KR20000048743A - 골수양 선조 세포 억제 인자-1(ｍｐｉｆ-1), 단핵구 콜로니 억제인자(ｍ-ｃｉｆ) 및 대식 세포 억제 인자-4(ｍｉｐ-4)를이용하여질병 상태를 치료하기 위한 치료 조성물 및 치료 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인간 골수양 선조세포 억제 인자-1(MPIF-1)폴리펩티드[과거에는 MIP-3 및 케모킨 β8(CKβ8 또는 ckb-8)로 지칭]; 인간 단핵구 콜로니 억제 인자(M-CIF) 폴리펩티드[과거에는 MIP1-γ및 케모킨 β1(CKβ1 또는 ckb-1)으로 지칭)], 및 대식세포 억제 단백질-4(MIP-4)를 암호하는 분리된 핵산 분자 뿐 아니라 MPIF-1, M-CIF 및/또는 MIP-4 폴리펩티드 자체를 이용하는 치료 조성물과 방법에 관한 것이며, 이를 생산하는 벡터, 숙주 및 재조합 방법도 본 발명에 속한다.

Description

골수양 선조 세포 억제 인자-1(ＭＰＩＦ-1), 단핵구 콜로니 억제 인자(Ｍ-ＣＩＦ) 및 대식 세포 억제 인자-4(ＭＩＰ-4)를 이용하여 질병 상태를 치료하기 위한 치료 조성물 및 치료 방법{Therapeutic Compositions and Methods for Treating Disease States with Myeloid Progenitor Inhibitory Factor-1(MPIF-1), Monocyte Colony Inhibitory Factor(M-CIF), and Macrophage Inhibitory Factor-4(MIP-4)}

인터크린(intercrine) 시토킨으로 지칭되는 케모킨은 구조적으로 및 기능적으로 관련된 시토킨의 아과(subfamily)에 속한다. 이들 분자는 8-14kd의 크기를 갖는다. 일반적으로 케모킨은 아미노산 레벨이 20-75% 동일하며 2개의 이황화 결합을 형성하는 보존된 시스테인 잔기 4개를 갖는 것으로 규명된다. 처음 두개의 시스테인 잔기의 배열을 기준으로 케모킨은 두개의 아과, 즉, 알파와 베타로 분류되어 왔다. 알파 아과에서 처음의 두개 시스테인은 하나의 아미노산에 의해 분리되므로 "C-X-C" 아과로 불린다. 베타 아과에서는 두개의 시스테인이 서로 인접하여 위치하므로 이를 -C-C-아과로 지칭된다. 지금까지, 이러한 아과에 속하는 8개 이상의 다른 일원(一員)들이 인간에게서 동정된 바 있다.

인터크린 시토킨은 광범위하면서도 다양한 기능을 갖는다. 이것의 두드러진 특징은 단핵구, 호중구, T 림프구, 호염기성 백혈구, 및 섬유아세포를 비롯한 서로 다른 유형의 세포의 주화성 이동을 이끌어내는 케모킨의 능력에 있다. 다수의 케모킨은 친염증작용을 가지는 것으로 다단계의 염증 반응과 관련있다. 이러한 친염증 작용으로는 히스타민의 방출, 리소좀 효소 및 류코트리엔 방출, 상피세포에 대한 목적 면역세포의 증가된 유착, 보체 단배질의 증가된 결합력, 과립구 유착 분자 및 보체 수용체의 유도된 발현 및 호흡폭발 작용을 자극하는 것등이 있다. 이들이 염증작용에 관여하는 것외에도, 어떤 케모킨은 다른 작용을 나타내는 것으로 밝혀진 바 있다. 그러한 케모킨의 예로는 조혈 간상부 세포 증식을 억제할 수 있는 대식세포 염증 단백질 I(MIP-1), 상피세포 증식을 강력히 억제할 수 있는 억제제인 혈소판 인자-4(PF-4), 각질세포의 증식을 촉진하는 인터류킨-8(IL-8), 골수양 세포의 오토크린 증식 인자인 GRO가 있다.

전술한 바와 같이 케모킨의 다양한 생물학적 작용에 비추어 볼때, 림프구 트래패킹(trafficking), 상처 치유, 조혈 조절, 및 면역학적 장애(알러지, 천식 및 관절염)를 비롯한 다수의 생리학적 질환이 케모킨과 관련되어 있다는 것은 놀라운 일이 아니다. 조혈계의 조절인자의 예로는 MIP-1가 있다. 이 MIP-1은 처음에 대식세포에서 생산된 내독소 유발 친염증 시토킨으로서 규명되었었다. 이후의 연구 결과는 MIP-1가 두개의 서로 다르지만 관련된 두 단백질 MIP-1α 및 MIP-1β로 이루어져있다는 것을 제시했다. 이 두 단백질은 대식세포, 단핵구, T 림프구에 대해 화학주성인자이다. 흥미롭게도, 다능성 간상부 세포 억제제(SCI)를 생화학적으로 정제하고 서열을 분석하면 SCI는 MIP-1β와 동일한 것으로 나타났다. 또한, MIP-1β는 조혈 간상부 세포 증식을 억제하는 MIP-1α의 능력을 상쇄시킬 수 있는 것으로 밝혀진 바 있다. 이러한 발견은 MIP-1의 생물학적 주기능이 골수에서 조혈작용을 조절하는 데 있고, 제안된 염증 기능은 부차적인 기능이라는 가설을 설정케한다. 간상부 세포 억제제로서 MIP-1α의 작용 모드는 G₂S 세포분열 중간기에서 세포 주기를 차단하는 이의 능력과 관계있다. 또한, MIP-1α의 억제 효과는 미성숙 선조 세포로 한정되는 것으로 보이지만 실제로는 과립구 대식세포-콜로니 자극 인자(GM-CSF)의 존재하에 후기 선조 세포들에도 자극적이다.

쥐의 MIP-1은 지질당단백질 자극 RAW 264.7에서 주로 분비된 단백질이다, 이는 쥐의 대식 세포 종양 세포주로서 정제결과 두개의 관련된 단백질 MIP-1α와 MIP-1β로 정제 및 구성된 것으로 밝혀진 바 있다.

단백질 MIP-1α 및 MIP-1β의 인간의 동족체일 확률이 높은 몇몇 그룹들이 클론화 된 바 있다. 이 경우 모두 cDAN는 활성화된 T-세포 RNA에 대해 제조된 라이브러리로부터 분리되었다.

MIP-1 단백질은 초기의 상처 염증 세포에서 검출될 수있으며 상처난 섬유아세포에서 IL-1 및 IL-6의 생성을 유발하는 것으로 알려진 바있다. 또한, 정제된 천연 MIP-1(MIP-1, MIP-1α 와 MIP-1β 폴리펩티드)는 토끼의 뇌척수액으로 조내(intracisternally)로 주사되거나 또는 마우스의 각부에 피하내로 주사되었을 때 급성 염증을 일으킨다(Wolpe and Cerami, FASEB J. 3;2565-73(1989)). MIP-1의 친염증성 특성외에도, 직접 또는 간접적으로 MIP-1은 멸균된 상처실을 사용하는 실험실의 마우스 모델에서 상처 치료의 초기 염증 상태에서 회수된 바 있다(Fahey, et al. Cytokine, 2:92(1990)). 예를 들면, 치론 코오포레이숀의 이름으로 출원된 PCT 출원 미국 제92/05198호는 효모에서 포유동물의 대식세포 염증 단백질(MIPs)를 생산하는 템플레이트로서 활성인 DNA 분자를 개시하고 있다.

쥐의 MIP-1α와 MIP-1β는 서로 다른 것이긴 하지만 서로 밀접하게 관련된 시토킨이다. 부분적으로 정제된 이 두개 단백질 혼합물은 호중구 기능, 점막 국소 염증 및 발열과 관련이 있다. MIP-1α는 효모 세포에서 발현되어 균질하게 정제된 바 있다. 이를 구조적으로 분석해보면 MIP-1α는 제한된 서열 상동성을 갖는 혈소판 인자 4(PF-4)와 인터루킨 8(IL-8)과 상당히 유사한 이차 구조 및 삼차 구조를 가지는 것으로 확인되었다. MIP-1α는 생체내에서 활성이 있어 이후 삼중 수소 처리된 티미딘에 의해 시험관내에서 마우스의 간상부 세포가 사멸되는 것을 방지할 수 있는 것으로 입증된바 있다. MIP-1α는 또한 과립구 대식세포 콜로니-자극 인자에 반응하여 더 많은 선조 과립구 대식세포 콜로니 형성 세포를 증가시키는 것으로 밝혀진 바 있다[Clemens, J.M.et al, Cytokine 4:76-82(1992)].

본 발명의 폴리펩티드, 즉, 모출원에서 처음에 MIP-1r 및 Ckβ-1이라 지칭되었던 M-CIF는 아미노산 서열의 동질성을 근거로 β 케모킨의 새로운 일원으로 간주되었다. MPIF-1 폴리펩티드 역시 모출원에서 처음에 MIP-3 과 Ckβ-8로 지칭되었지만 이는 또한 아미노산 서열의 동질성을 근거해 볼때 β 케모킨 군의 새로운 일원에 속한다.

본 발명은 신규한 케모킨 폴리펩티드 및 케모킨 폴리펩티드를 암호하는 핵산에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 인간의 MPIF-1 폴리펩티드[과거에는 MIP-3 및 케모킨 β8(CKβ8 또는 ckb-8)로 지칭됨]; 인간의 단핵구 콜로니 억제 인자(M-CIF) 폴리펩티드[과거에는 MIP1-γ 및 케모킨 β1(CKβ1 또는 ckb-1)이라 지칭됨], 및 대식세포 억제 단백질-4(MIP-4)를 암호하는 분리된 핵산 분자 뿐 아니라 MPIF-1, M-CIF 및/또는 MIP-4 폴리펩티드 자체를 사용하는 치료 조성물과 방법에 관한 것이며, 또한 이를 생성하는 벡터, 숙주 세포, 및 재조합 방법도 제공한다.

본 발명을 구체적으로 설명하는 하기의 도면들은 본 발명의 청구범위에서 제시한 영역을 한정하는 것이 아니다.

도1은 MPIF-1을 암호하는 cDNA 서열(서열 번호 3) 및 이의 상응하는 추정된 아미노산 서열(서열 번호 4)을 도시한 것이다. 여기서 처음의 21개 아미노산은 리더 서열이다. 모든 시그날 서열은 바큘로바이러스 발현 단백질의 N-말단 펩티드 서열 분석에 의해 결정되었다.

도2는 M-CIF를 암호하는 cDNA 서열(서열 번호 1) 및 이의 상응하는 추정된 아미노산 서열(서열 번호 2)을 도시한 것이다. 여기서 처음의 19개 아미노산은 리더 서열이다.

도3은 MIP-4를 암호하는 cDNA 서열(서열 번호 5) 및 이의 상응하는 추정된 아미노산 서열(서열 번호 6)을 도시한 것이다. 여기서 처음의 20개 아미노산은 리더 서열이다.

도4는 MPIF-1(상단)(서열 번호 4)와 인간의 MIP-1α(하단)(서열 번호 55)간의 아미노산 상동성을 도시한 것이다. 모든 케모킨중에서 4개의 시스테인 특성이 본도면에 제시되었다.

도5는 두개의 아미노산 서열을 도시한 것으로서, 이중에서 상단 서열은 인간의 MIP-4 아미노산 서열(서열 번호 6)이고, 하단 서열은 인간의 MIP-1α(인간 편도 림프구 LD78 베타 단백질 전구체)(서열 번호 55)이다.

도6은 M-CIF(상단)와 인간의 MIP-1α(하단)(서열 번호 55)간의 아미노산 서열을 정렬한 것이다.

도7은 COS 세포에서 HA-태그된 M-CIF의 발현후 M-CIF가 전기영동된 겔의 사진이다.

도8은 바큘로바이러스 발현 시스템에서 M-CIF의 발현 및 정제후의 SDS-PAGE 겔 사진이다.

도9는 바큘로바이러스 발현 시스템에서 MPIF-1를 발현 및 3단계 정제한 후의 SDS-PAGE 겔 사진이다.

도10은 48-웰 마이크로챔버 장치(Neuro Probe, Inc)를 사용하여 주화성 분석으로 MPIF-1의 주화성 인자의 활성을 측정한 것이다. 실험절차는 제조업자들이 제공하는 매뉴얼에 기재되어 있다. 시험한 MPIF-1의 각 농도에 있어서, 5개의 고전력장에서 이동이 관찰되었다. 결과는 두번의 독립된 실험으로부터 얻은 값을 나타낸다. THP-1(A) 세포 및 인간 PBMCs(B)상에서의 주화성 활성이 도시되어 있다.

도11은 히타치 F-2000 형광 분광계를 사용하여 MPIF-1 반응에 대한 새포내 칼슘의 농도 변화를 측정한 것이다. 박테리아 발현된 MPIF-1를 Indo-1이 부착된 THP-1 세포에 가해 최종 농도가 50nM이 되게 하였다. 칼슘농도의 세포내 레벨이 측정되었다.

도12. IL-3(5 ng/ml), SCF(100 ng/ml), IL-1α(10 ng/ml) 및 M-CSF(5 ng/ml)의 존재하에 지정된 케모킨(100 ng/ml)을 사용 또는 사용하지 않는 상태에서 아가 함유 배지중에 마우스의 골수 세포로 이루어진 저밀도 개체군을 평판배양하였다(1500 세포/접시). 나타난 데이터는 두개의 독립적으로 행해진 실험(각각 2회씩 실시)에서 얻은 평균값을 의미한다. 평판배양한지 14일후에 콜로니의 수를 세었다. 케모킨 존재하에 생성된 콜로니의 수는 임의로 첨가된 케모킨이 없는 가운데 생성된 것의 평균 함량(%)으로서 표시되었다.

도13은 HPP-CFC(A) 및 LPP-CFC(B)에 의해 마우스의 골수 콜로니 형성에 대한 MPIF-1, 및 M-CIF의 효과를 나타낸 것이다.

도14는 새로 분리된 골수세포의 M-CFS 및 SCF 자극에 의한 콜로니 형성에 대한 바큘로바이러스가 발현하는 MPIF-1 및 M-CIF의 효과를 도시한 것이다.

도15는 IL3 및 SCF가 자극하여 골수세포 계통이 고잘된 개체군의 증식 및 분화에 대한 MPIF-1 및 M-CIF의 효과를 도시한 것이다.

도16A-B는 골수 세포 계통이 고갈된 개체군으로부터 Gr.1 및 Mac-1(표면 마커) 양성 개체군 세포의 생성에 대한 MPIF-1, 및 M-CIF의 효과를 도시한 것이다. 이 골수세포 계통 고갈 세포는 성장 배지에서 항온배양한 것으롯 이 배지는 IL-3(5 ng/ml)와, (a) SCF(100 ng/ml), (b) MPIF-1(50 ng/ml) 또는 (c) M-CIF(50 ng/ml)로 보충된 배지이다. 세포를 이후 골수양 분화 Gr.1, Mac-1, Sca-1, 및 CD45R 표면 항원에 대한 단일클론 항체로 염색한 뒤 FACSan으로 분석하였다. 데이터를 대세포 개체군(도16A)과 소세포 개체군(도16B) 두개중에 존재하는 양성 세포의 함량(%)으로서 제시된 것이다.

도17은 MPIF-1 단백질의 존재가 IL-3, M-CSF 및 GM-CSF에 응답하여 골수 세포 콜로니의 형성을 억제하는 것을 나타낸 도면이다.

도18은 MPIF-1의 용량반응이 골수세포 콜로니의 형성을 억제하였음을 나타낸다. 세포를 분리하고 이를 제19도에서와 같이 처리하였다. 처리된 세포를 1, 10, 50, 100 ng/ml의 MPIF-1 존재 또는 부재하에 IL-3, GM-CSF 또는 M-CSF(5 ng/ml)와 함께 1000 세포/접시의 밀도로 평판배양하여 아가 콜로니 형성 분석으로아가 콜로니 형성 분석하였다. 데이터는 특정 인자 단독에 의해 형성된 콜로니 수(%)로서 콜로니 형성을 제시하였다. 이 데이터는 2회의 평판 배양 접시에서의 콜로니 수를 평균낸 것인데, 여기서 오차 막대(error bar)는 표준값에서 벗어났음을 의미한다.

도19는 인간 단핵구에서 MPIF-1를 암호화하는 RNA의 발현을 나타낸 것이다. 새로 세정한 단핵구에서 RNA 전체를 분리한뒤 이를 100 U/mg hu rIFN-g, 100 ng/ml LPS, 또는 이 둘다로 처리하였다. 각각의 처리에서 생성된 RNA(8㎍)를 전기영동법으로 1.2%의 아가로즈 겔상에서 분리하고 이를 나일론막에 옮겼다. MPIF-1 mRNA를³²P 표지의 cDNA로 탐침/정량하였다. 생성된 방사기록 사진상의 밴드들은 사진 농도학적으로 정량된 것이다.

