forrás besugárzó felhasználásával (143 modell, I. L. Shepherd és Associates, San Femando, CA) besugározzuk (10 000 rád). Az UV- vagy gammabesugárzott HT144-et centrifugáljuk, és 5% humán AB-szérumot tartalmazó TCM-ben a kívánt sejtsűrűség mellett újraszuszpendáljuk, az MLTC-hez történő hozzáadás céljából. Néhány MLTC-hez - limfocitákon és melanómasejteken kívül - humán rIL-2-t és/vagy tisztított humán CLMF-t is adunk, a meghatározott koncentrációban. Az MLTC-hez 104 M végső koncentrációban (UV-besugárzott melanómasejteket tartalmazó tenyészetek) vagy 10'5 M (gamma-besugárzott melanómasejteket tartalmazó tenyészetek) végső koncentrációban hidrokortizon-nátrium-szukcinátot (Sigma) adunk, az endogén citokin-termelés visszaszorítása, [S. Gillis és tsai: I. Immunoi. 123: 1624-1631 (1979)] és a tenyészetekben a nemspecifikus LAK sejtek képződésének csökkentése [L. M. Muul és Μ. K. Gately, I. Immunoi. 132: 1202-1207 (1984)] céljából. A tenyészeteket 37 C-on 5% széndioxidot és 95% levegőt tartalmazó nedvesített atmoszférában 6 napon át inkubáljuk. Ezután a limfocitákat a replikáit tenyészetekből összegyűjtjük, centrifugáljuk, 5% humán AB-szérumot tartalmazó TCM-ben (1,2 ml) újraszuszpendáljuk, és HT 144 melanóma sejteket lizáló hatásukra vizsgáljuk; ezenkívül egy éjjelen át végzett 5lCr leadó tesztet is végzünk, specifikus kontrollként K562 eritroleukémiás sejteket (ATCC-től szerezhetők be) alkalmazva.
Malenomasejteket és K562 sejteket 51Cr nátriumkromáttal jelzünk, a Gately és tsai által leírt módon [INCI 69; 1245-1254 (1982)]. Hasonlóképpen, a 5lCr jelzett melanomasejtek limfociták által közvetített lízisének mérését a Gately és tsai által glioma célsejtek lízisének mennyiségi meghatározására leírt módon (ibid) mérjük. Az 51Cr jelzett K562 sejtek lízisének meghatározása céljából limfocita szuszpenziók 0,1 ml-es aliquot részeit Costar 3696 „félterületű” mikroteszt lemezek mélyedéseiben 5lCr jelzett K562 (2X105 sejt/ml, 5% humán AB szérumot tartalmazó TCM-ben) 25 μΐ aliquot részeivel összekeverjük. Ezután 37 ’C-on egy éjjelen át inkubáljuk, majd a lémezeket 1400xg mellett 5 percen át centrifugáljuk, és minden mélyedésből 50 μΐ sejttenyészetet veszünk le. Minden mintában az 5lCr mennyiségét gammaszámlálóval (Packard) meghatározzuk, és a specifikus 51Cr felszabadulás %-os értékét a fentiekben leírt módon meghatározzuk. Minden meghatározást négy ismétlésben végzünk el, és az alábbi táblázatban megadott értékek az átlagérték ±1% szórásnak felelnek meg.
T-sejtnövekedés faktor (TGF) teszt
A tenyészet felülúszók és kromatográfiás frakciók PHA-aktivált humán T limfoblaszt burjánzás serkentésében kifejtett hatását az alábbiak szerint mérjük. Humán PBMC-t izolálunk nemfolyamatos Ficoll és szaccharóz gradiensen végzett centrifugálással, a korábbiakban az LCI teszt kapcsán leírtak szerint. A PBMC-t (5X1O5 sejt/ml) 37 C-on 0,1% phytohemagglutinin-P-t (PHA-P) (Difco Laboratories, Detroit, MI) tartalmazó PCM-ben tenyésztjük. A tenyészeteket 3 nap múlva friss PCM-et 1:1 arányban elegyítjük, majd minden tenyészethez 50 egység/ml végső koncentrációban humán rIL-2-t adunk. A tenyészeteket további 1-2 napon át inkubáljuk, majd a sejteket összegyűjtjük, mossuk és PCM-ben 4X105 sejt/ml koncentrációban újra szuszpendáljuk. A kapott sejtszuszpenzióhoz hővel inaktivált kecske anti-humán rEL-2 antiszérumot adunk (végső hígítás: 1/200), a tesztben fellépő esetleges potenciális IL-2 indukált sejtburjánzás blokkolása céljából. Ezt az antiszérumot az irodalomban jólismert módszerekkel állíthatjuk elő vagy a Genzyme Co.,
HU 211 879 A9
Boston MA cégtől szerezhetjük be. A felhasznált antiszérum 1/20 000 szérumhígítás mellett 2 egység/ml rIL-2 50%-os semlegesítését idézi elő.
Az anti-IL-2 antiszérumot tartalmazó sejtszuszpenzió 50 μΙ-es aliquot részeit Costar 3596 mikrolemezek mélyedéseiben tenyészet felülúszók vagy kromatográfiás frakciók hígítássorozatai 50 μΙ-es aliquot részeivel elegyítjük. A tenyészeteket 5% széndioxidból és 95% levegőből álló nedvesített atmoszférában 37 °C-on egy napon át inkubáljuk, majd minden mélyedéshez 50 μΐ 3H timidint (New England Nuclear, Boston, MA) adunk, 10 pCi/ml TCM-ben. A tenyészeteket egy éjjelen át inkubáljuk, majd az egyes tenyészetek tartalmát sejtösszegyűjtő (Cambridge Technology Inc., Cambridge, MA) segítségével üvegszálszűrőkön összegyűjtjük, és a sejt DNS-be beépült 3H-timidin mennyiségét folyadékszcintillálós számlálóban mérjük. Minden mintát háromszoros ismétlésben határozzuk meg.
A CLMF tisztítása során a kromatográfiás eluálási profilok kialakítása és a tisztított anyag kinyert %-os aktivitása, valamint specifikus aktivitása kiszámítása céljából az aktivitási egységek definiálására van szükség. E célból standardként PHA-aktivált humán PBMC és NC37 sejtek együttes tenyésztésével nyert humán citokinból előállított, részlegesen tisztított készítményt alkalmazunk. E készítmény aktivitását önkényesen 2000 egység/ml értéknek tekintjük. E készítmény több hígítását adjuk hozzá az egyes TGF vagy LAK indukciós teszt során. A dózis-hatás görbe elkészítéséhez ezt a standard készítményt használjuk, és e görbéből az adott hígításnál az egyes ismeretlen minták aktivitását (egység/ml) interpoláljuk. A kapott értéket a hígítási faktorral beszorozva az eredeti minta egység/ml-ben kifejezett aktivitását kapjuk.
Az antitest közömbösítési vizsgálatokhoz a PGF tesztet a következőképpen módosítjuk. CLMF-tartalmú közeg 25 μΙ-es aliquot részeit COSTAR 3596R mikrolemezek mélyedéseiben az antiszérum vagy antitest oldatok sorozathígításai 50 μΙ-es aliquot részeivel elegyítjük. A kapott elegyeket 37 °C-on 30 percen át inkubáljuk, majd minden mélyedéshez a PHA-aktivált limfoblast szuszpenzió (8xl05/ml, TCM-ben, plusz 1:100 anti-rIl-2) 25 μΙ-es aliquot részeit adjuk. A tenyészeteket tovább inkubáljuk, 3H-timidinnel rázatjuk, összegyűjtjük és a beépült 3H-timidinre elemezzük.
Természetes killer (NK) sejt aktiválási teszt
A tisztított CLMF-nek NK sejtek aktiválására kifejtett hatását - önmagában vagy rIL-2-el kombinálva - a következőképpen határozzuk meg. Humán PBMC-t nemfolyamatos Ficoll-on végzett centrifugálással és szacharóz-gradiens szerint a fentiekben leírt módon izolálunk, és 10% hővel aktivált magzati borjúszérummal, 100 egység/ml penicillinnel, 100 μg/ml sztreptomicinnel és 2 mM L-glutaminnal kiegészített RPMI 1640 táptalajban szuszpendálunk. A PBMC-t egy éjjelen át 37 °C-on 1 ml-es tenyészetekben (5X106 sejt/tenyészet) rIL-2-el és/vagy tisztított CLMF-el együtt különböző koncentrációban inkubáljuk. A tenyészetek tartalmát 18-20 óra múlva összegyűjtjük, centrifugáljuk, a sejteket az egy éjszakás tenyészeteknél felhasználttal azonos táptalajban újraszuszpendáljuk. A tenyésztett PBMC citolitikus aktivitását a 5lCr leadó teszt során a fentiekben leírt módon határozzuk meg.
Sejtfelülúszó oldatok betöményítése
Indukált NC-37 sejtek több gyártásából származó, összesen 60 liter tárolt fagyasztott nyers humán CLMF felülúszó oldatot összegyűjtünk, és 30-szorosra betöményítünk, 30 000 NMWL PTTK 00005; Millipore Corp., Bedford, MA Pellicon casette rendszer felhasználásával. A kívánt térfogatra (kb. 1,9 liter) történő betöményítés után 10 mM MES segítségével puffercserét hajtunk végre, és a pH-t 10 -N nátrium-hidroxidoldattal 6,0 értékre állítjuk be. A koncentrátumot lOOOOxg mellett 4 C-on 10 percen át centrifugáljuk, és a csapadékot kidobjuk.
Ioncserélő kromatográfia NuGel P-SP oszlopon
A betöményített felülúszó oldatot 120 ml/óra sebességgel 10 mM MES-ben egyensúlyba hozott (pH 6,0) Nu-Gel P-SP oszlopra (Separation Industries, Metuchen, NJ) (5x5 cm) visszük fel. Az oszlopot 280 nm szerint végzett nyomonkövetés mellett alapvonal abszorpció eléréséig mossuk. A megkötött fehérjéket 500 ml só-gradiens szerint 0-0,5 M NaCl/10 mM MES, pH 6,0 2 ml/perc átfolyási sebesség mellett eluáljuk (1. ábra). A frakciók aliquot részeit T sejtnövekedés faktor TGF aktivitásra elemezzük. A TGF aktivitást tartalmazó frakciókat összegyűjtjük, és 50 térfogat 20 mM Tris/HCl-el (pH 7,5) szemben (Spectra/Por 7, Fisher Scientific) dializáljuk, a készítmény sókoncentrációjának 50-szeres csökkentése céljából.
Színezék affinitás kromatográfia Blue B-agaróz oszlopon
A dializált mintákat 10 OOOxg mellett 4 “C-on 10 percen át centrifugáljuk, és a csapadékot kidobjuk. A felülúszó oldatot 20 ml/óra átfolyási sebességgel 20 mM Tris/HCl-el (pH 7,5) egyensúlyba hozott BlueB-agaróz oszlopra (Amicon, Danvers, MA; 2,5x10 cm) visszük fel. Az oszlopot ugyanezzel a pufferrel 280 nM mellett végzett nyomonkövetéssel az alapvonal abszorpció megjelenéséig mossuk. A megkötött fehérjéket 15 ml/óra átfolyási sebességgel 500 ml sógradiens szerint 0-0,5 M NaCl/20 mM Tris/HCl, pH 7,5 eluáljuk (2. ábra). A frakciók aliquot részeit TGF aktivitásra vizsgáljuk. A TGF aktivitást tartalmazó frakciókat összegyűjtjük, és 100 térfogat 20 mM tris/HCl-el (pH 7,5) szemben dializáljuk (Spectra/Por 7, Fisher Scientific), a készítmény sótartalmának 100-szoros csökkentése céljából.
Ioncserélő kromatografálás Mono Q kromatográfiával
A dializált mintát 0,45 μπι cellulózacetát szűrőn (Nalgene Co-, Rochester, Ny) átszűrjük, és a szűrletet 60 ml/óra átfolyási sebességgel 20 mM Tris/HCl-el (pH 7,5) egyensúlyba hozott Mono Q HR 5/5 oszlopra (5x50 mm Pharmacia LKB Biotechnology, Inc., Pisca11
HU 211 879 A9 taway, NJ) visszük fel. Az oszlopot a fenti pufferrel addig mossuk, amíg 280 nm mellett nyomonkövetve az alapvonal abszorpció megjelenik. A megkötött fehérjéket 60 ml/óra átfolyási sebesség mellett egy órás lineáris sógradiens szerint 0-0,25 M NaCl/20 mM Tris/HCI, pH 7,5 eluáljuk (3. ábra). A frakciók aliquot részeit TGF aktivitásra meghatározzuk, és a fehérjetisztaságot redukció nélkül SDA-PAGE segítségével [Laemmli, Natúré (London) 227; 680-685 (1970)] 12%-os gél felhasználásával mérjük. A fehérje láthatóvá tételéhez ezüsttel színezett géleket [Morrissey: Anal. Biochem.
117: 307-310 (1981)] alkalmazunk (4. ábra). A 36. és 37. frakció tisztasága 95%-nál magasabb, és ezek a frakciók 75 000 molekulatömegnél fősávot mutatnak.
A 38-41. frakció TGF-aktivitást tartalmaz, és SDS- 15 PAGE szerint 75 kDa fehérjét mutat, 55 000 és 40 000 molekulatömegű főszennyezésekkel.
A fenti szennyező fehérjék eltávolítása céljából az előző Mono Q kromatográfia során nyert 38. frakciót 8M karbamiddal 1:1 térfogat/térfogat arányban hígít- 20 juk, és fordított fázisú HPLC dúsító módszerrel Vydac difenil-oszlopra visszük fel. Az oszlopot 5 ml 0,1 %-os trifluor-ecetsavval mossuk. A fehérjék eluálását 0-70% acetonitril-gradiens szerint 7 órán át 0,1 %-os trifluor-ecetsavban végezzük el (5. ábra). A 25 frakciók aliquot részeit TGF aktivitásra vizsgáljuk. A
TGF aktivitást tartalmazó frakciók fehérjetisztaságát SDS-PAGE segítségével, nemredukáló körülmények között, 10% gél felhasználásával határozzuk meg. A fehérjék láthatóvá tétele céljából a gélt ezüsttel meg5 festjük (6. ábra), a 86-90. frakció tisztasága 90%-nál magasabb, és a fehérje molekulatömege 75 000. A 87. és 88. frakciót összegyűjtjük és redukáló (beta-merkapto-etanol jelenlétében), illetve nemredukáló (betamerkapto-etanol nélkül) körülmények között SDS10 PAGE elemzésnek vetjük alá. Redukáló körülmények között a 75 000 molekulatömegű CLMF két alegységre - 40 000 és 35 000 dalton - válik szét (7. ábra). Ebből következően a CLMF diszulfid kötésekkel összekapcsolt 40 kDa és 35 kDa alegységekből álló 75 kDa heterodimer.
A CLMF teljes tisztítását az 1. táblázatban ismertetjük. A Mono Q- és Vydac difenil-tisztított anyag fehérjetartalmát aminosav analízis alapján számítjuk ki. A Mono Q- és Vydac difenil-tisztított anyag fajlagos aktivitása 8,5xl07 egység/mg, illetve 5,2xl07 egység/mg. Az a tény, hogy a difenil-tisztított fehérje fajlagos aktivitása valamivel alacsonyabb a Mono Q tisztított anyag megfelelő értékénél annak tulajdonítható, hogy HPLC eluáló oldószerekben (azaz acetonitril, 0,1% trifluorecetsavban) a CLMF molekuláinak egy része inaktiválódik vagy denaturálódik.
1. táblázat
Lépés Térfogat (ml) Összegyűjtött aktivitás (g/ml) Összes egység (E) Összegyűjtött fehérje (mg/ml) Összfehérje (mg) Fajlagos aktivitás (U/mg)
Összegyűjtött sejtfelülúszó 60 000 2.58X103 l,6xl08 ND ND ND
Ultraszűrt koncentrátum 1,940 1,57x1ο5 3,0xl08 1,83 3550 8,5x104
Nugel P-SP 90 2,00xl06 l,8xl08 0,70 63 2,8x10®
Blue-B-Agarose 45 3,11x10® l,4xl08 0,24 11 l,3xl07
Mono Q 37. frakció 1 6,40x10® 6,4x10® 0,075 0,075 8,5x107
Mono Q 38>42. frakció 5 6,90x10® 3,45x107 0,081 0,405 8,5x107
Difenil 87+88 frakció 1,1 5.74X105 5,22x1ο5 0,008 0,010 5,2x107
Kémiai jellemzés
A homogén CLMF előállíthatósága az első alkalommal tette lehetővé a természetben előforduló CLMF fehérje aminosav összetételének meghatározását, és részleges szekvencia analízisét. 10-20 pikomól 50 Mono Q tisztított CLMF-t hidrolízisnek vetünk alá, és aminosav összetételét meghatározzuk (2. táblázat). A prolint, ciszteint és triptofánt nem határoztuk meg (ND). A hisztidin kvantitatív meghatározása a Tris-el asszociált, a His (*)-el koeluáló nagy csúcs miatt nem 55 volt meghatározható.
5-30 pikomól difenil-tisztított CLMF-t hidrolízisnek vetjük alá, perhangyasavas előkezeléssel vagy anélkül. A kapott teljes aminosavösszetételt - triptofán kivételével - a 3. ábrán tüntetjük fel. 60
Az aminoterminális szekvencia meghatározását 100 pmól Mono Q tisztított CLMF-en automatizált Edman lebontással kíséreltük meg. Az első 22 ciklus adatai - a CLMF heterodimer szerkezetéből várható módon - két szekvencia jelenlétét jelzik. A kapott eredményeket az alábbiakban foglaljuk össze:
Cik- lus 1 2 3 4 5 6 7 8
Ami- no- sav I/? W/? E/L L/P K/V K/A D/T V/P
Cik- lus 9 10 11 12 13 14 15 16
HU 211 879 A9
Cik- lus 1 2 3 4 5 6 7 8
Ami- no- sav Y/D V/P V/G E/M L/F D/P W/? Y/L
Cik- lus 17 18 19 20 21 22
Ami- no- sav P/H D/H A/S P/Q GZ? E/?
