【発明の詳細な説明】
骨髄前駆体阻害因子-1（MPIF-1）、単球コロニー阻害因子（M-CIF）、およびマ
クロファージ阻害因子-4（MIP-4）で疾患状態を処置するための
治療組成物および方法
発明の背景
発明の分野
本発明は、新規のケモカインポリペプチドおよびコードする核酸に関する。よ
り詳細には、ヒト骨髄前駆細胞阻害因子-1（MPIF-1）ポリペプチド（以前は、MI
P-3およびケモカインβ８（CKβ８またはckb-8）と呼ばれた）；ヒト単球コロニ
ー阻害因子（M-CIF）ポリペプチド（以前は、MIP-γおよびケモカインβ１(CKβ
１またはckb-1)を呼ばれた）、およびマクロファージ阻害タンパク質-4（MIP-4
）をコードする単離された核酸分子を使用する治療組成物および方法、ならびに
MPIF-1、M-CIF、および/またはMIP-4ポリペプチドそれ自体が提供され、またこ
れらを産生するためのベクター、宿主細胞、および組換え法も提供される。
関連技術
ケモカイン（インタークリン（intercrine）サイトカインとも呼ばれる）は、
構造的および機能的に関連するサイトカインのサブファミリーである。これらの
分子は、サイズが８〜14kdである。一般に、ケモカインは、アミノ酸レベルで20
％〜75％の相同性を示し、そして２つのジスルフィド結合を形成する４つの保存
されたシステイン残基によって特徴づけられる。第一の２つのシステイン残基の
配置に基づいて、ケモカインは、２つのサブファミリー（αおよびβ）に分類さ
れている。αサブファミリーにおいて、最初の２つのシステインは、１つのアミ
ノ酸によって分離され、従って「C-X-C」サブファミリーといわれる。βサブフ
ァミリーにおいて、２つのシステインは、隣接する位置にあり、そしてそれゆえ
-C-C-サブファミリーといわれる。これまでのところ、このファミリーの少な
くとも８つの異なるメンバーは、ヒトにおいて同定されている。
インタークリンサイトカインは、広範な種々の機能を示す。証明的特徴は、異
なる細胞型（単球、好中球、Ｔリンパ球、好塩基球、および線維芽細胞を含む）
の走化性移動を誘発するその能力である。多くのケモカインは、炎症誘発性活性
を有し、そして炎症性反応の間の多数の段階に関与する。これらの活性には、ヒ
スタミン放出、リソソーム酵素およびロイコトリエン放出の刺激、標的免疫細胞
の内皮細胞への接着の増大、補体タンパク質の結合の増大、顆粒球接着分子およ
び補体レセプターの誘導された発現、ならびに呼吸バーストが含まれる。それら
の炎症への関与に加えて、特定のケモカインが他の活性を示すことが示されてい
る。例えば、マクロファージ炎症性タンパク質I(MIP-1)は、造血幹細胞増殖を抑
制し得、血小板因子-4(PF-4)は、内皮細胞増殖、ケラチノサイトのインターロイ
キン-8(IL-8)によって促進される増殖の強力なインヒビターであり、そしてGRO
は、黒色腫細胞の自己分泌増殖因子である。
多様な生物学的活性を考慮して、ケモカインが多くの生理学的状態および疾患
状態（リンパ球輸送、創傷治癒、造血調節、ならびにアレルギー、喘息、および
関節炎のような免疫学的疾患を含む）に関係していることは驚くことではない。
造血系統調節因子の一例は、MIP-1である。MIP-1は、元々、マクロファージから
産生されるエンドトキシン誘導炎症誘発性サイトカインとして同定された。引き
続く研究は、MIP-1が２つの異なるが、関連するタンパク質MIP-1αおよびMIP-1
βから構成されることを示した。MIP-1αおよびMIP-1βの両方が、マクロファー
ジ、単球、およびＴリンパ球の化学誘引物質である。興味深いことに、多分化能
幹細胞インヒビター（SCI）の生化学的精製および引き続く配列分析により、SCI
がMIP-1βと同一であることが明らかになった。さらに、MIP-1βは、造血幹細胞
増殖を抑制するMIP-1αの能力を相殺し得ることが示されている。この知見は、M
IP-1の一次的な生理学的役割が、骨髄における造血を調節することであり、そし
て提案された炎症性機能が二次的なものであるという仮説を導く。MIP-1αの幹
細胞インヒビターとしての作用の態様は、細胞サイクルをG2S静止期でブロック
するその能力に関連する。さらに、MIP-1αの阻害効果は、未成熟の前駆細胞に
限定されるようであり、そして実際に、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子
（GM-CSF）の存在下で、後期前駆細胞に対して刺激性である。
マウスMIP-1は、リポポリサッカライド刺激RAW 264.7（マウスマクロファージ
腫瘍細胞株）由来の主要な分泌タンパタ質である。これは、精製されており、そ
して２つの関連するタンパク質MIP-1αおよびMIP-1βからなることが見出されて
いる。
いくつかのグループが、MIP-1αおよびMIP-1βのヒトホモログであるようであ
るものをクローニングしている。全ての場合において、cDNAは、活性化されたＴ
細胞RNAに対して調製されたライブラリーから単離された。
MIP-1タンパク質は、初期の創傷炎症細胞において検出され得、そして創傷線
維芽細胞からIL-1およびIL-6の産生を誘導することが示されている。さらに、精
製された天然のMIP-1（MIP-1、MIP-1α、およびMIP-1βポリペプチドを含む）は
、マウスの足跡に皮下に、またはウサギの脳脊髄液に大槽内にのいずれかで注入
された場合に、急性の炎症を引き起こす(WolpeおよびCerami，FASEB J．3:2565-
73(1989))。MIP-1のこれらの炎症誘発性特性（これらは、直接または間接であり
得る）に加えて、MIP-1は、滅菌創傷チャンバーを使用した実験マウスモデルに
おける創傷治癒の初期の炎症段階の間に回収されている(Faheyら、Cytokine，2:
92(1990))。例えば、Chiron Corporationによって出願されたPCT出願U.S.92/051
98は、酵母において哺乳動物マクロファージ炎症性タンパク質（MIP）を産生す
るテンプレートとして活性であるDNA分子を開示する。
マウスMIP-1αおよびMIP-1βは、異なるが、密接に関連するサイトカインであ
る。２つのタンパク質の部分精製された混合物は、好中球機能に影響を及ぼし、
そして局所的な炎症および発熱を引き起こす。MIP-1αは、酵母細胞において発
現され、そして均質にまで精製されている。構造分析により、MIP-1αが、血小
板因子４（PF-4）およびインターロイキン８（IL-8）（これらに対し、限定され
た配列相同性を有する）に非常に類似する二次および三次構造を有することが確
認された。MIP-1αは、インビボで活性であり、マウス幹細胞を、トリチウム化
チミジンによる引き続くインビトロ殺傷から保護することが実証されている。MI
P-1αはまた、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子に応答して、より拘束さ
れた前駆顆粒球マクロファージコロニー形成細胞の増殖を増強することが示され
た(Clemens，J.M.ら、Cytokine 4:76-82(1992))。
本発明のポリペプチド、M-CIF（元々、親出願において、MIP-1γおよびCkβ-1
といわれた）は、アミノ酸配列相同性に基づいて、βサイトカインファミリーの
新たなメンバーである。MPIF-1ポリペプチド（元々、親出願において、MIP-3お
よびCkβ-8といわれた）はまた、アミノ酸配列相同性に基づいて、βケモカイン
ファミリーの新たなメンバーである。
発明の要旨
本発明の１つの局面に従って、新規の全長または成熟ポリペプチド（これらは
、MPIF-1、MIP-4、および/またはM-CIF）、および生物学的に活性な、診断的に
有用な、または治療的に有用なフラグメント、アナログ、およびそれらの誘導体
が提供される。本発明のMPIF-1、MIP-4、およびM-CIFは、好ましくは、動物起源
であり、そしてより好ましくはヒト起源である。
本発明の別の局面に従って、このようなポリペプチドをコードするポリヌクレ
オチド（DNAまたはRNA）およびこのようなポリペプチドをコードする単離された
核酸分子（mRNA、DNA、cDNA、ゲノムDNAを含む）、ならびに生物学的に活性で、
そして診断的にまたは治療的に有用なフラグメント、アナログ、およびその誘導
体が提供される。
MPIF-1ポリヌクレオチド。本発明はまた、図１に示されるアミノ酸配列（配列
番号４）または細菌宿主中でATCC受託番号75676として1994年２月９日に寄託さ
れたcDNAクローンによってコードされるアミノ酸配列を有するMPIF-1ポリペプチ
ドをコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を提供する。寄託さ
れたMPIF-1クローンを配列決定することによって決定されたヌクレオチド配列（
図１に示される（配列番号３））は、120アミノ酸残基のポリペプチドをコード
するオープンリーディングフレームおよび約21アミノ酸残基のリーダー配列を含
み、そして成熟タンパク質の推定分子量は、非グリコシル化形態において11kDa
、そしてグリコシル化形態において約11〜14kDa（グリコシル化の程度に依存す
る）である。成熟MPIF-1ンパク質のアミノ酸配列を、図１に示す（配列番号４）
。
従って、本発明の１つの局面は、以下からなる群から選択されるヌクレオチド
配列を有するポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を提供する：(1)(a)図
１の全アミノ酸配列（配列番号４）を有するMPIF-1ポリペプチドをコードするヌ
クレオチド配列；(1)(b)図１の全アミノ酸配列（配列番号４）（しかし、Ｎ末端
メチオニン残基を除く）を有するMPIF-1ポリペプチドをコードするヌクレオチド
配列；(1)(c)図１（配列番号４）の22〜120位のアミノ酸配列を有する成熟MPIF-
1ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；(1)(d)ATCC受託番号75676に含ま
れるcDNAクローンによってコードされる全アミノ酸配列を有するMPIF-1ポリペプ
チドをコードするヌクレオチド配列；(1)(e)ATCC受託番号75676に含まれるcDNA
クローンによってコードされるアミノ酸配列を有する成熟MPIF-1ポリペプチドを
コードするヌクレオチド配列；および上記(1)(f)(1)-(a)、(b)、(c)、(d)、また
は(e)におけるヌクレオチド配列のいずれかに相補的なヌクレオチド配列。
M-CIFポリヌクレオチド。１つの局面において、本発明は、図２に示すアミノ
酸配列（配列番号２）またはATCC受託番号75572として細菌宿主中に1993年10月1
3日に寄託されたcDNAクローンによってコードされるアミノ酸配列を有するM-CIF
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を提供す
る。寄託されたM-CIFクローンを配列決定することによって決定されたヌクレオ
チド配列（図２に示される（配列番号１））は、93アミノ酸残基のポリペプチド
をコードするオープンリーディングフレームおよび約19アミノ酸残基のリーダー
配列を含み、そして推定分子量は、非グリコシル化形態で約9kDa、およびグリコ
シル化形態で約９〜14kDa（グリコシル化の程度に依存する）である。成熟M-CIF
タンパク質のアミノ酸配列は、図２に示される（配列番号２）。
従って、本発明の１つの局面は、以下からなる群から選択されるヌクレオチド
配列を有するポリペプチドを含む単離された核酸分子を提供する：(2)(a)図２の
全アミノ酸配列（配列番号２）を有するM-CIFポリペプチドをコードするヌクレ
オチド配列；(2)(b)図２の全アミノ酸配列（配列番号２）（しかし、Ｎ末端メチ
オニン残基を除く）を有するM-CIFポリペプチドをコードするヌクレオチド配列
；(2)(c)図２の20〜93位のアミノ酸配列（配列番号２）を有する成熟M-CIFポリ
ペプチドをコードするヌクレオチド配列；(2)(d)ATCC受託番号75572に含まれ
るcDNAクローンによってコードされる全アミノ酸配列を有するM-CIFポリペプチ
ドをコードするヌクレオチド配列；(2)(e)ATCC受託番号75572に含まれるcDNAク
ローンによってコードされるアミノ酸配列を有する成熟M-CIFポリペプチドをコ
ードするヌクレオチド配列；および上記(2)(f)(2)-(a)、(b)、(c)、(d)、または
(e)におけるヌクレオチド配列のいずれかに相補的なヌクレオチド配列。
MIP-4ポリヌクレオチド。本発明は、図３に示すアミノ酸配列（配列番号６）
、または細菌宿主中にATCC受託番号75675として1994年２月９日に寄託されたcDN
Aクローンによってコードされるアミノ酸配列を有するMIP-4ポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチド単離された核酸分子をさらに提供する。寄託されたMIP-
4クローンを配列決定することによって決定されたヌクレオチド配列（図３に示
される（配列番号５））は、89アミノ酸残基のポリペプチドをコードするオープ
ンリーディングフレームおよび約20アミノ酸残基リーダー配列を含み、そして推
定分子量は、非グリコシル化形態で約8kDaおよびグリコシル化形態で約8〜14kDa
（グリコシル化の程度に依存する）である。成熟MIP-4タンパク質のアミノ酸配
列は、図２に示される（配列番号６）。
本発明の別の局面は、以下からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有す
るポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を提供する：(3)(a)図３の全アミ
ノ酸配列（配列番号６）を有するMIP-4ポリペプチドをコードするヌクレオチド
配列；(3)(b)図３の全アミノ酸配列（配列番号６）（しかし、Ｎ末端メチオニン
残基を除く）を有するMIP-4ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；(3)(c
)図３の21〜89位のアミノ酸配列（配列番号６）を有する成熟MIP-4ポリペプチド
をコードするヌクレオチド配列；(3)(d)ATCC受託番号75675に含まれるcDNAクロ
ーンによってコードされる全アミノ酸配列を有するMIP-4ポリペプチドをコード
するヌクレオチド配列；および(3)(e)ATCC受託番号75675に含まれるcDNAクロー
ンによってコードされるアミノ酸配列を有する成熟MIP-4ポリペプチドをコード
するヌクレオチド配列；および上記(3)(f)(3)-(a)、(b)、(c)、(d)、または(e)
におけるヌクレオチド配列のいずれかに相補的なヌクレオチド配列。
MIPIF-1、M-CIF、およびMIP-4ポリヌクレオチド改変体。本発明はさらに、図
１、２、および３（配列番号２、４、および６）の推定アミノ酸配列を有する
ポリペプチドの、または寄託されたクローンのcDNAによってコードされるポリペ
プチドのフラグメント、アナログ、および誘導体をコードする本明細書中上記の
ポリヌクレオチドの改変体に関する。ポリヌクレオチドの改変体は、ポリペプチ
ドの天然に存在する対立遺伝子改変体か、またはポリペプチドの天然に存在しな
い改変体であり得る。
相同なMPIF-1、M-CIF、およびMIP-4ポリペプチド。本発明のさらなる実施態様
には、上記の(1)-、(2)-、または(3)-(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、または(f)のヌ
クレオチド配列のいずれかに少なくとも95％、96％、97％、98％、または99％同
一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、あるいはストリンジェン
トなハイブリダイゼーション条件下で、上記の(1)-、(2)-、または(3)-(a)、(b)
、(c)、(d)、(e)、または(f)のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌク
レオチドを含む単離された核酸分子が含まれる。ハイブリダイズするこれらのポ
リヌクレオチドは、Ａ残基のみ、またはＴ残基のみからなるヌクレオチド配列を
有するポリヌクレオチドには、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件
下でハイブリダイズしない。
核酸プローブ。本発明のなお別の局面に従って、MPIF-1、M-CIF、および/また
はMIP-4核酸配列に特異的にハイブリダイズする充分な長さの核酸分子を含む核
酸プローブがまた提供される。
組換えベクター、宿主細胞、および発現。本発明はまた、本発明の単離された
核酸分子を含む組換えベクター、および組換えベクターを有する宿主細胞、なら
びにこのようなベクターおよび宿主細胞を作製する方法、および組換え技術によ
るMPIF-1、M-CIF、またはMIP-4ポリペプチドまたはペプチドの産生のためにこれ
らを使用する方法に関する。
MPIF-1ポリペプチド。本発明は、以下からなる群から選択されるアミノ酸配列
を有する単離されたMPIF-1ポリペプチドをさらに提供する：(I)(a)図１（配列番
号４）に示されるリーダー配列を含む全120アミノ酸配列を有するMPIF-1ポリペ
プチドのアミノ酸配列；(I)(b)図１（配列番号４）に示されるリーダー配列を含
む全120アミノ酸配列（しかし、Ｎ末端メチオニン残基を除く）を有するMPIF-1
ポリペプチドのアミノ酸配列；(I)(c)図１（配列番号４）の22〜120位のアミノ
酸配列を有する成熟MPIF-1ポリペプチド（リーダーを含まない）のアミノ酸配列
；(I)(d)ATCC受託番号75676に含まれるcDNAクローンによってコードされる全ア
ミノ酸配列（リーダーを含む）を有するMPIF-1ポリペプチドのアミノ酸配列；お
よび(I)(e)ATCC受託番号75676に含まれるcDNAクローンによってコードされるア
ミノ酸配列を有する成熟MPIF-1ポリペプチドのアミノ酸配列。
M-CIFポリペプチド。本発明はさらに、以下からなる群から選択されるアミノ
酸配列を有する単離されたM-CIFポリペプチドを提供する：(II)(a)図２（配列番
号２）に示されるリーダー配列を含む全93アミノ酸配列を有するM-CIFポリペプ
チドのアミノ酸配列；(II)(b)図２（配列番号２）に示されるリーダー配列を含
む全93アミノ酸配列（しかし、Ｎ末端メチオニン残基を除く）を有するM-CIFポ
リペプチドのアミノ酸配列；および(II)(c)図２（配列番号２）の20〜93位のア
ミノ酸配列を有する成熟M-CIFポリペプチド（リーダー配列を含まない）のアミ
ノ酸配列；(II)(d)ATCC受託番号75572に含まれるcDNAクローンによってコードさ
れる全アミノ酸配列（リーダーを含む）を有するM-CIFポリペプチドのアミノ酸
配列；(II)(e)ATCC受託番号75572に含まれるcDNAクローンによってコードされる
アミノ酸配列を有する成熟MPIF-1ポリペプチドのアミノ酸配列。
MIP-4ポリペプチド。本発明はさらに、以下からなる群から選択されるアミノ
酸配列を有する単離されたMIP-4ポリペプチドを提供する：(III)(a)図３（配列
番号６）に示されるリーダー配列を含む全89アミノ酸配列を有するMIP-4ポリペ
プチドのアミノ酸配列；(III)(b)図３（配列番号６）に示されるリーダー配列を
含む全89アミノ酸配列（しかし、Ｎ末端メチオニン残基を除く）を有するMIP-4
ポリペプチドのアミノ酸配列；(III)(c)図３（配列番号６）の21〜89位のアミノ
酸配列を有する成熟M-CIFポリペプチド（リーダー配列を含まない）のアミノ酸
配列；(III)(d)ATCC受託番号75675に含まれるcDNAクローンによってコードされ
る全アミノ酸配列（リーダーを含む）を有するMIP-4ポリペプチドのアミノ酸配
列；および(III)(e)ATCC受託番号75675に含まれるcDNAクローンによってコード
されるアミノ酸配列を有する成熟MIP-4ポリペプチドのアミノ酸配列。
相同なMPIF-1、M-CIF、およびMIP-4ポリペプチド。本発明のポリペプチドはま
た、上記の(I)-、(II)-、および(III)-(a)、(b)、(c)、(d)、または(e)に記載
の少なくとも95％の同一性を有するアミノ酸配列を有する相同なポリペプチド、
ならびに上記の配列に少なくとも95％、96％、97％、98％、または99％の同一な
アミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
MPIF-1、M-CIF，MIP-4エピトープ保有ポリペプチドおよびコードするポリヌク
レオチド。本発明のこの局面のさらなる実施態様は、上記の(I)-、(II)-、およ
び(III)-(a)、(b)、(c)、(d)、または(e)に記載のMPIF-1、M-CIF、またはMIP-4
ポリペプチドのエピトープ保有部分のアミノ酸配列を有するペプチドまたはポリ
ペプチドに関する。本発明のMPIF-1、M-CIF、またはMIP-4ポリペプチドのエピト
ープ保有部分のアミノ酸配列を有するペプチドまたはポリペプチドは、少なくと
も６または７、好ましくは少なくとも９、およびより好ましくは少なくとも約30
アミノ酸〜約50アミノ酸を有するこのようなポリペプチドの部分を含むが、上記
の本発明のポリペプチドの全アミノ酸配列をまでおよびそれを含むエピトープ保
有ポリペプチドは、本発明に包含される。
本発明のさらなる核酸の実施態様は、上記の(I)-、(II)-、および(III)-(a)、
(b)、(c)、(d)、または(e)のアミノ酸配列を有するMPIF-1、M-CIF、またはMIP-4
ポリペプチドのエピトープ保有部分のアミノ酸配列を有するペプチドまたはポリ
ペプチドエピトープ保有部分のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含
む単離された核酸分子に関する。
MPIF-1、M-CIF、およびMIP-4抗体。本発明のなおさらなる局面に従って、この
ようなポリペプチドに対する抗体が提供される。別の実施態様において、本発明
は、上記の(I)-、(II)-、および/または(III)-(a)、(b)、(c)、(d)、または(e)
のアミノ酸配列を有するMPIF-1、M-CIF、またはMIP-4ポリペプチド特異的に結合
する単離された抗体を提供する。
本発明はさらに、本明細書中に記載されるアミノ酸配列を有するMPIF-1、M-CI
F、またはMIP-4ポリペプチド特異的に結合する抗体を単離するための方法を提供
する。このような抗体は、以下に記載されるように診断的または治療的に有用で
ある。
MPIF-1、M-CIF、またはMIP-4アンタゴニストおよび方法。本発明のなお別の局
面に従って、このようなポリペプチドのアンタゴニストまたはインヒビターが
提供される。これらは、例えば、動脈硬化症、自己免疫疾患、ならびに慢性炎症
性および感性性疾患、ヒスタミン媒介性アレルギー性反応、過好酸性症候群、ケ
イ肺炎、肉芽種性疾患、肺の炎症性疾患IL-1およびTNFの阻害、再生不良性貧血
、ならびに脊髄形成異常症候群の処置におけるこのようなポリペプチドの作用を
阻害するために使用され得る。あるいは、このようなポリペプチドは、IL-1およ
びTNF-αの産生を阻害して、再生不良性貧血、脊髄形成異常症候群、喘息、およ
びリウマチを処置するために使用され得る。
診断アッセイ。本発明のなお別の局面において、ポリペプチドの過少発現およ
び過剰発現に関連する疾患を検出するため、およびこのようなポリペプチドをコ
ードする核酸配列における変異を検出するための診断アッセイが提供される。
本発明のなお別の局面に従って、このようなポリペプチド、またはこのような
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、科学的研究、DNAの合成、およ
びDNAベクターの製造に関するインビトロの目的で研究試薬として利用するため
のプロセスが、ヒト疾患の処置のための治療薬および診断を開発する目的で提供
される。
本発明はまた、MPIF-1、M-CIF、またはMIP-4ポリペプチドによって誘導される
細胞性応答を増幅または阻害し得る化合物を同定するためのスクリーニング法で
あって、MPIF-1、M-CIF、またはMIP-4ポリペプチドを発現する細胞を候補化合物
と接触させる工程、細胞応答をアッセイする工程、および細胞応答を標準的な細
胞応答と比較する工程を包含する方法を提供する。ここで、標準は候補化合物の
非存在下で接触がなされた場合にアッセイされる；これにより、標準に対して増
大した細胞応答が、その化合物がアゴニストであること、そして標準に対して減
少した細胞応答が、その化合物がアンタゴニストであることを示す。
多くの疾患について、有意に高いかまたは低いレベルのMPIF-1、M-CIF、また
はMIP-4遺伝子発現が、このような障害を有する個体から採取した特定の組織ま
たは体液（例えば、血清、血漿、尿、滑液、または髄液）において、「標準」MP
IF-1、M-CIF、またはMIP-4遺伝子発現レベル（すなわち、障害を有さない個体か
らの組織または体液におけるMPIF-1、M-CIF、またはMIP-4発現レベル）に比較し
て、検出されると考えられる。従って、本発明は、以下の工程を包含する疾患の
診断の間に有用な診断方法を提供する：（ａ）個体の細胞または体液中でのMPIF
-1、M-CIF、またはMIP-4遺伝子発現レベルをアッセイする工程；（b）MPIF-1、M
-CIF、またはMIP-4遺伝子発現レベルを、標準のMPIF-1、M-CIF、またはMIP-4遺
伝子発現レベルと比較し、それにより、標準の発現レベルに比較したアッセイさ
れたMPIF-1、M-CIF、またはMIP-4遺伝子発現レベルの増大または減少が疾患の指
標である、工程。このような障害には、白血病、慢性炎症、自己免疫疾患、固形
腫瘍が含まれる。
薬学的組成物。本発明はまた、別の局面において、MPIF-1、M-CIF、またはMIP
-4の少なくとも１つのポリヌクレオチド、プローブ、ベクター、宿主細胞、ポリ
ペプチド、フラグメント、改変体、誘導体、エピトープ保有部分、抗体、アンタ
ゴニスト、またはアゴニストを含む薬学的組成物を提供する。
治療方法。本発明のなおさらなる局面に従って、治療目的のために（例えば、
化学療法の間に化学治療剤から骨髄幹細胞を保護するため、白血病細胞を除去す
るため、免疫応答を刺激するため、造血およびリンパ球輸送を調節するため、乾
癬、固形腫瘍の処置、耐性および急性および慢性の感染に対する宿主防御を増強
するため、ならびに創傷治癒を刺激するために）このようなポリペプチドまたは
このようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを利用するためのプロー
ブが提供される。
本発明のさらなる局面は、体内における増大したレベルのMPIF-1、M-CIF、ま
たはMIP-4活性を必要とする個体を処置するための方法であって、このような個
体に治療有効量の本発明の単離されたMPIF-1、M-CIF、またはMIP-4ポリペプチド
、またはそのアゴニストをそれぞれ含む組成物を投与する工程を包含する、方法
に関する。
本発明のなおさらなる局面は、体内のMPIF-1、M-CIF、またはMIP-4活性のレベ
ルの減少を必要とする個体を処置するための方法に関する。この方法は、このよ
うな個体に、治療有効量のMPIF-1、M-CIF、またはMIP-4アンタゴニストを含む組
成物を投与する工程を包含する。本発明の使用のために好ましいアンタゴニスト
は、それぞれのM-CIF特異的抗体である。
本発明のこれらおよび他の局面は、本明細書中の教示から当業者には明らかで
ある。
図面の簡単な説明
以下の図面は、本発明の実施態様の例示であり、そして請求の範囲によって包
含される本発明の範囲を制限することを意味しない。
図１は、MPIF-1（配列番号３）をコードするcDNA配列および対応する推定アミ
ノ酸配列（配列番号４）を示す。最初の21アミノ酸は、推定リーダー配列を表す
。すべてのシグナル配列は、バキュロウイルス発現タンパク質のＮ末端ペプチド
配列決定により決定された。
図２は、M-CIF（配列番号１）をコードするcDNA配列および対応する推定アミ
ノ酸配列（配列番号２）を示す。最初の19アミノ酸は、リーダー配列を表す。
図３は、MIP-4（配列番号５）をコードするcDNA配列および対応する推定アミ
ノ酸配列（配列番号６）を示す。最初の20アミノ酸は、リーダー配列を表す。
図４は、MPIF-1(上部)（配列番号４）とヒトMIP-4α（下部）（配列番号55）
との間のアミノ酸相同性を示す。すべてのケモカインの４つのシステイン特性を
示す。
図５は、２つのアミノ酸配列を示す。ここで、上側の配列は、ヒトMIP-4アミ
ノ酸配列（配列番号６）であり、そして下側の配列は、ヒトMIP-4α（ヒト扁桃
腺リンパ球LD78βタンパク質前駆体）（配列番号55）である。
図６は、M-CIF（上部）（配列番号４）とMIP-α（下部）（配列番号55）との
間のアミノ酸整列を示す。
図７は、HAタグ化M-CIFのCOS細胞における発現後のM-CIFを電気泳動したゲル
の写真である。
図８は、バキュロウイルス発現系におけるM-CIFの発現および精製後のSDS-PAG
Eゲルの写真である。
図9A〜9Bは、バキュロウイルス発現系におけるMPIF-の発現および三工程精製
後のSDS-PAGEゲルの写真である。
図10。MPIF-1の化学誘引剤活性は、48ウェルのマイクロチャンバーデバイス（
Neuro Probe，Inc.）を用いて走化性アッセイで決定した。実験手順は、製造
者の手引きに記載される通りであった。試験したMPIF-1の各濃度について、５つ
の高電力場における移動度を試験した。示される結果は、２つの独立の実験から
得られた平均値を表す。THP-I(A)細胞およびヒトPBMC(B)における化学誘因剤の
活性を示す。
図11は、MPIF-1に応答する細胞内カルシウム濃度の変化を、Hitachi F-2000蛍
光分光測定器を使用して決定した。細菌発現したMPIF-1を、Indo-1負荷THP-1細
胞へ、最終濃度50nMで添加し、そしてカルシウム濃度の細胞内レベルをモニター
した。
図12。低密度集団のマウス骨髄細胞を、指示された化学誘因剤（100ng/ml）を
含むか、または含まない寒天含有培地に、IL-3（5ng/ml）、SCF（100ng/ml）、I
L-1α（10ng/ml）、またはM-CSF（５ng/ml）の存在下で、プレートした（1,500
細胞／ディッシュ）。示されるデータは、２つの独立の実験（各二連で実施した
）から得られた平均を表す。プレーティングの14日後にコロニーを計数した。ケ
モカインの存在下で生成されたコロニー数を、いずれの添加されたケモカインの
非存在下で生成される数の平均の割合として表す。
図13は、HPP-CFC(A)およびLPP-CFC(B)によるマウス骨髄コロニー形成における
MPIF-1およびM-CIFの影響を示す。
図14は、新鮮に単離された骨髄細胞のM-CFSおよびSCF刺激コロニー形成におけ
るバキュロウイルス発現M-CIFおよびMPIF-1の影響を示す。
図15は、骨髄細胞のlin-集団のIL3およびSCF刺激の増殖および分化へのMPIF-1
およびM-CIFの影響を示す。
図16A〜B。図16A〜Bは、骨髄細胞の系統枯渇集団由来のGr.1およびMac-1(表面
マーカー)ポジティブ集団の生成へのMPIF-1およびM-CIFの影響を示す。lin-細胞
を、IL-3(5ng/ml)およびSCF(100ng/ml)のみ(a)、MIPF-1(50ng/ml)を補充(b)、ま
たはM-CIF(50ng/ml)を補充(c)した、増殖培地中でインキュベートした。次いで
、細胞を骨髄肺分化Gr.1、Mac-1、Sca-1、およびCD45R表面抗原に対するモノク
ローナル抗体で染色し、そしてFACScanにより分析した。データを、大きな（図1
6A）および小さな（図16B）細胞集団の両方におけるポジティブ細胞の百分率と
して示される。
図17は、MPIF-1タンパク質の存在が、IL3、M-SCF、およびGM-CSFに対する骨髄
細胞コロニー形成を阻害することを示す。
図18。MPIF-1の用量応答は、骨髄細胞コロニー形成を阻害する。細胞を単離し
、そして図19におけるように処置した。処置された細胞を、IL-3、GM-CSF、また
はM-CSF(5ng/ml)の存在下で、MPIF-1を１、10、50または100ng/mlを伴うか伴わ
ないで、寒天ベースのコロニー形成において1,000細胞／ディッシュの密度でプ
レートした。データを、特異的な因子のみで形成されるコロニー数の百分率とし
てのコロニー形成として示す。データを、標準偏差を示すエラーバーとともに二
連のディッシュの平均として示す。
図19。ヒト単球におけるMPIF-1をコードするRNAの発現。新鮮な洗浄単球由来
の総RNAを単離し、そして100U/mlのhu rIFN-g、100ng/ml LPSまたは両方で処理
した。核処理からのRNA（８μｇ）を1.2％アガロースゲル上で電気泳動により分
離し、そしてナイロンメンブレンに移した。MPIF-l mRNAを32P-標識cDNAでプロ
ーブすることにより定量し、そして得られたオートラジオグラフのバンドを濃度
測定的に定量した。
図20A〜B。図20Aは、MPIF-1アミノ酸配列の分析を示す（配列番号４）。α、
β、ターン、およびコイル領域；親水性および疎水性；両親媒性領域；可撓性領
域；抗原性指標および表面確率を示す。「抗原性指標−Jameson-Wolf」グラフに
おいて、図１（配列番号４）におけるアミノ酸残基21〜30、31〜44、49〜55、59
〜67、72〜83、86〜103、および110〜120、または、図１（配列番号４）におい
てそこにおける任意の範囲もしくは数値は、MPIF-1タンパク質の示された高度に
抗原性の領域に対応する。図20Bは、M-CIFアミノ酸配列の分析を示す（配列番号
２）。α、β、ターン、およびコイルの領域；親水性および疎水性；両親媒性領
域；可撓性領域；抗原性指標および表面確率を示す。「抗原性指標−Jameson-Wo
lf」グラフにおいて、図２（配列番号２）におけるアミノ酸残基20〜36、42〜52
、52〜64、67〜75、75〜84、および／または86〜93、または、図２（配列番号２
）においてそこにおける任意の範囲もしくは数値は、M-CIFタンパク質の示され
た高度に抗原性の領域に対応する。
図21A-B。図21Aは、MPIF-1の5-Fu誘発性のLPP-CFC細胞の殺傷への骨髄保護性
効果を示す。図21Bは、MPIF-1のAra-C誘発性のLPP-CFC細胞の殺傷への骨髄保護
性効果を示す。
図22は、5-Fu-誘発性の循環白血球数の減少のマウスのMPIF-1前処理の影響を
示す。
図23は、３群のマウス（１群あたり６匹）を含む実験設計を示す。これらのマ
ウスは、以下のように処置した。群１（１、２、および３日目に生理食塩水を注
射した）；群２（０日目および３日目に5-Fuを注射した）；および群３（０日目
および３日目に5-Fuを注射し、そしてMPIF-1を１、２、および３日目に注射した
）。骨髄を、６日目および９日目に採集してクローン原性アッセイを用いてHPP-
CFCおよびLPP-CFC頻度を決定した。
図24は、第二の用量の5-Fuの前のMPIF-1の投与の、骨髄におけるHPP-CFCおよ
びLPP-CFC頻度における効果を示す。
図25は、MPIF-1改変体を示す。MPIF-1の120アミノ酸配列の最初の80アミノ酸
配列（図１（配列番号４））を、一文字アミノ酸コードで示す。ここで最初の21
残基は、切断されて成熟型野生型タンパク質を生じるシグナル配列の特徴を示す
。改変体−１および改変体−６は、野生型には存在しないＮ末端のメチオニンを
含む。あるいは、改変体−９の最初の４アミノ酸（HAAG）は、野生型MPIF-1タン
パク質には存在しない。改変体−１、−６、および−９は、それぞれ配列番号７
、８、および９に対応する。改変体−２は、配列番号４におけるアミノ酸残基46
〜120に対応する。改変体−３は、配列番号４におけるアミノ酸残基45〜120に対
応する。改変体−５は、配列番号４のアミノ酸残基49〜120に対応する。改変体
−７は、配列番号４のアミノ酸残基39〜120に対応する。改変体−８は、配列番
号４のアミノ酸残基44〜120に対応する。
図26A〜図26B。図26Aは、ヒトMPIF-1スプライシング改変体cDNAのヌクレオチ
ド配列を示す（配列番号10）。このcDNA配列を、一文字アミノ酸コードを用いて
137アミノ酸のタンパク質（配列番号11）をコードするオープンリーディングフ
レームとともに示す。下線を示したＮ末端21アミノ酸は、推定リーダー配列を示
す。MPIF-1配列には表されないがスプライス改変体に独特な18アミノ酸配列の挿
入は、イタリック体で表される。図26Bは、MPIF-1改変体（配列番号11）と野生
型MPIF-1分子（配列番号４）とのアミノ酸配列の比較を示す。
図27は、ヒト単球におけるMPI-1αによって誘導される最大のカルシウム動員
応答の50％に要求されるMPIF-1改変体タンパク質の濃度を示す。
図28Aおよび28Bは、図27の凡例に記載される100ng/mlで、示されたタンパク質
に対する応答してヒト単球において測定された細胞内有利カルシウム濃度におけ
る変化を示す。
図29は、ヒト単球におけるMIP-1α刺激カルシウム動員を脱感作するMPIF-1変
異体の能力を示す。
図30は、MPIF-1変異体に対するヒト末梢血単核細胞（PBMC）の化学誘引的応答
を示す。括弧内の数字は、示された濃度範囲で観察されたバックグラウンドを超
える化学誘引剤の刺激の倍数を反映する。
図31は、インビトロでの低増殖能力コロニー形成細胞（LPP-CFC）の増殖およ
び分化におけるMPIF-1の影響を示す。
図32は、マウスにおけるLPS誘導敗血ショック組換えヒトM-CIFでの前処理によ
る保護を示す。Balb/cマウスの群（n=7）に０日目に25mg/kgのLPSをi.P.投与し
た。M-CIFをi.P.で３mg/kg体重で、LPS投与の前日、当日、および翌日（−１、
０、および＋１）の３連続日にわたって与えた。緩衝液のみを受けるマウスは疾
患コントロールとして役立った。致死率の力学は、LPS投与後56時間について追
跡した。
図33は、致死性ショックにおけるM-CIFの保護的効果がLPS用量に依存すること
を示す。Balb/cマウスの群（n=9）に、異なる程度の敗血症誘発について０日目
に25mg/kgのLPSをi.P.注射した。10mg/kgのM-CIFを、LPS処置マウスの各群へ３
連続日にわたって毎日i.p投与した。致死率の力学は、LPS投与後56時間にわたっ
て追跡した。
図34は、マウスにおけるLPS誘導致死ショックに対する保護がM-CIF用量に依存
することを示す。Balb/cマウスの群（n=8）を、０日目に25mg/kgのLPSをi.P.注
射し、そして異なる用量（１、３、または10mg/kg）のM-CIFで毎日３連続日（−
１、０、＋１）にわたって処置した。緩衝液のみを受けるマウスは疾患コントロ
ールとして役立った。致死率の力学は、LPS投与後120時間について追跡した。
図35A〜Bは、Balb/c SCIDマウスにおけるLPS誘導ショックにおけるM-CIFの保
護効果を示す。Balb/c SCIDマウスの群（n=5〜7）に０日目に20、30、または40m
g/kgのLPSをi.P.投与し；そしてM-CIF処置を、３連続日にわたって（−１、０、
＋１）３mg/mlの１日用量でLPS処置マウスの各群に施す。20mg/kgのLPS誘導マウ
スにおけるM-CIF前処理の結果は、死を起こさないLPS単独注射と同一であった。
図36は、敗血症におけるE.coliおよびCHO発現ベクター由来のM-CIFタンパク質
の保護効果を示す。Balb/cマウスの群（n=８）に、０日目に25mg/kgのLPSを注射
し；そして３連続日にわたって（−１、０、＋１）１mg/kgでM-CIFのことなるバ
ッチ（E1および）で処置した。緩衝液のみを受けるマウスは疾患コントロールと
して役立った。致死率の力学は、LPS投与後120時間について追跡した。
図37。アジュバント誘導関節炎における足の浮腫を低減させるM-CIFの効力。L
ewisラットの群（n=5）を、０日目に５mg/mlのMycobacterium butyricumを含む1
00μｌ/ラットのフロイントの完全アジュバントで尾部の付け根に皮内注射した
。０日目に予防的処置を開始し、そして毎日（M-CIF、５回／週）16日間、緩衝
液（40m酢酸ナトリウム；500mM NaCl）中の１または３mg/kgでのM-CIFをi.P.で
、または薬物コントロールとして16日間毎日（５回／週）メチルセルロース中の
1mg/kgのインドメタシンをp.o.で継続した。緩衝液またはメチルセルロースのみ
を受けるラットは疾患コントロールとして役立った。両方の後ろ足の膨脹を、示
された日にちに、プレチスモメーターチャンバーを用いてモニターし、そして試
験薬物の足の体積における効力の百分率を計算した。
図38。総関節炎症におけるM-CIFの保護効果。図40と同一の実験の終わりに（
これは、アジュバント免疫の40日後であった）、１群あたり二匹のラット由来の
２本の後ろ脚を、組織染色分析のために収集した。結果を総組織学的値の平均と
して表す。
図39。関節炎の慢性特徴におけるM-CIFの保護効果。アジュバント免疫の40日
後にまでM-CIFまたはインドメタシンの毎日の処置を延期した図40と類似の実験
を実施して、肥大、繊維症、血管拡張および血管のまわりのリンパ球凝集を含む
慢性組織病理学的変化をさらに分析した。結果を、上記の総特徴の平均（n=5）
として表した。独立Ｔ検定を、統計的有意を評価するために使用した。
図40。骨および軟骨浸食におけるM-CIFの保護効果。図39と同様の実験におい
て、パンヌス形成、骨および軟骨破壊を評価した。結果を、上記の総特徴の平均
(n=5)として表した。独立Ｔ検定を、統計的有意を評価することを得るために使
用した。
図41。M-CIF処置は、DBA/IマウスにおけるII型コラーゲン誘導関節炎の発生を
予防する。雌性DBA/ilacJマウスを完全フロイントのアジュバントに懸濁したウ
シII型コラーゲンで尾部の付け根にi.d.免疫した。20日後、マウスに、60mg/100
のLPSのs.c.注射を投与した。LPS注射の２日前に、３群の動物（１群あたり１０
匹）に、３mg/mlのインドメタシン、M-CIF、またはそれぞれ、それらの緩衝液コ
ントロールをi.P.注射した。これらの処置を14日間にわたって毎日継続した。動
物を検査して、そしてそれらの臨床的な症状を半定量化した。事象％を、この図
において示す。
図42。動物を、図44に記載されるウシII型コラーゲンで免疫した。結果を平均
の重篤度として表す。
図43は、全身性TNF-A産生におけるM-CIFの抑制効果を示す。雌性Balb/cマウス
の群を、０日目に生理食塩水中のE.coli血清型0127:B8（Sigma）由来の25mg/kg
のリポポリサッカライド（LPS）を投与した。M-CIFまたは緩衝液をLPS注射の１
日前および同日（１時間前）に投与した。血清を、LPS投与後の種々の時間点で
収集し、そしてTNF-Aレベルを決定した。結果を独立Ｔ検定で分析し、そしてデ
ータを平均±SEMとして表した。
図44は、M-CIF処置マウスから単離された腹膜細胞からのTNF-α産生の減少を
示す。マウスを、２日間3mg/kgのM-CIFで処置した。第二のM-CIF注射の１時間後
に腹腔細胞を採集し、そしてLPSの存在または非存在下でサイトカイン産生につ
いてアッセイするために培養物中に入れる。TNF-αのレベルをELISAによって測
定した
図45は、M-CIF処置マウスの腹腔における相殺帽数の増加を示す。マウスを、
処置しなかったか、ビヒクルコントロールで処置したか、または1mg/kgおよび3m
g/kgのM-CIFで、毎日６連続日処置した。７日目に、マウスを屠殺してそして腹
膜細胞を採集してそして定量した。
図46は、M-CIF処置マウスの腹腔におけるCD4陽性Ｔリンパ球における特定の増
加を示す。マウスを図48A〜48Bに記載されるように処置した。各動物を処置しな
い、ビヒクル処置、1mg/kg M-CIF処置、および3mg/kgM-CIF群からの異なるシン
ボルにより表す。各群は、各10匹の動物を含み、これは、CD4、CD5、CD8、MacI
、MHCクラスII、B220、IgM、Gr.IおよびCD14に対する抗体を用いる細胞表面染色
により分析される各動物からの細胞を伴う。
図47は、M-CIF処置マウスの腹腔における総Ｔリンパ球細胞数（CD5/IgM-、CD4
、およびCD8）の増加を示す。
図48A〜48Bは、MacI+／MHCクラスII細胞の百分率に対応する増加を伴う、M-CI
F処置マウスの腹腔におけるMacI+／MHCクラスII＋細胞の百分率の増加を示す。
図49は、M-CIF処置マウスの腹腔におけるMacI+／MHCクラスII−細胞の総数の
増加を示す。
図50は、MPIF-1の投与に対する応答での正常マウスの幹細胞可動化を示す。
図51は、FACS Vantage方法によって決定されるとおり、２サイクルの5-Fu処置
の後の血小板の回収におけるMPIF-1とG-SCFとの効果の比較を示す。
図52は、２サイクルの5-Fu処置の後の血液中のGra.1およびMacIダブルポジテ
ィブ細胞の回収におけるMPIF-1とG-SCFとの効果の比較を示す。
図53は、FACS Vantage方法によって決定されるとおり、２サイクルの5-Fu処置
の後の骨髄中のGra.1およびMacIダブルポジティブ細胞の回収におけるMPIF-1とG
-SCFとの効果の比較を示す。
図54は、２サイクルの5-Fu処置の後の骨髄中の造血前駆体の回収におけるMPIF
-1とG-CSFとの効果の比較を示す。
図55。14週間にわたって毎日（５日間／週）１または5mg/kgのM-CIF(n=8)ある
いは緩衝液（ｎ＝９）でi.P.処置した３つの異なる群におけるMRL lprマウス（
８週齢）の生存率の経時変化。
図56。14週間にわたって１日１回、３日間／週で、１または５mg/kgのM-CIF(n
=8)あるいは緩衝液（ｎ＝９）でi.p.処置した３つの異なる群におけるMRL lprマ
ウス（８週齢）の生存率の経時変化。
図57は、マウスが８週齢の時から14週間にわたって毎日（毎週５日間）緩衝液
コントロール、rhM-CIFまたはメトトレキサート（MTX）を1mg/kgで処置した23週
齢MRL lpr/lrpマウスの両方の腎臓の二重盲検組織評価によるタンパク質円柱形
成における変化。値は、１群あたり４〜５マウスの平均±SEMである。
図58。マウスが８週齢の時から14週間にわたって毎日（毎週５日間）緩衝液コ
ントロール、rhM-CIFまたはメトトレキサート（MTX）を1mg/kgで処置した23週齢
MRL lpr/lrpマウスの両方の腎臓の複数盲検組織評価による糸球体損傷における
変化。複数盲検組織評価により評価された糸球体損傷は、基底膜肥厚、半月体形
成および瘢痕、過剰細胞性、繊維症、および核崩壊の総計を表す。値は、１群あ
たり４〜５マウスの平均±SEMである。
図59。マウスが８週齢の時から14週間にわたって毎日（毎週５日間）緩衝液コ
ントロール、rhM-CIFまたはメトトレキサート（MTX）を1mg/kgで処置した23週齢
MRL lpr/lrpマウスの両方の腎臓の複数盲検組織評価による腎臓硬化症における
変化。値は、１群あたり４〜５マウスの平均±SEMである。
図60。マウスが８週齢の時から14週間にわたって毎日（毎週５日間）緩衝液コ
ントロール、rhM-CIFまたはメトトレキサート（MTX）を1mg/kgで処置した23週齢
MRL lpr/lrpマウスの両方の腎臓の免疫組織評価によるマクロファージ浸潤にお
ける変化。値は、１群あたり４〜５マウスの平均±SEMである。
図61。マウスが８週齢の時から14週間にわたって毎日（毎週５日間）緩衝液コ
ントロール、rhM-CIFまたはメトトレキサート（MTX）を1mg/kgで処置した23週齢
MRL lpr/lrpマウスの両方の腎臓の複数盲検組織評価によるリンパ球浸潤および
脈管周囲炎における変化。値は、１群あたり４〜５マウスの平均±SEMである。
図62は、pHE4-5発現ベクター（配列番号56）およびサブクローン化したMPIF-1
Δ23 cDNAコード配列の模式図を示す。カナマイシン耐性マーカー遺伝子、MPIF-
1Δ23コード配列、oric配列、およびlacIQコード配列の位置を示す。
図63は、MPIF-1Δ23の産生のための発酵プロセスの概観を示す。
図64は、図63似示されるプロセスによって産生されるMPIF-1Δ23を回収するた
めに使用される方法の流れ図を示す。
図65は、図63および64に示されるプロセスによって産生されそして回収される
MPIF-1Δ23の精製のためのプロセスを示す。
図66は、pHEプロモーター（配列番号57）の調節エレメントのヌクレオチド配
列を示す。２つのlacオペレーター配列、Shine-Delgamo配列（S/D）、および末
端のHindIIIおよびNdeI制限部位（イタリック体）を示す。
図67A〜67Gは、pHEベクター（配列番号56）の完全ヌクレオチド配列を示す。
実施態様の説明
本発明は、以下のようなポリペプチドをコードする単離されたポリヌタレオチ
ド分子、またはポリペプチド自身を利用する、診断的または治療的組成物および
方法を提供する：（i）ヒト単球コロニー阻害因子（M-CIF）ポリペプチド（以前
にMIPI-γおよびケモカインβ1（CKβ1またはckb-1）と称した）；（ii）ヒト骨
髄前駆体阻害因子-1（MPIF-1）ポリペプチド（以前にMIP-3およびケモカインβ8
（CKβ8またはckb-8）と称した）；および／または（iii）マクロファージ阻害
タンパク質-4（MIP-4）、ならびにこれらを産生するためのベクター、宿主、お
よび組換えもしくは合成方法を提供する。
MPIF-1、M-CIFおよびMIP-4ポリヌクレオチド
本発明の局面に従って、それぞれ、図１、２、または３（配列番号２、４、お
よび６）の推定アミノ酸配列を有する全長または成熟MPIF-1、M-CIF、またはMIP
-fポリペプチドならびに1994年２月９日にATCC寄託第75675号として寄託された
クローンのcDNAによりコードされる成熟MIP-4ポリペプチド、1993年10月13日に
寄託されたATCC第75572号として寄託されたクローンのcDNAによってコードされ
るM-CIFポリペプチドをコードする単離された核酸配列（ポリヌクレオチド）が
提供される。アメリカンタイプカルチャーコレクションの住所は、12301 Park L
awn Drive，Rockville，Maryland 20852である。寄託クローンは、pBluescript
SK(-)プラスミド（Stratagene，LaJolla，CA）に含まれる。
本明細書中において言及される寄託（単数または複数）は、特許手順の目的の
ための微生物の寄託の国際認定に関するブタベスト条約の条件下に維持される。
これらの寄託は、当業者に対して単に簡便になるように提供され、そして寄託が
35U.S.C．§112下で必要とされることを承認するものではない。寄託された物質
中に含まれるポリヌクレオチドの配列、ならびにそれによってコードされるポリ
ペプチドのアミノ酸配列は、本明細書中において参考として援用され、そして本
明細書中の配列の説明との任意のコンフリクトの事象において制限する。ライセ
ンスが、寄託された物質を作製、使用、または販売するために必要とされ得、そ
してそのようなライセンスは本明細書によって容認されない。
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、サイトカインまたは
ケモカインファミリー内に存在する炎症後スーパージーン「インタークライン」
に構造的に関連する。MPIF-1およびMIP-4の両方はM-CIE相同体であり、そしてMI
P-1βに対してよりもMIP-1αに対してより相同である。MIPF-1をコードするポリ
ヌクレオチドは、大動脈内皮cDNAライブラリーに由来し、そして120アミノ酸残
基のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含み、それは多
くのケモカインに対して顕著な相同性を示す。最大の適合は、ヒトマクロファー
ジ炎症性タンパク質1αに対してであり、36％同一性および66％類似性を示す（
図４）。
MIP-4（配列番号５）をコードするポリヌクレオチドは、ヒト成人肺cDNAライ
ブラリーに由来し、そして89アミノ酸残基のポリペプチドをコードするオープン
リーディングフレーム（配列番号６）を含み、これは多くのケモカインに対して
顕著な相同性を示す。最大の適合は、ヒト扁桃腺リンパ球LD78βタンパク質（配
列番号55）に対してであり、60％同一性および89％類似性を示す（図５）。さら
に、特徴的なモチーフ中のすべてのケモカインにおいて生じる４つのシステイン
残基は、両方のクローン（単数または複数）において保存される。遺伝子中の最
初の２つのシステイン残基が隣接する位置に存在するという事実によって、それ
らの残基は「C-C」またはケモカインのβサブファミリーとして分類される。他
のサブファミリー（「CXC」またはαサブファミリー）において、最初の２つの
システイン残基は、１つのアミノ酸によって分離されている。
M-CIFからコードされるポリヌクレオチド（配列番号１）は、93アミノ酸のポ
リペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（配列番号２）を含み、
その最初の約19はリーダー配列であり、その結果、成熟ペプチドは約74のアミノ
酸残基を含む。M-CIFは、ヒトマクロファージ阻害性タンパク質αに対して顕著
な相同性（80アミノ酸の伸長上の48％同一性および72％類似性）を示す。さらに
、特徴的なモチーフを含む４つのシステイン残基が保存される。
本発明のポリヌクレオチドは、RNAの形態またはDNA（このDNAは、cDNA、ゲノ
ムDNA、および合成DNAを含む）の形態であり得る。DNAは二本鎖または一本鎖で
あり得、そして一本鎖の場合には、コード鎖または非コード（アンチセンス）鎖
であり得る。成熟ポリペプチドをコードするコード配列は、図１、２、および３
に示すコード配列（それぞれ、配列番号３、１、および５）、または寄託したク
ローンのコード配列と同一であり得るか、あるいはそのコード配列が、遺伝コー
ドの重複または縮重の結果として、図１、２、および３（配列番号３、１、およ
び５）のDNAまたは寄託したcDNAと同じ成熟ポリペプチド（または、本明細書中
上記に簡単に記載されるように本明細書中注記される他のポリペプチド）をコー
ドする異なるコード配列であり得る。
図１、２、および３の成熟ポリペプチド（配列番号４、２、および６）、また
は寄託したcDNAによりコードされる成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオ
チドは、以下を包含し得る：成熟ポリペプチドのコード配列のみ；成熟ポリペプ
チドのコード配列、ならびにリーダーまたは分泌配列、もしくはプロタンパク質
配列のような付加的コード配列；成熟ポリペプチドのコード配列（および必要に
応じて付加的コード配列）および非コード配列（例えば、イントロンあるいは成
熟ポリペプチドのコード配列の５'および/または３'非コード配列）。
従って、用語「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」は、ポリペプチ
ドのコード配列のみを含むポリヌクレオチド、ならびに付加的コード配列、およ