도20A-B에서 도20A는 MPIF-1 아미노산 서열(서열 번호 4)을 분석한 것이다. 알파, 베타, 전환 및 코일 영역; 소수성 및 친수성 영역; 양친매성 영역; 가요성 영역;항원지수 및 표면 확률이 도시되어 있다."Antigenic Index-Jameson-Wolf" 그래프에서 도1(서열 번호 4)의 아미노산 잔기 21-30, 31-44, 49-55, 59-67, 72-83, 86-103 및 110-120 또는 이중 임의의 범위 또는 임의의 수치는 MPIF-1 단백질의 항원 영역과 상당히 많이 일치한다. 도20B는 M-CIF 아미노산 서열(서열 번호2)의 분석을 나타낸 것이다. 알파, 베타, 전환 및 코일 영역; 소수성 및 친수성 영역; 양친매성 영역; 가요성 영역;항원지수 및 표면 확률이 도시되어 있다."Antigenic Index-Jameson-Wolf" 그래프에서 도2(서열 번호 2)중의 아미노산 잔기 20-36, 42-52, 52-64, 67-75, 75-84, 및/또는 86-93 또는 이안의 범위 또는 값은 M-CIF 단백질의 항원 영역과 상당히 많이 일치한다.

도21A-B에서 도21A는 LPP-CFC 세포가 5-Fu 유도하여 사멸된 것에 대한 MPIF-1의 골수양 효과를 도시한 것이다. 도21B는 LPP-CFC 세포의 Ara-C 유도 사멸에 대한 MPIF-1의 골수양 효과를 도시한 것이다.

도22는 순환성 WBC 카운트에서 5-Fu 유발이 감소된 것에 대한 마우스의 MPIF-1 예비 치료 효과를 나타낸 것이다.

도23은 다음과 같이 3마리의 마우스 그룹(그룹당 6 마리)을 치료하는 것을 포함하는 실험적 디자인을 도시한 것이다: 그룹-1에는 1,2 및 3일째에 생리적 식염수를 주사하고; 그룹-2에는 0일 및 3일째에 5-Fu를 주사하고; 그룹 3에는 0 일 및 3일째에 5-Fu 및 1,2,3일째에 MPIF-1을 주사하였다. 골수를 6일 및 9일째에 수거한 뒤 클론 분석을 수행하여 HPP-CFC 및 LPP-CFC 빈도를 측정했다.

도24는 골수에서 HPP-CFC 및 LPP-CFC 빈도에 대한 두번째 양의 5-Fu를 투여하기 전에 MPIF-1를 투여한 효과를 나타낸 것이다.

도25는 MPIF-1의 변형체를 나타낸다. 도 1(서열 번호4) MPIF-1 아미노산 서열 120개중 처음 80개는 단일 아미노산 문자 코드를 사용하여 도시되었다. 여기 문자 코드에서 처음의 21개의 잔기는 성숙한 야생형 단백질을 생산하도록 절단되는 시그날 서열 특성을 나타낸다. 변이-1 및 변이-6은 야생형에 존재하지 않는 N-말단 잔기로서 메티오닌을 함유한다. 또한, 변이-9의 처음 아미노산 4개(HAAG)는 야생형 MPIF-1 단백질에 존재하지 않는다. 변이-1, 6, 9는 서열 번호 7, 8, 9와 각기 상응한다. 변이-2는 서열 번호 4에서 아미노산 잔기 46-120과 상응한다. 변이-3은 서열 번호 4의 아미노산 잔기 45-120과 상응한다. 변이-4는 서열 번호 4에서 아미노산 잔기 48-120과 상응한다. 변이-5는 서열 번호 4에서 아미노산 잔기 49-120과 상응한다. 변이-7은 서열 번호 4에서 아미노산 잔기 39-120과 상응한다. 변이-8은 서열 번호 4에서 아미노산 잔기 44-120과 상응한다.

도26A-B. 도26A는 인간 MPIF-1 스플라이스 변형체 cDNA(서열 번호 10)의 뉴클레오티드 서열을 도시한 것이다. 이 cDNA 서열은 단일 문자 아미노산 코드를 사용하여 137개의 아미노산(서열 번호 11)의 단백질을 암호화하는 오픈 해독틀과 함께 도시되어 있다. 본도면에서 밑줄친 N-말단 21개의 아미노산은 추정되는 리더 서열을 도시한 것이다. MPIF-1 서열에 제시되어 있지 않지만 스플라이스 변형체에 독특한 18개의 아미노산 서열을 삽입한 부분은 도면상에 이탤릭체로 표시되어 있다. 도26B는 야생형 MPIF-1 분자의 아미노산 서열(서열 번호 4)과 MPIF-1 변형체의 아미노산 서열(서열 번호 11)을 비교한 것이다.

도27은 인간 단핵구에서 MIP-1α에 의해 유발된 최대 칼슘 이동 반응을 50%일으키는 데 필요한 MPIF-1 변이 단백질의 농도를 도시한 것이다.

도28은 도27에 기술된 바와 같이 100 ng/ml에서 지시된 단백질에 반응하여 세포내 유리 칼슘농도 변화가 인간 단핵구에서 측정되었음을 도시한 것이다.

도29는 인간 단핵구에서 MIP-1α 자극 칼슘 이동에 대한 민감성을 상실하는 MPIF-1 변이 능력을 나타낸 것이다.

도30은 MPIF-1 변이에 대한 인간 말초 혈액 단핵구(PBMC)의 주화성 반응을 도시한 것이다. 괄호안의 숫자는 지시된 농도 범위에서 관찰된 기본값 보다는 높게 자극된 것을 반영한 것이다.

도31은 시험관내에서 소량 증가한 포텐셜 콜로니 형성 세포(LPP-CFC)의 성장 및 분화에 대한 MPIF-1 변형체의 효과를 도시한 것이다.

도32는 재조합 인간 M-CIF로 예비 치료하므로써 마우스에 LPS-유발 패혈증 쇼크에 대한 보호를 나타낸 것이다. Balb/c 마우스(n=7)에 0일째에 LPS 25mg/kg을 복강내로 주사하였다. LPS 투여하기 하루전부터 시작해서 LPS를 투여한지 하루 지난후까지(-1, 0, +1) 연속해서 M-CIF를 마우스 체중 1kg당 3mg을 3일동안 투여하였다. 질환 대조군으로서 완충액만을 투여한 마우스를 사용했다. 치사 동력학은 LPS 투여한후 56시간동안 나타났다.

도33은 치사쇼크에 대한 M-CIF의 보호효과가 LPS 복용에 의존함을 나타낸 것이다. Balb/c 마우스(n=9)에 25 mg/kg의 LPS를 0일째에 복강내로 주사하여 다른 정도의 패혈증이 유발되었는 지를 측정했다. LPS를 치료한 마우스 각 그룹에 3일간 연속해서 10mg/kg의 M-CIF를 매일 복강내로 투여하였다. 치사 동력학은 LPS 투여한 후 56시간 동안 나타났다.

도34는 LPS-유발한 치사쇼크에 대한 보호효과가 M-CIF 복용에 의존함을 나타낸 것이다. Balb/c 마우스(n=8)에 0일째에 25 mg/kg의 LPS를 복강내로 주사하고 M-CIF를 이와 다른 용량으로(1, 3, 또는 10 mg/kg) 3일간(-1, 0, +1) 매일 치료하였다. 완충액만을 투여받은 마우스는 질환 대조군으로서 사용한다. 치사 동력학은 LPS 투여한후 120시간동안 계속되었다.

도35A-B는 Balb/c SCID 마우스에서 LPS-유발 쇼크에 대한 M-CIF의 보호효과를 나타낸 것이다. Balb/c SCID 마우스 각 그룹은(n=5-7) 0일째에 LPS를 20, 30 또는 40mg/kg을 복강내 투여받았다; 3일간 연속해서(-1, 0, +1) 3mg/kg의 일일용량으로 LPS를 주사한 마우스 각 군에 M-CIF를 투여하여 치료하였다. 치사 동력학은 LPS 주입후 120시간 동안 나타냈다. 20 ㎎/kg의 LPS 주입 마우스에 대한 M-CIF 예비치료 결과는 단독으로 LPS를 주입한 것과 동일하게 사망을 일으키지 않았다.

도 36은 패혈증에 대한 이.콜리 및 CHO 발현 벡터에서 얻은 M-CIF 단백질의 보호 효과를 나타낸 것이다. Balb/c 마우스 각 그룹은(n=8) 0일째에 LPS를 25mg/kg으로 복강내 투여받았다; 3일간 연속해서(-1, 0, +1) 1mg/kg의 일일용량으로 M-CIF의 상이한 배치(E1 및 C1)로 마우스를 치료받았다. 완충액만을 주입받은 마우스는 질환 대조군이다. 치료 동력학은 LPS 투여한지 120시간후에 나타났다.

도37은 보조제가 유발한 관절염 모델에서 발부종을 감소시키는 데 있어서의 M-CIF의 효과를 나타낸 것이다. Lewis 쥐(n=5)의 그룹에 0일째에 Mycobacterium butyricum 5 mg/ml을 함유하는 Freund 완전 보조제 100㎕/쥐 꼬리저부에 피내로 주사하였다. 0일째 부터 예방치료를 개시하되 완충액(40mM 초산 나트륨; 500 mM Nacl)중의 M-CIF 1 또는 3mg/kg을(1주일에 5회의 양으로 M-CIF 투여) 복강내로 매일 연속해서 16일간 투여하든지 또는 메틸 셀룰로오스중의 1mg/kg의 인도메타신을 대조 약물로서 경구적으로 1주일에 5회의 양으로 16일간 투여하였다. 완충액 또는 메틸 셀룰로오스만을 투여받은 쥐는 질환 대조물로서 사용한다. 양뒷발의 부종을 혈류량촉진계를 사용하여 지시한 날짜에 측정하였고 발 부피에 대한 시험 약물의 효능을 계산하였다.

도38은 전관절 염증에 대한 M-CIF의 보호효과를 제시한 것이다. 도40과 동일한 실험 수행 끝무렵, 즉, 보조제로 면역화한지 40일후에, 그룹당 두마리 쥐의 양뒷사지에 대해 조직병리학 분석을 위해 수거하였다. 결과는 전체 조직 병리학 점수의 평균값으로 표시되었다.

도39는 만성 관절염에 대한 M-CIF의 보호효과를 나타낸 것이다. 이 실험은 도40과 비슷하게 수행하지만 보조제fh 면역한지 40일후에 M-CIF 또는 인도메타신으로 더 연장하여 치료를 수행하므로서 비대증, 섬유증, 혈관 확장증, 및 림프구 응집을 비롯한 만성 조직병리학 변화를 분석하였다. 결과는 상술된 특징의 평균(n=5)으로 표시되었다. 짝짓지 않은 T 테스트(Unpaired T test)를 사용하여 통계적인 유의값을 평가하였다.

도40은 골수 및 연골 침식증에 대한 M-CIF의 보호 효과를 도시한 것이다. 도 39와 동일한 실험에서, 판누스 형성, 골수 파괴 및 골 파괴를 평가하였다. 결과는 상술한 바와 같이 전체 특징들의 평균(n=5)으로 표시되었다. 짝짓지 않은 T 테스트를 사용하여 통계적인 유의값을 평가하였다.

도41은 M-CIF 치료가 DBA/I 마우스에서 타입 11 콜라겐-유도 관절염의 진행을 예방함을 나타낸 것이다. 암컷 DBA/ilacJ 마우스의 꼬리저부에 완전 Freund 보조제중에 유화된 보바인 타입 11 콜라겐을 피내로 투여하여 면역화시켰다. 20일후에 마우스에 60 mg/100의 LPS를 피하 주사하였다. LPS를 주사하기 2일 앞서 3 그룹의 동물(각 그룹당 n=10)에 3 mg/ml의 인도메타신, M-CIF, 또는 이의 완충액 대조물을 각각 복강내로 투여하였다. 이러한 치료를 14일간 매일 계속하였다. 동물을 조사하고 이들의 임상학적 결과를 반정량화하였다. 발병율(%)이 도41에 나타나있다.

도42에서 동물은 도44에 기술된 보바인 유형 II 콜라겐으로 면역화하였다. 결과는 평균적인 경중을 표시하였다.

도43은 전신성 TNA-A 생성에 대한 M-CIF의 억제 효과를 도시한 것이다. 암컷 Balb/마우스의 그룹에 0일째에 E.coli 혈청형 0127:B(시그마)로부터 얻은, 생리적 식염수중의 25mg/kg의 지질당단백질(LPS)을 투여하였다. M-CIF 또는 완충액을 LPS 주사를 맞기 하루전 및 그 주사 맞기 한 시간 전에 투여하였다. 혈청을 LPS 투여한지 여러 시간에 걸쳐 수거한뒤 TNA-A 레벨을 측정하였다. 결과를 짝짓지 않은 T 테스트로 분석한 뒤 그 데이터를 평균 ±SEM으로 표시하였다.

도44는 M-CIF로 치료한 마우스로부터 분리한 복막세포에서 TNF-(α) 생성이 감소되었음을 제시한 것이다. 마우스를 2일간 M-CIF 3mg/kg으로 치료하였다. 2번째 M-CIF 주사를 놓은지 1시간후에 복막 세포를 수거하고 배양물에 넣어 LPS 존재 또는 부재하에 시토킨 생성을 위한 분석을 시행하였다. TNF-(X레벨)을 ELISA로 측정하였다.

도45는 M-CIF로 치료한 마우스의 복강에서 전체 세포수가 증가되었음을 나타낸다. 연속해서 6일간 M-CIF 1mg/kg 및 3 mg/kg의 일일용량으로 치료하거나 또는 부형제 대조군으로 치료 또는 비치료하였다. 7일 째에 동물을 죽이고, 복막을 수거하여 정량하였다.

도46은 M-CIF 치료된 마우스의 복강내에서 CD4 양성 T-림프구가 특이적으로 증가했음을 도시한다. 마우스를 도48에 기재된 대로 치료하였다. 각 동물은 비처리된 그룹, 부형제로만 처리된 그룹, 1 mg/kg M-CIF으로 처리된 그룹, 및 3 mg/kg의 M-CIF 그룹 등 다양한 심볼로 제시되었다. 각 그룹은 각기 CD4, CD5, CD8, Macl, MHC 부류 II, B220, IgM, Gr I CD 14에서 생성된 항체를 사용하여 세포 표면 염색에 의해 분석된 각 동물에서 얻은 세포를 각기 갖는 10마리의 동물이었다.

도47은 M-CIF 치료된 마우스의 복강에서 전체 T-림프구 세포수(CD5/IgM, CD4, 및 CD8)가 증가되었음을 도시한다.

도48은 M-CIF 치료된 마우스의 복강내에서 Macl+/MHC 부류 II 세포의 전체수가 감소된 반면 Macl+/MHC 부류 II+ 세포에서 상응하는 증가가 나타났음을 도시한 것이다.

도49는 M-CIF 치료된 마우스의 복강에서 Macl+/MHC 부류 II-세포의 전체수가 증가되었음을 도시한 것이다.

도50은 MPIF-1의 투여에 반응하여 정상의 마우스에서 간상부 세포 이동을 도시한 것이다.

도51은 FACS 반티지(Vantage) 방법에 의해 측정한 바와 같이, 5-Fu 치료를 2회 시행한 후에 혈소판의 회수시 G-CSF 와 MPIF-1의 효과를 비교한 것이다.

도52는 5-Fu 치료를 2 회 시행한 후에 혈액내에서 Gra.1 및 Mac.1 이중 양성 세포 회수에 대한 MPIF-1와 G-CSF의 효과를 비교한 것이다.

도53은 FACS 반티지 방법에 의해 결정한 바와 같이, 5-Fu 치료를 2 회 시행한 후에 골수에서 Gra.1 및 Mac.1 이중 양성 세포의 회수시 G-CSF와 MPIF-1의 효과를 비교한 것이다.

도54는 5-fu 치료를 2회 수행한 후에 골수에서 조혈 선조 세포의 회수시 G-CSF 와 MPIF-1의 효과를 비교한 것이다.

도55는 1 또는 5mg/kg의 M-CIF(n=8)의 일일 용량으로 1주일에 5일간 14주 동안 복강내로 다른 3 종류그룹을 치료 또는 완충액(n=9)으로 14 주간 치료했을 때 MRL lpr 마우스(8주연령)의 생존 비율의 시간 경과를 기록한 것이다.

도56은 1 또는 5mg/kg의 M-CIF(n=8)의 일일 용량으로 매일 1주일에 3일간 14주 동안 복강내로 1일에 1회 다른 3그룹을 치료 또는 완충액(n=9)으로 14 주간 치료했을 때 MRL lpr 마우스(8주령) 의 생존 비율의 시간 경과를 기록한 것이다.