2. táblázat
Aminosav Mól %
Aszparaginsav vagy aszparaginn 11,8
Treonin 7,8
Szerin 8,4
Glutaminsav vagy glutaminn 14,9
Prolin ND
Glicin 6,2
Alanin 7,6
Cisztein ND
Valin 6,9
Metionin 2,0
Izoleucin 4,6
Leucin 9,0
Tirozin 3,7
Fenil-alanin 4,0
Hisztidin *
Lizin 9,3
Arginin 5,4
Triptofán ND
3. táblázat
Aminosav Mól %
Aszparaginsav vagy aszparaginn 10,8
Treonin 7,2
Szerin 8,9
Glutaminsav vagy glutaminn 13,1
Prolin 3,8
Glicin 4,7
Alanin 5,9
Cisztein 2,9
Valin 6,2
Metionin 1,9
Izoleucin 4,2
Leucin 9,4
Tirozin 3,6
Fenil-alanin 3,7
Hisztidin 1,8
Lizin 7,7
Arginin 4,4
Triptofán ND
Fordított fázisú HPLC
A kromatográfiás rendszert korábban [Stern, A. S. és Lewis, R. V. (1985): Research Methods in Neurochemistry, Ed. Marks, N., és Rodnight, r. (Plenum,
New York) Vol. 6, 153-193] írták le. A fehérjét az oszlop effluensekben egy fluoreszcamint (Polysciences, Inc., Warrington PA) felhasználó automatizált fluoreszcencia detektor rendszer követi nyomon [Stein S. és Moschera, J. (1981) Methods Enzymol. 78; 435447]. A fordított fázisú HPLC-t Vydac Cl8 vagy difenil-oszlopok (4,6x20 mm, The Sep/at/ra/tions Group, Hesperia, CA) felhasználásával végezzük el. A fehérjét 0,1% TFA-ban acetonitril gradiens szerint eluáljuk.
Fehérje elemzés
Az aminosav elemzést utó-oszlopos reakcióban fluoreszcamint felhasználó készülékben végezzük el [Pan, Y.-C. E., és Stein, S. (1986): Methods of Protein Microcharacterization (Shively, J. E., Ed.), pp. 105-119, Humana Press, Clifton, NJ],
A szekvencia analízist Applied Biosystems Inc. Model 470A gázfázisú szekvencia meghatározó berendezéssel végezzük el (Foster City, CA) [Hewick, R. M., Hunkapillar, M. W„ Hood, L. E., és Dreyer, W. 1, J. Bioi. Chem. 256; 7990-7997 (1981)]. A feniltiohidantoin (PTH) aminosavszármazékokat ABI modell 120A PTH analizátor segítségével, „on-line” azonosítjuk.
CLMF alegységek részleges aminosavszekvenciáinak meghatározása
CLMF 40 kDa alegységének tisztítása
Összesen 39,1 liter tárolt NC35 sejt felülúszó oldatot összegyűjtünk, és Pellicon Casette rendszer felhasználásával kb. 2,4 literre bepárolunk, és -20 C-on tárolunk. A koncentrátumot felengedés utáni tisztítás céljából centrifugáljuk, és a csapadékot kidobjuk.
A felülúszó oldatot Nu-Gel P-SP oszlopra visszük fel, és a fehérjét sógradiens szerint eluáljuk (8. ábra). A csúcs TGF aktivitást meghatározzuk, az aktív frakciókat összegyűjtjük, és a készítmény sótartalmának 50szeres csökkentése céljából dializáljuk. A terméket a szennyezések eltávolítása céljából centrifugáljuk, majd Blue-G-agaróz oszlopra visszük fel. A fehérjét sógradiens szerint eluáljuk (9. ábra). A csúcs TGF aktivitást meghatározzuk, az aktív frakciókat összegyűjtjük, és a készítmény sótartalmának 100-szoros csökkentése céljából dializáljuk. A kapott anyagot szűrés után Mono Q oszlopra visszük fel. A fehérjét sógradiens szerint eluáljuk (10. ábra). A frakciók aliqout részeit TGF aktivitásra vizsgáljuk.
Az előző Mono Q kromatografálásnál nyert 39. és 40. frakciót összegyűjtjük, 8 M karbamiddal 1:1 térfogat/térfogat arányban hígítjuk, és dúsító eljárás segítségével Vydac difenil oszlopra szivattyúzzuk. Az oszlopot 5 ml 0,1 %-os trifluor-ecetsavval mossuk. A fehérjék eluálását 0,70% acetonitril gradiens szerint 0,1% trifluor-ecetsavban 7 órán át végezzük (11. ábra). A frakciók aliqout részeit TGF aktivitásra elemezzük. A TGF aktivitást tartalmazó frakciók fehérjetisztaságát redukáló körülmények között (azaz beta-merkapto-etanol jelenlétében) SDS-PAGE szerint határozzuk meg (12. ábra). A 94-97. frakció j90% tisztaságú 40 000 dal tón alegységet tartalmaz.
HU 211 879 A9
CLMF alegységei aminoterminális szekvenciájának meghatározása
A CLMF 40 000 dalton alegységéből nagymértékben feldúsított kompozíciót állíthatunk elő, és ez parciális szekvencia analízist lehetővé teszi.
Aminoterminális szekvencia meghatározást 20 pmól difenil-tisztított 40 000 dalton alegység automatizált Edman lebontásával kíséreltünk meg. Az eredményeket az alábbiakban foglaljuk össze:
Ciklus 1 2 3 4 5 6 7
Ami- nosav I W E L K K D
Ciklus 8 9 10 11 12 13 14
Ami- nosav V Y V V E L D
Ciklus 15 16 17 18 19 20 21
Ami- nosav W Y P D A P G
Ciklus 22 23
Ami- nosav E M
A 75 000 dalton CLMF szekvencia analízise és a CLMF 40 000 daltonos alegységének szekvencia analízise alapján a CLMF 35 000 daltonos alegységének aminoterminális szekvenciája kikövetkeztethető. A 35 000 daltonos alegység és a 40 000 daltonos alegység aminoterminális szekvenciája a következőképpen foglalható össze:
000 dalton alegység:
NH2-?-?-Leu-Pro-Val-Ala-Thr(?)-Pro10
Asp-Pro-Gly15
Met-Phe-Pro-?-Leu-His-His-Ser(?)20
Gln40 000 dalton alegység:
5 10
NH2-Ile-Trp-Glu-Leu-Lys-Lys-Asp-ValTyr-Val-Val-Glu
20
Leu-Asp-Trp-Tyr-Pro-Asp-Ala-Pro-Gly23
Glu-Metahol is ? a meghatározatlan vagy „legjobban valószínűsített” maradékot jelenti.
CLMF 40 kDa alegysége belső aminosavszekvencia szegmenseinek meghatározása CLMF-t a fentiekben leírt módon tisztítunk. A
000 daltonos alegységet elválasztjuk, és a 35 000 daltonos alegységtől a Matsudaira [J. Bioi. Chem. 262: 10 035-10 038 (1987)] által leírt módon megtisztítjuk. 50 pg CLMF-t (500 μΐ és 20 mM Tris-ben, pH 7,5; 0,15 M NaCl) a mintapuffer [Laemmli, Natúré 227: 680-685 (1970)] kétszeres koncentrátuma 200 μΙ-ével hígítunk. A mintát 400 μΙ-re betöményítjük, és a diszulfid kötéseket 18 μΐ beta-merkaptoetanol hozzáadásával, majd 6 percen át 105 °C-on végzett kezeléssel felhasítjuk.
A mintát 12% poliakrilamidot tartalmazó minigéle (1,0 mm vastagságú) töltjük, és Laemmli módszerével (supra) elektroforézisnek vetjük alá. A géleket elektroforézis után 5 percen át transzer pufferbe (10 mM 3-ciklohexil-amino-l-propánszulfonsav, 0% metanol, pH 11,0) merítjük, a Tris és glicin mennyiségének csökkentése céljából. Ez alatt az idő alatt egy polivinilidén-difluorid (PVDF) membránt (Immobilon, Millipore, Bedford, MA) 100% metanollal öblítünk, és transzfer pufferben tároljuk. A két PDF membránréteggel, és néhány szűrőpapír réteggel megerősített gélt Biot berendezésbe visszük és transzfer pufferben 0,5 Amp mellett 30 percen át elektroeluáljuk. A PVDF membránt ionmentesített vízzel 5 percen át mossuk. A biot szegélyét a PVDF membránból kivágjuk, majd 0,1% Coomassie Blue R-250 színezékkel 50% metanolban 5 percen át színezzük, végül a színezéket szobahőmérsékleten 50% metanolban 10% ecetsavval 5-10 percen át eltávolítjuk. A 40 000 dalton megfestett sávot a meg nem színezett biot megfelelő tartományával összehasonlítjuk és a 40 000 alegységet a meg nem színezett PVDF-ből kivágjuk.
A Coomassie Blue színezékkel megfestett 40 000 daltonos alegység N-végcsoportjait szekvenciáljuk annak igazolása céljából, hogy az N-terminus az egyik korábban meghatározottnak felel meg (lásd fent). Ezzel a módszerrel a 40 000 daltonos fehérjét a CLMF 40 000 alegységként azonosítottuk.
5% PVDF-hez kötött 40 000 daltonos alegység aminosav összetételét megelemezzük (4. táblázat). A megkötött 40 000 daltonos alegység maradék 95%-át Bauw és tsai módszerével tripszinnel fragmentáljuk [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86; 7701-7705 (1989)]. A fehérjét hordozó membránt kb. 3x3 mm-es részekre vágjuk és Eppendorf csőben gyűjtjük össze. Ezeket a darabokat 300 μΐ metanolos 2%-os polivinilpirrolidonba (40 000 dalton) merítjük. Az elegyet 30 perc múlva azonos térfogatú desztillált vízzel hígítjuk, és
5-10 percen át továbbinkubáljuk. A felülúszó folyadékot elöntjük, és a membrán részecskéket 300 μΐ vízzel négyszer és 300 μΐ 100 mM Tris HCl-el (pH 8,5) egyszer mossuk. 2 pg tripszint tartalmazó fenti puffért (100 μΐ) adunk hozzá. A mintát rázatjuk és 4 órán át 37 ’C-on inkubáljuk. A felülúszó oldatot második Eppendorf csőbe visszük át, majd a membrán darabokat 100 μΐ 88%-os hangyasavval egyszer és 100 μΐ ionmentesített vízzel háromszor mossuk. Az összes mosófolyadékot a második Eppendorf csőben adjuk az emésztett elegyhez. Az összegyűjtött emésztett folyadékban levő peptideket HPLC (HP1090A, Hewlett Packard) segítségével IMC C-19 oszlopon (2,6x50 mm; Morris Plains, NJ) választjuk el.
HU 211 879 A9
4. táblázat
Aminosav Maradék Szám
Aszparaginsav vagy aszparaginn 27,9 (28)
Treonin 20,7 (23)
Szerin 24,6 (34)
Glutaminsav vagy glutaminn 44,6 (35)
Prolin ND (14)
Glicin 16,3 (15)
Alanin 16,2 (14)
Cisztein ND (10)
Valin 20,9 (23)
Metionin 2,5 (2)
Izoleucin 10,3 -(12)
Leucin 22,9 (22)
Tirozin 12,9 (12)
Fenil-alanin 9,9 (9)
Hisztidin 5,2 (5)
Lizin 24,5 (26)
Arginin 12,5 (12)
Triptofán ND (10)
Megjegyzés: a fenti eredmények két elemzés átlagértékét jelentik. A prolint, ciszteint és triptofánt nem határoztuk meg (ND). A zárójelben levő értékek a 40 000 daltonos alegység elméleti aminosav összetételét jelentik, amelyet a klónozott 40 000 daltonos alegység szekvencia analíziséből következtetett fehérje primer szerkezete alapján állapítottunk meg.
A fentiekben leírt eljárást vázlatosan a 13. és 14. ábrán tüntetjük fel.
Az emésztett 40 000 daltonos alegység triptikus peptid térképét a 15. ábrán tüntetjük fel. A peptideket lineáris acetonitril gradiens szerint eluáljuk. A szekvenciáit csúcsokat frakciószámaik szerint számozzuk. Ezeknek a peptideknek az aminosav szekvenciáját az
5. táblázatban tüntetjük fel.
Az intakt 40 000 daltonos alegység valamennyi tartományából sok triptikus peptidet nyertünk ki (5. táblázat). Az N-terminális hexapeptidet (60. sz. frakció) magas kitermeléssel nyerjük. A karboxi-terminális peptidet (72. frakció) az előre jelzett C-terminális peptid teljes hosszával nyertük, bár az utolsó két aminosavat szekvenciálással pozitívan nem igazoltuk. Ez valószínűleg annak a ténynek tudható be, hogy a Cis és Ser maradék pontosan nem mutatható ki, különösen ha a peptid végén jelentkezik. A cDNS szekvenciából négy Asn-hez kapcsolódó szénhidrát hely jelenlétére lehet következtetni. Két fenti helyet tartalmazó két peptidet szekvenciáltunk. A 196-208 peptid (70. sz. frakció) szekvenci ál ása esetén a 200 maradékon csúcsot nem mutattunk ki, és ez azt jelzi, hogy ez az Asn (a cDNS alapján) ténylegesen glikozilezett. A 103-108 peptid (52. sz. frakció) a 103 maradékon Asn-t eredményezett. Ez a hely ezért nem glikozilezett.
Az 55. sz. frakció fenil-izotiocianát (TTH) szekvencia analízisében [Hewick és tsai: J. Bioi. Chem. 256; 7990 (1981)] a 148. sz. maradéknak megfelelő helyzetben ismeretlen csúcs látható. Előrejelzés szerint ez a hely egy Cys maradék, amely általában szekvencia analízissel nem mutatható ki, kivéve, ha módosított.
A fenti PVDF transzfer eljárást a CLMF második 50 pg-os aliqout részén megismételjük (lásd: a fenti eljárás 13. és 14. ábrája). A blottozott 40 000 daltonos alegységet azonban a Staphylococcus aureus V8 protease (Endoproteinase Glu-C, Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) proteolitikus enzimmel fragmentáljuk. A membrán darabokat 20 pg V8 segítségével 6 órán át 37 ’C-on emésztjük. A peptideket 88 térfogat/térfogat%-os hangyasavval extraháljuk és fázisszétválasztó oszlopon (2x150 mm, C8 S3, Queensferry, Anglia, UK) szétválasztjuk (16. ábra). A peptideket lineáris acetonitril gradiens szerint eluáljuk. A csúcsokat szekvenciájuk és frakciószámaik szerint számozzuk. A fenti peptidek aminosav frekvenciáját a 6. táblázatban adjuk meg.
5. táblázat
PVDF triptikus 40 kDa CLMF peptidek
Frakciószám Maradék szám N-terminális szekvencia
52 103-108 N-K-T-F-L-R
55 139-157 G-S-S-D-P-Q-G- V-T-*-G-A-A-T-L- S-A-E-R
55 és 57 267-279(7) V-F-T-D-K-T-S-A- T-V-I-7-R
57 52-58 T-L-T-I-Q-V-K
57 218-228 N-L-Q-L-K-P-L- K-N-S-R
60 1-6 I-W-E-L-K-K
67 288-7 A-Q-D-R-Y-Y-S- S-
67 85-102(7) K-E-D-G-I-W-S-T- D-I-L-K-D-Q-K- E-P-
70 196-208 L-K-Y-E-7-Y-T-S- S-F-F-I-(R?)
71 85-96 (?)-K-E-D-G-l-7- S-T-D-I-L-K
72 288-306(7) A-Q-D-R-Y-Y-S- S-S-W-E-7-A-S-V- P-7-7
78 71-85 (G?)-G-E-V-L-S- H-S-L-L-L-(L?)- H-K-K
6. táblázat
PVDF V8 (Glu-C) 40 kDa peptidek
Frakciószám Maradék szám N-terminális szekvencia
47 1-3 I-W-E
54 4-12 L-K-K-D-V-Y-V- V-E
HU 211 879 A9
Frakciószám Maradék szám Ν-terminális szekvencia
57 13-22 L-D-W-Y-P-D-A- P-G-E
57 45-59 V-L-G-S-G-K-T- L-T-I-Q-V-K-(E?)
A 4 peptidet tartalmazó 3 fő peptid csúcsot (47., 54. és 57. frakció) szekvenciáljuk. Mind a négy peptid a 40 kDa alegység amino-terminális tartományából származik, és ez azt jelzi, hogy a fehérje N-terminusa V8 emésztéssel szemben a legérzékenyebb.
A 17. ábrán a CLMF 40 000 daltonos alegysége fehérje szerkezet meghatározását foglaljuk össze.
CLMF 35 000 daltonos alegysége amino-terminális szekvenciájának közvetlen meghatározása A 39. Mono Q frakció (lásd 3. ábra) redukáló (beta-merkapto-etanol jelenlétében) és nemredukáló (beta-merkapto-etanol nélkül) körülmények között végzett SDS-PAGE analízise azt mutatja, hogy a 40 000 dalton molekulatömegű „szennyezés” a „szabad” 40 000 daltonos CLMF alegység (azaz a 35 000 dalton alegységgel nincs asszociálva). Ez a következtetés abból a tényből vonható le, hogy redukció nélkül (18. ábra, B pálya) főként a 75 000 daltonos CLMF van jelen, kevés 40 000 daltonos fehérjével együtt. Redukció után (18. ábra, C pálya) a 75 000 daltonos CLMF eltűnik, a 35 000 daltonos alegység és feldúsított 40 000 daltonos sáv keletkezése közben.
Az előző Mono Q kromatográfia 39. frakcióját 4 M karbamid jelenlétében 5% beta-merkapto-etanolban redukáljuk, és 5 percen át 95 ’C-on hevítjük. A mintát dúsító módszer fehasználásával Vydac Cl8 oszlopra szivattyúzzuk át és az oszlopot 5 ml 0,1%os trifluor-ecetsavval mossuk. A fehérjék eluálását 0-70%-os acetonitril gradiens szerint 0,1% trifluorecetsavban 5 órán át végezzük (19. ábra). A fluoreszcamin-pozitívnak talált frakciók fehérje tisztaságát SDS-PAGE segítségével, nemredukáló körülmények között határozzuk meg. A gélt a fehérjék láthatóvá tétele céljából ezüsttel színezzük (20. ábra). A 112117. ábra 35 000 molekulatömegnél 95%-nál nagyobb tisztaságú diffúz sávot mutat. A 40 000 daltonos alegység és a 39. frakcióban jelenlevő többi fehérje a C-l 8 oszlophoz marad kötve. Ezeket a fehérjéket (beleértve a 40 000 daltonos alegységet) végül 42% hangyasavat és 40% 1-propanolt tartalmazó oldattal eluáljuk.