び/または非コード配列を含むポリヌクレオチドを含む。
他に示されない限り、本明細書中のDNA分子を配列決定することによって決定
されるすべてのヌクレオチド配列は、自動化DNA配列決定機（例えば、Applied B
iosystems，Inc.のModel 373）を用いて決定され、そして本明細書中において決
定されるDNA分子によってコードされるポリペプチドのすべてのアミノ酸配列は
、上記のように決定したDNA配列の翻訳によって予測された。従って、この自動
化アプローチによって決定される任意のDNA配列について当該分野において公知
のように、本明細書中において決定された任意のヌクレオチド配列はいくつかの
誤
差を含み得る。自動化によって決定されたヌクレオチド配列は、配列決定された
DNA分子の実際のヌクレオチド配列に対して、代表的には少なくとも約90％同一
、より代表的には少なくとも約95％〜少なくとも約99.9％同一である。実際の配
列は、他のアプローチ（当該分野において周知の手動DNA配列決定法を含む）に
よってより正確に決定され得る。当該分野においてまた公知のように、実際の配
列と比較して、決定されたヌクレオチド配列中の単一の挿入または欠失は、ヌク
レオチド配列の翻訳におけるフレームシフトを引き起こし、その結果、決定され
たヌクレオチド配列によってコードされる予測されるアミノ酸配列は、配列決定
されたDNA分子によって実際にコードされるアミノ酸配列とは完全に異なり、そ
のような挿入または欠失の点で始まる。
他に示されない限り、本明細書中に示される各「ヌクレオチド配列」は、デオ
キシリボ核酸（A、G、C、およびTと省略される）の配列として示される。しかし
、核酸分子またはポリヌクレオチドの「ヌクレオチド配列」によって、DNA分子
またはポリヌクレオチドについてはデオキシリボヌクレオチド、そしてRNA分子
またはポリヌクレオチドについては、リボヌクレオチド(A、G、C、およびU)の対
応する配列が意図され、ここで、特定されたデオキシリボヌクレオチド配列中の
各チミジンデオキシリボヌクレオチド（T）は、リボヌクレオチドウリジン（U）
によって置き換えられる。例えば、デオキシリボヌクレオチドの略語を用いて示
されるように、配列番号１、３、または５の配列を有するRNA分子との言及は、
配列番号１の各デオキシリボヌクレオチドA、G、またはCが対応するリボヌクレ
オチドのA、G、またはCによって置換され、そして各デオキシリボヌクレオチドT
がリボヌクレオチドUによって置換された配列を有するRNA分子を示すことが意図
される。
本明細書中に提供される情報を用いて、図１、２、または３中のヌクレオチド
配列のような、MPIF-1、M-CIF、またはMIP-4の（それぞれの）ポリペプチドをコ
ードする本発明の核酸分子は、標準的なクローニングおよびスクリーニング手順
（例えば、開始物質としてmRNAを用いてcDNAをクローニングするための手順）を
用いて得られ得る。
本発明はさらに、図１、２、および３（配列番号４、２、および６）の推定ア
ミノ酸配列を有するポリペプチドまたは寄託したクローンのcDNAによりコードさ
れるポリペプチドの、フラグメント、アナログ、および誘導体をコードする本明
細書中上記のポリヌクレオチドの変異体に関する。ポリヌクレオチドの変異体は
、ポリヌクレオチドの天然に存在する対立遺伝子変異体、またはポリヌクレオチ
ドの天然に存在しない変異体であり得る。
本発明はまた、図１、２、および３（配列番号４、２、および６）に示すもの
と同じ成熟ポリペプチド、または寄託したタローン（単数または複数）のcDNAに
よりコードされる同じ成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならび
にこのようなポリヌクレオチドの変異体を包含する。この変異体は、図１、２、
および３（配列番号４、２、および６）のポリペプチド、または寄託したクロー
ン（単数または複数）のcDNAによりコードされるポリペプチドのフラグメント、
誘導体またはアナログをコードする。このようなヌクレオチド変異体は、欠失変
異体、置換変異体、および付加または挿入変異体を包含する。
本明細書中上記で示したように、ポリヌクレオチドは、図１、２、および３（
配列番号４、２、および６）に示すコード配列、または寄託したクローンのコー
ド配列の、天然に存在する対立遺伝子変異体であるコード配列を有し得る。当該
分野で公知なように、対立遺伝子変異体は、１つ以上のヌタレオチドの置換、欠
失または付加を有し得るポリヌクレオチド配列の別の形態であり、これはコード
されるポリペプチドの機能を実質的に変化させない。
本発明はまた、ポリヌクレオチドを含み、ここで、成熟ポリペプチドについて
のコード配列は、同一のリーディングフレームにおいて、宿主細胞からのポリペ
プチドの発現および分泌を補助するポリヌクレオチド配列（例えば、細胞からの
ポリペプチドの輸送を制御するための、分泌配列として機能するリーダー配列）
に融合し得る。リーダー配列を有するポリペプチドは、プレタンパク質であり、
そして宿主細胞によって切断されるリーダー配列を有し、ポリペプチドの成熟形
態を形成し得る。これらのポリヌクレオチドはまた、付加的５'アミノ酸残基を
加えた成熟タンパク質であるプロタンパク質をコードし得る。プロ配列を有する
成熟タンパク質は、プロタンパク質であり、そしてタンパク質の不活性な形態で
ある。一旦プロ配列が切断されると、活性な成熟タンパク質が残る。
従って、例えば、本発明のポリヌクレオチドは、成熟タンパク質、あるいはプ
ロ配列を有するタンパク質、またはプロ配列およびプレ配列（リーダー配列）の
両方を有するタンパク質をコードし得る。
本発明のポリヌクレオチドはまた、本発明のポリペプチドの精製を可能にする
マーカー配列にインフレームで融合されたコード配列を有し得る。マーカー配列
は、細菌宿主の場合には、マーカーに融合された成熟ポリペプチドの精製を提供
する、pQE-9ベクターにより供給されるヘキサヒスチジンタグであり得る。ある
いは、例えば、マーカー配列は、哺乳動物宿主（例えば、COS-7細胞）が使用さ
れる場合は、血球凝集素(HA)タグであり得る。HAタグは、インフルエンザ血球凝
集素タンパタ質に由来するエピトープと一致する（Wilson，I.ら、Cell，37:767
(1984)）。
用語「遺伝子」は、ポリペプチド鎖を産生することに関するDNAのセグメント
を意味し；それは、コード領域の前後の領域（リーダーおよびトレーラー）、な
らびに個々のコードセグメント（エクソン）間に介在性配列（イントロン）を含
む。
示されるように、本発明の核酸分子は、RNAの形態（例えばmRNA）、またはDNA
の形態（例えば、cDNA、およびクローニングによって得られるまたは合成的に生
成されるゲノムDNA）であり得る。DNAは、二本鎖または一本鎖であり得る。一般
鎖DNAまたはRNAは、センス鎖としてもまた公知のコード鎖であり得るか、または
それはアンチセンス鎖としてもまた言及される非コード鎖であり得る。
用語「単離された」は、物質がその本来の環境（例えば、天然に存在する場合
は、天然の環境）から取り出されていることを意味する。例えば、生きている動
物の中に存在する天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、単離
されていないが、天然の系において共存する物質の幾らかまたは全てから分離さ
れている同一のポリヌクレオチドまたはDNAまたはポリペプチドは、単離されて
いる。このようなポリヌクレオチドはベクターの一部であり得、そして／または
このようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、組成物の一部であり得、そ
してそのようなベクターまたは組成物はその天然の環境の一部ではないように、
なお単離され得る。単離されたRNA分子は、本発明のDNA分子のインビボまたはイ
ンビトロRNA転写物を含む。本発明による単離された核酸分子は、さらに合成的
に生成されたような分子を含む。
本発明の単離した核酸分子は、MPIF-1 cDNA、M-CIF cDNA、またはMIP-4 cDNA
についてのオープンリーディングフレーム(ORF)を含むDNA分子；成熟M-CIFタン
パク質、成熟MPIF-1タンパク質、または成熟MIP-4タンパク質についてのコード
配列を含むDNA分子；および、上記の配列とは実質的に異なるが、遺伝子コード
の縮重に起因してなおM-CIFポリペプチド、MPIF-1ポリペプチド、またはMIP-4ポ
リペプチドをコードする配列を含むDNA分子を含む。当然のことながら、遺伝子
コードは、当該分野において周知である。従って、上記の縮重した変異体を生成
することは、当業者にとって日常的である。
本発明はさらに、配列間に少なくとも95％の同一性が存在する場合、本明細書
中上記の配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本発明は特に、
本明細書中上記のポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイ
ズするポリヌクレオチドに関する。本明細書中で用いられる用語「ストリンジェ
ントな条件」は、ハイブリダイゼーションが、配列間に少なくとも95％、そして
好ましくは少なくとも97％の同一性が存在する場合のみに生じることを意味する
。好ましい実施態様において、本明細書中上記のポリヌクレオチドにハイブリダ
イズするポリヌクレオチドは、図１、２、および３のcDNA（配列番号３、１、お
よび５）、もしくは寄託されたcDNAによりコードされる成熟ポリペプチドと実質
的に同じ生物学的機能または活性のいずれかを保持するポリペプチドをコードす
る。
あるいは、ポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドにハイブリダイズ
する少なくとも20塩基、好ましくは30塩基、そしてより好ましくは少なくとも50
塩基を有し得、そして本発明のポリヌクレオチドは、それに対して上記のように
同一性を有し、そして活性を保持してもしなくてもよい。例えば、そのようなポ
リヌクレオチドは、配列番号１、３、および５のポリヌクレオチドについてのプ
ローブとして（例えば、ポリヌクレオチドの回収のため、または診断用プローブ
として、またはPCRプライマーとして）使用され得る。
別の局面において、本発明は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条
件下で上記の本発明の核酸分子中のポリヌクレオチドの一部にハイブリダイズす
るポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を提供する（例えば、ATCC受託番
号75572(M-CIF)；ATCC受託番号75676(MPIF-1)；またはATCC受託番号75675(MIP-4
)に含まれるcDNAクローン）。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条
件」によって、溶液（50％ホルムアミド、５×SSC（150mM NaCl，15mMクエン酸
三ナトリウム）、50mMリン酸ナトリウム(pH7.6)、５×デンハート溶液、10％デ
キストランリン酸、および20g/mlの変性させた剪断したサケ精子DNAを含む）中
での42℃にて一晩のインキュベーション、続く約65℃での0.1×SSC内でのフィル
ターを洗浄することを意図される。
ポリヌクレオチドの「一部」にハイブリダイズするポリヌクレオチドによって
、参照ポリヌクレオチドの、少なくとも約15ヌクレオチド(nt)、そしてより好ま
しくは少なくとも約20nt、なおさらに好ましくは約30nt、そしてさらにより好ま
しくは約30〜70ntにハイブリダイズするポリヌクレオチド（DNAまたはRNA）が意
図される。これらは、先に、そしてより詳細には以下で考察されるような診断用
プローブおよびプライマーとして有用である。
当然のことながら、参照ポリヌクレオチド（例えば、寄託されたcDNAクローン
）のより大きな部分（例えば、50〜750nt長）、または参照ポリヌクレオチドの
全長にハイブリダイズするポリヌクレオチドはまた、本発明によるプローブとし
て有用であり、寄託されたcDNAのヌクレオチド配列、または配列番号１(M-CIF)
；配列番号３(MPIF-1)；または配列番号５(MIP-4)に示されるようなヌクレオチ
ド配列のすべてではないにしろほとんどに対応するポリヌクレオチドも同様であ
る。例えば、「少なくとも20nt長」のポリヌクレオチドの一部によって、参照ポ
リヌクレオチドのヌクレオチド配列由来の20以上の連続したヌクレオチドが意図
される。示されるように、そのような部分は、従来のDNAハイブリダイゼーショ
ン技術によるプローブとして、または上記のポリメラーゼ連鎖反応(PCR)による
標的配列の増幅のためのプライマーとして診断的に有用である（例えば、Molecu
lar Cloning，A Laboratory Manual，第２版、Sambrook，J.，Fritsch，E.F．お
よびManiatis，T.編，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Har
bor，N.Y．(1989)を参照のこと、その全体の開示は、本明細書中において参考と
して援用される）。
MPIF-1 cDNAクローン、M-CIF cDNAクローン、およびMIP-4 cDNAクローンは寄
託され、そして決定されたヌクレオチド配列が提供されているため、MPIF-1 cDN
A分子、M-CIF cDNA分子、およびMIP-4cDNA分子の一部にハイブリダイズするポリ
ヌクレオチドを生成することは、当業者に日常的である。例えば、MPIF-1 cDNA
クローン、M-CIF cDNAクローン、およびMIP-4 cDNAクローンの、制限エンドヌク
レアーゼ切断または超音波処理による剪断は、それぞれMPIF-1 cDNA分子、M-CIF
cDNA分子、およびMIP-4 cDNA分子にハイブリダイズするポリヌタレオチドであ
る種々のサイズのDNA部分を生成するために容易に使用され得る。
あるいは、本発明のハイブリダイズするポリヌクレオチドは、公知の技術に従
って合成的に生成され得る。当然のことながら、ポリA配列（例えば、cDNAの3'
末端ポリ(A)トラクト）にのみ、またはT(またはU)残基の相補的な伸長にハイブ
リダイズするポリヌクレオチドは、本発明の核酸の一部にハイブリダイズするた
めに使用される本発明のポリヌタレオチドに含まれない。なぜなら、そのような
ポリヌタレオチドは、ポリ(A)伸長を含む任意の核酸分子またはその相補体（例
えば、実際に任意の二本鎖cDNAクローン）にハイブリダイズするからである。
示されるように、MPIF-1ポリペプチド、M-CIFポリペプチド、およびMIP-4ポリ
ペプチドをコードする本発明の核酸分子は、以下を含むが、これらに限定されな
い：それ自体によって成熟ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸；成熟
ポリペプチドについてのコード配列およびさらなる配列（例えば、リーダーをコ
ードする配列）または分泌配列（例えば、プレタンパク質配列またはプロタンパ
ク質配列またはプレプロタンパク質配列）；成熟ポリペプチドのコード配列（先
述のさらなるコード配列を有するまたは有さない）であり、転写、mRNAプロセシ
ング（スプライシングおよびポリアデニル化シグナル（例えば、リボソーム結合
およびmRNAの安定性）を含む）において役割を担う転写非翻訳配列のようなイン
トロン、および非コード5'および3'配列を含むが、これらに限定されない、さら
なる非コード配列を共に有するコード配列；さらなるアミノ酸（例えば、さらな
る機能性を提供するアミノ酸）をコードするさらなるコード配列。従って、ポリ
ペプチドをコードする配列は、マーカー配列（例えば、融合ポリペプチドの精製
を容易にするペプチドをコードする配列）に融合され得る。本発明のこの局
面の特定の好ましい実施態様において、マーカーアミノ酸配列は、とりわけヘキ
サ-ヒスチジンペプチド(例えば、pQEベクター(Quiagen，Inc.)において提供され
るタグ)であり、その多くは市販されている。例えば、Gentzら、Proc．Natl．Ac
ad．Sci．USA 86:821-824(1989)において記載されるように、ヘキサ-ヒスチジン
は、融合タンパク質の簡便な精製を提供する。「HA」タグは、インフルエンザ赤
血球凝集素由来のエピトープに対応する精製のために有用な別のペプチドであり
、これはWilsonら、Cell 37:767(1984)によって記載されている。以下に議論さ
れるように、他のこのような融合タンパク質は、MPIF-1、M-CIF、またはMIP-4の
ポリペプチド、またはＮ末端もしくはＣ末端でFcに融合されるフラグメントのう
ちの少なくとも１つを含む。
本発明はさらに、本発明の核酸分子の変異体に関し、これは、MPIF-1ポリペプ
チド、M-CIFポリペプチド、およびMIP-4ポリペプチドの一部、アナログ、または
誘導体をコードする。変異体は、天然の対立遺伝子変異のように天然に存在し得
る。「対立遺伝子変異」によって、生物の染色体上の所定の遺伝子座を占める遺
伝子のいくつかの交換形態の１つが意図される。GenesV，Lewin，B編、Oxford U
niversity Press，New York(1994)。天然に存在しない変異体は、当該分野で公
知の変異誘発技術を用いて生成され得る。
そのような変異体は、ヌクレオチド置換、欠失、または付加によって生成され
るものを含む。置換、欠失、または付加は、１つ以上のヌクレオチドを含み得る
。変異体は、コード領域、非コード領域、またはその両方において変換され得る
。コード領域における変換は、保存性もしくは非保存性の、アミノ酸置換、欠失
、または付加を生じ得る。これらのうちで特に好ましいものは、サイレントな置
換、付加、および欠失であり、それらは、MPIF-1、M-CIF、またはMIP-4のポリペ
プチドもしくはその一部の特性および活性を変化しない。また、この点において
特に好ましいものは保存性置換である。最も高度に好ましいものは、本明細書中
に記載のような、成熟タンパク質をコードする核酸分子、または寄託されたcDNA
クローンによってコードされる成熟アミノ酸配列である。
MPIF-1、M-CIF、およびMIP-4の相同ポリヌクレオチド。本発明はさらに、配列
番号２、４、および６のポリペプチド、ならびにそのフラグメント（このフ
ラグメントは、そのようなポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド
に少なくとも30塩基、そして好ましくは少なくとも50塩基を有する）をコードす
るポリヌクレオチドに少なくとも95％同一性を有するポリヌクレオチドに関する
。
本発明のさらなる実施態様は、以下のヌクレオチドに少なくとも95％、96％、
97％、98％、99％同一なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む単離
された核酸分子を含む：(a)予想されるリーダー配列を含む、それぞれ、配列番
号４、配列番号２、もしくは配列番号６のアミノ酸配列を有するMPIF-1、M-CIF
、およびMIP-4のポリペプチドまたはフラグメントをコードするヌクレオチド配
列；(b)予想されるリーダー配列を含むが、Ｎ末端メチオニン残基を含まない、
それぞれ、配列番号４、配列番号２、もしくは配列番号６のアミノ酸配列を有す
るMPIF-1、M-CIF、およびMIP-4のポリペプチドまたはフラグメントをコードする
ヌクレオチド配列；(c)成熟MPIF-1ポリペプチド、成熟M-CIFポリペプチド、およ
び成熟MIP-4ポリペプチド（リーダーを除いた全長ポリペプチド）をコードする
ヌクレオチド配列；(d)寄託されたcDNAクローンによってコードされるリーダー
を含む、完全なアミノ酸配列を有する全長ポリペプチドをコードするヌクレオチ
ド配列；(e)寄託されたcDNAクローンによってコードされるアミノ酸配列を有す
る成熟ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列;または(f)(a)、(b)、(c)、(
d)、もしくは(e)中の任意のヌクレオチドに相補的なヌクレオチド配列。
MPIF-1、M-CIF、およびMIP-4のポリペプチドをコードする参照ヌクレオチド配
列に少なくとも例えば95％「同一な」ヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチ
ドによって、ポリヌクレオチド配列が、ポリペプチドをコードする参照ヌクレオ
チド配列の各100ヌクレオチド当たり５までの点変異を含み得ることを除き、ポ
リヌクレオチドのヌクレオチド配列が参照配列に同一であることが意図される。
換言すれば、参照ヌクレオチド配列に少なくとも95％同一なヌクレオチド配列を
有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列中の５％までのヌクレオチドが
欠失され、別のヌクレオチドと置換され得るか、または参照配列中の全ヌクレオ
チドの５％までの数のヌクレオチドが参照配列中に挿入され得る。これらの参照
配列の変異は、参照ヌクレオチド配列の5'もしくは3'末端位置、またはこれらの
末端位置間のいずれかの場所に生じ得、参照配列中のヌクレオチド間で個々に、
または参照配列内の１つ以上の連続した群に分散して生じる。
実際の問題として、任意の特定の核酸分子が、例えば、図１、３、もしくは５
に示されるヌクレオチド配列、または寄託されたcDNAクローンのヌクレオチド配
列に、少なくとも95％、96％、97％、98％、もしくは99％同一であるか否かは、
Bestfitプログラム（Wisconsin Sequence Analysis Pachage，Version 8 for Un
ix，Genetics Computer Group，University Research Park，575 Science Drive
，Madison，WI 53711）のような公知のコンピュータプログラムを用いて慣習的
に決定され得る。Bestfitは、２つの配列間の最も相同性のセグメントを見出す
ためのSmithおよびWaterman，Advances in Applied Mathematics 2:482-489(198
1)の局所的相同性アルゴリズムを使用する。Bestfit、または特定の配列が、例
えば本発明による参照配列に95％同一であるか否かを決定するための任意の他の
配列整列プログラムを用いる場合、当然のことながら、同一性％が参照ヌクレオ
チド配列の全長にわたって計算され、そして参照配列中のヌクレオチドの総数の
５％までの相同性でのギャップが許容されるようにパラメータを設定する。
当業者が認識するように、上記の配列決定の誤差の可能性、ならびに異なる公
知のタンパク質におけるリーダーについての切断可能部位の可変性に起因して、
寄託されたcDNAによってコードされる成熟M-CIFポリペプチドは、約74アミノ酸
を含むが、69〜93アミノ酸の範囲のいずれかの場所であり得；そしてこのタンパ
ク質の実際のリーダー配列は約19アミノ酸であるが、約15〜約24のアミノ酸の範
囲のいずれかの場所であり得る。
当業者が認識するように、上記の配列決定の誤差の可能性、ならびに異なる公
知のタンパク質におけるリーダーについての切断可能部位の可変性に起因して、
奇託されたcDNAによってコードされる成熟MPIF-1ポリペプチドは、約99アミノ酸
を含むが75〜120アミノ酸の範囲のいずれかの場所であり得；そしてこのタンパ
ク質の実際のリーダー配列は約21アミノ酸であるが、約15〜約35のアミノ酸の範
囲のいずれかの場所であり得る。
当業者が認識するように、上記の配列決定の誤差の可能性、ならびに異なる公
知のタンパク質におけるリーダーについての切断可能部位の可変性に起因して、
寄託されたcDNAによってコードされる成熟MIP-4ポリペプチドは、約69アミノ酸
を含むが60〜89アミノ酸の範囲のいずれかの場所であり得；そしてこのタンパク
質の実際のリーダー配列は約20アミノ酸であるが、約15〜約30のアミノ酸の範囲
のいずれかの場所であり得る。
核酸プローブ。そのような単離された分子、特にDNA分子は、染色体とのイン
サイチュハイブリダイゼーションによる遺伝子マッピングのため、そして例えば
、ノーザンブロット分析によってヒト組織におけるMPIF-1、M-CIF、および／ま
たはMIP-4遺伝子の発現を検出するためのプローブとして有用である。本発明は
さらに、本明細書中に記載の単離された核酸分子のフラグメントに関する。寄託
されたMPIF-1 cDNA、M-CIF cDNA、もしくはMIP-4 cDNAのヌクレオチド配列、ま
たはそれぞれ図１、２、もしくは３（配列番号３、１、および５）のいずれか、
もしくはすべてに示されるヌクレオチド配列を有する単離された核酸分子のフラ
グメントによって、少なくとも約15nt長、そしてより好ましくは少なくとも約20
nt長、さらにより好ましくは少なくとも約30nt長、そしてさらにより好ましくは
少なくとも約40nt長のフラグメントが意図され、これは本明細書中で議論される
ように診断用プローブおよびプライマーとして有用である。当然のことながら、
寄託されたMPIF-1 cDNA、M-CIF cDNA、もしくはMIP-4cDNAのすべてではないにし
ろほとんどのヌクレオチド配列、または図１、２、および３（配列番号３、１、
および５）において示されるようなヌクレオチド配列に対応するフラグメントと
同様に、より長い50〜500nt長のフラグメントもまた本発明によって有用である
。例えば、少なくとも20nt長のフラグメントによって、寄託されたcDNAのヌクレ
オチド配列、または図１、２、および３（配列番号３、１、および５）において
示されるようなヌクレオチド配列由来の20以上の連続した塩基を含むフラグメン
トが意図される。遺伝子は寄託されており、そして図１、２、および３（配列番
号３、１、および５）において示されるようなヌクレオチド配列が提供されるた
め、そのようなDNAフラグメントを生成することは当業者に日常的である。例え
ば、制限エンドヌクレアーゼ切断、または超音波処理による剪断は、種々のサイ
ズのフラグメントを生成するために容易に使用され得る。あるいは、そのような
フラグメントは、合成的に生成され得る。
本発明の全長遺伝子のフラグメントを、cDNAライブラリーについてのハイブリ
ダイゼーションプローブとして使用して、全長cDNAを単離し得、そしてその遺伝
子に対する高い配列類似性または類似の生物学的活性を有する他のcDNAを単離し
得る。好ましくは、この型のプローブは、少なくとも30塩基を有し、そして例え
ば50以上の塩基を含み得る。また、プローブを使用して、全長転写物に対応する
cDNAクローン、ならびに調節領域、プロモーター領域、エクソン、およびイント
ロンを含む完全な遺伝子を含むゲノムクローン（単数または複数）を同定し得る
。スクリーニングの例は、オリゴヌクレオチドプローブを合成するための公知の
DNA配列を用いることによって遺伝子のコード領域を単離する工程を包含する。
本発明の遺伝子の配列に相補的な配列を有する標識したオリゴヌクレオチドを用
いて、ヒトcDNA、ゲノムDNA、またはmRNAをスクリーニングし、プローブがライ
ブラリーのどのメンバーにハイブリダイズするかを決定する。
ベクター、宿主細胞、およびタンパク質発現。本発明はまた、本発明の単離さ
れた核酸分子を含むベクター、組換えベクターを含む遺伝子操作された宿主細胞
、および組換え技術によるMPIF-1、M-CIF、もしくはMIP-4のポリペプチドまたは
フラグメントの生成に関する。本発明はさらに、細菌系におけるタンパク質生成
に有用な新規な発現ベクターに関する。これらの新規なベクターは、pHE4シリー
ズのベクター、そして特にpHE4-5ベクターによって例示される（図62および67A
〜67G）。
本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、宿主における増殖につ
いての選択マーカーを含むベクターに結合され得る。以下で詳細に議論されるよ
うに、一般にプラスミドベクターは、沈殿物（例えば、リン酸カルシウム沈殿物
）において、または荷電脂質との複合体において、宿主細胞中に導入される。ベ
クターがウイルスである場合、ベクターは、適切なパッケージング細胞株を用い
てインビトロでパッケージングされ、次いで宿主細胞中に形質導入され得る。
目的のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたシス作用制御領域を含むベク
ターは、本発明の実施における使用について好ましい。シス作用制御領域は、オ
ペレーターおよびエンハンサー配列を含む。本明細書中で使用される用語「オペ
レーター」は、通常DNAから構成される、隣接ヌクレオチド配列の転写を制御す
るヌクレオチド配列をいう。オペレーター配列は、一般に細菌染色体由来である
。
本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の、高等真核生物による
転写は、ベクターにエンハンサー配列を挿入することにより増大される。エンハ
ンサーはシス作用エレメントであり、通常は約10〜約300bpであり、これは所定
の宿主細胞型においてプロモーターに作用してその転写を増大させる。例として
、複製起点のbp100〜270の後期側に位置するSV40エンハンサー、サイトメガロウ
イルスの初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハ
ンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。
適切なトランス作用因子は、宿主によって供給され得るか、相補ベクターによ
って供給され得るか、または宿主中への導入に際してベクター自体によって供給
され得る。
この点における特定の好ましい実施態様において、ベクターは特異的な発現を
提供し、それは誘導性および／または細胞型特異的であり得る。そのようなベク
ターの中で特に好ましいものは、操作が容易な環境要因（例えば、温度および栄
養添加物）によって誘導されるものである。また、実施例30において記載される
pHE4-5ベクターは、MPIF-1の発現について好ましい。
本発明において有用なさらなる発現ベクターは、染色体由来のベクター、エピ
ソーム由来のベクター、およびウイルス由来ベクター（例えば、細菌プラスミド
、バクテリオファージ、酵母エピソーム、酵母染色体エレメント、ウイルス（例
えば、バキュロウイルス、パポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイル
ス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、およびレトロウイルス）、およびそれ
らの組み合わせ由来のベクター（例えば、コスミドおよびファージミド））を含
む。
適切な核酸配列は、種々の手順によってベクター中に挿入され得る。一般に、
核酸配列は、適切な制限エンドヌクレアーゼ部位（単数または複数）中に、当該
分野で公知の手順によって挿入される。そのような手順および他のものは、当業
者の範囲内であると考えられる。
核酸挿入物は、適切なプロモーター（例えば、ファージλPLプロモーター、E
．coli lac、trp、およびtacプロモーター、SV40初期プロモーターおよび後期プ
ロモーター、ならびにレトロウイルスLTRのプロモーター、ならびに原核生物も
しくは真核細胞またはそれらのウイルス中の遺伝子の発現を制御することが知ら
れている他のプロモーター）に作動可能に連結されるべきである。本明細書中で
使用される用語「プロモーター」は、ヌクレオチド配列、または最小でRNAポリ
メラーゼ作用についての結合部位もしくは開始部位を提供するヌクレオチド配列
の群をいう。発現構築物はさらに、転写開始、終結のための部位、および転写さ
れる領域において翻訳のためのリボソーム結合部位を含む。構築物によって発現
される成熟転写物のコード部分は、好ましくは始めの翻訳開始、および翻訳され
るべきポリペプチドの末端に適切に配置された終結コドン(UAA、UGA、またはUAG
)を含む。ベクターはまた、発現を増強するための適切な配列を含み得る。
本明細書中で使用される句「作動可能に連結された」は、ヌクレオチド配列が
、配列（単数または複数）の機能を変換し得るように別のヌクレオチド配列（単
数または複数）に結合される連結をいう。例えば、プロモーター／オペレーター
に作動可能に連結されたタンパク質コード配列は、これらの配列の影響または制
御下でタンパク質コード配列の発現を行う。２つのヌクレオチド配列（例えば、
タンパク質コード配列およびコード配列の5'末端に連結されたプロモーター領域
配列）は、プロモーター機能の誘導がタンパク質コード配列mRNAの転写を生じる
場合、そして２つのヌクレオチド配列間の連結の性質が(1)フレームシフト変異
の導入を生じることも、(2)発現調節配列がmRNAまたはタンパク質の発現を指向
するのを妨げることもしない場合、作動可能に連結されているといわれる。従っ
て、プロモーター領域は、プロモーターがヌクレオチド配列の転写をもたらし得
る場合、ヌクレオチド配列に作動可能に連結される。
本明細書中で使用される句「クローニングベクター」は、プラスミドもしくは
ファージ核酸、または宿主細胞において自律的に複製し得、そして１つもしくは
少数のエンドヌクレアーゼ認識部位によって特徴付けられる他の核酸配列をいい
、この部位で、そのような核酸配列はベクターの本質的な生物学的機能の欠失な
しに決定可能な様式で切断され得、この部位中で核酸がその複製およびクローニ
ングを生じるようにスプライシングされ得る。クローニングベクターはさらに、
クローニングベクターを用いて形質転換された細胞の同定における使用に適切な
マーカーを含み得る。例えば、マーカーは、エリスロマイシンおよびカナマイシ
ン耐性である。用語「ビヒクル」は、時に「ベクター」のために使用される。
本明細書中で使用される句「発現ベクター」は、発現ベクターの宿主中での形
質転換後、発現ベクター中にクローン化される構造遺伝子を発現し得るクローニ
ングベクターに類似のベクターをいう。発現ベクターにおいて、クローン化され
た構造遺伝子（目的の任意のコード配列）は、そのような遺伝子が特定の宿主に
おいて発現されるのを可能にする特定の配列の制御下に置かれる（すなわち、そ
れに作動可能に連結される）。例えば、pHE4-5において、構造遺伝子は、T5ファ
ージプロモーター配列および２つのlacオペレーター配列に作動可能に連結され
る。発現制御配列は変化し、そしてさらに特定の転写エレメント（例えば、転写
配列）および／または翻訳エレメント（例えば、開始および終結部位）を含み得
る。
先に示されるように、発現ベクターは、好ましくは少なくとも１つの選択マー
カーを含む。そのようなマーカーは、真核細胞培養については、ジヒドロ葉酸レ
ダクターゼまたはネオマイシン耐性、そしてE.coliおよび他の細菌における培養
については、テトラサイクリン、カナマイシン、またはアンピシリン耐性遺伝子
を含む。適切な宿主の代表的な例としては以下を含むが、これらに限定されない
：細菌細胞（例えば、E．coli、Streptomyces、Salmonella tyPhimurium細胞）
；真菌細胞（例えば酵母細胞）；昆虫細胞（例えば、DrosophilaS2およびSpodop
tera Sf9細胞）；動物細胞（例えば、CHO、COSまたはBowes黒色腫細胞）；植物
細胞。上記の宿主細胞のための適切な培養培地および条件は、当該分野において
公知である。
本発明の実施における発現ベクターの使用に加えて、本発明はさらに、目的の
タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたオペレーター
およびプロモーターエレメントを含む新規な発現ベクターを含む。そのようなベ
クターの１つの例は、pHE4-5（配列番号56）であり、これは以下および実施例30
の両方において詳細に記載される。pHE4-5ベクターを含む細菌宿主は、アメリカ
ンタイプカルチャーコレクション(メリーランド20852、ロックビル、パークロー
ンドライブ12301)に1997年９月30日に寄託され、そしてATCC受託番号209311を与
えられた。
図62および67A〜67Gにおいて要約されるように、pHE4-5ベクター(配列番号5
6)の成分は以下を含む：1)選択マーカーとしてのネオマイシンホスホトランスフ
エラーゼ遺伝子、2)E.coli複製起点、3)T5ファージプロモーター配列、4)２つの
lacオペレーター配列、5)MPIF-1Δ23をコードするヌクレオチド配列（配列番号2
7）、6)Shine-Deigarno配列、7)ラクトースオペロン抑制遺伝子(lacIq)。複製起
点(oriC)は、pUCi9(LTI，Gaithersburg，MD)由来である。プロモーター配列およ
びオペレーター配列を合成的に作製した。核酸配列の合成生成は当該分野におい
て周知である。CLONTECH 95/96 Catalog，215-216頁、CLONTECH，1020 East Mea
dow Circle，Palo Alto，CA 94303。
上記のように、pHE4-5ベクターはlacIq遺伝子を含む。lacIqは、lacオペレー
ターの強固な調節を与えるlacI遺伝子の対立遺伝子である。Arnann，E.ら、Gene
69:301-315(1988);Stark，M，Gene51:255-267(1987)。lacIq遺伝子は、lacオペ
レーターに結合し、そして下流の(すなわち、3')配列の転写をブロックする抑制
タンパク質をコードする。しかし、lacIq遺伝子産物は、ラクトースまたは特定
のラクトースアナログ(例えば、イソプロピルB-D-チオガラクトロピラノシド(TP
TG))のいずれかの存在下でlacオペレーターから解離する。従って、MPIF-1Δ23
は、pHE4-5ベクターを含む非誘導宿主細胞中で検出可能な量で生成されない。し
かし、薬剤(例えば、IPTG)の添加によるこれらの宿主細胞の誘導は、MPIF-1Δ23
コード配列の発現を生じる。
pHE4-5ベクターのプロモーター／オペレーター配列(配列番号57)は、T5ファー
ジプロモーターおよび２つのlacオペレーター配列を含む。１つのオペレーター
は、転写開始部位に対して5'に配置され、そして他方は、同じ部位に対して3'に
配置される。これらのオペレーターは、lacIq遺伝子産物と組み合わせて存在す
る場合、lacオペロン誘導因子(例えば、IPTG)の非存在下で下流配列の強固な抑
制を与える。lacオペロンから下流に位置する、作動可能に連結された配列の発
現は、lacオペロン誘導因子(例えば、IPTG)の添加によって誘導され得る。lac誘
導因子のlacIqタンパク質への結合は、lacオペレーター配列からのそれらの放出
および作動可能に連結された配列の転写の開始を生じる。遺伝子発現のlacオペ
ロン調節は、Devlin，T．TEXTBOOK OF BIOCHEMISTRY WITH CLINICAL CORRELATIO
NS，第４版（1997）、802-807頁に総説される。
pHE4シリーズのベクターは、MPIF-1Δ23コード配列を除いて、pHE4-5ベクター
のすべての成分を含む。pHE4ベクターの特徴は、最適化された合成T5ファージプ
ロモーター、lacオペレーター、およびShine-Delagarno配列を含む。さらに、こ
れらの配列はまた、挿入された遺伝子の発現が強固に調節され得、そして高レベ
ルの発現が誘導の際に生じるように最適に空間配置される。
本発明のタンパク質の生成における使用のために適切な公知の細菌プロモータ
ーには、E.coli lacIおよびlacZプロモーター、T3およびT7プロモーター、gptプ
ロモーター、λPRおよびPLプロモーター、ならびにtrpプロモーターが挙げられ
る。適切な真核生物プロモーターは、CMV直前プロモーター、HSVチミジンキナー
ゼプロモーター、初期および後期SV40プロモーター、レトロウイルスLTRのプロ
モーター(例えば、Rous Sarcoma Virus (RSV))、ならびにメタロチオネインプロ
モーター（例えば、マウスメタロチオネイン-Ｉプロモーター）を含む。
pHE4-5ベクターはまた、AUG開始コドンの5'側にShine-Delgarno配列を含む。S
hine-Delgarno配列は、AUG開始コドンから約10ヌクレオチド上流(すなわち、5')
に一般に位置する短い配列である。これらの配列は、本質的には、原核生物リボ
ソームをAUG開始コドンに指向する。
従って、本発明はまた、本発明のタンパク質の生成に有用な発現ベクターに関
する。本発明のこの局面は、pHE4-5ベクター(配列番号56)によって例示される。
細菌における本発明のタンパク質の発現における使用のために好ましいさらな
るベクターは、以下を含む：pQE70、pQE60、およびpQE-9(Qiagen);pBSベクター
、pD10、Phagescriptベクター、pBluescriptベクター、pNH8A、pNH16a、pNm8A、
pNH46A(Stratageneから入手可能)；ならびにptrc99a、pKK233-3、pDR540、pRIT5
(Pharmaciaから入手可能)。好ましい真核生物ベクターは、pWLNEO、pSV2CAT、pO
G44、pXT1、およびpSG(Stratageneから入手可能)；ならびに、pSVK3、pBPV、pMS
G、およびpSVL(Pharmaciaから入手可能)。
他の適切なベクターは、当業者に容易に明白であり、そしてpBR322(ATCC 3701
7)、pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals，Uppsala，Sweden)、およびGEMI(Prom
ega Biotec，Madison，WI，USA)を含む。これらのpBR322「バックボーン」切片
は、適切なプロモーターおよび発現されるべき構造配列と組み合わせられる。
適切な宿主株の形質転換および宿主株の適切な細胞密度までの増殖後、選択され
たプロモーターは適切な手段（例えば、温度変化または化学的誘導）によって誘
導され、そして細胞はさらなる期間培養される。
さらなる実施態様では、本発明は上記の構築物を含有する宿主細胞に関する。
宿主細胞は、高等真核生物細胞（例えば、哺乳動物細胞）または下等真核生物細
胞（例えば、酵母細胞）であり得るか、あるいは宿主細胞は原核生物細胞（例え
ば、細菌細胞）であり得る。構築物の宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムト
ランスフェクション、DEAE-デキストラン媒介トランスフェクション、エレクト
ロポレーション、形質導入、感染、または他の方法により達成され得る。そのよ
うな方法は、多くの標準的な実験マニュアルにおいて記載される(例えば、Davis
ら，BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY,(1986))。
組換え構築物は、周知の技術（例えば、感染、形質導入、トランスフェクショ
ン、トランスベクション(transvection)、エレクトロポレーション、および形質
転換）を用いて宿主細胞中に導入され得る。ベクターは、例えば、ファージ、プ
ラスミド、ウイルスベクター、またはレトロウイルスベクターであり得る。レト
ロウイルスベクターは、複製コンピテントまたは複製欠失であり得る。後者の場
合において、ウイルス増殖は、一般に宿主細胞を相補する際にのみ起こる。
宿主細胞は、本発明のベクター（例えば、クローニングベクターまたは発現ベ
クターであり得る）を用いて遺伝子操作（形質導入または形質転換またはトラン
スフェクト）される。ベクターは、例えば、プラスミド、ウイルス粒子、ファー
ジなどの形態であり得る。操作された宿主細胞は、プロモーターの活性化、形質
転換体の選択、またはMPIF-1、MIP-4、およびM-CIF遺伝子の増幅に適切なように
改変された従来の栄養培地において培養され得る。培地条件（例えば、温度、pH
など）は、発現のために選択された宿主細胞に関して以前に使用された条件であ
り、当業者に明白である。
本発明のポリヌクレオチドは、組換え技術によりポリペプチドを産生するため
に用いられ得る。従って、例えば、ポリヌクレオチドは、ポリペプチドを発現す
るための種々の発現ビヒクル、特にポリペプチドを発現するためのベクターまた
はプラスミドのいずれか１つに含まれ得る。このようなベクターは、染色体核酸
配列、非染色体核酸配列、および合成核酸配列を含む（例えば、SV40の誘導体；
細菌性プラスミド；ファージ核酸；酵母プラスミド；プラスミドおよびファージ
核酸の組み合わせに由来するベクター、ウイルス核酸（例えば、ワクシニア、ア
デノウイルス、鶏痘ウイルス、αウイルス、および仮性狂犬病））。しかし、宿
主において複製可能で、かつ存続可能である限り、他の任意のベクターも使用さ
れ得る。
上記のように、本明細書中上記のような適切な核酸配列ならびに適切なプロモ
ーター配列または制御配列を含有するベクターは、適切な宿主を形質転換して宿
主にタンパク質を発現させるために用いられ得る。
適切な宿主の代表的な例としては、以下が挙げられ得る：細菌細胞（例えば、
E．coli、Streptomyces、Salmonella tyPhimurium）；真菌細胞（例えば酵母）
；昆虫細胞（例えば、DrosophilaおよびSf9）；動物細胞（例えば、CHO、COSま
たはBowes黒色腫）；植物細胞など。適切な宿主の選択は、本明細書中の教示か
ら当業者の範囲内であると考えられる。
さらに詳細には、本発明はまた、上記で広範に記載した１つ以上の配列を含む
組換え構築物を包含する。構築物は、ベクター（例えば、プラスミドベクターま
たはウイルスベクター）を含み、このベクターの中に、本発明の配列が正方向ま
たは逆方向に挿入されている。この実施態様の好ましい局面において、構築物は
さらに、配列に作動可能に連結された調節配列（例えば、プロモーターを含む）
を含む。非常に多数の適切なベクターおよびプロモーターが当業者には公知であ
り、そして市販される。以下のベクターが例として提供される。細菌性：pQE70
、pQE60、pQE-9(Qiagen)、pBS、pD10、phagescript、psiX174、pBluescript SK
、pbsks、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A(Stratagene)；ptrc99a、pKK223-3、p
KK233-3、pDR540、pRIT5(Pharmacia)。真核性：pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1
、pSG(Stratagene)，pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL(Pharmacia)。しかし、他の任意
のプラスミドまたはベクターも、それらが宿主において複製可能で、かつ存続可
能である限り、使用され得る。
宿主細胞中の構築物を従来の様式で用いて、組換え配列によってコードされる
遺伝子産物を生成し得る。あるいは、本発明のポリペプチドは、従来のペプチド
合成機によって合成的に生成され得る。
成熟タンパク質は、哺乳動物細胞、酵母、細菌、または他の細胞中で適切なプ
ロモーターの制御下で発現され得る。無細胞翻訳系もまた、本発明のDNA構築物
に由来するRNAを使用して、このようなタンパク質を産生するために用いられ得
る。原核生物宿主および真核生物宿主で使用される適切なクローニングベクター
および発現ベクターは、Sambrookら，Molecular Cloning:A Laboratory Manual
，第２版，Cold Spring Harbor,N.Y.，(1989)（この開示は、本明細書中に参考
として援用される）に記載されている。
一般に、組換え発現ベクターは、宿主細胞の形質転換を可能とする複製起点お
よび選択マーカー（例えば、E．coliのアンピシリン耐性遺伝子およびS.cerevis
iaeのTRP1遺伝子）、ならびに下流の構造配列の転写を指向する高発現遺伝子由
来のプロモーターを含有する。このようなプロモーターは、とりわけ、解糖酵素
（例えば、3-ホスホグリセリン酸キナーセ(PGK)）、α因子、酸性ホスファター
ゼ、または熱ショックタンパク質をコードするオペロンに由来し得る。異種構造
配列は、翻訳開始配列および翻訳終結配列、ならびに好ましくは翻訳されたタン
パク質の細胞膜周辺腔または細胞外の培地への分泌を指向し得るリーダー配列と
適切な相内で組立てられる。必要に応じて、異種配列は、所望の特徴（例えば、
発現された組換え産物の安定化または簡略化された精製）を与えるＮ末端同定ペ
プチドを含む融合タンパク質をコードし得る。
細菌の使用に有用な発現ベクターは、機能的なプロモーターと作動可能な読み
取り相で、適切な翻訳開始シグナルおよび翻訳終結シグナルと共に所望のタンパ
ク質をコードする構造核酸配列を挿入することにより構築される。ベクターは、
１つ以上の表現型選択マーカー、およびベクターの維持を確実にし、かつ所望な
らば宿主内での増幅を提供するための複製起点を含有する。形質転換のために適
切な原核生物宿主は、とりわけ、E．coli，Bacillus subtilis、Salmonella typ
himurium、ならびにPseudomonas属、Streptomyces属、およびStaphylococcus属
内の種々の種を含むが、他の種もまた選択対象として用いられ得る。
細胞は、代表的には遠心分離によって収集され、物理的または化学的手段によ
って破壊され、そして得られる粗抽出物は、さらなる精製のために保持される。
タンパク質の発現において使用される微生物細胞は、任意の簡便な方法（凍結
-解凍のサイクル、超音波処理、機械的破壊、または細胞溶解剤の使用を含む）
によって破壊され得、そのような方法は当業者に周知である。
種々の哺乳動物細胞の培養系もまた、組換えタンパク質を発現するために用い
られ得る。哺乳動物発現系の例には、Gluzman，Cell，23:175(1981)に記載され
るサル腎臓線維芽細胞のCOS-7株、および適合性のベクターを発現し得る他の細
胞株（例えば、C127、3T3、CHO、HeLa、およびBHK細胞株）が含まれる。哺乳動
物発現ベクターは、複製起点、適切なプロモーターおよびエンハンサー、ならび
に任意の必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナー部
位およびスプライスアクセプター部位、転写終結配列、ならびに５'隣接非転写
配列をまた含有する。SV40スプライス部位、およびポリアデニル化部位に由来す
る核酸配列は、必要な非転写遺伝的エレメントを提供するために使用され得る。
ポリペプチドおよびポリペプチドフラグメント。本発明はさらに、寄託された
cDNAによってコードされるアミノ酸配列、または図１、２、もしくは３（それぞ
れ、配列番号４、２、または６）中のアミノ酸配列を有する、単離されたMPIF-1
、M-CIF、またはMIP-4ポリペプチド、あるいは、上記のポリペプチドの一部を含
むペプチドまたはポリペプチドを提供する。用語「ペプチド」および「オリゴペ
プチド」は（一般に認識されるように）同義であると考えられ、そして各用語は
、文脈がペプチジル結合によって結合される少なくとも２つのアミノ酸の鎖を示
す必要がある場合、交換可能に使用され得る。用語「ポリペプチド」は、10より
多いアミノ酸残基を含む鎖について本明細書中において使用される。本明細書中
のすべてのオリゴヌクレオチドおよびポリペプチドの式または配列は、左から右
に、そしてアミノ末端からカルボキシ末端の方向で記載される。
「MPIF-1活性を有するポリペプチド」によって、特定の生物学的アッセイにお
いて測定される場合、本発明のMPIF-1タンパク質（全長タンパク質、または好ま
しくは成熟タンパク質のいずれか）の活性に同一である必要ではないが、類似の
活性を示すポリペプチドが意図される。MPIF-1タンパク質活性は、実施例15、16
、ならびに図11において示されるアッセイによって測定され得る。例えば、以下
の実施例15（後述）に開示されるインビトロでの骨髄保護(myeloprotection)ア
ッ
セイを用いて、MPIF-1タンパク質活性を測定した。
手短かには、系統劣化(lineage-depleted)細胞（Lin-細胞）の集団を、マウス
骨髄から単離し、そしてMPIF-1とともに、またはMPIF-1なしで、複数のサイトカ
インの存在下でインキュベートする。48時間後、各培養物の１つのセットを5-Fu
に与え、次いでインキュベーションをさらに24時間継続する。この時点で、生存
する低増殖可能性コロニー形成細胞(LPP-CFC)の数を、当業者に公知の任意の適
切なクローン原性アッセイによって決定する。LPP-CFCの大きな％（例えば、≧3
0〜50％（例えば、≧40％））を、MPIF-1の存在下で5-Fu誘導細胞傷害性から保
護するが、LPP-CFCのわずかな保護（＜５％）が、MPIF-1の非存在下または非関
連タンパク質の存在下で観察される。そのようなアッセイにおいて、高増殖可能
性コロニー形成細胞(HPP-CFC)は、MPIF-1の存在下で5-Fu誘導細胞傷害性からさ
らに保護され得るが、いくつかの場合においては保護され得ない。一般に、LPP-
CFCが保護されない場合、HPP-CFCは保護されない。
従って、「MPIF-1タンパク質活性を有するポリペプチド」は、上記のアッセイ
においてMPIF-1活性を示すポリペプチドを含む。活性の程度は、MPIF-1タンパク
質の活性の程度と同一である必要はないが、好ましくは「MPIF-1タンパク質活性
を有するポリペプチド」は、MPIF-1タンパク質と比較した場合、実質的に類似の
活性を示す（すなわち、候補ポリペプチドは、より大きな活性、すなわち参照MP
IF-1タンパク質と比較して約20分の１のみ、好ましくは約10分の１のみの活性を
示す）。
「M-CIF活性を有するポリペプチド」によって、特定の生物学的アッセイにお
いて測定される場合、本発明のM-CIFタンパク質（全長タンパク質、または好ま
しくは成熟タンパク質のいずれか）の活性に同一である必要ではないが、類似の
活性を示すポリペプチドが意図される。例えば、M-CIFタンパク質活性は、以下
の実施例25（後述）に記載されるようなアッセイにおいて、動物細胞（例えば、
骨髄細胞）によるM-CSF誘導コロニー形成のインビトロ阻害を用いて測定され得
る。
従って、「M-CIFタンパク質活性を有するポリペプチド」は、上記のアッセイ
においてM-CIF活性を示すポリペプチドを含む。活性の程度は、M-CIFタンパク質
の活性の程度と同一である必要はないが、好ましくは「M-CIFタンパク質活性を
有するポリペプチド」は、M-CIFタンパク質と比較した場合、実質的に類似の活
性を示す（すなわち、候補ポリペプチドは、より大きな活性、すなわち参照M-CI
Fタンパク質と比較して約20分の１のみ、好ましくは約10分の１のみの活性を示
す）。
本発明はさらに、MPIF-1ポリペプチド、M-CIFポリペプチド、およびMIP-4ポリ
ペプチドに関する。それらは、図１、２、および３（配列番号４、２、および６
）の推定アミノ酸配列を有するか、または寄託されたcDNAによってコードされる
アミノ酸配列、ならびにそのようなポリペプチドのフラグメント、アナログ、お
よび誘導体を有する。
図１、２、および３（配列番号４、２、および６）、または寄託されたcDNAに
よってコードされるポリペプチドをいう場合、用語「フラグメント」、「誘導体
」、および「アナログ」は、そのようなポリペプチドと同じ生物学的機能または