도57은 마우스가 8주령이었을 때 14 주간(매주일마다 5일) 완충액 대조물, rhM-CIF 또는 메토트렉세이트(MTX) 1mg/kg을 일일 용량으로 치료한 23주 년령의 MRL lpr/pr 마우스의 두개의 신장을 멀티-블라인디드(Multi-blinded) 조직병리학 평가하여 단백질 주조물 형성에서의 변화를 나타낸 것이다. 1그룹당 4-5 마리의 평균 값은 ±SEM으로 나타낸다.

도58은 마우스가 8주령이었을 때 완충액 대조물, rhM-CIF 또는 메토트렉세이트(MTX) 1mg/kg을 일일 용량으로 14주동안(매주일마다 5일) 치료한 23주 년령의 쥐 MRL lpr/pr 마우스의 두개의 신장을 멀티-블라인디드 조직학으로 평가하여 신사구체 병변에서의 변화를 나타낸 것이다. 멀피-블라인디드 조직학 평가는 기저막 농후성, 겸상형 구조 형성 및 반흔형성, 세포과다, 섬유조직증식 및 핵붕괴를 나타낸다. 그룹당 4-5 마우스의 평균값 ±SEM 으로 나타냈다.

도59는 마우스가 8주령이었을 때 완충액 대조물, rhM-CIF 또는 메토트렉세이트(MTX) 1mg/kg을 일일 용량으로 14주동안(매주일마다 5일) 치료한 23주 년령의 쥐 MRL lpr/pr 마우스의 두개의 신장을 멀티-블라인디드 조직병리학 평가하여 신장 경화증의 변화를 나타낸 것이다. 그룹당 ±SEM 4-5 마우스의 평균값이다.

도60은 마우스가 8주령이었을 때 완충액 대조물, rhM-CIF 또는 메토트렉세이트(MTX) 1mg/kg을 일일 용량으로 14주동안(매주일마다 5일) 치료한 23주 년령의 쥐 MRL lpr/pr 마우스의 두개의 신장을 면역조직학 평가에 의한 대식세포 침입 변화를 도시한 것이다. 그룹당 ±SEM 4-5 마우스의 평균값이다.

도61은 마우스가 8주령이었을 때 완충액 대조물, rhM-CIF 또는 메토트렉세이트(MTX) 1mg/kg을 일일 용량으로 14주동안(1주일에 5일) 치료한 23주 년령의 쥐 MRL lpr/pr 마우스의 두개의 신장을 멀티-블라인디드 조직병리학 평가에 의한 혈관주위염 및 림프구 침입에서의 변화를 도시한 것이다. 멀피-블라인디드 조직학 평가는 기저막 농후성, 겸상형 구조 형성 및 반흔형성, 세포과다, 섬유조직증식 및 핵붕괴를 나타낸다. 그룹당 4-5 마우스의 평균 값 ±SEM 이다.

도62는 pHE4-5 발현 벡터(서열 번호 56) 및 서브클론화 MPIF-1△23 cDNA 암호서열을 계통적으로 도시한 것이다. 카나미이신 내성 마커 유전자, MPIF-1△23 암호서열, oriC 서열 및 lacIq 암호서열이 도시되었다.

도63은 MPIF-1△23 생산의 전체 발표공정을 도시한 것이다.

도64는 도63에 도시한 공정에 의해 생산된 MPIF-1△23 을 회수하기 위하여 사용된 방법의 플로우 다이아그램이다.

도65는 도63 및 도64에 도시된 방법에 의해 생산하고 회수한 MPIF-1△23 의 정제방법을 도시한 것이다.

도66은 pHE 프로모터의 조절 성분인 뉴클레오티드 서열(서열 번호 57)을 도시한 것이다. 두개의 lac 작동 서열, Shine-Delgarno 서열(S/D), 및 말단 HindIII 및 NdeI 제한 부위(이탤릭체 글씨)가 표시되어 있다.

도67A-E는 pHE4-5 벡터의 완전한 뉴클레오티드 서열(서열 번호 56)을 도시한 것이다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 (i) 인간 단핵구-콜로니 억제 인자(M-CIF), 폴리펩티드[과거에는 MIP1-γ 및 케모킨 β(CKβ1 또는 ckb-1)로 지칭]; (ii) 인간 골수양 선조 세포 억제 인자-1(MIPF-1)폴리펩티드[과거에는 MIP-3 및 케모킨 β8(CKβ8 또는 ckb-8)지칭]; 및/또는 대식세포 억제 단백질-4(MIP-4) 등의 폴리펩티드를 생산하는 벡터, 숙주 세포 및 재조합이나 합성 방법과 함께, 이를 암호하는 분리된 폴리펩티드 암호 폴리뉴클레오티드 분자나 폴리펩티드 그 자체를 이용하는 진단 또는 치료 조성물과 방법을 제공한다.

MPIF-1, M-CIF 및 MIP-4 폴리뉴클레오티드

본 발명의 한 가지 양상에 의하면, 각각 도 1,2 또는 3의 추론된 아미노산 서열(서열 번호 4,2,6)을 갖는 전장 또는 성숙한 MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4 폴리펩티드를 암호하는 분리된 핵산(폴리뉴클레오티드)과 1994년 2월 9일에 ATCC 기탁번호 75676으로 기탁된 클론(들)의 cDNA에 의해 암호되는 성숙 MPIF-1 폴리펩티드를 암호하는 분리된 핵산, 1994년 2월 9일에 ATCC 기탁번호 75675로 기탁된 클론의 cDNA에 의해 암호되는 성숙 MIP-4 폴리펩티드를 암호하는 분리된 핵산, 1993년 10월 13일에 ATCC 기탁번호 75572로 기탁된 클론의 cDNA에 의해 암호되는 성숙 M-CIF 폴리펩티드를 암호하는 분리된 핵산이 제공된다. 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection)의 주소는 메릴랜드 20852, 록빌, 파크 론 드라이브 12301이다. 기탁된 클론들은 pBluescript SK(-) 플라스미드(Stratagene, LaJolla, CA)에 포함되어 있다.

본 명세서에서 언급되는 기탁물들은 특허절차상 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트조약하에서 유지될 것이다. 이 기탁물들은 단지 당업자들의 편의를 위해 제공되는 것일 뿐이며 35 U.S.C §112에 따라 기탁이 요구되는 것을 인정하는 것은 아니다. 상기 기탁물들에 함유된 폴리뉴클레오티드의 서열과 이들에 의해 암호되는 폴리펩티드의 아미노산 서열은 본원에 참고로 포함되며 본원의 서열 기재와의 충돌의 경우 조절가능하다. 상기 기탁물들의 제조, 사용 또는 판매를 위해서는 실시권이 요구될 수 있으며 그러한 실시권은 본 명세서에 의해 부여되지 않는다.

본 발명의 폴리펩티드를 암호하는 폴리뉴클레오티드는 사이토카인(cytokine) 또는 케모킨(chemokine) 군에 속하는 친-염증성 수퍼유전자 "인터크린(intercrine)"과 구조적으로 관련된다. MPIF-1과 MIP-4 둘 다 M-CIF 동족체이며 MIP-1β보다 MIP-1α에 더욱 상동성이다. MPIF-1을 암호하는 폴리뉴클레오티드는 대동맥 내피세포 cDNA 라이브러리에서 유래되었으며, 다수의 케모킨에 상당한 상동성을 나타내는 120 아미노산 잔기의 폴리펩티드를 암호하는 오픈 리딩 프레임(open reading frame)을 함유한다. 사람 마크로파지 염증 단백질 1α에 대해 가장 상동성이 높으며 36% 동일성과 66% 유사성을 나타낸다(도4).

MIP-4를 암호하는 폴리뉴클레오티드(서열 번호 5)는 사람 성인 폐 cDNA 라이브러리에서 유래되었으며, 다수의 케모킨에 대해 상당한 상동성을 나타내는 89 아미노산 잔기의 폴리펩티드(서열 번호 6)를 암호하는 오픈 리딩 프레임을 함유한다. 사람 편도선 임파구 LD78β단백질(서열 번호 55)에 대해 가장 상동성이 높으며 60% 동일성과 89% 유사성을 나타낸다(도5). 더욱이, 모든 케모킨에서 특징적인 모티프로 존재하는 네 개의 시스테인 잔기가 두 클론 모두에 보존되어 있다. 상기 유전자들에서 첫 번째 두 시스테인 잔기가 서로 이웃해 있다는 사실은 그들을 케모킨의 "C-C" 또는 β아군으로 분류한다. 다른 아군인 "CXC" 또는 α아군에서는 첫 번째 두 시스테인 잔기가 하나의 아미노산에 의해 분리되어 있다.

M-CIF를 암호하는 폴리뉴클레오티드(서열 번호1)는 93 아미노산의 폴리펩티드를 암호하는 오픈 리딩 프레임을 함유하며, 이들 아미노산중 처음 약 19 아미노산은 리더(leader) 서열이어서 성숙 펩티드는 약 74 아미노산 잔기를 함유한다. M-CIF는 사람 마크로파지 억제 단백질-α에 상당한 상동성을 나타내어, 80 아미노산에 걸쳐 48%의 동일성과 72%의 유사성을 가진다. 더욱이, 특징적인 모티프를 구성하는 네 개의 시스테인 잔기가 보존되어 있다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 RNA 형태일수도 있고 DNA 형태일 수도 있으며, DNA는 cDNA, gDNA 및 합성 DNA를 포함한다. DNA는 이중 쇄나 단일 쇄일 수 있으며, 단일 쇄일 경우 암호 쇄이거나 비-암호(안티-센스) 쇄일 수 있다. 성숙 폴리펩티드를 암호하는 암호 서열은 도 1,2 및 3에 나타난 암호 서열(각각 서열 번호 3,1,및 5), 또는 상기 기탁된 클론들의 암호 서열과 동일할 수 있으며, 또는 유전자 코드의 축퇴성의 결과로서 암호 서열이 도 1,2 및 3의 DNA(서열 번호 3,1, 및 5) 또는 기탁된 cDNA와 동일한 성숙 폴리펩티드를 암호하는 상이한 암호 서열일 수 있다.

도 1,2, 및 3(서열 번호 4,2,및 6)의 성숙 폴리펩티드 또는 기탁된 cDNA에 의해 암호되는 성숙 폴리펩티드를 암호하는 폴리뉴클레오티드는 성숙 폴리펩티드를 위한 암호 서열만 포함할 수도 있고, 성숙 폴리펩티드를 위한 암호 서열과 함께 리더 또는 분비 서열 또는 프리(pre)단백질 서열같은 부가적인 암호 서열을 포함할 수도 있고, 성숙 폴리펩티드를 위한 암호 서열(그리고 선택적으로 부가적인 암호 서열)과 인트론 또는 성숙 폴리펩티드를 위한 암호 서열의 5' 및/또는 3'의 비-암호 서열같은 비-암호 서열을 포함할 수도 있다.

따라서, "폴리펩티드를 암호하는 폴리뉴클레오티드"라는 개념은 폴리펩티드를 위한 암호 서열만을 포함하는 폴리뉴클레오티드뿐만 아니라, 부가적인 암호 및/또는 비-암호 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

달리 나타내지 않으면, 본원에서 DNA 분자의 서열 결정에 의해 결정되는 모든 뉴클레오티드 서열은 자동화된 DNA 시퀀서(예로 Applied Biosystems, Inc.의 모델 373)를 이용하여 결정되었으며, 본 명세서에서 결정된 DNA 분자에 의해 암호되는 폴리펩티드의 모든 아미노산 서열은 전술한 대로 결정된 DNA 서열의 번역에 의해 예측되었다. 그래서, 자동화된 방법에 의해 결정된 모든 DNA 서열에 대해 당업계에 공지된 바처럼, 본원에서 결정된 임의의 뉴클레오티드 서열은 약간의 오류를 함유할 수도 있다. 자동화에 의해 결정된 뉴클레오티드 서열은 일반적으로, 서열 결정된 DNA 분자의 실제 뉴클레오티드 서열에 적어도 약 90%, 더욱 일반적으로는 적어도 약 95% 내지 약 99.9% 동일하다. 실제 서열은 당업계에 잘 알려진 수동 DNA 서열 결정 방법을 포함한 기타 방법들에 의해 더욱 정확하게 결정될 수 있다. 당업계에 공지된 바처럼, 실제 서열에 비교했을 때, 결정된 뉴클레오티드 서열에서의 하나의 삽입 또는 결실은 뉴클레오티드 서열의 번역에서 프레임 이동을 야기하여, 결정된 뉴클레오티드 서열에 의해 암호된 예측된 아미노산 서열은, 그러한 삽입 또는 결실이 일어난 곳부터, 서열 결정된 DNA 분자에 의해 실제로 암호되는 아미노산 서열과 완전히 달라질 것이다.

달리 나타내지 않으면, 본원 명세서에서 각 "뉴클레오티드 서열"은 데옥시리보뉴클레오티드(A,G,C 및 T)의 서열로 나타내진다. 하지만, 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오티드의 "뉴클레오티드 서열"은, DNA 분자 또는 폴리뉴클레오티드의 경우엔 데옥시리보뉴클레오티드의 서열을 의미하며, RNA 분자 또는 폴리뉴클레오티드의 경우엔 특정 데옥시리보뉴클레오티드 서열에서 각 티미딘 데옥시리보뉴클레오티드(T)가 리보뉴클레오티드 우리딘(U)에 의해 치환된 리보뉴클레오티드(A,G,C,U)의 서열을 의미한다. 예를 들어, 서열 번호 1,3 또는 5의 서열(데옥시리보뉴클레오티드 약자를 이용해 표기됨)을 갖는 RNA 분자란 서열 번호 1의 각 데옥시리보뉴클레오티드 A,G,또는 C가 상응하는 리보뉴클레오티드 A,G,또는 C에 의해 치환되고 각 데옥시리보뉴클레오티드 T가 리보뉴클레오티드 U에 의해 치환된 서열을 갖는 RNA 분자를 나타낸다.

도 1,2, 또는 3의 뉴클레오티드 서열과 같은 본원에서 제공되는 정보를 이용하면, MIPF-1, M-CIF 또는 MIP-4 폴리펩티드 각각을 암호하는 본 발명의 핵산 분자는 출발 물질로서 mRNA를 이용하는 cDNA 클로닝과 같은 표준적인 클로닝 및 선별 과정을 이용하여 얻어질 수 있다.

본 발명은 또한 도 1,2 및 3의 추론된 아미노산 서열(서열 번호 4,2 및 6)을 갖는 폴리펩티드 또는 기탁된 클론(들)의 cDNA에 의해 암호된 폴리펩티드의 단편, 유사체 및 유도체를 암호하는 전술한 폴리뉴클레오티드의 변이체에 관한 것이다. 폴리뉴클레오티드의 변이체는 폴리뉴클레오티드의 자연 발생적인 대립유전자 변이체이거나 폴리뉴클레오티드의 비-천연 변이체일 수 있다.

본 발명은 또한 도 1,2 및 3(서열 번호 4,2 및 6)에 나타난 것과 동일한 성숙 폴리펩티드 또는 기탁된 클론(들)의 cDNA에 의해 암호되는 동일한 성숙 폴리펩티드를 암호하는 폴리뉴클레오티드와, 그러한 폴리뉴클레오티드의 변이체로서 도 1,2 및 3(서열 번호 4,2 및 6)의 폴리펩티드 또는 기탁된 클론의 cDNA 에 의해 암호되는 폴리펩티드의 단편, 유도체 또는 유사체를 암호하는 변이체를 포함한다. 그러한 뉴클레오티드 변이체는 결실 변이체, 치환 변이체 및 부가 또는 삽입 변이체를 포함한다.

전술한 바처럼, 상기 폴리뉴클레오티드는 도 1,2 및 3(서열 번호 4,2 및 6)에 나타난 암호 서열 또는 기탁된 클론의 암호 서열의 천연 대립유전자 변이체인 암호 서열을 가질 수 있다. 당업계에 공지된 바처럼, 대립유전자 변이체는 하나 이상의 뉴클레오티드의 치환, 결실 또는 부가를 가질 수 있으며 암호된 폴리펩티드의 기능을 실질적으로 변화시키지 않는, 다른 형태의 폴리뉴클레오티드 서열이다.

본 발명은 또한, 성숙 폴리펩티드를 위한 암호 서열이 숙주 세포에서 폴리펩티드의 발현과 분비를 돕는 폴리뉴클레오티드 서열(예로서, 폴리펩티드가 세포로부터 수송되는 것을 조절하기 위한 분비 서열로 작용하는 리더(leader) 서열이 있다)에 동일한 리딩 프레임으로 융합될 수 있는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 리더 서열을 가진 폴리펩티드는 프리단백질이며 숙주 세포에 의해 리더 서열이 잘려 성숙 폴리펩티드를 형성할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 또한 성숙 단백질에 더하여 부가적인 5' 아미노산 잔기를 갖는 프리단백질을 암호할 수 있다. 프로(pro) 서열을 갖는 성숙 단백질이 프로단백질이며 불활성 형태의 단백질이다. 일단 프로 서열이 잘려지면 활성을 갖는 성숙 단백질이 남는다.