A homogén 35 000 alegység előállíthatósága a CLMF fehérje alacsony molekulatömegű alegysége aminosav összetételének meghatározását és részleges szekvencia analízisét teszi lehetővé. Kb. 1 gg 35 kDa alegységet hidrolízisnek vetünk alá, és aminosav összetételét meghatározzuk (7. ábra). A prolim, ciszteint és triptofánt nem határozzuk meg (ND).
7. táblázat
Aminosav Mól%
Aszparaginsav vagy aszparaginn 10,9
Treonin 6,7
Szerin 8,3
Glutaminsav vagy glutaminn 14,9
Prolin ND
Glicin 6,1
Alanin 7,7
Cisztein ND
Valin 6,3
Metionin 2,9
Izoleucin 4,5
Leucin 10,9
Tirozin 3,2
Fenil-alanin 4,4
Hisztidin 2,3
Lizin 5,6
Arginin 5,5
Triptofán ND
Az amino-terminális szekvencia meghatározását
100 pmól C-l8 tisztított 35 kDa alegységen automatizált Edman lebontással kíséreltük meg. Az első 20 ciklusból nyert adatok a fentiekben leírt redukcióból nyert szekvenciát igazolták. A 21-26 aminosavon kívül továbbá egy második aminosavat is kaptunk. Az eredményeket az alábbiakban foglaljuk össze:
Ciklus 1 2 3 4 5 6 7
Ami- nosav ? N L P V A T
Ciklus 8 9 10 11 12 13 14
Ami- nosav P D P G M F P
Ciklus 15 16 17 18 19 20 21
Ami- nosav 7 L H H S Q N
Ciklus 22 23 24 25 26
Ami- nosav L L R A V
A fentiekből következően a 35 000 dalton alegység amino-terminális szekvenciája a következőképpen foglalható össze:
000 dalton alegység:
10
NH2-?-Asn-Leu-Pro-Val-Ala-Thr-Pro-Asp-Pro-Gl y-Met15 20 25 26
Phe-Pro-?-Leu-His-His-Ser-Gln-Asn-Leu-Leu-ArgAla-Val ahol ? a nem meghatározott maradékot jelenti.
CLMF triptikus fragmense szekvenciájának meghatározása
A CLMF előzetes tisztításából származó 36. és 37. Mono Q frakciót összegyűjtjük (kb. 100 pmól/1,7 ml).
HU 211 879 A9
Egy 30 μΐ mintát eltávolítunk, és a maradék térfogatát hélium áramban 200 μΐ-re csökkentjük. Ezután 100 μΐ 0,1 M ammónium-hidrogénkarbonátot adunk hozzá, majd 37 ’C-on 20 órán át 2:1 tömeg/tömeg szubsztrátum:enzim arány mellett tripszines (Worthington Biochemical Corp., Freehold, NJ) hasítást végzünk. A kapott peptid fragmenseket redukáljuk és karboximetilezzük. Ezt 160 μΐ 0,1 M Tris-HCl, pH 8,5/6 M guanidinhidroklorid hozzáadásával végezzük el. A térfogatot hélium-áramban 200 μΐ-re csökkentjük, és 4 μΐ ditiotreitet (50 mg/ml) adunk hozzá. Az elegyet 37 ’C-on 4 órán át inkubáljuk. A diszulfid kötések reduktív hasítása után (14C)jód-ecetsavat (4 pmól) adunk hozzá, és a kapott oldatot sötétben szobahőmérsékleten 10 percen át inkubáljuk.
A kapott peptid fragmenseket S-5 120 Angstrom ODS oszlopon (2,6x50 mm, YMC, Inc., Morris Plains, NJ) fordított fázisú HPLC segítségével izoláljuk (21. példa). A peptideket 1-propanol-gradiens szerint, 0,9 M ecetsavban oly módon eluáljuk, hogy a pH-t 4,0 értékre állítjuk be. A 46. frakcióban talált peptid aminosav frekvenciája a következő: Asp-üe-Ile-Lys-Pro-AspPro-Pro-Lys (automatizált Edman lebontással meghatározva).
CLMF belső aminosav frekvencia szegmenseinek meghatározása
CLMF-t a korábbiakban leírt módon tisztítunk. Kb. 80 pg fehérjét 10% triklór-ecetsavval kicsapunk. A csapadékot szobahőmérsékleten 70 térfogat/térfogat%os vizes hangyasavban oldjuk. Ezután a metionin maradékokra vonatkoztatva kb. 50-szeres moláris fölöslegben kis térfogat 70%-os hangyasavban cianogénbromidot (CNBr) adunk hozzá, keverés közben, majd az elegyet sötétben oxigénmentes héliumatmoszférában szobahőmérsékleten 48 órán át inkubáljuk. Az elegyet 15 térfogat vízzel hígítjuk, 2 egyenlő részre osztjuk, és hélium áramban szárítjuk. A sav és a melléktermékek teljes eltávolítása céljából a szárítást további mennyiségű víz hozzáadása után megismételjük.
A fragmentált CLMF egyik részletét (kb. 40 pg) 4% beta-merkapto-etanolt tartalmazó 50μ1 Laemmli mintapufferben [Laemmli, Natúré 227: 680-685 (1970)] oldjuk, majd 6 percen át 105 ’C-on hőkezeljük. A mintát 17,5% poliakrilamidot tartalmazó minigélt (1,0 mm vastag) magábanfoglaló 3 mélyedésbe töltjük, és Laemmli szerint (supra) elektroforézisnek vetjük alá.
A géleket elektroforézis után transzfer pufferben (10 mM 3-ciklohexilamino-l-propánszulfonsav, 10% metanol, pH 11,0) 30 percen át áztatjuk. Ezalatt az idő alatt egy polivinilidén-difluorid (PVDF) membránt (Immobilon, Millipore, Bedford, MA) 100%-os metanollal öblítünk, és transzfer pufferben szárítunk. A két PVDF membránréteggel megerősített és szűrőpapír rétegek közé helyezett gélt ezután 30 percen keresztül transzfer pufferben 0,5 Amp mellett elektroeluáljuk. A PVDF membránt ionmentesített vízzel 5 percen át mossuk, és 0,1% Coomassie Blue R-250 színezékkel 50%-os metanolban megfestjük, majd a színezéket szobahőmérsékleten 50%-os metanolban 10%-os ecetsavval 5-10 percen át eltávolítjuk. Számos elkenődött sávot figyeltünk meg (lásd 22B ábra).
A membrán 5 tartományát a CNBr által emésztett CLMF-t tartalmazó utolsó három pályán keresztül kivágjuk. Ezeket a tartományokat szekvenciáljuk. A CLMF CNBr-fragmenseiből kapott szekvenciák összefoglalását a 22A ábrán tüntetjük fel.
A CLMF fragmens 2. részletét (kb. 40 pg) 6M guanidin-hidrokloridot, 0,1 M Tris/HCl-t, 0,5 M nátrium-hidroxidot tartalmazó kb. 400-500 pl 88%-os hangyasavban (pH 8,0) oldjuk. A pH-t hangyasavval 4-re állítjuk be. A peptid fragmenseket fordított fázisú HPLC segítségével (23. ábra) Vydac C4 oszlopon (4,6x20 mm, The Sep/a/ra/tions Group, Hesperia, CA) izoláljuk. A peptideket 4,5 órán át lineáris acetonitril gradiens szerint 0,1% trifluor-ecetsavval eluáljuk. Az egyik csúcsot szekvenciáljuk, e peptid aminosav szekvenciája az alábbi:
Frakció, szám N-Terminálís szekvencia
47 V-D-A-V-H-K-L-K-Y-E-7-Y- T-S-(S?)
-F-F-I-R-D-I-I-K-P-
(A 40 kDa alegység 190 sz. maradékánál kezdődik.)
Feltételezzük vagy ismert, hogy a fenti szekvenciát egy Met maradék előzi meg. A „?”-által jelzett maradék a „legjobban előrejelzett” maradékot jelenti.
CLMF és 40 000 daltonos alegységének tisztítása, affinitás kromatográfia felhasználásával Az affinitáskromatográfia gyantát oly módon készítjük el, hogy az alábbiakban ismertetett módon előállított monoklonális 7B2 antitestet aktivált agarózhoz kapcsolunk. Hasonlóképpen, az alábbiakban leírt tisztítást oly módon hajtjuk végre, hogy az antitestet kovalensen kovasavhoz vagy vékony mikroporózus membránokhoz kötjük. Az aktivált agarózt a következőképpen állítjuk elő:
1. 100 ml Sepharose CL-6B-t 3x100 ml vízzel mosunk.
2. 100 ml 1%-os vizes nátrium-metaperjodát oldatot a gyantához adunk, és a szuszpenziót szobahőmérsékleten 60 percen át rázatjuk.
3. A gyantát hideg vízzel alaposan mossuk.
A 7B2-nek az aktivált agarózhoz történő kovalens kapcsolását a következőképpen hajtjuk végre:
1. 9 ml a fentiek szerint előállított aktivált agarózt foszfátpufferezett sóoldatban (pH 7,4) 7,2 ml 7B2ben (kb. 3,9 mg/ml) szuszpendálunk.
2. A gélszuszpenzióhoz 50,2 mg ciano-bórhidridet adunk, és a gélszuszpenziót egy éjjelen át 4 ’C-on rázatjuk.
3. A gélszuszpenziót szűrjük, és 50,2 mg ciano-bórhidridet tartalmazó 7 ml (1,0 M) etanolaminhoz (7,0) adjuk.
pl fentiekben leírt gyantát (kb. 2,6 mg IgG/ml gél) egy oszlopra töltünk, és foszfátpufferezett sóoldattal alaposan mossuk. A Mono Q kromatográfiából szár17
HU 211 879 A9 mazó, a 75 kDa CLMF-t tartalmazó fehérjét és további fő szennyező fehérjéket tartalmazó frakciókat összegyűjtjük (kb. 3,5xl06 U TGF aktivitás) és PBS-sel szemben alaposan dializáljuk. A kapott készítményt szobahőmérsékleten 5 ml/óra sebességgel 7B2-Sepharose oszlopra visszük fel. Az oszlopot foszfátpufferezett sóoldattal (pH 7,4) addig mossuk, amíg 280 nm mellett nyomon követve bázisvonal abszorpció jelentkezik. A megkötött fehérjéket 0,2 n ecetsavval, 0,5 M nátrium-klorid (pH kb. 3), eluáljuk. A frakciók aliquot részeit TGF aktivitásra vizsgáljuk. A savas eluátumban a kiindulási aktivitás kb. 76%-a található.
A fehérjetisztaságot redukció nélkül SDS-PAGE segítségével [Laemmli, Natúré 227: 68-685 (1970)] 10% gél felhasználásával határozzuk meg. A géleket a fehérje láthatóvá tétele céljából ezüsttel megfestjük [Morrissey, Anal. Biochem. 117: 307-310 (1981)]. A savas eluens tiszta CLMF-t és a CLMF „szabad” nem asszociált 40 kDa alegységét tartalmazza (24. ábra).
A CLMF pl-ének meghatározása
Az összegyűjtött Mono Q 36. és 37. frakciót (lásd
3. ábra) előreöntött amfolin PAGplate gélre [pH 3,59,5 (Pharmacia LKB Biotechnology)] visszük fel, a CLMF pl-ének meghatározása céljából. Standard pl markerek alapján 4,8 pl mellett egy fősávot és pl 5,2 mellett egy melléksávot találtunk. A pH meghatározás alapján e sávok pl értéke 4,2, illetve 4,6.
Tisztított CLMF biológiai aktivitása
A tisztított CLMF a T-sejtnövekedés faktor tesztben humán pHA-aktivált limfoblasztok burjánzását gátolja (8. ábra). A Mono Q oszlopról nyert tisztított CLMF a T-sejtnövekedés faktor aktivitását 5 különálló kísérletben standard humán limfokinek hatékonyságával hasonlítjuk össze; a tisztított CLMF fajlagos aktivitása 8,5±0,9xl07 egység/mg fehérje. Egy kísérletben difenil HPLC-ről kapott tisztított CLMF hatását TGF tesztben a standard limfokin készítmény aktivitásával összehasonlítva 5,2xl07 egység/mg fehérje fajlagos aktivitást találtunk. Szuboptimális koncentrációjú tisztított CLMF és humán rIL-2 teszt során vizsgálva additív burjánzást találtunk (8. ábra), egészen a rIL-2 által önmagában előidézett maximális burjánzásig. A rIL-2 által okozott burjánzás azonban a CLMF által előidézett burjánzástól megkülönböztethető, minthogy semlegesítő kecske anti-humán IL-2 antiszérum jelenléte az előzőt teljesen gátolja, az utóbbit azonban nem befolyásolja.
A tisztított CLMF citotoxikus effektor sejteket aktiváló képességét 4 napos LAK-sejt indukciós teszttel és egyéjszakás NK-sejt aktiválási teszttel vizsgáljuk. Az LCI teszt során a tisztított CLMF még 800 egység/ml koncentrációban is csupán kis aktivitást mutat IL-2 nélkül (9. ábra). A CLMF azonban kis koncentrációjú humán rIL-2-el szinergista kölcsönhatásba lép, és LAK-sejt indukciót okoz, mivel a két citokin jelenlétében előidézett lítikus aktivitás lényegesen nagyobb, mint a bármelyik citokint önmagában tartalmazó tenyészetekben megfigyelt lítikus aktivitások összege (9.
ábra). A tisztított CLMF rIL-2 jelenlétében már 3 egység/ml koncentrációban is hatékony.
8. táblázat
Tisztított humán CLMF stimulálja a humán PHA-aktivált limfoblasztok burjánzását
Hozzáadott citokin PHA-aktivált limfoblasztok
Kísérlet Humán CLMF (μ/ml) Humán rlL2 (μ/ml) által beépített 3H timidin átlagos cpm+1 átlagos szórás
1’ 0 0 10,6071596
500 0 70,05811,630
100 0 60,37711,927
20 0 36,0181321
4 0 24,9961669
0,8 0 17,7651790
2b 0 0 9,9761374
200 0 60,98011,713
50 0 38,8171884
12,5 0 18,88512,132
3,1 0 13,6481731
0 16 80,04115,835
0 4 21,28211,145
0 1 11,2411898
50 4 62,05012,408
12,5 4 40,62812,196
3,1 4 31,14413,754
a az 1. kísérletben valamennyi tenyészet kecske antihumán rIL-2-t tartalmaz.
b a 2. kísérletben egyetlen tenyészet sem tartalmaz kecske anti-humán rIL-2-t.
c Mono Q FPLC-ből nyert tisztított humán CLMF.
9. táblázat
A tisztított humán CLMF humán rIL-2-vel limfokin aktivált Killer (LAK) sejtek képződése közben 4 napos tenyészetekben szinergizmust mutat
Hozzáadott citokin Specifikus 51Cr felszabadulás ,%
Humán CLMF* (μ/nü) Humán rlL2 (μ/ml) K562-ből Raji-ból
0 0 311,7 -110,5
800 0 710,3 110,1
200 0 511,1 110,4
50 0 413,0 010,9
0 5 1012,4 2±O,8
800 5 4114,0 1110,8
200 5 4211,9 1110,3
50 5 3612,7 910,8
HU 211 879 A9
Hozzáadott citokin Specifikus 51Cr felszabadulás a, %
Humán CLMFh (μ/ml) Humán rlL2 (μ/ml) K562-ből Raji-ból
12,5 5 28+2,1 7±O,7
3,1 5 19±0,8 5+0,3
0,8 5 14±1,2 3±O,8
a Az értékek 4 ismétléses meghatározás átlagértékét ±1 szórás jelentik. A spontán 51Cr felszabadulási érték 16%, illetve 14%.
b Mono Q FPLC-ből nyert tisztított humán CLMF.
A 4 napos LAK indukciós teszt során nyert eredményekkel ellentétben, a tisztított CLMF önmagában a humán NK-sejtek aktiválásában az egy éjszakás teszt során önmagában hatékony (10. ábra). Ennél a tesztnél a CLMF már 1,6 egység/ml koncentrációban aktív. A CLMF-t humán rIL-2-vel kombinálva a teszt azt mutatja, hogy a két citokin az NK aktivitás elősegítésében legjobb esetben is additív hatást mutat (10. táblázat).
10. táblázat
A tisztított humán CLMF egy éjszakás tenyészetekben a természetes killer (NK) sejteket aktiválja
Hozzáadott citokin Specifikus 51Cr felszabadulása,%
Raji sejtekből, az alábbi effektor/cél arány mellett
Humán CLMF** (μ/ml) Humán rlL2 (μ/ml) 20/1 5/1
0 0 10+0,6 5±0,4
40 0 31 ±0,4 14±0,5
8 0 23±2,1 12±0,4
1,6 0 15±0,3 10±0,6
0,3 0 12±1,2 9±0,2
0 1 13±0,4 6+0,5
40 1 33±2,0 17±0,5
8 1 26±0,8 13±1,9
1,6 1 19±1,1 11±2,1
0,3 1 16±l,0 10±l,5
0 5 20±l,3 13±0,6
40 5 23±2,0 12±1,5
8 5 29±1,1 16±0,7
1,6 5 27±1,2 13±0,8
0,3 5 24±1,8 13±1,2
0 25 38±1,4 19±0,7
a Mindegyik érték 4 párhuzamos meghatározás átlagértékét ±1 szórás jelenti. A spontán 5,Cr felszabadulás 9%.
b Mono Q FPLC-ből származó tisztított humán CLMF.
A CLMF a nemspecifikus NK/LAK-sejtek lítikus aktivitását növelő hatásán kívül in vitro a specifikus humán citolitikus T limfocita (CTL) válaszokat is elősegíti. A CLMF növeli a specifikus allogén CTL-nek gyengén immunogén gamma-besugárzott HT144 melanoma sejtekre adott válaszát (11. ábra). A CLMF alacsony koncentrációjú rIL-2-el kombinálva megkönnyíti a specifikus allogén humán CTL-nek UV-besugárzott HT144 melanoma sejtekre adott reagálását, amely citokinek hozzáadása nélkül kimutatható CTL választ nem idéz elő (11. ábra). A fenti kísérletek során képezett citolitikus effektor sejtek specifikusságát oly módon bizonyítjuk, hogy ezek a sejtek a 5lCr-jelzett HT144 melanoma sejtek jelentős lízisét idézik elő, azonban a K562 sejtek esetében lízist csak kismértékben vagy egyáltalán nem okoznak. Ezzel szemben, a fenti kísérletben alacsony sűrűségű limfocitáknak rlL2-vel hidrokortizon távollétében történő inkubálásával képezett LAK-sejtek a K562 sejteket sokkal nagyobb mértékben lizálják, mint a HT144 melanoma sejteket. A fenti tesztek során képezett citolitikus effekor sejtek specifikusságának és azonosításának további részleteit all. táblázatban ismertetjük [Gately és tsai: J. Immunoi. 136: 1274-1282(1986)].