活性を本質的に保持するポリペプチドを意味する。従って、アナログは、プロタ
ンパク質部分の切断によって活性され、活性な成熟ポリペプチドを生成し得るプ
ロタンパク質を含む。
本発明のポリペプチドは、組換えポリペプチド、天然ポリペプチド、または合
成ポリペプチド、好ましくは組換えポリペプチドであり得る。
図１、２，および３（配列番号４、２、および６）のまたは寄託されたcDNAに
よりコードされたポリペプチドのフラグメント、誘導体、またはアナログは、（
ｉ）１つ以上のアミノ酸残基が保存されたまたは保存されていないアミノ酸残基
（好ましくは、保存されたアミノ酸残基）と置換され、およびこのような置換さ
れたアミノ酸残基が遺伝コードによってコードされたものであるかまたはそうで
ないもの、または（ii）１つ以上のアミノ酸残基が置換基を含むもの、または（
iii）成熟ポリペプチドが別の化合物（例えば、ポリペプチドの半減期を増大さ
せる化合物（例えば、ポリエチレングリコール）と融合されたもの、またはさら
なるアミノ酸（例えば、リーダーまたは分泌配列または成熟ポリペプチドの精製
のために使用される配列またはプロタンパク質配列）が成熟ポリペプチドと融合
されたものであり得る。このようなフラグメント、誘導体、およびアナログは、
本明細書における教示から当業者の範囲内であると判断される。
本発明のポリペプチドは、好ましくは、単離された形態で提供され、そして好
ましくは均一に精製される。
本発明のポリペプチドは、配列番号２、４、および６のポリペプチド（特に、
成熟ポリペプチド）、ならびに配列番号２、４、および６のポリペプチドに対し
て少なくとも95％の類似性（なおより好ましくは、少なくとも９５％の同一性）
を有するポリペプチドを含み、そしてまたこのようなポリペプチドの部分を含み
、このようなポリペプチドの部分は、一般に少なくとも30アミノ酸およびより好
ましくは少なくとも50アミノ酸を含む。
当該分野で知られるように、２つのポリペプチド間の「類似性」は、１つのポ
リペプチドのアミノ酸配列およびその保存されたアミノ酸置換を第２のポリペプ
チドの配列と比較することにより決定される。
もちろん、遺伝コードの縮重のために、当業者は、寄託されたcDNA（ATCC 756
76）の核酸配列または図１に示された核酸配列（配列番号３）に少なくとも95％
、96％、97％、98％、または99％同一である大量の核酸分子が、「MPIF-1タンパ
ク質活性を有する」ポリペプチドをコードすると即時に認識する。当業者はまた
、寄託されたcDNA（ATCC 75572）の核酸配列または図２に示された核酸配列（配
列番号１）に少なくとも95％、96％、97％、98％、または99％同一である大量の
核酸分子が、「M-CIFタンパク質活性を有する」ポリペプチドをコードすると即
時に認識する。さらに、当業者は、寄託されたcDNA（ATCC 75675）の核酸配列ま
たは図３に示された核酸配列（配列番号５）に少なくとも95％、96％、97％、98
％、または99％同一である大量の核酸分子が、「MIP-4タンパク質活性を有する
」ポリペプチドをコードすると即時に認識する。実際、これらのヌクレオチド配
列の縮重改変体は同じポリペプチドをコードしているので、これは、上記の比較
アッセイを行わなくてさえ当業者に明らかである。縮重改変体でないこのような
核酸分子については、妥当な数がまたMPIF-1、M-CIF、またはMIP-4タンパク質活
性を有するポリペプチドをコードしていることがさらに当該分野で認識される。
これは、当業者が、タンパク質機能に顕著に影響する可能性が低いかまたは影響
しないようであるアミノ酸置換（例えば、ある脂肪族アミノ酸と別の脂肪族アミ
ノ酸
との置換）を十分に理解しているからである。
例えば、表現型的にサイレントなアミノ酸置換を行う方法に関する指針は、Bo
eiw，J.U.ら、「Deciphering the Message in Protein Sequences;Tolerance to
Amino Acid Substitutions」Science 247:1306-1310(1990)に提供される。ここ
では、著者らは、アミノ酸配列の変化に対する寛容性を研究するための２つの主
要なアプローチが存在することを示している。第一の方法は、進化の過程に依存
し、ここでは変異が天然の選択によって許容されるかまたは拒絶されるかのいず
れかである。第二のアプローチは、クローン化された遺伝子の特定の位置にアミ
ノ酸配列変化を導入する遺伝子操作、または機能性を維持する配列を同定するた
めにスクリーニングする。著者らが述べているように、これらの研究は、タンパ
ク質が驚くほどアミノ酸置換に寛容であることを明らかにした。著者らは、どの
アミノ酸変化がタンパク質の特定の位置で許容性であるようであることをさらに
示している。例えば、ほとんどの埋没したアミノ酸残基は非極性側鎖を必要とす
るが、表面側鎖の特性のほとんどは一般的には保存されない。他のこのような表
現型的にサイレントな置換は、Bowie,J.U.ら、上述およびそこに援用されている
文献に記載されている。
本発明のポリペプチドのフラグメントまたは部分は、ペプチド合成による対応
する全長ポリペプチドの生成のために用いられ得る；従って、このフラグメント
は、全長ポリペプチドの生成のための中間体として用いられ得る。本発明のポリ
ヌクレオチドのフラグメントまたは部分は、本発明の全長ポリヌクレオチドを合
成するために用いられ得る。
翻訳されたタンパク質の小胞体の管腔、細胞膜周辺腔、または細胞外環境内へ
の分泌のために、適切な分泌シグナルは、発現されたポリペプチドに取り込まれ
得る。このシグナルは、ポリペプチドに対して内因性であるか、または異種シグ
ナルであり得る。
ポリペプチドは、改変型（例えば、融合タンパク質）で発現され得、そして分
泌シグナルだけでなく、さらなる異種機能領域もまた含み得る。例えば、さらな
るアミノ酸（特に荷電アミノ酸）の領域が、ポリペプチドのＮ末端に付加されて
、精製の間、または続く操作および保存の間の宿主細胞における安定性および維
持
を改善させ得る。また、ペプチド部分がポリペプチドに付加されて、精製を容易
にし得る。このような領域は、ポリペプチドの最終調製の前に除去され得る。ポ
リペプチドにペプチド部分を付加して、とりわけ分泌または排出を引き起こす、
安定性を増大させる、および精製を容易にすることは、当該分野においてよく知
られた日常的な技術である。好ましい融合タンパク質は、タンパク質の可溶化に
有用である免疫グロブリン由来の異種領域を含む。例えば、EP-A-0 464 533（カ
ナダ対応2045869）は、免疫グロブリン分子の定常領域の種々の部分を別のヒト
タンパク質またはそれらの一部と共に含む融合タンパク質を開示する。多くの場
合、融合タンパク質におけるFc部は、治療および診断に使用するために充分に有
利であり、従って、例えば、改善された薬物速度特性を生じる（EP-A-0232 262
）。他方で、いくつかの用途については、融合タンパク質が上述の有利な様式に
おいて、発現され、抽出され、そして精製された後、Fc部を欠失し得ることが望
ましい。これは、Fc部が治療および診断において使用する障害となることが分か
っている場合であり、例えば、融合タンパク質が免疫化のための抗原として用い
られる場合である。薬物探索において、例えば、ヒトタンパク質（例えば、hIL5
-レセプター）は、hIL-5のアンタゴニストを同定するための高処理量スクリーニ
ングアッセイの目的のために、Fc部と融合されている。D．Bennettら，Journal
of Molecular Recognition，Vol．8:52-58(1995)およびK．Johansonら、The Jou
rnal of Biological Chemistry，Vol．270，No.16:9459-9471(1995)を参照のこ
と。
MPIF-1、M-CIF、またはMP-4タンパク質は、周知の方法（硫酸アンモニウムま
たはエタノール沈降、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー
、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、
親和性クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、およ
びレクチンクロマトグラフィーを含む）によって、組換え細胞培養物から回収ま
たは精製され得る。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィー（「HPLC」）
が、精製のために用いられる。本発明のポリペプチドは、天然に精製された産物
、化学合成手順による産物、および原核生物または真核生物宿主（例えば、細菌
、酵母、高等植物、昆虫、および哺乳動物細胞を含む）から組換え技術により産
生さ
れた産物を包含する。組換え産生手順に用いられる宿主に依存して、本発明のポ
リペプチドは、グリコシル化であり得るか、または非グリコシル化であり得る。
さらに、本発明のポリペプチドはまた、ある場合では宿主媒介プロセスの結果と
して、初期改変メチオニン残基を含み得る。
MPIF-1、M-CIF、およびMIP-4ポリペプチド改変体。MPIF-1、M-CIF、またはMIP
-4ポリペプチドのいくつかのアミノ酸配列は、タンパク質の構造または機能に顕
著に影響することなく変化され得ることが、当該分野で認識される。配列におけ
るこのような差異が意図される場合、タンパク質上の活性を決定する必須領域が
存在することを覚えておくべきである。一般に、同様の機能を実施する残基が用
いられる場合、三次構造を形成する残基を置換することが可能である。他の場合
では、改変がタンパク質の非必須領域で生じる場合、残基のタイプは、完全に重
要ではない。
従って、本発明は、それぞれ、実質的なMPIF-1、M-CIF、またはMIP-4ポリペプ
チド活性を示すか、またはそれぞれ、以下に記載のタンパク質部分のような、MP
IF-1、M-CIF、またはMIP-4タンパク質の領域を含む、MPIF-1、M-CIF、またはMIP
-4ポリペプチドの変形をさらに包含する。このような変異体は、欠失、挿入、逆
位、反復、およびタイプ置換（例えば、別の親水性残基に対するある親水性残基
への置換、しかし、通例は、強い疎水性残基についての強い親水性残基への置換
ではない）を含む。小さな変化またはこのような「中性の」アミノ酸置換は、一
般に、活性においてほとんど影響を有さない。
保存的置換として代表的に理解されるのは、脂肪族アミノ酸Ala、Val、Leuお
よびIle間での別のものに対するある残基への置換；ヒドロキシル残基Serおよび
Thrの交換、酸性残基AspおよびGluの交換、アミド残基AsnおよびGln間の置換、
塩基性残基LysおよびArgの交換、および芳香族残基Phe、Tyr間の置換である。
さらに特に関心のあることはまた、荷電アミノ酸の別の荷電アミノ酸または中
性アミノ酸との置換である。これは改善された特性（例えば凝集が少ない）を有
するタンパク質を生じ得る。凝集の妨害は、高度に望ましい。タンパク質の凝集
は、活性の減少を生じ得るだけでなく、薬学的処方物を調製する際にそれらが免
疫原性であるため問題である（Pinckardら、Clin．Exp．Immunol.2:331-340(196
7)、Robbinsら、Diabetes 36:838-845(1987)、Clelandら、Crit．Rev．Therapeu
tic Drug Carrier Systems 10:317-377(1993)）。
アミノ酸の置換はまた、細胞表面レセプターへの結合の選択性を変化させ得る
。Ostadeら、Nature 361:266-268(1993)は、２つの既知のTNFレセプターの１つ
のみへのTNFαの選択的結合を生じる特定のTNFα変異を記載した。
上述に詳細に示されるように、どのアミノ酸変化が表現型的にサイレントであ
るようである（すなわち、機能に顕著に有害でないようである）かに関するさら
なる指針が、Bowie，J.U.ら、「Deciphering the Message in Protein Sequence
s:Tolerance to Amino Acid Substitutions」Science 247:1306-1310（1990）に
見出され得る（表１を参照のこと）。
示されるように、変化は、好ましくは、些細である（例えば、タンパク質の折
り畳みまたは活性に顕著に影響を及ぼさない保存的アミノ酸置換）（表１を参照
のこと）。
表１。保存的アミノ酸置換。 もちろん、当業者が行い得るアミノ酸置換の数は、上記および以下に記載の要
因を含む多くの要因に依存する。一般的にいえば、任意の所定のMPIF-1またはMC
IFポリペプチドまたはそれらの変異体についての置換の数は、目的物に依存して
、50、40、30、20、10、５、または３より多くない。特定のMPIF-1およびMCIFの
アミノ酸置換を以下に記載する。
MPIF-1改変体。さらに、MPIF-1の改変体が同定され、特徴づけられている。こ
れらのアナログのいくつかは、アミノ末端短縮を含む。さらに、明らかにオルタ
ナティブスプライシング部位から生じるMPIF-1アナログもまた、同定され、特徴
づけられている（図２６（配列番号１１））。実施例１７は、これらのMPIF-1ア
ナログの生物学的活性を開示する。これらのアナログの配列は、図２５（配列番
号７、８、および９、同様に配列番号４におけるアミノ酸残基46-120、45-120、
48-120、49-120、39-120、および44-120）に示される。
MPIF-1ポリペプチド（単数または複数）の特性を改善または改変するために、
タンパク質操作が用いられ得る。当業者に公知の組換えDNA技術は、新規なタン
パク質を作出するために用いられ得る。ムテインおよび欠失または融合タンパク
質は、例えば、活性の増強または安定性の増大を示し得る。さらに、それらは、
高収率で精製され得、そして少なくとも特定の精製および貯蔵条件下でより良好
な溶解性を示し得る。構築され得る変異のさらなる例を以下に記載する。
MPIF-1アミノ末端およびカルボキシ末端欠失：インターフェロンγは、タンパ
ク質のカルボキシ末端から８〜10アミノ酸残基を欠失させることにより、10倍ま
J．Blol．Chem.，268(4):2984-2988(1993)は、３、８、または27アミノ末端アミ
ノ酸残基を欠失した場合でさえもヘパリン結合活性を有する改変KGFタンパク質
を報告した。多くの他の例がいずれの当業者にも知られている。
図１（配列番号４）に示すアミノ酸配列の特に好ましいMPIF-1ポリペプチドを
以下に示す： 従って、１つの局面では、MPIF-1のＮ末端欠失変異体が、本発明によって提供
される。このような変異体は、図１（配列番号４）の少なくとも最初の22Ｎ末端
アミノ酸残基の欠失（すなわち、少なくともMet(1)−−Arg(22)の欠失）を有す
るが、最初の60Ｎ末端アミノ酸残基より多くはない欠失を有する図１（配列番号
４）に示すアミノ酸配列を含むものを含む。あるいは、欠失は、図１（配列番号
４）の少なくとも最初の22Ｎ末端アミノ酸残基を含むが、最初の53Ｎ末端アミノ
酸残基より多くはない。あるいは、欠失は、図１（配列番号４）の少なくとも最
初の33N末端アミノ酸残基を含むが、最初の53Ｎ末端アミノ酸残基より多くはな
い。あるいは、欠失は、図１（配列番号４）の少なくとも最初の37Ｎ末端アミノ
酸残基（すなわち、少なくともMet(1)−−Pro(37)の欠失）を含むが、最初の53
Ｎ末端アミノ酸残基より多くはない。あるいは、欠失は、図１（配列番号４）の
少なくとも最初の48Ｎ末端アミノ酸残基を含むが、最初の53Ｎ末端アミノ酸残基
より多くはない。
上記のMPIF-1のＮ末端欠失変異体の範囲に加えて、本発明はまた、上記の範囲
の全ての組み合わせに関する。例えば、図１（配列番号４）の少なくとも最初の
22Ｎ末端アミノ酸残基を含むが最初の48Ｎ末端アミノ酸残基より多くない欠失；
図１（配列番号４）の少なくとも最初の37Ｎ末端アミノ酸残基を含むが最初の48
Ｎ末端アミノ酸残基より多くない欠失；図１（配列番号４）の少なくとも最初の
22Ｎ末端アミノ酸残基を含むが最初の37Ｎ末端アミノ酸残基より多くない欠失；
図１（配列番号４）の少なくとも最初の22Ｎ末端アミノ酸残基を含むが最初の33
Ｎ末端アミノ酸残基より多くない欠失；図１（配列番号４）の少なくとも最初の
33Ｎ末端アミノ酸残基を含むが最初の37Ｎ末端アミノ酸残基より多くない欠失；
および図１（配列番号４）の少なくとも最初の33Ｎ末端アミノ酸残基を含むが最
初の48Ｎ末端アミノ酸残基より多くない欠失。
別の局面では、MPIF-1のＣ末端欠失変異体が本発明によって提供される。好ま
しくは、このMPIF-1のＣ末端欠失変異体のＮ末端アミノ酸残基は、図１（配列番
号４）のアミノ酸残基１(Met)または22（Arg）である。このような変異体は、少
なくとも最後のＣ末端アミノ酸残基（Asn(120)）であるが最後の52Ｃ末端アミノ
酸残基（例えば、図１（配列番号４）のアミノ酸残基Glu(69)-Asn（120）の欠失
）より多くない欠失を有する図１（配列番号４）に示すアミノ酸配列を含むもの
を含む。あるいは、欠失は、図１（配列番号４）の少なくとも最後の10または15
Ｃ末端アミノ酸残基を含むが、最後の52Ｃ末端アミノ酸残基より多くはない。あ
るいは、欠失は、図１（配列番号４）の少なくとも最後の20Ｃ末端アミノ酸残基
を含むが、最後の52Ｃ末端アミノ酸残基より多くはない。あるいは、欠失は、図
１（配列番号４）の少なくとも最後の30Ｃ末端アミノ酸残基を含むが、最後の52
Ｃ末端アミノ酸残基より多くはない。あるいは、欠失は、図１（配列番号４）の
少なくとも最後の36Ｃ末端アミノ酸残基を含むが、最後の52Ｃ末端アミノ酸残基
より多くはない。あるいは、欠失は、図１（配列番号４）の少なくとも最後の41
Ｃ末端アミノ酸残基を含むが、最後の52Ｃ末端アミノ酸残基より多くはない。あ
るいは、欠失は、図１（配列番号４）の少なくとも最後の45Ｃ末端アミノ酸残基
を含むが、最後の52Ｃ末端アミノ酸残基より多くはない。あるいは、欠失は、図
１（配列番号４）の少なくとも最後の48Ｃ末端アミノ酸残基を含むが、最後の52
Ｃ末端アミノ酸残基より多くはない。
上記のMPIF-1のＣ末端欠失変異体の範囲に加えて、本発明はまた、上記の範囲
の全ての組み合わせに関する。例えば、図１（配列番号４）の少なくとも最後の
Ｃ末端アミノ酸残基を含むが最後の48Ｃ末端アミノ酸残基より多くない欠失；図
１（配列番号４）の少なくとも最後のＣ末端アミノ酸残基を含むが最後の45Ｃ末
端アミノ酸残基より多くない欠失；図１（配列番号４）の少なくとも最後のＣ末
端アミノ酸残基を含むが最後の41Ｃ末端アミノ酸残基より多くない欠失；図１（
配列番号４）の少なくとも最後のＣ末端アミノ酸残基を含むが最後の36Ｃ末端ア
ミノ酸残基より多くない欠失；図１（配列番号４）の少なくとも最後のＣ末端ア
ミノ酸残基を含むが最後の10Ｃ末端アミノ酸残基より多くない欠失；図１（配列
番号４）の少なくとも最後の10Ｃ末端アミノ酸残基を含むが最後の20Ｃ末端アミ
ノ酸残基より多くない欠失；図１（配列番号４）の少なくとも最後の10Ｃ末端ア
ミノ酸残基を含むが最後の30Ｃ末端アミノ酸残基より多くない欠失；図１（配列
番号４）の少なくとも最後の10Ｃ末端アミノ酸残基を含むが最後の36Ｃ末端アミ
ノ酸残基より多くない欠失；図１（配列番号４）の少なくとも最後の20Ｃ末端ア
ミノ酸残基を含むが最後の30Ｃ末端アミノ酸残基より多くない欠失；など、など
、など．．．
さらに別の局面では、本発明によって含まれるのは、Ｎ末端およびＣ末端残基
の両方から欠失したアミノ酸を有するMPIF-1欠失変異体である。このような変異
体は、上述したＮ末端欠失変異体およびＣ末端欠失変異体の全ての組み合わせを
含む。このような変異体は、図１（配列番号４）の少なくとも最初の22Ｎ末端ア
ミノ酸残基の欠失であるが、最初の60Ｎ末端アミノ酸残基より多くはない欠失を
有し、かつ少なくとも最後のＣ末端アミノ酸残基を含むが最後の52Ｃ末端アミノ
酸残基より多くない欠失を有する図１（配列番号４）に示すアミノ酸配列を含む
ものを含む。あるいは、欠失は、図１（配列番号４）の少なくとも最初の33、37
、または48Ｎ末端アミノ酸であるが最初の52Ｎ末端アミノ酸より多くなく、そし
て図１（配列番号４）の少なくとも最後の10、20、30、36、41、45、または48Ｃ
末端アミノ酸残基であって、最後の52Ｃ末端アミノ酸より多くない欠失を含み得
る。上記範囲の全ての組み合わせがさらに含まれる。
アミノ酸の置換：本発明のさらなる局面はまた、アミノ酸の置換を含む。特に
関心があるのは、タンパク質の折り畳みに顕著に影響を及ぼさない保存的アミノ
酸置換である。当業者に公知の保存的アミノ酸置換の例は、上述の表１に示す。
さらに特に関心のあることは、荷電アミノ酸の別の荷電アミノ酸または中性ア
ミノ酸との置換である。これは改善された特性（例えば凝集が少ない）を有する
タンパク質を生じ得る。凝集の妨害は、高度に望ましい。タンパク質の凝集は、
活性の減少を生じ得るだけでなく、薬学的処方物を調製する際にそれらが免疫原
性であり得るため問題である（Pinckardら、Clin．Exp．Immunol.2:331-340(196
7)、Robbinsら、Diabetes 36:838-845(1987)、Clelandら、Crit．Rev．Therapeu
tic Drug Carrier Systems 10:307-377(1993)）。
MPIF-1タンパク質は、天然変異または人為的操作のいずれかからの１つまたは
いくつかのアミノ酸置換、欠失または付加を含み得る。図１（配列番号４）に示
すアミノ酸配列のいくつかの好ましい変異の例を、以下に提供する。（表示によ
り、例えば、Ala(21)Metは、図１（配列番号４）の21位のAlaがMetに置換される
ことを意図する。）MPIF-1の137アミノ酸スプライス改変体のアミノ末端欠失：
上述のように、本発明は、ヒトMPIF-1スプライス改変体をさらに提供する。cD
NA配列および137アミノ酸配列を図２６Ａ（それぞれ配列番号１０および１１）
に示す。真核生物発現系を用いて、本発明は、このMPIF-1スプライス改変体の３
つのＮ末端欠失変異体を発見した。これらは、His(60)-Asn(137)；Met(46)-Asn(
137)；およびPro(54)-Asn(137)を含む。従って、さらなる局面では、MPIF-1スプ
ライス改変体Ｎ末端欠失変異体は、本発明により提供される。このような変異体
は、図２６Ａ（配列番号１１）の少なくとも最初の45Ｎ末端アミノ酸残基の欠失
であるが、最初の59Ｎ末端アミノ酸残基より多くはない欠失を有する図２６Ａ（
配列番号１１）に示すアミノ酸配列を含むものを含む。あるいは、欠失は、図２
６Ａ（配列番号１１）の少なくとも最初の53Ｎ末端アミノ酸残基を含むが、
最初の59Ｎ末端アミノ酸残基より多くはない。あるいは、欠失は、図２６Ａ（配
列番号１１）の少なくとも最初の45Ｎ末端アミノ酸残基を含むが、最初の53Ｎ末
端アミノ酸残基より多くはない。
M-CIF改変体。M-CIFポリペプチド（単数または複数）の特性を改善または改変
するために、タンパク質操作が用いられ得る。当業者に公知の組換えDNA技術は
、新規なタンパク質を作出するために用いられ得る。ムテインおよび欠失または
融合タンパク質は、例えば、活性の増強または安定性の増大を示し得る。さらに
、それらは、高収率で精製され得、そして少なくとも特定の精製および貯蔵条件
下でより良好な溶解性を示し得る。構築され得る変異の例を以下に記載する。
M-CIFアミノ末端およびカルボキシ末端欠失：インターフェロンγは、タンパ
ク質のカルボキシ末端から８〜10アミノ酸残基を欠失させることにより、10倍ま
J．Biol．Chem.，268(4):2984-2988(1993)は、３、８、または27アミノ末端アミ
ノ酸残基を欠失した場合にもヘパリン結合活性を有する改変KGFタンパク質を報
告した。多くの他の例がいずれの当業者にも知られている。
図２（配列番号２）に示すアミノ酸配列のいくつかの特に好ましいM-CIFポリ
ペプチドを以下に示す：
従って、１つの局面では、M-CIFのＮ末端欠失変異体が、本発明によって提供
される。このような変異体は、図２（配列番号２）の少なくとも最初の20Ｎ末端
アミノ酸残基の欠失（すなわち、少なくともMet(1)−−Thr(20)の欠失）である
が、最初の40Ｎ末端アミノ酸残基より多くはない欠失を有する図２（配列番号２
）に示すアミノ酸配列を含むものを含む。あるいは、欠失は、図２（配列番号２
）の少なくとも最初の20Ｎ末端アミノ酸残基を含むが、最初の33Ｎ末端アミノ酸
残基より多くはない。あるいは、欠失は、図２（配列番号２）の少なくとも最初
の23Ｎ末端アミノ酸残基を含むが、最初の33Ｎ末端アミノ酸残基より多くはない
。あるいは、欠失は、図２（配列番号２）の少なくとも最初の28Ｎ末端アミノ酸
残基を含むが、最初の33N末端アミノ酸残基より多くはない。
上記のM-CIFのＮ末端欠失変異体の範囲に加えて、本発明はまた、上記の範囲
の全ての組み合わせに関する。例えば、図２（配列番号２）の少なくとも最初の
20Ｎ末端アミノ酸残基を含むが最初の28Ｎ末端アミノ酸残基より多くない欠失；
図２（配列番号２）の少なくとも最初の20Ｎ末端アミノ酸残基を含むが最初の23
Ｎ末端アミノ酸残基より多くない欠失；および図２（配列番号２）の少なくとも
最初の28Ｎ末端アミノ酸残基を含むが最初の33Ｎ末端アミノ酸残基より多くない
欠失。
別の局面では、M-CIFのＣ末端欠失変異体が本発明によって提供される。好ま
しくは、このM-CIFのＣ末端欠失変異体のＮ末端アミノ酸残基は、図２（配列番
号2）の１(Met)または20(Thr)である。このような変異体は、少なくとも最後の
Ｃ末端アミノ酸残基（Asn(93)）であるが最後の25Ｃ末端アミノ酸残基（例え
ば、図２（配列番号２）のアミノ酸残基Lys(69)-Asn(93)の欠失）より多くない
欠失を除いて図２（配列番号２）に示すアミノ酸配列を含むものを含む。あるい
は、欠失は、図２（配列番号２）の少なくとも最後のＣ末端アミノ酸残基を含む
が、最後の18Ｃ末端アミノ酸残基より多くはない。あるいは、欠失は、図２（配
列番号２）の少なくとも最後の３Ｃ末端アミノ酸残基を含むが、最後の18Ｃ末端
アミノ酸残基より多くはない。あるいは、欠失は、図２（配列番号２）の少なく
とも最後の５Ｃ末端アミノ酸残基を含むが、最後の18Ｃ末端アミノ酸残基より多
くはない。あるいは、欠失は、図２（配列番号２）の少なくとも最後の12Ｃ末端
アミノ酸残基を含むが、最後の18Ｃ末端アミノ酸残基より多くはない。あるいは
、欠失は、図２（配列番号２）の少なくとも最後の５Ｃ末端アミノ酸残基を含む
が、最後の18Ｃ末端アミノ酸残基より多くはない。
さらに別の局面では、本発明によって含まれるのは、アミノ酸がＮ末端および
Ｃ末端残基の両方から欠失したM-CIF欠失変異体である。このような変異体は、
上述したＮ末端欠失変異体およびＣ末端欠失変異体の全ての組み合わせである。
このような変異体は、図２（配列番号２）の少なくとも最初の20Ｎ末端アミノ酸
残基の欠失であるが、最初の33Ｎ末端アミノ酸残基より多くはない欠失を有し、
かつ少なくとも最後のＣ末端アミノ酸残基であるが最後の18Ｃ末端アミノ酸残基
より多くない欠失を有する図２（配列番号２）に示すアミノ酸配列を含むものを
含む。あるいは、欠失は、図２（配列番号２）の少なくとも最初の23または28Ｎ
末端アミノ酸であるが最初の33Ｎ末端アミノ酸より多くなく、そして図２（配列
番号２）の少なくとも最後の３、５、または12Ｃ末端アミノ酸残基であって、最
後の18Ｃ末端アミノ酸より多くない欠失を含み得る。上記範囲の全ての組み合わ
せがさらに含まれる。
M-CIFタンパク質は、天然変異または人為的操作のいずれかからの１つまたは
いくつかのアミノ酸置換、欠失または付加を含み得る。図２（配列番号２）に示
すアミノ酸配列のいくつかの好ましい変異の例は、以下である：
本発明のポリペプチドは、好ましくは、単離された形態で提供され得るか、ま
たは好ましくは、実質的に精製される。MPIF-1、M-CIF、またはMIP-4ポリペプチ
ドの組換え産生形態は、SmithおよびJohnson．Gene 67:31-40(1988)に記載の一
工程方法によって実質的に精製され得る。
本発明のポリペプチドは、リーダーを含む寄託されたcDNAによりコードされた
ポリペプチド、リーダーのない寄託されたcDNAによりコードされた成熟ポリペプ
チド（すなわち、成熟タンパク質）、リーダーを含む図１（配列番号４）、図２
（配列番号２）または図３（配列番号６）のポリペプチド、リーダーを含むがＮ
末端メチオニン残基のない図１（配列番号４）、図２（配列番号２）または図３
（配列番号６）のポリペプチド、リーダーのない図１（配列番号４）、図２（配
列番号２）または図３（配列番号６）のポリペプチド、ならびに上記の配列に少
なくとも95％の類似性、およびさらにより好ましくは、少なくとも96％、97％、
98％または99％の類似性を有するポリペプチドを含む。本発明のさらなるポリペ
プチドは、寄託されたcDNAによりコードされたポリペプチドに対して、図１（配
列番号４）、図２（配列番号２）または図３（配列番号６）のポリペプチドに対
して少なくとも95％同一である、さらにより好ましくは、少なくとも96％、97％
、98％または99％同一であるポリペプチドを含み、そしてまた少なくとも30アミ
ノ酸を有するおよびより好ましくは少なくとも50アミノ酸を有するこのようなポ
リペプチドの部分を含む。
２つのポリペプチドについて「％類似性」とは、２つのポリペプチドをBestfi
tプログラム（Wisconsin Sequence Analysis Package，Version 8 for Unix，Ge
netics Computer Group，University Research Park，575 Science Drive，Madi
son，WI 53711）および類似性決定のためのデフォルト設定を用いて２つのポリ
ペプチドのアミノ酸配列を比較することによって生じた類似性スコアを意図する
。Bestfitは、SmithおよびWaterman（Advances in Applied Mathematics 2:482-
489，1981）の局所相同性演算を用いて２つの配列間の最良の類似性ｔグメント
を見出す。
MPIF-1、M-CIFまたはMIP-4ポリペプチドの参照アミノ酸配列に少なくとも、例
えば、95％「同一である」アミノ酸配列を有するポリペプチドとは、ポリペプチ
ドのアミノ酸配列が、ポリペプチド配列が、MPIF-1、M-CIFまたはMIP-4ポリペプ
チドの参照アミノ酸の各100アミノ酸当たり５アミノ酸までの変化を含み得るこ
とを除いて参照配列と同一であることを意図する。言い換えれば、参照アミノ酸
配列に少なくとも95％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るため
に、参照配列中５％までのアミノ酸残基が別のアミノ酸と欠失または置換され得
るか、または参照配列中の全アミノ酸残基の５％までの数のアミノ酸が参照配列
に挿入され得る。参照配列のこれらの変化は、参照アミノ酸配列のアミノまたは
カルボキシ末端位置またはそれらの末端位置間の任意の位置で、参照配列中の残
基間で個別にまたは参照配列内で１つ以上の群でのいずれかで分散して生じ得る
。
実際問題として、任意の特定のポリペプチドは、例えば、図１（配列番号４）
、図２（配列番号２）または図３（配列番号６）に示すアミノ酸配列または寄託
されたcDNAクローンによりコードされたアミノ酸配列に少なくとも95％、96％、
97％、98％または99％同一であるか否かは、公知のコンピュータープログラム（
例えば、Bestfitプログラム（Wisconsin Sequence Analysis Package，Versio
n 8 for Unix，Genetics Computer Group，University Research Park，575 Sci
ence Drive，Madison，WI 53711）を用いて従来的に決定され得る。Bestfitまた
は任意の他の配列整列プログラムを用いて、特定の配列が、例えば、本発明に従
う参照配列に95％同一であるか否かを決定する場台、パラメーターは、もちろん
、同一性パーセントが、参照アミノ酸配列の全長にわたって算定され、かつ参照
配列中のアミノ酸残基の総数の５％までの相同性のギャップを可能にするように
設定される。
本発明のポリペプチドは、SDS-PAGEゲルまたは当業者に周知の方法を用いる分
子篩ゲル濾過カラムの分子量マーカーとして用いられ得る。
以下に詳細に記載するように、本発明のポリペプチドは、ポリクローナル抗体
およびモノクローナル抗体を惹起させるために用いられ得る。これは、以下に記
載するようにMPIF-1、M-CIFまたはMIP-4タンパク質発現を検出するためのアッセ
イにおいて、またはMPIF-1、M-CIFまたはMIP-4タンパク質機能を増強または阻害
し得るアゴニストおよびアンタゴニストとして有用である。さらに、このような
ポリペプチドは、酵母ツーハイブリッドシステムにおいて、MPIF-1、M-CIFまた
はMIP-4タンパク質結合タンパク質を「捕獲」するために用いられ得る。このタ
ンパク質もまた、本発明に従う候補アゴニストおよびアンタゴニストである。酵
母ツーハイブリッドシステムは、FieldsおよびSong，Nature 340:245-246(1989)
に記載される。
MPIF-1、M-CIFまたはMIP-4エピトープ保有ポリペプチド。別の局面では、本発
明は、本発明のポリペプチドのエピトープ保有部分を含むペプチドまたはポリペ
プチドを提供する。このポリペプチド部分のエピトープは、本発明のポリペプチ
ドの免疫原性または抗原性エピトープである。「免疫原性エピトープ」は、全タ
ンパク質が免疫原である場合抗体応答を惹起するタンパク質の部分として定義さ
れる。これらの免疫原性エピトープは、分子上で少数の遺伝子座に制限されると
考えられている。他方で、抗体が結合し得るタンパク質分子の領域は、「抗原性
エピトープ」として定義される。一般に、タンパク質の免疫原性エピトープの数
は、抗原性エピトープの数より少ない。例えば、Geysenら、Proc．Natl．Acad．
Sci．USA 81:3998-4002(1983)を参照のこと。
抗原性エピトープを保有する（すなわち、抗体が結合し得るタンパク質分子の
領域を含む）ペプチドまたはポリペプチドの選択に関して、タンパク質配列の一
部を模倣する比較的短い合成ペプチドが、部分的に模倣されたタンパク質と反応
する抗血清を日常的に惹起し得ることが当該分野で周知である。例えば、Sutcli
ffe，J.G．Shinnick，T.M.，Green，N.およびLearner，R.A.，Science 219:660-
666(1983)を参照のこと。
タンパク質反応性血清を惹起し得るペプチドは、タンパク質の一次配列におい
て頻繁に示され、単純な化学法則のセットにより特徴づけられ得、そしてインタ
クトなタンパク質の免疫優性領域（すなわち、免疫原性エピトープ）またはアミ
ノ酸もしくはカルボキシ末端のいずれにも限定されない。極度に疎水性のペプチ
ドおよび６残基以下のペプチドは、模倣されたタンパク質に結合する抗体の誘導
に一般に有効ではない；より長いペプチド（特に、プロリン残基を含むペプチド
）が通常有効である。Sutcliffeら、上述、661。例えば、これらの指針に従って
設計した20のうち18（インフルエンザウイルス血液凝集素HAIポリペプチド鎖の
配列の75％を網羅する８〜39残基を含む）は、HA1タンパク質またはインタクト
なウイルスと反応する抗体を誘導した；そしてMuLVポリメラーゼ由来の12/12お
よび狂犬病糖タンパク質由来の18/18は、それぞれのタンパク質を沈降した抗体
を誘導した。
従って、本発明の抗原性エピトープ保有ペプチドおよびポリペプチドは、本発
明のポリペプチドに特異的に結合する抗体（モノクローナル抗体を含む）を惹起
するために有用である。従って、抗原エピトープ保有ペプチドで免疫したドナー
由来の脾臓細胞の融合により得られた高い割合のハイブリドーマは、一般に、ネ
イティブタンパク質と反応性の抗体を分泌する。Sutcliffeら、上述、663。抗原
性エピトープ保有ペプチドまたはポリペプチドにより惹起された抗体は、模倣さ
れたタンパク質を検出するために有用であり、そして異なるペプチドに対する抗
体は、翻訳後プロセシングを受けるタンパク質前駆体の種々の領域の運命を追跡
するために用いられ得る。ペプチドおよび抗ペプチド抗体は、模倣されたタンパ
ク質についての種々の定性または定量アッセイで、例えば、競合アッセイで用い
られ得る。なぜなら、これは、短いペプチド（例えば、約９アミノ酸）でさえ、
免疫沈降アッセイにおいて結合し、そしてより大きなペプチドと置換し得ること
が示されてためである。例えば、Wilsonら、Cell 37:767-778(1984)、777を参照
のこと。本発明の抗ペプチド抗体はまた、例えば、当該分野で周知の方法を用い
る吸着クロマトグラフィーによる、模倣されたタンパク質の精製のために有用で
ある。
上記の指針に従って設計された本発明の抗原性エピトープ保有ペプチドおよび
ポリペプチドは、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列内に含まれる、好ましく
は、少なくとも７、より好ましくは、少なくとも９、そして最も好ましくは約15
〜約30アミノ酸の配列を含む。しかし、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列の
より大きな部分を含むペプチドまたはポリペプチド（約30〜約50アミノ酸、また
は本発明のポリペプチドの全アミノ酸配列までのおよびこれを含む任意の長さを
含む）もまた、本発明のエピトープ保有ペプチドまたはポリペプチドとみなし、
そしてまた、模倣されたタンパク質と反応する抗体を誘導するために有用である
。好ましくは、エピトープ保有ペプチドのアミノ酸配列は、水性溶媒において実
質的な溶解度を提供するように選択される（すなわち、配列は、比較的親水性の
残基を含み、そして高度に疎水性の配列は、好ましく避けられる）；そしてプロ
リン残基を含む配列は、特に好ましい。
MPIF-1特異的抗体を生成するために用いられ得る抗原性ポリペプチドまたはペ
プチドの非限定的な例は、以下を含む：配列番号４における約21〜約30のアミノ
酸残基を含むポリペプチド；配列番号４における約31〜約44のアミノ酸残基を含
むポリペプチド；配列番号４における約49〜約55のアミノ酸残基を含むポリペプ
チド；配列番号４における約59〜約67のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列
番号４における約72〜約83のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号４にお
ける約86〜約103のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号４における約110
〜約120のアミノ酸残基を含むポリペプチド。上記に示したように、本発明者ら
は、上記ポリペプチドフラグメントがMPIF-1の抗原性領域であることを決定した
。
M-CIF特異的抗体を生成するために用いられ得る抗原性ポリペプチドまたはペ
プチドの非限定的な例は、以下を含む：配列番号２における約20〜約36のアミノ
酸残基を含むポリペプチド；配列番号２における約42〜約52のアミノ酸残基を含
むポリペプチド；配列番号２における約52〜約64のアミノ酸残基を含むポリペプ
チド；配列番号２における約67〜約75のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列
番号２における約75〜約84のアミノ酸残基を含むポリペプチド；および配列番号
２における約86〜約93のアミノ酸残基を含むポリペプチド。上記に示したように
、本発明者らは、上記ポリペプチドフラグメントがM-CIFタンパク質の抗原性領
域であることを決定した。
本発明のエピトープ保有ペプチドまたはポリペプチドは、本発明の核酸分子を
用いて、ペプチドまたはポリペプチドを作製するための任意の従来の手段（組換
え手段を含む）によって産生され得る。例えば、本発明の短いエピトープ保有ア
ミノ酸配列は、組換え産生および精製の間、ならびに抗ペプチド抗体を生成する
ための免疫化の間、キャリアとして作用するより大きなポリペプチドに融合され
得る。エピトープ保有ペプチドはまた、既知の化学合成方法を用いて合成され得
る。例えば、Houghtenは、４週間未満で多数のペプチド（例えば、調製され（EL
ISAタイプ結合研究により）特徴づけられたHAIポリペプチドのセグメントの単一
のアミノ酸改変体を表す10〜20mgの248の異なる13残基ペプチド）を合成する簡
便な方法を記載している。Houghton，R.A．（1985）General method for the ra
pid solid-phase synthesis of large numbers of peptides:Specificity of an
tigen-antibody interaction at the level of lndividual amino acids．Proc
．Natl．Acad．Sci．USA 82:5131-5135．この「同時多重ペプチド合成（Simulta
neous Multiple Peptide Synthesis(SMPS)」プロセスは、米国特許第4,631,211
号（Hoghtonら(1986)）にさらに記載されている。この手順において、種々のペ
プチドの固相合成のための個々の樹脂は、別個の溶媒透過性パケットに含有され
、固相法に関与する多くの同一の反復工程の至適な使用を可能にする。競合マニ
ュアル手順は、500〜1000またはそれ以上の合成を同時に行うことを可能にする
。Houghtonら、上述、5134。
本発明の好ましい核酸フラグメントは、MPIF-1、M-CIFまたはMIP-4タンパク質
のエピトープ保有部分をコードする核酸分子を含む。
特に、本発明のMPIF-1のこのような核酸フラグメントは、以下をコードする核
酸分子を含む：配列番号４における約21〜約30のアミノ酸残基を含むポリペプチ
ド；配列番号４における約31〜約44のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番
号４における約49〜約55のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号４におけ
る約59〜約67のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号４における約72〜約
83のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号４における約86〜約103のアミ
ノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号４における約110〜約120のアミノ酸残基
を含むポリペプチド、またはその中の任意の範囲または値。
特に、本発明のM-CIFのこのような核酸フラグメントは、以下をコードする核
酸分子を含む：配列番号２における約20〜約36のアミノ酸残基を含むポリペプチ
ド；配列番号２における約42〜約52のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番
号２における約52〜約64のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号２におけ
る約67〜約75のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号２における約75〜約
84のアミノ酸残基を含むポリペプチド；および配列番号２における約86〜約93の
アミノ酸残基を含むポリペプチド、またはその中の任意の範囲または値。
本発明者らは、上記ポリペプチドフラグメントがMPIFおよびM-CIFタンパク質
の抗原性領域であることを決定した。MPIF-1、M-CIF、またはMIP-4タンパク質の
他のこのようなエピトープ保有部分を決定するための方法は、以下に詳細に記載
される。
本発明のエピトープ保有ペプチドおよびポリペプチドは、当該分野で周知の方
法に従って抗体を誘導するために用いられる。例えば、Sutcliffeら、上述；Wil
sonら、上述；Chow，Mら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA82:910-914；およびBitt
le，F.J.らJ．Gen．Vlrol．66:2347-2354(1985)。一般に、動物は、遊離ペプチ
ドで免疫され得る；しかし、抗ペプチド抗体価は、ペプチドの巨大分子キャリア
（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)または破傷風トキソイド）
への結合により追加免疫投与され得る。例えば、システインを含有するペプチド
は、リンカー（例えば、m-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクインイミド
エステル(MBS)）を用いてキャリアに結合され得る。一方、他のペプチドは、グ
ルタルアルデヒドのようなより一般的な連結剤を用いてキャリアに連結され得る
。動物（例えば、ウサギ、ラット、およびマウス）は、遊離ペプチドまたはキャ
リア結合ペプチドのいずれかで、例えば、約100gのペプチドまたはキャリアタ
ンパク質とフロイントアジュバントとを含む乳剤の腹腔内および／または皮内注
射によって免疫される。いくつかの追加免疫注射が、例えば、固体表面に吸着さ
れた遊離ペプチドを用いるELISAアッセイによって、検出され得る抗ペプチド抗
体の有用な力価を提供するために、例えば、約２週間の間隔で必要とされ得る。
免疫動物由来の血清中の抗ペプチド抗体の力価は、例えば、当該分野で周知の方
法に従う固体支持体上のペプチドへの吸着および選択された抗体の溶出による、
抗ペプチド抗体の選択によって増大され得る。
本発明の免疫原性エピトープ保有ペプチド（すなわち、全タンパク質が免疫原
である場合抗体応答を惹起するタンパク質のそれらの部分）は、当該分野で公知
の方法に従って同定される。例えば、Geysenら、上述は、酵素結合免疫吸着アッ
セイにおいて反応するのに十分な純度の数百のペプチドの固体支持体上における
迅速な同時合成のための方法を開示している。合成されたペプチドと抗体との相
互作用は、次いで、支持体からそれらを除去することなく容易に検出される。こ
のようにして、所望のタンパク質の免疫原性エピトープを保有するペプチドは、
当業者によって日常的に同定され得る。例えば、口蹄疫ウイルスの外被タンパク
質における免疫学的に重要なエピトープは、Geysenらによって位置決めされ、タ
ンパク質の全213アミノ酸配列を網羅する全ての208の可能なヘキサペプチドの重
複セットの合成によって７アミノ酸が解明された。次いで、全ての20アミノ酸が
順にエピトープ内のすべての位置で置換された完全なペプチド置換セットが合成
され、そして抗体との反応について特異性を与える特定のアミノ酸が決定された
。従って、本発明のエピトープ保有ペプチドのペプチドアナログが、本方法によ
って日常的に作製され得る。米国特許第4,708,781号（Geysen(1987)）は、所望
のタンパク質の免疫原性エピトープを保有するペプチドを同定する本方法をさら
に記載する。
なおさらに、米国特許第5,194,392号（Geysen(1990)）は、目的の抗体の特定
のパラトープ（抗原結合部位）に相補的なエピトープの幾何学的に等価なモノマ
ー（すなわち、「ミモトープ」）（アミノ酸または他の化合物）の配列を検出ま
たは決定する一般的方法を記載している。より一般には、米国特許第4,433,092
号（Geysen(1989)）は、目的の特定のレセプターのリガンド結合部位に相補的な
リガンドの幾何学的に等価なモノマーの配列を検出または決定する一般的方法を
記載している。同様に、米国特許第5,480,971号（Houghten，R.A.ら(1996)Peral
kylted Oligopeptide Mixtures）は、直鎖状Ｃ1−Ｃ7アルキル過アルキル化オリ
ゴペプチドならびにこのようなペプチドのセットおよびライブラリー、ならびに
目的のアクセプター分子に優先的に結合する過アルキル化オリゴペプチドの配列
を決定するためにこのようなオリゴペプチドセットおよびライブラリーを用いる
方法を開示している。従って、本発明のエピトープ保有ペプチドの非ペプチドア
ナログは、これらの方法によって日常的に作製され得る。
「ポリペプチドおよびペプチド」について本節で引用した各文書の完全な開示
が、本明細書中に参考として援用されている。
当業者は、本発明のMPIF-1、M-CIFまたはMIP-4ポリペプチドおよび上記のそれ
らのエピトープ保有フラグメントが、免疫グロブリン（IgG）の定常ドメインの
一部と組み合わされて、キメラポリペプチドを生じ得ることを理解する。これら
の融合タンパク質は、精製を容易にし、そしてインビボで増大された半減期を示
す。これは、例えば、ヒトCD4−ポリペプチドの最初の２つのドメインおよび哺
乳動物免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の定常領域の種々のドメインからなるキ
メラタンパク質（EPA 394,897；Trauneckerら、Nature 331:84-86(1988)）につ
いて示されている。IgG部のためにジスルフィド結合ダイマー構造を有する融合
タンパク質はまた、モノマーMPIF-1、M-CIFまたはMIP-4タンパク質またはタンパ
ク質フラグメント単独よりも、他の分子を結合し、中和するのにより効率的であ
り得る（Fountoulakisら、J Biochem 270:3958-3964(1995)）。
ポリペプチド精製および単離。MPIF-1、MIP-4およびM-CIFは、硫酸アンモニウ
ムまたはエタノール沈澱、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフ
ィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィ
ー、親和性クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、
およびレクチンクロマトグラフィーを含む方法によって、組換え細胞培養物から
回収および精製される。タンパク質再折り畳み工程は、必要に応じて、成熟タン
パク質の配置を完全にすることにおいて用いられ得る。最後に、高速液体クロマ
トグラフィー(HPLC)は、最終精製工程のために用いられ得る。
本発明のポリペプチドは、天然に精製された生成物または化学合成手順の産物
であり得るか、あるいは原核生物宿主もしくは真核生物宿主から（例えば、培養
物中の細菌、酵母、高等植物、昆虫、および哺乳動物細胞による）組換え技術に
よって産生され得る。組換え産生手順で使用される宿主に依存して、本発明のポ
リペプチドは哺乳動物もしくは他の真核生物の炭水化物でグリコシル化され得る
か、または非グリコシル化され得る。本発明のポリペプチドはまた、最初のメチ
オニンアミノ酸残基を含み得る。
抗体。本発明での使用のためのMPIF-1、M-CIF、またはMIP-4タンパク質特異的
抗体は、完全なMPIF-1、M-CIF、もしくはMIP-4タンパク質、またはその抗原性ポ
リペプチドフラグメントに対して惹起され得、これはアルブミンのようなキャリ
アタンパク質とともに、またはそれが十分に長い（少なくとも約25アミノ酸）場
合はキャリアをともなわずに、動物系（例えば、ウサギまたはマウス）に提示さ
れ得る。
本明細書中で使用される用語「抗体」（Ab）または「モノクローナル抗体」（
Mab）は、MPIF-1、M-CIF、またはMIP-4タンパク質に特異的に結合し得る完全な
分子および抗体フラグメント（例えば、FabおよびF(ab')2フラグメント）を含む
ことを意味する。FabおよびF(ab')2フラグメントは、完全な抗体のFcフラグメン
トを欠いており、循環からより迅速に排除され、そして完全な抗体のより少ない
非特異的組織結合を有し得る（Wahlら、J．Nucl．Med．24:316-325(1983)）。従
って、これらのフラグメントが好ましい。
ポリペプチド、それらのフラグメントもしくは他の誘導体、またはそれらのア
ナログ、またはそれらを発現する細胞が、それらに対する抗体を産生するための
免疫原として使用され得る。これらの抗体は、例えば、ポリクローナル抗体また
はモノクローナル抗体であり得る。本発明はまた、キメラ抗体、単鎖抗体、およ
びヒト化抗体、ならびにFabフラグメント、またはFab発現ライブラリーの産生を
含む。当該分野で公知の種々の手順が、このような抗体およびフラグメントの産
生に使用され得る。
本発明の配列に対応するポリペプチドに対して生成された抗体、またはそのイ
ンビボのレセプターが、動物へのポリペプチドの直接の注射によって、または動
物（好ましくは、ヒト以外）へのポリペプチドの投与によって得られ得る。次い
で、このように得られた抗体は、ポリペプチド自体に結合する。この様式では、
ポリペプチドのフラグメントのみをコードする配列でさえ、すべての天然のポリ
ペプチドに結合する抗体を生成するために使用され得る。次いで、このような抗
体は、このポリペプチドを発現する組織からポリペプチドを単離するために使用
され得る。
モノクローナル抗体の調製のために、持続的な細胞株培養によって産生される
抗体を提供する任意の技術が使用され得る。例として、ハイブリドーマ技術（Ko
hlerおよびMilstein、1975、Nature、256：495-497）、トリオーマ技術、ヒトＢ
細胞ハイブリドーマ技術（Kozborら、1983、Immunology Today 4:72）、および
ヒトモノクローナル抗体を産生するためのEBVハイブリドーマ技術（Coleら、198
5、Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy、Alan R．Liss，Inc.，77-96頁
）が挙げられる。
単鎖抗体の産生について記載される技術（米国特許第4、946、778号）が、本
発明の免疫原性ポリペプチド産物に対する単鎖抗体を産生するために適合され得
る。
本発明の抗体は、任意の種々の方法によって調製され得る。例えば、MPIF-1、
M-CIF、もしくはMIP-4タンパク質、またはその抗原性フラグメントを発現する細
胞が、ポリクローナル抗体を含有する血清の産生を誘導するために動物に投与さ
れ得る。好ましい方法において、MPIF-1、M-CIF、またはMIP-4タンパク質の調製
物は、それが天然の混入物を実質的に含まないように調製されそして精製される
。次いで、このような調製物が、より大きな特異的活性のポリクローナル抗血清
を産生するために動物に導入される。
最も好ましい方法において、本発明の抗体は、モノクローナル抗体（または、
そのMPIF-1、M-CIF、もしくはMIP-4タンパク質結合フラグメント）である。この
ようなモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術（Kohlerら、Nature 256:495
（1975）；Kohlerら、Eur．J．Immunol．6:511（1976）；Kohlerら、Eur．J．Im
munol．6:292（1976）；Hammerlingら、Monoclonal Antibodies and T-Cell Hyb
ridomas，Elsevier，N.Y．（1981）563-681頁）を使用して調製され得る。一般