따라서, 예를 들어, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 성숙 단백질을 암호할 수도 있고, 프로서열을 갖는 단백질을 암호할 수도 있고, 또는 프로서열과 프리 서열(리더 서열) 둘다를 갖는 단백질을 암호할 수도 있다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 또한 본 발명의 폴리펩티드의 정제를 가능하게 하는 표식 서열에 정확한 프레임으로 융합된 암호 서열을 가질 수 있다. 표식 서열은, 박테리아 숙주의 경우엔 표식에 융합된 성숙 폴리펩티드의 정제를 가능하게 하는 pQE-9 벡터에 의해 공급되는 헥사-히스티딘 꼬리표일 수 있으며, 포유동물 숙주(예로서 COS-7 세포)를 이용하는 경우엔 헤마글루티닌(HA) 꼬리표일 수 있다. HA 꼬리표는 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질에서 유래한 에피토프에 상응한다(Wilson, I., et al., Cell, 37:767(1984)).

"유전자"라는 개념은 폴리펩티드 쇄를 생산하는 데 관여하는 DNA 절편을 의미하며, 암호 부위에 선행하는 부분과 뒤따르는 부분(리더와 트레일러) 및 각각의 암호 절편(엑손)사이의 간섭 서열(인트론)을 포함한다.

전술한 바처럼, 본 발명의 핵산 분자는 mRAN같은 RNA형태일 수도 있고, 클로닝이나 합성에 의해 얻어진 cDNA와 gDNA를 포함하는 DNA 형태일 수도 있다. DNA는 이중쇄일 수도 있고 단일 쇄일 수도 있다. 단일-쇄 DNA 또는 RNA는 센스(sense)쇄로 알려진 암호쇄일 수도 있고, 안티-센스(anti-sense)쇄로 불리는 비-암호 쇄일 수도 있다.

"분리된"이라는 개념은 그 물질이 원래의 환경(예를 들어, 그 물질이 천연적인 것이면 자연 환경)으로부터 제거된 것을 의미한다. 예를 들어, 살아있는 동물에 존재하는 천연 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 분리된 것이 아니지만, 동일한 폴리뉴클레오티드 또는 DNA 또는 폴리펩티드가 자연계에서 공존하는 물질들의 일부 또는 전부로부터 떨어진 것은 분리된 것이다. 그러한 폴리뉴클레오티드는 벡터의 일부일 수도 있고 또는 그러한 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 조성물의 일부일 수도 있으며, 그러한 벡터 또는 조성물이 자연 환경의 일부가 아니어서 분리된 것일 수도 있다. 분리된 RNA 분자는 본 발명의 DNA 분자의 생체내 또는 생체외 RNA 전사체를 포함한다. 본 발명의 분리된 핵산 분자는 합성된 핵산 분자들을 추가로 포함한다.

본 발명의 분리된 핵산 분자는 MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4 cDNA를 위한 오픈 리딩 프레임(ORF)을 포함하는 DNA 분자, 성숙 M-CIF, MPIF-1 또는 MIP-4 단백질을 위한 암호 서열을 포함하는 DNA 분자 및 전술한 DNA들과 상당히 다르지만 유전자 코드의 축퇴성때문에 여전히 MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4 폴리펩티드를 암호하는 서열을 포함하는 DNA분자를 포함한다. 물론, 유전자 코드는 당업계에서 잘 공지되어 있다. 따라서, 당업자가 전술한 축퇴성 변이체를 생성하는 것은 일상적인 일이다.

본 발명은 또한, 전술한 서열에 하이브리드화하며 그 서열들 사이에 적어도 95%의 동일성이 있는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명은 특히 엄격한 조건하에서 전술한 폴리뉴클레오티드들에 하이브리드화하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 본원 명세서에서, "엄격한 조건"이라는 개념은 적어도 95%, 바람직하게는 적어도 97%의 동일성이 서열사이에 존재할때만 하이브리드화가 일어나는 것을 의미한다. 바람직한 구체예에서 전술한 폴리뉴클레오티드에 하이브리드화하는 폴리뉴클레오티드는 도1,2 및 3의 cDNA(서열 번호 3,1 및 5) 또는 기탁된 cDNA에 의해 암호되는 성숙 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 생물학적 작용 또는 활성을 보유한 폴리펩티드를 암호한다.

또한, 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 하이브리드화하며 전술한 대로 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 동일성을 가지며 활성을 보유할 수도 있고 보유하지 않을 수도 있는 ,적어도 20 염기, 바람직하게는 30 염기, 더욱 바람직하게는 적어도 50 염기를 가질 수도 있다. 예를 들어, 그러한 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 1,3 및 5의 폴리뉴클레오티드를 위한 프로브, 예를 들어 폴리뉴클레오티드의 회수를 위한 프로브로서, 또는 진단 프로브로서 또는 PCR 프라이머로서 이용될 수도 있다.

다른 양상으로는, 본 발명은 엄격한 하이브리드화 조건하에서 전술한 본 발명의 핵산 분자(예를 들어, ATCC 기탁 번호 75572(M-CIF), ATCC 기탁 번호 75676(MPIF-1), 또는 ATCC 기탁 번호 75675(MIP-4)에 함유된 cDNA 클론)의 폴리뉴클레오티드의 일부분에 하이브리드화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분리된 핵산 분자를 제공한다. "엄격한 하이브리드화 조건"이란 50% 포름아미드, 5xSSC(150mM NaCl, 15mM 트리소듐 시트레이트), 50mM 인산 나트륨(pH7.6), 5x 덴하르트(Denhardt's) 용액, 10% 덱스트란 설페이트 용액 및 20g/ml 변성, 전단된 연어 정자 DNA를 포함한 용액에서 42℃에서 밤새 배양한 뒤 약 65℃에서 0.1xSSC로 필터를 세척하는 것을 의미한다.

폴리뉴클레오티드의 "일부"에 하이브리드화하는 폴리뉴클레오티드란 기준 폴리뉴클레오티드의 적어도 약 15 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 적어도 약 20 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 적어도 약 30 뉴클레오티드, 더더욱 바람직하게는 약 30-70 뉴클레오티드에 하이브리드화하는 폴리뉴클레오티드(DNA 또는 RNA)를 의미한다. 이들은 전술한바처럼 진단 프로브와 프라이머로서 유용하며 하기에서 더욱 상세히 설명될 것이다.

물론, 기준 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 기탁된 cDNA 클론)의 더 큰 부분, 예로써 50-750 뉴클레오티드 길이 또는 심지어는 전장의 기준 폴리뉴클레오티드에 하이브리드하는 폴리뉴클레오티드 역시 본 발명에 따른 프로브로서 유용하며, 서열 번호 1(M-CIF), 서열 번호 3(MPIF-1) 또는 서열 번호 5(MIP-4)에 나타난 뉴클레오티드 서열 또는 기탁된 cDNA의 뉴클레오티드 서열의 대부분에 상응하는 폴리뉴클레오티드가 그러하다. 예를 들어 "적어도 20 뉴클레오티드 길이"의 폴리뉴클레오티드 부분은 기준 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열로부터의 20 이상의 연속한 뉴클레오티드를 의미한다. 상기한 바처럼, 그러한 부분은 통상적인 DNA 하이브리드화 기법에 따른 프로브로서 또는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)(Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd. edition, Sambrook, J., Fritsch,E.F. and Maniatis, T.,eds, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(1989)에 설명되어 있으며 그 내용은 본 명세서에 참고로 포함됨)에 의해 표적 서열을 증폭시키기 위한 프라이머로서 진단학적으로 유용하다.

MPIF-1, M-CIF 및 MIP-4 cDNA 클론은 기탁되었으며 그들의 결정된 뉴클레오티드 서열이 제공되기 때문에, MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4 cDNA 분자의 일부에 하이브리드화하는 폴리뉴클레오티드를 제조하는 것은 당업자에게는 일상적인 일이다. 예를 들어 MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4 cDNA 클론을 제한 엔도뉴클레아제를 이용하여 절단하거나 초음파분해에 의해 전단하는 것은, MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4 cDNA 분자의 일부에 각각 하이브리드화하는 폴리뉴클레오티드인 다양한 크기의 DNA 부분을 생성하기 위해 쉽게 이용될 수 있다.

한편으로는, 본 발명의 하이브리드화 폴리뉴클레오티드는 공지의 기법에 따라 합성될 수 있다. 물론, 단지 cDNA의 3' 말단 폴리(A) 꼬리같은 폴리 A 서열 또는 상보적인 T(또는 U) 잔기 스트레치에 하이브리드화하는 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 핵산의 일부에 하이브리드화시키기 위해 이용되는 본 발명 폴리뉴클레오티드에 포함되지 않을 것이다. 왜냐하면, 그러한 폴리뉴클레오티드는 폴리(A) 스트레치 또는 그들의 상보체를 함유하는 임의의 핵산 분자(예를 들어, 실제적으로는 임의의 이중 쇄 cDNA 클론)에 하이브리드화하기 때문이다.

전술한 바처럼, MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4 폴리펩티드를 암호하는 본 발명의 핵산 분자는 성숙 폴리펩티드 그 자체의 아미노산 서열을 암호하는 핵산 분자; 성숙 폴리펩티드 암호 서열과, 프리-, 또는 프로- 또는 프리프로-단백질 서열같은 리더 또는 분비 서열을 암호하는 것과 같은 부가적인 서열; 전술한 부가적인 암호 서열이 있거나 없으며, 부가적인 비-암호 서열을 가진 성숙 폴리펩티드의 암호 서열; 및 부가적인 기능을 제공하는 부가적인 아미노산을 암호하는 부가적인 암호 서열을 포함할 수 있으며 이들에 한정되지 않는다. 상기의 부가적인 비-암호 서열은 예를 들어 스플라이싱(splicing)과 폴리아데닐화 시그날 (예를 들어 mRNA의 리보좀 결합과 안정성)를 포함한 mRNA 프로세싱과 전사에서 역할을 하는 전사되고 비-번역될 서열같은 비-암호화 5' 및 3' 서열과 인트론을 포함하며 이에 한정되지 않는다. 따라서, 폴리펩티드를 암호하는 서열은 융합된 폴리펩티드의 정제를 촉진하는 펩티드를 암호하는 서열같은 표식 서열에 융합될 수도 있다. 본 발명의 이러한 양상의 일부 바람직한 구체예에서, 표식 아미노산 서열은 시판되는 것들중에서 pQE 벡터(Qiagen, Inc.)로 제공되는 꼬리표같은 헥사-히스티딘 펩티드이다. Gentz et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:821-824(1989)에 설명된 바처럼, 헥사-히스티딘은 융합 단백질의 편리한 정제를 제공한다. "HA" 꼬리표는 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질에서 유래된 에피토프에 상응하며 정제에 유용한 또 다른 펩티드이며, Wilson et al., Cell 37: 767(1984)에 설명되어 있다. 하기에 설명되는 바와 같이, 다른 그러한 융합 단백질은 N-말단 또는 C-말단에서 Fc에 융합된 MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4 폴리펩티드 또는 단편중 적어도 하나를 포함한다.

본 발명은 추가로 MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4 폴리펩티드의 일부, 유사체 또는 유도체를 암호하는 본 발명의 핵산 분자의 변이체에 관련된다. 변이체들은 천연 대립유전자처럼 자연적으로 존재할 수도 있다. "대립유전자 변이체"는 한 유기체의 염색체상의 하나의 위치를 차지하는 하나의 유전자의 몇 가지 대체 형태중 하나를 의미한다.(Genes V, Lewin, B., ed., Oxford University Press, New York(1994)). 비-천연 변이체는 공지의 돌연변이 기법을 이용하여 생성될 수도 있다.

그러한 변이체는 뉴클레오티드 치환, 결실 또는 부가에 의해 생성된 것들을 포함한다. 치환, 결실 또는 부가는 하나 이상의 뉴클레오티드에 관련될 수도 있다. 변이체는 암호 부위, 비-암호 부위, 또는 둘 다에서 바뀔 수도 있다. 암호 부위에서의 변화는 보존적 또는 비-보존적 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 생성할 수도 있다. 특히 이중에서 바람직한 것은 MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4 폴리펩티드 또는 그들의 일부의 특성과 활성을 바꾸지 않는 침묵성(silent) 치환, 부가 및 결실이다. 또한 이점에서는 보존적 치환이 특히 바람직하다. 본원에서 기술되는 바와 같이, 기탁된 cDNA 클론에 의해 암호되는 성숙 아미노산 서열 또는 성숙 단백질을 암호하는 핵산 분자가 매우 바람직하다.

MPIF-1, M-CIF 및 MIP-4 상동체 폴리뉴클레오티드

본 발명은 추가로 서열 번호 2,4 및 6의 폴리펩티드를 암호하는 폴리뉴클레오티드에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드와, 적어도 30 염기, 바람직하게는 적어도 50 염기를 갖는 그들의 단편 및 그러한 폴리뉴클레오티드에 의해 암호되는 폴리펩티드에 대한 것이다.

본 발명의 추가의 구체예는 (a)서열 번호 4, 서열 번호 2 또는 서열 번호 6의 아미노산 서열을 각각 가지며 예측된 리더 서열을 갖는 MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4 폴리펩티드 또는 단편을 암호하는 뉴클레오티드 서열, (b)서열 번호 4, 서열 번호 2 또는 서열 번호 6의 아미노산 서열을 각각 가지며 예측된 리더 서열을 포함하지만 N-말단 메티오닌 잔기를 갖지 않는 MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4 폴리펩티드 또는 단편을 암호하는 뉴클레오티드 서열, (c)성숙 MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4 폴리펩티드(리더가 제거된 전장 폴리펩티드)를 암호하는 뉴클레오티드 서열, (d)기탁된 cDNA 클론에 의해 암호되는, 리더를 포함한 완전한 아미노산 서열을 갖는 전장 폴리펩티드를 암호하는 뉴클레오티드 서열, (e) 기탁된 cDNA 클론에 의해 암호되는 아미노산 서열을 갖는 성숙 폴리펩티드를 암호하는 뉴클레오티드 서열, 또는 (f) (a),(b),(c),(d) 또는 (e)의 뉴클레오티드 서열중의 어느 것에 상보적인 뉴클레오티드 서열에 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 분리된 핵산 분자를 포함한다.

예를 들어, MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4 폴리펩티드를 암호하는 기준 뉴클레오티드 서열에 적어도 95% 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드는, 그 폴리뉴클레오티드 서열이 그 폴리펩티드를 암호하는 기준 뉴클레오티드 서열의 각 100 뉴클레오티드마다 최대 5개까지의 점 돌연변이를 포함할 수도 있다는 것을 제외하고는, 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열이 기준 서열과 동일하다는 것을 말한다. 다시 말하면, 기준 뉴클레오티드 서열에 적어도 95% 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 얻기 위해서는, 기준 서열에서 최대 5%의 뉴클레오티드가 결실되거나, 다른 뉴클레오티드로 치환되거나 또는 기준 서열의 총 뉴클레오티드 숫자의 최대 5%만큼의 뉴클레오티드가 기준 서열에 삽입될 수도 있다. 기준 서열의 이러한 돌연변이는 기준 뉴클레오티드 서열의 5' 또는 3' 말단 위치에서 일어날 수도 있고 말단 위치사이의 어느곳에서 일어날 수도 있으며, 기준 서열내의 뉴클레오티드 사이에 개별적으로 흩어져 존재하거나 기준 서열내에 하나 이상의 연속적인 군으로 존재할 수도 있다.

실제적인 문제로서, 임의의 특정 핵산 분자가 예를 들어 도1,3,또는 5에 나타난 뉴클레오티드 서열에 또는 기탁된 cDNA 클론의 뉴클레오티드 서열에 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한지 여부는 베스트피트 프로그램(위스콘신 서열 분석 패키지, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711)같은 공지의 컴퓨터 프로그램을 이용하여 결정할 수 있다. 베스트피트는 Smith와 Waterman의 Advances in Applied Mathematics 2:482-489(1981)의 국소 상동성 알고리즘을 이용하여 두 서열간의 최상의 상동성 절편을 찾는다. 베스트피트나 기타 서열 배열 프로그램을 이용하여 특정 서열이 예를 들어 본 발명의 기준 서열에 95% 동일한지를 결정할 때는, 물론 그 파라미터는 동일성의 백분율이 기준 뉴클레오티드 서열의 전장에 대해 계산되고 기준 서열의 뉴클레오티드 총수의 최대 5%까지 상동성의 차이가 허용되도록 설정된다.

당업자는, 전술한 서열 결정시의 오류 가능성과 공지의 다른 단백질에서의 리더를 위한 절단 부위의 변이성때문에, 기탁된 cDNA에 의해 암호되는 성숙 M-CIF 폴리펩티드가 약 74 아미노산을 포함하지만 69-93 아미노산의 범위내에 존재할 수 있으며, 이 단백질의 실제 리더 서열은 약 19 아미노산이지만 약 15 내지 약 24 아미노산 범위내일 수도 있음을 알 것이다.