11. táblázat
Tisztított humán CLMF elősegíti az allogén melanoma sejtekre adott in vitro specifikus humán citolitikus T limfocita választ
Tenyészetben levő Specifikus 51Cr felszabadulás, %
Lim- focita Hid- ro- korti- zon Me- lano- ma rll^2 1. kísérletből 2. kísérletből
(Per- coll- frak- ciób) (M) sej- tekc (μ/ml) (μ/ml) HT14 4 K562 HT14 4 K562
4 ΙΟ-4 6±3 -4+1 -2±2 3±4
4 10*4 7,5 10 -3±1 -1±1 -5±1 4±1
4 10-4 HTUV 0±2 -3±1 -2±2 2±1
4 10-4 HTUV 10 7±2 -1±1 13±3 -4+1
4 10-4 HTUV 7,5 5±1 3±1 1±3 3±3
4 10-4 HTUV 7,5 10 2O±3 10±l 27±9 -6±1
4 105 HTy 17±3 -4±1 10±l 3±1
4 10'5 HRy 10 39±3 -2±2 33±6 5±3
1+2 15 33±4 67±3 19±1 47±1
a Mindkét kísérletben a duplikátum tenyészetek tartalmát összegyűjtjük, mossuk, 1,2 ml TCM-ben újraszuszpendáljuk, és a lítikus aktivitást hígítás nélkül és 1:0,5 hígításban meghatározzuk. Az 1. kísérletnél feltüntetett adatokat a citolitikus tesztben 1:1 arányú limfocita hígítással kaptuk, ami kb. 4:1 limfocita:cél aránynak felel meg. A 2. kísérletnél csak abban az esetben tapasztaltunk szignifikáns lízist, amikor a limfocitákat hígítás nélkül adtuk a lítikus elegyhez; ezeket az adatokat a táblázatban tüntetjük
HU 211 879 A9 fel. Az 1. és 2. kísérletben a 5lCr felszabadulás a
HT144 sejtekből 25%, illetve 31%, míg az 1. és 2. kísérletben K562-re 18%, illetve 27%.
b A Percoll 4 frakció a 45 és 58%-os Percoll réteg között levő határfelületről kinyert sűrűségű limfocitákat tartalmaz, míg az 1+2 Percoll frakció a 35% és 38% rétegek közötti határfelületről, illetve a 38% és 41% közötti határfelületről izolált alacsony sűrűségű limfocitákat tatalmaz. A 4. Percoll frakció CTL prekurzorokat tartalmaz, azonban csak kevés LAK prekurzort foglal magában; másrészről az 1:2 frakció LAK sejtprekurzorokban gazdag. CHTUV és HTy UV besugárzott, illetve gamma-besugárzott HT144 melanoma sejteket képvisel.
Eredményeink azt mutatják, hogy a tisztított humán
CLMF önmagában az aktivált humán T-limfociták burjánzását okozza, humán NK-sejtek citolitikus aktivitását elősegíti, és a humán CTL válaszokat növeli. Ezek a CLMF aktivitások - amelyek az IL-2 hatásaihoz hasonlóak - arra utalnak, hogy a CLMF - az IL-2-höz hasonlóan - in vivő egyetlen gyógyászati hatóanyagként alkalmazva immunorendszert segítő és tumorellenes hatásokat mutat. A CLMF továbbá várhatóan az NK/LAK-sejtek és aktivált T-sejtek (pl. tumor beszűrődő limfocitákból leszármaztatható sejtek) növekedését in vitro serkenti [Topalian és tsai: J. Immunoi. 142: 3714-3725 (1989)]. A tisztított CLMF továbbá kis koncentrációjú rIL-2 hatását szinergizálva humán LAK-sejtek képződését idézi elő a tenyészetben, és rIL-2-el additíven vagy szinergetikusan in vitro specifikus CTL válaszokat elősegíti. Ennek alapján feltételezhető, hogy a CLMF rIL-2-vel kombinálva optimálisabb tumorellenes hatással rendelkezik.
cDNS kódolása a humán CLMF 40 kDa alegysége számára
1. poliA+RNS sejttenyészete és izolálása
NC 37 sejteket (98 al-klón) forgó üvegekben a fentiekben leírt módon tenyésztünk, és 15,5 órán át PMA-val és kalcium-ionofórral indukálunk. A sejteket összegyűjtjük, és ily módon kb. 5,25xpoliA+RNS-t 108 sejtet tartalmazó fagyasztott sejtpelletet kapunk. A tenyésztést a táptalaj egy részével 3 napon át folytatjuk, ekkor a CLMF aktivitás bioteszt, titere 2200 egység/ml, ami azt jelzi, hogy az RNS izolálása céljából összegyűjtött sejtek ténylegesen CLMF aktivitást termeltek. A teljes RNS-t a fagyasztott sejtekből standard módszerekkel izoláljuk, és a poliA+RNS-t affinitás kromatográfiával nyerjük. A poliA+RNS kitermelése 2,5 tömeg/tömeg%, a betáplált RNS teljes mennyiségéhez viszonyítva.
2. A cDNS könyvtár megalkotása pg fenti poliA+RNS-t cDNS-be fordítottan átírunk, primerként 150 ng véletlen hexamereket alkalmazva. Egy könyvtárat hozunk létre lambda gt 10-ben, és screenelés céljából l,5xl05 kiónt amplifikálunk.
3. PCR felhasználása a 40 kDa CLMF alegység
CDNS számára specifikus DNS minta képzéséhez
A tisztított 40 kDa fehérje N-terminális szekvenciája
IWELKKDVYVVELDWYPDAP... Standard módszerekkel két prímért tervezünk és szintetizálunk, vegyes primer PCR-ben történő felhasználásra. A fenti szekvenciában az ELKKD aminosavaknak megfelelő kódoló szálként az elülső prímért tervezzük, amely e szekvencia összes lehetséges kodonját tartalmazza, és 5' végén egy EcoRI helyet és három további bázist hozzáadó stabilitást magábanfoglaló kiterjesztést tartalmaz. Az elülső primer szekvenciája tehát 5' ctc gaa ttc gaa/g c/ttn aaa/g aaa/g ga, azaz egy 23mer 64 különböző szekvenciával. A fordított prímért ugyanilyen módon tervezzük, amely a parciális N-terminális 40 kDa szekvenciában az YPDAP aminosav szekvenciának megfelelő antiérzékelő szálat jelenti. Ennek megfelelően a fordított primer szekvenciája 5' ctc gaa ttc ngg ngc a/gtc ngg a/gta, és ez egy 256 különböző szekvenciát tartalmazó 24mer. Az n szimbólum a lehetséges a, g, c vagy t bázisok bármelyikét jelenti. A primerek tehát hosszúságban 72 bázispár egy amplikonját definiálják. Alklónozás céljából EcoRI segítségével összetapadó végek kialakítása közben történő hasítás után az amplikon nagysága 64 bázispárra csökken. A PCR-ben történő felhasználás céljából a fenti 2. szakaszban leírtak szerint egyelenszálas cDNS-t képezünk, indukált sejtekből származó poli+RNS felhasználásával; kontrollként nem indukált sejtek szolgálnak. A fenti cDNS-ek bármelyikéből 40 ng-t elülső és fordított primerekkel 100 μΐ 10 mM Tris-HCl-al pH 8,3/50 mM KCl/1,5 mM MgCl2/0,01% zselatint ampfilikálunk; minden printerre 4 nukleotid/10 egység Taq-polimeráz/250 pmól alkalmazásával. A PCR paraméterek az alábbiak: kezdeti denaturálás 95%-on 7 percen át. Alacsony sűrűségű anneálást végzünk 2 percen át 37 ’C-on történő hűtéssel, 2 percen keresztül 37 ’C-on végzett inkubálással, 2,5 órán át 72 ’C-on történő melegítéssel, 1,5 percen át 72 ’C-on történő kezeléssel, 95 ’C-on 1 percen át végzett hevítéssel és 95 ’C-on 1 percen keresztül végzett denaturálással; ezt az alacsony sűrűségű anneálási ciklust egyszer megismételjük. Ezután 30 standard ciklust futtatunk le a következőképpen: 95 ’C-on 1 percen át, 55 ’C-on 2 percen keresztül, 72 ’C-on 2 percen át. A végső kiterjesztést 72 ’C-on 10 percen át végezzük. Az összes minták 10%-át 4%-os agaróz gélen futtatjuk, megfestjük, és megelemezzük. A várt nagyságú amplikon csak abban a mintában mutatható ki, amelyben az indukált cDNS ampfilikálódott. A minta maradék részét fenollal extraháljuk, etanolos kicsapással betöményítjük, és 42 plvízben újra oldjuk. A mintát 50 μΐ térfogatban 60 egység restrikciós EcoRI enzimmel 37 ’C-on 2 órán át emésztjük. A mintát ezután 6%-os poliakrilamid gélen futtatjuk, a 64 bp amplikont a gélből kivágjuk, és standard módszerekkel eluáljuk. A DNS amplikont standard módszerekkel (Stratagene, La Jolla, CA) a bluescript SK+plazmid EcoRI helyébe alklónozzuk. Az E.coli DH5 törzs (az ATCC-től szerezhető be) transzformálásából kapott telepeket összegyűjtjük, és a 64 bp inzert jelenlétére elemezzük (Bluescript SK+plazmidokkal kompatibilis más E.coli törzsek is felhasználhatók: A klónozott amplikon szekvenciájának meghatározásához két lehetséges jelöltet szekvenciálunk. A fenti analízisből kitűnik, hogy a helyes fragmenst amplifikáltuk, minthogy a következ20
HU 211 879 A9 tetett aminosav szekvencia pontosan a tisztított 40 kDa fehérje részleges aminoterminális aminosav szekvenciájának felel meg. Az 54 bp hosszúságú oligonukleotid minta megtervezéséhez utólag ezt az információt használtuk; a cDNS könyvtár screenelésére ez a minta szolgál. Két oligot tervezünk az alábbi szekvenciával: 5' gag cta aag aaa gat gtt tat gtc gta gaa ttc gat és 5' agg ggc atc cgg ata cca atc caa ttc tac gac ata. Ez a két oligo részlegesen komplementer az alábbi szerkezet képzéséhez:
5' gagctaaagaaagatgtttatgtcgtagaattggat 3'
3' atacagcatcttaacctaaccataggcctacgggga 5'
Ezt a szerkezetet Klenow fragmens felhasználásával jelölhetjük meg, és a jelzett nukleotidek (pl. magas fajlagos aktivitású minták) képződnek a cDNS könyvtárak sreeneléséhez.
4. CDNS könyvtárak screenelése
Amplifikált könyvtárból összesen 3X1O5 kiónt sreenelünk 6 kettősszűrőn az alábbi körülmények között: 50 ml 5xSSC/10xDenhardt/100 pg/ml denaturált borjú thymus DNS/20% formamid/0,1 % SDS/l,5xl06cpm jelzett 54 mer 37 ’C-on 16 órán át. A szűrőket 42 ’C-on 30 percen át utólag 2xSSC-vel mossuk, majd röntgenfilm hatásának tesszük ki. Intenzifikáló szűrőn egy éjszakán át végzett kezelés után 16 lehetséges pozitivet gyűjtünk össze, és ezeket egy második screenelési menetben tovább elemezzük. 10 rehibridizáló fágot izolálunk, és a DNS-üket elkészítjük. Ebből a 10 izolátumból 8 azonosnak tűnik, EcoRI hasítással két fragmenst (hosszúság 0,8 kb és 0,6 kb) felszabadítva, ami lehetséges belső EcoRI jeleket jelez. Biot és a screenelő mintával történő hibridizálás után csak a 0,6 kb fragmens mutat hibridizálást. A két fragmenst a fentiekben leírt módon a Bluescript SK+plazmid EcoRI helyébe alklónozzuk, és teljesen szekvenciáljuk. Az analízis azt mutatja, hogy mindkét fragmens egy mintegy 1,4 kb hosszúságú összefüggő cDNS-hez csatlakozik, minthogy fordításkor mindkét fragmens a tisztított 40 kDa fehérjéből ténylegesen izolált triciklikus peptideket kódoló olvasó keretek jelenlétét mutatja. A 40 kDa alegység teljes szekvenciáját - a cDNS-ből következett módon - a 25. ábrán tüntetjük fel. A cDNS 328 aminosav nyitott olvasókeretét kódolja. A fehéije a kiinduló Metél kezdődik, amelyet 21 aminosav követ, és ez klasszikus hidrofób szignál peptidnek felel meg. Az érett tisztított 40 kDa alegység N-terminusa - azaz IWELKKD... - azonnal a szignál szekvencia után következik. Az érett fehérje tehát 306 aminosavból áll. A következtetett fehéije szekvencia 4 lehetséges N-kapcsolódó glikozilező helyet tartalmaz, amelyek közül 2 az izolált és szekvenciáit triptikus peptidekben van jelen. E két hely közül az egyiket használjuk fel in vivő a szénhidrát oldallánc kapcsolására. Az érett glikozilátlan fehéije molekulatömege 34 699, a pl érték 5,24. A megfelelő mRNS hossza 2,4 kb és csak indukált sejtekből származó RNS Northern blotjában mutatható ki.
Humán CLMF 35 kDa alegységét kódoló cDNS klónozása
A sejttenyésztést, a mRNS izolálását és a cDNS könyvtár kialakítását a fentiekben a 40 kDa alegység klónozása kapcsán leírtak szerint végezzük el.
Vegyes primer PCR felhasználása a 35 kDa alegység cDNS számára specifikus DNS minta képzése céljából
A tisztított 35 kDa alegység részleges N-terminális szekvenciája
7NLPVATPDPGMFP7LHHSQNLLRAV... Vegyes primer PCR-ben történő felhasználásra két prímért standard módszerekkel készítünk. Az elülső prímért a fenti szekvenciában levő DPGMF aminosavaknak megfelelő kódoló szálként tervezünk, amely a szekvencia összes kodonját tartalmazza, és az 5' végén egy EcoRI helyet és 3 további bázis additív stabilitást magában foglaló kiterjesztést tartalmaz. Ennek megfelelően ezen elülső primer szekvenciája 5' CTC GAA TTC GAT/C CCN GGN ATG TT -3', azaz egy 23 mer, 32 különböző szekvenciával. A fordított prímért ugyanilyen módon tervezzük, amely a részleges N-terminális szekvenciában levő NLLRA aminosavaknak megfelelő antiérzékelő szálat jelenti. Ezen fordított primer 5' szekvenciája 5' CTC GAA TTC NGC NCG/T NAA/G NAA/G A/GTT, azaz egy 24 mer 4096 különböző szekvenciával. Mindkét primer szekvenciában N mind a 4 bázist jelenti. A két prímért tehát 69 bázis hosszúságú amplikonként definiáljuk. Alklónozás céljából EcoRI segítségével tapadó végek kialakításához vezető vágáskor az amplicon nagysága 61 fázisra csökken. Kb. 3 gg humán genom DNS-t elülső és fordított primerekkel amplifikáljuk 50 gl 10 mM Tris-HCl-ben pH 8,3/50 mM KCl/1,5 mM MgClj/O.Oiyo zselatin/200gM, a 4 nukleotid mindegyikére/2,5 egység Taq polimeráz/64 pmól elülső és 2048 pmól fordított primer (a két primer nagymértékben eltérő komplexicitásának kompenzálása céljából). Alacsony sűrűségű anneálást oly módon végzünk el, hogy 2 percen át 32 ’C-ra hűtjük, 37 ’C-on 2 percen át inkubáljuk, 72 ‘C-on 2,5 percen át hevítjük, 72 ’C-on 1,5 percen át kiterjesztjük, 1 percen keresztül 95 ’C-ra melegítjük, és 95 ’C-on 1 percig denaturáljuk: ezt az alacsony sűrűségű anneáló ciklust egyszer megismételjük. Ezután 40 standard ciklust a következőképpen futtatunk le: 95 ’Con 1 percen át, 55 ’C-on 2 percen kérészül és 72 ’C-on 3 percen át. A végső kiterjesztést 72 ’C-on 10 percen át végezzük. A minták kb. 20%-át 6%-os poliakrilamid gélen futtatjuk, és a várt nagyságú amplicont etidiumbromiddal végzett színezés után mutatjuk ki. A maradék mintákat fenollal extraháljuk, etanolos lecsapással betöményítjük, és 17 gl vízben újraoldjuk. A mintát 20 egység EcoRI enzimmel 20 gl-ben 60 percen át 37 ’Con emésztjük. A mintát ezután 8%-os poliakrilamid gélen frakcionáljuk, a 61 bázispár amplicont a gélből kivágjuk, és standard módszerekkel eluáljuk. A DNS amplicont Bluescript plazmid SK+(Stratagene, La Jolla, CA) EcoRI helyére standard eljárásokkal klónozzuk. Az E.coli DH5 törzs transzformálásakor kapott telepeket a 61 bázispár inzert jelenlétére elemezzük. Az alklónozott amplicon szekvenciájának meghatározása céljából két jelöltet szekvenciálunk. A két klón
HU 211 879 A9 közül az egyik tartalmazza a helyes szekvenciát, minthogy e szekvencia lefordítása a tisztított fehérjéből várt aminosav szekvenciát eredményez. A fenti információ alapján két szintetikus oligonukleotidet tervezünk, amelyek szekvenciája az alábbi:
5' gatccgggaatgttcccatgccttcaccactccc 3'
3' gtacggaagtggtgagggttttggaggatgcccga 5'
Az ilyen szekvencia Klenow fragmenssel radiojelzett nukleotidek felhasználásával jelezhető, és könyvtárscreeneléshez nagyon nagymértékben specifikus aktivitás érhető el.
cDNS könyvtár screenelése
Az amplifikált 16 órás könyvtárból összesen 106 kiónt 40 kétszeres szűrőn a fenti mintával az alábbi körülmények között screenelünk: 400 ml 5xSSC/20% formamid/10xDenhardt/100 pg/ml denaturált borjú thymus DNS/0,1% SDS/3,8xlO7 cpm jelzett minta, 37 ’C-on egy éjjelen át. A szűrőket ezután 40 ’C-on SSC-vel kétszer mossuk, és egy éjjelen át szűrővel röntgenfilm hatásának tesszük ki. A screenelés első fordulójából 6 potenciális pozitivet választunk ki, és egy második fordulóban a fentiekben leírt módon plakk hibridizálásra analizáljuk. A végső analízishez 1 kiónt választunk ki. Fág DNS készítése során azt találtuk, hogy a klón két EcoRI fragmenst tartalmaz, amelyeknek a nagysága mintegy 0,8 kb és 0,3 kb. A két fragmenst külön Bluescript SK+plazmidba alklónozzuk, és szekvenciáljuk. Az analízis azt mutatja, hogy a két fragmens a természetben előforduló belső EcoRI hellyel mintegy 1,1 kb összhosszúságban összefüggő szekvenciát képez. A cDNS teljes szekvenciáját és a 35 kDa CLMF alegységre következtetett aminosav szekvenciát a 26. ábrán tüntetjük fel. A cDNS 219 aminosav nyitott leolvasó keretét kódolja, amely az 1 helyzetben a kezdő Met-tel indul. A következő 21 aminosav klasszikus hidrofób szignál szekvenciát képez. Az érett 35 kDa fehérje N-terminusa azonnal a szignál peptidet követően a RNLPVAT... szekvenciával kezdődik. A tisztított 35 kDa fehérje a 7NLPVAT... szekvenciát adja. Az érett 35 kDa fehérje tehát 197 aminosavból áll, amelyek három lehetséges N-kötődő glikozilezési helyetés 7 Cys-maradékot tartalmaznak. Az érett nem-glikozilezett fehérje molekulatömeg 22 513, és a pl érték 6,09. A megfelelő mRNS 1,4 kb hosszúságú, és csak olyan sejtekből származó RNS-ben mutatható ki, amelyeket legalább 6 órán át CLMF-re indukáltunk.