に、このような手順は、MPIF-1、M-CIF、またはMIP-4タンパク質抗原で、または
より好ましくは、MPIF-1、M-CIF、またはMIP-4タンパク質発現細胞で動物（好ま
しくは、マウス）を免疫することを含む。適切な細胞は、抗MPIF-1、M-CIF、ま
たはMIP-4タンパク質抗原に結合するそれらの能力によって認識され得る。この
ような細胞は、任意の適切な組織培養培地中で培養され得る；しかし、10％のウ
シ胎児血清（約56℃で不活化した）を補充し、そして10g/lの非必須アミノ酸、
約1,000U/mlのペニシリン、および約100g/mlのストレプトマイシンを補充したEa
rle改変Eagle培地中で細胞を培養することが好ましい。このようなマウスの脾細
胞が抽出され、そして適切な骨髄腫細胞株と融合される。任意の適切な骨髄腫細
胞株が、本発明に従って使用され得る；しかし、親骨髄腫細胞株（SP20）（アメ
リカンタイプカルチャーコレクション、Rockville，Marylandより入手可能）を
使用することが好ましい。融合後、得られたハイブリドーマ細胞はHAT培地中で
選択的に維持され、次いで、Wandsら（Gastroenterology 80:225-232（1981））
に記載されるような限界希釈によってクローン化される。次いで、このような選
択によって得られたハイブリドーマ細胞は、MPIF-1、M-CIF、またはMIP-4タンパ
ク質抗原に結合し得る抗体を分泌するクローンを同定するためにアッセイされる
。
あるいは、MPIF-1、M-CIF、またはMIP-4タンパタ質抗原に結合し得るさらなる
抗体が、抗イディオタイプ抗体の使用によって二工程手順で産生され得る。この
ような方法は、抗体がそれ自体抗原であるという事実、および従って二次抗体に
結合する抗体を得ることが可能であるという事実を利用する。この方法に従って
、MPIF-1、M-CIF、またはMIP-4タンパク質特異的抗体が、動物（好ましくは、マ
ウス）を免疫するために使用される。次いで、このような動物の脾細胞がハイブ
リドーマ細胞を産生するために使用され、そしてハイブリドーマ細胞が、MPIF-1
、M-CIF、またはMIP-4タンパク質特異的抗体に結合するそれらの能力がMPIF-1、
M-CIF、またはMIP-4タンパク質抗原によってブロックされ得る抗体を産生するク
ローンを同定するためにスクリーニングされる。このような抗体は、MPIF-1、M-
CIF、またはMIP-4タンパク質特異的抗体に対する抗イディオタイプ抗体を含み、
そしてさらなるMPIF-1、M-CIF、またはMIP-4タンパク質特異的抗体の形成を誘導
するように動物を免疫するために使用され得る。
FabおよびF(ab')2、ならびに本発明の抗体の他のフラグメントが本明細書中で
開示される方法に従って使用され得ることが明らかである。このようなフラグメ
ントは、代表的には、パパイン（Fabフラグメントを産生するため）またはペプ
シン（F(ab')2フラグメントを産生するため）のような酵素を使用する、タンパ
ク質分解的切断によって産生される。あるいは、MPIF-1、M-CIF、またはMIP-4タ
ンパク質結合フラグメントは、組換えDNA技術の適用によって、または合成化学
によって産生され得る。
「ヒト化」キメラモノクローナル抗体を使用することが好ましくあり得る。こ
のような抗体は、上記のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞に由
来する遺伝的構築物を使用して産生され得る。キメラ抗体を産生するための方法
は、当該分野で公知である。概説については、Morrison、Science 229:1202（19
85）；Oiら、BioTechniques 4:214（1986）；Cablllyら、米国特許第4、816、56
7号；Taniguchiら、EP 171496；Morrisonら、EP 173494；Neubergerら、WO 8601
533；Robinsonら、WO 8702671；Boulianneら、Nature 312:643（1984）；Neuber
gerら、Nature 314:268（1985）を参照のこと。
本発明のMPIF-1、M-CIF、またはMIP-4タンパク質特異的抗体のためのさらなる
適切な標識が、以下に示される。適切な酵素標識の例として、リンゴ酸デヒドロ
ゲナーセブドウ球菌ヌクレアーゼ、デルタ-5-ステロイドイソメラーゼ、酵母ア
ルコールデヒドロゲナーセ、α-グリｔロールホスフェートデヒドロゲナーゼ、
トリオースホスフェートイソメラーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファ
ターゼ、アスパラギネート、グルコースオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、
リボヌクレアーセ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース-6-ホスフェートデヒ
ドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ、およびアセチルコリンエステラーゼが挙げら
れる。
適切な放射性同位元素標識の例として、3H、111In、125I、131I、32P、35S、1 4
C、51Cr、57To、58Co、59Fe、75Se、152Eu、90Y、67Cu、217Ci、211At、212Pb
、47Sc、109Pdなどが挙げられる。111Inは、インビボの画像解析が使用される場
合、それが肝臓による125Iまたは131I標識したモノクローナル抗体の脱ハロゲン
化の問題を回避するので、好ましい同位元素である。さらに、この放射性ヌクレ
オチドは、画像解析のためのより好ましいガンマ放出エネルギーを有する（Perk
insら、Eur．J．Nucl．Med．
10:296-301（1985）；Carasquilloら、J．Nucl．Med．28:281-287(1987)）。
適切な非放射性同位元素標識の例として、157Gd、55Mn、162Dy、52Tr、および56
Feが挙げられる。
適切な蛍光標識の例として、152Eu標識、フルオレセイン標識、イソチオシア
ネート標識、ローダミン標識、フィコエリトリン標識、フィコシアニン標識、ア
ロフィコシアニン標識、0-フタアルデヒド標識、およびフルオレスアミン標識が
挙げられる。
適切な毒素標識の例として、ジフテリア毒素、リシン、およびコレラ毒素が挙
げられる。
化学発光標識の例として、ルミナール標識、イソルミナール標識、芳香族アク
リジニウムエステル標識、イミダゾール標識、アクリジニウム塩標識、シュウ酸
エステル標識、ルシフェリン標識、ルシフェラーゼ標識、およびエクオリン標識
が挙げられる。
核磁気共鳴対比剤の例として、Gd、Mn、および鉄のような重金属核が挙げられ
る。
抗体に対する上記の標識の結合のための代表的な技術は、Kennedyら、Clin．C
him．Acta 70:1-31（1976）、およびSchursら、Clin．Chim．Acta 81:1-40（197
7）によって提供される。後者に記載されるカップリング技術は、グルタルアル
デヒド法、過ヨウ素酸法、ジマレイミド法、m-マレイミドベンジル-N-ヒドロキ
シ-スクシンイミドエステル法であり、これらの方法の全て本明細書中で参考と
して援用される。
染色体アッセイ。本発明の核酸分子はまた、染色体同定のために役立つ。配列
は、個々のヒト染色体上の特定の位置に特異的に標的化され、そしてそれとハイ
ブリダイズし得る。さらに、染色体上の特定の部位を同定することの現在の必要
性が存在する。実際の配列データ（反復多型性）に基づく少しの染色体標識試薬
（chromosome marking reagent）しか、現在、染色体位置を標識するために利用
可能でない。本発明による、DNAの染色体へのマッピングは、これらの配列を、
疾患に関連する遺伝子に相関させることにおける重要な最初の段階である。
これに関しての特定の好ましい実施態様において、本明細書中に開示されるcD
NAは、MPIF-1、M-CIF、またはMIP-4タンパク質遺伝子のゲノムDNAをクローン化
するために使用される。これは、種々の周知の技術およびライブラリー（これは
一般に市販されている）を使用して達成され得る。次いで、ゲノムDNAは、イン
サイチュ染色体マッピングのために、この目的のために周知の技術を使用して、
用いられる。代表的には、染色体マッピングのための慣習的な手順に従って、い
くらかの試行錯誤が、良好なインサイチュハイブリダイゼーションシグナルを与
えるゲノムプローブを同定するために必要であり得る。
簡潔には、配列は、cDNAからPCRプライマー（好ましくは15〜25bp）を調製す
ることによって、染色体にマップされ得る。cDNAのコンピューター解析が、ゲノ
ムDNAにおいて１つより多いエキソンにまたがらず、従って増幅プロセスを複雑
にしないプライマーを迅速に選択するために使用される。次いで、これらのプラ
イマーは、個々のヒト染色体を含む体細胞ハイブリッドのPCRスクリーニングの
ために使用される。プライマーに対応するヒト遺伝子を含むハイブリッドのみが
、増幅フラグメントを生じる。
体細胞ハイブリッドのPCRマッピングは、特定のDNAを特定の染色体に割り当て
るための迅速な手順である。同じオリゴヌタレオチドプライマーとともに本発明
を使用して、詳細な局在化（sublocalization）が、特定の染色体由来の部分の
パネルまたは大きなゲノムクローンのプールを用いて類似の方法で達成され得る
。その染色体へマップするために同様に使用され得るその他のマッピングストラ
テジーとしては、インサイチュハイブリダイセーション、標識フロー分取染色体
を用いる事前スクリーニング、および染色体特異的cDNAライブラリーを構築する
ためのハイブリダイゼーションによる事前選択が挙げられる。
cDNAクローンの中期染色体展開物への蛍光インサイチュハイブリダイゼーショ
ン（「FISH」）は、１工程で正確な染色体位置を提供するために使用され得る。
この技術は、50または60bpほど短いcDNA由来のプローブとともに使用され得る。
この技術の総説のためには、Vermaら、Human Chromosomes:A Manual Of Basic T
echniques，Pergamon Press，New York(1988)を参照のこと。
一旦配列が正確な染色体位置にマップされると、染色体上の配列の物理的位置
は、遺伝子地図データと相関され得る。そのようなデータは、例えば、Johns Ho
pkins University，Welch Medical Libraryを通じてオンラインで利用可能であ
るV．McKusick，Mendelian Inheritance In Manにおいて見出される。次いで、
遺伝子と、同じ染色体領域にマップされている疾患との間の関係は、連鎖解析（
物理的に隣接する遺伝子の同時遺伝）を通して同定される。
次に、罹患個体と非罹患個体との間のcDNAまたはゲノム配列における差異を決
定することが必要である。変異が、いくらかのまたは全ての罹患個体においては
観察されるが、いかなる正常個体においても観察されない場合、変異は、疾患の
作因でありそうである。
物理的マッピングおよび遺伝子マッピング技術の現在の解像度では、疾患に関
連する染色体領域に正確に局在化されたcDNAは、50と500との間の潜在的な原因
遺伝子の１つであり得る。これは、１メガベースのマッピング解像度および20kb
当たり１つの遺伝子を仮定している。
罹患個体と非罹患個体との比較は、一般に、まず染色体における構造的変化（
例えば、染色体展開物から可視であるか、またはそのcDNA配列に基づくPCRを使
用して検出可能である欠失または転座）を探すことを含む。最後に、いくつかの
個体由来の遺伝子の完全な配列決定が、変異の存在を確認するために、そして変
異を多型性から区別するために必要とされる。
本発明はさらに、アンチセンス技術の使用によるインビボにおけるMPIF-1、MI
P-4、およびM-CIFの阻害に関する。アンチセンス技術は、三重鎖形成またはアン
チセンスDNAもしくはRNA（両方の方法は、ポリヌタレオチドのDNAまたはRNAへの
結合に基づいている）を介して遺伝子発現を制御するために使用され得る。例え
ば、ポリヌクレオチド配列（これは、本発明のポリペプチドをコードする）の5'
コード部分は、長さ約10〜40塩基対のアンチセンスRNAオリゴヌクレオチドを設
計するために使用される。DNAオリゴヌクレオチドは、転写に関与する遺伝子の
領域に相補的であるように設計され（三重鎖−Leeら、No.cl．Acids Res.，6:30
73（1979）；Cooneyら、Science，241:456（1988）；およびDervanら、Science
，251:1360(1991)を参照のこと）、それによってMPIF-1、MIP-4、およびM-CIFの
転写および産生を防止する。アンチセンスRNAオリゴヌクレオチドは、インビボ
においてmRNAにハイブリダイズし、そしてmRNA分子のMPIF-1、MIP-4、およびM-C
IF
への翻訳をブロックする（アンチセンス−Okano，J．Neurochem.，56:560（1991
）；Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibltors of Gene Expression，CR
C Press，Boca Raton，FL(1988)）。
あるいは、上記のオリゴヌクレオチドは、アンチセンスRNAまたはDNAがインビ
ボにおいて発現されて、MPIF-1、MIP-4、およびM-CIFの産生を上記の方法で阻害
し得るように、当該分野における手順によって細胞に送達され得る。
従って、MPIF-1、MIP-4、およM-CIFに対するアンチセンス構築物は、MPIF-1、
MIP-4、および／またはM-CIF誘導性または増強性のいずれかである障害（例えば
、アテローム性動脈硬化症、自己免疫疾患（例えば、多発性硬化症およびインス
リン依存性糖尿病）ならびに慢性炎症性および感染性疾患、ヒスタミン媒介性ア
レルギー反応、慢性関節リウマチ、珪肺症、サルコイドーシス、特発性肺線維症
およびその他の肺の慢性炎症性疾患、特発性好酸球増多症候群、内毒素性ショッ
ク、ヒスタミン媒介性アレルギー反応、プロスタグランジン非依存性発熱、なら
びに再生不良性貧血およびその他の骨髄不全の症例）を処置するために使用され
得る。
アンタゴニスト、アゴニスト、および方法。本発明はさらに、化合物をスクリ
ーニングして、本発明のケモカインポリペプチドに対するアゴニストおよびアン
タゴニストを同定するための方法を提供する。アゴニストは、ポリペプチドの類
似の生物学的機能を有するか、またはポリペプチドの機能を増強する化合物であ
り、一方アンタゴニストは、そのような機能をブロックする。走化性は、細胞（
これは、本発明のポリペプチドのいずれかによって化学誘引される）を、細胞が
入るために十分な直径（約５μｍ）の孔を有するフィルターの頂部に置くことに
よってアッセイされ得る。潜在的なアゴニストの溶液を上方区画中の適切なコン
トロール培地を含むチャンバーの底部に入れ、従って、アゴニストの濃度勾配は
、経時的に多孔性膜中にまたは多孔性膜を通って移動する細胞を計数することに
よって測定される。
アンタゴニストについてアッセイする場合、本発明のケモカインポリペプチド
は、底部チャンバーに入れられ、そして細胞の走化性が防止されるかどうかを決
定するために、潜在的なアンタゴニストが添加される。
あるいは、ポリペプチドのレセプターを発現している哺乳動物細胞または膜調
製物は、化合物の存在下で、標識されたケモカインポリペプチド（例えば、放射
能）とともにインキュベートされる。次いで、化合物がこの相互作用をブロック
する能力が測定され得る。この様式でアゴニストをアッセイする場合、ケモカイ
ンは存在せず、そしてアゴニスト自体がレｔプターと相互作用する能力が測定さ
れ得る。
潜在的なMPIF-1、MIP-4、およびM-CIFアンタゴニストの例としては、ポリペプ
チドに結合する抗体、またはいくつかの場合において、オリゴヌクレオチドが挙
げられる。潜在的なアンタゴニストの別の例は、ポリペプチドのネガティブドミ
ナント変異体（negative dominant mutant）である。ネガティブドミナント変異
体は、野生型ポリペプチドのレセプターに結合するが、生物学的活性を保持して
いないポリペプチドである。
アンチセンス技術を使用して調製されたアンチセンス構築物はまた、潜在的な
アンタゴニストである。アンチセンス技術は、三重鎖形成またはアンチセンスDN
AもしくはRNA（両方の方法は、ポリヌクレオチドのDNAまたはRNAへの結合に基づ
いている）を介して遺伝子発現を制御するために使用され得る。例えば、ポリヌ
クレオチド配列（これは、本発明の成熟ポリペプチドをコードする）の5'コード
部分は、長さ約10〜40塩基対のアンチセンスRNAオリゴヌクレオチドを設計する
ために使用される。DNAオリゴヌクレオチドは、転写に関与する遺伝子の領域に
相補的であるように設計され（三重鎖−Leeら、Nucl．Acids Res.，6:3073（197
9）；Cooneyら、Science，241:456（1988）；およびDervanら、Science，251:13
60(1991)を参照のこと）、それによってケモカインポリペプチドの転写および産
生を防止する。アンチセンスRNAオリゴヌクレオチドは、インビボにおいてmRNA
にハイブリダイズし、そしてmRNA分子のポリペプチドへの翻訳をブロックする（
アンチセンス−Okano，J．Neurochem.，56:560(1991)；Oligodeoxynucleotide a
s Antisense Inhibitors of Gene Expression，CRC Press，Boca Raton，FL(198
8)）。上記のオリゴヌクレオチドはまた、アンチセンスRNAまたはDNAがインビボ
において発現されて、ケモカインポリペプチドの産生を阻害し得るように細胞に
送達され得る。
別の潜在的なケモカインアンタゴニストは、生物学的機能は喪失しているが、
なおポリペプチドのレセプターを認識しそしてそれに結合し、それによってレセ
プターを有効にブロックする、天然にまたは合成的に改変されたポリペプチドの
アナログであるポリペプチドのペプチド誘導体である。ペプチド誘導体の例とし
ては、小ペプチドまたはペプチド様分子が挙げられるが、それらに限定されない
。
アンタゴニストは、MPIF-1、MIP-4、およびM-CIF誘導性または増強性のいずれ
かである障害（例えば、自己免疫疾患ならびに慢性炎症性および感染性疾患）を
処置するために用いられ得る。自己免疫疾患の例としては、多発性硬化症および
インスリン依存性糖尿病が挙げられる。
アンタゴニストはまた、単核食細胞のリクルートメント（recruitment）およ
び活性化を防止することによって、珪肺症、サルコイドーシス、特発性肺線維症
を含む感染性疾患を処置するために用いられ得る。それらはまた、好酸球の産生
および移動を防止することによって、特発性好酸球増多症候群を処置するために
用いられ得る。内毒素性ショックはまた、マクロファージの移動および本発明の
ケモカインポリペプチドのそれらの産生を防止することによって、アンタゴニス
トによって処置され得る。
アンタゴニストはまた、動脈壁における単球浸潤を妨げることによってアロテ
ーム性動脈硬化症を処置するために使用され得る。
アンタゴニストはまた、ケモカイン誘導性肥満細胞および好塩基球脱顆粒なら
びにヒスタミンの放出を阻害することによって、ヒスタミン媒介性アレルギー反
応および免疫学的障害（遅延相アレルギー反応、慢性蕁麻疹、およびアトピー性
皮膚炎）を処置するために使用され得る。アレルギー性喘息、鼻炎、および湿疹
のようなIgE媒介性アレルギー反応もまた処置され得る。
アンタゴニストはまた、創傷領域への単球の誘引を妨げることによって、慢性
および急性の炎症を処置するために使用され得る。それらはまた、正常な肺性マ
クロファージ集団を調節するために使用され得る。なぜなら、慢性および急性の
炎症肺性疾患は、肺における単核食細胞の隔絶と関係するからである。
アンタゴニストはまた、患者の関節における骨膜体液への単球の誘引を妨げる
ことによってリウマチ様関節炎を処置するために使用され得る。単球流入および
活性化は、退行性および炎症性関節症の両方の病原に有意な役割を果たす。
アンタゴニストは、主としてIL-1およびTNFに起因する有害なカスケードを妨
害するのに使用され得、これは、他の炎症性サイトカインの生合成を妨げる。こ
の方法において、アンタゴニストは、炎症を妨げるために使用され得る。アンタ
ゴニストはまた、ケモカインによって誘導されるプロスタグランジン非依存性発
熱を阻害するために使用され得る。
アンタゴニストはまた、骨髄の不全（例えば、再生不良性貧血および脊髄形成
異常症候群）の症例を処置するために使用され得る。
アンタゴニストはまた、肺における好酸球蓄積を妨げることによって、喘息お
よびアレルギーを処置するために使用され得る。アンタゴニストはまた、喘息肺
の顕著な特徴である上皮下基底膜線維症を処置するために使用され得る。
アゴニスト。M-CIF、MPIF-1および/またはMIP-4アゴニストは、本明細書中に
記載されるような任意の１つ以上のこれらのポリペプチドに類似した活性を有す
る任意の小分子を含む。例えば、MPIF-1アゴニストは、MPIF-1活性を増強するた
めに使用され得る。例えば、化学療法または骨髄移植を受けた患者におけるMPIF
-1誘導性骨髄保護を増強するために。別の例としては、M-CIFアゴニストは、M-C
IFの種々の機能性活性について本明細書中に記載される１以上の抗炎症活性、抗
TNFα活性などを提供し得る。
疾患診断および予後。下記に考察されるような、所定の疾患または障害は、対
応する「標準的」哺乳動物（すなわち、疾患または障害を有さない同じ種の哺乳
動物）と比較して、MPIF-1、M-CIFまたはMIP-4タンパク質およびMPIF-1、M-CIF
またはMIP-4タンパク質をコードするmRNAの増大したレベルと関連し得る。さら
に、増大したレベルのMPIF-1、M-CIFまたはMIP-4タンパク質が、疾患または障害
を有さない哺乳動物に由来する血清と比較した場合に、疾患または障害を有する
同じ種の哺乳動物由来所定の体液（例えば、血清、血漿、尿、および髄液）にお
いて検出され得る。従って、本発明は、診断方法を提供する。これは、哺乳動物
の細胞または体液中のMPIF-1、M-CIFまたはMIP-4タンパク質をコードする遺伝子
の発現レベルをアッセイすること、およびその遺伝子発現レベルと標準MPIF-1、
M-CIFまたはMIP-4遺伝子発現レベルとを比較することを含み、それによって、標
準を上回る遺伝子発現レベルにおける増大が、特定の疾患または障害の指示物と
なる。
疾患または障害の診断が、通常の方法に従ってすでに行われた場合、本発明は
、予後指示物として有用であり、それによって増大したMPIF-1、M-CIFまたはMIP
-4遺伝子発現を示す患者は、より低いレベルで遺伝子を発現する患者と比較して
より悪い臨床結果を経験する。
「MPIF-1、M-CIFまたはMIP-4タンパク質をコードする遺伝子の発現レベルをア
ッセイする」によって、直接的に（例えば、絶対的なタンパタ質レベルまたはmR
NAレベルを決定するか、または見積もることによって）または相対的に（例えば
、第２の生物学的サンプル中のMPIF-1、M-CIFもしくはMIP-4タンパク質レベルま
たはmRNAレベルと比較することによって）のいずれかで、第１の生物学的サンプ
ル中のMPIF-1、M-CIFまたはMIP-4タンパク質のレベルあるいはMPIF-1、M-CIFま
たはMIP-4タンパク質をコードするmRNAのレベルを定性的または定量的に測定す
るか、もしくは見積もることが意図される。
好ましくは、第１の生物学的サンプル中のMPIF-1、M-CIFもしくはMIP-4タンパ
ク質レベルまたはmRNAレベルが、測定されるか、または見積もられ、そして標準
MPIF-1、M-CIFまたはMIP-4タンパク質レベルまたはmRNAレベルと比較される。こ
の標準は、疾患または障害を有さない個体から得られた第２の生物学的サンプル
から採取される。当該分野で理解されるように、一旦標準MPIF-1、M-CIPもしく
はMIP-4タンパク質レベルまたはmRNAレベルが知られると、比較のための標準と
して繰り返し使用され得る。
「生物学的サンプル」によって、MPIF-1、M-CIFもしくはMIP-4タンパク質また
はmRNAを含む個体、細胞株、組織培養物、または他の供給源から得られた任意の
生物学的サンプルが意図される。生物学的サンプルは、分泌された成熟MPIF-1、
M-CIFまたはMIP-4タンパク質を含む哺乳動物体液（例えば、血清、血漿、尿素、
滑液および骨髄液）、および卵巣、前立腺、心臓、胎盤、膵臓、腹水、筋肉、皮
膚、腺、腎臓、肝臓、脾臓、肺、骨、骨髄、眼球、末梢神経、中枢神経、乳房お
よび臍の組織を含む。哺乳動物から組織バイオプシーおよび体液を得るための方
法は、当該分野で周知である。生物学的サンプルがmRNAを含む場合、組織バイオ
プシーが好ましい供給源である。
本発明は、哺乳動物における疾患を検出するために有用である。詳細には、本
発明は、哺乳動物（好ましくは、ヒト）における種々の免疫系関連障害の診断ま
たは処置に有用である間、有用である。このような障害は、腫瘍、ガン、および
免疫細胞機能の任意の不調節（自己免疫、関節炎、白血病、リンパ腫、免疫抑制
、敗血症、創傷治癒、急性および慢性感染、細胞媒介免疫、体液免疫、炎症腸疾
患、骨髄抑制などが挙げられるがこれらに限定されない）を含む。好ましい哺乳
動物は、サル、尾なしザル、ネコ、イヌ、ウシ、ブタ、ウマ、ウサギおよびヒト
を含む。特に好ましいのはヒトである。
総細胞RNAは、任意の技術（例えば、ChomczynskiおよびSacchi，Anal.Biochem
．162:156-159(1987)に記載される単一工程グアニジン-チオシアネート-フェノ
ール-クロロホルム法）を用いて生物学的サンプルから単離され得る。次いで、M
PIF-1、M-CIFまたはMIP-4タンパク質をコードするmRNAのレベルは、任意の適切
な方法を用いてアッセイされる。これらは、ノーザンブロット分析、S1ヌクレア
ーゼマッピング、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、ポリメラーゼ連鎖反応と組み
合わせた逆転写（RT-PCR）、およびリガーゼ連鎖反応と組み合わせた逆転写（RT
-LCR）を含む。
ノーザンブロット分析は、Haradaら、Cell 63:303-312(1990)に記載されるよ
うに行われ得る。手短には、総RNAは、上記のように生物学的サンプルから調製
される。ノーザンブロットのために、RNAは、適切な緩衝液（例えば、グリオキ
サール/ジメチルスルホキシド/リン酸ナトリウム緩衝液）において変性され、ア
ガロースゲル電気泳動に曝され、そしてニトロセルロースフィルター上に移され
る。RNAがUVリンカーによってフィルターに連結された後、フィルターは、ホル
ムアミド、SSC、デンハート溶液、変性サケ精子、SDS、およびリン酸ナトリウム
緩衝液を含む溶液中でプレハイブリされる。任意の適切な方法（例えば、32Pマ
ルチプライムcDNA標識システム(Amersham)）に従って標識された、MPIF-1、M-CI
FまたはMIP-4タンパク質cDNAは、プローブとして使用される。一晩のハイブリダ
イゼーションの後、フィルターは、洗浄され、そしてｘ線フィルムに曝される。
本発明に従ってプローブとして使用するためのcDNAは、上記のセクションに記載
され、そして好ましくは少なくとも15bp長である。
S1マッピングは、Fujitaら、Cell 49:357-367（1987）に記載されるように行
われ得る。S1マッピングにおいて使用するためのプローブDNAを調製するために
、上記cDNAのセンス鎖は、標識アンチセンスDNAを合成するためにテンプレート
として使用される。次いで、アンチセンスDNAは、適切な制限エンドヌクレアー
ゼを用いて消化されて、所望の長さのさらなるDNAプローブが作製される。この
ようなアンチセンスプローブは、標的mRNA（すなわち、MPIF-1、M-CIFまたはMIP
-4タンパク質をコードするmRNA）に対応する保護されたバンドを可視化するため
に有用である。ノーザンブロット分析は上記のように行われ得る。
好ましくは、MPIF-1、M-CIFまたはMIP-4タンパク質をコードするmRNAのレベル
は、Makinoら、Technique 2:295-301(1990)に記載されるRT-PCR法を用いてアッ
セイされる。この方法によって、ポリアクリルアミドゲルバンドにおける「アン
プリコン」の放射能は、標識mRNAの初期濃度に正比例する。手短には、この方法
は、生物学的サンプルから単離された総RNAをRTプライマーおよび適切な緩衝液
を含有する反応混合物中に添加することを含む。プライマーアニーリングのため
のインキュベーションの後、混合物は、RT緩衝液、dNTP、DTT、RNaseインヒビタ
ーおよび逆転写酵素を補充され得る。RNAの逆転写を達成するためのインキュベ
ーションの後、次いで、RT産物を、標識プライマーを用いるPCRに曝す。あるい
は、プライマーを標識しないで、PCR反応混合物に標識dNTPが含まれ得る。PCR増
幅は、従来技術に従ってDNAサーマルサイクラーにおいて行われ得る。増幅を達
成するための適切な回数の後、PCR反応混合物は、ポリアクリルアミドゲル上に
電気泳動される。ゲルを乾燥させた後、適切なバンド（MPIF-1、M-CIFまたはMIP
-4タンパク質をコードするmRNAに対応する）の放射能が、イメージングアナライ
ザーを用いて定量される。RTおよびPCR反応成分ならびに条件、試薬およびゲル
濃度、ならびに標識方法は、当該分野で周知である。RT-PCR法における改変は、
当業者に明らかである。
逆転写された標的mRNAを増幅するオリゴヌクレオチドプライマーの任意のセッ
トが使用され得、そして上記のセクションに記載されるように設計され得る。
生物学的サンプル中のMPIF-1、M-CIFまたはMIP-4タンパク質レベルをアッセイ
することは、任意の当該分野で公知の方法を用いて起こり得る。生物学的サン
プル中のMPIF-1、M-CIFまたはMIP-4タンパク質レベルをアッセイするために好ま
しいのは、抗体ベース技術である。例えば、組織におけるMPIF-1、M-CIFまたはM
IP-4タンパク質発現は、古典的な免疫組織学的方法で研究され得る。これらにお
いて、特異的認識は、一次抗体（ポリクローナルまたはモノクローナル）によっ
て提供されるが、二次検出系は、蛍光、酵素、または他の結合した二次抗体を利
用し得る。結果として、病理学的調査のための組織切片の免疫組織学的染色が得
られる。組織は、例えば、ウエスタンブロットまたはドット/スロットアッセイ
用のMPIF-1、M-CIFまたはMIP-4タンパク質の遊離のために、例えば、尿素および
中性界面活性剤を用いて抽出され得る（Jalkanen，M.ら、J.Cell.blol．101:976
-985(1985);Jalkanen，M.ら、J.Cell.Biol．105:3087-3096(1987)）。この技術
において、これは、カチオン性固相の使用に基づき、MPIF-1、M-CIFまたはMIP-4
タンパク質の定量は、標準として単離されたMPIF-1、M-CIFまたはMIP-4タンパク
質を用いて達成され得る。この技術は、体液に適用され得る。これらのサンプル
を用いて、MPIF-1、M-CIFまたはMIP-4タンパク質のモル濃度は、異なる体液（例
えば、血清、血漿、尿、髄液など）についてのMPIF-1、M-CIFまたはMIP-4タンパ
ク質含量の標準値を設定することを補助する。次いで、MPIF-1、M-CIFまたはMIP
-4タンパク質量の正常な出現は、健常な個体からの値を用いて設定され得る。こ
れは、試験被験体から得られるものと比較され得る。
MPIF-1、M-CIFまたはMIP-4タンパク質遺伝子発現を検出するための有用な他の
抗体ベース法は、免疫アッセイ（例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)お
よびラジオイムノアッセイ(RIA)）を含む。例えば、MPIF-1、M-CIFまたはMIP-4
タンパク質特異的モノクローナル抗体は、MPIF-1、M-CIFまたはMIP-4タンパク質
を検出および定量するための免疫吸着剤および酵素標識プローブの両方として使
用され得る。サンプル中に存在するMPIF-1、M-CIFまたはMIP-4タンパク質の量は
、直線回帰コンピューターアルゴリズムを用いて標準調製物中に存在する量と比
較して計算され得る。別のELISAアッセイにおいて、２つの個々の特異的なモノ
クローナル抗体が、体液中のMPIF-1、M-CIFまたはMIP-4タンパク質を検出するた
めに使用され得る。このアッセイにおいて、一方の抗体は免疫吸着剤として、そ
して他方の抗体は酵素標識プローブとして使用される。
上記の技術は、本質的に「１工程」または「２工程」アッセイとして行われ得
る。「１工程」アッセイは、MPIF-1、M-CIFまたはMIP-4タンパク質と固定化抗体
とを接触させる工程および、洗浄せずに、その混合物と標識抗体とを接触させる
工程を含む。「２工程」アッセイは、混合物と標識抗体とを接触させる前に洗浄
する工程を含む。他の従来の方法もまた、適切に使用され得る。通常、支持体上
のアッセイ系の１つの成分を固定化することが望ましく、それによって、系の他
の成分が、その成分との接触にもたらされ、そしてサンプルから容易に除去され
る。
適切な酵素標識は、例えば、オキシダーゼ群由来のものを含み、これらは、基
質と反応することによって過酸化水素の産生を触媒する。グルコースオキシダー
ゼは、それが良好な安定を有し、そしてその基質（グルコース）が容易に入手可
能であるので特に好ましい。オキシダーゼ標識の活性は、酵素標識抗体/基質反
応によって形成される過酸化水素の濃度を測定することによってアッセイされ得
る。酵素の他に、他の適切な標識としては、放射性同位体（例えば、ヨウ素（12 5
I，121I）、炭素（14C）、硫黄（35S）、トリチウム（3H）、インジウム（112I
n）、およびテタネチウム(99mTc)）、および蛍光標識（例えば、蛍光およびロー
ダミン、およびビオチン）を含む。
本発明のポリペプチド、およびそのようなポリペプチドをコードするポリヌク
レオチドは、科学研究、DNAの合成およびDNAベクターの製造に関するインビトロ
目的、ならびにヒト疾患の処置のための治療薬および診断薬を開発するための目
的のための研究試薬として使用され得る。例えば、M-CIFおよびMPIF-1は、それ
らの分化を一時的に妨げることによって、未成熟な造血前駆細胞（例えば、顆粒
球、マクロファージまたは単球）の拡大に使用され得る。これらの骨髄細胞は、
インビトロで培養され得る。
全長MPIF-1、MIP-4またはM-CIF遺伝子のフラグメントは、cDNAのハイブリダイ
ゼーションプローブとして使用され得、全長の遺伝子が単離され、そしてその遺
伝子に対して高配列類似性または類似の生物学的活性を有する他の遺伝子が単離
される。しかし、好ましくは、プローブは少なくとも30塩基を有し、そして例え
ば、50以上の塩基を含み得る。プローブはまた、全長転写物およびゲノムクロ
ーンまたは完全な遺伝子（レギュレーターおよびプロモーター領域、エキソン、
およびイントロンを含む）を含むクローンに対応するcDNAクローンを同定するた
めに使用され得る。スクリーニングの例は、オリゴヌクレオチドプローブを合成
するための既知のDNA配列を用いることによって、遺伝子のコード領域を単離す
る工程を含む。本発明の遺伝子にの配列相補的な配列を有する標識オリゴヌクレ
オチドは、プローブがライブラリーのどのメンバーにハイブリダイズするかを決
定するために、ヒトcDNA、ゲノムDNAまたはmRNAのライブラリーをスクリーニン
グするために使用される。
本発明はまた、核酸配列中の変異の存在に関連する疾患または疾患への感受性
を検出するための診断アッセイの一部としてのMPIF-1、MIP-4またはM-CIF遺伝子
の使用に関連する。このような疾患は、ケモカインポリペプチドの過小発現に関
連する。
MPIF-1、MIP-4またはM-CIFにおいて変異を保有する個体は、種々の技術によっ
てDNAレベルで検出され得る。診断のための核酸は、患者の細胞（例えば、血液
、尿、唾液、組織バイオプシーおよび剖検物質由来）から得られ得る。ゲノムDN
Aは、検出のために直接的に使用され得るか、または分析の前にPCR（Saikiら、N
ature 324:163-166(1986)）を用いて酵素的に増幅され得る。RNAまたはcDNAはま
た、同じ目的で使用され得る。例として、MPIF-1、MIP-4およびM-CIFをコードす
る核酸に相補的なPCRプライマーは、MPIF-1、MIP-4またはM-CIF変異を同定およ
び分析するために使用され得る。例えば、欠損および挿入は、正常な遺伝子型と
比較した増幅産物のサイズにおける変化によって検出され得る。点変異は、放射
標識MPIF-1、MIP-4およびM-CIF RNAあるいは、放射標識MPIF-1、MIP-4およびM-C
IFアンチセンスDNA配列に増幅DNAをハイブリダイズさせる工程によって同定され
得る。完全に一致した配列は、RNase A消化または融点の差異によって、ミスマ
ッチした二重鎖から区別され得る。
DNA配列差異に基づく遺伝子試験は、変性剤を有するかまたは有さないゲルに
おけるDNAフラグメントの電気泳動移動度における変化の検出によって達成され
得る。小さな配列欠損および挿入は、高解像度ゲル電気泳動によって可視化され
得る。異なる配列のDNAフラグメントは、異なるDNAフラグメントの移動度がそれ
らの特異的な融点または部分的な融点に従って異なる位置でゲルにおいて遅延す
る変性ホルムアミド勾配ゲル上で区別され得る（例えば、Myersら、Science 230
:1242(1985)を参照のこと）。
特定の位置での配列変化はまた、ヌクレアーセ保護アッセイ（例えば、RNase
およびS1保護）または化学切断法によって示され得る（例えば、Cottonら、PNAS
，USA 85:4397-4401(1985)）。
従って、特定のDNA配列の検出は、ハイブリダイゼーション、RNase保護、化学
的切断、直接的DNA配列決定または制限酵素の使用（例えば、制限フラグメント
長多型(RFLP)）およびゲノムDNAのサザンブロッティングのような方法によって
達成され得る。
より慣習的なゲル電気泳動およびDNA配列決定に加えて、変異はまた、インサ
イチュ分析によって検出され得る。
本発明はまた、種々の組織におけるMPIF-1、MIP-4およびM-CIFのタンパク質の
変化したレベルを検出するための診断アッセイに関する。なぜなら、正常コント
ロール組織サンプルと比較したタンパタ質の過剰発現が、疾患の存在（例えば、
腫瘍）または疾患に対する感受性を検出し得る。宿主に由来するサンプル中のMP
IF-1、MIP-4およびM-CIFタンパク質のレベルを検出するために使用されるアッセ
イは、当業者に周知であり、そしてラジオイムノアッセイ、競合結合アッセイ、
ウエスタンブロット分析、ELISAアッセイおよび「サンドイッチ」アッセイを含
む。ELISAアッセイ（Coliganら、Current Protocols in Immunology 1(2)，６章
(1991)）は、最初に、MPIF-1、MIP-4およびM-CIF抗原に特異的な抗体（好ましく
は、モノクローナル抗体）を調製する工程を含む。さらに、レセプター抗体はモ
ノクローナル抗体に対して調製される。レセプター抗体に、検出可能な試薬（例
えば、放射能、蛍光または、この例では、西洋わさびベルオキシダーゼ酵素）が
付着される。サンプルは、宿主から取り出され、そしてサンプル中のタンパク質
に結合する固相支持体（例えば、ポリスチレンディッシュ）上でインキュベート
される。次いで、ディッシュ上の任意の遊離タンパク質結合部位は、BSAのよう
な非特異的タンパク質とインキュベートすることによってカバーされる。次に、
モノクローナル抗体は、モノクローナル抗体が、ポリスチレンディッシュに付着
した任意のMPIF-1、MIP-4およびM-CIFタンパク質に付着する時間の間、ディッシ
ュ中でインキュベートされる。全ての非結合モノクローナル抗体を緩衝液で洗い
落とす。ここで、西洋わさびペルオキシダーゼに連結したレセプター抗体は、デ
ィッシュ中に置かれ、MPIF-1、MIP-4およびM-CIFに結合した任意のモノクローナ
ル抗体へのレセプター抗体の結合を生じる。次いで、非付着レセプター抗体は洗
い落とされる。次いで、ペルオキシダーゼ基質は、ディッシュに添加され、そし
て所定の期間に発生した呈色の量は、標準曲線と比較した場合、患者サンプルの
所定の容量中に存在するMPIF-1、MIP-4およびM-CIFタンパク質の量の尺度である
。
競合アッセイは、MPIF-1、MIP-4およびM-CIFに特異的である抗体が固相支持体
に付着され、そして標識されたMPIF-1、MIP-4およびM-CIFに付着され、そして宿
主由来のサンプルが固相支持体を通過され、そして（例えば、液体シンチレーシ
ョンクロマトグラフィーによって）検出された標識の量は、サンプル中のタンパ
ク質の量に相関し得る。
「サンドイッチ」アッセイは、ELISAアッセイに類似する。「サンドイッチ」
アッセイにおいて、MPIF-1、MIP-4およびM-CIFが、固相支持体を通過され、そし
て固相支持体に付着された抗体に結合する。次いで、第２の抗体はMPIF-1、MIP-
4およびM-CIFに結合される。次いで、標識され、そして第２の抗体に対して特異
的である、第３の抗体は、固相支持体を通過され、そして第２の抗体に結合し、
次いで量が定量され得る。
本発明は、ケモカインポリペプチドのレセプターの同定のための方法を提供す
る。レセプターをコードする遺伝子は、当業者に公知の種々の方法（例えば、リ
ガンドパニングおよびFACS分取）によって同定され得る（Coliganら、Current P
rotocols in Immun．1(2)、５章、(1991)）。好ましくは、発現クローニングが
使用され、ここでポリアデニル化RNAがポリペプチドに応答性である細胞から調
製され、そしてこのRNAから作製されたcDNAライブラリーは、プールに分けられ
、そしてCOS細胞、またはポリペプチドに対して応答性でない他の細胞をトラン
スフェクトするために使用される。ガラススライド上で増殖するトランスフェク
ト細胞は、標識ポリペプチドに曝される。ポリペプチドは、種々の手段（ヨウ素
化または部位特異的タンパク質キナーゼの認識部位の封入）によって標識され得
る。
固定化およびインキュベーションの後、スライドは、オートラジオグラフ分析に
曝される。ポジティブプールが同定され、そしてサブプールが調製され、そして
反復性サブプーリングおよび再スクリーニングプロセスを用いて再トランスフェ
クトされ、最終的に推定レセプターをコードする単一クローンが産生される。
レセプター同定のための代替的アプローチとして、標識ポリペプチドは、細胞
膜またはレセプター分子を発現する抽出調製物と光親和性結合され得る。架橋物
質は、PAGE分析によって分解され、そしてＸ線フィルムに曝される。ポリペプチ
ドのレセプターを含有する標識複合体が、切り出され、ペプチドフラグメントに
分解され、そしてタンパク質微量配列決定に曝され得る。微量配列決定から得ら
れるアミノ酸配列は、推定レセプターをコードする遺伝子を同定するためにcDNA
ライブラリーをスクリーニングするための変性オリゴヌクレオチドプローブの組
を設計するために使用される。
治療薬。本発明のポリペプチドは、種々の免疫調節および炎症機能において使
用され得、そしてさらに多数の疾患状態において使用され得る。MPIF-1、MIP-4
およびM-CIFは、ケモカインファミリーであり、それゆえそれらは、白血球（例
えば、単球、好中球、Ｔリンパ球、好酸球、好塩基球など）の化学誘引物質であ
る。
ノーザンブロット分析により、MPIF-1、MIP-4およびM-CIFが優先的に発現され
るのは、造血性起源の組織であることが示される。
MPIF-1治療/診断適用。MPIF-1は、免疫応答および炎症の調節において重要な
役割を果たすことが示される。図19において、リポポリサッカライドが、ヒト単
球からMPIF-1の発現を誘導することが示される。従って、エンドトキシンの存在
に応答して、MPIF-1は、単球から発現され、それゆえ、MPIF-1の投与は、宿主の
免疫応答を調節するために使用され得る。MPIF-1は、抗炎症剤として使用され得
る。
図10に示されるように、THP-1細胞(A)およびPBMC(B)におけるMPIF-1の化学誘
引活性が有意である。MPIF-1はまた、THP-1細胞において有意なカルシウム動員
を誘導し（図11）、これは、MPIF-1が単球に対して生物学的効果を有することを
示す。さらに、MPIF-1は、用量依存性化学向性を生じ、カルシウム動員はヒト単
球において応答する。
さらに、本発明のポリペプチドは、抗腫瘍治療において有用であり得る。なぜ
なら、腫瘍に注射されたケモカイン発現細胞が、例えば、カポジ肉腫の処置にお
いて、腫瘍の退行を引き起こしたからである。MPIF-1は、細胞がTNF-αを分泌す
ることを誘導し得る。TNF-αは、腫瘍退行のための公知の因子である。この場合
、このタンパク質は、腫瘍退行を誘導するために使用され得る。MPIF-1はまた、
ヒト単球が他の腫瘍およびガンを阻害する因子（例えば、IL-6、IL-1およびG-CS
F）を分泌することを誘導し得る。さらに、MPIF-1、MIP-4およびM-CIFは、それ
らの化学向性活性を介して宿主防御（殺腫瘍性）細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細
胞およびマクロファージ）の浸潤および活性化を刺激し、そしてまた、この様式
で固形腫瘍を処置するのに使用され得る。
ポリペプチドはまた、造血細胞の増殖および分化を阻害するために使用され得
、それゆえ、化学療法の間に化学療法薬剤から骨髄幹細胞を保護するために使用
され得る。図12および13は、MPIF-1が、低増殖能力コロニー形成細胞（LPP-CFC
）によってコロニー形成を阻害することを示す。図14は、M-CIFがM-CSF刺激性コ
ロニー形成を特異的に阻害し、一方、MPIF-1が阻害しないことを示す。MPIF-1お
よびM-CIFの両方が骨髄細胞の増殖および/または分化を有意に阻害するので、こ
の抗増殖性効果は、化学療法薬剤のより高用量の投与を可能にし得、それゆえ、
より効果的な化学療法処置を可能にし得る。
関連した前駆細胞（例えば、顆粒球、およびマクロファージ/単球細胞）の亜
集団に対するM-CIFおよびMPIF-1ポリペプチドの阻害効果は、白血病細胞の増殖
を阻害するために治療的に使用され得る。
さらに、本発明者らは、MPIF-1およびその改変体（例えば、MPIF-1Δ23）が、
ヒト骨髄および顆粒球前駆体のインビトロ増殖および分化を阻害することを見出
した。同様に、動物研究は、MPIF-1Δ23が、例えば、インビトロおよびインビボ
で低増殖能力コロニー形成細胞（LPP-CFC）ならびに顆粒球/単球関連前駆体の発
生を特異的に阻害することを示した。これらの知見は、MPIF-1が化学保護薬剤と
して治療適用を有する。これは、初期骨髄前駆体を一般に使用される化学治療薬
物の細胞傷害性効果から保護し得る。
MPIF-1およびその改変体が骨髄前駆体細胞を選択的に阻害する能力を有するた
め、MPIF-1は、骨髄増殖性障害(例えば、本質的な血小板増多症(ET)、赤血球増
加症(PV)、または突発性骨髄異形成(AMM))を処置するために使用され得る。これ
は、臨床的に密接に関連する。各障害は、単一の造血幹細胞の獲得された変異か
ら生じる。これは、その幹細胞の子孫に増殖利点を与える。これらの障害の病態
生理学は、異なる細胞型の過剰生産が存在する点において異なる。PVにおいて、
赤血球、血小板、および巨核球の過剰生産が存在する。ETにおいて、定義によっ
て、血小板ならびに白血球の過剰生産が存在する。AMMはまた、骨髄線維症に加
えて血小板増多症または白血球増多症を示す。
PV患者の安定化は、瀉血による赤血球の除去によって取り組まれ得る。しかし
、ET患者における上昇した血小板レベルについての匹敵する治療は存在しない。
いくつかの骨髄抑制性治療は、血小板増多症の危険性を低下するために研究され
ている。放射性リン、ヒドロキシ尿素、アルキル化剤（ブスルファンおよびクロ
ランブシル）、インターフェロン、またはアナグレリド(anagrelide)での処置は
、全ての示された有意な副作用を有する。詳細には、アナグレリドを除く各骨髄
抑制性治療での急性白血病の増大した危険性が存在する。アナグレリドは有望な
治療である。しかし、アナグレリドに対する有害な反応が心配され、そしてその
慢性の毒性能力は確立されていない。インターフェロンは、高価であり、副作用
を有し、そして非経口投与の不便さから、現在、二次系統（second-line）治療
である。これらの知見は、これらの疾患における治療の実質的な必要性が依然と
して存在することを示す。MPIF-IΔ23で予め処置し、次いで5-FUで処置したマウ
スにおけるインビボ研究は、血小板前駆細胞増殖の阻害を示す。
本発明は、さらに他の骨髄抑制性治療および薬剤と組み合わせた、MPIF-1、お
よびその改変体の使用を含む。
図15、16および17において、利用された細胞系統の関連細胞を取り出し、そし
て得られた細胞の集団をM-CIFおよびMPIF-1と接触させたところ、細胞のMac-1ポ
ジティブ集団における、ほぼ50％の減少を生じた。これは、図14の結果と一致す
る。これは、M-CIFがM-CSF応答性コロニー形成細胞の阻害を誘導することを示す
。図17に示されるように、MPIF-1は、IL-3、GM-CSFおよびM-CSFに応答したコロ
ニ
ーを形成する関連前駆細胞の能力を阻害する。さらに、図18に示されるように、
MPIF-1の用量応答は、コロニー形成を阻害することが示される。この阻害は、こ
れらの因子によって媒介される分化シグナルの特異的ブロックまたは前駆細胞に
対する細胞傷害効果に起因し得る。さらに、実施例15および16は、MPIF-1が、化
学治療薬剤の細胞傷害性に対するインビトロおよびインビボの骨髄保護活性を有
することを示す。従って、MPIF-1は、化学療法を受ける患者についての骨髄保護
物として有用であり得る。
上記のように、化学療法および放射線治療から生じる１つの主要な合併症は、
非病原性細胞型の破壊である。本発明は、個体における骨髄細胞増殖を抑制する
ことによって、放射線および化学治療薬剤からの骨髄保護のための方法を提供す
る。これらの方法は、骨髄抑制量のMPIFを単独、またはマクロファージ炎症タン
パク質-1α（MIP-1α）、マクロファージ炎症タンパク質-2（MRP-2）、血小板因
子４（PF4）、インタ-ロイキン-8（IL-8）、マクロファージ化学向性および活性
化因子（MCAF）、およびマクロファージ炎症タンパク質関連タンパク質-2（MRP-
2）からなる群から選択される１以上のケモカインとともにのいずれかで、放射
線処置または化学治療療法の一部として個体に投与する工程を含む。従って、本
発明の骨髄抑制性組成物は、骨髄保護性効果を提供し、そして骨髄細胞に対して
有害な効果を有する治療と組み合わせて有用である。そういうわけで、本発明の
骨髄抑制性組成物は、骨髄細胞を低周期状態に置き、それによって例えば、放射
線治療または細胞周期活性化薬剤（例えば、シトシンアラビノシド、ヒドロキシ
尿素、5-FuおよびAra-C）を用いる化学療法によって引き起こされる細胞損傷に
対する保護を提供する。一旦、化学治療薬物が個体の系を解消した場合、MPIF-1
によって保護される前駆体細胞の迅速な増幅および分化を、例えば、骨髄刺激剤
（例えば、インターロイキン-11(IL-11)、エリスロポエチン(EPO)、GM-CSF、G-C
SF、幹細胞因子(SCF)、およびトロンボポエチン(Tpo)）を用いて刺激することが
望ましい。
化学治療薬剤の存在下でインビボ骨髄保護を付与するMPIF-1の能力は、実施例
28に示される。実施例28は、化学治療薬剤の投与の前の個体へのMPIF-1の投与が
複数周期の5-Fu処置の後でさえ、血液中の血小板の回復を加速することを示す。
実施例28に示される実験はまた、複数同期の5-Fu処置の間のMPIF-1処置が顆粒球
のより早い回復を生じることを示す。さらに、実施例28の結果はまた、MPIF-1お
よびG-CSFが、同時投与された場合、相加的な効果を発揮することを示唆する。
示されるように、本発明者らは、MPIF-1、およびその変異体が、骨髄由来の低
増殖能コロニー形成細胞(LPP-CFC)の強力なインビトロ抑制を示すことを見出し
た。LPP-CFCは、顆粒球および単球系統になる二分化性造血前駆細胞である。MPI
F-1はまた、顆粒球および単球コロニー形成細胞に由来するヒトCD34+幹細胞によ
るコロニー形成を可逆的に阻害する。本発明者らのインビトロ化学的保護実験は
、
の細胞傷害性効果から、MPIF-1Δ23によるこれらの造血前駆細胞の保護を示した
。
インビボ化学療法モデルにおけるMPIF-1変異体(Δ23)の使用は、それが骨髄前
駆細胞ならびに好中球および血小板の末梢細胞集団の両方のより迅速な回復を生
じることを示した。さらに、実施例16および28に示されるように、MPIF-1の投与
は、5-Fuで処置された実験動物において、好中球減少症および血小板減少症から
の促進された回復を生じる。従って、MPIF-1およびその変異体は、化学療法剤に
関連した骨髄形成不全、顆粒球減少症、および血小板減少症の期間を短縮し、そ
れによってそのような薬剤の処置を受けた患者における感染の可能性を減少する
。
従って、本発明は、骨髄前駆細胞の保護のための方法、および分裂する細胞を
優先的に殺傷する治療（例えば、放射線治療または細胞周期活性薬物での処置）
を受けている個体へのMPIF-1の投与を含む血小板および顆粒球の回復を促進する
ことに関する。MPIF-1は、充分量で投与されて分裂する細胞を優先的に殺傷する
処置および薬剤に対するインビボ骨髄保護を提供する。「MPIF-1が投与される」
は、MPIF-1、MPIF-1のアナログ、またはそれらの組み合わせが、治療的有効量で
投与されることを意味する。MPIF-1の投与の様態は、以下に詳細に考察される。
MPIF-1は、分裂する細胞を優先的に殺傷する治療の前、後、または最中に投与
され得る。好ましい実施態様において、MPIF-1は、放射線治療または細胞周期活
性薬物の投与の前に投与され、MPIF-1が骨髄細胞の増殖を抑制することを可能に
するに充分な時間がある。本発明によってさらに意図されることは、分裂中の細
胞を優先的に殺傷する治療の複数ラウンドの間の骨髄細胞を保護するためのMPIF
-1の使用である。このような場合、MPIF-1は、治療または処置療法において異な
る時間点で単一用量または複数用量のいずれかで投与され得る。
上記に示されるように、MPIF-1は、単独または１つ以上の骨髄刺激因子と共に
使用され得る。骨髄刺激因子は、現在、放射線治療または細胞周期活性薬物での
処置を受ける個人においてそれらの欠乏の後、骨髄細胞の増殖を刺激するために
当該分野で使用されている。例えば、Kannan，V.ら，Int.J.Radiat.Oncol.Biol.
Phys.37:1005-1010(1997);Engelhardt,M.ら，Bone Marrow Transplant 19:529-5
37(1997);Vadhan-RaJ，S.ら，Ann Intern Med．126:673-681(1997);Harker,．L.