당업자는, 전술한 서열 결정시의 오류 가능성과 공지의 다른 단백질에서의 리더를 위한 절단 부위의 변이성때문에, 기탁된 cDNA에 의해 암호되는 성숙 MPIF-1 폴리펩티드가 약 99 아미노산을 포함하지만 75-120 아미노산의 범위내에 존재할 수 있으며 이 단백질의 실제 리더 서열은 약 21 아미노산이지만 약 15 내지 약 35 아미노산 범위내일 수도 있음을 알 것이다.

당업자는, 전술한 서열 결정시의 오류 가능성과 공지의 다른 단백질에서의 리더를 위한 절단 부위의 변이성때문에, 기탁된 cDNA에 의해 암호되는 성숙 MIP-4 폴리펩티드가 약 69 아미노산을 포함하지만 60-89 아미노산의 범위내에 존재할 수 있으며 이 단백질의 실제 리더 서열은 약 20 아미노산이지만 약 15 내지 약 30 아미노산 범위내일 수도 있음을 알 것이다.

핵산 프로브

그러한 분리된 분자, 특히 DNA 분자는 염색체와의 인 시추(in situ) 하이브리드화에 의한 유전자 지도화, 그리고 인체 조직에서 MPIF-1, M-CIF 및/또는 MIP-4 유전자의 발현의 노던 블롯 분석등을 이용한 검출을 위한 프로브로서 유용하다. 본 발명은 또한 본 명세서에 개시된 분리된 핵산 분자의 단편에 관한 것이다. 기탁된 MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4 cDNA의 뉴클레오티드 서열, 또는 도 1,2 및 3(서열 번호 3,1 및 5) 모두 또는 어느 것에 나타난 각각의 뉴클레오티드 서열을 갖는 분리된 핵산 분자의 단편이란, 전술한 대로 진단 프로브와 프라이머로서 유용한 적어도 약 15 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 적어도 약 20 뉴클레오티드, 여전히 더욱 바람직하게는 적어도 약 30뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 적어도 약 40뉴클레오티드 길이의 단편을 말한다. 물론, 50-500 뉴클레오티드 길이의 더 큰 단편 역시, MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4 cDNA의 뉴클레오티드 서열, 또는 도 1,2 및 3(서열 번호 3,1 및 5)에 나타난 뉴클레오티드 서열의 대부분에 상응하는 단편들처럼 본 발명에 따라 유용하다. 예를 들어, 적어도 20뉴클레오티드 길이의 단편이란 기탁된 cDNA의 뉴클레오티드 서열 또는 도 1,2 및 3(서열 번호 3,1 및 5)에 나타난 뉴클레오티드 서열로부터의 20 이상의 연속적인 염기들을 포함하는 단편을 의미한다. 상기 유전자는 기탁되었으며 도 1,2 및 3(서열 번호 3,1 및 5)에 나타난 아미노산 서열이 제공되기 때문에, 그러한 DNA 단편을 생성하는 것은 당업자에게는 일상적인 일이다. 예를 들어, 제한 엔도뉴클레아제 절단이나 초음파 분해에 의한 전단은 다양한 크기의 단편을 생성하기 위해 쉽게 이용될 수 있다. 한편, 그러한 단편들은 합성될 수도 있다.

본 발명의 전장 유전자의 단편들은 전장 cDNA를 분리하거나 상기 유전자와 높은 서열 유사성을 갖거나 유사한 생물학적 활성을 갖는 다른 cDNA를 분리하고자 할때 cDNA 라이브러리에 대한 하이브리드화 프로브로 이용될 수도 있다. 이러한 유형의 프로브는 적어도 30개의 염기를 갖는 것이 바람직하며, 예를 들어 50개 이상의 염기를 가질 수도 있다. 상기 프로브는 또한 전장 전사체 및 조절 부위와 프로모터 부위, 엑손 및 인트론을 포함하는 완전한 유전자를 가진 게놈 클론(들)에 상응하는 cDNA 클론을 확인하기 위해 이용될 수도 있다. 선별의 한 가지 예는 알고 있는 DNA 서열을 이용하여 올리고뉴클레오티드 프로브를 합성함으로써 상기 유전자의 암호화 부위를 분리하는 것을 포함한다. 본 발명의 유전자의 서열에 상보적인 서열을 갖는 표지된 올리고뉴클레오티드는 이 프로브가 라이브러리의 어느 성분과 하이브리드화하는가를 결정하기 위해 인간 cDNA, 게놈 DNA 또는 mRNA 라이브러리를 선별하는데 이용된다.

벡터, 숙주 세포 및 단백질 발현

본 발명은 또한 본 발명의 분리된 핵산 분자를 함유한 벡터, 상기 재조합 벡터를 함유한 유전적으로 조작된 숙주 세포, MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4 폴리펩티드 또는 이들의 단편의 재조합 기법에 의한 생산에 관한 것이다. 본 발명은 또한 박테리아에서 단백질들의 생산에 유용한 신규의 발현 벡터에 관한 것이다. 이들 신규의 벡터의 예는 pHE4 벡터 시리즈 및 특히, pHE4-5벡터이다(도 62와 67A-E).

본 발명 단백질을 암호하는 폴리뉴클레오티드는 숙주에서의 증식을 위한 선택적 마커를 함유한 벡터에 연결될 수도 있다. 하기에서 상세히 설명되는 바와 같이, 일반적으로, 플라스미드 벡터는 인산 칼슘 침전물같은 침전물 상태로, 또는 전하를 띤 지질과의 복합체 상태로 숙주 세포내로 도입된다. 벡터가 바이러스라면, 적절한 팩키징 세포주를 이용하여 생체외(in vitro)로 팩키징되어 숙주 세포내로 형질도입될 수도 있다.

본 발명에 이용하기에 바람직한 벡터는 관심의 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 연결된 시스(cis)-작용성 조절 부위를 포함한 벡터이다. 시스-작용성 조절 부위는 작동 유전자(operator)와 인핸서(enhancer) 서열을 포함한다. 본 명세서에서, "작동 유전자"는 이웃한 뉴클레오티드 서열의 전사를 조절하며 대개 DNA로 구성되는 뉴클레오티드 서열을 말한다. 작동 유전자 서열은 일반적으로 박테리아 염색체로부터 유래된다.

본 발명의 폴리펩티드를 암호하는 뉴클레오티드 서열의 고등 진핵생물에서의 전사는 벡터에 인핸서 서열을 도입함으로써 증가될 수도 있다. 인핸서는 일반적으로 약 10 내지 300bp 떨어진 시스-작용성 요소로서 주어진 숙주 세포 유형에서 프로모터의 전사 활성을 증가시키는 작용을 한다. 인핸서의 예로는 복제 오리진의 후반부에 100 내지 270bp 위치에 존재하는 SV40 인핸서, 사이토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 오리진의 후반부에 위치한 폴리오마 인핸서 및 아데노바이러스 인핸서가 있다.

적절한 트랜스(trans)-작용성 요소가 숙주에 의해, 보충 벡터에 의해, 또는 벡터 그 자체에 의해, 숙주 세포로의 도입시에 공급될 수도 있다.

이 점에 관하여 일부 바람직한 구체예에서는, 벡터가 유도성 및/또는 세포 유형-특이적일 수도 있는 특이적 발현을 제공한다. 그러한 벡터중에서 온도와 영양분과 같은 조작하기 쉬운 환경 요소에 의해 유도되는 벡터가 특히 바람직하다. 또한 MPIF-1 의 발현을 위해서는 실시예 30에 개시된 pHE4-5벡터가 바람직하다.

본 발명에서 유용한 부가적인 발현 벡터는 염색체-유래, 에피좀-유래 및 바이러스-유래 벡터, 예를 들면, 박테리아 플라스미드, 박테리오파지, 효모 에피좀, 효모 염색체 성분 및 바큘로바이러스, 파포바 바이러스, 우두 바이러스, 아데노바이러스, 계두 바이러스, 슈도라비 바이러스 및 레트로바이러스같은 바이러스에서 유래된 벡터, 및 코스미드와 파지미드같은 그들의 조합에서 유래된 벡터를 포함한다.

적절한 핵산 서열이 다양한 방법에 의해 벡터내로 도입될 수 있다. 일반적으로, 핵산 서열은 당업계에 공지된 방법에 의해 적절한 제한 엔도뉴클레아제 부위로 도입된다. 그러한 방법들은 당업자에게 자명하다.

핵산 삽입물은 파지 람다 PL 프로모터, 이.콜리 lac, trp 및 tac 프로모터, SV40 초기 및 후기 프로모터 및 레트로바이러스 LTR의 프로모터 및 기타 원핵 세포 또는 진핵 세포 또는 그들의 바이러스에서 유전자의 발현을 조절하는 것으로 알려진 프로모터들과 같은 적절한 프로모터에 작동적으로 연결되어야 한다. 다른 적절한 프로모저는 당업계에 공지되어 있다. 본 명세서에서, "프로모터"는 최소한 RNA 폴리머라제의 작용을 위한 결합 부위 또는 개시 부위를 제공하는 뉴클레오티드 서열 또는 뉴클레오티드서열 군을 말한다. 발현 구조체는 전사 개시 부위, 전사 종결 부위 및, 전사된 부위에서의 번역을 위한 리보좀 결합 부위를 추가로 함유할 것이다. 상기 구조체에 의해 발현된 성숙한 전사체의 암호화 부위는 전사될 폴리펩티드의 시작부분의 번역 개시 코돈과 전사될 폴리펩티드의 말단에 적절하게 위치한 종결 코돈(UAA, UGA 또는 UAG)을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 벡터는 또한 발현을 증대시키기 위한 적절한 서열을 포함할 수 있다.

본 명세서에서, "작동적으로 연결된"이라는 표현은 하나의 뉴클레오티드 서열이 다른 뉴클레오티드 서열(또는 서열들)의 기능을 바꿀수 있는 방식으로 그 서열(또는 서열들)에 연결된 것을 말한다. 예를 들어, 프로모터/작동 유전자에 작동적으로 연결된 단백질 암호 서열의 경우, 그 단백질 암호 서열의 발현은 프로모터/작동 유전자의 영향 또는 조절을 받게 된다. 프로모터 작용의 유도가 단백질 암호 서열 mRNA의 전사를 일으키며 두 뉴클레오티드 서열사이의 연결 특성이 프레임-이동 돌연변이를 야기하지 않고 발현 조절 서열이 mRNA 또는 단백질의 발현을 지시하는 것을 막지 않는다면, 두 뉴클레오티드 서열(단백질 암호 서열과 그 암호 서열의 5' 말단에 연결된 프로모터 부위 서열같은)은 작동적으로 연결되었다고 한다. 따라서, 프로모터 부위가 뉴클레오티드 서열의 전사를 일으킬 수 있으면 뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결된 것이다.

본 명세서에서, "클로닝 벡터"는 숙주 세포에서 스스로 복제할 수 있는 플라스미드 또는 파지 핵산 또는 기타 핵산 서열을 가리키는 것으로서, 이들 핵산 서열은 하나 또는 소수의 엔도뉴클레아제 인지 부위를 가지고 있어 이 부위에서 이들 핵산 서열은 벡터의 필수적인 생물학적 기능의 상실없이 결정적인 양상으로 절단될 수도 있고, 핵산이 이 부위로 접합되어 복제나 클로닝을 야기할 수도 있다. 클로닝 벡터는 추가로 그 클로닝 벡터로 형질전환된 세포의 확인에 사용하기 적합한 표식을 함유할 수도 있다. 표식의 예로는 에리트로마이신 내성과 카나마이신 내성을 들 수 있다. "비히클(vehicle)"은 때때로 "벡터" 대신 사용된다.

본 명세서에서, "발현 벡터"는 클로닝 벡터와 유사한 벡터를 가리키는 것으로서, 숙주 세포내로 발현 벡터가 형질전환된 후, 발현 벡터내에 클로닝된 구조 유전자를 발현할 수 있는 벡터이다. 발현 벡터에서, 클로닝된 구조 유전자(관심의 대상이 되는 임의의 암호 서열)는 그 유전자가 특정 숙주에서 발현되도록 하는 특정 서열의 조절하에 놓이게 된다(즉, 작동적으로 연결됨). 예를 들어, pHE4-5벡터에서, 구조 유전자는 T5 파지 프로모터 서열과 두개의 lac 작동 유전자 서열에 작동적으로 연결된다. 발현 조절 서열은 다양하며, 부가적으로 종결 서열같은 전사 요소 및/또는 개시 부위와 종결 부위같은 번역 요소를 함유할 수도 있다.

전술한 바와 같이, 발현 벡터는 적어도 하나의 선별 표식을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 그러한 표식은 진핵 세포 배양의 경우엔 디하이드로폴레이트 환원효소 유전자 또는 네오마이신 내성 유전자를 포함하며, 이.콜리와 기타 박테리아 배양의 경우엔 테트라사이클린, 카나마이신, 또는 앰피실린 내성 유전자를 포함한다. 적절한 숙주의 대표적인 예는 이.콜리, 스트렙토마이세스 및 살모넬라 티피뮤리움 세포같은 박테리아 세포, 효모 세포같은 균류 세포, 드로소필라 에스 투(Drosophila S2)와 스포돕테라 에스에프 나인(Spodoptera Sf9) 세포같은 곤충 세포, CHO, COS 및 보우에스(Bowes) 흑색종 세포같은 동물 세포 및 식물 세포를 포함하며, 이들에 한정되지 않는다. 전술한 숙주 세포를 위한 적절한 배양 배지와 조건은 당업계에 공지되어 있다.

본 발명의 실시에서의 발현 벡터의 이용에 더하여, 본 발명은 대상 단백질을 암호하는 뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결된 작동 유전자와 프로모터 요소를 포함하는 신규한 발현 벡터를 추가로 포함한다. 그러한 벡터의 한 가지 예가 하기와 실시예 30에서 상세히 설명될 pHE4-5(서열번호 56)이다. pHE4-5 벡터를 함유한 박테리아 숙주는 1997년 9월 30일에 미국 모식균 배양 수집소(미국 매릴랜드주 20852 록빌 파아크론 드라이브 12301)에 기탁되었으며 기탁번호는 - 이다.

도 62와 67에 요약된 바와 같이, pHE4-5 벡터(서열 번호 56)의 성분은 1)선별 표식으로서의 네오마이신포스포트랜스퍼라제 유전자, 2)이.콜리 복제 오리진, 3) T5 파지 프로모터 서열, 4) 두개의 lac 작동 유전자 서열, 5) MPIF-1△23를 암호하는 뉴클레오티드 서열(서열 번호 27), 6)샤인-달가노(Shine-Delgarno) 서열, 7)락토즈 오페론 억제 유전자(lacIq)를 포함한다. 복제 오리진(oriC)은 pUC19에서 유래한다(LTI, Gaithersburg, MD). 프로모터 서열과 작동 유전자 서열은 합성했다. 핵산 서열의 합성은 당업계에 공지된 것이다. 클론테크(CLONTECH) 95/96 카타로그, 215-216페이지, CLONTECH, 1020 East Meadow Circle, Palo Alto, CA 94303.

전술한 바와 같이, pHE4-5 벡터는 lacIq 유전자를 함유한다. LacIq는 lac 작동 유전자의 엄격한 조절을 부여하는 lacI 유전자의 대립 유전자이다.(Amann, E.et al., Gene 69:301-315(1988); Stark, M., Gene 51;255-267(1987)). lacIq 유전자는 lac 작동 유전자 서열에 결합하여 하부(즉, 3')서열의 전사를 막는 억제 단백질을 암호한다. 하지만, lacIq 유전자 산물은 락토즈나 일부 락토즈 유사체, 예를 들어 이소프로필 B-D-티오갈락토피라노시드(IPTG)의 존재하에서 lac 작동 유전자로부터 분리된다. 따라서, MPIF-1△23은 pHE4-5 벡터를 함유한 유도되지 않은 숙주 세포에서는 감지할 수 있을 정도의 양으로 생성되지 않는다. 하지만, IPTG같은 제제의 첨가에 의한 숙주 세포의 유도는 MPIF-1△23 암호 서열의 발현을 일으킨다.

pHE4-5 벡터(서열 번호 57)의 프로모터/작동 유전자 서열은 T5 파지 프로모터와 두 개의 lac 작동 유전자 서열을 포함한다. 하나의 작동 유전자는 전사 개시 부위에 대하여 5'에 위치하며 다른 하나는 동일한 전사 개시 부위에 대하여 3'에 위치한다. 이들 작동 유전자들은 lacIq 유전자 산물과 함께 존재할 경우, IPTG 같은 lac 오페론 유도인자 부재하에서 하부 서열을 엄격히 억제한다. lac 작동 유전자의 하부에 위치한 작동적으로 연결된 서열의 발현은 IPTG같은 lac 오페론 유도인자의 첨가에 의해 유도될 수도 있다. lac 유도인자가 lacIq 단백질에 결합하면 lacIq 단백질이 lac 작동 유전자 서열로부터 유리되며 작동적으로 연결된 서열의 전사가 개시된다. lac 오페론의 유전자 발현 조절은 Devlin, T., TEXTBOOK OF BIOCHEMISTRY WITH CLINICAL CORRELATIONS, 4TH Edition(1997), 802-807페이지에서 설명되어 있다.

pHE4 벡터 시리즈는 MPIF-1△23 암호 서열을 제외하고는 pHE4-5 벡터의 모든 성분을 함유한다. pHE4 벡터의 특징은 적정화된 합성 T5 파지 프로모터, lac 작동 유전자 및 샤인-달가노 서열을 포함한다. 추가로, 이들 서열은 또한 삽입된 유전자의 발현이 엄격하게 조절되고 유도시 높은 발현이 일어나도록 적절하게 배치된다.