Biológiailag aktív rekombináns CLMF kifejezése
COS-sejtekben
A CLMF két alegységét emlős sejtekben történő kifejezésre a következőképpen alkotjuk meg:
kDa alegység
A 40 kDa CLMF alegység teljes hosszúságú cDNS-ét képező két E.coRl fragmenst a pBC 12-höz hasonló kifejező vektorhoz [B. Cullen, Meth. Enzymology 152; 684-703 (1987)] ligáljuk, azzal az eltéréssel, hogy a cDNS kifejezést az SV40 korai prootor/elősegítőből eltávolítjuk. A két inzertet egymáshoz viszonyítva megfelelő orientációban tartalmazó kiónokat a belső E.coli helyeket a 40 kDa cDNS-ben áthidaló szintetikus oligonukleotidekkel végzett telephibridizálással kiválasztjuk. Az oligonukleotid szerkezete a következő: 5' CTG AAG CCA TTA AAG AAT TCT CGG CAG GTG 3'. Ezt a standard módszerek segítségével kinázolással jelezzük. A kiónokat a polimeráz láncreakció eljárással az inzert vektor helyes orientációjára elemezzük, elülső primerként az SV40 korai promotorban levő szekvenciák számára egy specifikus prímért alkalmazunk, és fordított primerként a 851-868 sz. helyzetekben levő 40 kDa cDNS szekvenciának megfelelő oligonukleotidet használunk. A helyes orientációjú kiónok adják a 885 bp PCR amplikont. A tesztelt 20 kiónból 8 az előre várt fragmenst adja, és további vizsgálatokhoz 1 kiónt választunk ki.
kDa alegység
A 35 kDa alegység számára szolgáló teljes hosszúságú cDNS-t az eredeti lambda fágból PCR által amplifikáljuk, a lambda gtlO-ben levő EcoRI helytől balra és jobbra elhelyezkedő primerek felhasználásával (a primerek a New England Biolab Articles 1231 és 1232 sz. termékei). A kapott TCR amplikont tompa végű ligálással a Bluescript SK+plazmid EcoRV helyébe illesztjük, és a DNS-t szaporítjuk. A DNS szekvenciálása azt mutatja, hogy a cDNS inzert orientációja a plazmidon belül olyan, hogy a mRNS 5' végének megfelelő cDNS végződés a polilinkerben a Clal helyhez közel helyezkedik el. Az inzertet Clal segítségével történő vágással felszabadítjuk, ezt a végződést T4 DNS polimerázzal kitöltjük, és szekunder módon Nőt I-el vágjuk. A kapott fragmentet géltisztításnak vetjük alá, és Bluescript vektor alapú és SV40 korai promotort tartalmazó kifejező vektorba alklónozzuk, az inzert cDNS kifejezésének kihajtása céljából. A kifejező plazmidban felhasznált helyek a cDNS 5' végén a tompavégű PstI hely és a cDNS 3' végén a Nőt I hely. A szerkezet PCR segítségével történő meghatározása után további vizsgálatokhoz egy kiónt választunk ki, a korábbiakban a 40 kDa szerkezettel kapcsolatban leírtak szerint.
Két cDNS kifejezése COS-sejtekben
A 40 kDa és 35 kDa alegység kifejezésére szolgáló DNS-t 6 cm átmérőjű csészéken COS-sejtekbe (ATCCtől szerezzük be) illesztünk be, a DEAE dextrán transzfekciós eljárással (7X105 sejt/csésze; 1 μΐ DNS/csésze); az eljárást Culler írta le [Meth. Enzymology 752; 684 (1987)]. A transzfekció után 24 órával a sejteket standard szövettenyészet táptalajhoz adjuk, amely magzati szarvasmarha szérum helyett 1% Nutridomát tartalmaz. A felülúszókat 40 óra múlva összegyűjtjük, és 0,45 μ szűrőn átszűrjük.
A 35 kDa CLMF alegységet vagy a 40 kDa CLMF alegységet kódoló cDNS-el vagy mindkét cDNS-el transzfektált COS sejttenyészetek felülúszó folyadékát a T sejtnövekedés faktor teszt segítségével CLMF aktivitásra vizsgáljuk (13. táblázat). A táblázatból kitűnik,
HU 211 879 A9 hogy a csak az egyik alegység cDNS-el transzfektált COS-sejtek nem bocsájtanak biológiailag aktív CLMF-t a tenyészet folyadékba. A mindkét cDNS alegységgel transzfektált COS-sejtek azonban biológiailag aktív CLM-t termelnek. A kétszeresen transzfektált COS-sejtekből származó tenyészetfolyadékkal indukált limfoblaszt burjánzás mennyiségét a tisztított NC-37-származék CLMF által indukált buijánzás mennyiségével összehasonlítva a tenyészfolyadék CLMF aktivitás koncentrációja várhatóan 374 egység/ml. A fajlagos aktivitást 8xl07 egység/mg CLMF fehérje értéknek feltételezve a fenti eredmény arra utal, hogy a kétszeresen transzfektált COS-sejtek tenyészetéből származó folyadék kb. 4,7 mg/ml rekombináns CLMF-t tartalmaz.
13. táblázat
Rekombináns CLMF T sejtnövekedés faktor aktivitása, COS-sejtekben kifejezve
Hozzáadott citokin Koncentráció PHA-aktivált limfoblasztok által beépített 3H-timidin (átlag cpm+szórás)
14,5871343
Természetes CLMF* 200 egység/ml 79,8481854
Természetes CLMF 40 egység/ml 59,09312029
Természetes CLMF 8 egység/ml 39,180+545
Természetes CLMF 1,6 egység/ml 25,9961763
Alábbi módon fertőzött COS-sejtek tenyészetéből nyert felülúszó folyadék
35 kDa CLMF alegység cDNS 1/5 hígítás 15,3321797
35 kDa CLMF alegység cDNS 1/25 hígítás 12,149+379
40 kDa CLMF alegység cDNS 1/5 hígítás 14,883+1039
40 kDa CLMF alegység cDNS 1/25 hígítás 13,8891110
35 kDa+40 kDa CLMF alegység cDNS 1/5 hígítás 66,2281166
35 kDa+40 kDa CLMF alegység cDNS 1/25 hígítás 47,8731275
látszat transzfektált 1/5 hígítás 14,368+628
Látszat transzfektált 1/25 hígítás 14,4261173
* Mono Q FPLC-ből nyert tisztított NC-37 származék CLMF.
Anti-CLMF hibridómák és antitestek
Anti-CLMF hibridómák előállítása, jellemzése és tisztítása
Lewis patkányokat (Charles River Laboratories, Wilmington, MA) először azonos térfogatú Freund-féle teljes adjuvánssal (Gibco) összekevert részlegesen tisztított CLMF-el intraperitoneálisan (i. p.) megfertőztünk. A patkányokba a 14. példában megadott séma szerint emlékeztető immunizálást fecskendezünk, Freund-féle nem teljes adjuvánssal (Gibco) összekevert CLMF felhasználásával. Aktivált lépsejtek készítése céljából egy patkányba a sejtfúzió előtti 4. naptól kezdődően két egymásutáni napon részlegesen tisztított CLMF-t fecskendezünk intravénásán (i. v.) - lásd 14. táblázat A lépsejteket ebből a patkányból izoláljuk és NSO-sejtekkel [Galfre és tsai: Meth. Enzymol. 73:
3-46(1981)] fuzionáljuk 1:1 arányban (lépsejtek: NSO sejtek) 35%-os polietilénglikollal (PEG 4000, E. Merck). Fúziós partnerként a hibridóma sejt fúzióban NSO sejtek helyett más sejtek is felhasználhatók. A fúzionált sejteket 48 mélyedéses csészékben 5X104 sejt/mélyedés/ml sűrűségben 15% magzati szarvasmarha szérummal (FBS), glutaminnal (2 mM), beta-merkapto-etanollal (0,1 mM), gentamicinnel (50 gg/ml), HEPES-el (10 mM) és 15% P 388 Dl sejt felülúszóval (a P 388 Dl sejtek az ATCC-től szerezhetők be) kiegészített IMDM-ben [Iscove és tsai: J. Exp. Med. 147: 923-933 (1978)] szélesztjük. A hibridóma felülúszókat specifikus CLMF antitestekre 4 teszttel viszgáljuk:
1. i25I-jelzett CLMF immunolecsapása;
2. CLMF bioaktivitás immunolegyengítése;
3. CLMF Western biot; és
4. 125I-CLMF PHA-aktivált PBL blaszt sejtekhez történő kötődésének gátlása.
Az anti-CLMF antitesteket kiválasztó hibridóma sejtvonalakat határhígítással klónozzuk. Az antitesteket nagy mennyiségben gyártott hibridóma tenyészetekből vagy aszcitikus folyadékokból térhálósított agarózhoz kötött G fehérjén végzett aktivitás kromatografálással, a gyártó előírásai szerint tisztítjuk (Gammabind G, Genex, Gaithersburg. MD).
14. táblázat Immunizálási model
Dátum CLMF (108 egység/mg) Összfe- hérje Fajlagos aktivitás Tiszta- ság
egység pg (pg) (E/mg) (%)
3/28/89 lxlO4 0,1 15 6.7X105 6,7
4/10/89 l,2xl04 0,1 ? 6xlO5 0,6
5/3/89 1. véreztetés
5/18/89 2.2Χ105 2 75 2,9xl06 2,9
6/7/89 2. véreztetés
6/29/89 6,3x104 0,63 83 7,5x105 0,75
7/21/89 l,2xl05 1,2 24 5xl06 5,0
8/2/89 3. véreztetés
HU 211 879 A9
Dátum CLMF(108egy- ség/mg) Összfe- hérje Fajlagos aktivitás Tiszta- ság
10/19/89 2,lxlO6 (i.v.)
10/20/89 2,lxlO6 (i.v.)
10/23/89 Fúzió
CLMF-re specifikus monoklonális antitestek izolálása és azonosítása
Részlegesen tisztított CLMF-el (14. táblázat) és semlegesített CLMF bioakti vitással (5 egység/ml; a meghatározást a 27. ábra szerinti TGF teszttel végezzük el) immunizált patkány 3. véreztetéséből szérumot izolálunk. A semlegesítést fölös mennyiségű CLMF (200 egység/ml) hozzáadásával blokkolhatjuk, ami azt igazolja, hogy az antiszérum által történő semlegesítés CLMF-re specifikus (27. ábra). A normál patkányszérum a CLMF bioaktivitást nem semlegesíti (27. ábra). Ebből a patkányból izolált lépsejteket NSO sejtekkel fúzionálunk, és a kapott hibridómákat l25I-jelzett CLMF immunokicsapásával CLMF-specifikus antitestekre kezdeti screenelésnek vetjük alá.
A radiojódozott részlegesen tisztított CLMF készítmény túlnyomórészt CLMF 75 kDa heterodimert, kis mennyiségben szabad CLMF 40 kDa alegységet és két továbi kb. 92 kDa és 25 kDa fehérjét tartalmaz (28. ábra). A 125I-jelzett CLMF készítmény TGF teszt szerint CLMF bioaktivitását megtartotta, és ez azt igazolja, hogy a jelzési eljárás a CLMF molekula konfigurációját szignifikánsan nem változtatta meg. A CLMF immunizált patkányszérum a 75 kDa heterodimert és a szabad 40 kDa alegységet immunológiailag kicsapja (28. ábra 6. és 8. pálya), míg a normál patkány szérum ezeket a radiojelzett fehérjéket immunológiailag nem csapja le (28. ábra 7. és 9. pálya). Négy egyedi monoklonális antitest a 75 kDa heterodimert és a szabad 40 kDa alegységet immunológiailag szintén lecsapja (28. ábra), a 92 kDa vagy 25 kDa jelzett fehérjéket azonban nem. Az immunolecsapásos teszt 20 hibridómát azonosított, amelyek anti-CLMF antitesteket választanak ki (15. ábra). Valamennyi antitest SDS-PAGE és autoradiográfiai meghatározások szerint a radiojelzett 75 kDa heterodimert és a szabad 40 kDa alegységet immunológiailag kicsapja (4 reprezentatív antitestre vonatkozó adatokat a 28. ábrán tüntetjük fel).
15. táblázat
Monoklonális anti-CLMF antitestek (40 kDa alegység specifikus)
Antitest Western Biot 125,. CLMF/Receptor teszt (%-os gátlás) Bioaktivitás semlegesíté- se
Red. N. R.
Gátló/Semlegesítő
7B2 - + 95 +
2A3 - + 99 +
Antitest Western Biot «25,. Bioaktivitás
1B8 - +/- CLMP/Re- ceptor teszt (%-os gátiá^ semlegesílé- se ND
1C1 - + 81 ND
4A1 - + 98 +
4C8 ND ND 68 ND
4D1 - + 100 ND
6A2 - +/- 75 ND
7A1 +/- + 94 ND
8A1 - + 99 ND
8A2 - + 83 ND
9C8 - + 62 ND
22E7 + + 91 ND
Nemgátló/Nemsemlegesítő
8E3 + + 35 -
9F5 + + 18 ND
4A6 - - 17 ND
6A3 - + 20 -
8C4 - + 33 ND
8E4 - + 1 ND
39B3 ND ND 46 ND
Kontroll - - 12 -
1: Western biot: N.R. a nem-redukált és Red. redukált SDS-PAGE-t jelenti. A Western biot során 5% 75 kDa heterodimert és 95% szabad 40 kDa alegységet tartalmazó CLMF mintát 10% SDS-PAGE-n szétválasztunk, és a leírt módszerek szerint Western blot-okat készítünk. Az értékelést az alábbi skála szerint végezzük: erősen pozitív (++), pozitív (+), gyengén pozitív (+/-) és negatív (-).
2: CLMF megkötő teszt: Egy antitestet akkor tekintünk gátló jellegűnek, ha a radiojelzett CLMF-nek a PHA-aktivált PBL blasztokhoz való kötődése több mint 60%-át blokkolja.
3: A CLMF bioaktivitás semlegesítését TGF teszt segítségével értékeljük. Egy antitestet akkor tekintünk semlegesítő jellegűnek, ha 200 gg/ml mellett a burjánzás több mint 50%-át blokkolja. Az eredmények értékelése: pozitív (+) vagy negatív (-).
4: ND = nem határoztuk meg.
A specifikus CLMF antitesteknek az immunolecsapásos tesztben történő kezdeti azonosítása után megvizsgáljuk az antitestek CLMF bioaktivitás immunogyengítő képességét, a TGF- és LAK-sejt indukciós teszt segítségével. Emelkedő mennyiségű CLMF a TGF teszt szerint a PBL blasztok burjánzásának dózis24
HU 211 879 A9 tói függő növekedését idézi elő; ezt a 3H-timidinnek osztódó blaszt sejtekbe történő beépülésével mérjük (29. ábra). A CLMF aktivitás immobilizált anti-CLMF antitestek által történő immunogyengítése dózistól függő módon játszódik le (29. ábra). Hibridóma felülúszó oldat aliqout részei (0,4 és 0,1 ml) a tenyészetközegből 50 és 200 egység/ml CLMF aktivitást teljesen legyengítenek. A felülúszó oldat 0,025 ml-e 50 egység/ml-t teljesen legyengít, 200 egység/ml-nek azonban csak a kb. 50%-át gyengíti le. A hibridóma felülúszó 0,0062 ml-e 50 és 200 egység/ml CLMF még kisebb legyengítését mutatja. Egy anti-IL-1 receptor antitest felülúszó oldat a CLMF bioaktivitás immunogyengítését egyáltalán nem mutatja.
Emelkedő mennyiségű CLMF a célsejtek LAK-sejtek által történő lízisének dózisfüggő növekedését okozza; ezt a LAK-sejt indukció mikrotesztben 51Cr felszabadulása mérésével határozzuk meg (30. ábra). Az immobilizált anti-CLMF antitestek a LAK-sejt indukció teszt szerint a CLMF aktivitást dózistól függő módon szintén gyengítik (30. ábra). A fenti adatok igazolják, hogy a radiojelzett részlegesen tisztított CLMF készítményből a 75 kDa jelzett fehérjét immunológiailag lecsapó antitestek CLMF-re specifikusak. Az adatok ezenkívül bizonyítják, hogy a radiojelzett 75 kDa fehéqe felelős a CLMF bioaktivitásért.