ら，Blood 89：155-165(1997);Basser,R,ら，Lancet 348:1279-1281(1996);Gros
sman，A.ら，Blood 88:3363-3370(1996)；Gordon，M.ら，Blood 87:3615-3624(1
996)を参照のこと。MPIF-1は、例えば分裂する細胞を殺傷する処置の前に投与さ
れ得、そして１つ以上の骨髄刺激因子はそのような治療過程の後または最中に投
与される。このような場合、MPIF-1lは、治療および骨髄刺激因子（単数または
複数）の投与から骨髄細胞を保護し、次いで保護された骨髄細胞集団の増殖をも
たらす。
骨髄刺激因子は、代表的には、治療的に有効量の化学療法薬剤での処置を受け
る患者に投与される。用量処方物および投与の様態は、処置される個体、刺激さ
れる細胞の状態、化学療法措置の処置の段階、および使用される骨髄刺激因子（
単数または複数）を含む多数の要因で変化し得る。例えば、GM-CSFおよびG-CSF
は、それぞれ約１μｇ/キログラム体重および５〜10μｇ/キログラム体重の用量
で治療的に有効であり、そして皮下注射により毎日の投与され得る。例えば、Ka
nnan，V.ら，Int.J.Radiat.Oncol.Biol.Phys.37:1005-1010(1997);Engelhardt，
M.ら，Bone Marrow Transplant 19:529-537(1997);Sniecinski，I.ら，Blood 89
:1521-1528(1997)を参照のこと。IL-11は、100μｇ/キログラム体重までの用量
範囲で毎日の皮下注射によって投与され得る。Gordon，M.ら,前出。しかし、10
μｇ/キログラム体重未満のIL-11の用量が、化学療法で誘導される血小板減少症
を減少することに有効であると考えられている。Tpoは、0.3〜2.5μｇ/キログラ
ム体重の用量範囲で静脈内注射によって投与され得る。例えば、Vadhan-RaJ，S
．
ら.，Ann.Intern.Med.126:673-681(1997);Harker，L.ら，Blood 89:155-165(199
7)を参照のこと。当業者が理解するように、最適な用量処方物および投与の様態
は、上記の要因を含む多数の要因によって変化する。さらなる骨髄刺激因子に対
する用量処方物および投与の様態は、当該分野で公知である。
分裂する細胞を優先的に殺傷する治療を含む処置プロトコールの部分としての
骨髄刺激因子の投与のタイミングはまた、用量処方物および投与の様態について
の上記の要因とともに変化し得る。放射線治療または細胞周期活性薬物を含む処
置プロトコールの部分として骨髄刺激因子の個体への投与を開示する多数の報告
が公開されている。例えば、Vadhan-Raj，S.ら、前出は、化学療法剤投与の３週
前に、Tpoの単一の静脈内投与の使用を報告する。Papadimitrou，C.ら，Cancer
79:2391-2395(1997)およびWhitehead，R.ら，J.Clin.Oncol．15.2414-2419(1997
)は、数週間の経過にわたって化学療法剤の投与を含む化学療法処置法を報告す
る。これらの場合のそれぞれにおいて、G-CSFの用量は、化学療法剤での処置の
最初の日後および最終日の前の複数の時間点で投与される。IL-11およびGM-CSF
の両方の類似の使用法が、Gordon，M.ら,前出、およびMichael，M.,ら，Am.J.Cl
in.Oncol．20:259-262(1997)に報告されている。しかし、骨髄刺激因子の投与の
最適のタイミングが、使用される特定の骨髄刺激因子、およびそれらが投与され
る条件とともに変化することを、当業者は認識している。
従って、分裂する細胞を優先的に殺傷する治療が骨髄細胞に対して有する細胞
傷害作用を軽減するという骨髄刺激因子の投与は、当該分野で公知である。骨髄
刺激因子は、静脈内注射および皮下注射を含むいくつかの経路によって投与され
得る。投与される骨髄刺激因子の濃度は、多数の要因と共に広範に変化するが、
一般的に、約0.1〜100μｇ/キログラム体重の範囲であり、そして化学療法処置
もしくは放射線処置措置において、種々の時間点で単回用量または複数用量で投
与され得る。しかし、骨髄刺激因子は、一般的に、化学療法剤の投与もしくは放
射線処置の前または後で投与される。当業者が理解するように、骨髄刺激因子が
使用される条件は、特定の骨髄刺激因子および処置措置の両方で変化する。
当業者に明らかなように、MPIF-1は、一般的に造血成長因子の有効性を増強す
るために、上記のように使用され得る。このような造血成長因子としては、赤血
球の産生を促進するエリスロポエチン、およびより初期の幹細胞を刺激し、それ
によって全ての血液細胞型の数を増加する多系列成長因子であるIL-3が挙げられ
る。他には、幹細胞因子；GM-CSF；ならびにG-CSFおよびエリスロポエチンのハ
イブリッド分子；IL-3およびSCF；ならびにGM-CSFおよびG-CSFが挙げられる。
本発明の骨髄抑制性薬学的組成物もまた、骨髄細胞の過剰増殖状態を引き起こ
す白血病の処置に有用である。従って、本発明は、骨髄抑制量のMPIF-1を単独か
、またはMIP-1α、MIP-2α、PF4、IL-8、MCAF、およびMRP-2からなる群より選択
される１つ以上のケモカインとともにかのいずれかで白血病患者に投与する工程
を包含する白血病を処置する方法をさらに提供する。
「骨髄細胞増殖を抑制すること」は、骨髄細胞の細胞増殖を減少すること、お
よび／または緩序な細胞周期(slow-cycling phase)にある骨髄細胞の割合を増加
することが意図される。上記のように、「個体」は、哺乳動物、好ましくはヒト
が意図される。本発明の骨髄抑制性組成物のアセトニトリル(ACN)とのプレイン
キュベーションは、骨髄前駆細胞の抑制に対するこれらのケモカインの比活性を
有意に増強する。従って、好ましくは、投与の前に、本発明の骨髄抑制性組成物
は、Broxmeyer H.E.,ら，Ann-Hematol．71(5):235-46(1995)およびPCT公開WO94/
13321（これらの全体の開示が本明細書中に参考として援用される）に記載のよ
うに、ACNで前処理される。
本発明の骨髄抑制性組成物は、ナイトロジェンマスタード、エチレンイミン、
メチルメラミン、アルキルスルホン酸塩、ニトロ尿素(nitrosuourea)、およびト
リアジン(triazene)のようなアルキル化剤；葉酸アナログ、ピリミジンアナログ
（特に、フルオロウラシルおよびシトシンアラビノシド）のような代謝拮抗剤、
ならびにプリンアナログ；ビンカアルカロイド、エピポドフィロトキシン、抗生
物質、酵素および生物学的応答変更因子のような天然産物；ならびにプラチナ配
位複合体、アントラセンジオン、ヒドロキシ尿素のような置換された尿素、メチ
ルヒドラジン誘導体、および副腎コルチコイド抑止剤のような雑多な産物を含む
種々の化学治療剤を組み合わせて使用され得る。
化学療法剤は、公知の技術に従って、既知の濃度で投与され得る。本発明の骨
髄抑制性組成物は、化学療法剤と同時に投与され得るか、または化学療法剤が投
与される前または後のいずれかで別々に投与され得る。
MIP-1β、MIP-2β、およびGRO-αのような特定のケモカインは、本発明の骨髄
抑制性組成物に影響する骨髄抑制を阻害（少なくとも部分的にブロック）する。
従って、さらなる実施態様において、本発明は、MIP-1β、MIP-2β、およびGRO-
αからなる群より選択される有効量の骨髄抑制阻害剤を、以前に骨髄抑制剤MPIF
-1を単独または１つ以上のMIP-1α、MIP-2α、PF4、IL-8、MCAF、およびMRP-2と
ともにのいずれかに曝された哺乳動物へ投与する工程を包含する、骨髄抑制を阻
害するための方法を提供する。
MPIF-1活性（骨髄抑制剤または骨髄抑制阻害剤とともにまたはなしで骨髄抑制
に有効な量のMPIF-1ポリペプチドを含む）の増加したレベルを必要とする個体を
処置するための有効量のMPIF-1ポリペプチドが、MPIF-1の投与が適応される各条
件に対して経験的に決定され得ることが、当業者に明らかである。MPIF-1活性を
有するポリペプチドは、１つ以上の薬学的に受容可能な賦形剤と組み合わせた薬
学的組成物において投与され得る。
MPIF-1はまた、アポトーシスを誘導することによって、白血病および異常増殖
細胞（例えば、腫瘍細胞）の処置のために用いられ得る。MPIF-1は、造血前駆細
胞の集団におけるアポトーシスを誘導する。
MPIF-1は、末成熟造血前駆細胞（例えば、顆粒球、マクロファージまたは単球
）の分化を一時的に阻害することによって、それらの増殖するために用いられ得
る。これらの骨髄細胞は、インビトロで培養され得る。従って、MPIF-1はまた、
骨髄移植および／または遺伝子治療の目的にインビトロでの造血幹細胞の修飾因
子として有用であり得る。幹細胞はまれであり、そして遺伝子治療のために導入
する遺伝子として最も有用であるので、MPIFは、幹細胞の富化された集団を単離
するために使用され得る。幹細胞は、分裂する細胞を迅速に殺傷する細胞毒(例
えば、5-Fu)の存在下で細胞を培養することによって富化され得、そこで幹細胞
はMPIF-1によって保護される。これらの幹細胞は、骨髄移植患者へ戻され得るか
、または次いで遺伝子治療のために所望の遺伝子のトランスフェクションのため
に使用され得る。さらに、MPIF-1は個体へ注入され、個体の骨髄細胞由来の幹細
胞の末梢血への放出をもたらし得る。これらの幹細胞は、自己の骨髄移植または
遺
伝子治療のための操作の目的で単離され得る。患者が化学療法または放射線処置
を終了した後、単離された幹細胞は患者に戻され得る。
さらに、MPIF-1は、Ｔリンパ球、およびマクロファージに対する作用を有する
ので、MPIF-1は、抗原提示細胞(APC)がウイルス、細菌、または他の外来物質を
取り込む能力を増強し、それらをプロセスし、そして免疫応答をになうリンパ球
へそれらを提示し得る。MPIF-1はまた、APCのＴリンパ球およびＢリンパ球との
相互作用を調節し得る。MPIF-1は、応答細胞を生存、増殖、分化、さらなるサイ
トカインもしくは可溶性メディエーターの分泌、またはアポトーシスもしくは他
の細胞死の機構を誘導することによる応答細胞の選択的除去へ導く、抗原提示の
間の同時刺激シグナルを提供し得る。APCは、HIVのCD4+Ｔリンパ球への輸送を容
易にすることが示されたので、MPIF-1はまた、この能力に影響し得、そしてHIV
またはAPCを介して媒介される他のウイルスによるリンパ球の感染を防止し得る
。これはまた、APC、Ｔリンパ球、または他の細胞型のHIV、EBV、または他のそ
のようなウイルスのいずれかによる初期感染についても真実である。
さらに、MIP-1αレセプターが、HIVのヒト単球およびＴリンパ球への侵入を促
進することにおける補因子として役立つという最近の証明は、MPIF-1またはその
変異体が、細胞内へのHIV侵入のプロセスを妨害し得るという興味深い可能性を
生じる（実施例17を参照のこと）。従って、MPIF-1は、それらの侵入がMIP-1α
レセプターによって促進されるウイルスまたはレトロウイルスに対する抗ウイル
ス剤として有用であり得る。
MPIF-1は、細菌感染およびウイルス感染、ならびに他の外来体を攻撃するため
のＴリンパ球の内在的活性を促進することによる免疫増強因子として作用し得る
。このような活性は、アレルギーの感染、ならびに固形腫瘍および白血病の両方
を含む腫瘍性または良性の増殖に対する免疫応答のような外来抗原に対する正常
な応答のために有用である。
これらの理由のために、本発明は、哺乳動物、好ましくはヒトにおける種々の
免疫系関連疾患の診断または処置のために有用である。このような疾患には、腫
瘍、ガン、および任意の免疫細胞機能の非調節（自己免疫、関節炎、白血病、リ
ンパ腫、免疫抑制、敗血症、創傷治癒、急性感染および慢性感染、細胞媒介免疫
、
液性免疫、炎症性腸疾患、骨髄抑制などを含むが、それらに限定されない）が挙
げられる。
M-CIF治療的／診断的適用。M-CIF活性は、免疫増強または抑制、骨髄保護、幹
細胞動員、急性および慢性感染制御、ならびに白血病の処置に有用である。さら
に、M-CIFは、Ｔリンパ球およびマクロファージに対する作用を有するので、M-C
IFは、抗原提示細胞(APC)の、ウイルス、細菌、または他の外来物質を取り込む
能力を増強して、それらをプロセスし、そして免疫応答をになうリンパ球へそれ
らを提示する。さらに、M-CIFはまた、APCのＴリンパ球またはＢリンパ球との相
互作用を調整する。例えば、M-CIFは、応答細胞を生存、増殖、分化、さらなる
サイトカインもしくは可溶性メディエーターの分泌、またはアポトーシスもしく
は他の細胞死の機構を誘導することによる応答細胞の選択的除去へ導く、抗原提
示の間の同時刺激シグナルを提供し得る。APCは、HIVのCD4+Ｔリンパ球への輸送
を容易にすることが示されたので、M-CIFはまた、この能力に影響し得、そしてA
PCを介して媒介されるHIVまたは他のウイルスによるリンパ球の感染を防止し得
る。これはまた、APC、Ｔリンパ球、または他の細胞型の、HIV、EBV、または他
のそのようなウイルスのいずれかによる初期感染についても真実である。
M-CIFは免疫系を抑制する。一つの機構として、M-CIFが、CTLA-4を介したＴリ
ンパ球の活性をダウンレギュレートすることが考えられる。活性化および続くＴ
細胞の分化は、APCからの２つのタイプのシグナルを必要とする。これら２つの
シグナルのうちの１つは、APCに対する、B7ファミリーのメンバーとのＴ細胞表
面分子CD28の関与によって媒介される抗原非依存性シグナルである。Allison，C
urr．Opin．Immunol 6:414(1994);Juneら，Immunol．Today 15:321(1994)。CD28
とは対照的に、CTLA-4は、Ｔ細胞応答のネガティブ調節に重要である。Waterhou
seら，Science 270:985(1995)。最近の研究は、Ｔ細胞活性化の開始が、CD28か
らのポジティブシグナルとCTLA-4からのネガティブシグナルとの間の繊細に釣り
合った相互作用によって決定されることを示唆する。Waterhouseら，Science 27
0:985(1995)。多数の研究の累積的な結果は、CTLA-4の遮断が除去され、その一
方、CTLA-4の凝集が提供され、阻害的シグナルがＴ細胞応答をダウンレギュレー
トすることを示唆する。Allisonら，Science 270:932-933(1995)。さらにCTLA
-4ノックアウトマウスの表現型は、Ｔ細胞応答の調節におけるCTLA-4に対する阻
害的シグナリングの役割を支持する。Allisonら，Science 270:932-933(1995)。
M-CIFは、上記で考察されたように、Ｔ細胞のダウンレギュレーターとして公知
のCTLA-4細胞を誘導するようである。さらに、M-CIFは、Ｔ細胞のダウンレギュ
レーターとしてまた公知であるCD8+Ｔ細胞を直接阻害する。
Ｔ細胞をダウンレギュレートするためのM-CIFの能力は、細菌またはウイルス
による感染、およびアレルギーからの外来抗原に対する免疫応答、ならびに固形
腫瘍および白血病の両方を含む腫瘍性または良性の増殖に対する免疫応答を調節
するために有用である。
これらの理由のため、本発明は、哺乳動物、好ましくはヒトにおける種々免疫
系関連疾患の診断または処置に有用である。このような疾患には、腫瘍、ガン、
および任意の免疫細胞機能の非調節（自己免疫、関節炎、喘息、白血病、リンパ
腫、免疫抑制、敗血症、創傷治癒、急性感染および慢性感染、細胞媒介免疫、液
性免疫、炎症性腸疾患、骨髄抑制などを含むが、それらに限定されない）が挙げ
られる。
抗炎症剤としてのM-CIFは、TNFαの異常産生を含むがこれに限定されないその
ような疾患の処置のために使用され得る。このような疾患には、敗血症症候群（
悪液質、循環器崩壊、および急性または慢性の細菌感染、急性および慢性の寄生
性または感染性のプロセス（細菌、ウイルス、および真菌感染を含む）、急性お
よび慢性の免疫ならびに自己免疫症状（例えば、全身性エリテマトーデス(SLE)
および関節リウマチ）、アルコール誘導肝炎、サルコイドーシスおよびクローン
病のような慢性炎症性症状、汎発性血管内凝血、移植片対宿主病、川崎病のよう
な血管炎症性症状；TNF分泌腫瘍および神経退行性疾患を含む悪性症状が挙げら
れるが、これらに限定されない。
神経退行性疾患としては、AIDS痴呆複合症、脱髄疾患（例えば、多発性硬化症
および急性横断性脊髄炎；錐体外路疾患および小脳疾患（例えば、皮質髄質系の
傷害）；基底核の疾患または小脳疾患；運動冗進運動疾患（例えば、ハンチント
ン舞踏病および老年性舞踏病）；薬物誘導運動疾患（例えば、CNSドーパミンレ
セプターをブロックする薬物によって誘導される疾患）；運動低下運動疾患（例
えば、パーキンソン病）；進行性核上皮麻痺；小脳の構造的傷害；脊髄小脳変性
（例えば、脊髄失調症、Friedreich失調症、小脳髄質変性、多組織変性（Mencel
、Dejerine-Thomas、Shi-Drager、およびMachado-Joseph）；全身性疾患（Refsu
m疾患、無βリポタンパク血症、運動失調、毛細血管拡張、およびミトコンドリ
ア多組織疾患）；脱髄核疾患（例えば、多発性硬化症、急性横断性脊髄炎）；な
らびに運動単位の疾患（例えば、神経性筋萎縮（前角細胞変性（例えば、筋萎縮
性側索硬化症）、乳児性脊髄筋萎縮、および若年性脊髄筋萎縮））；アルツハイ
マー病；中年のダウン症候群；Diffuse Lewy体疾患；Lewy体型老年痴呆；Wernic
ke-Korsakoff症候群；慢性アルコール中毒；クロイツフェルト−ヤコブ病；亜急
性硬化性全脳炎Hallerrorden-Spats病；ならびにDementia pugilisticaが挙げら
れるが、これらに限定されない。一つの好ましい神経退行性疾患は、多発性硬化
症である。
例えば、Berkowら編、The Merck Manual,第16版、Merck and Co.，Rahway，N
．J.，1992を参照のこと。この文献およびこの文献で引用される参考文献はその
全体が参考として援用される。
上記のように、M-CIFはまた、SLEおよび他の疾患状態（免疫応答および炎症を
含む）の処置のために使用され得る。SLEは、糸球体腎炎および血管炎を誘導し
得る補体固定免疫凝集体の形成を生じる自己免疫疾患である。Steinberg，A.D．
およびKlinman，D.M.，Rheum.Dis.Clinics of No.Amer．14:25(1988)。SLE、な
らびに狼瘡の関連糸球体腎炎および血管炎の両方の処置において多数の薬剤が現
在使用中であるか、または使用の提案がなされている。これらの薬剤のうちには
、免疫応答の誘導に必要な細胞表面レセプターに対する特異性を有する抗体があ
る。例えば、抗CD11aおよび抗CD54モノクローナル抗体は、実験的ループス腎炎
の処置において有効であることが示されている。Koostra，C.J.ら，Clin.Exp.Im
munol．108:324-332(1997)。CD28/CTLA-4とそれらのリガンド（例えばCD80およ
びCD86)との間の相互作用のブロックはまた、狼瘡に関連した免疫応答を抑制す
る手段として提案され、そしてCD80およびCD86特異的モノクローナル抗体の投与
は、実験動物モデルにおいて狼瘡の発生および進行を妨げることが見出されてい
る。Nakajima，A.ら、Eur.J.Immunol．25:3060-3069(1995)。化学的薬剤もまた
、SLE、
および狼瘡関連糸球体腎炎および血管炎の両方の処置において治療効果を有する
ことが見出されている。これらの薬剤には、抗葉酸化合物（例えば、メトトレキ
サートおよびMX-68）および免疫抑制因子（例えば、コルチコステロイド、シク
ロホスファミド、ミコフェノール酸モフェチル(mofetil)、アザチオプリン）が
挙げられる。Corna，D.ら，Kidney Int．51:1583-1589(1997)；Mihara，M.ら，I
nt.Arch.Allergy Immunol．113:454-459(1997);Gansauge，S.ら，Ann.Rheum.Dis
．56:382-385(1997)。さらなる薬剤は、非狼瘡関連免疫複合体と関連した苫痛の
処置に治療的対して治療的な効果を有する。このような化合物の２つのクラスは
、フリーラジカル捕捉剤(例えば、OPC-15161)およびアンジオテンシン変換酵素
阻害剤（例えば、キナプリル（quinapril））である。Sanaka，T，らNephron 76
:315-322(1997);Ruiz-Ortega，M.ら，J.Am.Soc.Nephrol．8:756-768(1997)。
実施例19および29に示されるように、M-CIFは細胞媒介免疫性に関連した腎臓
炎症を抑制し、そして腎炎に関連した狼瘡の亢進を軽減する。従って、本発明は
、M-CIFのそれらを必要とする患者へ投与する工程を包含するSLEならびに免疫応
答（例えば、細胞媒介免疫性および免疫複合体の形成から生じる応答）に関連す
る他の疾患を処置する方法を提供する。M-CIFは単独の免疫応答調節因子として
投与され得るか、または免疫応答を調節する１つ以上のさらなる因子とともに投
与され得る。
従って、MPIF-1、MIP-4、およびM-CIFを使用して、標的免疫細胞の創傷への浸
潤を制御することによって創傷の治癒を容易にし得る。類似の様態において、本
発明のポリペプチドは、微生物殺傷白血球の誘引および活性化を介して、慢性感
染、例えば、ミコバクテリアの感染）に対する宿主の防御を増強し得る。
本発明のポリペプチド、およびそのポリペプチドをコードするポリヌクレオチ
ドは、科学的研究、DNAの合成、およびDNAベクターの製造に関するインビトロ目
的のため、ならびにヒト疾患の処置のための治療剤および診断剤の開発の目的の
ための研究試薬として使用され得る。例えば、M-CIFおよびMPIF-1は、未成熟造
血前駆細胞（例えば、顆粒球、マクロファージ、または単球）の分化を一過的に
阻害することによって、それらの増殖のために、用いられ得る。これらの骨髄細
胞は、インビトロで培養され得る。
このポリペプチドの別の使用は、IL-2生合成の阻害（例えば、自己免疫疾患お
よびリンパ細胞白血病において）を介したＴ細胞増殖の阻害である。
MPIF-1、MIP-4、およびM-CIFはまた、乾癬（ケラチノサイトの過剰増殖）にお
いて利用される上皮ケラチノサイト増殖を阻害するのに有用であり得る。なぜな
ら、皮膚におけるランゲルハンス細胞が、MIP-1αを産生することを見出されて
いるからである。
MPIF-1、MIP-4、およびM-CIFを使用して、残査清掃細胞および接着組織促進炎
症細胞の漸増を介して、およびその過剰のTGFβ媒介線維症の制御によっての両
方で創傷治癒の間の傷を予防し、さらにこれらのポリペプチドを使用して、発作
、血小板増加症、肺塞栓、および骨髄増殖疾患を処置し得る。なぜなら、MPIF-1
、MIP-4、およびM-CIFは血管透過性を増加するからである。
薬学的組成物。MPIF-1、M-CIF、およびMIP-4ポリペプチド薬学的組成物は、有
効量の本発明の単離されたMPIF-1、M-CIF、およびMIP-4ポリペプチド、詳細には
、MPIF-1、M-CIF、またはMIP-4活性レベルを増加させることが有効な個体におい
て、それらの活性レベルを増加させるために有効なMPIF-1、M-CIF、またはMIP-4
の成熟形態を含む。このような組成物は、個々の患者の臨床的状態（特に、MPIF
-1、M-CIF、またはMIP-4ポリペプチド単独での処置の副作用）、MPIF-1、M-CIF
、またはMIP-4ポリペプチド組成物の送達部位、投与方法、投与スケジュール、
および臨床医に公知の他の素因を考慮して、優れた臨床的実行と一致した様式で
処方および投薬され得る。従って、本明細書中の目的のための「有効量」のMPIF
-1、M-CIF、またはMIP-4ポリペプチドは、そのような考慮によって決定される。
本発明のポリペプチド、アンタゴニスト、またはアゴニストは、適切な薬学的
キャリアと組み合わせて用いられ得る。このような組成物は、治療的有効量のタ
ンパク質、および薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤を含む。このような
キャリアは、緩衝化生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノー
ル、およびそれらの組み合わせを含むが、それらに限定されない。処方物は、投
与の様態に適しなければならない。
「薬学的に受容可能なキャリア」によって、非毒性固体、半固体、または液体
充填剤、希釈剤、カプセル化剤、または任意の型の処方補助剤が意味される。本
明細書中で使用される用語「非経口的」は、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内、
皮下、および関節内への注射および注入を含む投与の様態を言う。
MPIF-1、M-CIF、またはMIP-4ポリペプチドはまた、徐放系によって適切に投与
される。徐放組成物の適切な例は、成形された物品（例えばフィルムまたは微小
カプセル）の形態の半透過性ポリマーマトリックスを含む。徐放マトリックスと
しては、ポリラクチド(米国特許第3,773,919号、欧州特許第58,481号)、Ｌ-グル
タミン酸およびγ-エチル-Ｌ-グルタミン酸のコポリマー(Sidman，Uら、Biopoly
mers 22.547-556(1983))、ポリ（2-ヒドロキシエチルメタクリレート）(R.Lange
rら，J Biomed．Mater．Res．15:167-277(1981)、およびR.Langer，Chem．Tech
．12:98-105(1982))、エチレンビニル酢酸(R．Langerら、前出)、またはポリ-D-
(-)-3-ヒドロキシブチル酸(欧州特許第133,988号)が挙げられる。徐放MPIF-1、M
-CIF、またはMIP-4ポリペプチド組成物はまた、リポソームに捕捉されたMPIF-1
、M-CIF、またはMIP-4ポリペプチドを含む。MPIF-1、M-CIF、またはMIP-4ポリペ
プチドを含むリポソームは、それ自体公知の方法によって調製される：DE3,218,
121；Epsteinら，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)82:3688-3692(1985):Hwangら，Proc
．Natl．Acad Sci.(USA)77:4030-4034(1980)；欧州特許第52,322号;欧州特許第3
6,676号；欧州特許第88,046号;欧州特許第143,949号;欧州特許第142,641号;日本
国特許出願第83-118008号;米国特許第4,485,045号および同第4,544,545号;なら
びに欧州特許第102,324号。通常、リポソームは、脂質含量が約30molより大きく
、コレステロールの％が、最適なMPIF-1、M-CIF、またはMIP-4ポリペプチド治療
のために調整されている選択された割合である小さな（約200〜800オングストロ
ーム）単層型である。
非経口投与のために、１つの実施態様において、MPIF-1、M-CIF、またはMIP-4
ポリペプチドは、一般的に、所望の精製度で、注射可能な形態（溶液、懸濁液、
および乳液）の単位用量において、薬学的に受容可能なキャリア（すなわち、使
用される用量および濃度でレシピエントに非毒性であり、そして処方物の他の成
分と適合する）とともに混合することによって処方される。例えば、処方物は、
好ましくは、酸化剤およびポリペプチドに有害であることが既知である他の化合
物を含まない。
一般的に、処方物は、MPIF-1、M-CIF、またはMIP-4ポリペプチドを、液性キャ
リアもしくは細かく分割された固体キャリアまたはその両方と均一かつ緊密に接
触することによって調製される。次いで、必要ならば、生成物は、所望の処方に
成形される。好ましくは、キャリアは非経口的キャリアであり、より好ましくは
、レシピエントの血液と等張な溶液である。このようなキャリアビヒクルの例と
しては、水、生理食塩水、リンゲル溶液、およびデキストロース溶液が挙げられ
る。不揮発性油(fixed oil)およびオレイン酸エチルのような非水性ビヒクルも
また、リポソームと同様に本明細書中で有用である。
キャリアはまた、等張性および化学的安定性を増強する物質のような小量の添
加物を適切に含む。このような物質は、用いられる用量および濃度でレシピエン
トに非毒性であり、そして緩衝液（例えば、リン酸、クエン酸、コハク酸、酢酸
または他の有機酸またはその塩）；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、低分子
量（約10残基より少ない）ポリペプチド（例えば、ポリアルギニンまたはトリペ
プチド））；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロ
ブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例え
ば、グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、またはアルギニン）；セルロー
スもしくはその誘導体、グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む単
糖、二糖、および他の炭水化物；EDTAのようなキレート剤；マンニトールまたは
ソルビトールのような糖アルコール；ナトリウムのような対イオン；および／ま
たは非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルビン酸、ポロキサマー(poloxamer
)またはPEG)を含む。
MPIF-1、M-CIF、またはMIP-4ポリペプチドは、代表的には、このようなビヒク
ルにおいて、約0.lmg/ml〜100mg/mL好ましくは１〜10mgの濃度で、約３〜８のpH
で処方される。前述の賦形剤、キャリア、または安定剤の特定の使用が、MPIF-1
、M-CIF、またはMIP-4ポリペプチド塩の処方物を生じることが理解される。
MPIF-1、および／またはその改変体が、ヒトにおける過剰増殖疾患の処置のた
めの化学治療措置の一部として骨髄保護剤として投与される場合、静脈内投与の
ための適切な用量範囲は、0.01μｇ/kg体重〜10μｇ/kg体重である。さらに、MP
IF-1は、0.1、1.0、10、および100μｇ/kg体重の用量で静脈内に投与され得る。
動
物研究からのデータの推定は、ヒトにおいて骨髄保護のために適切なMPIF-1の用
量は、0.016μｇ/kg体重であることを示す。
さらに、MPIF-1、および／またはその改変体は、特定の数の日の間（例えば、
３日）毎日１回投与され得る。さらに、化学療法措置において使用される場合、
MPIF-1は、化学療法剤の投与の前にヒトに投与され得る。例えば、MPIF-1は、２
日前（化学療法剤の投与の１日前、および投与される日）に投与され得る。
MPIF-1、および／またはその改変体が、骨髄増殖疾患の処置のためにヒトに投
与される場合、投与される用量は、MPIF-1が骨髄保護剤として使用される場合と
同じであり得る。骨髄増殖疾患の処置のためにヒトに投与される場合、MPIF-1は
、皮下に投与され得る。
治療的投与のために使用されるべきMPIF-1、M-CIF、またはMIP-4ポリペプチド
は、無菌でなければならない。無菌性は、滅菌濾過膜（例えば、0.2ミクロン膜
）を通して濾過することによって容易に達成される。治療的MPIF-1、M-CIF、ま
たはMIP-4ポリペプチド組成物は、一般的に、滅菌アクセスポート（例えば、皮
下注射針によって貫通可能なストッパーを有する静脈溶液バッグまたはバイアル
）を有する容器に配置される。
MPIF-1、M-CIF、またはMIP-4ポリペプチドは、通常、単位または多用量容器（
例えば、密封アンプルまたはバイアル）において水性溶液としてかまたは再構築
のための凍結乾燥処方物として保存される。凍結乾燥処方物の例として、10mlバ
イアルが、５mlの滅菌濾過１％(w/v)水性MPIF-1、M-CIF、またはMIP-4ポリペプ
チド溶液で満たされ、そして得られる混合物が凍結乾燥される。注入溶液は、静
菌性注射用水を用いて凍結乾燥MPIF-1、M-CIF、またはMIP-4ポリペプチドを再構
築することによって調製される。
本発明はまた、本発明の薬学的組成物の１つ以上の成分で満たされる１つ以上
の容器を含む薬学的パックまたはキットを提供する。このような容器と関連して
、薬品もしくは生物学的生成物の製造、使用、または販売を規制する政府機関に
よって定められた形態にある通知が存在し得、その通知は、ヒト投与のために製
造、使用または販売する当局による認可を反映する。さらに、本発明のポリペプ
チドは、他の治療的化合物とともに用いられ得る。
投与の様態。個体におけるMPIF-1、M-CIF、またはMIP-4の活性の標準または正
常レベルにおける減少によって生じる状態が、MPIF-1、M-CIF、またはMIP-4タン
パク質の投与によって処置され得ることが理解される。従って、本発明はさらに
、MPIF-1、M-CIF、またはMIP-4活性の増加したレベルを必要とする個体を処置す
る方法を提供し、この方法は、そのような個体に、有効量の本発明の単離された
MPIF-1、M-CIF、またはMIP-4ポリペプチド（詳細には、そのような個体において
MPIF-1、M-CIF、またはMIP-4活性レベルを増加するに有効なMPIF-1、M-CIF、ま
たはMIP-4の成熟形熊）を含む薬学的組成物を投与する工程を包含する。
被験体に投与されるMPIF-1、MIP-4、またはM-CIFの量および投薬措置は、投与
の様態、処置される状態の性質、および処方する医者の判断のような多数の要因
に依存する。薬学的組成物は、特定の適応症の処置および／または予防に有効な
量で投与される。一般的に、ポリペプチドは、少なくとも約10μｇ/kg体重の量
で投与され、そしてほとんどの場合、それらは１日あたり約10mg/kg体重を超え
ない量で投与され、そして好ましくは用量は、投与の経路、徴候、などを考慮し
て毎日約10μｇ/kg体重からである。
一般的な提案として、非経口投与される用量あたりの全薬学的有効量のMPIF-1
、M-CIF、またはMIP-4ポリペプチドは、より好ましくは患者の体重の約１μｇ/k
g/日〜10mg/kg/日の範囲内であるが、上記のように、これは治療的判断の主題で
ある。さらにより好ましくは、この用量は、少なくとも0.01mg/kg/日であり、ヒ
トに対して最も好ましくは、約0.01と1mg/kg/日との間である。連続的に与えら
れる場合、MPIF-1、M-CIF、またはMIP-4ポリペプチドは、代表的に、約１μｇ/k
g/時間〜約50μｇ/kg/時間の用量速度で、１日あたり１〜４回の注射によるかま
たは連続的皮下注入（例えば、ミニポンプを用いて）によるかのいずれかで投与
される。静脈バッグ溶液もまた用いられ得る。生じる応答について変化および処
置後の間隔を観察するために必要な処置の長さは、所望の効果に依存して変化す
るようである。
本発明のMPIF-1、M-CIF、またはMIP-4を含む薬学的組成物は、経口的にか、直
腸へか、非経口的にか、嚢内へか、膣内へか、腹腔内へか、局所的（粉末、軟膏
、ドロップ、または経皮パッチによって）か、頬側へか、または経口もしくは鼻
ス
プレーとして投与され得る。
遺伝子治療。ケモカインポリペプチド、およびポリペプチドであるアゴニスト
またはアンタゴニストは、本発明に従って、インビボでこのようなポリペプチド
を発現することによって用いられ得る（これは、しばしば「遺伝子治療」といわ
れる。
従って、例えば、患者由来の細胞は、エキソビボでポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチド(DNAまたはRNA)で操作され得、次いで操作された細胞と共に、
ポリペプチドで処置されるべき患者へ提供される。このような方法は当該分野で
周知である。例えば、細胞は、本発明のポリペプチドをコードするRNAを含むレ
トロウイルス粒子の使用によって当該分野で公知の手順によって操作され得る。
同様に、細胞は、例えば当該分野で公知の手順によってインビボでポリペプチ
ドを発現するためにインビボで操作され得る。当該分野で公知のように、本発明
のポリペプチドをコードするRNAを含むレトロウイルス粒子を産生するための産
生細胞は、インビボでの細胞の操作、およびインビボでのポリペプチドの発現の
ために患者に投与され得る。このような方法により本発明のポリペプチドを投与
するこれらおよび他の方法は、本発明の教示から当業者に明らかである。例えば
、細胞を操作するための発現ビヒクルは、適切な送達ビヒクルと組み合わせた後
インビボで細胞を操作するために使用され得るレトロウイルス以外（例えば、ア
デノウイルス）であり得る。
レトロウイルスに由来し得るレトロウイルスプラスミドベクターは、モロニー
マウス肉腫ウイルス、モロニーマウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ラウ
ス肉腫ウイルス、およびハーベイ肉腫ウイルスを含むが、それらに限定されない
。
好ましい実施態様において、レトロウイルス発現ベクターpMV-7は、モロニー
マウス肉腫ウイルスの長末端反復(LTR)によって隣接され、単純ヘルペスウイル
ス(HSV)チミジンキナーセ(tk)プロモーターの調節下で選択可能な薬物耐性遺伝
子neoを含む。唯一のEcoRIおよびHindIII部位は、コード配列の導入を容易にす
る(Kirschumeier，P.T.ら，DNA 7:219-25(1998))。
１つ以上の適切なプロモーターを含むベクターは、レトロウイルスLTR；SV40
プロモーター；およびMillerら，Biothechniques，第７巻，第９号:980-990(198
9)に記載のヒトサイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、または任意の他のプ
ロモーター（例えば、ヒストン、polIII、およびβアクチンプロモーターを含む
が、それらに限定されない真核生物細胞性プロモーターのような細胞性プロモー
ター）を含むが、それらに限定されない。適切なプロモーターの選択は、本明細
書中に含まれる教示から当業者に明らかである。
本発明のポリペプチドをコードする核酸配列は、ウイルスチミジンキナーゼプ
ロモーター（例えば、単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター）；レトロウ
イルスLTR、βアクチンプロモーター、およびポリペプチドをコードする遺伝子
を制御する天然のプロモーターを含むが、それらに限定されない適切なプロモー
ターの制御下にある。
レトロウイルスプラスミドベクターは、パッケージング細胞株を形質導入する
ために使用されて、産生体細胞株を形成する。トランスフェクトされ得るパッケ
ージング細胞の例としては、PE501、PA317、およびGP+alm2が挙げられるが、こ
れらに限定されない。ベクターは、当該分野で公知の任意の手段によってパッケ
ージング細胞へ形質導入され得る。このような手段としては、エレクトロポレー
ション、リポソームの使用、およびCaPO4沈殿が挙げられるが、これらに限定さ
れない。
産生体細胞株は、このポリペプチドをコードする核酸配列を含む感染性レトロ
ウイルスベクター粒子を生成する。次いで、このようなレトロウイルスベクター
粒子は、真核生物細胞を形質導入するために、インビトロまたはインビボのいず
れかで使用され得る。形質導入された真核生物細胞は、ポリペプチドをコードす
る核酸配列を発現する。形質導入され得る真核生物細胞は、線維芽細胞および内
皮細胞を含むが、これらに限定されない。
本発明はさらに、以下の実施例を参照して記載されるが、本発明がそのような
実施例に限定されないことを理解すべきである。全ての部分または量は、他に特
定されない限り重量による。
以下の実施例の理解を容易にするために、特定の頻繁に存在する方法および／
または用語が記載される。
「プラスミド」は、先行する小文字のp、ならびに／または続く大文字および
／もしくは数字によって示される。本明細書中の出発プラスミドは、市販される
か非限定的な基準に基づいて公に入手可能か、または公開された手順に従って入
手可能なプラスミドから構築され得るかのいずれかである。さらに、これらに記
載されるプラスミドと等価なプラスミドが、当該分野で公知であり、そして当業
者に明らかである。
DNAの「消化」は、DNA内の特定の配列でのみ作用する制限酵素でのDNAの触媒
的切断をいう。本明細書中で使用される種々の制限酵素が市販され、そしてそれ
らの反応条件、補因子、および他の必要物は、当業者に公知のように使用された
。分析目的には、代表的に、１μｇのプラスミドまたはDNAフラグメントが、約2
0μｌの緩衝液溶液中の約２単位の酵素とともに使用される。プラスミド構築物
からDNAフラグメントを単離する目的には、代表的には、５〜50μｇのDNAが、よ
り大きな容量中で20〜250単位の酵素で消化される。特定の制限酵素についての
適切な緩衝液および基質は、製造者によって特定されている。37℃で約１時間の
インキュベーション時間が通常使用されるが、供給者の使用説明書に従って変化
し得る。消化後、反応物を直接ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、所望のフ
ラグメントを単離する。
切断フラグメントのサイズ分離は、Goeddel，D.ら，Nucleic Aclds Res.，8:4
057(1980)に記載の８％ポリアクリルアミドゲルを用いて実施される。
「オリゴヌクレオチド」は、化学的に合成され得る一本鎖ポリデオキシヌクレ
オチドまたは２つの相補的ポリデオキシヌクレオチドのいずれかをいう。このよ
うな合成オリゴヌクレオチドは、5'リン酸を有さず、従ってキナーゼの存在下で
ATPとともにリン酸を付加することなくして別のオリゴヌクレオチドに連結され
ない。合成オリゴヌクレオチドは、脱リン酸化されていないフラグメントと連結
する。
「連結」は、２本鎖核酸フラグメント間にホスホジエステル結合を形成する過
程をいう(Maniatis，T.,ら，前出,146頁)。他に提供されない限り、連結は、既
知の緩衝液および連結されるべきDNAフラグメントのほぼ等モル量の0.5μｇあた
り10単位のT4 DNAリガーゼ（「リガーゼ」）を有する条件を用いて達成され得る
。
他に記述されない限り、形質転換は、Graham，FおよびVan der Eb，Aら，Viro
logy，52:456-457(1973)の方法に記載のように実施された。
ここで本発明を一般的に記載したが、本発明の例示のために提供され、そして
本発明を限定することを意図しない以下の実施例を参照することによってより容
易に理解される。
実施例１
MPIF-1の細菌発現および精製
MPIF-1、ATCC#75676をコードするDNA配列をまず、5'に対応するPCRオリゴヌク
レオチドプライマー、およびプロセス後のMPIF-1タンパク質（これからシグナル
ペプチド配列を除去したもの）、ならびにMPIF-1遺伝子の3'側のベクター配列を
用いて増幅する。Bam HIおよびXbaIに対応する追加的なヌクレオチドを5'側配列
および3'側配列にそれぞれ追加した。5'オリゴヌクレオチドプライマーは、配列
5'-TCAGGATCCGTCACAAAAGATGCAGA-3'（配列番号１２）を有しており、この配列は
、BamHI制限酵素部位の後に、プロセスされたタンパク質コドンの推定末端アミ
ノ酸から始まるMPIF-1コード配列の１８個のヌクレオチドを含む。3'側配列5'-C
GCTCTAGAGTAAAACGACGGCCAGT-3'（配列番号１３）は、XbaI部位に対する相補配列
を含んでいる。
制限酵素部位は細菌発現ベクターpQE-9（Qiagen，Inc．Chatsworth、CA）上の
制限酵素部位に対応する。pQE-9は、抗生物質耐性(Ampr)、細菌の複製起点（ori
）、IPTG-調節可能プロモーターオペレーター（P/O）、リボソーム結合部位（RB
S）、6-Hisタグおよび制限酵素部位をコードする。次いでpQE-9をBamHIおよびXb
aIで消化する。増幅した配列をpQE-9に連結し、ヒスチジンタグおよびRBSをコー
ドする配列をインフレームで挿入する。次いで連結混合物を用いて、Qiagenから
入手可能であるE．coli株M15/rep4を形質転換する。M15/rep4は、lacIリプレッ
サーを発現し且つカナマイシン耐性(Kanr)を付与する、プラスミドpREP4の複数
のコピーを含んでいる。形質転換体をLBプレート上で増殖できる能力によって同
定し、アンピシリン／カナマイシン耐性のコロニーを選択する。プラスミドDNA
を単離し、Amp（100ug/ml）およびKan（25ug/ml）の両方を補ったLB培地中にお
ける液体培養中で、一晩(O/N)の制限分析によって確認する。O/N培養物を用
いて、大培養物を1:100から1:250の比で接種する。細胞を、0.4から0.6の間の吸
光度600（O.D.600）まで増殖させる。次いで、最終濃度が1mMになるようにIPTG
（「イソプロピル-B-D-チオガラクトピラノシド」）を添加する。IPTGは、lacI
リプレッサーを不活性化することによって誘導し、P/Oを鮮明にする(clear)こと
により遺伝子発現を増大する。細胞をさらに３〜４時間増殖させる。次いで細胞
を遠心分離で収穫する。細胞ペレットを、カオトロピズム(chaotroplc)剤である
6MグアニジンHCIに可溶化する。清澄の後、6-Hisタグを含有するタンパク質の緊
密な結合を可能にする条件下におけるニッケル−キレートカラムのクロマトグラ
フィーにより、この溶液から、可溶化されたMPIF-1を精製する。Hochuli，E.ら
、J.Chromatography 411:177-184(1984)。MPIF-1（95%純度）を6MグアニジンHCl
pH5.0中においてカラムから溶出させ、再生のために、3MグアニジンHCl，100mM
リン酸ナトリウム、10mMグルタチオン（還元）および2mMグルタチオン（酸化）
に調節する。この溶液中での12時間のインキュベーション後、タンパク質を10mM
リン酸ナトリウムに対して透析する。
あるいは、以下の非タグ化プライマーを用いて、遺伝子をプラスミドpQE70に
クローニングした。
E．coliに対して最適化されたMPIF-1の構築
E．coli発現系におけるMPIF-1の発現レベルを増大するため、よく用いられるE
.coliコドンに対して遺伝子のコドンを最適化した。MPIF-1の最適化領域の合成
のため、４個の一連のオリゴヌクレオチド、mpif-lオリゴ番号１〜４（後述）を
作成した。これらの重複するオリゴを、以下の条件での７回のPCR反応において
用いた：
変性 95℃ 20秒
アエール 58℃ 20秒
伸長 72℃ 60秒
７回の合成の後、この領域に対する5'プライマー（ACA TGC ATG CGU GUU ACCA
AA GAC GCU GAA ACC GAA UUC AUG AUG UCC（配列番号１６））およびこの領域全
体に対する3'プライマー（GCC CAA GCT TTC AGT TTT TAC GGG TTT TGA TAC GGG
（配列番号１７））を、６個のオリゴヌクレオチドの最初の反応からの１マイク
ロリットルを含むPCR反応物に加えた。この生成物を以下の条件を用いて３０回
増幅した：
変性 95℃ 20秒
アニール 55℃ 20秒
伸長 72℃ 60秒
この最後の反応で生成された生成物を、SphIおよびHindIIIによって制限し、
同様にSphIおよびHindIIIによって切断されたpQE70にクローニングした。これら
のクローンを発現させ、上述の変異がない、より優れた発現レベルを有すること
を見いだした。
mpifオリゴ番号１：
mpif-1オリゴ番号２：
mpif-1オリゴ番号３：
mpif-1オリゴ番号４：
MPIF-1欠失変異体の構築
上述のE．coli最適化MPIF-1構築物を用いて、MPIF-1遺伝子の5'末端から欠失
変異体を構築した。5'欠失物を構築するために用いたプライマーは後述する。E.