본 발명의 단백질 생산에 이용하기에 적합한 공지의 박테리아 프로모터는 이.콜리 lacI 프로모터와 lacZ 프로모터, T3 프로모터와 T7 프로모터, gpt 프로모터, 람다 PR 및 PL 프로모터 및 trp 프로모터를 포함한다. 적절한 진핵 세포 프로모터는 CMV 직초기(immediate early) 프로모터, HSV 티미딘 키나제 프로모터, 초기 및 후기 SV40 프로모터, 라우스 사코마 바이러스(RSV)의 프로모터같은 레트로바이러스 LTR의 프로모터 및 마우스 메탈로티오네인-I 프로모터같은 메탈로티오네인 프로모터를 포함한다.

pHE4-5 벡터는 또한 AUG 개시 코돈의 5'에 샤인-달가노 서열을 함유한다. 샤인-달가노 서열은 AUG 개시 코돈으로부터 약 10 뉴클레오티드 상부(즉, 5')에 위치한 짧은 서열이다. 이들 서열은 기본적으로 원핵 세포의 리보좀을 AUG 개시 코돈으로 가도록 한다.

따라서, 본 발명은 또한 본 발명의 단백질의 생산에 유용한 발현 벡터에 관한 것이다. 본 발명의 이러한 양상은 pHE4-5 벡터(서열 번호 56)에 의해 예시된다.

본 발명 단백질을 박테리아에서 발현시키는데 이용하기에 바람직한 부가적인 벡터는 pQE70, pQE60 및 pQE-9(Qiagen); 스트라타진에서 시판되는 pBS 벡터, pD10, 파지스크립트 벡터, pBluescript 벡터, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A; 파마시아에서 시판되는 ptrc99a, pKK233-3, pDR540, pRIT5를 포함한다. 진핵 세포 벡터중에서는 스트라타진에서 시판되는 pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1 및 pSG와 파마시아에서 시판되는 pSVK3, pBPV, pMSG 및 pSVL이 바람직하다.

기타 적합한 벡터는 당업자에게 자명하며 pBR322(ATCC 37017), pKK223-3(파마시아 파인 케미칼스, 웁살라, 스웨덴) 및 GEM1(프로메가 바이오텍, 메디슨, 더블유아이, 미국)을 포함한다. 이들 pBR322 "기본 구조" 부분은 적절한 프로모터와 발현될 구조 서열과 연결된다. 적절한 숙주 세포의 형질전환과 적절한 농도까지의 숙주 세포의 성장후, 선택된 프로모터가 적절한 수단(예를 들어, 온도 변화 또는 화학적 유도)에 의해 유도되고 세포는 부가 기간동안 배양된다.

또다른 구체예에서는, 본 발명은 전술한 구조체를 함유하는 숙주 세포에 관한 것이다. 숙주 세포는 포유동물 세포같은 고등 진핵 세포일수도 있고, 효모 세포같은 하등 진핵 세포일수도 있으며, 또는 박테리아 세포같은 원핵 세포일 수도 있다. 상기 구조체의 숙주 세포로의 도입은 인산 칼슘 형질감염, DEAE-덱스트란 매개 형질감염, 양이온성 지질-매개 형질감염, 일렉트로포레이션, 형질 도입, 감염 또는 기타 방법에 의해 이루어질 수 있다. 그러한 방법들은 데이비스 등의 BASIC METHOD IN MOLECULAR BIOLOGY(1986)같은 많은 실험서에 개시되어 있다.

재조합 구조체는 감염, 형질 도입, 형질감염, 트랜스벡션(transvection), 일렉트로포레이션 및 형질전환같은 공지 방법을 이용해 숙주 세포에 도입될 수도 있다. 벡터는 예를 들어 파지, 플라스미드, 바이러스 벡터 또는 레트로바이러스 벡터일 수도 있다. 레트로바이러스 벡터는 복제 능력이 있을 수도, 없을 수도 있다. 후자의 경우, 바이러스의 증식은 일반적으로 보완 능력을 갖춘 숙주 세포에서만 일어날 것이다.

숙주 세포는 예를 들어 클로닝 벡터 또는 발현 벡터일 수 있는 본 발명 벡터로 유전적으로 조작된다(형질 도입 또는 형질 전환 또는 형질 감염됨).벡터는 예를 들어 플라스미드, 바이러스 입자, 파지 등의 형태일 수 있다. 조작된 숙주 세포는 프로모터를 활성화시키거나, 형질 전환체를 선별하거나, 또는 MPIF-1, MIP-4 및 M-CIF 유전자를 증폭시키는데 적합하도록 변형된 통상적인 영양 배지에서 배양될 수 있다. 온도, pH 등과 같은 배양 조건은 발현을 위해 선택된 숙주 세포들에 이용되는 전술한 것들이며, 당업자에게는 명백할 것이다.

본 발명의 폴리펩티드는 재조합 기법에 의해 폴리펩티드를 생산하기 위해 이용될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 폴리뉴클레오티드 서열은 다양한 발현 비히클, 구체적으로는 폴리펩티드 발현을 위한 벡터 또는 플라스미드에 포함될 수 있다. 그러한 벡터는 염색체, 비염색체 및 합성 핵산 서열을 포함하며, 예를 들어, SV40 유도체, 박테리아 플라스미드, 파지 핵산, 효모 플라스미드, 플라스미드와 파지 핵산의 조합에서 유래된 벡터, 백시니아, 아데노바이러스, 계두 바이러스, 알파바이러스 및 슈도래비같은 바이러스 핵산이 있다. 하지만, 다른 플라스미드 또는 벡터도 그들이 숙주 세포에서 복제와 생존이 가능하면 이용될 수 있다.

전술한 바처럼, 전술한 적절한 핵산 서열과 적절한 프로모터 또는 조절 서열을 함유한 벡터는 적절한 숙주 세포에 형질 전환되어 숙주가 그 단백질을 발현하도록 이용될 수 있다.

적절한 숙주의 대표적인 예는 이.콜리, 스트렙토마이세스 및 살모넬라 티피뮤리움 같은 박테리아 세포, 효모 같은 균류 세포, 드로소필라와 Sf9같은 곤충 세포, CHO, COS 또는 보우에스(Bowes) 흑색종 같은 동물 세포 및 식물 세포를 포함한다. 적절한 숙주의 선택은 당업자에겐 자명한 일일 것이다.

더욱 구체적으로, 본 발명은 또한 광범위하게 전술한 서열중 하나 이상을 포함하는 재조합 구조체를 포함한다. 그 구조체는 본 발명의 서열이 정방향 또는 역방향으로 삽입된 플라스미드 또는 바이러스 벡터같은 벡터를 포함한다. 이 구체예의 바람직한 양상에서, 그 구조체는 본 발명 서열에 작동적으로 연결된, 프로모터와 같은 조절 서열을 추가로 포함한다. 다수의 적절한 벡터와 프로모터가 당업자에게 알려져 있으며, 시판되고 있다. 다음이 벡터의 예이다. 박테리아 벡터로는 pQE70, pQE60 및 pQE-9(Qiagen); 스트라타진에서 시판되는 pBS, pD10, 파지스크립트, psiX174, pBluescript SK, pbsks, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A; 파마시아에서 시판되는 ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5를 포함한다. 진핵 세포 벡터중에서는 스트라타진에서 시판되는 pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1 및 pSG와 파마시아에서 시판되는 pSVK3, pBPV, pMSG 및 pSVL이 있다. 하지만, 기타 다른 벡터도 그들이 숙주에서 복제와 생존이 가능하다면 이용될 수 있다.

숙주 세포내의 구조체는 재조합 서열에 의해 암호되는 유전자 산물을 생산하기 위해 통상적인 방식으로 이용될 수 있다. 다른 한편으론, 본 발명의 폴리펩티드는 통상적인 펩티드 합성기에 의해 합성될 수 있다.

성숙 단백질은 적절한 프로모터의 조절하에서 포유동물 세포, 효모, 박테리아, 또는 기타 세포에서 발현될 수 있다. 무세포 번역 시스템이 또한 본 발명의 핵산 구조체에서 유래된 RNA를 이용하여 그러한 단백질을 생산하기 위해 이용될 수 있다. 원핵 세포와 진핵 세포에서 이용하기에 적절한 클로닝 벡터와 발현 벡터는 Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y.,(1989)에 설명되어 있으며 그 내용은 본원에 참고로 인용된다.

일반적으로, 재조합 발현 벡터는 복제 오리진 및 숙주 세포의 형질전환을 허용하는 선별 표식(예를 들어, 이.콜리의 앰피실린 내성 유전자와 에스.세레비제 TRP1 유전자), 및 하부에 위치한 구조 서열의 전사를 지시하기 위해 고-발현 유전자에서 유래된 프로모터를 포함할 것이다. 그러한 프로모터는 3-포스포글리서레이트 키나제(PGK)같은 해당 효소, α인자, 산 포스파타제, 또는 열충격 단백질 등을 암호하는 오페론에서 유래될 수 있다. 이종성 구조 서열은 적절한 단계에서 번역 개시 서열 및 종결 서열, 그리고 바람직하게는, 번역된 단백질이 주변세포질 공간 또는 세포외 배지로 분비되도록 할 수 있는 리더 서열과 함께 조립된다. 선택적으로, 이종성 서열은 원하는 특성(예를 들어, 발현된 재조합 산물의 안정화 또는 간단한 정제)을 부여하는 N-말단 동정 펩티드를 포함하는 융합 단백질을 암호할 수 있다.

박테리아에서 이용하기에 유용한 발현 벡터는 원하는 단백질을 암호하는 구조 핵산 서열을 적절한 번역 개시 및 종결 시그날과 함께 작동가능한 리딩 상으로 작용 프로모터와 같이 삽입함으로써 만들어질 수 있다. 이 벡터는 하나 이상의 표현형 선별 표식과 복제 오리진을 포함하여 벡터의 유지를 보장하고, 필요하다면 숙주내에서의 증폭을 제공할 것이다. 형질전환을 위해 적합한 원핵 숙주는 이.콜리, 바실러스 서틸리스, 살모넬라 티피뮤리움 및 슈도모나스, 스트렙토마이세스 및 스타필로코커스 속내의 다양한 종을 포함하며, 다른 박테리아 역시 이용될 수 있다.

세포는 일반적으로 원심분리에 의해 수집되고, 물리적 또는 화학적 수단에 의해 파괴되며, 이렇게 생성된 미정제 추출물은 추가 정제를 위해 보관된다.

단백질 발현에 이용된 미생물 세포는 동결-해동 순환, 초음파 분해, 기계적 파괴, 세포 분해제의 이용과 같은 당업계에 잘 알려진 임의의 통상적인 방법에 의해 파괴될 수 있다.

다양한 포유동물 세포 배양 시스템이 재조합 단백질의 발현을 위해 이용될 수 있다. 포유동물 발현 시스템의 예는 Gluzman, Cell 23:175(1981)에 기술된 원숭이 신장 섬유아세포의 COS-7 세포주 및 C127, 3T3, CHO, HeLa, BHK 세포주같은 양립성 벡터를 발현할 수 있는 기타 세포주를 포함한다. 포유동물 발현 벡터는 복제 오리진, 적절한 프로모터와 인핸서, 및 필요한 리보좀 결합 부위, 폴리아데닐화 부위, 스플라이스 공여 부위와 수용 부위, 전사 종결 서열 및 5' 측면 비전사 서열을 포함할 것이다. SV40 스플라이스에서 유래된 핵산 서열과 폴리아데닐화 부위는 필요한 비전사 유전 요소를 제공하기 위해 이용될 수 있다.

폴리펩티드와 폴리펩티드 단편

본 발명은 기탁된 cDNA에 의해 암호되는 아미노산 서열, 또는 도1,2 또는 3(각각 서열 번호 4,2 또는 6)의 아미노산 서열을 갖는 분리된 MPIF-1, M-CIF, 또는 MIP-4 폴리펩티드, 또는 이들 폴리펩티드의 일부를 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드를 추가로 제공한다. "펩티드" 또는 "올리고펩티드"는 동일한 의미로 간주되며(일반적으로 그렇게 인식됨) 각 개념은 문맥의 필요에 따라 펩티드 결합에 의해 연결된 둘 이상의 아미노산의 쇄를 나타내기 위해 상호 교환 사용될 수 있다. "폴리펩티드"는 10개 이상의 아미노산 잔기를 함유한 쇄를 위해 이용된다. 본원에서 모든 올리고펩티드와 폴리펩티드 식 또는 서열은 왼쪽에서 오른쪽으로 그리고 아미노 말단에서 카르복시 말단 방향으로 쓰여진다.

"MPIF-1 활성을 갖는 폴리펩티드"는, 특정 생물학적 분석으로 측정될 때, 본 발명의 MPIF-1 단백질(전장 단백질 또는 바람직하게는 성숙 단백질)의 활성과 반드시 동일하지는 않더라도 유사한 활성을 나타내는 폴리펩티드를 의미한다. MPIF-1 단백질 활성은 실시예15,16과 도11에 기재된 분석에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, MPIF-1 단백질 활성은 하기 실시예 15에 개시된 생체외 미에로프로텍션 myeloprotection)분석을 이용하여 측정된다.

요약하면, 계통-고갈된(lineage-depleted) 세포 집단(Lin cells)을 마우스 골수로부터 분리하고, 다수 시토킨서 MPIF-1과 함께 또는 MPIF-1없이 배양한다. 48시간후, 각 배양물 한 세트에 5-Fu를 공급하고 이어서 24시간동안 추가 배양하며, 이때 생존한 저 증식능 콜로니-형성 세포(LPP-CFC)의 수를 당업계에 공지된 적절한 클론원성 분석에 의해 결정한다. 높은 백분율(40%이상과 같은 30-50% 이상)의 LPP-CFC가 MPIF-1 존재하에서 5-Fu-유도된 세포독성으로부터 보호되는 반면, MPIF-1 부재하 또는 무관한 단백질 존재하에서는 LPP-CFC의 낮은 비율(5% 미만)의 보호가 관찰될 것이다. 그러한 분석에서, 높은 증식능 콜로니-형성 세포(HPP-CFC)가 부가적으로 MPIF-1 존재하에서 5-Fu-유도된 세포독성으로부터 보호될 수 있으나, 일부 경우에는 그렇지 않다. HPP-CFC는 일반적으로 LPP-CFC가 보호되지 않을 때는 보호되지 않는다.

따라서, "MPIF-1 단백질 활성을 갖는 폴리펩티드"란 전술한 분석에서 MPIF-1 활성을 나타내는 폴리펩티드를 포함한다. 활성의 정도가 MPIF-1 단백질의 활성과 동일할 필요는 없으나, 바람직하게는 "MPIF-1 단백질 활성을 갖는 폴리펩티드"는 MPIF-1 단백질에 비해 상당히 유사한 활성을 나타낼 것이다(즉, 후보 폴리펩티드는 기준 MPIF-1 단백질에 비해 더 큰 활성을 나타내거나 또는 약 20배 이하 적은 활성을 나타낼 것이며, 바람직하게는 약 10배 이하 적은 활성을 나타낼 것이다).

"M-CIF 활성을 갖는 폴리펩티드"는 특정 생물학적 분석으로 측정될 때, 본 발명의 M-CIF 단백질(전장 단백질 또는 바람직하게는 성숙 단백질)의 활성과 반드시 동일하지는 않더라도 유사한 활성을 나타내는 폴리펩티드를 의미한다. M-CIF 단백질 활성은 하기의 실시예 25에 기재된 분석에서 골수 세포와 같은 동물 세포에 의한 M-CSF-유도된 콜로니 형성의 생체외 억제를 이용하여 측정될 수 있다.

따라서, "M-CIF 단백질 활성을 갖는 폴리펩티드"란 전술한 분석에서 M-CIF 활성을 나타내는 폴리펩티드를 포함한다. 활성의 정도가 M-CIF 단백질의 활성과 동일할 필요는 없으나, 바람직하게는 "M-CIF 단백질 활성을 갖는 폴리펩티드"는 M-CIF 단백질에 비해서 상당히 유사한 활성을 나타낼 것이다(즉, 후보 폴리펩티드는 기준 M-CIF 단백질에 비해 더 큰 활성을 나타내거나 약 20배 이하 적은 활성을 나타낼 것이며, 바람직하게는 약 10배 이하 적은 활성을 나타낼 것이다).