Monoklonális antitestek meghatározására szolgáló módszerek
CLMF tisztítása és *25/-el történőjelzése
CLMF-t humán perifériás vér limfocitákból (PBL) vagy NC-37 sejtekből a korábbiakban leírt módon nyert sejt felülúszóból részlegesen tisztítunk. A részlegesen tisztított CLMF-t a jodogén módszer módosításával jelzünk 125I-el. Jodogént (Pierce Chemical Co.) kloroformban 0,5 mg/ml koncentrációban oldunk, és 12x75 boroszilikát üvegcsövekhez 0,1 ml-es aliquot részeket adunk. A kloroformot nitrogénáramban elpárologtatjuk, és a jodogént az üvegcsövek fenekének közepén megszárítjuk. A bevont csöveket szárítószekrényben szobahőmérsékleten vákuumban tároljuk. Radiojelzés céljából 0,5-1,0 mCi 125I-Na-t (Amersham) 0,50 ml Tris-jódozott puffért (25 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,4 M NaCl, 1 mM EDTA) tartalmazó jodogén bevont csőhöz adunk és 4 percen át szobahőmérsékleten inkubáljuk. Az aktivált 125I-oldatot 0,05-0,1 ml CLMF-t (kb. 5 pg 0,125 M NaCl-ban, 20 mM Tris-HCl pH 7,5) tartalmazó 1,5 ml-es csőbe viszünk át, és a reakcióelegyet további 8 percen át szobahőmérsékleten inkubáljuk. Az inkubálás befejezése után 0,05 ml jodogén stop puffért [10 mg/ml tirozin, 10% glicerin, Dulbecco-féle foszfáttal pufferolt sóoldatban (PBS), pH 7,4] adunk hozzá, és 30 másodpercen át reagáltatjuk. Az elegyet 1,0 ml Tris-jódozó pufferrel hígítjuk, és BioRad BioGel P10DG (BioRad Laboratories) sómentesítő kromatográfiás oszlopra visszük fel. Az oszlopot Tris-jódozó pufferrel eluáljuk, és a jelzett fehérje csúcsmennyiségét tartalmazó frakciókat (1 ml) egyesítjük, és Tris-jódozó pufferben 0,25% zselatinnal lxlO8 cpm/ml értékre hígítjuk. A TCA által lecsapható radioaktivitás (10% triklórecetsav végső koncentráció) tipikusan a teljes radioaktivitás 95%-nál nagyobb. A radiospecifikus aktivitás mértéke 6000-10 000 cpm/fmól.
CLMF immunogyengítése
Hibridóma tenyészet felülúszókat vagy tisztított monoklonális antitesteket CLMF gyengítő képességükre a következőképpen vizsgálunk. Kecske anti-patkány IgG agaróz szemcséket (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) 1% szarvasmarha szérum albuminnal (BSA) (Sigma) (PBS/BSA oldat) kiegészített 3x10 ml PBS-el (Gibco) mosunk. A szemcséket mosás után 50 térfogat/térfogat% végkoncentrációban PBS/BSA-ban újraszuszpendáljuk. A szuszpenzió aliquot részeit (0,2 ml) monoklonális antitestek vagy hibridóma felülúszó oldatok megjelölt mennyiségeivel együtt
1,5 ml-es Eppendorf csövekhez adjuk. Minden keverék térfogatát 0,1% magzati szarvasmarha szérumot (FBS), 10% Nutridoma-SP-t (Boethringer-Mannheim) és mM L-glutamint tartalmazó, a Dulbecco-féle táptalaj (IMDM) Iscove-féle módosítását képező hibridóma fenntartó táptalaj hozzáadásával 1,4 ml-re állítjuk be, és a keverékeket szobahőmérsékleten 2 órán át hematológiai-kémiai keverőn inkubáljuk. A csöveket inkubálás után Beckman 12 mikrofugán (1,5 perc, 5. beállítás) centrifugáljuk, és a felülúszókat elöntjük. A szemcséket PBS/BSA-al ismét 3x mossuk, majd 5% humán AB-szérumot és a megadott koncentrációban tisztított humán CLMF-t tartalmazó szövettenyészet táptalaj (TCM) 1 ml-ében újraszuszpendáljuk. A csöveket a keverőberendezésben egy éjjelen át 4 ’C-on inkubáljuk. Ezután a szemcséket a mikrofugában centrifugálással eltávolítjuk, és a kapott immunológiailag gyengített felülúszó oldat maradék CLMF aktivitását a TGF teszt vagy LAK-sejt indukció mikroteszt segítségével meghatározzuk.
Immunolecsapásos teszt
Az immunolecsapásos teszt során 0,05-0,5 ml hibridóma felülúszót, hígított antiszérumot vagy tisztított IgG-t 1,5 ml-es mikrofuga csövekhez adunk, amelyek 0,1 ml, agarózhoz kapcsolt 50%-os kecske-anti-patkány IgG-t tartalmaznak (Sigma Chemical Co.). A térfogatot 0,5 ml RIPA puffer segítségével (50 mM NaPO4, pH 7,5,150 mM NaCl 1% Triton-X 100,1% deoxikólsav, 0,1% SDS, 1% BSA és 5 mM EDTA) 0,5 mire állítjuk be, és az elegyet szobahőmérsékleten forgókeverőn 2 órán át inkubáljuk. A szemcséket 12 OOOxg mellett 1 percen át végzett centrifugálással pelletírozzuk, majd I25I-CLMF-t (lxlO6 cpm) tartalmazó RIPA pufferben (1 ml) újraszuszpendáljuk. Az elegyet ezután forgókeverőn 16 órán át 4 ‘C-on inkubáljuk. A szemcséket inkubálás után centrifugálással pelletírozzuk, és BSA nélkül RIPA-val 2x mossuk. A szemcséket ezután 0,125 M Tris-HCI-el (pH 6,8) és 10% glicerinnel egyszer mossuk. A szilárdfázisú antitestekhez kötött 125ICLMF-t 10 μΐ 2x mintapuffer (Laemmli, Supra) hozzáadásával - 5% beta-merkapto-etanollal és anélkül - és percen át 95 ’C-on történő hevítéssel felszabadítjuk. Az immunolecsapott l25I-CLMF-t 10% vagy 12% po25
HU 211 879 A9 liakrilamid gélen végzett SDS-PAGE segítségével analizáljuk, és auto-radiográfiával tesszük láthatóvá.
CLMF receptor megkötő teszt
Hibridóma felülúszó oldatok, tisztított IgG vagy antiszérum azon képességét, hogy 125I-CLMF-nek PHA aktivált humán T-limfoblasztokhoz történő kötődését meggátolja, a következőképpen mérjük: a tenyészet felülúszók, tisztított IgG vagy az antiszérum sorozathígításainak 0,1 ml-es aliqout részeit 125I-CLMF-t (lxlO3 cpm) tartalmazó megkötő puffer (RPMI-1640, 5% FBS, 25 mM HEPES pH 7,4, l25I-CLMF-t tartalmaz, lxlO5 cpm) 0,025 ml-es aliquot részeivel elegyítjük. A kapott elegyet orbitális rázóberendezésen szobahőmérsékleten 1 órán át inkubáljuk, majd minden csőhöz 0,025 ml aktivált blasztokat (5xl07 sejt/ml) adunk. Az elegyet szobahőmérsékleten további 1 órán át inkubáljuk. A nem-specifikus kötődést oly módon határozzuk meg, hogy a teszt során 10 nM jelzetlen CLMF-t adunk hozzá. Az inkubálásokat kétszeres vagy háromszoros ismétlésben végezzük el. A sejthez kötött radioaktivitást a szabad 123I-CLMF-től oly módon választjuk el, hogy a tesztek során kapott elegyeket 0,1 ml olajelegyben [Thomas Silicone 6428-R15: A. H. Thomas és Silicone Oil AR 200: Gallard-Schlessinger 1:2 arányú elegye] 4 ‘C-on 10 000 xg mellett 90 másodpercen át centrifugáljuk. A sejtpelletet tartalmazó részt kivágjuk, és a sejthez kötött radioaktivitást gammaszámlálóban meghatározzuk.
SDS poliakrilamid gél elektroforézis (SDS/PAGE) és Western Biot
Ummunológiailag lecsapott l25I-jelzett fehérjéket és részlegesen tisztított CLMF-t Laemmli mintapufferrel (2% SDS, 125 mM Tris-GCl, pH 6,8 10% glicerol, 0,025% brómfenol kék) 5% beta-merkapto-etanol jelenlétében és anélkül kezelünk, 95 ’C-on 3 percen át hevítünk, és 7,5%-os vagy 12%-os előreöntött gélen (BioRad Laboratories) SDS-PAGE által elválasztjuk. Az immunollecsapott 125I-jelzett fehérjék számára a géleket 25%-os izopropilalkoholban és 10%-os ecetsavban 0,2% Coomassie Brillant Blue színezékkel megfestjük, 10%-os metanolban és 10%-os ecetsavban. Színtelenítjük, szárítjuk, és autoradiográfiai elemzésnek vetjük alá. A Western biot céljából az SDS-PAGE által elválasztott fehérjéket nitrocellulóz membránra (0,2 μ) visszük át 16 órán keresztük, 100 V mellett (10 mM Trisz-HCL-ben pH 8,3, 76,8 mM glicin, 20% metanol és 0,01% SDS). A nitrocellulóz membránt 1 órán át 32 ‘C-on 3% zselatinban (Tris-HCl pH 7,5, 0,15 M NaCl) blokkoljuk, majd AB pufferrel (1% szarvasmarha szérum albumin, 50 mM nátrium-foszfát pH 6,5, 0,5 M NaCl, 0,05% Tween 20) hígított hiridóma felülúszó oldatokkal vagy tisztított antitestekkel 16 órán át 4 °C-on kezeljük. Ezután mosópufferrel (PBS, 0,05% Tween 20) mossuk, majd a nitrocellulóz csíkokat szobahőmérsékleten 2 órán át peroxidázzal (Boehringer Mannheim Biochemicals) kapcsolt AB-pufferben hígított kecske antipatkány IgG antitestekkel inkubáljuk. A nitrocellulóz membránt mosópufferrel mossuk, majd a megkötött antitestet szobahőmérsékleten 4-klór-l-naftollal (0,5 mg/ml 0,15% H2O2-ban, 0,5 M NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5) 30 percen át végzett inkubálással tesszük láthatóvá. A reakciót desztillált vízzel végzett alapos mosással állítjuk le.
A monoklonális antitestek által megkötött CLMF alegység azonosítása
A CLMF 40 kDa és 35 kDa alegységből álló 75 kDa heterodimer fehérje. Western biot analízissel határozzuk meg, hogy a monoklonális anti-CLMF-antitestek a 40 kDa vagy 35 kDa alegységeket felismerike. Nagymértékben tisztított 75 kDa CLMF heterodimert nemredukáló SDS-PAGE által szétválasztunk, és nitrocellulóz membránra visszük át (31. ábra). Ezenkívül, kb. 95% szabad 40 kDa alegységből éa 5% 75 kDa heterodimerből álló tisztított CLMF-t nemredukáló és redukáló SDS-PAGE segítségével szétválasztunk, és a fehérjéket nitrocellulóz membránra visszük át (32. ábra). A nemredukált 75 kDa CLMF heterodimert (31. ábra), a nemredukált 40 kDa alegységet (32. ábra, felső mező) és a redukált 40 kDa alegységet (32. ábra alsó mező) tartalmazó egyes nitrocellulóz csíkokat monoklonális anti-CLMF antitestekkel kontroll, monoklonális antitestekkel, patkány anti-CLMF szérummal és kontroll patkány szérummal vizsgáljuk. A monoklonális anti-CLMF és a patkány poliklonális anti-CLMF antitestek a nemredukált 75 kDa CLMF-t tartalmazó csíkokon a kb. 75 kDa heterodimerhez specifikusan kötődnek, míg a kontroll antitest készítmények ezt a specifikus aktivitást nem mutatják (31. ábra). Az összes monoklonális és patkány poliklonális anti-CLMF antitest a nemredukált 40 kDa alegységet felismeri (32. ábra felső mező). Azonban csak a patkány poliklonális antiszérum és a három monoklonális antitest (8E3, 9F5 és 22E7) kötődik a redukált 40 kDa alegység fehérjéhez (32. ábra alsó mező). A fenti adatokból látható, hogy az összes monoklonális antitest a CLMF 40 kDa alegységére specifikus.
CLMF receptor azonosítása PHA-aktivált limfoblasztokon
Az előzőek során közölt adatok igazolják, hogy a monoklonális anti-CLMF antitestek a 125I-jelzett CLMF-t immunológiailag kicsapják, a CLMF bioaktivitást immunológiailag gyengítik, és a CLMF 40 kDa alegységéhez kötődnek. A hibridóma felülúszó oldatokban levő antitestek azonban a TGF- vagy LAK-sejt indukció tesztekben CLMF bioaktivitást közömbösítő képességükre közvetlenül nem vizsgálhatók, minthogy a kontroll antitesteket tartalmazó felülúszó oldatok nemspecifikus gátló hatásokat mutatnak. Az IL-2 monoklonális antitestekkel végzett korábbi munkáink igazolták, hogy a ,25I-IL-2-nek a sejttartalmú IL-receptorhoz történő kötődését blokkoló antitestek az IL-2 bioaktivitást is semlegesítenék. Minthogy a receptor kötődési teszteket hibridóma felülúszó oldatok vagy más anyagok hozzáadása általában nem befolyásolja, az anti-CLMF antitestek gátló/semlegesítő aktivitásának meghatározására CLMF receptormegkötő tesztet
HU 211 879 A9 dolgoztunk ki. A CLMF receptor megkötő tesztet 125Ijelzett CLMF és PHA-aktivált perifériás vér limfoblasztok alkalmazásával alakítottuk ki (33. ábra). A125ICLMF-nek a pHA-aktivált limfoblasztokhoz történő kötődése telíthető és specifikus (33. ábra). Az egyensúlyi megkötő adatok Scatchard görbe függvény elemzése [See Scatchard; Ann. N.Y. Acad. Sci. 57; 660-672 (1949)] azt mutatja, hogy a l25I-CLMF-nek a receptorhoz történő kötődésének látszólagos disszociációs állandója kb. 200 pM és minden limfoblaszt kb. 700-800 receptort tartalmaz. Minthogy a CLMF által immunizált patkányból nyert szérum a CLMF bioaktivitását semlegesíti, megvizsgáltuk a l25I-CLMF limfoblasztokhoz történő kötődésének gátlását (24. ábra). A patkány immunszérum a 125I-jelzett CLMF kötődését kb. 1/500-szoros hígításban blokkolja, míg a kontroll patkányszérum ebben a hígításban gátlást egyáltalán nem mutat. A receptor kötődő teszt specifikussága segítségével a hibridóma felülúszó oldatokat olyan antitestek jelenlétére vizsgálunk, amelyek gátolnák a 125I-CLMF kötődését a limfoblasztokhoz.
A 125I-CLMF limfoblasztokhoz történő kötődése gátlásának mértékét minden hibridóma felülúszó oldat 1/2-szeres hígításánál határozzuk meg (35. ábra). 12 hibridóma oldat 60%-nál nagyobb mértékben gátolja a 125I-CLMF kötődését limfoblasztokhoz. A felülúszó oldatokban jelenlevő antitesteket mint gátló/semlegesítő antitesteket osztályozzuk. Hat hibridóma felülúszó oldat 40%-nál kisebb mértékben gátolja a 125I-jelzett CLMF kötődést, és ezeket nemgátló/nemsemlegesítő antitesteknek minősítjük. A kontroll antit 10%-kal gátolja ,25I-CLMF kötődését a limfoblasztokhoz.
Három gátló antitestet (7B2, 2A3 és 4A1) és két nemgátló antitestet (6A3 és 8E3) aszcitikus folyadékból fehérje G-affinitás kromatográfiával GammaBind G (Genex, Gaithersburg, MD) oszlopon tisztítunk. A 4A1, 2A3 és 7B2 antitestek dózistól függően gátolják a 125I-CLMF kötődését a limfoblasztokhoz, a megfelelő IC50 koncentráció 0,7 pg/ml, 7 pg/ml, illetve 9,5 pg/ml (36. ábra). A 6A3 és 8E3 antitestek 100 pg/ml koncentrációban nem gátolják a ,25I-CLMF kötődését (36. ábra). A fenti adatokból látható, hogy az egyes antitestek gátló vagy nemgátló csoportba történő besorolása helyes volt.
CLMF bioaktivitás közvetlen semlegesítése antitestek által
Annak meghatározása céljából, hogy a CLMF receptor megkötő teszt által gátlónak minősített antitestek a CLMF bioaktivitást közvetlenül semlegesítik-e, minden gátló antitest semlegesítő aktivitását a TGFteszt szerint meghatározzuk (16. táblázat). Két gátló antitest (4A1 és 7B2) 0,03-100 pg/ml koncentrációban a CLMF bioaktivitást dózistól függően semlegesíti (40 egység/ml), a megfelelő IC50 koncentráció 1 pg/ml, illetve 80 pg/ml. A fenti adatok igazolják, hogy a l25I-CLMF-nek a CLMF-receptorhoz történő kötődését gátló antitestek a CLMF bioaktivitást is semlegesítik.
16. táblázat
CLMF bioaktivitás közömbösítése monoklonális anti-CLMF által
Teszt-tartalom: Teljes 3Htimidin beépülés %-os semlegesítés6
CLMF8 Antitest**
- - 9923+439
CLMF - 25 752+592
CLMF 4A1
100 pg/ml 12 965+938 81
20 pg/ml 12 215±663 86
4 pg/ml 12 985+269 81
-8 pg/ml 19 932+1016 37
-16 pg/ml 22 379+410 21
-03 pg/ml 25 405+1093 2
CLMF 7B2
200 pg/ml 10 763+878 96
100 pg/ml 15 083+406 67
20 pg/ml 23 690+228 13
4 pg/ml 25 849+1408 0
CLMF Kontroll
200 pg/ml 27 654+1086 0
100 pg/ml 22 221+381 22
20 pg/ml 27 335+620 0
a A TGF tesztben tisztított CLMF-t 40 egység/ml koncentrációban alkalmazunk.
b Tisztított antitesteket a táblázatban megadott koncentrációban adunk hozzá.
c A 3H-timidin beépülésnek a hozzáadott citokinek nélkül tapasztalt szintre történő csökkenését 100%os semlegesítésnek tekintjük.
CLMF 35 000 dalton alegysége szintetikus peptid fragmense ellen irányított antitestek előállítása 35 kDa alegység NH2-terminál is szekvenciája 3-13 aminosavát és egy COOH-terminális ciszteint tartalmazó peptidet (L-P-V-A-T-P-D-P-G-M-F-C) szilárdfázisú peptid metodika segítségével szintetizálunk, HPLC segítségével tisztítunk, és metilezett szarvasmarha szérum albumin eljáráson keresztül tengeri tapadókagyló hemocianáttal konjugálunk. Két nyulat Freund-féle teljes adjuvánsban a konjugált peptiddel intradermálisan immunizálunk (300 pg peptid/nyúl). Az immunizálás után hat héttel a nyulaknak szabad peptiddel (100 pg, intravénásán) és PBS-ben oldott KLH-konjugált peptiddel (150 pg, szubkutáns úton) emlékeztető oltást adunk be. A 7 nappal később levett vérből szérummintákat készítünk. Az emlékeztető oltást és a vérmintavételt 4-5 hetenként megismételjük.