coli最適化MPIF-1構築物について上述したのと同様にPCR増幅を行った。Delta17
-A qe6、Delta23、Delta28についての生成物を、5'部位に対してはNcoIで制限し
、3'部位に対してはHindIIIで制限し、NcoIおよびHindIIIによって消化されたプ
ラスミドpQE60にクローニングした。その他の全ての生成物は、5'部位に対して
はSphIで制限し、3'部位に対してはHindIIIで制限し、SphIおよびHindIIIによっ
て消化されたプラスミドpQE70にクローニングした。
用いた5'プライマーは以下の通りである：
Delta 17-A qe6（pQE60）
5'NcoI gc gca g ccatgg aa aac ccg gtt ctg ctg gac3'（配列番号２２）
この欠失変異体の得られたアミノ酸配列：
Delta 16-A qe7（pQE70）
5'SphI gc cat g gcatgc tg gaa aac ccg gtt ctg ctg gac（配列番号２４）
この欠失変異体の得られたアミノ酸配列：
Delta 23（pQE60）
5'NcoI gc gca g ccatgg ac cgt ttc cac gct acc tcc（配列番号２６）
この欠失変異体の得られたアミノ酸配列：
Delta 24（pQE70）
5'SphI gcc atg gcatgc gtt tcc acg cta cct cc（配列番号２８）
この欠失変異体の得られたアミノ酸配列：
Delta 28（pQE60）
5'NcoI gcg cag ccatgg cta cct ccg ctg act gct gc（配列番号２９）
この欠失変異体の得られたアミノ酸配列：S70からA変異体（７０位のSerをAlaに変異した）（pQE70）
アンチセンスttc gaa gta ggc ttc cag cag（配列番号３１）
センスctg ctg gaa gcc tac ttc gaa（配列番号３２）
5'Sphiフルgcc atg gcatgc gtg tta cca aag acg ctg aaa cc（配列番号３３）
この欠失変異体の得られたアミノ酸配列：
全ての構築物に用いた3'プライマー：
3'HindIII
gcc c aagctt tca gt ttt tac ggg ttt tga tac ggg（配列番号３５）
MPIF-I配列の全長（E．coliに偏向したヌクレオチド由来）
実施例２
MIP-4の細菌発現および精製
MIP-4、ATCC#75675をコードするDNA配列をまず、プロセス後のMIP-4タンパク
質の5'配列（これからシグナルペプチド配列を除去したもの）に対応するPCRオ
リゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅した。BamHIおよびXbaIに対応する追
加的なヌクレオチドを5'側配列および3'側配列にそれぞれ追加した。5'オリゴヌ
クレオチドプライマーは、配列5'-TCAGGATCCTGTGCACAAGTTGGTACC-3'（配列番号
３６）を有しており、この配列は、BamHI制限酵素部位の後に、プロセスされた
タンパク質コドンの推定末端アミノ酸から始まるMIP-4コード配列の１８個のヌ
クレオチドを含む。3'側配列5'-CGCTCTAGAGTAAAACGACGGCCAGT-3'（配列番号１３
）は、XbaI部位に対する相補配列を含んでいる。
制限酵素部位は細菌発現ベクターpQE-9（Qiagen，Inc．Chatsworth、CA）上の
制限酵素部位に対応する。pQE-9は、抗生物質耐性(Ampr)、細菌の複製起点（o
ri）、IPTG-調節可能プロモーターオペレーター（P/O）、リボソーム結合部位（
RBS）、6-Hisタグおよび制限酵素部位をコードする。次いでpQE-9をBamHIおよび
XbaIで消化した。増幅した配列をpQE-9に連結し、ヒスチジンタグおよびRBSをコ
ードする配列をインフレームで挿入した。次いで連結混合物を用いて、Qiagenか
ら入手可能であるE．coli株M15/rep4を形質転換した。M15/rep4は、lacIリプレ
ッサーを発現し且つカナマイシン耐性(Kanr)を付与する、プラスミドpREP4の複
数のコピーを含んでいる。形質転換体をLBプレート上で増殖できる能力によって
同定し、アンピシリン／カナマイシン耐性のコロニーを選択した。プラスミドDN
Aを単離し、制限分析によって確認した。所望の構築物を含有するクローンを、A
mp（100ug/ml）およびKan（25ug/ml）の両方を補ったLB培地中における液体培養
中で一晩(O/N)増殖させた。O/N培養物を用いて、大培養物を1:100から1:250の比
で接種する。細胞を、0.4から0.6の間の吸光度600（O.D.600）まで増殖させた。
次いで、最終濃度が1mMになるようにIPTG（「イソプロピル-B-D-チオガラクトピ
ラノシド」）を添加した。IPTGは、lacIリプレッサーを不活性化することによっ
て誘導し、P/Oを鮮明にする(clear)ことにより遺伝子発現を増大する。細胞をさ
らに３〜４時間増殖させた。次いで細胞を遠心分離で収穫した。細胞ペレットを
、カオトロピズム(chaotropic)剤である6MグアニジンHClに可溶化した。清澄の
後、6-Hisタグを含有するタンパク質の緊密な結合を可能にする条件下における
ニッケル−キレートカラムのクロマトグラフィーにより、この溶液から、可溶化
されたMPIF-4を精製した。Hochuli，E.ら、J.Chromatography 411:177-184(1984
)。MIP-4（95%純度）を6MグアニジンHCl pH5.0中においてカラムから溶出させ、
再生のために、3MrグアニジンHCl、100mMリン酸ナトリウム、10mMグルタチオン
（還元）および2mMグルタチオン（酸化）に調節した。この溶液中での12時間の
インキュベーション後、タンパク質を10mMリン酸ナトリウムに対して透析した。
あるいは、以下の非タグ化プライマーを用いて、遺伝子をプラスミドpQE60に
クローニングした。
実施例３
M-CIFの細菌発現および精製
M-CIF、ATCC#75572をコードするDNA配列をまず、プロセス後のM-CIFタンパク
質の5'配列および3'配列（これからシグナルペプチド配列を除去したもの）に対
応するPCRオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅し、BamHIおよびXbaIに対
応する追加的なヌクレオチドを5'側配列および3'側配列にそれぞれ追加した。5'
オリゴヌクレオチドプライマーは、配列5'-GCCCGCGGATCCTCCTCACGGGGACCTTAC-3'
（配列番号３９）を有しており、この配列は、BamHI制限酵素部位の後に、プロ
セスされたタンパク質コドンの推定末端アミノ酸から始まるM-CIFコード配列の
１５個のヌクレオチドを含む。3'側配列5'-GCCTGCTCTAGATCAAAGCAGGGAAGCTCCAG-
3'（配列番号４０）は、XbaI部位、翻訳終止コドン、およびM-CIFコーディング
配列の最後の２０個のヌクレオチドに対する相補配列を含んでいる。
制限酵素部位は細菌発現ベクターpQE-9（Qiagen，Inc．9259 Eton Avenue，Ch
atsworth、CA，91311）上の制限酵素部位に対応する。pQE-9は、抗生物質耐性(A
mpr)、細菌の複製起点（ori）、IPTG-調節可能プロモーターオペレーター（P/O
）、リボソーム結合部位（RBS）、6-Hisタグおよび制限酵素部位をコードする。
次いでpQE-9をBamHIおよびXbaIで消化した。増幅した配列をpQE-9に連結し、ヒ
スチジンタグおよびRBSをコードする配列をインフレームで挿入した。図６にこ
の構成の概略図を示す。次いで連結混合物を用いて、QiagenからM15/rep4の商標
で入手可能であるE．coli株を形質転換した。M15/rep4は、lacIリプレッサーを
発現し且つカナマイシン耐性(Kanr)を付与する、プラスミドpREP4の複数のコピ
ーを含んでいる。形質転換体をLBプレート上で増殖できる能力によって同定し、
アンピシリン／カナマイシン耐性のコロニーを選択した。プラスミドDNAを単離
し、制限分析によって確認した。所望の構築物を含有するクローンを、Amp（100
ug/ml）およびKan（25ug/ml）の両方を補ったLB培地中における液体培養中で一
晩(O/N)増殖させた。O/N培養物を用いて、大培養物を1:100から1:250の比で接種
する。細胞を、0.4から0.6の間の吸光度600（O.D.600）まで増殖させた。次いで
、最終濃度が1mMになるようにIPTG（「イソプロピル-B-D-チオガラクトピラノシ
ド」）を添加した。IPTGは、lacIリプレッサーを不活性化することによって誘導
し、P/Oを鮮明にする(clear)ことにより遺伝子発現を増大する。細胞をさらに３
〜４時間増殖させた。次いで細胞を遠心分離で収穫した。細胞ペレットを、カオ
トロピズム(chaotropic)剤である6MolarグアニジンHClに可溶化した。清澄の後
、6-Hisタグを含有するタンパク質の緊密な結合を可能にする条件下におけるニ
ッケルーキレートカラムのクロマトグラフィーにより、この溶液から、可溶化さ
れたM-CIFを精製した。Hochuli，E.ら、J.Chromatography 411:177-184(1984)。
M-CIF（95%純度）を6MグアニジンHCl、pH5.0中においてカラムから溶出させ、再
生のために、３MグアニジンHCl、100mMリン酸ナトリウム、10mMグルタチオン（
還元）および2mMグルタチオン（酸化）に調節した。この溶液中での12時間のイ
ンキュベーション後、タンパク質を10mMリン酸ナトリウムに対して透析した。誘
導の後に14kDaに相当する新しいタンパク質の存在により、M-CIFの発現が示され
た（図７）。
もしくは、遺伝子をプラスミドpQE60に挿入するために以下の非標識プライマ
ーが用いられる。
実施例４
哺乳類細胞中のMPIF-1、M-CIFまたはMIP-4タンパク質遺伝子配列の一過性発現
に用いられるベクターのほとんどは、SV40複製起点を有するべきである。これに
より、ウイルスDNA合成の開始に必要なＴ抗原を発現する細胞（例えば、COS細胞
）中で複写数の多いベクターの複製が可能となる。この目的のためには他のいか
なる哺乳類細胞株でも利用し得る。
典型的な哺乳類発現ベクターは、mRNAの転写の開始を媒介するプロモータ要素
、タンパク質コード化配列、および転写物の転写の終了およびポリアデニル化に
必要なシグナルを含む。さらに含まれる要素としては、エンハンサ、Kozak配列
、およびRNAスライシングのためにドナー部位とアクセプタ部位とに挟まれた介
在配列がある。SV40からの初期および後期プロモータ、レトロウイルス、例えば
RSV、HTLVI、HIVIからの末端反復(LTR)、およびサイトメガロウイルス(CMV)の初
期プロモータにより、効率性の高い転写が実現され得る。しかし、細胞性シグナ
ルもまた用いられ得る（例えば、ヒトアタチンプロモータ）。本発明を実行する
場合に使用される適切な発現ベクターは、例えば、sPVLおよびpMSG（Pharmacia
，Uppsala，Sweden）、pRSV cat（ATCC 37152）、pSV2dhfr（ATCC 37146）、お
よびpBC12MI（ATCC 67109）のようなベクターが含まれる。使用され得る哺乳類
ホスト細胞としては、ヒトHeLa、283、H9およびJurkart細胞、マウスNIH3T3およ
びC127細胞、Cos 1、Cos 7およびCV1、アフリカミドリザル細胞、ウズラQC1-3細
胞、マウスＬ細胞、ならびにチャイニーズハムスター卵巣細胞が挙げられる。
もしくは、遺伝子は、染色体に組込まれたその遺伝子を含む安定細胞株中で発
現され得る。dhft、gpt、ネオマイシン、ハイグロマイシンのような選択可能マ
ーカーとの同時トランスフェクションにより、トランスフェクトされた細胞の同
定および単離が可能となる。
トランスフェクトされた遺伝子はまた、多量のコード化タンパク質を発現する
ように増幅され得る。目的の遺伝子の数百個または数千個もの複写を有する細胞
株を発現するためには、DHFR（ジヒドロフォレート還元酵素）が有用なマーカー
である。別の有用な選択マーカーとしては、酵素グルタミンシンターゼ(GS)があ
る（Murphyら、Biochem J.227:277-279(1991)：Bebbingtonら、Bio/Technology
10:169-175(1992)）。このようなマーカーを用いて、選択培地内で哺乳類細胞を
成長させ、最も高い耐性を有する細胞が選択される。これらの細胞株は、染色体
に組込まれた増幅遺伝子を含む。タンパク質の産生にはチャイニーズハムスター
卵巣(CHO)細胞が用いられることが多い。
発現ベクターpC1およびpC4は、ラウス肉腫ウイルスの強力プロモータ(LTR)(Cu
llenら、Molecular and Cellular Biology，438-447(March，1985))、およ
びCMVエンハンサーのフラグメント（Boshartら、Cell 41:521-530(1985)）を含
む。マルチクローニング部位は、例えば、制限酵素切断部位BamHI、XbaIおよびA
sp718と共に、目的の遺伝子のクローニングを容易にする。ベクターはさらに、3
'イントロン、ラットプレプロインスリン遺伝子のポリアデニル化および末端シ
グナルを含む。
Ａ．C0S細胞中の組換えMPIF-1の発現
プラスミドCMV-MPIF-1 HAの発現は、1)SV40複製起点、2)アンピシリン耐性遺
伝子、3)E.coli複製起点、4)CMVプロモータ、続いてポリリンカー領域、SV40イ
ントロン、およびポリアデニル化部位を含むベクターpcDNAI/Amp（インビトロゲ
ン）に由来する。MPIF-1前駆体全体およびその3'末端にインフレームで融合され
るHAタグをコードするDNAフラグメントが、ベクターのポリリンカー領域にクロ
ーン化される。従って、組換えタンパタ質発現は、CMVプロモータの下で行われ
る。HAタグは、上述のようにインフルエンザヘマグルチニンタンパク質由来のエ
ピトープに対応する（Wilson，H.ら、Cell 37:767(1991)）。HAタグのターゲッ
トタンパク質への侵入により、HAエピトープを認識する抗体による組換えタンパ
ク質の検出が容易となる。
プラスミドの構築ストラテジーについて以下に述べる。
MPIF-1をコードするDNA配列、ATCC#75676は、以下の２つのプライマーを用い
てクローンされるオリジナルEST上のPCRによって構築される。すなわち、5'プラ
イマー、5'-GGAAAGCTTATGAAGGTCTCCGTGGCT-3'(配列識別番号43)、HindIII部位お
よびこれに続く開始コドンから始まる18個のヌクレオチドのMPIF-1コード配列を
含む。および3'配列、5'-CGCTCTAGATCAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAATTCTTCCTG
GTCTTGATCC-3'(配列識別番号44)、XbaI部位、翻訳停止コドン、HAタグ、およびM
PIF-1コード化配列の最後の20個のヌクレオチド（停止コドンは含まない）の相
補配列を含む。従って、PCR産物は、HindIII部位、MPIF-Iコード化配列、これに
続くインフレームで融合されるHAタグ、HAタグの次の翻訳終了停止コドン、およ
びXbaI部位を含む。PCR増幅DNAフラグメントおよびベクターpcDNAI/Ampは、Hind
IIIおよびXbaI制限酵素により消化され連結される。連結混合物を、E.coli株SUR
E
(Stratagene Cloning Systems，11099 North Torrey Pines Road，La Jolla，C
Ａ92037から入手可能)に形質転換し、形質転換された培養物をアンピシリン培地
プレートで培養して、耐性コロニーを選択する。プラスミドDNAを形質転換体か
ら単離し、制限分析によって正しいフラグメントが存在するかどうかを調べる。
組換えMPIF-1の発現では、COS細胞がDEAE-DEXTRAN法（J．Sambrook，E．Fritsch
，T．Maniatis、Molecu1ar Cloning:A Laboratory Manual，Cold Spring Labora
tory Press(1989)）によって発現ベクターによりトランスフェクトされる。MPIF
-1-HAタンパク質の発現は、放射標識および免疫沈降法（E．Harlow，D．Lane、A
ntibodies:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1988)
）によって検出される。細胞を、トランスフェクションの２日後35S-システイン
により８時間標識化する。次に培養培地を回収して、細胞を界面活性剤（RIPA緩
衝液(150mMのNaCl、1％のNP-40、0.1％のSDS、1%のNP-40、0.5%のDOC、50mMのTr
is、pH7.5)(Wilson，Iら、上提、37:767(1984)）により溶解させる。細胞溶解物
および培養培地の両方が、HAに特異的なモノクローナル抗体により沈降する。沈
降したタンパク質を15%のSDS-PAGEゲルで分析する。
Ｂ．CHO細胞中のクローニングおよび発現
MPIF-1タンパク質の発現にはベクターpC1が用いられる。プラスミドpC1は、プ
ラスミドpSV2-dhfr（ATCC登録番号37146）の誘導体である。両方のプラスミドが
、SV40初期プロモータの制御下でマウスDHFR遺伝子を含む。これらのプラスミド
によりトランスフェクトされる、ジヒドロフォレート活性の無いチャイニーズハ
ムスター卵巣細胞または他の細胞が、化学療法剤メトトレキサートが補充された
選択培地（アルファマイナスMEN、Life Technologies）中で細胞を成長させるこ
とによって選択され得る。メトトレキサート(MTX)に耐性である細胞中のDHFR遺
伝子の増幅については十分に記述されている（例えば、Alt，F.W.、Kellems，R.
M.、Bertino，J.R.およびSchimke，R.T.、1978，J．Biol．Chem．253:1357-1370
：Hamlin，J.L.およびMa，C.、1990，Biochem．et Biophys.Acta，1097:107-143
：Page，M.J.およびSydenham，M.A.、1991，Biotechnology Vol．9:64-68参照）
。高濃度のMTX中で成長させた細胞は、DHFR遺伝子の増幅の結果としてターゲッ
ト
酵素DHFRを過剰産生することによって薬剤への耐性を生じさせる。第２の遺伝子
がDHFR遺伝子にリンクされる場合は、第２の遺伝子は通常は共増幅されて過剰発
現する。最先端技術では、1,000個を超える数の遺伝子複写を有する細胞株が生
成される。続いて、メトトレキサートを除去すると、細胞株は染色体に組込まれ
た増幅遺伝子を含む。
プラスミドpC1は、目的の遺伝子の発現のために、ラウス肉腫ウイルスの末端
反復(LTR)の強力プロモータ（Cullenら、Molecular and Cellular Biology，Mar
ch 1985:438-4470）、およびヒトサイトメガロウイルス(CMS)の直接初期遺伝子
のエンハンサーから単離されたフラグメント（Boshartら、Cell 41:521-530，19
85）を含む。プロモータの下流側は、続いて、遺伝子の統合を可能にする単一制
限酵素開裂部位BamHIであり、この後、3'イントロンおよびプレプロインスリン
遺伝子のポリアデニル化部位が続く。発現には他の効率性の高いプロモータ、例
えば、ヒトβアクチンプロモータ、SV40初期または後期プロモータ、または他の
レトロウイルス、例えばHIVおよびHTLVIからの長末端反復が用いられ得る。mRNA
のポリアデニル化には、例えばヒト成長ホルモンまたはグロビン遺伝子からの他
のシグナルも同様に用いられ得る。
染色体に組込まれた目的の遺伝子を有する安定細胞株はまた、gpt、G418また
はハイグロマイシンのような選択マーカーと同時トランスフェクトされると選択
され得る。最初に１つより多い選択マーカーを、例えばG418にメトトレキサート
をプラスして用いると有利である。
プラスミドpC1は、制限酵素BamHIにより消化され、次に当該分野では既知の手
順によって、子牛腸ホスフェートを用いて脱ホスホリル化する。次にベクターを
1%アガロースゲルから単離する。
MPIF-1、ATCC番号75676をコードするDNA配列は、遺伝子の5'および3'配列に対
応するPCRオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅される。
5'プライマーは、配列、
(配列識別番号45)を有し、これは、下線のBamHI制限酵素部位および図１のMPIF-
1タンパク質をコードする配列（配列識別番号３）の一部を含む。後述するよう
に、発現ベクターに挿入されると、ヒトMPIF-1をコードする増幅フラグメントの
5'末端は効率的なシグナルペプチドを提供する。Kozak，M.、J．Mol．Biol．196
:947-950(1987)に記載されているように、真核生物細胞内での翻訳開始のための
効率的なシグナルは、構築物のベクター部内に適切に位置している。
3'プライマーは配列、
(配列識別番号46)を有し、これは、Asp718制限部位、および、停止コドンを含む
、図１に示されているMPIF-1コード化配列に相補的なヌクレオチド部分を含む。
増幅フラグメントは、上述のように1%アガロースゲルから単離され、次にエン
ドヌタレアーゼBamHIおよびAsp718により消化され、そして1%アガロースゲル上
で再び精製される。
次に、単離されたフラグメントおよび脱リン酸化されたベクターはT4 DNAリガ
ーゼにより連結される。次にE.coll HB101細胞は形質転換され、制限酵素BamHI
を用いて正しい方位で挿入されたプラスミドpC1を含むバクテリアが同定される
。挿入された遺伝子の配列は、DNA配列化によって確認される。
CHO-DHFR細胞のトランスフェクション
トランスフェクションのために活性DHFR酵素の無いチャイニーズハムスター卵
巣細胞が用いられる。５μｇの発現プラスミドC1をリポフェクト法（Felgnerら
、上提）を用いて0.5μｇのプラスミドpSVneoにより同時トランスフェクトする
。プラスミドpSV2-neoは支配的な選択マーカー、G418を含む抗生物質群への耐性
を与える酵素をコードするTn5からの遺伝子neoを含む。細胞を、1mg/mlのG418に
より補充されるアルファマイナスMEN内に播種する。２日後、細胞をハイブリド
ーマクローニングプレート（Greiner，Germany）でトリプシン処理および播種し
、10〜14日間培養する。この期間後、単一クローンをトリプシン処理し、次に様
々な濃度のメトトレキサート（25nM、50nM、100nM、200nM、400nM）を用いて６
ウェルのペトリ皿内に播種する。次に最も高い濃度のメトトレキサートで成長す
るクローンを、もっと高い濃度のメトトレキサート（500nM、1μＭ、2μＭ、5
μＭ）を含む新しい６ウェルプレートに移す。クローンが100μＭの濃度で成長
するまで、同じ手順を繰り返す。
所望の遺伝子産物が発現したかどうかを、ウェスタンブロット分析およびSDS-
PAGEによって分析する。
実施例５
Ａ．COS細胞中の組換えMIP-4の発現
プラスミドCMV-MIP-4 HAの発現は、1)SV40複製起点、2)アンピシリン耐性遺伝
子、3)E.coli複製起点、4)CMVプロモータ、続いて、ポリリンカー領域、SV40イ
ントロン、およびポリアデニル化部位を含むベクターpcDNAI/Amp（インビトロゲ
ン）から引き出される。MPIF-4前駆体全体およびその3'末端にフレームで融合さ
れるHAタグをコードするDNAフラグメントは、ベクターのポリリンカー領域にク
ローンされる。従って、組換えタンパク質発現はCMVプロモータの下で行われる
。HAタグは、上述のようにインフルエンザヘマグルチニンタンパタ質由来のエピ
トープに対応する（Wilson，H.ら、Cell 37:767(1984)）。HAタグのターゲット
タンパク質への侵入により、HAエピトープを認識する抗体による組換えタンパク
質の検出が容易となる。
プラスミドの構築ストラテジーについて以下に述べる。
MPIF-4に対してコードするDNA配列ATCC#75675は、以下の２つのプライマーを
用いるPCRによって構築される。すなわち、5'プライマー、5'-GGAAAGCTTATGAAGG
GCCTTGCAGCTGCC-3'(配列識別番号47)、HindIII部位、およびこれに続く開始コド
ンから始まる20個のヌクレオチドのMPIF-4コード化配列を含む。および3'配列、
5'-CGCTCTAGATCAABCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAGGCATTCAGCTTCAGGTC-3'(配列識別
番号48)、XbaI部位、翻訳停止コドン、HAタグ、およびMPIF-4コード化配列の最
後の19個のヌクレオチド（停止コドンは含まない）の相補配列を含む。従って、
PCR産物は、HindIII部位、MIP-4コード化配列、これに続くインフレームで融合
されるHAタグ、HAタグの次の翻訳終了停止コドン、およびXbaI部位を含む。PCR
増幅DNAフラグメントおよびベクターpcDNAI/Ampを、HindIIIおよびXbaI制限酵素
により消化し連結する。連結混合物を、E.coli株SURE(Stratagene Cloning Syst
ems，La Jolla，CAから入手可能)に形質転換し、形質転換された培養物をアンピ
シリン培地プレートで培養して、耐性コロニーを選択する。プラスミドDNAを形
質転換体から単離し、制限分析によって正しいフラグメントが存在するかどうか
を調べる。組換えMPIF-4の発現では、COS細胞をDEAE-DEXTRAN法（J．Sambrook，
E．Fritsch，T．Maniatis、Molecular Cloning:A Laboratory Manual，Cold Spr
ing Laboratory Press(1989)）によって発現ベクターによりトランスフェクトす
る。MPIF-4-HAタンパク質の発現は、放射性同位元素標識および免疫沈降法（E．
Harlow，D．Lane、Antibodies:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Labo
ratoryPress(1988)）によって検出する。細胞を、35S-システイン２日後トラン
スフェクションにより８時間標識化する。次に培養培地を回収して、細胞を界面
活性剤（RIPA緩衝液(150mMのNaCl、1%のNP-40、0.1%のSDS、1%のNP-40、0.5%のD
OC、50nMのTris、pH7.5)(Wilson，Hら、Cell，37:767(1984)）により溶解させる
。細胞溶解物および培養培地の両方が、HAに特異的なモノクローナル抗体により
沈降する。沈降したタンパタ質を15%のSDS-PAGEゲルで分析する。
Ｂ．CHO細胞中のクローニングおよび発現
MIP-4タンパク質の発現にはベクターpC1が用いられる。プラスミドpC1は、プ
ラスミドpSV2-dhfr（ATCC登録番号37146）の誘導体である。両方のプラスミドが
、SV40初期プロモータの制御下でマウスDHFR遺伝子を含む。これらのプラスミド
によりトランスフェクトされる、ジヒドロフォレート活性の無いチャイニーズハ
ムスター卵巣細胞または他の細胞が、化学療法剤メトトレキサートにより補充さ
れた選択培地（アルファマイナスMEN、Life Technologles）中で細胞を成長させ
ることによって選択され得る。メトトレキサート(MTX)に耐性である細胞中のDHF
R遺伝子の増幅については十分に記述されている（例えば、Alt，F.W.、Kellems
，R.M.、Bertino，J.R.およびSchimke，R.T.、1978，J．Biol．Chem．253:1357-
1370:Hamlin，J.L.およびMa，C.、1990，Biochem．et Biophys．Acta，1097:107
-143:Page，M.J.およびSydenham，M.A.、1991，Biotechnology Vol．9:64-68参
照）。高濃度のMTX中で成長させた細胞は、DHFR遺伝子の増幅の結果としてター
ゲット酵素DHFRを過剰産生することによって薬剤への耐性を生じる。第２の遺伝
子がDHFR遺伝子に連結される場合は、第２の遺伝子は通常は共増幅されて過剰発
現する。最先端技術では、1,000個を超える数の遺伝子複写を有する細胞株が生
成される。続いて、メトトレキサートを除去すると、細胞株は染色体に組込まれ
た増幅遺伝子を含む。
プラスミドpC1は、目的の遺伝子の発現のために、Rouse Sarcoma Virusの長末
端反復(LTR)の強力なプロモーター(Cullen，et al.，Molecular and Cellular B
iology，March 1985:438-4470)と、ヒトサイトメガロウイルス(CMV)の即時初期
遺伝子のエンハンサーから単離された断片(Boshart et al.，Cell 41:521-530，
1985))とを含有する。このプロモーターの下流は、遺伝子の組み込みを可能にす
る以下の単一制限酵素切断部位である：BamHI、これに続く３’イントロンおよ
びネズミプレプロインシュリン遺伝子のポリアデニル化部位。他の高効率プロモ
ーター、例えば、ヒトβアクチンプロモーター、SV40初期または後期プロモータ
ー、または他のレトロウィルス（例えば、HIVおよびHTLVI）からの長末端反復を
上記発現に用いることも可能である。mRNAのポリアデニル化のために、他のシグ
ナル、例えば、ヒト成長ホルモンまたはグロビン遺伝子からのシグナルも用いる
ことができる。
染色体に組み込まれる目的の遺伝子を有する安定な細胞株は、gpt、G418また
はハイグロマイシンのような選択マーカーを用いた同時トランスフェクション時
に選択することもできる。初めに１つより多くの選択マーカー、例えば、G418お
よびメトトレキセートを使用するのが有利である。
当該分野において公知の手順によって、プラスミドpC1を制限酵素BamHIで消化
し、次いで、子牛腸ホスフェート(calf intestinal phosphates)を用いて脱リン
酸化する。次いで、そのベクターを１％アガロースゲルから単離する。
MIP-4、ATCC番号75675をコードするDNA配列を、その遺伝子の５’および３’
配列に対応するPCRオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅する。
５’プライマーは、以下の配列
（配列番号４９）を有する。この配列は、下線を付したBamHI制限酵素部位と、
図３のMIP-4タンパク質をコードする配列（配列番号５）の一部とを含む。下記
のように発現ベクターに挿入すると、ヒトMIP-4をコードする増幅した断片の５
’末端は、効率的なシグナルペプチドを提供する。Kozak，M.，J．Mol．Biol．1
96:947-950(1987)に記載のような真核生物細胞内での翻訳を開始するための効率
的なシグナルは、この構築物のベクター部分に適切に位置する。
３’プライマーは、以下の配列
（配列番号５０）を有する。この配列は、Asp718制限部位を含み、その後には、
ストップコドンを含む図３に示したMIP-4コード配列（配列番号５）の一部に相
補的なヌクレオチドが続く。
増幅した断片を上記のように１％アガロースゲルから単離し、次いで、エンド
ヌクレアーゼBamHIおよびAsp718で消化し、次いで、１％アガロースゲル上で再
び精製する。
次いで、単離した断片および脱リン酸化したベクターを、T4 DNAリガーゼでラ
イゲーションする。次いで、E．Coli HB101細胞を形質転換し、制限酵素BamHIを
用いて正しい方向に挿入したプラスミドpC1を含むバクテリアを同定する。挿入
した遺伝子の配列を、DNA配列決定によって確認する。
ＣＨＯ−ＤＨＦＲ細胞のトランスフェクション
活性ＤＨＦＲ酵素を欠損するチャイニーズハムスター卵巣細胞をトランスフェ
クションのために使用する。５μｇの発現プラスミドＣ１を、リポフェクト方法
（Felgnerら、上記）を使用して、0.5μｇのプラスミドｐＳＶｎｅｏと共に同時
トランスフェクトする。プラスミドｐＳＶ２-ｎｅｏは、優性選択マーカーを含
み、このマーカーは、Ｇ４１８を含む抗生物質の群に対する耐性を与える酵素を
コードする、Ｔｎ５からのｎｅｏ遺伝子である。細胞を、1mg/mlのＧ４１８を補
充したαマイナスＭＥＭ中に播種する。２日後、細胞を、トリプシン処理し、そ
してハイブリドーマクローニングプレート（Greiner，Germany）中に播種し、そ
し
て10日から14日培養する。この期間の後、単一のクローンを、トリプシン処理し
、次いで異なる濃度のメトトレキセート（25nM，50nM，100nM，200nM，および40
0nM）を使用して６ウェルペトリ皿中に播種した。次いで、最高濃度のメトトレ
キセートで増殖するクローンを、より高濃度のメトトレキセート（500nM，1μＭ
，2μＭ，および5μＭ）を含む新しい６ウェルプレートに移した。同じ手順をク
ローンが100μＭの濃度で増殖するまで繰り返した。
所望の遺伝子産生物の発現を、ウエスタンブロット分析およびＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅによって分析した。
実施例６
Ａ．ＣＯＳ細胞中の組換えＭ−ＣＩＦの発現
プラスミドＣＭＶ−Ｍ−ＣＩＦ ＨＡの発現は、１）ＳＶ４０の複製起点、２
）アンピシリン耐性遺伝子、３）E.coli複製起点、ならびに４）ＣＭＶプロモー
ター、続いてポリリンカー領域、ＳＶ４０のイントロン、およびポリアデニル化
部位、を含むベクター（すなわち、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（Invitrogen））から
得る。Ｍ−ＣＩＦ前駆体の全体およびその３’末端ヘインフレームで融合される
ＨＡタグをコードするＤＮＡフラグメントは、ベクターのポリリンカー領域へク
ローン化し、したがって、組換えタンパク質発現は、ＣＭＶプロモーター下で指
向される。ＨＡタグは、以前に記載されるような（Wilson，H.ら、Cell 37:767(
1984)）インフルエンザ血球凝集素タンパク質から得られたエピトープに対応す
る。本発明者らの標的タンパク質へのＨＡタグの融合は、ＨＡエピトープを認識
する抗体を用いた組換えタンパク質の簡易な検出を可能にする。
プラスミド構築ストラテジーを、以下のように記述する：
Ｍ−ＣＩＦをコードするＤＮＡ配列（すなわち、ＡＴＣＣ＃７５５７２）は、２
つのプライマー（すなわち、開始コドンから始まる20ヌクレオチドのＭ−ＣＩＦ
コード配列が後に続くＨｉｎｄＩＩＩ部位を含む５’プライマー５’-GGAAAGCTT
ATGAAGATTCCGTGGCTGC-３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：51）およびＸｂａＩ部位に対す
る相補配列、翻訳停止コドン、ＨＡタグ、およびＭ−ＣＩＦコード配列の最後の
19ヌクレオチド（停止コドンを含まない）を含む３’配列５’-CGCTCTAGATCAA
GCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAGTTCTCCTTCATGTCCTTG-3’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：5
2）を使用するＰＣＲによって構築した。したがって、ＰＣＲ産生物は、Ｈｉｎ
ｄＩＩＩ部位、Ｍ−ＣＩＦコード配列、続いてインフレームで融合されたＨＡタ
グ、ＨＡタグの隣の翻訳終結停止コドン、およびＸｂａＩ部位を含む。ＰＣＲ増
幅されたＤＮＡフラグメントおよびベクター（すなわち、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ
）は、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩの制限酵素で消化し、そして連結させる。
連結混合物は、E.coli株ＳＵＲＥ（Stratagene Cloning Systems，La Jolla，CA
）へ形質転換し、形質転換された培地は、アンピシリン培地プレート上にプレー
トし、そして耐性クローンを選択した。プラスミドＤＮＡを、形質転換体から単
離し、制限分析によって正しいフラグメントが存在するかどうかを検査した。組
換えＭ−ＣＩＦの発現について、ＣＯＳ細胞を、ＤＥＡＥ−ＤＥＸＴＲＡＮ法（
J．Sambrook，E．Fritsch，およびT．Maniatis，Molecular Cloning:A Laborato
ry Manual，Cold Spring Laboratory Press，(1989)）によって発現ベクターで
トランスフェクトした。Ｍ−ＣＩＦ−ＨＡタンパク質の発現を、放射標識化およ
び免疫沈殿法（E．HarlowおよびD．Lane，Antibodies:A Laboratory Manual，Co
ld Spring Harbor Laboratory Press，(1988)）によって検出した。細胞を、ト
ランスフェクション後２日目に35Ｓ−システィンで８時間、標識した。次に培養
培地を回収し、細胞を界面活性剤（RIPA緩衝液（150mM ＮａＣｌ、１％ＮＰ−４
０、0.1％ＳＤＳ、１％ＮＰ−４０、0.5％ＤＯＣ、50mM Ｔｒｉｓ．pH7.5））で
溶解した。（Wilson，H.ら、Cell 37:767(1984)）。細胞溶解産物および培養液
の両方を、ＨＡ特異的モノクローナル抗体で沈殿させた。沈殿したタンパク質は
、15％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分析した。
Ｂ．ＣＨＯ細胞におけるクローニングおよび発現
Ｍ−ＣＩＦタンパク質の発現のためにベクターｐＣ１を用いる。プラスミドｐ
Ｃ１は、プラスミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ受託番号第３７１４６号）の
誘導体である。プラスミドの両方は、ＳＶ４０の初期プロモーターの制御下にあ
るマウスのＤＨＦＲ遺伝子を含む。これらのプラスミドでトランフェクトされる
ジヒドロ葉酸活性が欠乏するチャイニーズハムスターの卵巣または他の細胞は、
化学療法薬剤メトトレキセートで増補される選択培地（alpha minus MEM，Life
Technologies)において細胞を増殖させることによって選択され得る。メトトレ
キセート（ＭＴＸ）に耐性である細胞におけるＤＨＦＲ遺伝子の増幅は、文献に
多くの記載がある（例えば、Alt，F.W.，Kellems，R.M.，Bertino，J.R.，and S
chimke，R.T.，1978，J．Biol．Chem．253:1357-1370，Hamlin，J.L．and Ma，C
．1990，Biochem．et Biophys．Acta，1097:107-143，Page，M.J．and Sydenham
，M.A．1991，Biotechnology Vol．9:64-68を参照）。ＭＴＸの漸増濃度で増殖
される細胞は、ＤＨＦＲ遺伝子の増幅の結果、標的酵素ＤＨＦＲを過剰産生する
ことによって薬物への耐性を発達させる。第２の遺伝子がＤＨＦＲ遺伝子に連鎖
される場合、それは通常、同時増幅および過剰発現される。遺伝子の１０００を
上回るコピーを運ぶ細胞株を発生することが現状技術である。続いて、メトトレ
キセートが回収される際、細胞株は染色体に組み込まれた増幅遺伝子を含む。
プラスミドｐＣ１は、目的の遺伝子の発現に対してRouse Sarcoma Virusの長
末端反復配列（ＬＴＲ）の強力なプロモーター（Cullen，et al.，Molecular an
d Cellular Biology，March 1985:438-4470)および、ヒトのサイトメガロウイル
ス（ＣＭＶ）の即時初期遺伝子のエンハンサーから隔離されたフラグメント(Bos
hart et al.，Cell 41:521-530，1985)を含む。プロモーターの下流は、遺伝子
の組込みを可能にする以下の単一の制限酵素切断部位である：ＢａｍＨＩ、続い
て、３’イントロンおよびラットのプレプロインスリン遺伝子のポリアデニル化
部位。他の高い効率のプロモーターも発現のために用いられ得る。それらは、例
えば、ヒトのβアクチンプロモーター、ＳＶ４０の初期または後期プロモーター
、または、例えば、ＨＩＶおよびＨＴＬＶＩなど他のレトロウイルスからの長末
端反復配列である。ｍＲＮＡのポリアデニル化に対して、例えば、ヒト成長ホル
モンまたはグロビン遺伝子からの他のシグナルも使用され得る。
染色体に組み込まれた目的の遺伝子を運ぶ安定な細胞株は、ｇｐｔ、Ｇ４１８
またはハイグロマイシンなど選択マーカーを用いた同時トランスフェクションの
際に選択され得る。初めに、例えば、Ｇ４１８およびメトトレキセートなどの１
つ以上の選択マーカーを用いると有利である。
プラスミドｐＣｌは、制限酵素ＢａｍＨＩによって消化され、次いで、当該分
野で公知の手順で仔ウシ腸リン酸塩を用いて脱リン酸される。次いで、ベクター
は、１％のアガロースゲルから単離される。
Ｍ−ＣＩＦ、ＡＴＣＣ第７５５７２号をコードするＤＮＡ配列は、遺伝子の５
’および３’配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅
される。
５’プライマーは、配列:
（配列識別番号:53）を有し、この配列は、下線のＢａｍＨＩ制限酵素部位およ
び図２のＭ−ＣＩＦの配列(配列識別番号:1)を含む。以下に説明するように、発
現ベクターに挿入されると、ヒトのＭ−ＣＩＦをコードする増幅フラグメントの
５’末端は、効率的なシグナルペプチドを提供する。Kozak，M.，J．Mol．Biol
．196:947-950(1987)に記載のような真核生物細胞における翻訳の開始のための
効率的なシグナルは、構築物のベクター部分に適切に配置される。
３’プライマーは、配列:
(配列識別番号:54)を有し、この配列は、Ａｓｐ７１８制限部位および、終止コ
ドンを含む図２で示すＭ−ＣＩＦコード配列の部分(配列識別番号:1)を含む。
増幅フラグメントは、上述のように１％のアガロースゲルから隔離され、エン
ドヌクレアーゼＢａｍＨＩおよびＡｓｐ７１８で消化され、次いで、再び１％の
アガロースゲルで精製される。
単離されたフラグメントおよび脱リン酸されたベクターは、Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼで結合される。次いで、Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１細胞を形質転換し、制限酵素
ＢａｍＨＩを用いて正確な方向に挿入されたプラスミドｐＣ１を含むバクテリア
が同定される。挿入された遺伝子の配列は、ＤＮＡ配列決定により確認される。
CHO-DHFR細胞のトランスフェクション
トランスフェクションには活性DHFR酵素を欠損するチャイニーズハムスター卵
巣細胞が用いられる。リポフェクト法（Felgnerら、上提）を用いて５μｍの発
現プラスミドC1を0.5μｇのプラスミドpSVneoと同時トランスフェクトする。プ
ラス
ミドpSV2-neoは、優性選択マーカー、G418を含む抗生物質群への耐性を与える酵
素をコードするTn5からの遺伝子neoを含む。細胞を、1mg/mlのG418により補充し
たアルファマイナスMEN内に播種する。２日後、細胞をハイブリドーマクローニ
ングプレート(Greiner，Germany)でトリプシン処理および播種し、10〜14日間培
養する。この期間後、単一クローンをトリプシン処理し、次に様々な濃度のメト
トレキセート（25nM、50nM、100nM、200nM、400nM）を用いて６ウェルのペトリ
皿内で播種する。次に最も高い濃度のメトトレキサートで増殖するクローンを、
もっと高い濃度のメトトレキセート（500nM、1μＭ、2μＭ、5μＭ)を含む新し
い６ウェルプレートに移す。クローンが100μＭの濃度で増殖するまで、同じ手
順を繰り返す。
所望の遺伝子産物が発現したかどうかを、ウェスタンブロット分析およびSDS-
PAGEによって分析する。
実施例７
ヒト組織中のM-CIFの発現パターン
ヒト組織中のM-CIFの発現レベルを調べるためにノーザンブロット分析を実行
した。全細胞RNAサンプルをRNAzolTMＢシステム（Biotex Laboratories，Inc.，
Houston，TX）により単離した。特定された各ヒト組織から単離された全RNAの約
10μｇを、1%アガロースゲルで分離して、ナイロンフィルター（Sambrook、Frit
schおよびManiatis、Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring H
arbor Press，(1989)）上にブロットした。50ngのDNAフラグメントを用いてStra
tagene Prime-Itキットに従って標識反応を行った。標識されたDNAをSelect-G-5
0カラム（5 Prime-3 Prime，Inc.，Boulder，CO）で精製した。次にフィルター
を、0.5MのNaPO4、pH7.4および7%のSDS中に1,000,000cpm/mlの放射能標識された
全長M-CIF遺伝子により、65℃で一夜ハイブリダイズした。0.5×SSC、0.1%のSDS
で室温で２度および60℃で二度洗浄した後、フィルターを増強スクリーンを用い
て-70℃で一夜露出した。
実施例８
ヒト組織中のMPIF-1の発現パターン
ヒト組織中のMPIF-1の発現レベルを調べるためにノーザンブロット分析を実行
した。全細胞RNAサンプルをRNAzolTMＢシステム（Biotex Laboratories，Inc.，
6023 South Loop East，Houston，TX 77033）により単離した。特定された各ヒ
ト組織から単離された全RNAの約10μｇを、1%アガロースゲルで分離して、ナイ
ロンフィルター（Sambrook、FritschおよびManiatis、Molecular Cloning,Cold
Spring Harbor Press，(1989)）上にブロットした。50ngのDNAフラグメントを用
いてStratagene Prime-Itキットに従って標識反応を行った。標識されたDNAをSe
lect-G-50カラム（5 Prime-3Prime，Inc.，5603 Arapahoe Road，Boulder，CO 8
0303）で精製した。次にフィルターを、0.5MのNaPO4、pH7.4および7%のSDS中に1
,000,000cpm/mlの放射性同位元素標識された全長MPIF-1遺伝子により、65℃で一
夜ハイブリダイズする。0.5×SSC、0.1%のSDSで室温で２度および60℃で二度洗
浄した後、フィルターを増感スタリーンを用いて-70℃で一夜曝露した。
実施例９
ヒト細胞中におけるMIP-4の発現パターン
ノーザンブロット分析を行い、ヒト細胞中におけるMIP-4の発現レベルを調べ
た。全細胞RNAサンプルは、RNAzoITMBシステム（Biotecx Laboratories，Inc．6
023 South Loop East，Houston，TX 77033）を用いて単離された。特定された各
ヒト組織から単離された全RNAの約10ugを、1%アガロースゲル上で分離し、ナイ
ロンフィルタ上にブロットを行った（Sambrook、Fritsch、およびManiatis、Mol
ecular Cloning、Cold Spring Harbor Press(1989)）。標識反応を、Stratagene
Prime-Itキットに従って、50ng DNA断片を用いて行った。標識DNAをSelect-G-50
カラムを用いて精製した（5 Prime-3 Prime，Inc．5603 Arapahoe Road，Boulde
r，CO 80303）。次にフィルターを、放射能標識された全長MIP-4遺伝子で0.5M N
aPO4、pH7.4および7%SDS中1,000,000cpm/mlで用い、65℃で一晩ハイブリダイズ
した。0.5×SSC、0.1%SDSを用いて室温で２回、60℃にて２回洗浄した後、フィ
ルターを増感スクリーンを用いて-70℃で一晩曝露した。図６を参照せよ。
実施例１０
バキュロウイルス発現系を用いたケモカインMPIF-の発現および精製
SF9細胞を、MPIF-1 cDNAを発現するように設計された組換えバキュロウィルス
によって感染させた。細胞をMOI２で感染させ、28℃にて72〜96時間培養した。
感染培養物由来の細胞残滓を、低速遠心分離により除去した。最終濃度が20μｇ
/ml Pefabloc SC、1μｇ/mlロイペプチン、1μｇ/ml E-64および1mM EDTAになる
ように、上清にプロテアーゼインヒビターカクテルを加えた。15%SDS-PAGEゲル
に上清の20〜30μｌをロードすることにより、上清中におけるMPIF-1のレベルを
モニターした。MPIF-1は、数mg/リットルの発現レベルに対応して9Kd可視バンド
として検出された。３段階精製手順によりMPIF-1をさらに精製した：ヘパリン結
合性クロマトグラフィー。バキュロウィルス培養物の上清を、100mM HEPES/MES/
NaOAc pH6を含有する緩衝液の1/3容量と混合し、0.22μｍ膜を介して濾過した。
次に、サンプルをヘパリン結合カラム（HEl poros 20、Bi-Perceptive System I
nc.）にかけた。pH6の50mM HEPES/MES/NaOAc中50〜500mM NaClの直線勾配で、MP
IF-1を約300mM NaClにて溶出した；カチオン交換クロマトグラフィー。ヘパリン
クロマトグラフィーから得られたMPIF-1に富む画分を、50mM HEPES/MES/NaOAc p
H6を含有する緩衝液を用いて５倍に希釈した。次に、得られた混合物をカチオン
交換カラム(S/M poros 20、Bio-Perceptive Systems Inc.)にかけた。pH6の50mM
HEPES/MES/NaOAc中25〜300mM NaClの直線勾配で、MPIF-1を約250mM NaClにて溶
出した；サイズ排除クロマトグラフィー。カチオン交換クロマトグラフィーに続
いて、MPIF-1をサイズ排除クロマトグラフィーカラム（HW50、TOSO HAAS、1.4×
45cm）にかけることによりさらに精製した。MPIF-lは、タンパク質のダイマー形
態に対応し、13.7Kd分子量標準(RNaseA)に近い位置で分画した。
上述の３段階精製の後、得られたMPIF-1は、SDA-PAGEゲル（図９Ａ〜９Ｂ）の
クマシーブルー(commassie blue)染色から、90%より純粋であることが判定され
た。
また、精製されたMPIF-1をエンドトキシン／LPS汚染について試験した。LPS含
量は、LALアッセイ（Bio Whittaker）に基づき0.1ng/ml未満であった。
実施例１１
新しく単離された骨髄細胞のM-CSFおよびSCF-刺激性コロニー形成に対する、バ
キュロウィルス発現M-CIFおよびMPIF-Iの効果
マウス骨髄細胞の低密度集合を、プロセス化組織培養皿中で、３７℃にて１時
間インキュベートすることにより、単球、マクロファージおよびその他のプラス
チック表面に付着する細胞を除去した。次に、細胞の非付着集団を、図１４に示
す因子の存在下あるいは不在下で、増殖培地を含む寒天にプレートした（10,000
細胞／皿）。培養物を３７℃にて10日間インキュベートし（88%N2、５%CO2、お
よび７%O2）、反転顕微鏡下においてコロニーのスコアを付けた。データは、コ
ロニーの平均数として表しており、３連で行われたアッセイから得られたもので
ある。
実施例１２
骨髄細胞のｌｉｎ集団のＩＬ−３およびＳＣＦ刺激増殖および分化に対するＭＰ
ＩＦ−１およびＭ−ＣＩＦの効果
初期の造血前駆体を富化したマウスの骨髄細胞の集団を、陰性選択手順を用い
て得た。ここで、系統の大多数の拘束細胞は、モノクローナルの抗体（抗ｃｄｌ
ｌｂ，ＣＤ４，ＣＤ８，ＣＤ４５ＲおよびＧｒ−１抗原）のパネルおよび磁気ビ
ーズを用いて除去された。得られた細胞（系統枯渇細胞）の集合は、ＩＬ−３(
５ng/ml)および幹細胞因子（ＳＣＦ）(100ng/ml)を補充した増殖培地において、
指定されたケモカイン(50ng/ml)が存在する、または存在しない状態でプレート
した(５×１０4細胞/ml)。加湿インキュベータ（5%のCO2，7%のO2,および88%のN2
の環境）において、３７℃で７日間インキュベートした後、ＨＰＰ−ＣＦＣに
ついてアッセイしそして未成熟前駆体に細胞が収集およびアッセイされた。さら
に、細胞を、特定の分化抗原の発現に対してＦＡＣＳｃａｎによって分析した。
コロニーデータは、コロニーの平均数＋／−ＳＤ）として表現され、
細胞の各集団に対して６つのシャーレにおいて実施したアッセイから得た（図１
５）。
実施例１３
ＭＰＩＦ−１はＩＬ−３，Ｍ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦに応答してコロニー形
成を阻害する
マウスの骨髄細胞を、大腿骨および脛骨の両方から流し、フィコール密度勾配
およびプラスチック接着によって除去された単球上で分離された。得られた細胞