본 발명은 도 1,2 및 3(서열 번호 4,2 및 6)의 추론된 아미노산 서열 또는 기탁된 cDNA에 의해 암호된 아미노산 서열을 갖는 MPIF-1, M-CIF 및 MIP-4 폴리펩티드와 이러한 폴리펩티드의 단편, 유사체 및 유도체에 관련된다.

도 1,2 및 3(서열 번호 4,2 및 6)의 폴리펩티드 또는 기탁된 cDNA에 의해 암호되는 폴리펩티드에 있어서, "단편", "유도체" 및 "유사체"는 그러한 폴리펩티드와 기본적으로 동일한 생물학적 기능 또는 활성을 갖는 폴리펩티드를 의미한다. 따라서, 유사체는 활성 성숙 폴리펩티드를 생산하기 위해 프로단백질 부분의 절단에 의해 활성화될 수 있는 프로단백질을 포함한다.

본 발명의 폴리펩티드는 재조합 폴리펩티드, 천연 폴리펩티드 또는 합성 폴리펩티드일 수 있으며, 재조합 폴리펩티드가 바람직하다.

도 1,2 및 3(서열 번호 4,2 및 6)의 폴리펩티드, 또는 기탁된 cDNA에 의해 암호되는 폴리펩티드의 단편, 유도체 또는 유사체는 (i)아미노산 잔기중 하나 이상이 보존된 또는 비보존된 아미노산 잔기(바람직하게는 보존된 아미노산 잔기)로 치환되고 그러한 치환된 아미노산 잔기가 유전자 코드에 의해 암호되거나 암호되지 않는 것, 또는 (ii)아미노산 잔기중 하나 이상이 치환기를 포함하는 것, 또는 (iii)성숙 폴리펩티드가 폴리펩티드의 반감기를 증가시키는 화합물(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜)같은 다른 화합물에 융합된 것, 또는 (iv)리더 또는 분비 서열 또는 성숙 폴리펩티드 또는 프로단백질 서열의 정제를 위해 이용될 서열같은 부가적인 아미노산이 성숙 폴리펩티드에 융합된 것일 수 있다. 그러한 단편, 유도체 및 유사체는 본원 기재내용으로부터 당업자에게 자명할 것이다.

본 발명의 폴리펩티드는 분리된 형태로 제공되는 것이 바람직하며, 균질하게 정제된 현태로 제공되는 것이 바람직하다.

본 발명의 폴리펩티드는 서열 번호 2,4 및 6의 폴리펩티드(특히 성숙 폴리펩티드)와 서열 번호 2,4 및 6의 폴리펩티드에 적어도 95% 유사성(더욱 바람직하게는 적어도 95% 동일성)을 갖는 폴리펩티드를 포함하며, 또한 그러한 폴리펩티드의 적어도 30 아미노산 그리고 더욱 바람직하게는 적어도 50 아미노산을 함유하는 폴리펩티드의 부분들을 포함한다.

당업계에 공지된 바처럼, 두 폴리펩티드 사이의 "유사성"은 하나의 폴리펩티드의 아미노산 서열과 그것의 보존된 아미노산 치환을 두 번째 폴리펩티드의 서열과 비교함으로써 결정된다.

물론, 유전자 코드의 축퇴성때문에, 기탁된 cDNA(ATCC 75676)의 핵산 서열 또는 도1의 핵산 서열(서열 번호 3)에 적어도 95%,96%,97%,98%, 또는 99% 동일한 서열을 갖는 많은 핵산 분자들이 "MPIF-1 단백질 활성을 갖는" 폴리펩티드를 암호할 것이라는 것을 당업자는 즉시 인식할 것이다. 당업자는 또한 기탁된 cDNA(ATCC 75572)의 핵산 서열 또는 도2의 핵산 서열(서열 번호 1)에 적어도 95%,96%,97%,98%, 또는 99% 동일한 서열을 갖는 많은 핵산 분자들이 "M-CIF 단백질 활성을 갖는" 폴리펩티드를 암호할 것이라는 것을 즉시 인식할 것이다. 부가적으로, 당업자는 기탁된 cDNA(ATCC 75675)의 핵산 서열 또는 도3의 핵산 서열(서열 번호 5)에 적어도 95%,96%,97%,98%, 또는 99% 동일한 서열을 갖는 많은 핵산 분자들이 "MIP-4 단백질 활성을 갖는" 폴리펩티드를 암호할 것이라는 것을 즉시 인식할 것이다. 사실, 이들 뉴클레오티드 서열의 축퇴성 변이체는 모두 동일한 폴리펩티드를 암호하기 때문에, 전술한 비교 분석을 수행하지 않더라도 이는 당업자에게 명백할 것이다. 축퇴성 변이체가 아닌 그러한 핵산 분자들도 일부는 역시 MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4 단백질 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호할 것이라는 것을 당업자는 인식할 것이다. 이는 당업자는 단백질 기능에 크게 영향주지 않는 아미노산 치환(예를 들어, 하나의 지방족 아미노산을 다른 지방족 아미노산으로 치환하는 것)을 잘 알고 있기 때문이다.

예를 들면, 표현형으로 나타나지 않는 아미노산 치환을 만드는 것에 관한 지침은 Bowie, J.U. et al., "Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions," Science 247:1306-1310(1990)에서 제공되며, 상기 저자들은 아미노산 서열의 변화에 대한 용인 연구를 위한 두 가지 접근법을 제시한다. 첫 번째 방법은 돌연변이가 자연 선택에 의해 수용되거나 거부되는 진화 과정에 의존한다. 두 번째 방법은 클로닝된 유전자의 특정 부위에 아미노산 변화를 도입하기 위해 유전 공학을 이용하고 기능을 유지하는 서열을 확인하기 위해 선택 또는 선별을 이용한다. 저자들이 기술하는 바처럼, 이러한 연구는 단백질이 아미노산 치환에 대해 놀라울 정도로 관용적임을 밝혔다. 저자들은 아미노산 변화가 단백질의 특정 부위에서 허용될 가능성이 높음을 추가로 나타낸다. 예를 들면, 대부분의 묻혀진 아미노산 잔기들은 비극성 측쇄를 요구하며, 반면에 표면 측쇄의 소수 특성만이 일반적으로 보존된다. 다른 그러한 표현형이 변하지 않는 치환은 상기의 Bowie,J.U.et al.,에서 설명되며 참고로 인용된다.

본 발명의 폴리펩티드의 단편 또는 부분은 펩티드 합성에 의해 상응하는 전장 폴리펩티드를 생성하기 위해 이용될 수도 있다. 그래서, 그 단편들은 전장 폴리펩티드를 생성하기 위한 중간체로 이용될 수도 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 단편 또는 부분은 본 발명의 전장 폴리뉴클레오티드를 합성하기 위해 이용될 수도 있다.

번역된 단백질이 소포체의 강내로, 주변세포질 공간으로 또는 세포외 환경으로 분비되도록 하기 위해서 적절한 분비 시그날이 발현될 폴리펩티드내로 도입될 수도 있다. 시그날은 폴리펩티드에 대해 내인성일 수도 있고 이종성 시그날일 수도 있다.

폴리펩티드는 융합 단백질처럼 변형된 형태로 발현될 수도 있으며, 분비 시그날뿐만 아니라 부가적인 이종성 기능성 부분을 포함할 수도 있다. 예를 들어, 부가적인 아미노산, 구체적으로는 전하를 띤 아미노산 부분이 폴리펩티드의 N-말단에 첨가되어, 정제동안 또는 이어지는 조작과 저장동안 숙주 세포에서의 안정성과 유지성을 개선시킬 수도 있다. 또한, 펩티드 부분이 정제를 촉진하기 위해 폴리펩티드에 첨가될 수도 있다. 그러한 부분은 그 폴리펩티드의 최종 제조전에 제거될 수도 있다. 분비를 가능하게 하거나, 안정성을 개선하거나, 정제를 촉진하기 위해 폴리펩티드에 펩티드 부분을 첨가하는 것은 당업계에서는 익숙하고 일상적인 일이다. 바람직한 융합 단백질은 단백질을 가용화하는데 유용한 면역글로불린으로부터의 이종성 부분을 포함한다. 예를 들어, EP-A-O 464 533(Canadian counterpart 2045869)은 다른 인간 단백질 또는 그들의 일부와 함께 면역글로불린 분자의 정상부의 다양한 부분을 포함하는 융합 단백질을 개시한다. 많은 경우, 융합 단백질에서 Fc 부분은 치료와 진단에 이용하기에 유익하며 따라서, 예를 들어 개선된 약학동역학적 특성으로 귀결된다(EP-A 0232 262). 한편으로는, 일부 용도의 경우, 융합 단백질이 발현되고, 검출되어 전술한 유익한 방식으로 정제된 후 Fc 부분을 결실시킬 수 있는 것이 바람직할 것이다. 이것은 융합 단백질이 면역화를 위한 항원으로 이용될 경우처럼, Fc 부분이 치료와 진단에 이용하는 데 방해가 되는 경우 그러하다. 약의 발견의 경우, hIL5-수용체 같은 사람 단백질은 hIL-5의 길항 물질을 동정하기 위한 고-처리능력의 선별 분석의 목적을 위해 Fc 부분과 융합되었다. D.Bennett et al., Journal of Molecular Recognition, Vol.8:52-58(1995)와 K.Johanson et al., The Journal of Biological Chemistry, Vol.270, No.16:9459-9471(1995)를 참고.

MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4 단백질은 황산 암모늄 침전이나 에탄올 침전, 산 추출, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로즈 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 하이드록시아파타이트 크로마토그래피 및 렉틴 크로마토그래피를 포함하는 공지 방법들에 의해 재조합 세포 배양물로부터 회수되어 정제될 수 있다. 고성능액체 크로마토그래피(HPLC)를 이용한 정제가 가장 바람직하다. 본 발명의 폴리펩티드는 천연 정제된 산물, 화학 합성 과정의 산물 및 재조합 기법에 의해 박테리아, 효모, 고등 식물, 곤충 및 포유동물 세포를 포함하는 원핵 또는 진핵 숙주로부터 얻어진 산물을 포함한다. 재조합 생산 과정에 이용되는 숙주에 따라, 본 발명의 폴리펩티드는 글리코실화될 수도 있고 글리코실화되지 않을 수도 있다. 더욱이, 본 발명의 폴리펩티드는 또한 일부 경우, 숙주에 의해 매개되는 과정에 의해 변형된 개시 메티오닌 잔기를 포함할 수도 있다.

MPIF-1, M-CIF 및 MIP-4 폴리펩티드 변이체

당업자는 MPIF-1, M-CIF 및 MIP-4 폴리펩티드의 일부 아미노산 서열이 단백질의 구조나 기능에 큰 영향없이 변할 수 있음을 인식할 것이다. 서열상의 그러한 차이를 고려할 경우, 활성을 결정하는 중요한 부분이 단백질상에 존재함을 기억해야 한다. 일반적으로, 유사한 기능을 수행하는 잔기가 이용된다면, 3차 구조를 형성하는 잔기를 치환하는 것이 가능하다. 다른 예의 경우, 그러한 변화가 단백질의 중요하지 않은 부분에서 일어난다면 잔기의 유형은 전혀 중요하지 않을 수도 있다.

따라서, 본 발명은, 각각 상당한 MPIF-1, M-CIF 및 MIP-4 폴리펩티드 활성을 나타내거나 또는 각각 하기에 기술되는 단백질 부분들같은 MPIF-1, M-CIF 및 MIP-4 펩티드의 부분들을 포함하는, MPIF-1, M-CIF 및 MIP-4 폴리펩티드의 변이체를 추가로 포함한다. 그러한 돌연변이는 결실, 삽입, 역위, 중복 및 유형 치환(예를 들어, 하나의 친수성 잔기가 다른 친수성 잔기로 치환된 것, 그러나 강한 소수성이 강한 친수성으로 치환되는 것은 아님)을 포함한다. 작은 변화 또는 그러한 "중성" 아미노산 치환은 일반적으로 활성에 거의 영향을 미치지 않을 것이다.

일반적으로 지방족 아미노산 Ala, Val, Leu 및 Ile중에서 서로 치환되는 것, 하이드록실 잔기 Ser과 Thr의 교환, 산성 잔기 Asp와 Glu의 교환, 아미드 잔기 Asn과 Gln사이의 치환, 염기성 잔기 Lys과 Arg의 교환 및 방향족 잔기 Phe, Tyr사이의 치환은 보존적 치환으로 간주된다.

부가적으로 특히 관심있는 것은 전하를 띤 아미노산과 전하를 띤 다른 아미노산과의 치환 또는 중성 아미노산과의 치환이다. 이러한 치환은 더 적은 응집같은 개선된 특성을 가진 단백질이 되도록 한다. 응집의 방지는 매우 바람직하다. 단백질의 응집은 활성을 감소시킬 수 있을 뿐만 아니라, 그들의 면역원성 때문에 약학 제제 제조시 문제가 될 수 있다. (Pinckard et al., Clin.Exp.Immunol.2:331-340(1967), Robbins et al., Diabetes 36:838-845(1987), Cleland et al., Crit. Rev. Therapeutic Drug Carrier Systems 10:307-377(1993)).

아미노산의 치환은 또한 세포 표면 수용체에 대한 결합의 선택성을 변화시킬 수 있다. Ostade et al.,Nature 361:266-268(1993)은 일부 TNF 알파 돌연변이가 두 개의 공지 TNF 수용체중의 단지 하나에 대해서만 TNF 알파가 선택적으로 결합하도록 함을 개시한다.

전술한 바처럼, 아미노산 변화가 표현형으로 나타나지 않을 것인지(즉, 기능에 큰 해로운 영향을 끼치지 않을 가능성)에 대한 추가의 지침이 Bowie,J.U., et al., "Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions," Science 247:1306-1310(1990)에 있다(표1 참조).

변화는 단백질의 활성 또는 접힘(folding)에 크게 영향을 주지 않는 보존적 아미노산 치환같은 적은 특성이 바람직하다. (표 I 참조)

보존적 아미노산 치환

방향족	페닐알라닌, 트립토판, 티로신
소수성	루이신, 이소루이신, 발린
극성	글루타민, 아스파라긴
염기성	아르기닌, 라이신, 히스티딘
산성	아스파르트산, 글루탐산
작은 크기	알라닌, 세린, 트레오닌, 메티오닌, 글리신

물론, 당업자가 만들 아미노산 치환의 수는 전술한 사항과 후술할 사항을 포함하는 많은 요소들에 의존한다. 일반적으로 말해서, 임의의 주어진 MPIF-1 또는 MCIF 폴리펩티드 또는 그들의 돌연변이를 위한 치환의 수는 목적에 따라 50,40,30,20,10,5,또는 3을 초과하지 않을 것이다. 특이적인 MPIF-1 또는 MCIF 아미노산 치환이 후술된다.

MPIF-1 변이체

부가적으로, MPIF-1의 변이체가 동정되고 특성이 규명되었다. 이들 유사체중 일부는 아미노 말단의 절단을 포함한다. 더욱이, 명백히 선택적(alternative) 스플라이스 부위에서 얻어진 MPIF-1 유사체 또한 동정되고 특성이 규명되었다(도 26(서열 번호 11)). 실시예 17은 이들 MPIF-1 유사체의 생물학적 활성을 개시한다. 이들 유사체의 서열은 도25(서열 번호 7,8 및 9, 서열 번호 4에서 아미노산 잔기 46-120, 45-120, 48-120, 49-120, 39-120 및 44-120)에 나타난다

MPIF-1 폴리펩티드의 특성을 개선하거나 변화시키기 위해, 단백질 공학이 이용될 수도 있다. 당업계에 공지된 재조합 DNA 기법은 신규한 단백질을 생성하기 위해 이용될 수 있다. 뮤테인(mutein)과 결실 또는 융합 단백질은 예를 들어 증가된 활성 또는 증가된 안정성을 나타낼 수 있다. 더욱이, 그들은 더 높은 수율로 정제되고 적어도 일부 정제 조건과 저장 조건하에서는 더 나은 용해도를 나타낼 수 있다. 만들어질 수 있는 부가적인 돌연변이의 예가 하기에 기재되어 잇다.

MPIF-1 아미노말단 및 카르복시 말단 결실: 인터페론 감마는 그 단백질의 카르복시 말단으로부터 8-10 아미노산 잔기를 결실시킴으로써 최대 10배 더 높은 활성을 나타낸다(Dobeli et al.,J. of Biotechnology 7:199-216(1988)). Ron et al., J.Biol.Chem.,268(4):2984-2988(1993)은 3,8,또는 27 아미노 말단 아미노산 잔기가 없어졌음에도 불구하고 헤파린 결합 활성을 갖는 변형된 KGF 단백질을 보고했다. 많은 다른 예가 당업자에게 알려져 있다.

도1(서열 번호 4)에 나타난 아미노산 서열의 특히 바람직한 MPIF-1 폴리펩티드가 하기에 기재된다.