Minden nyúl első és második vérmintáját közvetlen ELISA teszt segítségével szintetikus peptidekkel való reakciókészségre vizsgáljuk. A szintetikus szabad peptidet mikrotiter lemezekre 5 ng/ml és 20 ng/ml vastag27
HU 211 879 A9 ságban felvisszük, a lemezeket szarvasmarha szérum albuminnal mossuk, és blokkoljuk. A szérummintákat különböző hígításokban teszteljük (17. táblázat) és az antitest reakcióképességet egy második antitest (HRPkonjugált kecske anti-nyúl IgG) felhasználásával mutatjuk ki, szubsztrátumként o-feniléndiamint alkalmazva. A reakciót kénsav hozzáadásával állítjuk le, majd az abszorpció értékeket 490 nm mellett olvassuk le. Az eredmények mindkét nyúlban a 35 000 dalton CLMF fehérje elleni antitest termelését mutatják (17. táblázat). Külön kísérletekben igazoltuk, hogy az antitest a pepiidre specifikus, minthogy (a) a nem-immunizált nyulakból nyert szérum a pepiiddel ELISA-ban nem reagál, (b) a szintetizált peptiddel immunizált nyulakból nyert szérumok a CLMF 40 000 daltonos alegységéből készített pepid fragmenssel nem reagálnak, és (c) a szérummintákból nyert tisztított IgG a szintetikus peptiddel is reagál.
Az egyik nyálból vett vérmintát (első véreztetés) Western biot analízisben 75 kDa CLMF-el és a 35 kDa CLMF alegységgel mutatott reakciókészségre vizsgáljuk (37. ábra). Részlegesen tisztított CLMF-t (kb. 120 gg/ml) SDS-PAGE-n futtatunk, nitrocellulózra viszünk át, és nyúl anti-CLMF peptid antiszérum 1:500 hígításával kezelünk. Biotinilezett kecske anti-nyúl IgG és alkálikus foszfatáz-konjugált streptavidin felhasználásával antitest reakciókészséget mutattunk ki. Azt találtuk, hogy az anti-CLMF peptid antitest mind a nemredukált 75 kDa CLMF fehérjével, mind a redukált 35 kDa CLMF alegységgel reagál (37. ábra).
Bár a jelen példában termelt valamennyi antitest poliklonális, a CLMF 35 kDa alegysége elleni monoklonális antitestek készítését hasonló megközelítéssel végezzük el. Patkányok immunizálására a jelen példában felhasznált szintetikus peptid vagy a 35 kDa CLMF alegység aminosavszekvenciája alapú más szintetikus peptidek alkalmazhatók (26. ábra). Fúziót végezhetünk el, és hibridóma tenyészeteket monoklonális anti-CLMF antitesek termelésére screenelhetünk a fentiekben leírt módon.
17. táblázat
CLMF 35 000 dalton alegységből nyert KIT-konjugált szintetikus peptidek ellen immunizált nyulakból levett szérumminták EL1SA elemzése
Szérum-for- rás Szérum hígítás A490 (szeres)
Nyúl Szám Vé- rezte- tés Szám
Sza- bad peptid lxlO4 2,5xlC 4 1,6x10 5 3,9x10 5
1 1 20 2,7 2,1 1,4 0,8 0,5
1 1 4 0,7 0,4 0,3 0,2 0,1
1 1 0 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05
1 2 20 2,5 1,8 1,1 0,6 0,3
1 2 4 0,9 0,6 0,4 0,2 0,1
1 2 0 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05
Szérum-for- rás Szérum hígítás A490 (szeres)
2 1 20 2,7 2,2 1,6 0,9 0,5
2 1 4 0,9 0,5 0,3 0,2 0,1
2 1 0 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05
2 2 20 2,2 1,5 1,0 0,5 0,3
2 2 4 0,7 0,4 0,2 0,1 0,1
2 2 0 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05
SZABADALMI IGÉNYPONTOK

Claims (53)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Citotoxikus limfocita érési faktor (CLMF) aktivitást tartalmazó fehérje lényegében tiszta formában, vagy e fehérje CLMF aktivitást kifejtő és a CLMF természetes formája aminosav-szekvenciájának legalább egy részét tartalmazó származéka.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti fehérje, azzal jellemezve, hogy a CLMF 75 kDa molekulatömegű természetes formája vagy annak biológiailag aktív fragmense.
  3. 3. Az 1. igénypont szerinti fehérje, azzal jellemezve, hogy a CLMF 75 kDa molekulatömegű természetes formája vagy annak biológiailag aktív fragmense, mimellett a 75 kDa CLMF polipeptid diszulfrd által öszszekapcsolt két alegységből - éspedig egy 35 kDa alegységből és egy 40 kDa alegységből áll.
  4. 4. Az 1. igénypont szerinti fehérje, azzal jellemezve, hogy Arg Asn Leu Pro Val Alá Thr Pro Asp Pro Gly MET Phe Pro Cys Leu His His Ser Gin Asn Leu Leu Arg Alá Val Ser Asn MET Leu Gin Lys Alá Arg Gin Thr Leu Glu Phe Tyr Pro Cys Thr Ser Glu Glu Ile Asp His Glu Asp Ile Thr Lys Asp Lys Thr Ser Thr Val Glu Alá Cys Leu Pro Leu Glu Leu Thr Lys Asn Glu Ser Cys Leu Asn Ser Arg Glu Thr Ser Phe Ile Thr Asn Gly Ser Cys Leu Alá Ser Arg Lys Thr Ser Phe MET MET Alá Leu Cys Leu Ser Ser Ile Tyr Glu Asp Leu Lys MET Tyr Gin Val Glu Phe Lys Thr MET Asn Alá Lys Leu Leu MET Asp Pro Lys Arg Gin Ile Phe Leu Asp Gin Asn MET Leu Alá Val Ile Asp Glu Leu MET Gin Alá Leu Asn Phe Asn Ser Glu Thr Val Pro Gin Lys Ser Ser Leu Glu Glu Pro Asp Phe Tyr Lys Thr Lys Ile Lys Leu Cys Ile Leu Leu His Alá Phe Arg Ile Arg Alá Val Thr Ile Asp Arg Val Thr Ser Tyr Leu Asn Alá Ser képletű aminosav-szekvenciát vagy annak alszekvenciáját tartalmazza, és adott esetben N-terminális Met-maradékot tartalmaz.
  5. 5. Az 1. igénypont szerinti fehérje, azzal jellemezve, hogy Ile Trp Glu Leu Lys Lys Asp Val Tyr Val Val Glu Leu Asp Trp Tyr Pro Asp Alá Pro Gly Glu MET Val Val Leu Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Gly Ile Thr Trp Thr Leu Asp Gin Ser Ser Glu Val Leu Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gin Val Lys Glu Phe Gly Asp Alá Gly Gin Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Val Leu Ser His Ser Leu Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp Ser Thr Asp Ile Leu Lys Asp Gin Lys Glu Pro Lys Asn Lys Thr Phe Leu Arg Cys Glu Alá Lys Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp Leu Thr Thr Ile Ser
    HU 211 879 A9
    Thr Asp Leu Thr Phe Ser Val Lys Ser Ser Arg Gly Ser Ser Asp Pro Gin Gly Val Thr Cys Gly Alá Alá Thr Leu Ser Alá Glu Arg Val Arg Gly Asp Asn Lys Glu Tyr Glu Tyr Ser Val Glu Cys Gin Glu Asp Ser Alá Cys Pro Alá Alá Glu Glu Ser Leu Pro Ile Glu Val MET Val Asp Alá Val His Lys Leu Lys Tyr Glu Asn Tyr Thr Ser Ser Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn Leu Gin Leu Lys Pro Leu Lys Asn Ser Arg Gin Val Glu Val Ser Trp Glu Tyr Pro Asp Thr Trp Ser Thr Pro His Ser iyr Phe Ser Leu Thr Phe Cys Val Gin Val Gin Gly Lys Ser Lys Arg Glu Lys Lys Asp Arg Val Phe Thr Asp Lys Thr Ser Alá Thr Val Ile Cys Arg Lys Asn Alá Ser Ile Ser Val Arg Alá Gin Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp Ser Glu Trp Alá Ser Val Pro Cys Ser képletű aminosav-szekvenciát vagy annak alszekvenciáját tartalmazza, és adott esetben N-terminális Met-maradékot tartalmaz.
  6. 6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti fehéijét kódoló izolált polinukleotid.
  7. 7. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti fehérjét kódoló izolált polinukleotid, azzal jellemezve, hogy a ATG TGT CAC CAG CAG TTG GTC ATC TCT TGG TTT TCC CTG GTT TTT CTG GCA TCT CCC CTC GTG GCC ATA TGG GAA CTG AAG AAA GAT GTT TAT GTC GTA GAA TTG GAT TGG TAT CCG GAT GCC CCT GGA GAA ATG GTG GTC CTC ACC TGT GAC ACC CCT GAA GAA GAT GGT ATC ACC TGG ACC TTG GAC CAG AGC AGT GAG GTC TTA GGC TCT GGC AAA ACC CTG ACC ATC CAA GTC AAA GAG TTT GGA GAT GCT GGC CAG TAC ACC TGT CAC AAA GGA GGC GAG GTT CTA AGC CAT TCG CTC CTG CTG CTT CAC AAA AAG GAA GAT GGA ATT TGG TCC ACT GAT ATT TTA AAG GAC CAG AAA GAA CCC AAA AAT AAG ACC TTT CTA AGA TGC GAG GCC AAG AAT TAT TCT GGA CGT TTC ACC TGC TGG TGG CTG ACG ACA ATC AGT ACT GAT TTG ACA TTC AGT GTC AAA AGC AGC AGA GGC TCT TCT GAC CCC CAA GGG GTG ACG TGC GGA GCT GCT ACA CTC TCT GCA GAG AGA GTC AGA GGG GAC AAC AAG GAG TAT GAG TAC TCA GTG GAG TGC CAG GAG GAC AGT GCC TGC CCA GCT GCT GAG GAG AGT CTG CCC ATT GAG GTC ATG GAT GAT GCC GTT CAC AAG CTC AAG TAT GAA AAC TAC ACC AGC AGC TTC TTC ATC AGG GAC ATC ATC AAA CCT GAC CCA CCC AAG AAC TTG CAG CTG AAG CCA TTA AAG AAT TCT CGG CAG GTG GAG GTC AGC TGG GAG TAC CCT GAC ACC TGG AGT ACT CCA CAT TCC TAC TTC TCC CTG ACA TTC TGC GTT CAG GTC CAG GGC AAG AGC AAG AGA GAA AAG AAA GAT AGA GTC TTC ACG GAC AAG ACC TCA GCC ACG GTC ATC TGC CGC AAA AAT GCC AGC ATT AGC GTG CGG GCC CAG GAC CGC TAC TAT AGC TCA TCT TGG AGC GAA TGG GCA TCT GTG CCC TGC AGT képletű nukleotid szekvenciát egészben vagy részben tartalmazza.
  8. 8. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti fehérjét kódoló izolált polinukleotid, azzal jellemezve, hogy a ATG TGT CCA GCG CGC AGC CTC CTC CTT GTG
    GCT ACC CTG GTC CTC CTG GAC CAC CTC AGT TTG GCC AGA AAC CTC CCC GTG GCC ACT CCA GAC CCA GGA ATG TTC CCA TGC CTT CAC CAC TCC CAA AAC CTG CTG AGG GCC GTC AGC AAC ATG CTC CAG AAG GCC AGA CAA ACT CTA GAA TTT TAC CCT TGC ACT TCT GAA GAG ATT GAT CAT GAA GAT ATC ACA AAA GAT AAA ACC AGC ACA GTG GAG GCC TGT TTA CCA TTG GAA TTA ACC AAG AAT GAG AGT TGC CTA AAT TCC AGA GAG ACC TCT TTC ATA ACT AAT GGG AGT TGC CTG GCC TCC AGA AAG ACC TCT TTT ATG ATG GCC CTG TGC CTT AGT AGT ATT TAT GAA GAC TTG AAG ATG TAC CAG GTG GAG TTC AAG ACC ATG AAT GCA AAG CTT CTG ATG GAT CCT AAG AGG CAG ATC TTT CTA GAT CAA AAC ATG CTG GCA GTT ATT GAT GAG CTG ATG CAG GCC CTG AAT TTC AAC AGT GAG ACT GTG CCA CAA AAA TCC TCC CTT GAA GAA CCG GAT TTT TAT AAA ACT AAA ATC AAG CTC TGC ATA CTT CTT CAT GCT TTC AGA ATT CGG GCA GTG ACT ATT GAC AGA GTG ACG AGC TAT CTG AAT GCT TCC képletű nukleotid szekvenciát egészben vagy részben tartalmazza
  9. 9. Rekombináns vektor, azzal jellemezve, hogy az
    1-5. igénypontok bármelyike szerinti fehéijét kódoló polinukleotidot tartalmaz.
  10. 10. Rekombináns vektor, azzal jellemezve, hogy az
    1—5. igénypontok bármelyike szerinti fehérjét kódoló, a 7. igénypontban ismertetett nukleotid szekvenciát egészben vagy részben magábanfoglaló polinukleotidot tartalmaz.
  11. 11. Rekombináns vektor, azzal jellemezve, hogy az
    1-5. igénypontok bármelyike szerinti fehérjét kódoló, a 8. igénypontban ismertetett nukleotid szekvenciát egészében vagy részben magábanfoglaló polinukleotidot tartalmaz.
  12. 12. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti fehérjét kódoló polinukleotidot tartalmazó rekombináns vektorral transzformált mikroorganizmus.
  13. 13. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti fehérjét kódoló, a 7. igénypontban megadott nukleotid szekvenciát egészében vagy részben magábanfoglaló polinukleotidot tartalmazó rekombináns vektorral transzformáit mikroorganizmus.
  14. 14. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti fehérjét kódoló, a 8. igénypontban megadott nukleotid szekvenciát egészében vagy részben magábanfoglaló polinukleotidot tartalmazó rekombináns vektorral transzformáit mikroorganizmus.
  15. 15. CLMF ellen irányított lényegében tiszta poliklonális vagy monoklonális antitest.
  16. 16. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti fehérje, mint tumorellenes hatóanyag.
  17. 17. Eljárás az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti fehérje előállítására, azzal jellemezve, hogy
    a) a fenti fehérjét kódoló polinukleotidot tartalmazó rekombináns vektorral transzformált mikroorganizmust valamely táptalajban a kódolt fehérje kifejezését biztosító körülmények között tenyésztünk; és
    b) a kifejezett fehérjét a tenyészettáptalajból kinyerjük.
    HU 211 879 A9
  18. 18. Eljárás az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti fehérjék előállítására, azzal jellemezve, hogy
    a) a fenti fehérje alegység-peptidjeit szokásos peptidszintézis módszerekkel ekészítjük;
    b) az alegység peptideket peptidkötések képződésének kedvező körülmények között kapcsoljuk.
  19. 19. Eljárás az 1. igénypont szerinti citotoxikus limfocita érési faktor (CLMF) lényegében tiszta formában történő előállítására, azzal jellemezve, hogy
    a) CLMF termelésére képes sejteket - pl. limfoblasztoid sejteket - oly módon stimulálunk, hogy a sejtek citokineket termelnek és a felülúszó folyadékba választanak ki;
    b) a stimulált sejtek által termelt felülúszó folyadékot összegyűjtjük;
    c) a felülúszó folyadékot fehérje frakciókra szétválasztjuk;
    d) mindegyik fehérje frakciót megfelelő teszt segítségével CLMF jelenlétére vizsgálunk;
    e) a CLMF-t tartalmazó fehérje frakciókat megtartjuk; és
    f) a kapott CLMF-tartalmú frakciókból a CLMF-t lényegében tiszta formában izoláljuk.
  20. 20. A 19. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy NC-37 limfoblasztoid sejteket alkalmazunk.
  21. 21. A 19. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a felülúszó folyadékot erős kationcserélő oszlop felhasználásával választjuk szét fehérje frakciókra.
  22. 22. A 19. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a felülúszó folyadékot szulfopropil kationcserélő gyanta felhasználásával választjuk szét fehérje frakciókra.
  23. 23. A 19. igénypont szerinti eljárás, amelynek során a felülúszó folyadékot erős kationcserélő oszlop felhasználásával választjuk szét a fehérje frakciókra, azzal jellemezve, hogy az alábbi lépéseket tartalmazza:
    a) a CLMF-tartalmú fehérje frakciókat agaróz mátrixhoz kovalensen kapcsolt Blue B színezéket tartalmazó agaróz gélen vezetjük át; és
    b) az agaróz gélről eluált frakciókat CLMF jelenlétére vizsgáljuk, és a CLMF-tartalmú fehérje frakciókat megtartjuk.
  24. 24. A 19. igénypont szerinti eljárás, amelynek során a felülúszó folyadékot erős kationcserélő oszlop felhasználásával választjuk szét a fehéije frakciókra oly módon, hogy a CLMF-tartalmú fehérje frakciókat agaróz mátrixhoz kovalensen kapcsolt Blue B színezéket tartalmazó agaróz gélen vezetjük át, az agaróz gélről eluált fehérje frakciókat CLMF jelenlétére vizsgáljuk, és a CLMF-tartalmú fehérje frakciókat megtartjuk, azzal jellemezve, hogy az eljárás az alábbi további lépéseket tartalmazza:
    a) az ily módon kapott CLMF-tartalmú fehérje frakciókat nagy teljesítőképességű folyadék kromatográfiával vagy gyors fehéije folyadék kromatográfiával erős anioncserélő gyantáról eluáljuk, és ily módon fehérje frakciókat nyerünk; és
    b) az erős anioncserével eluált fehérje frakciókat CLMF jelenlétére vizsgáljuk és a CLMF-tartalmú frakciókat megtartjuk.
  25. 25. Eljárás az 1. igénypont szerinti fehérje előállítására tenyésztett sejtekből nyert felülúszó folyadékokból, amelyek a CLMF-t más fehérjékkel együtt tartalmazzák, azzal jellemezve, hogy
    a) a felülúszó folyadékokat fehérje frakciókra választjuk szét;
    b) minden fehérje frakciót megfelelő teszt segítségével CLMF jelenlétére vizsgálunk;
    c) a CLMF-tartalmú fehérje frakciókat megtartjuk; és
    d) a CLMF-tartalmú frakciókból a CLMF-t lényegében tiszta formában izoláljuk.