の集合は、ＩＬ−３(5Hg/ml)、ＧＭ−ＣＳＦ(5ng/ml)、Ｍ−ＣＳＦ（10ng/ml)、
およびＧ−ＣＳＦ(10ng/ml)を補充したＭＥＭベースの培地で一晩インキュベー
トされた。これらの細胞は、ＩＬ−３(5ng/ml)、ＧＭ−ＣＳＦ（5ng/ml)、Ｍ−
ＣＳＦ(5ng/ml)の存在下で、50ng/mlのＧ−ＣＳＦ１を用いるか、または用いな
い状熊で、寒天ベースのコロニー形成アッセイにおいて１つのシャーレにつき１
０００細胞ずつプレートした。データは、特定の因子のみで形成されるコロニー
の数の割合として、コロニー形成の際に与えられる。２つの実験が、各実験に対
する標準偏差を示すエラーバーと共に複数シャーレの平均として示されたデータ
として示される（図１７）。
実施例１４
遺伝子治療を介する発現
線維芽細胞を皮膚生検によって被検体から得る。得られた組織を組織培養培地
に置き、そして小片に分離される。組織の小片を、組織培養フラスコの湿った表
面上に置く。各フラスコには約１０片を置く。フラスコと、逆さまにし、密閉そ
して室温で一晩放置する。室温での２４時間後、フラスコを逆さにし、そして組
織の塊がフラスコの底に固定されている状態で新鮮な培地（例えば、１０％のＦ
ＢＳ、ペニシリン、およびストレプトマイシンを有するHamのＦ１２培地）を加
える。次いで、これを、約１週間３７℃でインキュベートする。この時、新鮮な
培地を加え、数日おきに取り替える。さらに２週間の培養後、線維芽細胞の単層
が出現する。単層を、トリプシン処理し、大きなフラスコにスケールアップする
。
モロニーマウス肉肺ウイルスの末端反復配列隣接するｐＭＶ−７（Kirshmeier
，P.T.ら，DNA 7:219-25(1988)を、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、
続いて、仔ウシの腸管ホスファターゼによって処置される。線状ベクターをアガ
ロースゲル上で分画し、そしてガラスビーズを用いて精製する。
本発明のポリペプチドをコードするｃＤＮＡは、５’および３’末端配列にそ
れぞれ対応するＰＣＲプライマーを用いて増幅される。５’プライマーはＥｃｏ
ＲＩ部位を含み、３’プライマーは、ＨｉｎｄＩＩＩ部位を含む。同量のモロニ
ーマウス肉腫ウイルスの線状骨格およびＥｃｏＲＩならびにＨｉｎｄＩＩＩ断片
がＴ４ＤＮＡリガーゼの存在下で加えられる。得られた混合物は、２つの断片の
連結に対して適切な条件下で維持される。連結混合物は細菌Ｂ１０１の形質転換
に用いられる。次いで、これらは、ベクターが対象の遺伝子を適切に挿入された
ことを確認する目的で寒天を含むカナマイシンのプレートにする。
両種向性なｐＡ３１７またはＧＰ＋ａｍｌ２のパッケージング細胞を組織培養
中で、１０％の仔ウシ血清（ＣＳ）、ペニシリン、およびストレプトマイシンを
有するDulbeccolのModified Eagles Medium(DMEM)中でコンフルエントな密度ま
で増殖させる。次いで、遺伝子を有するＭＳＶベクターを培地に加え、パッケー
ジング細胞をベクターによって形質転換する。パッケージング細胞は、遺伝子を
含む感染性のウイルス粒子を生成する（よって、パッケージング細胞はプロデュ
ーサー細胞と呼ばれる）。
新鮮な培地を形成転換プロデューサー細胞に加え、続いて、培地をコンフルエ
ントなプロデューサー細胞の１０ｃｍのプレートから採集する。感染性ウイルス
粒子を含む使用済み培地を、ミリポアフィルターを通して剥離し、剥離したプロ
デューサー細胞を除去し、次いでこの培地を使用して線維芽細胞を感染させる。
培地を、線維芽細胞のサブコンフルエントプレートから除去し、プロデューサー
細胞からの培地で迅速に置換する。この培地を除去し、新鮮な培地で置換する。
ウイルスのカ価が高い場合、実質的に全ての線維芽線維が感染され、選択の必要
はない。カ価が非常に低い場合、neoまたはhisなどの選択可能なマーカーを有す
るレトロウイルスのベクターを用いる必要がある。
次いで、操作された加工線維芽細胞を、cytodex３のマイクロキャリアビーズ
上でコンフルーエンスまで増殖した後、または単独のいずれかで宿主に注入する
。
よって、線維芽細胞はタンパク質産物を産生する。
実施例１５
インビトロ骨髄保護
上記に示したように、ＭＰＩＦ−１は、低増殖性能力コロニー形成細胞（Low
Proliferative Potential Colony-Forming Cell（ＬＰＰ−ＣＦＣ）の強力なイ
ンヒビターである。低増殖性能力コロニー形成細胞は、顆粒球および単球系統を
生じる骨髄前駆体である。ＭＰＩＦ−１が細胞周期作用性化学療法薬物の細胞傷
毒性からＬＰＰ−ＣＦＣの保護を提供することを実証するために、細胞の系統枯
渇集合（Ｌｉｎ−細胞）をマウスの骨髄から単離し、ＭＰＩＦ−１を有するか、
または有さない状態の複数のサイトカインの存在下でインキュベートした。４８
時間後、５−Ｆｕおよびインキュベーションを受けた各培養の１組は、次いでさ
らに２４時間継続され、その時点でクローン原生アッセイによって残存ＬＰＰ−
ＣＦＣの数が決定される。図２１Ａに示すように、ＬＰＰ−ＣＦＣの約４０％ま
でがＭＰＩＦ−１の存在下で５−Ｆｕに誘発された細胞傷毒性から保護された。
それに対して、ＭＰＩＦ−１が存在しない状態、または無関係なタンパク質が存
在するでは、ＬＰＰ−ＣＦＣに対する保護がほとんど（＜５％）観察されなかっ
た。高増殖性能力コロニー形成細胞（ＨＰＰ−ＣＦＣ）は、同一の培養条件下で
はＭＰＩＦ−１によって保護されず、ＭＰＩＦ−１の保護効果の特異性を実証し
た。
５−Ｆｕの代わりに、化学治療薬剤Ａｒａ−Ｃを用いて同様の実験を実施した
。図２１Ｂに示すように、野生型ＭＰＩＦ−１および変異体ＭＰＩＦ−１（すな
わち、変異体−１、この変異体の説明は以下の実施例１７を参照）の両方からＬ
ＰＰ−ＣＦＣの劇的な保護が得られた。よって、ＭＰＩＦ−１は、５−Ｆｕおよ
びＡｒａ−Ｃの両方の化学治療薬物によって誘発された細胞傷毒性からＬＰＰ−
ＣＦＣを保護することができる。
実施例１６
インビボ骨髄保護
インビボ骨髄保護の結果は、化学治療薬剤の作用の期間中にＭＰＩＦ−１によ
って骨髄中の臨界細胞種が保護され得る場合に、化学療法を受ける癌患者に観察
される重篤な副作用である細胞傷毒性薬物によって惹起された骨髄毒性が改善さ
れ得ることを示唆する。インビボ骨髄保護を実証するために、２種類の実験をマ
ウスで実施した。１つの実験では、１群のマウス（グループ４）を1.0mg/KgのＭ
ＰＩＦ−１によって２４時間周期で３日間毎日注射（Ｉ．Ｐ．）し、３日目にこ
れらのマウスに150mg/Kgの５−Ｆｕを注射（Ｉ．Ｐ．）した。生理食塩水のみ（
グループ１）、ＭＰＩＦ−１のみ（グループ２）または５−Ｆｕのみ（グループ
３）を注射した動物がコントロールの役割を果たした。次いで、各グループから
の４つの動物が、５−Ｆｕ投与の後に３、６、および１０日目に屠殺され、末梢
血における白血球（ＷＢＣ）の計数を決定した。図２２に示すように、ＭＰＩＦ
−１のみの注射ではＷＢＣ計数に影響がほとんどない。予測されたように、５−
Ｆｕ処置は、５−Ｆｕ後の６日目における循環するＷＢＣ計数に劇的な減少を得
られた。顕著に、５−Ｆｕ投与前にＭＰＩＦ−１で処置された動物は、５−Ｆｕ
のみで処置された動物に比べて血液中において約２倍高いＷＢＣカウントを示し
た。よって、５−Ｆｕの前のＭＰＩＦ−１でマウスを処置することによって、好
中球減少から促進的な回復が得られる。
骨髄中の造血幹細胞および多能性前駆体細胞は化学治療に続いて全ての造血性
系統を回復するよう機能する。正常な個人において、これらの細胞は低い頻度で
分裂し、よって、化学治療薬剤の一回の投与量が節約される。しかし、これらの
細胞は、第１の投与量後３日以内に薬剤の第２の投与量が投与された場合には殺
傷される。なぜなら、脊髄中の重要な前駆体細胞種はこの期間中に迅速に分裂す
るからである。
ＭＰＩＦ−１が骨髄においてこのような細胞種を保護できることを実証するた
めに、以下の実験を行った。この実験は、以下のように処置された３グループの
マウス（各グループにつき６匹）を用いて行われた。グループ１には、１、２お
よび３日目に生理食塩水を注射し、グループ２には、０および３日目に５−Ｆｕ
で注射し、グループ３には、０および３日目に５−Ｆｕを、および１、２および
３日目にＭＰＩＦ−１を注射する（図２３を参照のこと）。骨髄が６および９日
目に採集され、当業者に周知のクローン原性のアッセイを用いてＨＰＰ−ＣＦＣ
およびＬＰＰ−ＣＦＣの頻度を決定する。結果は、５−Ｆｕの第２の投与量の前
にＭＰＩＦ−１を投与する事は、５−Ｆｕのみで処置された動物と比較して９日
目までにＨＰＰ−ＣＦＣおよびＬＰＰ−ＣＦＣの回復が迅速に得られることを実
証した（図２４を参照のこと）。
実施例１７
ＭＰＩＦ−１変異体での研究
Ｎ末端から切断される多くのＭＰＩＦ−１改変体が同定され、そして特徴づけ
られている。Edman分解によって決定されるようなこれらの改変体のアミノ末端
配列を図２５に示す。例えば、変異体−２，−３，−７および−８は、ＭＰＩＦ
−１の成熟形態の精製中に自然に生じた。そして、この調製物は調製物K0871と
呼ぶ。同様に、変異体−２，−３，−４および−５は、精製されたＭＰＩＦ−１
の調製物のバッチに発見された（調製物HG00300-B7)。これらの改変体を互いか
ら精製することは不可能であるので、調製物K0871およびHG00300-B7は以下の実
験においてそのままの状態で用いられた。Ｎ末端以外はアミノ末端配列に関して
変異体３と同一の変異体６は、インビトロ変異原性によって発生された。Ｎ末端
メチオニン以外は野生型と同一の変異体１も変異誘発によって発生される。さら
に、ＭＰＩＦ−１のオルタナティブスプライシングされた形態（変異体９）が発
見された（図２５を参照のこと）。この変異体９のｃＤＮＡは、１３７アミノ酸
のタンパク質をコードする（図２６Ａ）。変異体９のアミノ酸配列をＭＰＩＦ−
１の配列と比較すると、ＭＰＩＦ−１配列における残留物４５および４６の間の
１８アミノ酸の挿入、ならびにＭＰＩＦ−１のアルギニン４６の減少が明らかに
なる。以下は、これらのＭＰＩＦ−１変異体タンパク質の生物学的活性を要約す
る。
細胞内のカルシウム動員。前述の実施例において、ＭＰＩＦ−１タンパク質は
単球においてカルシウムを動員することを示す。野生型および変異体ＭＰＩＦ−
１タンパク質は、ヒトのＭＩＰ−１αをポジティブコントロールとして用いる
ヒトの単球内における細胞内カルシウムの動員の能力について検査された。以下
のように実験が行われた。ヒトの単球は、洗浄によって隔離され，1mMのCaCl2，
2mMのMgSO4,5mMのグルコース、および10mMのＨＥＰＥＳ、pH7.4を含む1mlのＨＢ
ＳＳおよび2.5mMのIndo-1／アセトキシメチルエステル中で３０分間３７℃で１
×１０6の細胞をインキュベートすることによってIndo-1/アセトキシメチルエス
テルを負荷する。次いで、細胞はＨＢＳＳによって洗浄され、５×１０5cel1/ml
で同一の緩衝液において再懸濁され、指示されたタンパク質の様々な濃度で３７
℃で刺激される。細胞内カルシウム（（Ｃａ＋＋）ｉ）の変化に応答して誘導さ
れた蛍光シグナルは、３００ｎｍにおけるIndo-1の励起および４０５nmおよび４
８５ｎｍにおける放出をモニターすることによってHatchiF-2000の蛍光分光光度
計上で測定される。結果を図２７に示す。
結果は、調製物K0871,HG00300-B7,および変異体９が、野生型よりも１０倍よ
り活性である一方、変異体６は野生型から識別不能であり、変異体１は野生型よ
りも２倍より活性であることを実証する（図２７参照）。ＭＩＰ−αおよびＭＰ
ＩＦ−１が一次アミノ酸配列に対して４５％同一であるので、これらが同一のレ
セプターで相互作用するかどうかを決定することが興味の対象となった。この可
能性を探索するために、ＭＩＰ−αに誘発されたカルシウム動員を不感化させる
ＭＰＩＦ−１の能力について研究した。図２８Ａおよび図２８ＢはＭＩＰ−αお
よびＭＰＩＦ−１の野生型タンパク質が単球においてカルシウムを動員する能力
を互いに脱感作し得るが、ＭＣＰ−４（別のβケモカイン）はし得ないことを示
す。
同様の実験において、調製物K0871およびHG00300-B7および変異体-１，−６お
よび−９は、ＭＩＰ−αに誘発されるカルシウム動員をブロックすることができ
た。この実験は、以下のように行われた。100ng/mlの指定されたタンパク質に対
するヒトの単球のカルシウム動員の応答が、図２７に開示された実験に対して指
定されたように測定された。脱感作の研究に対して、単球はまず１つの因子に曝
され、第１の処置への応答がベースラインに戻った時、同一の細胞に第２の因子
が加えられた。第２の因子に対しては（−）サインによって何の応答も示されず
、（＋）サインによって第１の因子に対して刺激性の応答が示された（図２
９を参照のこと）。
このように、ＭＰＩＦ−１およびその変異改変体は、ＭＩＰ−１αの細胞表面
レセプターの成分と相互作用するかまたはこの成分を共有するようである。ＭＩ
Ｐ−１αレセプターが、ＨＩＶがヒトの単球およびＴリンパ球へ入ることを容易
にする際に補助因子として役立つことという最近の実証は、ＭＰＩＦ−１または
その改変体が、ＨＩＶが細胞への侵入するプロセスを妨害し得るという興味ある
可能性を提示する。
走化性。ヒト末梢血単核性細胞（ＰＢＭＣ）画分（主に、リンパ球および単球
から構成される）の走化性を、96ウエル神経プローブ走化性チャンバ中のＭＰＩ
Ｆ−１およびその改変体の種々の濃度に対する応答において、測定した。実験は
、以下のように行った：細胞を、0.1％ＢＳＡを伴うＨＢＳＳ（ＨＢＳＳ／ＢＳ
Ａ）中で３回洗浄し、そして標識するために２×106/mlで再懸濁した。カルセイ
ンＡＭ（Molecular Probes）を、最終濃度1mMに加え、そして細胞は、37℃で30
分間インキュベートした。このインキュベートに続いて、細胞を、ＨＢＳＳ／Ｂ
ＳＡ中で３回洗浄した。次に標識細胞は、８×106/mlとなるよう再懸濁し、そし
てこの懸濁液25ml（２×105細胞）が96ウエル走化性プレートのそれぞれの上部
チャンバへ分け入れられた。走化性試薬を、それぞれのウェルの底部チャンバに
、種々の濃度で分配した。上部および底部チャンバは、ポリカーボネートフィル
ター（孔の大きさ３〜５mm；ＰＶＰなし；NeuroProbe、Inc.）によって分けられ
ている。細胞は、45〜90分間移動させ、そして次に、移動した細胞（フィルター
の底面表面に付着した細胞および底部チャンバ中の細胞の両方）の数が、Cytofl
uor 11蛍光プレート読み取り機を使用して定量された。数値は、ピーク活性が、
括弧内に示されたバックグラウンドより上の相対誘導倍数（relatlve fold indu
ction）で観察された濃度を表す。
図30で示される結果は、調製物Ｋ０８７１およびＨＧ００３００−Ｂ７が野生
型よりさらに強力な走化性の誘導物質であり、一方、変異体−１および−６が野
生型と区別がつかないことを実証する。
ＬＰＰ−ＣＦＣによるコロニー形成への影響。ＬＰＰ−ＣＦＣによるコロニー
形成へのＭＰＩＦ−１改変体の影響を決定するために、制限された数のマウス骨
髄細胞を、種々の濃度のＭＰＩＦ−１改変体を有するまたは有さない、複数種の
サイトカインを補充した軟らかい寒天含有培地にプレートした。実験を、以下の
ように行った：低密度集団のマウス骨髄細胞を、示されたＭＰＩＦ−１改変体を
種々の濃度で有するまたは有さない寒天含有培地に、以下のマウス組換えサイト
カイン、ＩＬ−３（５ng/ml）、ＳＣＦ（100ng/ml）、ＩＬ−１α（10ng/ml）お
よびＭ−ＣＳＦ（5ng/ml）の存在下でプレート（1,500細胞／直径3.5cmの皿）し
た。次に、皿は、組織培養インキュベーターで14日間インキュベートし、14日目
の時点で、ＬＰＰ−ＣＦＣコロニーは、倒立顕微鏡下で数えた。図31に表された
データは、それぞれの条件で２連でアッセイした数個の異なる実験からプールす
る。
その結果は、調製物Ｋ０８７１およびＨＧ００３００−Ｂ７の場合、最大阻害
の50％に必要な有効濃度は、野生型の有効濃度より20から100倍低く、そして変
異体−６の場合は、２から１０倍低いことを実証する。（図31を参照のこと）。
このように、ＭＰＩＦ−１タンパク質のＮ末端アミノ酸が欠失するとその分子の
効力が増加するという結果になる。
実施例１８
リポ多糖体誘導致死性敗血症のＭ−ＣＩＦ保護
敗血症性ショックは、ヒトにおいて著しい罹患率および死亡率を有する疾患で
あり、血液によって運ばれる細菌感染に応答して起こるサイトカインの制御のき
かない放出によって引き起こされる。細菌の内毒素は、グラム陰性敗血症性ショ
ツクの病因の主要な因子として認められ(MorrisonおよびRyan,Annu．Rev．Med．
38:417(1987)；WolffおよびBenett，N．Engl．J．Med．291:733(1974))、ここで
グラム陰性敗血症性ショックは、ＴＮＦ−ａおよび他のサイトカインの生産につ
いて内毒素に応答してマクロファージによって媒介されるようである(Freudenbe
rgら、Infect．Immun．51:891(1986)，Traceyら、Nature(Lond)．330:662(1987)
)。
Ｍ−ＣＩＦは、βケモカインファミリーの新しいメンバーであり、単球／マク
ロファージへのインビトロの走化性活性を全く有さず、そしてＴリンパ球へのあ
る程度の走化性活性を有する。Ｍ−ＣＩＦは、ＭＩＰ−１αおよびＲＡＮＴＥＳ
と共有されるレセプターを介して細胞内Ca++を変化させるように単球／マクロフ
ァージを誘導すること以外には、ほとんどの白血球に対して不活性である（Schu
lz-Knappeら、J．Exp．Med．183:295(1996)）。さらに、Ｍ−ＣＩＦは、Ｍ−Ｃ
ＳＦで誘導された前単球コロニー形成に対して強い阻害効果を有することが示さ
れてきた（Kreiderら、Abstract for The International Society for Interfer
on and Cytokine Research，Geneva，Switzerland，1996）。
本検討において、本発明者らは、動物モデルにおいて内毒素誘導敗血症性ショ
ックに対するＭ−ＣＩＦの効果を調べる。ある実験において、細菌毒素の効果に
対する公知のマウスの天然の抵抗性を回避するために（Peavyら、J．Immunol．1
05:1453(1970)）、本発明者らは、Ｄガラタトサミンで前処置することによって
マウスの感受性を増加させた（Galanosら、Proc．Natl．Acad．Scl．USA76:5939
(1979);Lehmannら、J．Exp．Med．165:657(1987)）。本発明者らは、敗血症の可
能性があるマウスにＭ−ＣＩＦで全身的処置することによって、ＬＰＳ誘導致死
性ショックを有意に予防したことを示す。
材料および方法
化学物質および試薬。内毒素ＬＰＳ（E.coil ０１２７：Ｂ８から得られた）
およびＤガラクトサミンは、Sigma Chemical Co．（St Louis，MO）から購入し
た。組換えヒトＭ−ＣＩＦは、タンパク質の発現および精製のために３つの異な
るベクター系（バキュロウイルス、E.coli、およびＣＨＯ細胞）を利用して産生
した。インビボ使用のための最終タンパク質調製物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析で
測定されたように90％より多くのＭ−ＣＩＦを含み、そして4.0EU/mgより低い内
毒素レベルを有した。
動物。これらの実験は、Harlan Sprague Dawley（Indianapolis，IN）から購
入されたＢａ１ｂ／ｃおよびＣＦ−１マウス、ならびにAnimal Production Faci
lity，National Cancer Institute/Charles River（Frederick，MD）から購入さ
れたＢａｌｂ／ｃ ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄ（ＳＣＩＤ）マウスを用いて行った。す
べてのマウスは、生後８から12週齢で使用し、そして水道水へ自由にアクセスさ
せながら標準的な実験室食餌で維持した。動物は、12時間の光周期（午前６時か
ら午後６時、明）ならびにモニターされた22℃の温度および65％の湿度を有する
部屋で、実験で使用する前に少なくとも１週間、フィルタートップ（filter top
）を有するプラスチックのマイクロアイソレーターケージ（microisolator cage
）中に、制御された条件下で収容した。ＳＣＩＤマウスに与えるすべての床敷き
および水は、使用の前にオートクレーブにかけられ、食餌は使用前に放射線を照
射された。
実験の設計。致死性敗血症は、Ｄ-gal感作をあらかじめ（ＬＰＳの１時間前に
）行いまたは行わずに、０日目に正常生理食塩水で溶解された種々の用量のＬＰ
Ｓを腹腔内注射で、マウスに誘導した。種々のベクター／バッチからのＭ−ＣＩ
Ｆは、異なる用量で、毎日連続３日間、−１日目、０日目（ＬＰＳの１時間前）
、および１日目に、腹腔内に与えた。緩衝液（40mM酢酸ナトリウム、pH5.5；150
mM NaCl）を受けたマウスを、疾患コントロールとして役立てる。動物を、ＬＰ
Ｓチャレンジ後120時間もの間、ＬＰＳチャレンジ後１日当たり３回、瀕死（mor
bundity）および罹患率についてモニターした。生き残ったマウスのパーセント
を、生存中のマウスの数／マウスの総数×100％として、計算した。
結果
Ｂａｌｂ／ｃマウスにおける敗血症性ショックの２つの動物モデルに対するＭ
−ＣＩＦの効果。第１モデルの致死性ショックを、ＬＰＳ（25mg/kg、腹腔内）
でマウスに誘導した。このモデルにおいて、動物の85％は、ＬＰＳ注射後５２時
間で死んだ。Ｍ−ＣＩＦ（3mg/kg、腹腔内）の毎日３日間の処置で、緩衝液コン
トロール（図32）に比較して、40％も死亡率を防いだ。第２モデルの致死性敗血
症を、Ｄ-gal（20mg/mouse、腹腔内）感作の１時間後にＬＰＳ（1μｇ/mouse、
腹腔内）をマウスに注射することによって誘導し、そしてすべての動物は、ＬＰ
Ｓ投与後８時間以内に死んだ。マウスをＭ−ＣＩＦ（1mg/kg、腹腔内）で同様の
投与レジメン（regiment）を用いて３日間前処置すると、生理食塩水コントロー
ルに比較して死亡率を50％防ぎ、そして一回投与処置は、マウスの25％における
死亡を防いだだけだった。さらに、Ｍ−ＣＩＦと、ＬＰＳ（1μｇ/マウス）また
はＤ-gal（20mg/マウス）のいずれかの組合せ処置は、動物において死亡および
瀕死の徴候を全く起こさなかった、このことはＭ−ＣＩＦ調製物中の内毒素レベ
ルが無視できることを示唆する（表２）。
マウスは、連続３日間（すなわち、ＬＰＳ前１日（−１日目）、ＬＰＳ前１時
間（０日目）、およびＬＰＳ後１日（１日目）（−１、０、＋１））、またはＬ
ＰＳ前１時間に（０日目）（単に０と記す）注射した。ＮＤ−行わず。
敗血症に対するＭ−ＣＩＦの予防効果は、動物系統に依存しない。ＣＦ−１マ
ウスはまた、Ｄ-gal感作ＬＰＳ誘導致死ショックモデルにおいて使用した。Ｂａ
ｌｂ／ｃマウスと異なり、生理食塩水コントロール群において、ＣＦ−１マウス
の50％だけがＬＰＳ後11時間目までに死に、そしてＭ−ＣＩＦを毎日連続３日間
追加投与すると、すべてのマウスについて死亡を防いだ（表３）。これらの結果
は、ヒトＭ−ＣＩＦがマウス相同体に非常に近く、そして敗血症に対するＭ−Ｃ
ＩＦの予防効果が、動物の系統選択的ではなくて、広範な現象であることを示唆
する。
マウスは、連続３日間（すなわち、ＬＰＳ前２日（−２日目）、ＬＰＳ前１日（
−１日目）、およびＬＰＳ前１時間（０日目）（−２、−１、０））注射した。
敗血症性ショックに対するＭ−ＣＩＦの予防効果は、ＬＰＳの用量に依存する
。大規模実験において、Ｂａ１ｂ／ｃマウスは、一用量のＬＰＳ（25mg/kg）を
腹腔内にチャレンジされ、そしてこの群の致死の程度は、90％であった（図33）
。毎日10mg/kgで連続３日間のＭ−ＣＩＦの前処置により、70％も保護した（図3
6）。
致死性敗血症に対するＭ−ＣＩＦの用量依存性効果。この大規模実験は、Ｂａ
ｌｂ／ｃマウスにおいて25mg/kgのＬＰＳに基づいていた。100％の致死が、ＬＰ
Ｓ注射後48時間以内に緩衝液コントロール群において誘導された。対照的に、1m
g/kgのＭ−ＣＩＦで処置されたマウスにおいては、同じ期間においてなお40％の
生存率があり、５日目までにこの群のすべてのマウスは、死んだ。さらに、３お
よび10mg/kg用量のＭ−ＣＩＦは、それぞれマウスの50％および65％を致死性シ
ョックから防いだ（図34）。
Ｍ−ＣＩＦは、Ｂａｌｂ／ｃＳＣＩＤマウスにおいて敗血症を予防できる。致
死の最適度を決定するために、ＢおよびＴリンパ球において欠損を有するＳＣＩ
Ｄマウスに、20、30、40、または50mg/kgのＬＰＳを腹腔内に注射した。正常Ｂ
ａｌｂ／ｃマウスと異なり、Ｍ−ＣＩＦ処置を行うかまたは行わないにかかわら
ず、20mg/kgのＬＰＳを注射されたマウスにおいて死亡は、全く起こらなかった
（ｎ＝８）。30mg/kgのＬＰＳ群において、30％だけの死亡率が観察され、3mg/k
gのＭ−ＣＩＦで追加処置すると、すべてのＳＣＩＤマウスをショックから保護
した。ＬＰＳの用量をさらに40mg/kgに増加すると、免疫不全マウスの緩衝液コ
ントロール群において80％の死亡率が誘導され、そして３mg/kgで連続３日間の
Ｍ−ＣＩＦの迫加処置をすると、マウスの40％を死亡から保護した（図35Aおよ
び図35B）。いったんＬＰＳ用量を50mg/kgで与えると、正常Ｂａｌｂ／ｃマウス
と全く同様に、緩衝液コントロール群においてすべてのＳＣＩＤマウスが24時間
以内に死に；そして５動物はすべて、追加Ｍ−ＣＩＦ処置によって保護できなか
った。
敗血症に対する、異なるベクター調製物からのＭ−ＣＩＦの一貫性のある予防
効果。E.coliおよびＣＨＯの発現ベクターから調製されたＭ−ＣＩＦタンパク質
を、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおけるＬＰＳ誘導致死性敗血症において試験した。25
mg/kgのＬＰＳのチャレンジ後48時間以内に100％の致死率を示した緩衝液コント
ロールと比較して、ＣＨＯベクターから得られたＭ−ＣＩＦ（1mg/kg）は、同じ
期間において60％ものマウスを死亡から救い、そして50％をＬＰＳ注射後３日間
死亡から救った。さらに、E.coliベクターから得られた同用量のタンパク質はま
た、マウスの25％を致死性ショックから防いだ。しかし、Ｍ−ＣＩＦのこの調製
物は、他の２つのベクターから得られた材料より強力でないようであり、このこ
とはタンパク質の発現および精製処理中に著しい変化があり得ることを示唆して
いる（図36）。
実施例19
腎臓損傷におけるＭ−ＣＩＦ調節
ＴＮＦ−αは、数タイプの糸球体損傷の病因に関与していると示されてきた（
Martinら、Clin．Exp．Immunol．2:283-288(1995)；Oritzら、Adv．Nephrol．Ne
cker．Hosp．24.53-77(1995)；Karkarら、Kidney Int．44:967-973(1993)；
Nikolic-Patersonら、Kidney Int．45:S79-S82(1994)；Egidoら、Kidney Int．4
3:S59-S64(1993)）、そして尿細管間質性腎炎、線維症、および腎臓同種移植拒
絶（Baudら、Miner.Electrolyte Metab．21:336-341(1995)；Tangら、Lab．Inve
st．70:631-638(1994)；Wilson，The Kidney，Brenner、編、Philadelphia，W.B
.Saunders Company，1253頁(1996))；Perkinら、TheKidney，Brenner編，Philad
elphia，W.B．Saunders Company，2576頁(1996)）に役割をはたし得る。腎臓疾
患の発症および経過を変更する際におけるＭ−ＣＩＦの効力を研究するために、
動物モデルを、半月状糸球体腎炎、巣状および分節状の糸球体硬化症（ＦＳＧＳ
）、ならびに薬剤誘導間質性腎炎について利用する。
抗ＧＢＭ疾患のモデルは、糸球体半月を特に発症しやすい一系統のラット（Ｗ
ＫＹ）において誘導する（Huangら、Kidney Int．46:69-78(1994)；Boltonら、K
ldney Int．44:294-306，(1993))）。この研究において使用された抗体は、雌の
ニュージーランド白ウサギ中に産生される。ウサギは、腎臓の基底膜リッチな沈
殿物で繰り返し免疫する（Schreinerら、J．Exp．Med．147:369-384(1978)）。
免疫血清を、56℃で30分間、熱不活性化し、そしてラットの赤血球で吸収し、そ
してその結果生じた血清を腎毒性血清（ＮＴＳ）と呼ぶ。正常雄ＷＫＹラット（
125〜150g）は、腎炎原性より下の（subnephritogenic）用量のＮＴＳの一回静
脈内注射を受ける。用量は、Ｌｅｗｉｓラットにおいて即時の糸球体損傷が起こ
らないように選ばれる。
公知の方法によると、ＷＫＹラットへのＮＴＳの投与は、マクロファージに30
分以内に糸球体への浸潤を起こさせ、10日の期間にわたってその数を増加させる
。糸球体の過細胞性（hypercellularity）は、48時間以内に明らかにあり、そし
て６日目までに、壊死があり、および初期の半月形成の存在がある。ＮＴＳ投与
後10日で糸球体の大多数は、びまん性かつ増殖性の糸球体腎炎を示す。
疾患経過を変更するためのＭ−ＣＩＦの効力を試験するために、ラットは、Ｎ
ＴＳを受け、そしてＭ−ＣＩＦまたはプラシーボの腹腔内注射で毎日処置される
。疾患の経過は、タンパク尿およびＴＮＦ−αレベルを評価するために、それぞ
れ尿および血清を毎日採取することによってモニターする。ＮＴＳ投与後、30分
から10日の範囲の種々の時点で、ラットを屠殺し、そして浸潤細胞の同定は、マ
ク
ロファージおよびＴ細胞に特異的な市販のモノクローナル抗体を使用して、凍結
切片の免疫組織学的試験によって評価する。
慢性アミノヌクレオシドネフローゼのモデルが、進行性病巣または分節性糸球
体硬化症のプロトタイプとして用いられる。このモデルにおいて、マクロファー
ジが腎皮質に浸潤し、腎皮質において、上昇したレベルのＴＮＦ−αおよび増大
したエンドセリンレセプター遺伝子の発現が見いだされる(Diamondら、Am．J．P
athol．141:887-894(1992)、Diamondら、Lab．Invest．64:21-28(1991)、Nakamu
raら、J．Am．Soc．Nephrol．5:1585-1590(1995))。体重１２５〜１５０ｇの雄
のSprague-Dawleyラットが、これらの研究に用いられる。これらのラットは、ピ
ューロマイシンアミノヌクレオシド(50mg/kg、Sigma Chemical Co.，St．Louise
，MO)を３分間にわたって右頸静脈を通って一度静脈内へ注入される。動物は、
２週間以内に、蛋白尿、重篤な尿細管間質異常を発生し、マクロファージの流入
を示す。蛋白尿のこの期間は軽減して、次いで１８週までに再発する。このとき
、糸球体の４４％が病巣または分節性糸球体硬化症を呈する(Diamondら、Kidney
Int．32:671-677(1987))。
この進行性腎臓損傷を阻止するＭ−ＣＩＦの能力を試験するために、ラットに
ピューロマイシンアミノヌクレオシドを静脈内へ注入し、その後、Ｍ−ＣＩＦま
たはプラシーボのいずれかを毎日腹腔内注入で処置する。ＴＮＦ−αの蛋白尿お
よび血清レベルを、１８週間の研究にわたって、選択された間隔でモニターする
。様々な時点で、ラットを屠殺し、市販のマクロファージおよびＴ細胞に対する
モノクローナル抗体を用いて、腎皮質の浸潤を腎臓の複数の部位で調べる。形態
学的異常の度合いを、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した標準的パラフィ
ン切片上で、２人により注入された物質を知らされない状態で、且つコンピュー
タ化形態測定ユニットを用いて、評価する。
肉芽腫形成を導く腎臓細管に対する細胞媒介免疫損傷のモデルを用いて、薬物
誘導間質性腎炎を寛解させるＭ−ＣＩＦの効力を評価する。体重１４０〜１８０
ｇの雄のBrown Norwayラットが、以前に報告したようにこのモデルに用いられる
(Rennkeら、Kidney Int．45:1044-1056(1994))。標的抗原としてハプテン分子
（ＡＢＡ）が用いられる。免疫源（ＡＢＡ−ＫＬＨ）を生成するために、３１．
４ｍｇのｐ−アルサニル酸(Eastman Kodak Co.，Rochester，NY)を２．５ｍｌの
１Ｎ ＨＣｌに溶解し、その後ゆっくりと亜硝酸ナトリウムを添加することによ
りジアゾ化し、活性化ＡＢＡを生じる。５００ｍｇのキーホールリンペットヘモ
シアニン（ＫＬＨ）(Calbiochem Corp．La Jolla，CA)を２０ｍｌのホウ酸緩衝
生理食塩水に溶解することにより溶液を調製し、ｐＨを９．２に調整する。ジア
ゾ化アルサニル酸をゆっくりと添加し、６０分後に、混合液をリン酸緩衝生理食
塩水に対して透析する。得られたＡＢＡ−ＫＬＨを、使用するまで、−２０℃で
アリコートで凍結する。
ラットを、５ｍｇ／ｍｌのＨ３７Ｒａ結核菌(Difco laboratories，Detroit，
MI)を含むフロイント完全アジュバントで乳化された１ｍｇのＡＢＡ−ＫＬＨを
尾の付け根に皮下投与することにより免疫する。この免疫化の１０日後に、腎動
脈を介して左肝臓に、０．０５ｍｇ／ｍｌのベラパミルを含む１〜２ｍｌのリン
酸緩衝生理食塩水、２ｍｌの活性化ＡＢＡ（ホウ酸緩衝生理食塩水の４ｍＭ溶液
、ｐＨ８．１）、および０．０５ｍｇ／ｍｌのベラパミルを含む１ｍｌのリン酸
緩衝生理食塩水を連続的に灌流する。
これを達成するために、ラットを麻酔し、加熱した手術台上に配置し、開腹を
行う。左腎臓脈管を単離し、ゆるいスネアを左腎臓静脈および腹大動脈回りに配
置する。左腎臓動脈に３０ゲージ針でカニューレを挿入し、大動脈および腎臓静
脈回りにスネアを閉じる。その後、左腎臓のエキソビボ灌流が、１．１ｍｌ／分
の速度で起こり、その後流出物が一時的に結紮された左腎臓静脈の穿刺を介して
排出する。止血が回復し結紮が開放された後、１〜２分以内に腎臓の再灌流が起
こる。２４時間以内に、多形態核白血球および単核細胞により構成される、穏や
かではあるが拡散性の炎症細胞浸潤物が生成される。５日目までに、単球および
マクロファージが優勢となる。このとき（５日目）、腎皮質の７５％が肉芽腫性
炎症を含んでいる。
このモデルにおけるＭ−ＣＩＦの効力を試験するために、Ｍ−ＣＩＦまたはプ
ラシーボを毎日腹腔内投与する。様々な時点でラットを屠殺し、そのＴＮＦ−α
の血清レベルを定量化し、炎症プロセスに関わった腎皮質の量を、コンピュータ
化形熊測定ユニットを用いてヘマトキシリンおよびエオシンで染色した標準的パ
ラフィン切片上で評価する。浸潤炎症性細胞の同一性を、市販の単球／マクロフ
ァージおよびＴ細胞に対するモノクローナル抗体を用いて、組織切片で同定する
。Ｍ−ＣＩＦは、腎臓損傷において低減した炎症を提供すると予測される。
実施例２０
Ｍ−ＣＩＦによる、ラットのアジュバント関節炎における慢性関節炎症の保護
関節リューマチにおいて、苦痛および腫脹は概して、現在入手可能な薬物によ
り制御され得るが、この疾患に関連する進行性関節破壊を止めることは困難であ
る。そのため、骨および軟骨の破壊を引き起こす細胞および分子メカニズムのよ
り特異的な阻害に多くの努力が向けられてきた。ラットにおけるフロイントアジ
ュバント誘導関節炎モデルは、増殖性滑膜炎および最終的には軟骨および骨の浸
食を導く四肢の腫脹(PearsonおよびWood，Arthritis Rheum．2:440(1959)、Jone
sおよびWard，Arthritis Rheum．6:23(1963))の存在から、関節炎の患者と多く
の特徴を共有している。ヒトの関節リューマチと同様に、アジュバント関節炎を
有するラットの炎症滑膜には、マクロファージが多数存在する(Johnsonら、Arth
ritis Rheum．29:1122(1986))。マクロファージは、関節炎において、組織分解
酵素または炎症誘発サイトカイン(Lopex-Boteら、Arthritis Rhuem．31:769(198
8))を分泌するか、抗原駆動応答(UnanueおよびAllen，Science 236:551(1987))
中の免疫調節機能により、組織破壊のエフェクター細胞のいずれかとして主要な
役割を果たしていると考えられる。この動物モデルは後ろ足の腫脹の定量（急性
炎症の測定として）および慢性関節ダメージのための軟骨および骨の組織病理学
的改変による、抗炎症および免疫抑制性薬物の検出に用いられてきた。この研究
において、本発明者らは、アジュバント関節炎ラットモデルにおいて、急性およ
び慢性の両方の炎症性関節炎に対するＭ−ＣＩＦの効果を試験した。
０日目に、成体の雄のLewisラット（１２０〜１５０ｇ）の尾の付け根に、フ
ロイント完全アジュバントを皮内注入した。フロイント完全アジュバントは、My
cobacterium butyricum(Difco Lab，Detroit，MI)を、５ｍｇ／ｍｌの濃度でミ
ネラルオイルに添加することにより調製した。ラットに、Ｍ−ＣＩＦまたはその
緩衝液を、以下に述べるように、０日目から１６日目まで又は０日目から４０日
目まで毎日腹腔内へ注入した。１ｍｇ／ｋｇ用量のインドメタシンまたはそのメ
チルセルロースビヒクルを、他のグループのラットに毎日経口投与した。プレチ
スモメトリーチャンバー(Baxco Electronics，Troy，NY)を用いて、後ろ足の腫
脹を測定した。後ろ足における容量を、両方の後ろ足における容量の平均値およ
び後ろ足容量におけるパーセント変化として表した。
実験の最後に、足首および足根の関節を切断し、組織学的評価のために処理し
た。２人の研究員が、病理学的変化ならびに骨および軟骨の変化を、用いられた
物質を知らされない状態で、以下のパラメータを用いて評価した：血管拡張、線
維症／線維増殖症、過形成／肥大、脈管周囲リンパ様凝集、パンヌス形成、軟骨
破壊、および骨破壊。変化の度合いおよび分布を区別するために用いられる主観
的半定量的スコアリングシステムを以下のように定義した。０＝正常、０．５＝
非常に軽度、１＝軽度、２＝重度、３＝非常に重度。
第１の実験において、動物を０日目から１６日目まで処置した。足首を、１４
日目（試験した最初の期間）までに腫脹し、１６日目と２０日目との間に最高の
重度に達した。この後、急性炎症は次第に治まった。足首の腫脹に対するＭ−Ｃ
ＩＦの効力を図３７に示す。Ｍ−ＣＩＦの両用量とも、足の腫脹の穏やかな低減
を示したが、水腫を低減させるにはインドメタシンがはるかに有効であった。パ
イロット研究において、各グループからの２匹の動物の四肢を組織学的スコアリ
ングのために処理した。結果を図３８に示す。急性および慢性の両方の特徴を考
慮すると、０日目から１６日目までＭ−ＣＩＦで処置した動物は、緩衝液コント
ロールのグループに比較して、総関節炎症の大幅な低減を示した。
これらの結果に基づいて、第２の実験プロトコルを用いた。第２の実験プロト
コルにおいて、実験の期間中（０日目から４０日目まで）、ラットを毎日処置し
た。研究の最後に、グループあたり５匹の動物からの四肢を組織学的評価のため
に処理した。Ｍ−ＣＩＦを毎日３ｍｇ／ｋｇの用量で与えた場合、その緩衝液コ
ントロールと比較した場合、慢性滑膜炎（図３９）ならびに骨および軟骨浸食（
図４０）の大幅な低減があった。インドメタシンは、慢性関節炎の組織病理学
的研究には何らの効力も示さなかった。そのため、Ｍ−ＣＩＦは、急性水腫に対
しては穏やかな効力しか示さなかったが、関節炎の慢性的特徴、最も重要には、
骨および軟骨の浸食に対して有意な保護効果を示した。
Ｍ-ＣＩＦ処置は、ＤＢＡ／ｌマウスのタイプＩＩコラーゲン誘導関節炎の発
主を防止する。ウシタイプＩＩコラーゲンおよびフロイント完全アジュバントの
等量の２ｍｇ／ｍｌ溶液を用いて乳化剤を調製した。５〜６週齢の雌のＤＢＡ／
ｌ ＬａｃＪマウスを、１００μｌの乳化剤を尾の付け根から皮内投与すること
により免疫した。１８日後、マウスを１０匹ずつ３グループに分け、３ｍｇ／ｍ
ｌのインドメタシン、Ｍ−ＣＩＦ、またはコントロール緩衝液を腹腔内投与した
。この投与を１４日間繰り返した。この処置の開始から２日後（実験の開始から
２０日後）に、マウスに、総容量１００μｌのＬＰＳを６０μｇ、皮下注射でチ
ャレンジした。動物を検査し、その臨床的病状を、以下のスコアリングシステム
により関節炎の発生に対して半定量化した。
発生率＝（少なくとも１本の影響を受けた足を有するマウスの数／マウスの総
数）×１００
臨床的重度スコア 記述
０．５ １本以上の腫脹指
１．０ 足全体が腫脹
２．０ 炎症が治まった後変形が認められる
３．０ 強直症：足の関節の機能の完全喪失
図４１に示すように、Ｍ−ＣＩＦおよびその緩衝液処理グループの両方におい
て、ＬＰＳチャレンジから４〜１０日後までには約７０％のマウスが急性の足水
腫を発生していた。しかし、この急性炎症の重篤度は、緩衝液グループにおける
よりもＭ−ＣＩＦ処置マウスにおいて弱かった（図４２）。経時的に、緩衝液処
置グループの発生率および重篤度は増加し、一方、Ｍ−ＣＩＦ処置動物は改善さ
れた。ポジティブコントロールとして用いられたインドメタシンもまた、発生率
および重篤度の両方を予測通り低減するために有効であった。
考察。アジュバントおよびコラーゲン誘導関節炎は、広く用いられている関節
リューマチの実験モデルであり、共通の臨床的および組織学的特徴を有する。
関節リューマチにおいて、苦痛および腫脹は概して、現在入手可能な薬物により
制御され得るが、この疾患に関連する進行性関節の破壊を止めることは困難であ
った。そのため、骨および軟骨の破壊を引き起こす細胞および分子メカニズムの
より特異的な阻害に多くの努力が向けられてきた。関節炎の慢性的特徴、最も重
要には、関節の変形および破壊を導く骨および軟骨の浸食に対するＭ−ＣＩＦの
保護効果は、Ｍ−ＣＩＦが、ヒトの関節リューマチなどの慢性炎症性関節炎の治
療剤として良好な可能性を有していることを強く示唆している。Ｍ−ＣＩＦのみ
では急性水肺に対して穏やかな効力しか有しないが、Ｍ−ＣＩＦおよびＮＳＡＩ
Ｄの組み合わせによる処置は、苦痛および腫脹などの急性期関節炎および進行性
関節破壊の両方に有益であり得る。このように、Ｍ−ＣＩＦは、炎症および苦痛
などの関節炎の慢性的特徴に対する保護を提供することが示されている。
実施例２１
全身性ＴＮＦ−α生成に対するＭ−ＣＩＦの抑制効果
敗血症性ショックは、血液由来の細菌感染に応答するサイトカインの制御不能
な放出から生じる、ヒトにおいて重大な病的状態と死亡率を伴う疾患である。細
菌エンドトキシンは、グラム陰性の敗血症性ショックの病因の主要なファクター
であると認められている(MorrisonおよびRyan，Annu．Rev．Med．38:417，1987
、WolffおよびBenett，N．Engl．J．Med．291:733(1974))。これは、ＴＮＦ−α
および他のサイトカインの生成のために、エンドトキシンに応答するマクロファ
ージにより媒介されるようである(Freudenbergら、Infect．Immun．51:891(1986
)、Traceyら、Nature(Lond)．330:662(1987))。
以前の研究は、Ｍ−ＣＩＦによるマウスの全身的処置は、２つの動物モデルで
ＬＰＳ誘導致死的ショックを有意に阻止することを示した。ＴＮＦ−α生成は、
敗血症性ショックを引き起こす中心であるため、本発明者らは、Ｍ−ＣＩＦはＴ
ＮＦ−αの生成に干渉し、それによりＴＮＦ媒介内毒素性ショックをインビボで
保護するのかどうかという疑問を持った。
インビボ。０日目に、７〜８週齢の雌のＢａｌｂ／ｃマウスに、生理食塩水中
のＥ．Ｃｏｌｉ血清型０１２７：Ｂ８（Signa Chemical Co.，St．Louis，M
O)からの２５ｍｇ／ｋｇのリポ多糖（ＬＰＳ）をチャレンジした。１日目に、Ｌ
ＰＳ注入前の１時間前に、Ｍ−ＣＩＦまたはその緩衝液を腹腔内投与した。ＬＰ
Ｓ投与から１時間後、２時間後、および４時間後に、４匹のマウスのグループを
屠殺した。逆眼窩(retrorbital)血管叢から血清を得、ＴＮＦ−αレベルをGenzy
me Corp.，Cambridge，MAより購入したＥＬＩＳＡキットを用いてＴＮＦ−αレ
ベルを決定した。製造業者により記載された通りにアッセイを行った。各サンプ
ルを１：４に希釈し、二連ウエル内でアッセイし、結果を対応のないＴ検定で分
析した。データは、平均値＋ＳＥＭで表している。
図４３に示すように、緩衝液コントロールグループの血清ＴＮＦ−αレベルは
、ＬＰＳ注入から１時間後に最高となり、その後急速に低下した。逆に、３ｍｇ
／ｋｇのＭ−ＣＩＦを投与されたマウスは、ＬＰＳ注入から１時間後には、緩衝
コントロールグループに比べて、その血清中に有意に少ないＴＮＦ−αを有して
いた。１ｍｇ／ｋｇのＭ−ＣＩＦで処置された動物は、レベルを低減させたが、
統計的有意性には至らなかった。
全身性ＴＮＦ−α生成に対するＭ−ＣＩＦの阻害効果は、Ｍ−ＣＩＦがマウス
をＬＰＳ誘導敗血症性ショックから保護するメカニズムの一つの局面であると予
測される。この効果は、関節リューマチおよび骨関節炎などの自己免疫炎症性疾
患の処置に有益である。
インビトロ。４〜６週齢の雌のＢａｌｂ／ｃマウスを、１グループ１０匹ずつ
、２グループに分けた。グループに、２日間連続してビヒクルコントロールまた
は３ｍｇ／ｋｇのＭ−ＣＩＦのいずれかを腹腔内へ注入した。２回目の注入から
１時間後に、マウスを屠殺して腹腔洗浄を行って常在性細胞を収集した。その後
、細胞を洗浄して、培養培地(RPMI 1640/20% FBS)中で１×１０6細胞／ｍｌの濃
度で再懸濁した。細胞をその後４８ウェルプレート内にプレーティングし、ＬＰ
Ｓの存在下または不在下（１および１０ｎｇ／ｍｌ）で一晩インキュベートした
。１８時間後、各ウェルから上清を収集し、使用するまで凍結保存した。上清中
のＴＮＦ−α含有量を決定するためのＥＬＩＳＡを、製造業者(Genzyme Diagnos
tics，Cambridge，MA)が特定するように行った。図４４に見られるように、Ｍ−
ＣＩＦ処置動物から単離され、その後インビトロでＬＰＳ処置された細胞は、
コントロールマウスから単離された細胞よりも、統計的に有意に低い量のＴＮＦ
−αを分泌する。
このように、Ｍ−ＣＩＦは、インビトロでＴＮＦ−α生成を阻止する能力を有
する。この活性は、急性および慢性の両方の炎症に有益である。上述した循環Ｔ
ＮＦ−αレベルに関するデータをまとめると、これは、Ｍ−ＣＩＦがＬＰＳ誘導
敗血症から保護するメカニズムの一つの局面を説明し得る。ＴＮＦ−αの上昇し
たレベルが広範な種々の免疫細胞疾患または反応と関連づけられているため、Ｍ
−ＣＩＦ処置は、本明細書中に記載したような疾患の状態に用いられ得る。
最近の研究は、ＴＮＦ−αに対する抗体または可溶性ＴＮＦ−αレセプターの
使用によりＴＮＦ−α活性を阻害の有効性を示している。これらの疾患は、急性
膵炎、同種移植拒絶、非インシュリン依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）、喘息、皮膚
の遅延過敏症反応、肺線維症、および虚血／再灌流障害を含む。逆に、ＴＮＦ−
αは、肝臓再生においてパラ分泌の役割を果たし、いくつかの場合には、皮膚お
よび心臓同種移植拒絶を抑制する。このように、Ｍ−ＣＩＦまたはそのアゴニス
トは、このような疾患状態において有益であることが予測される。
実施例22
インビボでのＴリンパ球の化学誘引剤としてのM-CIF
生後４〜６週間のメスのBalb/cマウスを、１グループ当たり10匹からなる４グ
ループにした。これらのグループに、処置しないか、ビヒクルコントロールを腹
腔内注射するか、または、M-CIFを1mg/kgもしくは3mg/kgで６日間連続で注射す
るかのいずれかを行った。７日目に、マウスを屠殺し、腹膜腔洗浄を行い、常在
細胞を収集した。細胞総数を計算し、以下のモノクローナル抗体のパネルを用い
て、細胞を細胞表面染色させた：CD3、CD4、CD8、Macl、GR1、B220、MHCクラスI
I、CD14、CD45、およびCD5（Pharmingen、サンディエゴ（San Diego）、カリフ
ォルニア州）。
図45に示されるように、腹膜腔内の細胞総数は、未処置またはビヒクル処置コ
ントロールよりも、２〜３倍増加した。これは、CD4、CD5およびCD8についての
細胞表面染色により判定されるような、Ｔリンパ球の流入によるものであると思
われる。CD4陽性細胞（図46）、ならびにCD5およびCD8細胞は劇的に増加し、そ
の結果、Ｔリンパ球の相対数の正味の増加が得られる（図47(2)）。さらに、腹
膜腔内の、Macl陽性、MHCクラスII陰性の細胞副次集団が有意に増加し、MHCクラ
スII陽性、Macl陽性の細胞副次集団のパーセンテージがそれに対応して減少して
いる（図48）。これはまた、腹膜腔内のMHCクラスII陰性、Macl陽性細胞の総数
に反映される（図49）。
従って、M-CIFは、インビボでのＴリンパ球の化学誘引剤であることが示され
る。これは、Ｔ細胞のCD4、CD8、またはその両方の副次集団について可能である
。このことに基づいて、M-CIFは、この免疫細胞集団の誘引および／または活性
化により利益を得る疾病状態に有益であり得る。これは、細菌性またはウィルス
性感染症、癌などを含む。また、M-CIFが、CD4リンパ球のTh1またはTh2サブクラ
スに対して特異的な影響を有する場合、M-CIFは、これらの細胞からのサイトカ
インの正常な産生を偏らせ得、単球、マクロファージ、好酸球、および他の免疫
細胞のようなその他の免疫細胞に劇的に影響を及ぼし得る。
Macl陽性細胞のMHCクラスII陰性副次集団が、M-CIFで処置した動物において増加
することは、これらの動物内の単球集団が、より高いパーセンテージの、活性化
されていない細胞からなることを示唆している。これは、M-CIFで処置した動物
からの腹膜細胞が、LPSに応答してより少ないTNF-aを産生することを示すデータ
と一致している。
実施例23
MPIF-1により誘導されるインビボでの幹細胞の動員
MPIF-1がインビボで幹細胞の可動化を刺激することを証明するために、以下の
実験を行なった。各処置グループに、６匹のマウスを使用した（C57Black 6/J、
メス、生後約６週間）。これらのマウスに、生理食塩水（ビヒクルコントロール
）またはMPIF-1のいずれかをマウス１匹につき5μｇ注射（腹腔内）した。30分
後、マウスから採血し、CoulterカウンターによりWBCについて分析した。次いで
、各グループの６匹すべてからの血液をプールし、FACScanにより、Gr.1+細胞お
よびCD34.Sca-l＋二重陽性細胞について分析した。WBCの数は、平均±S.D.とし
て
表され、そして、FACScanデータは、細胞総数の％として表される。CD34.Sca-1+
二重陽性細胞は、造血幹細胞に期待される特性を示すと考えられるため、図50に
示される結果は、MPIF-1が、幹細胞可動化剤として使用され得ることを示す。
実施例24
M-CIFの精製
CHO発現系からの精製
チャイニーズハムスター卵巣細胞でのM-CIFの発現後、以下の手順を用いてタ
ンパク質を精製した。特に明記しない限り、精製手順はすべて、５〜10℃で行な
った。トランスフェクトCHO細胞を、マイクロキャリア培養系（cytodex I、Phar
macia）を用いて、HGS-CHO-3培地で４日間増殖させた。低速遠心分離を用いて馴
化培地を採取し、細胞および細胞破壊片を取り除いた。酢酸でpHを7.0に調整し
た後、馴化培地を、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）（pH7.0）で予め平衡化した強
カチオン交換カラム（Poros HS-50、Perseptive Biosystems Inc.）にロードし
た。次いで、280nmでの吸光度が0.01 O.D．（10CV）未満になるまで、このカラ
ムを同じ緩衝液で洗浄した。1MのNaClを含むリン酸緩衝生理食塩水（pH7.0）で
カラムを洗浄することにより、所望のタンパク質を溶出させた。次いで、SDS-PA
GEにより、４〜20％の勾配のゲルを通して画分を分析し、所望のポリペプチドの
存在を確認した。
次いで、M-CIFを含むそれらの画分をプールし、50mMの酢酸ナトリウムおよび1
50mMのNaCl（pH6.0）を含む「サイジング（sizing）緩衝液」中で平衡化したSup
erdex-75樹脂（Pharmacia）のゲル濾過カラムにロードした。ロードされたサン
プルは、カラム容量の10%（V/V）未満であった。サンプルをカラム内に流した後
、同じ緩衝液を用いて、ゲル濾過マトリックスからタンパク質を溶出させた。画
分を収集し、溶出液の280nmでの吸光度を連続的にモニタした。次いで、A280に
より、溶出された材料を含むとして同定された画分が、SDS-PAGEにより分析した
。M-CIFを含む画分を、0.62カラム容量を中心とするピークで溶出され、そして
、これをプールした。
ゲル濾過クロマトグラフィーからのプールされた画分を、タンデム式の強アニ
オン交換カラム（Poros HQ-50、Perseptive Biosystems）および弱アニオン交換
カラム（Poros CM-20）の組に適用した。両方のカラムを、50mMの酢酸ナトリウ
ム緩衝液（pH6.0）で予め平衡化し、サンプルローディング後、50mMの酢酸ナト
リウム緩衝液（pH6.0）で洗浄した。次いで、カチオン交換カラム（CM-20）を0.