  26. 26. Eljárás az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti transzfomált mikroorganizmus előállítására, azzal jellemezve, hogy
    a) valamely mikroorganizmust az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti fehérjét kódoló polinukleotidot tartalmazó rekombináns vektorral transzformálunk;
    b) a transzformált mikroorganizmust egy táptalajban tenyésztjük, és
    c) a mikroorganizmust a tenyészettáptalajból kinyerjük.
  27. 27. Eljárás CLMF ellen irányított antitest előállítására, azzal jellemezve, hogy
    a) az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti fehérjét a fenti fehérjével szemben immunválasz kiváltására képes melegvérű állatba befecskendezünk; és
    b) az antitesteket az állatból kinyerjük.
  28. 28. Gyógyászati készítmény, azzal jellemezve, hogy az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti fehéijét és gyógyászatilag alkalmas hígítóanyagot, adjuvánst vagy hordozóanyagot tartalmaz.
  29. 29. Gyógyászati készítmény, azzal jellemezve, hogy az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti fehérjét, valamely interleukin-2 fehérjét és gyógyászatilag alkalmas hígítóanyagot, adjuvánst vagy hordozóanyagot tartalmaz.
  30. 30. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti fehérjék felhasználása tumorellenes szerként vagy a tumorellenes terápiában felhasználható gyógyszer előállítására.
  31. 31. Fehérje, azzal jellemezve, hogy a 17-25. igénypontok bármelyike szerinti eljárással állítjuk elő.
  32. 32. Transzformált mikroorganizmus, azzal jellemezve, hogy a 26. igénypont szerinti eljárással állítjuk elő.
  33. 33. CLMF ellen irányított antitest, azzal jellemezve, hogy a 27. igénypont szerinti eljárással állítjuk elő.
  34. 34. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti fehérjét tartalmazó anyag vagy kompozíció, tumorellenes szerként kezelési eljárásban történő felhasználásra, amely eljárás során a fenti anyagot vagy kompozíciót beadjuk.
  35. 35. Eljárás LAK-sejtek stimulálására, azzal jellemezve, hogy a LAK-sejteket CLMF-el vagy CLMF biológiailag aktív fragmensével vagy az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti fehérjével, és interleukin-2el vagy biológiailag aktív fragmensével kezeljük.
  36. 36. Eljárás aktivált T-sejtek stimulálására, azzal jellemezve, hogy T-sejteket CLMF-el vagy CLMF biológiailag aktív fragmensével vagy az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti fehérjével kezeljük.
    HU 211 879 A9
  37. 37. Eljárás aktivált T-sejtek stimulálására, azzal jellemezve, hogy
    a) T-sejteket CLMF-el vagy CLMF biológiailag aktív fragmensével vagy az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti fehérjével kezelünk; és
    b) az aktivált T-sejteket interleukin-2-el vagy biológiailag aktív fragmensével kezeljük.
  38. 38. Eljárás természetes killer sejtek stimulálására, azzal jellemezve, hogy a természetes killer sejteket CLMF-el vagy a CLMF biológiailag aktív fragmensével vagy az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti fehérjével kezeljük.
  39. 39. Új fehérje, lényegében ahogyan a jelen szabadalmi leírásban ismertetjük.
  40. 40. Új izolált polinukleotid, lényegében ahogyan a jelen szabadalmi leírásban ismertetjük.
  41. 41. Új rekombináns vektor, lényegében ahogyan a jelen szabadalmi leírásban ismertetjük.
  42. 42. Új mikroorganizmus, lényegében ahogyan a jelen szabadalmi leírásban ismertetjük.
  43. 43. Új antitest, lényegében ahogyan a jelen szabadalmi leírásban ismertetjük.
  44. 44. A 16. igénypont szerinti találmány, lényegében ahogyan a jelen szabadalmi leírásban ismertetjük.
  45. 45. Eljárás az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti fehéije előállítására, lényegében ahogyan a jelen szabadalmi leírásban ismertetjük.
  46. 46. Eljárás az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti fehérje termelésére képes transzformált mikroorganizmus előállítására, lényegében ahogyan a jelen szabadalmi leírásban ismertetjük.
  47. 47. Új eljárás CLMF elleni irányított antitestek előállítására, lényegében ahogyan a jelen szabadalmi leírásban ismertetjük.
  48. 48. Új gyógyászati készítmény, lényegében ahogyan a jelen szabadalmi leírásban ismertetjük.
  49. 49. A 30. igénypont szerinti találmány, lényegében ahogyan a jelen szabadalmi leírásban ismertetjük.
  50. 50. Új eljárás LAK-sejtek stimulálására, lényegében ahogyan a jelen szabadalmi leírásban ismertetjük.
  51. 51. Új eljárás aktivált T-sejtek stimulálására, lényegében ahogyan a jelen szabadalmi leírásban ismertetjük.
  52. 52. Új eljárás természetes killer sejtek stimulálására, lényegében ahogyan a jelen szabadalmi leírásban ismertetjük.
  53. 53. Anyag vagy kompozíció, kezelési eljárásban történő új felhasználásra, lényegében ahogyan a jelen szabadalmi leírásban ismertetjük.
    HU 211 879 A9 Int.Cl.6: C07 K 14/52
HU95P/P00267P 1989-12-22 1995-06-20 Cytotoxic lymphocyte maturation factor and monoclonal antibodies directed thereto HU211879A9 (en)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US45570889A 1989-12-22 1989-12-22
US52093590A 1990-05-09 1990-05-09
US57228490A 1990-08-27 1990-08-27

Publications (1)

Publication Number Publication Date
HU211879A9 true HU211879A9 (en) 1995-12-28

Family

ID=27412641

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU95P/P00267P HU211879A9 (en) 1989-12-22 1995-06-20 Cytotoxic lymphocyte maturation factor and monoclonal antibodies directed thereto

Country Status (11)

Country Link
EP (4) EP0790309B1 (hu)
JP (2) JP3238418B2 (hu)
AT (4) ATE366311T1 (hu)
AU (2) AU6834990A (hu)
BG (1) BG60933B2 (hu)
CA (3) CA2032653C (hu)
DE (4) DE69032086T2 (hu)
DK (4) DK0790308T3 (hu)
HU (1) HU211879A9 (hu)
IE (1) IE904694A1 (hu)
NZ (1) NZ236545A (hu)

Families Citing this family (49)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5456924A (en) * 1988-12-23 1995-10-10 Immunotec Research Corporation Ltd. Method of treatment of HIV-seropositive individuals with dietary whey proteins
US5811523A (en) 1988-11-10 1998-09-22 Trinchieri; Giorgio Antibodies to natural killer stimulatory factor
US5457038A (en) * 1988-11-10 1995-10-10 Genetics Institute, Inc. Natural killer stimulatory factor
EP0375045A1 (en) * 1988-12-22 1990-06-27 Duphar International Research B.V New annelated indole derivatives
US6683046B1 (en) 1989-12-22 2004-01-27 Hoffmann-La Roche Inc. Purification and characterization of cytotoxic lymphocyte maturation factor and monoclonal antibodies thereto
US6830751B1 (en) 1994-03-14 2004-12-14 Genetics Institute, Llc Use of IL-12 antagonists in the treatment of rheumatoid arthritis
ZA95960B (en) 1994-03-14 1995-10-10 Genetics Inst Use of interleukin-12 antagonists in the treatment of autoimmune diseases
CA2158977A1 (en) 1994-05-09 1995-11-10 James G. Respess Retroviral vectors having a reduced recombination rate
JP2000510813A (ja) * 1995-02-06 2000-08-22 ジェネテイックス・インスティテュート・インコーポレイテッド Ｉｌ−１２用処方
US5891680A (en) * 1995-02-08 1999-04-06 Whitehead Institute For Biomedical Research Bioactive fusion proteins comprising the p35 and p40 subunits of IL-12
GB9505784D0 (en) * 1995-03-22 1995-05-10 Lynxvale Ltd Anti-tumour treatment
US5853714A (en) * 1995-03-27 1998-12-29 Genetics Institute, Inc. Method for purification of IL-12
US5880146A (en) * 1995-06-07 1999-03-09 Fuji Immunopharmaceuticals Corporation Inhibition of IL-12-induced IFN-γ synthesis by specific bis-phenol compounds as a method of immune modulation
US5853697A (en) * 1995-10-25 1998-12-29 The United States Of America, As Represented By The Department Of Health & Human Services Methods of treating established colitis using antibodies against IL-12
GB9609932D0 (en) * 1996-05-13 1996-07-17 Hoffmann La Roche Use of IL-12 and IFN alpha for the treatment of infectious diseases
EP0850951A4 (en) * 1996-06-04 2001-04-11 Juridical Foundation NEW FELINE CYTOKINE PROTEIN
CA2268365A1 (en) * 1996-10-18 1998-04-30 Jeff Nordstrom Il-12 gene expression and delivery systems and uses
JP2001503258A (ja) * 1996-10-18 2001-03-13 バレンティス・インコーポレーテッド 遺伝子発現および搬送系および用途
US6054487A (en) * 1997-03-18 2000-04-25 Basf Aktiengesellschaft Methods and compositions for modulating responsiveness to corticosteroids
WO1998041229A1 (en) * 1997-03-19 1998-09-24 F. Hoffmann-La Roche Ag USE OF IL-12p40 AS IMMUNOSTIMULANT
JP2002241398A (ja) * 1997-06-03 2002-08-28 Chemo Sero Therapeut Res Inst 新規なイヌサイトカインタンパク質
US6060284A (en) 1997-07-25 2000-05-09 Schering Corporation DNA encoding interleukin-B30
ES2221717T3 (es) 1997-12-08 2005-01-01 Emd Lexigen Research Center Corp. Proteinas de fusion heterodimeras utiles para inmunoterapia dirigida e inmunoestimulacion general.
US7026456B1 (en) 1998-01-23 2006-04-11 Hoffman-La Roche, Inc. Antibodies against human IL-12
SK782002A3 (en) 1999-07-21 2003-08-05 Lexigen Pharm Corp FC fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
KR100827757B1 (ko) 1999-08-09 2008-05-07 메르크 파텐트 게엠베하 복수의 시토킨-항체 복합체
US7090847B1 (en) 1999-09-09 2006-08-15 Schering Corporation Mammalian cytokines; related reagents and methods
EP1905832A3 (en) * 1999-09-09 2009-09-09 Schering Corporation Mammalian interleukin-12 P40 and interleukin B30, combinations thereof, antibodies, uses in pharmaceutical compositions
DE60038304T3 (de) * 1999-09-09 2017-04-06 Merck Sharp & Dohme Corp. Interleukin-12 p40 und interleukin-b30. kombinationen davon. antikörper. verwendungen in pharmazeutische zusammensetzungen
AU2005202420B2 (en) * 1999-09-09 2008-08-07 Merck Sharp & Dohme Corp. Mammalian cytokines; related reagents and methods
US7115712B1 (en) 1999-12-02 2006-10-03 Maxygen, Inc. Cytokine polypeptides
ATE336514T1 (de) 2000-02-11 2006-09-15 Merck Patent Gmbh Steigerung der zirkulierenden halbwertzeit von auf antikörpern basierenden fusionsproteinen
US6902734B2 (en) 2000-08-07 2005-06-07 Centocor, Inc. Anti-IL-12 antibodies and compositions thereof
EP1366067B1 (en) 2001-03-07 2012-09-26 Merck Patent GmbH Expression technology for proteins containing a hybrid isotype antibody moiety
WO2002079415A2 (en) 2001-03-30 2002-10-10 Lexigen Pharmaceuticals Corp. Reducing the immunogenicity of fusion proteins
AU2002308562B2 (en) 2001-05-03 2008-01-24 Merck Patent Gmbh Recombinant tumor specific antibody and use thereof
EP1454138B1 (en) 2001-12-04 2012-01-18 Merck Patent GmbH Immunocytokines with modulated selectivity
PL211180B1 (pl) 2002-12-17 2012-04-30 Merck Patent Gmbh Białko fuzyjne typu przeciwciało-IL2, wektor zawierający sekwencję kwasów nukleinowych kodujących takie białko, kompozycja farmaceutyczna zawierająca takie białko fuzyjne oraz jego zastosowania do wytwarzania leków
EP1702069A2 (en) 2004-01-05 2006-09-20 EMD Lexigen Research Center Corp. Interleukin-12 targeted to oncofoetal fibronectin
SG158150A1 (en) 2004-12-21 2010-01-29 Centocor Inc Anti-il-12 antibodies, epitopes, compositions, methods and uses
WO2007076933A1 (en) 2005-12-30 2007-07-12 Merck Patent Gmbh Interleukin-12p40 variants with improved stability
JP2011504740A (ja) 2007-11-27 2011-02-17 アブリンクス エン．ヴェー． ヘテロ二量体サイトカイン及び／又はこれらの受容体に指向性を有するアミノ酸配列、並びにこれを含むポリペプチド
US7891807B2 (en) * 2009-06-11 2011-02-22 Ana Nichole Mansuy Decorative eyeglass temples
EA201892190A1 (ru) 2016-03-29 2019-04-30 Янссен Байотек, Инк. Лечение псориаза антителом к ил-12 и/или ил-23 с возрастанием интервала между введениями дозы
US10189151B2 (en) 2016-11-14 2019-01-29 Snap-On Incorporated Compact head body hammer
TW201922780A (zh) * 2017-09-25 2019-06-16 美商健生生物科技公司 以抗ｉｌ１２／ｉｌ２３抗體治療狼瘡之安全且有效之方法
EP3793521A4 (en) 2018-05-18 2022-02-23 Janssen Biotech, Inc. SAFE AND EFFECTIVE METHOD OF TREATING LUPUS WITH AN ANTI-IL12/IL23 ANTIBODY
AU2019346134C1 (en) 2018-09-24 2024-06-20 Janssen Biotech, Inc. Safe and effective method of treating ulcerative colitis with anti-il12/il23 antibody
CA3138241A1 (en) 2019-05-23 2020-11-26 Janssen Biotech, Inc. Method of treating inflammatory bowel disease with a combination therapy of antibodies to il-23 and tnf alpha

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE68926859T2 (de) * 1988-11-10 1997-02-13 Genetics Inst Natürlicher killerzellen-stimulationsfaktor
US5457038A (en) * 1988-11-10 1995-10-10 Genetics Institute, Inc. Natural killer stimulatory factor

Also Published As

Publication number Publication date
EP0790255A3 (en) 2000-03-01
CA2572802A1 (en) 1991-06-23
CA2346997A1 (en) 1991-06-23
DE69032086T2 (de) 1998-09-17
JP3375949B2 (ja) 2003-02-10
EP0433827B1 (en) 1998-03-04
JP2002167400A (ja) 2002-06-11
IE990007A1 (en) 2000-11-01
EP0790308A1 (en) 1997-08-20
EP0790255B1 (en) 2007-08-08
ATE368112T1 (de) 2007-08-15
JP3238418B2 (ja) 2001-12-17
DE69034244T2 (de) 2008-04-03
EP0790308B1 (en) 2007-07-04
BG60933B2 (bg) 1996-06-28
EP0433827A2 (en) 1991-06-26
DE69034247T2 (de) 2008-04-17
ATE369383T1 (de) 2007-08-15
IE990006A1 (en) 2000-11-01
JPH05294999A (ja) 1993-11-09
DE69034247D1 (de) 2007-09-06
DK0790255T3 (da) 2007-11-26
DE69032086D1 (de) 1998-04-09
CA2032653A1 (en) 1991-06-23
DK0790308T3 (da) 2007-10-08
CA2032653C (en) 2002-05-28
DK0790309T3 (da) 2007-11-05
NZ236545A (en) 1993-04-28
DE69034244D1 (de) 2007-08-16
CA2346997C (en) 2007-02-20
IE990005A1 (en) 2000-11-01
EP0790309B1 (en) 2007-07-25
AU674363B2 (en) 1996-12-19
IE904694A1 (en) 1991-07-17
EP0790309A1 (en) 1997-08-20
DK0433827T3 (da) 1998-09-28
EP0433827A3 (en) 1992-07-01
AU6834990A (en) 1991-06-27
DE69034249T2 (de) 2008-05-29
ATE163675T1 (de) 1998-03-15
ATE366311T1 (de) 2007-07-15
AU5471294A (en) 1994-06-09
DE69034249D1 (de) 2007-09-20
EP0790255A2 (en) 1997-08-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU211879A9 (en) Cytotoxic lymphocyte maturation factor and monoclonal antibodies directed thereto
US5780597A (en) Monoclonal antibodies to cytotoxic lymphocyte maturation factor
KR100764256B1 (ko) 인간 인터루킨-12에 대한 항체
SE504554C2 (sv) Ett nytt bifunktionellt tillväxtmodulerande glykoprotein
HU222810B1 (hu) Interleukin-1 inhibitorok, ezeket kódoló DNS-szekvenciák, a szekvenciákat tartalmazó rekombináns DNS-vektorok, a vektort tartalmazó gazdasejtek és rekombináns GT-10-il-1i-2A DNS molekula
CA2128151A1 (en) Receptors of interleukin-12 and antibodies
CA2005600A1 (en) Endothelial cell growth factor
EP0625990B1 (en) Glycoprotein complexes and glycoproteins
JPH1070986A (ja) ヒトＴｈ１特異的タンパク質及びこれをコードする遺伝子、並びにこれに関連する形質転換体、組換えベクター及び抗体
US5786168A (en) Method for recombinant production of antigen non-specific glycosylation inhibiting factor (GIF)
AU775308B2 (en) Therapeutic compositions and methods for treating disease states with myeloid progenitor inhibitory factor-1 (MPIF-1), monocyte colony inhibitory factor (M-CIF), and macrophage inhibitory factor-4 (MIP-4)
AU708987B2 (en) Secreted glycoprotein
IE19990005A1 (en) Monoclonal antibodies directed to the cytotoxic lymphocyte maturation factor
IE19990006A1 (en) Cytotoxic lymphocyte maturation factor 40kD subunit and monoclonal antibodies directed thereto
IE85054B1 (en) Monoclonal antibodies directed to the cytotoxic lymphocyte maturation factor
IE19990007A1 (en) Cytotoxic Lymphocyte Maturation Factor
IE84906B1 (en) Cytotoxic Lymphocyte Maturation Factor
MXPA00007124A (en) Antibodies against human il-12