3MのNaClで洗浄し、その後、同じ緩衝液系において0.3M〜0.8MのNaClの勾配溶出
を行なった。溶出された画分を、SDS-PAGEにより分析し、対象のタンパク質を含
む画分を合わせた。
上記精製工程の後、結果として得られたM-CIFの純度は、SDS-PAGEゲルのクマ
シーブルー染色からの判定では、95%よりも高かった。また、精製タンパク質を
、エンドトキシン/LPSの混入についてテストした。LALアッセイによれば、LPS含
有量は、精製タンパク質の0.1ng/mg未満であった。
M-CIFを精製するために、代替の精製手順も使用した。この手順は以下の工程
を含み、特に明記しない限り、すべての手順を５〜10℃で行なった。
CHO培養物の生成段階が終了すると、低速遠心分離を用いて細胞／細胞破壊片
を除去した後、馴化培地を得た。酢酸を添加して培地のpHをpH7.0に調整した後
、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）（pH7.0）で予め平衡化した強カチオン交換カラ
ム（Poros HS-50、Perspective Biosystems，Inc.）に、培地をロードした。次
いで、280nmでの吸光度が0.01 O.D．（10CV）未満になるまで、このカラムを同
じ緩衝液で洗浄した。1MのNaClを含むリン酸緩衝生理食塩水（pH7.0）でカラム
を洗浄することにより、所望のタンパク質を溶出させた。次いで、SDS-PAGEによ
り、４〜20％の勾配のゲルを通して画分を分析し、M-CIFの存在を確認した。
次いで、M-CIFを含むそれらの画分をプールし、その後、10mMの酢酸ナトリウ
ム（pH6.5）を４容量添加した。次いで、希釈されたサンプルを、以前に準備し
た、強アニオン交換樹脂（Poros HQ-50、Perseptive Biosystems）および弱アニ
オン交換樹脂（Poros CM-20、Perceptive Biosystems）のタンデムカラムの組に
ロードした。これらのカラムを、50mMの酢酸ナトリウム（pH6.5）で平衡化した
。CM-20カラムを、0.2MのNaCl、50mMの酢酸ナトリウム（pH6.5）の５カラム容量
で洗浄し、そして、0.2MのNaCl、50mMの酢酸ナトリウム（pH6.5）から、1.0MのN
aCl、50mMの酢酸ナトリウム（pH6.5）の範囲の10カラム容量線形勾配を用いて、
溶
出した。溶出液をA280で常にモニターしながら、画分を収集した。その後、対象
のタンパク質を含むそれらの画分（４〜20％のSDS-PAGEにより判定）をプールし
た。
次いで、M-CIFを含む合わせた画分を、100mMのNaCl、50mMの酢酸ナトリウム（
pH6.5）で平衡化したサイジング排除カラム（sizing exclusion column）（Supe
rdex-75、Pharmacia）にロードした。サンプルをカラム内に流した後、100mMのN
aCl、50mMの酢酸ナトリウム（pH6.5）を用いて、ゲル濾過マトリックスからタン
パク質を溶出させた。画分を収集し、溶出液の280nMでの吸光度を連続的にモニ
ターした。次いで、A280に、溶出された材料を含むとして同定された画分を、SD
S-PAGEにより分析した。次いで、M-CIFを含むそれらの画分をプールした。
上記の３工程精製手順の後、結果として得られたM-CIFの純度は、SDS-PAGEゲ
ルのクマシーブルー染色からの判定では、95%よりも高かった。また、精製タン
パク質を、エンドトキシン/LPSの混入についてテストした。LALアッセイによれ
ば、LPS含有量は、精製タンパク質1mg当たり0.1ng未満であった。
大腸菌からのM-CIFの精製
精製は以下の工程を含み、特に明記しない限り、すべての手順は４〜10℃で行
なった。
大腸菌発酵の生成段階が終了すると、細胞培養物を４〜10℃に冷却し、15,000
rpmでの連続的な遠心分離（Heraeus Sepatech）により、細胞を採取した。細胞
ペーストの単位重量当たりの期待されるタンパク質収率と、必要とされる精製タ
ンパク質の量とに基づいて、適切な量（重量）の細胞ペーストを、100mMのトリ
ス、50mMのEDTA（pH7.4）を含む緩衝溶液に懸濁させた。高剪断ミキサーを用い
て細胞を分散させ、均質な溶液にした。
次いで、この溶液をミクロ流動化装置（Microfluidics，Corp.またはAPV Gaul
in，Inc.）に4000〜6000psiで２回通過させることにより、細胞を可溶化した。
次いで、ホモジネートをNaCl溶液と混合して最終濃度を0.5MのNaClとし、その後
、7000gで15分間遠心分離を行なった。結果として得られたペレットを、再び0.5
MのNaCl、100mMのトリス、500mMのEDTA（pH7.4）を用いて洗浄した。
洗浄した封入体を、1.5Mの塩酸グアニジン（GuHCl）で２〜４時間可溶化した。7
000gの15分間の遠心分離の後、ペレットを捨て、M-CIFを含む上澄みを４℃で一
晩置いて、さらなるGuHClの抽出を行なった。
高速遠心分離（30000g）により不溶性粒子を除去した後、GuHCl抽出物を、50m
Mのナトリウム（pH4.5）、150mMのNaCl、2mMのEDTAを含む緩衝液20容量と、激し
く攪拌しながら素早く混合することにより、GuHCl可溶化タンパク質を、再折り
畳みした（refold）。再折り畳みされた希釈タンパク質溶液を、さらなる精製工
程前の12時間、混ぜることなく４℃に維持した。
再折り畳みされたM-CIFの溶液を澄明化するために、40mMの酢酸ナトリウム（p
H6.0）で平衡化した、適切な表面積を有する0.16umの膜フィルタを備えた、以前
に準備された接線濾過ユニット（Filtron）を用いた。濾過されたサンプルを、p
oros HS-50カチオン交換樹脂（Perseptive Biosystems）にロードした。カラム
を、40mMの酢酸ナトリウム（pH6.0）で洗浄し、250mM、500mM、1000mM、および1
500mMのNaClを含む同じ緩衝液で、段階的に溶出した。溶出液の280nmでの吸光度
を、連続的にモニターした。画分を収集し、SDS-PAGEによりさらに分析した。
次いで、所望のタンパク質を含むそれらの画分をプールして、水４容量と混合
した。その後、希釈されたサンプルを、以前に準備した、強アニオン交換樹脂（
Poros HQ-50、Perseptive Biosystems）および弱アニオン交換樹脂（Poros CM-2
0、Perseptive Biosystems）のタンデムカラムの組にロードした。これらのカラ
ムを、40mMの酢酸ナトリウム（pH6.0）で平衡化した。両方のカラムを、40mMの
酢酸ナトリウム（pH6.0）、200mMのNaClで洗浄した。次いで、0.2MのNaCl、50mM
の酢酸ナトリウム（pH6.0）から、1.0MのNaCl、50mMの酢酸ナトリウム（pH6.5）
の範囲の10カラム容量線形勾配を用いて、CM-20カラムを溶出した。溶出液をA28
0で常にモニタしながら、画分を収集した。次いで、対象のタンパク質を含むそ
れらの画分（16％のSDS-PAGEにより判定）をプールした。
上記の再折り畳み工程および精製工程の後、結果として得られたM-CIFの純度
は、95％よりも高かった。5ugの精製タンパク質をロードした場合、クマシーブ
ルーに染色された16％のSDS-PAGEゲルからは、主要な混入物バンドは観察されな
かった。また、精製タンパク質を、エンドトキシン/LPSの混入についてテストし
た。
LALアッセイによれば、LPS含有量は、0.1ng/ml未満であった。
実施例２５
M-CIFは、ヒトおよびマウス細胞のM-CSF-刺激コロニー形成を用量依存様式で阻
害する。
前駆体細胞を、本明細書に記載のように単離および処理する。マウス骨髄細胞
を、大腿骨および頚骨から単離し、フィコール分離し、そして塑性接着細胞を枯
渇させた。両方の細胞集団を、示された濃度でM-CIFとともにまたはなしで、M-C
SF(５ng/ml)の存在下、培地を含む寒天中にプレートする。データは、二重にな
されたサンプルからの、コロニー数+/-S.D.の平均数として表される。
マウス骨髄細胞におけるクローン原性アッセイ。CFU-Mコロニー形成アッセイ
を、２層寒天培養システム中で実施する。下層を、20% FBS(Sigma Tissue Cultu
re Products，St．Louis，MO)、0.5% Difco寒天、および15ng/mlのM-CSFを補填
した1mlのMEM培地で、3.5cm直径の組織培養皿中に、示された濃度のM-CIFまたは
コントロールβ-ファミリーケモカインの存在下または非存在下で調製する。次
いでこの層を、0.3％の寒天を含み、かつサイトカインを含まないことを除いて
は上記の寒天培地中に調製したマウス骨髄細胞懸濁液(104細胞/皿)の0.5mlで重
層する。次いで、この皿を、７日間、組織培養インキュベーター中でインキュベ
ートし(37℃、88％N2、５％CO2、および７％O2)、そしてCFU-Mコロニーを倒立顕
微鏡下で計数する。
ヒトCD34'由来細胞におけるクローン原性アッセイ。新たに精製したCD34'細胞
(５×104細胞/ml)を、４日間、ヒトIL-3(10ng/ml)およびヒトSCF(50ng/ml)を補
填したMyelocult H5100増殖培地(Stem Cell Technologies Inc.，Vancouver，Ca
nada)中で培養する。関係する造血前駆体の得られる集団を計数し、そして１ml
のMethoCult培地(Stem Cell Technologies Inc.，Vancouver，BC，Canada)中の1
,000の細胞を、M-CSF(10ng/ml)を補填した3.5cm直径の組織培養皿中に、示され
た濃度のM-CIFまたはコントロールβ-ファミリーケモカインの存在下または非存
在下でプレートする。インキュベータ(37℃、88％N2、５％CO2、および７％O2)
の14日後、コロニー数を倒立顕微鏡下で計数する。
実施例２６
モルモットにおける外科的に誘導されたモデル変形性関節炎におけるM-CIFの評
価
M-CIFが変形性関節炎(OA)の発症および進行を遅延することを示すために、Har
tleyモルモットにおける外科的に誘導されたモデルのOAを用いる。実験的OAにお
けるモルモットの使用は、OAの良く特徴付けられた、適切なかつ再現性あるモデ
ルである。この系統は、加齢とともに自発性変形性関節炎を発症することが示さ
れている。外科的に誘導した関節の不安定性は、膝関節に改変された生体機械学
的負荷を生成しOAに至る。このモデルで観察される病理学的変化は、ヒトOAで観
察されるそれと類似している(Meacock，S.C.ら、J．Exp．Pathol．71(2):279-93
(1990)、Bendele，A.M.ら、Vet Pathol．28:207-215(1991)、Jimenez，P.A.ら、
Inflam．Res．44(2):129-130(1995))。
手術は、ケタミン(40mg/kg)、キシラジン(5mg/kg)、フェンタニル(0.06mg/kg)
で、そして手術後はブプレノルフィン(0.05mg/kg)で皮下麻酔した、８週齢の雄
のHartleyモルモット(n=5)に対して実施される。手術前、モルモットを、12時間
の間、断食させる。動物を皮膚消毒、手術、および手術後の間、加熱パッド上に
維持する。切除は、#10ブレードを用い右膝の関節皮膜を通じてなされる。内側
半月上の筋膜を解剖し、そして内側側副靱帯および内側切開を開創する。前方内
側半月を、Tyrel微解剖フックで単離し、そして前方部分を#15ブレードで切除す
る。関節皮膜を連続5-0 Vicryltで縫合する。２つの巻回クリップを用いて皮膚
を閉じ、次いで手術後４日目に取り除く。動物の体重を、実験の初期およびその
後２週間毎に測定する。
M-CIFおよび偽薬を、手術の日から開始して６週間の間毎日投与(i.p.)する。
用いたのは：非処置コントロール、偽薬群およびM-CIF処置群である。Ｘ線撮影
を、研究の終わり安楽死の前に行う。実験の終わりに、すべての動物を、過剰用
量のペントバルビタールナトリウム(300mg/kg)で安楽死させる。膝関節を回収し
、10％ホルマリン中で４日間固定し、そしてPBS(pH7.2)中の20％ギ酸中で４日間
脱カルシウム処理する。５つの間隔で切片を切断し、そしてサフラニンＯ、フ
ァストグリーンおよびヘマトキシリンで染色する。
組織学的評価を、Mankin計数システム(Mankin H.J.，Orth．Cl1n．North Amer
ica 2:19-30(1971))を用いて実施する。
実施例２７
ラットにおける肉芽腫性腸炎のペプチドグリカン-多糖類ポリマーモデルにおけ
るM-CIFの評価
M-CIFが、肉芽腫性腸炎の発症および進行を遅延し得ることを示すために、Lew
isラットにおいて外科的に誘導された腸炎のモデルを用いる。実験的腸炎におけ
るLewisラットの使用は、良く特徴付けられた、適切かつ再現性ある腸炎モデル
である。ラットのLewis系統は、回腸遠位部、パイエル板、盲腸および結腸遠位
部の種々の領域において、ペプチドグリカン-多糖類(PG-PS)の移植後、腸炎にに
なることが示されている。外科的に移植されたPG-PSは、１-２日にピークとなり
、７-９日間鎮静期にあり、そして12-17日までに自然に再活性化し４ケ月までの
間存続し得る活性炎症をともなう急性腸炎を生成する(Elsonら、Gastroenteol．
109:1344-1367(1995))。慢性炎症の発症は、Ｔ細胞媒介免疫応答、PG-PSの乏し
い分解性、および遺伝的宿主感受性に依存する(Sartorら、Methods:A Companion
to Methods in Enzymology 9:233-247(1996))。このモデルで観察される免疫応
答は、ヒト腸炎で観察されるそれと類似しいてる。
手術は、ケタミン(40mg/kg)、キシラジン(5mg/kg)、フェンタニル(0.06mg/kg)
で、そして手術後はブプレノルフィン(0.05mg/kg)で皮下麻酔した、130-170gのL
ewisラット(n=10)に対して実施される。動物を、皮膚消毒、手術および手術後の
間、加熱パッド上に維持する。６-８cmの切除を、#10ブレードを用い腹を通って
作成し、回腸、盲腸および結腸をむき出す。ラットに、PG-APS(45mg乾燥重量お
よび15mgラムノース/g体重)で壁内(漿膜下)に注入する。各部位に、0.05ｍｌ(総
用量の1/10)を、回盲弁の近位方向２および４cm近傍、２つの遠位のパイエル板
、４つの盲腸中央部位、盲腸先端部のリンパ系凝集体に注入し、そして手術後４
日目に取り出す。動物の体重を、実験の初期およびその後５日毎に測定する。炎
症の程度を、足根関節の腫れの程度の形態学的スコアリングにより評価する。
足根関節のサイズは、腸における炎症の存在の信頼し得る指標であることが示さ
れている。
M-CIFおよび偽薬を、手術の日から開始して４週間の間毎日(i.p.)投与する。
非処置コントロール、偽薬群およびM-CIF群が存在する。
安楽死の２時間前にラットに、BrdU(100mg/kg i.p.)を注射する。実験の終わ
りに、すべての動物を、CO2窒息を用いて殺す。サンプルを、遠位回腸、盲腸お
よび遠位結腸からとり、そして10％ホルマリン中で固定する。切片を切断し、そ
してH & E、トリクロム、および抗-BrdU抗体で染色する。組織学的評価を、Sart
or計数システム(Sartorら、Methods:A Companion to Methods in Enzymology 9:
233-247(1996))を用いて実施する。
実施例２８
5-Fu処置の間のMPIF-1処置は、血小板および顆粒球のより速い回復を生じる。
化学的治療法から得られる２つの主要な合併症は、好中球減少症(減少した血
中好中球カウント)および血小板減少症(減少した血小板カウント)である。顆粒
球-コロニー刺激因子(G-CSF)は、現在、好中球減少症を緩和するために臨床で用
いられている。G-CSFは、インビトロでコロニー形成性単位-顆粒球(CFU-G)によ
るコロニー形成を刺激し、そして動物モデルにおいて顆粒球産生を刺激すること
が知られている。トロンボポエチン(Tpo)は、血小板減少症を軽減する目的のた
めに臨床試行にある。Tpoは、インビトロでコロニー形成性単位-巨核球(CFU-Meg
)によるコロニー形成を刺激し、そして動物中で実験的に誘導された血小板減少
症において血小板産生を刺激することが知られている。臨床におけるG-CSFの主
要な制限の１つは、それは、化学的治療法の複数サイクルを受けている患者にお
ける好中球減少症を軽減するには有効ではことである。これは、G-CSFが作用す
る、骨髄、標的細胞中のG-CSFの枯渇に起因するらしい。Tpoもまた、初期の臨床
試行結果により示されるのと同じ運命を受け得る。化学的治療法の間に、G-CSF
およびTpo標的細胞の枯渇を防ぎ得る任意の薬剤は、大きな臨床的価値を有し得
る。以下に示すデータは、MPIF-1がこの臨床必要性を満たし得ることを示唆する
。
先の実施例において、MPIF-1が、インビトロで、両能性の、顆粒球/単球骨髄
前駆体により、コロニー形成を阻害することが示されている。特に、実施例１５
-１６は、MPIF-1が、初期の、多能骨髄前駆体を、５-Fu誘導イントロおよびイン
ビボ細胞障害性から保護することを示すデータを提供する。これらの多能前駆体
は、CFU-GおよびCFU-Megを含むすべての骨髄系統のより関係する前駆体になると
期待される。以下の実験は、５-Fu処置の２または３サイクルの間のMPIF-1処置
が、血小板および顆粒球のより速い回復を生じることを示すために実施された。
材料および方法：平均体重19.4g(±1.1 S.D.、n=150)のC57BL6雌マウス(７-10週
齢)を用いた。すべてのマウスを、実験の経過を通じて、標準的な食餌ならびに
暗/光サイクルおよび温度の飼育条件下で飼育した。MPIF-1調製物(HG00304-E6)
をE.coli中で作成し、そして成熟タンパク質の23のＮ末端アミノ酸を欠くMPIF-1
の短縮型(すなわち、図２５中のMPIF-1 Mutant-3であって、それにＮ末端Met
mgen Center，Thousand Oaks，CA 91320により製造されている)。５-フルオロウ
ラシル(５-Fu)は、Sigma Chemicalから購入し、そしてそれは使用直前に温水中
に溶解することにより用時調製された。MPIF-1溶液は、通常の生理食塩水中に希
釈することにより新たに調製された。同様に、G-CSFは、10mM酢酸ナトリウム、
５％(wt/v)マンニトール、0.004％(v/v)Tween80、pH4.0からなる緩衝液中に希釈
した。マウスCD41a、Gra.1、およびMac.1抗原に対する、適切な蛍光色素を結合
したラットモノクローナル抗体を、Pharmingenから購入した。
５つの群のマウス（１群あたり30匹のマウス）を以下のように処理した：
グループ１は、通常のコントロールとして供するために−２、−１、０、６、
７、および８日に通常の生理食塩水0.1mlをI.P.注射した。
グループ２は、０および８日に、５-Fu溶液の0.2mlを(100mg/kg体重で)I.P.注
射した。
グループ３は、グループ２におけるように５-Fuを注射し、そしてさらに−２
、−１、０、６、７、および８日にMPIF-1溶液の0.1mlを(1.0mg/kg体重で)I.P.
注射した。
グループ４は、グループ２におけるように５-Fuを注射し、そしてさらに１、
２、３、９、１０、および１１日にG-CSF溶液の0.1mlを(0.5mg/kg体重で)I.P.注
射した。
グループ５は、グループ２におけるように５-Fuを、グループ３におけるよう
にMPIF-1を、そしてグループ４におけるようにG-CSFを注射した。
次いで、各群の各々からの６匹の動物を、示された日に、末梢血および骨髄の
レベルで血小板および顆粒球回復をモニターするために分析した。最初の５-Fu
後６および８日目に分析されたマウスは、MPIF-1または５-Fuを用いた第２番目
の処置を受けていなかったことに注目すべきである。
末梢血は、後方眼窩洞からEDTAでコートされたチューブに採集され、そして直
ちにFACS Vantageにより分析し、血小板(CD41a陽性事象)および顆粒球(Gra.1お
よびMac.1二重陽性細胞)カウントを測定した。ここで採用された分析方法および
動物種は、絶対的なカウントを得ることを可能にしないことに注意すべきである
。その代わりに、顆粒球は、総白血球細胞のパーセンテージとして表され、そし
て血小板は、ソーター上15秒あたりのCD41a陽性事象として評価された。次いで
マウスを屠殺し、標準的な方法を用いて骨髄細胞を得た。骨髄細胞はまた、FACS
により分析し、骨髄中のGra.1およびMac.1二重陽性細胞集団のパーセンテージを
モニターした。顆粒球系統中で、これらの抗原が発現され始めるステージは正確
には知られていないので、骨髄中のGra.1およびMac.1二重陽性細胞は、それらの
発達および成熟能力のステージに関して不均質であると期待される。
骨髄はまた、インビトロクローン原性アッセイを用いてクローン原性前駆体の
頻度を測定するために分析された。簡単に述べれば、高増殖能コロニー形成性細
胞(HPP-CFC)および低増殖能コロニー形成性細胞(LPP-CFC)アッセイを、２層寒天
培養系中で実施した。下層を、20％ FBS、0.5％ Difco寒天、7.5ng/ml mIL-3、7
5ng/ml mSCF、7.5ng/ml hM-CSFおよび15ng/mlのmIL-1αを補填した１mlのMEM培
地で、3.5cm直径の組織培養皿中に調製した。次いでこの層を、20％FBSおよび0.
3％の寒天を含むMEM中の2,000細胞/皿を有するマウス骨髄細胞懸濁液の0.5mlで
重層した。上層寒天は、室温で約15分間固化させた。次いで、この皿を、１４日
間、組織培養インキュベーター中でインキュベートし(37℃、88％N2、５％C
O2、および７％O2)、そしてコロニーを倒立顕微鏡下で計数した。この実験では
、総コロニーカウントを報告する。
FACSデータを、時点あたり各群の３匹の動物から得た材料を分析することによ
り生成し、その一方、クローン原性アッセイを、時点あたり各群から６匹の動物
から得た細胞を用いて実施した。最後に、１日目の群の実験に対するデータ点は
、生理食塩水を注射した通常マウス(グループ１)から得た値を表す。
結果：末梢血における血小板の回復をモニターするために、CD41a陽性細胞の定
常状態レベルを、FACS Vantageにより測定した。図５１に示されるように、５-F
uの前のMPIF-1処置(グループ３)は、５-Fu＋生理食塩水で処理されたマウス(グ
ループ２)において観察されたそれよりも、かなり速くかつ強い血小板の回復を
生じた。予期されるように、G-CSFで処理されたマウス(グループ４)における血
小板回復の動力学は、５-F＋生理食塩水処理マウスで観察されたそれと区別し得
なかった。また、５-Fu処置マウスにG-CSFプラスMPIF-１を投与することは(グル
ープ５)、MPIF-1単独で処理されたマウス(グループ３)中で観察されたそれと比
較したとき、血小板の全体の定常状態レベルに対してほとんど影響を有さなかっ
た。従って、５-Fu処置の前のマウスのMPIF前処理は、末梢血における血小板の
急速な回復を生じた。
末梢血における顆粒球の回復を、血液中のGra.1およびMac.1二重陽性細胞の定
常状態レベルを定量することによりモニターした。図５２に例示されるように、
マウスの５-Fu処置は、第１のおよび第２の５-Fu処置後６日目に血中のGra.1お
よびMac.1二重陽性細胞の定常状態において鋭い減少を生じた。MPIF-1前処理は
、２つの有益な効果を有していた；５-Fu＋生理食塩水で処理したマウス(グルー
プ2)において観察されたそれに比較して、好中球減少症の程度(Gra.1およびMac.
1二重陽性細胞の枯渇の程度)がかなり小さく、かつ回復速度がかなり速かった。
予期されるように、５-Fu処理後のG-CSFの投与(グループ４)は、血液中のGra.1
およびMac.1二重陽性細胞の迅速な回復を生じた。しかし、G-CSF処理されたマウ
スにおける好中球減少症からの回復の程度は、８日目にMPIF-1処理されたマウス
(グループ３)において観察されたそれより著しく小さかった。顆粒球枯渇および
回復に対するMPIF-1プラスG-CSFを投与する(グループ５)ことの効果は、これら
のマウスが、MPIF-1またはG-CSFいずれか単独で処理されたマウス中で観察され
たそれより血液中のGra.1およびMac.1二重陽性細胞のかなり高い定常状態レベル
を示したという点で極めて劇的であった。従って、図５２に示されるように、MP
IF-1およびG-CSFは、それらが同時投与されるとき、付加的な効果を奏し得るよ
うである。
上記で示されたように、骨髄レベルでの回復が、FACS Vantage法およびクロー
ン原性アッセイによりモニターされた。FACSで得た結果を図５３に示す。予期さ
れるように、５-Fu処理骨髄(グループ２)中のGra.1およびMac.1二重陽性細胞集
団のレベルは、６日から１４日を通じて顕著に低下したままで、次いで１６日ま
でに通常レベルに回復した。このGra.1およびMac.1二重陽性細胞の５-Fu介在枯
渇の影響は、マウスが、５-Fu前にMPIF-1処理されたとき(グループ３)、完全に
廃止された。驚くべきことに、G-CSF(グループ４)は、最初の５-Fu用量に応答し
て、Gra.1およびMac.1二重陽性細胞の枯渇を防ぎ得たが、第２のそれに対しては
防ぎ得なかった。これは、G-CSF標的細胞の利用可能性およびG-CSF投与のタイミ
ングに起因し得るようである。同様の応答が、最初の５-Fu後８日目に回復の程
度はMPIF-1またはG-CSFいずれか単独で処理したマウス中で観察されたそれより
かなり高かったが、MPIF-1プラスG-CSFで処理されたマウス(グループ５)で明ら
かであった。
クローン原性アッセイからのデータを図５４に示す。骨髄における前駆体の頻
度は、１６日目の暗示をともなって実験期間の１４日を通じて５-Fuに応答して
低下したままであった。前駆体の頻度におけるこの減少は、５-Fuの前にMPIF-1
で処理されたマウス中で廃止された。対照的に、マウスのG-CSF処理は、通常ま
たはMPIF-1処置骨髄のいずれかにおいて見出される前駆体の頻度を持続すること
において有効ではなかった。骨髄中の前駆体頻度に対するG-CSFプラスMPIF-1を
投与することの影響は複雑なようである。
実施例２９
rhM-CIF処理によるMRL lpr/lprマウスにおけるループス腎炎の改善
全身性エリテマトーデス(SLE)は、病原性自己抗体の過剰生産、および生命を
脅かす糸球体腎炎および脈管炎を誘導し得る補体固定免疫凝集物の形成により特
徴付けられる多器官関連自己免疫疾患である(Steinberg，A.D.およびKlinman，D
.M.、Rheum.Dis．Clinlcs of No．Amer．14:25(1988))。
MRL lpr/lprマウスは、アポトーシスfasレセプター中の変異に起因して(Watan
abe-Fukunaga，Rら、Nature 356:314-317(1992))、血清学的および免疫病理学的
にヒトSLEに重要な類似性を有する自己免疫疾患を自然進行する(Andrews，B.S.
ら、J．Exp．Med．148:1198(1978))。このマウスモデルの発展した特徴付けは、
種々の自己抗原に対する高抗体力価、糸球体腎炎、関節炎、脈管炎および未成熟
死を含むヒト狼瘡の病因学に多くの洞察を提供した(Theofilopoulos，A.N.およ
びDixon，F.J.、Immunol．Rev．55:179(1981);Tarkowski，A.ら、Clin．Exp．Im
munol．72:91(1988))。
MRL lpr/lprマウス中では、異常マクロファージならびにその他の細胞および
分子欠陥が自己免疫疾患の病因に関与している(Cohen，P.L.およびEisenberg，R
.A.、Annu．Rev．Immunol．9:243-269(1991))。MRL lpr/lprマウスは、通常マウ
スからのマクロファージより活性化されたステージにある腹膜マクロファージの
増加した数を有している(Kelly，V.E.およびRoths，J.B.、J．Immunol．129:923
(1982);Dang-Vu，A.P.ら、J.Immunol．138:1757(1987))。さらに、MRL lpr/lpr
マクロファージは、IL-lおよびTNF-αのような前炎症性(proinflammatory)サイ
トカインのより高いレベルを生産する。マクロファージは、通常の腎糸球にはま
まれにしか存在しないが、タンパク尿の前のMRL lpr/lpr糸球体に見出され得、
そして糸球体腎炎が進行するにつれより優勢になる(Boswell，J.M.ら、J．Immun
ol．141:3050(1988))。
新規β-ケモカインであるrhM-CIFは、弱い走化性活性を有し、そしてそれが、
MIP-1αおよびRANTESで共有されるレセプターを介する単球細胞内Ca+フラックス
を誘導することを除いて大部分の白血球に対して不活性である(Shulz-Knappe，P
.ら、J．Exp．Med．183:295(1996))。さらに、rhM-CIFは、M-CSFで誘導される前
単球のコロニー形成に対して強い選択的阻害効果を有している(Kreider，B.L.ら
、「M-CSFに仲介されるコロニー形成を特異的に阻害するβ-ファミリーケモカイ
ン」International Cytokine SocietyとInternational Society for Interferon
and Cytokine Research(1996)との第１回合同ミーティングにおける口頭発表)
。本発明者らの初期のインビボ実験は、rhM-CIFが、LPS-または生存E.coli細菌
誘導マクロファージ介在致死的敗血症に対して顕著な保護効果を有し、それは、
マウスにおいては、少なくとも部分的には、TNFαの減少およびIL-10血清レベル
の増加に起因する(Zhang，Jら、「rhM-CIF(HCC-1)によるTNF-αおよびIL-10の選
択的調整は、SCIDマウスにおけるLPS介在致死的敗血症に対するその保護効果と
関連する」The Role of Chemokines in Leukocyte Trafficking and Disease（1
997）Keystoneシンポジウムにおける口頭およびポスタープレゼンテーション)。
中程度および進行性関節傷害に対するrhM-CIFの顕著な軽減効果もまた、マウス
コラーゲン誘導関節炎およびラットアジュバント関節炎モデルの両方で観察され
ている(Zhang,J.ら、「アジュバント関節炎のラットモデルにおけるrhM-CIF(HCC
-1)による進行性関節破壊の保護」ILAR Congress of Rheumatology(1997)におけ
るポスタープレゼンテーション；Sturm，B.ら、「マウスにおけるコラーゲン誘
導関節炎に対するrhM-CIF(HCC-1)の軽減効果」第61回National Meeting of Amer
ican College of Rheumatology(1997)に提出されたアブストラクト)。
本発明の研究で、本発明者らは、MRL lpr/lprマウスにおけるこの自発性狼瘡
モデルに対するrhM-CIFの可能な効果を調査した。ループス腎炎進行の全経過に
対するrhM-CIFを用いた予防的処置は、糸球体傷害および腎硬化症を有意に軽減
し、そしてタンパク質円柱形成を減少することにより腎臓機能を保護し得た。rh
M-CIFまたはメトトレキセートのいずれも、おそらく、腎臓以外の他の器官にお
ける疾患の重篤性の結果として、未成熟死に対して有意な効果を有していなかっ
た。
材料および方法
動物
雌のMRL lpr/lprマウスを、The Jackson Laboratory(Bar Harbor、ME)から購
入し、そして実験に採用される前少なくとも１週間の間、HGSの動物施設で推奨
された標準に従って維持した。
化学薬品
アメトプテリン(メトトレキセート)は、Sigma Chemicals(St．Louis、MO)から
購入した。生理食塩水は、Abbott Labs(North Chicago、IL)から購入した。組換
えヒトM-CIF(バッチB9)を、バキュロウイルスベクター中で発現し、そしてSDS-P
AGEにより、8.677Kdの分子量を有して精製された。次いでこのタンパク質を、40
mM NaOAc、150mM NaCl、pH5.5からなる緩衝液中に、0.2EU/mgより少ないエンド
トキシンレベルで溶解した。
実験デザイン
１群あたり8-9の、50匹のMRL lpr/lprマウスに、緩衝液中のrhM-CIFまたは生
理食塩水中のメトトレキセート(１または5mg/kg、i.p.)を毎日、月曜から金曜ま
で、疾患の兆候がない場合８週齢で最初の14週について毎週投与した。緩衝液ま
たは生理食塩水を受けるマウスを疾患コントロールとして供した。動物を、臨床
症状および病的状態について、毎週または２週間に一度、緩衝液処置群で50％の
致死率に到達するまでモニターした。残存する動物のすべてを、腎臓の組織病理
学的評価のために実験の終わりに屠殺した。
組織病理学的分析
両方の腎臓を取り出し、そして直ちに、パラフィン包埋および切片化の手順の
ために10％中性緩衝過ホルマリン中に置いた。組織切片は、ヘマトキシリンおよ
びエオシン、および包括的検査のためにはPASおよびトリクロムを用いて染色し
た。腎臓傷害の病理学的評価は、多ブラインド(multi-blinded)手順を用いて行
った。すべてのスライドを観察した後の一般的印象に従って、以下の組織病理学
的特徴に０、+/-、+、++、+++、++++を与えることにより変化の程度および分布
の鑑別を可能にする主観的スコアリングシステムを採用した：
1）不規則な過剰細胞充実性および拡張、基底膜厚化、核崩壊、線維症および
ヒアリン質化、半月形成およびボーマン嚢の線維症のような糸球体傷害；
2）細管の管腔中のタンパク質円柱の形成(傷害の重篤度の評価の便宜のために
、
たとえ、タンパク質円柱形成がまた、糸球体毛細管ふさ状分岐の基底膜の増加し
た透過性に寄与したとしても、ここでそれを分類した)および実質的萎縮症およ
び補償的肥大および細管拡張を含む管傷害；
3）炎症性浸潤、リンパ脈管周囲炎、間隙線維症を含む間隙傷害；
4）顆粒状腎硬化症のような肉眼外観。
以下のスコアリングシステムを用いることにより半定量化分析を行った：
０＝０；+/-＝１；+＝２；++＝４；+++＝６；および++++＝８。
個々の組織病理学的評価の終了に際し、スライドを解読し、そして処置のレジ
メに関する病理学的変化の解釈について各群に適合させる。
マクロファージ免疫組織化学的分析
MRL lpr/Ipr腎臓からのパラフィンセクションを、マウス(F4/80)マクロファー
ジ抗原(Caltag Labs，San Francisco，CA)に対して特異的なラットモノクローナ
ル抗体、次いで標準的な免疫組織化学的技術を用いることによりマクロファージ
について染色した。腎臓中のマクロファージ浸潤の程度を評価するための規準は
、上記で述べた(０〜++++)に類似であった。
統計学的分析
生存したマウスのパーセントを、生存マウスの数／総マウス×100％として計
算した。組織病理学的データの分析を、実験の終わりに４匹ほどの生存マウスの
群についてのみ行った。平均スコア、SEMおよびP値を、種々の病理学的特性につ
いて、InStat統計学的ソフトウェアによって個々にまたは組合せで計算した。
結果
MRL lpr/lprマウスの生存におけるrhM-CIFの効果
rhM-CIFのBllの一群が疲労したときに、自発性自己免疫MRL lpr/lprマウスを
緩衝液または生理食塩水中のメトトレキセートで、各週毎日月曜日〜金曜日、14
週間処置した。疾患発達コントロールとして使用した緩衝液処置群と比較して、
実験の終了時に緩衝液処置群は56％致死に達したが、rhM-CIF 1mg/kg処置群では
63％の生存率であったことを除いて、rhM-CIF処置は、16週実験期間の間、同様
の生存率を示した（図55）。rhM-CIF処置と同様に、低用量のメトトレキセート
（1mg/kg）で処置した群は、約20％の防御がある場合、実験の最終週まで生理食
塩水コントロール群と並行したパターンを示した。しかし、高用量のメトトレキ
セート（5mg/kg）で処置した群は死亡率の増加を示し（図56）、これはおそらく
その増加した毒性による。
rhM-CIF処置によるMRL lpr/lpr腎臓におけるタンパク質円柱の減少
組織病理学的評価により測定した場合のタンパク質円柱情報は、腎機能を評価
するためのタンパク尿の代替的測定として選択した。３群（緩衝液、１mg/kgのr
h-M-CIF、およびメトトレキセート）のみが、続く組織学的分析のために定量し
た場合、このパイロット実験の終了時に４匹のマウスを生存させた。図57に示す
ように、緩衝液コントロール群は、MRL lpr/lpr腎臓のヘンレわな、遠位曲尿細
管、集合管、および尿細管腔における、大量のタンパク質および細胞性円柱を明
らかにした。対照的に、rhM-CIF(１mg/kg)処置マウスにおいては少量のタンパク
質円柱のみが見い出された；そしてメトトレキセート(１mg/kg)群の１匹のマウ
スが、重篤なタンパク質円柱形成を示したが、他の３匹のマウスは、総合的にこ
の病理学的特性を有さないままであった。rhM-CIFによるタンパク質円柱の形成
の減少は、緩衝液群と比較した場合、統計学的に有意（p=0.02）である。
糸球体障害におけるrhM-CIFの改善効果
糸球体障害、特に糸球体毛細管ふさ状分岐および基底膜の障害は、このループ
スモデルにおいて見られる本質的な特徴である。緩衝液コントロール群の生存動
物の半数（２匹のマウス）は、明らかな糸球体のほとんど全てにおいてかなり重
篤な損傷を示し、これは、ボーマン嚢におけるマクロファージの過剰増殖および
半月過剰形成；PAS染色により示されるふさ状分岐での糸球体間質細胞増殖；核
破損に起因する核崩壊；「ワイヤ−ループ障害」を生じる基底膜の肥厚化；赤血
球のボーマン嚢への漏洩；および線維症および/または硝子質化により示される
。さらに、完全なまたは部分的な糸球体機能不全が、皮質領域において非常に広
が
る。半月形成、壁側板と臓側板との接着、およびボーマン嚢の線維症は、割合の
点から糸球体障害と同程度に重篤であった。この群における他の２匹のマウスは
、かなり低い重篤障害を示した。対照的に、rhM-CIF（１mg/kg）で処置した生存
マウスのほとんど（3/5）は、緩衝液コントロールの約50％重篤度を示し、他（2
/5）は非常に緩和な損傷を示したか、または明らかな糸球体障害を示さなかった
。メトトレキセート処置のほとんどの生存マウス（3/4）でも、１匹の動物のみ
が比較的重篤な糸球体障害を示したことを除いて、同様の緩和な障害が見られた
。rhM-CIF処置マウスにおける糸球体障害の減少は、緩衝液コントロールと比較
して、統計学的に有意（p=0.01）である（図58）。
rhM-CIFは腎硬化症の発達を遅延した
ループス糸球体腎炎の進行性でありかつ長く不変な過程は、糸球体および細管
の病巣萎縮および代償性肥大に起因して、最終的に腎硬化症を導く。この後期の
特徴は、緩衝液コントロールで処置した４匹のマウスのうちの２匹において重篤
であり、そしてそれらの腎臓の表面は、ざらざらした革（grained leather）に
類似する点状瘢痕を示した。他の２匹のマウスは、このような進行した変化を示
さなかった。対して、rhM-CIF処置群におけるマウスはいずれも、管のより穏や
かな萎縮が時々観察されたことを除いて、明らかな腎硬化症を示さなかった。さ
らに、メトトレキセート群（n=4）の１匹のマウスのみが、進行した状態の硬化
的特徴を発達し、他の３匹のマウスは腎硬化症を発達しないままであった。統計
学的分析は、緩衝液コントロールにおける腎硬化症の重篤度がrhM-CIFおよびメ
トトレキセート処置群の腎硬化症よりも有意により高かったことを示す（図59）
。
rhM-CIFはMRL lpr/lpr腎臓におけるマクロファージ浸潤を中程度に阻害した
MRL lpr/lpr腎臓におけるマクロファージの存在は、進行性の糸球体腎炎の重
要な徴候である。免疫組織化学的分析は、マクロファージが緩衝液処置マウスの
腎臓を広範囲に浸潤することを示した。この重篤度は、上記のように他の病理学
的特徴と平行した。有意な腎臓障害を有する２匹のマウスは、最も重篤なマクロ
ファージ浸潤を示した。それらは、糸球体周囲領域、ネフロンの間質、および脈
管周囲の浸潤領域において、ボーマン嚢の増殖上皮細胞と混合された糸球体半月
において出現した。この群の他の３匹のマウスは中程度または穏やかなマクロフ
ァージ浸潤を示し、これはまた、それらの障害重篤度と平行であった。しかし、
メトトレキセート処置群由来の穏やかな組織病理学的障害を有する２匹のマウス
は、マクロファージ浸潤の比較的高いスコアを示した。この群における最も重篤
なマウスはまた、最も重篤なマクロファージ浸潤を示した。rhM-CIF群において
、マクロファージの出現は、緩衝液群と比較して、p値は0.08（統計学的に有意
差外である）であったが、中程度に抑制したようである。
MRL lpr/lpr腎臓におけるrhM-CIFのリンパ球浸潤およびリンパ脈管周囲炎にお
ける効果の欠除
腎臓の間隙組織におけるリンパ系細胞の塊状および拡散浸潤は、このMRL lpr/
lprモデルにおいて別の顕著な病理学的特徴である。これらの浸潤は、主に血管
周囲（小葉間動脈のようなより大きな動脈、または弓状動脈でさえ）領域、糸球
体周囲領域、および間質において見られた。間質におけるリンパ系細胞浸潤は、
大量萎縮細管のために、緩衝液コントロールにおいてより重篤であるようである
。しかし、rhM-CIFおよびメトトレキセート処置マウスの糸球体周囲領域におい
て大量の浸潤が見られたが、それらの糸球体障害は非常に穏やかであった。浸潤
の細胞型は種々である。脈管周囲領域（特により大きな動脈の周辺）において、
ほとんどの細胞はリンパ芽球および単核芽細胞であった。浸潤の全体写真は、リ
ンパ系細胞の複数の細胞型を示し、これは拡張したリンパ節において見られる細
胞の分類と同様であった（データ示さず）。緩衝液、rhM-CIF、およびメトトレ
キセート処置群の間の半定量および比較により、脈管周囲および糸球体周囲の明
白な差異は示されなかった（図61）。
考察
このパイロット実験において、実験の終了時に腎臓の組織病理学により評価さ
れたタンパク質円柱形成を、腎機能を評価するためのタンパク尿に対する別の特
徴として選択した。前述の結果は、ループス腎炎の発達過程の間の14週間のrhM-
CIFの予防処置は、タンパク質円柱形成の顕著な減少、ならびに５〜６月齢のMRL
lpr/lpr腎臓における糸球体障害および腎硬化症の改善を生じることを示した。
しかし、rhM-CIFは、腎炎および/または脈管炎誘導早熟死における効果をほとん
どまたは全く示さなかった。
MRL lpr/lprの腎臓糸球体における異常に活性化されたマクロファージの存在
が、ループス腎炎の病原において関連づけられている；そして、腎臓におけるM-
CSFmRNA転写物およびMRL lpr/lprマウスの循環におけるM-CSFタンパク質の増加
したレベルは、マタロファージ浸潤および活性化のためであり得る（Yui，M.A.
ら、Amer．J．Path．139:255（1991））。rhM-CIF処置は、MRL lpr/lpr腎臓にお
いてマクロファージ浸潤の中程度の阻害を示したが、M-CSF媒介腎臓マクロファ
ージ機能におけるrhM-CIFの可能な効果（これは組織破壊を引き起こす）は、明
らかとなっていない。しかし、以前の研究は、rhM-CIFが、（1）M-CSF誘導性前
単球コロニー形成の阻害、（2）LPS誘導性マクロファージ媒介性致死的敗血症の
保護、および（3）インビボでの全身的なTNF-αの下方制御およびIL-10の上方制
御、において効果的であることを示した。これらの全ての結果は、ループス腎炎
におけるrhM-CIFの改善効果についての支持証拠を提供し得る。
腎臓の間質組織におけるリンパ球の大量な浸潤は、ヒトSLEからMRL lpr/lprマ
ウスの特有な病理学的特徴であり、これは任意の免疫または自己免疫応答の間の
リンパ球のクローンの欠失におけるfasレセプター欠失により引き起こされる。M
RL lpr/lpr腎臓でのリンパ球浸潤におけるrhM-CIF効果の欠失は、rhM-CIFがMRLl
pr/lprリンパ球の移動、活性化、およびクローン拡大における阻害効果を有さな
いことを示す。実際、rhM-CIFは、インビトロでの活性化されたTリンパ球につい
て走化性であることが示されている。
要約
前述の研究は、自発性自己免疫疾患の発達の間の、メトトレキセートのような
rhM-CIFの延長した処置は、MRL lpr/lpr腎臓において、タンパク質円柱形成、糸
球体障害、および最終的に腎硬化症を減少することによって、ループス腎炎の
進行を顕著に改善したことを示した。しかし、メトトレキセートのようなrhM-CI
Fは、腎炎および/または血管炎誘導早熟死においてほとんどまたは全く効果を示
さなかった。
前臨床的薬理学の表の要約
以下の表（表4、5、および6）は、インビトロおよびインビボでの一次および
二次薬理学的研究を要約する。
表５、６、および８に参照される一群のための重要な表。MPIF-1の一群を、タン
パク質が発現された生物体および発現産物の形態（例えば、成熟、全長、または
改変体）を示す複数成分コードにより称する。名称の後ろのハイフン後の文字は
、タンパク質が発現された生物体または発現に用いたベクター（すなわち、B=バ
キュロウイルス、C=CHO細胞、E=E．coli）のいずれかを示す。ハイフンの前の最
後の３文字のアラビア数字は、発現されたタンパク質の形態または改変体を示す
（すなわち、300=全長MPIF-1、301=MPIF-1Δ17改変体、302=成熟アミノ酸配列の
アミノ末端に付加されたメチオニン残基を有する成熟MPIF-1、304=MPIF-1Δ23改
変体、311=全長MPIF-1）。従って、一群の名称は、発現MPIF-1タンパク質の形態
タンパタ質が宿主細胞から分泌されるか否か、および分泌タンパク質の形態（分
泌する場合）を示す。例えば、HG00300-B5は、バキュロウイルスベクターを用い
て全長MPIF-1タンパク質が発現されたことを示す。さらに、この系を用いて発現
されるMPIF-1は、昆虫宿主細胞によりプロセスされるので、このタンパク質の分
泌型は、成熟MPIF-1である。
上記の命名法は、一群のHG00300-B7については除外する。この一群は、４つの
異なるMPIF-1ポリペプチドの混合物を含む。本発明者らは、これらのポリペプチ
ドが、精製プロセスの間に生じるMPIF-1のタンパク質分解切断の結果として産生
されたことを考える。一群のHG00300-B7に存在するMPIF-1改変体は、実施例17に
おいて議論する。 実施例30
pHE4-5発現ベクターを用いるMPIF-1Δ23の産生、回収、および精製
MPIF-1は、新規なヒトβ-ケモカインである。MPIF-1の成熟型は、11.2kDaの分
子量を有する99アミノ酸ペプチドとして分泌される。76アミノ酸長の短縮型（MP
IF-1Δ23）はまた、MPIF-1の初期発現研究の間に同定された。バキュロウイルス
発現系において、MPIF-1Δ23を、次いで単離およびサブクローン化した。生物学
的アッセイは、短縮型が、全長対応物よりも活性であることを示す。
クローニングおよび発現
本来、大動脈内皮相補的デオキシリボ核酸ライブラリーから単離されたMPIF-1
Δ23遺伝子を、Nde1およびAsp718の単一の制限酵素切断部位で、発現ベタターpH
E4にサブクローニングし（図62）、そしてK12誘導E．coli SG13009株（Susan Go
ttesman，National Institutes of Health，Bethesda，MDから入手可能）に形質
転換した。pHE4を用いるタンパク質発現に適切な宿主として作用し得るE．coli
のさらなる株には、DH5αおよびW3110（ATCC受託番号27325）が含まれる。pHE4
ベクターは、２つのlacオペレーターを有する強力な合成プロモーターを含む。
このプロモーターからの発現は、lacリプレッサーの存在により調節され、そし
てイソプロピルB-D-チオガラクトピラノシド（IPTG）またはラクトースを用いて
誘導される。プラスミドはまた、効果的なリボソーム結合部位およびMPIF-1Δ23
遺伝子の下流の合成転写ターミネーターを含有する。ベクターはまた、pUCプラ
スミドの複製領域および形質転換細菌中でカナマイシン耐性を生じるネオマイシ
ンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を含有する。
製造方法
発酵プロセスの概要
MPIF-1Δ23の発酵プロセスを、以下の段階に概要し、そして図63に示す。
マスター播種バンク
プラスミド発現MPIF-1Δ23を用いて形質転換したE．coliのマスター細胞バン
ク（MCB）を、現在の優良医薬品製造基準（Good Manufacturing Practices）の
下で、調製した。このバンクを、凍結保存物としてグリセロールを含む培地中で
調製し、そして-80℃で凍結した。調製後、MCBを、ファージまたは他の微生物に
よる夾雑物の非存在を確認するために試験した。
第１の播種段階
第１のシード段階培養物を、種菌調製培地を含有するバッフル付き震盪フラス
コ中で調製する。震盪フラスコを、凍結シードストックで1:2000希釈で播種し、
そして225rpm、37℃に維持した震盪機に12時間配置する。
生成相
生成相培養物を、DO2、pH、温度、および栄養食餌コントロールを備えた100リ
ットルのFed-Batch発酵槽中で調製する。生成培地（37℃）を、第１の播種培養
物で播種し、600nmで0.20ユニット/mlの吸光度（OD）を提供する。培養物が、60
0nmで10±2ユニット/mlのODに達したとき、IPTGの添加によりタンパタ質発現を
誘導する（最終濃度20mM）。誘導４時間後、細胞を回収する。
細胞回収相
継続的なフロー遠心機を用いて、18,000gでの遠心分離により細菌を回収する
。得られた細胞ペーストを、-80℃で貯蔵する。
MPIF-1Δ23の回収
MPIF-1Δ23の回収を、図64に概要する。
細胞溶解物
E．coli細胞ペーストを解凍し、そして10容量の再懸濁緩衝液に再懸濁する。
次いで、細胞を、ホモジナイザーによる7000psiでの通過（2回）に続いて破壊す
る。
封入体洗浄
細胞溶解物に、0.5Mの終濃度までNaClを添加し、次いで0.45-μｍ膜を用いて
接線流動濾過により2倍濃縮する。残留物（remaining retentate）を、３容量の
洗浄-2緩衝液（100mM Tris-HCl、500mM NaCl、および25mM EDTA-Na2）、続いて1
容量の洗浄-1（100mM Tris-HCl、25mM EDTA-Na2）に対してダイアフィルトレー
トする。残留物を洗浄-1緩衝液で2倍希釈し、そして不溶性画分を継続的な遠心
分離により回収する。あるいは、封入体を遠心分離により洗浄し得る。
封入体可溶化
遠心分離後に得られたペレットを、等価量の９パックの封入体容量の可溶化緩
衝液（100mM Tris-HCl、1.75Mグアニジン-HCl、および25mM EDTA-Na2）中に再懸
濁する。懸濁液を、最初室温で２〜４時間、次いで2℃〜10℃で12〜18時間撹拌
する。
再折り畳み
懸濁液を遠心分離し、そして上清液を回収し、そして９容量の再折り畳み緩衝
液(100mM酢酸ナトリウム、125mM NaCl、および２M EDTA-Na2)と混合する。希釈
された物質を約２時間の間保持し(２〜10℃)、沈殿物を沈降させる。この物質を
濾過し、次いで直ちに処理するか、または72時間まで貯蔵し次いで処理する。
精製
HS-50カチオン交換クロマトグラフィー
MPIF-1Δ23の精製の概略を図65に示す。濾過液を、50mM NaOAc、150mM NaCl、
pH5.8〜6.2で平衡化したPOROS HS-50カラム上にロードする。タンパク質を、NaC
l(300〜1500mM)を用いてステップワイズ様式で溶出する。500mM NaClで溶出する
画分をプールし、そして注入のために水で２倍希釈する。
HQ-50/CM-20アニオン/カチオンイオン交換クロマトグラフィー
HS-50クロマトグラフィー後に得たプールされた画分を、CM-1緩衝液で平衡化
されたタンデムセットのカラム(HQ-50カラムの次にCM-20カラム)上にロードする
。MPIF-1Δ23を、CM-20カラムから、NaCl(100〜900mM)で溶出する。溶出した画
分を、ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアタリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)お
よび逆相高速液体クロマトグラフィー(HPLC)により分析し、MPIF-1Δ23を含む画
分をプールし、そして限外濾過またはさらなるHS-50を通す通過により濃縮する
。
サイズ排除クロマトグラフィー
CM-20溶出液を、S-100緩衝液で平衡化したScphacryl-100 HR上にロードする。
画分を回収し、そしてSDS-PAGEおよび逆相HPLCにより分析する。MPIF-1Δ23を含
む画分をプールし、0.2μｍフィルターを用いて濾過滅菌し、そして２°〜10℃
で保存する。
バルク物質のための仕様
表７に列挙する以下の使用が、バルクMPIF-1Δ23について確立された。 ＊MPIF-1Δ23調製物の純度は標準の対照と比較され、そのための仕様は現在規定
されている。
薬物産物のための仕様
完成した薬物産物は、表７中のバルク物質について記載されたような仕様のす
べてに合致し、そしてまた滅菌度について試験される(21CRF610.12)。
MPIF-1Δ23が仲介するコロニー形成の阻害は、単球中の細胞内Ca2+を可動化する
MPIF-1の能力と相関する
MPIF-1Δ23は、インビトロ軟寒天アッセイにおけるLPP-CFCコロニー形成を阻
害し、そしてTHP-1細胞(ヒト骨髄単球細胞株)を含む単球内の細胞内カルシウム
の可動化を誘導する。両方のアッセイを用いて、精製および安定性研究における
MPIF-1Δ23の生物学的活性を評価した。LPP-CFCアッセイでは、新たに単離され
たマウス骨髄細胞を、複数のサイトカインの存在下(5ng/mL IL-3、50ng/mL SCF
、5ng/m LM-CSF、および10ng/mL IL-1α)、軟寒天中のプレートとする。培養を1
4日間インキュベートし、その後、コロニーを倒立顕微鏡を用いて計数する。
カルシウム不動化アッｔイは、Fura-2ととも(100万あたり0.2nM)にロードされ
た新たに単離されたヒト単球またはTHP-1細胞を用いる。細胞がMPIF-1Δ23で刺
激される場合、Ca2+不動化は蛍光計により評価される。このCa2+不動化アッセイ
は、MPIF-1Δ23調製物の活性に関する迅速な指標を提供する(表８)。
*ヒト単球および/またはTHP-1細胞においてカルシウムを可動化するために必要
な最小濃度。
+コントロールと比較してLPP-CFCコロニー形成の50％阻害を生成する濃度。
処方および貯蔵
バルクMPIF-1Δ23を無菌的に製造し、そして液体処方物は、滅菌、単回用途の
産物である。タンパク質を、５mLのWheaton Type1ガラスバイアル中に満たした5
0mM酢酸ナトリウム、125mM NaCl、pH5.8中に緩衝化し、そして２°〜８℃で貯蔵
する。
安定性
安定性研究を、pH５、６、および７で酢酸ナトリウムを用いて緩衝化した1.0m
g/mLのタンパク質濃度を用いて、-80℃、２°〜８℃、20°〜25℃、および２°
〜８℃の温度で実施した。MPIF-1Δ23は、pH５〜７で、10mMの酢酸ナトリウム、
125mMのNaClの溶液中、２°〜８℃でまたはそれ以下で貯蔵されたとき、少なく
とも6ケ月間安定であることが見出された。現在進行中の研究では、サンプルは
、先に概観された仕様に合致するために、外観、タンパク質濃度、純度(SDS-PAG
E（還元または非還元）；逆相およびサイズ排除HPLC）、および活性(Ca2+可動化
バイオアッセイ)についてアッセイされ得る。
臨床前毒物学研究で用いられるMPIF-1Δ23バッチ(HG00304-E10)に対する安定
性研究が開始された。これらの研究で用いられるMPIF-1Δ23バッチは、50mM NaO
Ac、125mM NaCl、pH5.9中、4.0mg/mLのタンパク質濃度で処方された。貯蔵条件
は、60％の相対湿度で、-80℃、２°〜８℃、25℃、および37℃、ならびに75％
の相対湿度で、45℃である。安定性研究の継続期間は、25℃までの温度について
は12ケ月、37℃で6ケ月、そして45℃で1ケ月である。安定性は、外観、pH、タン
パク質濃度、純度(SDS-PAGE(還元または非還元)；逆相およびサイズ排除HPLC)、
および活性(Ca2+可動化バイオアッセイ)についてアッセイされ得る。エンドトキ
シンアッセイおよび生体負荷試験が選択された時点で実施され得る。
本発明が、先行する記載および実施例中に詳細に記載されたようなとは別に実
施され得ることは明らかである。
本発明の多くの修飾および改変が、上記の教示を考慮して可能であり、そして
それ故、添付の請求項の範囲内にある。
本明細書で言及されるすべての特許、特許出願、および刊行物の開示は、本明
細書に参考として援用される。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ａ６１Ｐ 1/00 Ａ６１Ｐ 7/00
7/00 13/12
13/12 17/02
17/02 19/02
19/02 29/00
29/00 43/00 １０５
43/00 １０５ Ｃ０７Ｋ 14/52
Ｃ０７Ｋ 14/52 Ｃ１２Ｎ 1/21
Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ
5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ
Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ
Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ
，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，
ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ
Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ
，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ
，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，
ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，Ｆ
Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ
，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，
ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，Ｍ
Ｗ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ
，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，
ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ
(72)発明者 パテル，ヴィクラム
アメリカ合衆国 メリーランド 20876,
ジャーマンタウン，セプトア リッジ テ
ラス 11117
(72)発明者 クライダー，ブレント エル.
アメリカ合衆国 メリーランド 20874,
ジャーマンタウン，プレイン ノル コー
ト 13014
(72)発明者 ザン，ユン
アメリカ合衆国 メリーランド 20817,
ベテスダ，クレストベリー プレイス
10100
(72)発明者 アントナキオ，ミカエル
アメリカ合衆国 メリーランド 20874,
ジャーマン タウン，マノア ストーン
ドライブ 13356
(72)発明者 メンドリック，ドナ
アメリカ合衆国 メリーランド 21771,
マウント エアリィ，リッジ ロード
29112
(72)発明者 ジメネッツ，パブロ
アメリカ合衆国 メリーランド 21043,
エリコット シティ，カレッジ アベニュ
ー 3843