따라서, 한 가지 양상에서, MPIF-1 N-말단 결실 돌연변이가 본 발명에 의해 제공된다. 그러한 돌연변이는 도1(서열 번호 4)의 최초 22 N-말단 아미노산 잔기(즉, 적어도 Met(1)-Arg(22)의 결실) 이상이고 최초 60 N-말단 아미노산 잔기 이하인 결실을 갖는 도1(서열 번호 4)에 나타난 아미노산 서열을 함유하는 돌연변이를 포함한다. 한편으로는, 결실은 도1(서열 번호 4)의 최초 22 N-말단 아미노산 잔기 이상최초 53 N-말단 아미노산 잔기 이하를 포함할 것이다. 한편으로는, 결실은 도1(서열 번호 4)의 최초 33 N-말단 아미노산 잔기 이상 최초 53 N-말단 아미노산 잔기 이하를 포함할 것이다.

한편으로는, 결실은 도1(서열 번호 4)의 최초 37 N-말단 아미노산 잔기(즉, 적어도 Met(1)-Pro(37)) 이상 최초 53 N-말단 아미노산 잔기 이하를 포함할 것이다.

한편으로는, 결실은 도1(서열 번호 4)의 최초 48 N-말단 아미노산 잔기 이상 최초 53 N-말단 아미노산 잔기 이하를 포함할 것이다.

전술한 MPIF-1 N-말단 결실 돌연변이의 범위에 더하여, 본 발명은 또한 전술한 범위의 모든 조합에 관련된다. 즉, 도1(서열 번호 4)의 최초 22 N-말단 아미노산 잔기 이상이고 최초 48 N-말단 아미노산 잔기 이하인 결실; 도1(서열 번호 4)의 최초 37 N-말단 아미노산 잔기 이상이고 최초 48 N-말단 아미노산 잔기 이하인 결실; 도1(서열 번호 4)의 최초 22 N-말단 아미노산 잔기 이상이고 최초 37 N-말단 아미노산 잔기 이하인 결실; 도1(서열 번호 4)의 최초 22 N-말단 아미노산 잔기 이상이고 최초 33 N-말단 아미노산 잔기 이하인 결실; 도1(서열 번호 4)의 최초 33 N-말단 아미노산 잔기 이상이고 최초 37 N-말단 아미노산 잔기 이하인 결실; 및 도1(서열 번호 4)의 최초 33 N-말단 아미노산 잔기 이상이고 최초 48 N-말단 아미노산 잔기 이하인 결실에 관련된다.

다른 양상에서는, MPIF-1 C-말단 결실 돌연변이가 본 발명에 의해 제공된다. 바람직하게는, 상기 MPIF-1 C-말단 결실 돌연변이의 N-말단 아미노산 잔기는 도1(서열 번호 4)의 아미노산 잔기 1(Met) 또는 22(Arg)이다. 그러한 돌연변이는 마지막 C-말단 아미노산 잔기(Asn(120)) 이상이고 마지막 52 C-말단 아미노산 잔기 이하인 결실(예를 들면, 도1(서열 번호 4)의 아미노산 잔기 Glu(69)-Asn(120)의 결실)을 갖는 도1(서열 번호 4)의 아미노산 서열을 포함하는 것들을 포함한다. 다른 한편으로는, 결실은 도1(서열 번호 4)의 마지막 10 내지 15 C-말단 아미노산 잔기 이상 마지막 52 C-말단 아미노산 잔기 이하를 포함할 것이다. 다른 한편으로는, 결실은 도1(서열 번호 4)의 마지막 20 C-말단 아미노산 잔기 이상 마지막 52 C-말단 아미노산 잔기 이하를 포함할 것이다. 다른 한편으로는, 결실은 도1(서열 번호 4)의 마지막 30 C-말단 아미노산 잔기 이상 마지막 52 C-말단 아미노산 잔기 이하를 포함할 것이다. 다른 한편으로는, 결실은 도1(서열 번호 4)의 마지막 36 C-말단 아미노산 잔기 이상 마지막 52 C-말단 아미노산 잔기 이하를 포함할 것이다. 다른 한편으로는, 결실은 도1(서열 번호 4)의 마지막 41 C-말단 아미노산 잔기 이상 마지막 52 C-말단 아미노산 잔기 이하를 포함할 것이다. 다른 한편으로는, 결실은 도1(서열 번호 4)의 마지막 45 C-말단 아미노산 잔기 이상 마지막 52 C-말단 아미노산 잔기이하를 포함할 것이다. 다른 한편으로는, 결실은 도1(서열 번호 4)의 마지막 48 C-말단 아미노산 잔기 이상 마지막 52 C-말단 아미노산 잔기 이하를 포함할 것이다.

전술한 C-말단 결실 돌연변이의 범위에 더하여, 본 발명은 또한 전술한 범위의 모든 조합에 관련된다. 예를 들면, 도1(서열 번호 4)의 마지막 C-말단 아미노산 잔기 이상이고 마지막 48 C-말단 아미노산 잔기 이하인 결실; 도1(서열 번호 4)의 마지막 C-말단 아미노산 잔기 이상이고 마지막 45 C-말단 아미노산 잔기 이하인 결실;도1(서열 번호 4)의 마지막 C-말단 아미노산 잔기 이상이고 마지막 41 C-말단 아미노산 잔기 이하인 결실;도1(서열 번호 4)의 마지막 C-말단 아미노산 잔기 이상이고 마지막 36 C-말단 아미노산 잔기 이하인 결실;도1(서열 번호 4)의 마지막 C-말단 아미노산 잔기 이상이고 마지막 10 C-말단 아미노산 잔기이하인 결실; 도1(서열 번호 4)의 마지막 10 C-말단 아미노산 잔기 이상이고 마지막 20 C-말단 아미노산 잔기 이하인 결실; 도1(서열 번호 4)의 마지막 10 C-말단 아미노산 잔기 이상이고 마지막 30 C-말단 아미노산 잔기 이하인 결실; 도1(서열 번호 4)의 마지막 10 C-말단 아미노산 잔기 이상이고 마지막 36 C-말단 아미노산 잔기 이하인 결실; 도1(서열 번호 4)의 마지막 20 C-말단 아미노산 잔기 이상이고 마지막 30 C-말단 아미노산 잔기 이하인 결실; 등이 있다.

또 다른 양상에서는, 본 발명은 또한 N-말단과 C-말단 잔기 둘다로부터의 결실된 아미노산을 갖는 MPIF-1 결실 돌연변이를 포함한다. 그러한 돌연변이는 전술한 N-말단 결실 돌연변이와 C-말단 결실 돌연변이의 모든 조합을 포함한다. 그러한 돌연변이는 도1(서열 번호 4)의 처음 22 N-말단 아미노산 잔기 이상 처음 52 N-말단 아미노산 잔기 이하의 결실과 마지막 C-말단 아미노산 잔기 이상 마지막 52 C-말단 아미노산 잔기 이하의 결실을 갖는 도1(서열 번호4)의 아미노산 서열을 함유한 돌연변이를 포함한다. 한편으로는, 결실은 도1(서열 번호4)의 처음 33,37,또는 48 N-말단 아미노산 이상 처음 52 N-말단 아미노산 잔기 이하를 포함할 수 있으며, 마지막 10,20,30,36,41,45 또는 48 C-말단 아미노산 잔기 이상 마지막 52 C-말단 아미노산 잔기 이하를 포함할 수 있다. 전술한 범위의 모든 조합이 또한 포함된다.

아미노산의 치환: 본 발명의 다른 양상은 또한 아미노산의 치환을 포함한다. 특히 흥미가 있는 것은 단백질의 접힘(folding)에 크게 영향을 주지 않는 보존적 아미노산 치환이다. 당업자에게 잘 알려진 보존적 아미노산 치환의 예가 상기 표1에 기재되어 있다.

부가적으로 흥미가 있는 것은 또한 전하를 띤 아미노산의 전하를 띤 다른 아미노산 또는 중성 아미노산과의 치환이다. 이것은 감소된 응집과 같은 개선된 특성을 갖는 단백질로 귀결될 수도 있다. 응집의 방지는 매우 바람직하다. 단백질의 응집은 활성을 감소시킬 수 있을 뿐만 아니라, 그들이 면역원성일 수 있어 약학 제제 제조시 문제가 될 수 있다 (Pinckard etal., Clin.Exp.Immunol.2:331-340(1967), Robbins et al., Diabetes 36:838-845(1987), Cleland et al., Crit. Rev. Therapeutic Drug Carrier Systems 10:307-377(1993)).

MPIF-1 단백질은 하나 또는 몇몇의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 함유할 수 있으며, 이들은 자연적인 돌연변이 또는 인위적인 조작에 의한 것일 수 있다. 도 1(서열 번호 4)의 아미노산 서열의 일부 바람직한 돌연변이의 예가 하기에 제공된다. (예를 들어, Ala(21)Met은 도1(서열 번호4)의 21번 위치의 Ala가 Met에 의해 치환됨을 나타낸다.)

MPIF-1 137 아미노산 스플라이스 변이체의 아미노말단 결실

전술한 바대로, 본 발명은 추가로 사람 MPIF-1 스플라이스 변이체를 제공한다. cDNA 서열과 137 아미노산 서열이 도26A(각각, 서열 번호 10과 11)에 나타난다. 진핵 세포 발현 시스템을 이용하여, 본 발명은 이 MPIF-1 스플라이스 변이체의 N-말단 결실 돌연변이 세 가지를 발견했다. 이들은 His(60)-Asn(137); Met(46)-Asn(137); 및 Pro(54)-Asn(137)을 포함한다. 따라서, 다른 양상에서, MPIF-1 스플라이스 변이체 N-말단 결실 돌연변이가 본 발명에 의해 제공된다. 그러한 돌연변이는 도26A(서열 번호11)의 처음 45 N-말단 아미노산 잔기 이상 처음 59 N-말단 아미노산 잔기 이하의 결실을 갖는, 도26A(서열 번호 11)에 나타난 아미노산 서열을 포함하는 것들을 포함한다. 한편으로는, 결실은 도26A(서열 번호11)의 처음 53 N-말단 아미노산 잔기 이상 처음 59 N-말단 아미노산 잔기 이하를 포함할 것이다. 한편으로는, 결실은 도26A(서열 번호11)의 처음 45 N-말단 아미노산 잔기 이상 처음 53 N-말단 아미노산 잔기 이하를 포함할 것이다.

M-CIF 변이체

M-CIF 폴리펩티드의 특징을 개선하거나 변형하기 위해 단백질 공학이 이용될 수 도 있다. 당업계에 공지된 재조합 DNA 기법은 신규한 단백질을 생성하기 위해 이용될 수 있다. 뮤테인(mutein)과 결실 또는 융합 단백질은 예를 들어 증가된 활성 또는 증가된 안정성을 나타낼 수 있다. 더욱이, 그들은 더 높은 수율로 정제되고 적어도 일부 정제 조건과 저장 조건하에서는 더 나은 용해도를 나타낼 수 있다. 만들어질 수 있는 부가적인 돌연변이의 예가 하기에 기재되어 잇다.

M-CIF 아미노말단 및 카르복시 말단 결실: 인터페론 감마는 그 단백질의 카르복시 말단으로부터 8-10 아미노산 잔기를 결실시킴으로써 최대 10배 더 높은 활성을 나타낸다(Dobeli et al.,J. of Biotechnology 7:199-216(1988)). Ron et al., J.Biol.Chem.,268(4):2984-2988(1993)은 3,8,또는 27 아미노 말단 아미노산 잔기가 없어졌음에도 불구하고 헤파린 결합 활성을 갖는 변형된 KGF 단백질을 보고했다. 많은 다른 예가 당업자에게 알려져 있다.

도2(서열 번호 2)에 나타난 아미노산 서열의 일부 바람직한 돌연변이중에서 특히 바람직한 M-CIF 폴리펩티드 변이체가 하기에 기재된다.

따라서, 한 가지 양상에서, M-CIF N-말단 결실 돌연변이가 본 발명에 의해 제공된다. 그러한 돌연변이는 도2(서열 번호 2)의 최초 20 N-말단 아미노산 잔기(즉, 적어도 Met(1)-Thr(20)의 결실) 이상이고 처음 40 N-말단 아미노산 잔기 이하인 결실을 갖는 도2(서열 번호 2)에 나타난 아미노산 서열을 함유하는 돌연변이를 포함한다. 한편으로는, 결실은 도2(서열 번호 2)의 최초 20 N-말단 아미노산 잔기 이상 최초 33 N-말단 아미노산 잔기 이하를 포함할 것이다. 한편으로는, 결실은 도2(서열 번호 2)의 최초 23 N-말단 아미노산 잔기 이상 최초 33 N-말단 아미노산 잔기 이하를 포함할 것이다. 한편으로는, 결실은 도2(서열 번호 2)의 최초 28 N-말단 아미노산 잔기 이상 최초 33 N-말단 아미노산 잔기 이하를 포함할 것이다.

전술한 M-CIF N-말단 결실 돌연변이의 범위에 더하여, 본 발명은 또한 전술한 범위의 모든 조합에 관련된다. 즉, 도2(서열 번호 2)의 최초 20 N-말단 아미노산 잔기 이상 최초 28 N-말단 아미노산 잔기 이하의 결실; 도2(서열 번호 2)의 최초 20 N-말단 아미노산 잔기 이상 최초 23 N-말단 아미노산 잔기 이하의 결실; 도2(서열 번호 2)의 최초 28 N-말단 아미노산 잔기 이상 최초 33 N-말단 아미노산 잔기 이하의 결실에 관련된다.

다른 양상에서는, M-CIF C-말단 결실 돌연변이가 본 발명에 의해 제공된다. 바람직하게는, 상기 M-CIF C-말단 결실 돌연변이의 N-말단 아미노산 잔기는 도2(서열 번호 2)의 아미노산 잔기 1(Met) 또는 20(Thr)이다. 그러한 돌연변이는 도2(서열 번호2)의 마지막 C-말단 아미노산 잔기(Asn(93)) 이상 마지막 25 C-말단 아미노산 잔기 이하의 결실(예를 들면, 도2(서열 번호 2)의 아미노산 잔기 Lys(69)-Asn(93)의 결실)을 제외하고 도2(서열 번호 2)의 아미노산 서열을 포함하는 것들을 포함한다. 다른 한편으로는, 결실은 도2(서열 번호 2)의 마지막 C-말단 아미노산 잔기 이상 마지막 18 C-말단 아미노산 잔기 이하를 포함할 것이다. 다른 한편으로는, 결실은 도2(서열 번호 2)의 마지막 3 C-말단 아미노산 잔기 이상 마지막 18 C-말단 아미노산 잔기 이하를 포함할 것이다. 다른 한편으로는, 결실은 도2(서열 번호 2)의 마지막 5 C-말단 아미노산 잔기 이상 마지막 18 C-말단 아미노산 잔기 이하를 포함할 것이다. 다른 한편으로는, 결실은 도2(서열 번호 2)의 마지막 12 C-말단 아미노산 잔기 이상 마지막 18 C-말단 아미노산 잔기 이하를 포함할 것이다. 다른 한편으로는, 결실은 도2(서열 번호 2)의 마지막 5 C-말단 아미노산 잔기 이상 마지막 12 C-말단 아미노산 잔기 이하를 포함할 것이다.

또 다른 양상에서는, 본 발명은 또한 N-말단과 C-말단 잔기 둘다로부터의 결실된 아미노산을 갖는 M-CIF 결실 돌연변이를 포함한다. 그러한 돌연변이는 전술한 N-말단 결실 돌연변이와 C-말단 결실 돌연변이의 모든 조합을 포함한다. 그러한 돌연변이는 도2(서열 번호 2)의 처음 20 N-말단 아미노산 잔기 이상 처음 33 N-말단 아미노산 잔기 이하의 결실과 마지막 C-말단 아미노산 잔기 이상 마지막 18 C-말단 아미노산 잔기 이하의 결실을 갖는 도2(서열 번호2)의 아미노산 서열을 함유한 돌연변이를 포함한다. 한편으로는, 결실은 도2(서열 번호2)의 처음 23,또는 28 N-말단 아미노산 이상 처음 33 N-말단 아미노산 잔기 이하를 포함할 수 있으며, 마지막 3,5, 또는 12 C-말단 아미노산 잔기 이상 마지막 18 C-말단 아미노산 잔기 이하를 포함할 수 있다. 전술한 범위의 모든 조합이 또한 포함된다.

M-CIF 폴리펩티드는 하나 또는 몇몇의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 함유할 수 있으며, 이들은 자연적인 돌연변이 또는 인위적인 조작에 의한 것일 수 있다. 도 2(서열 번호 2)의 아미노산 서열의 일부 바람직한 돌연변이의 예가 하기에 제공된다.

본 발명의 폴리펩티드는 분리된 형태로, 그리고 실질적으로 정제된 형태로 제공되는 것이 바람직하다. 재조합에 의해 생성된 MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4 폴리펩티드는 Smith와 Johnson, Gene 67:31-40(1988)에 기술된 1 단계 방법에 의해 실질적으로 정제될 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드는 리더를 함유한 기탁된 cDNA에 의해 암호되는 폴리펩티드, 리더가 없는 기탁된 cDNA에 의해 암호된 성숙 폴리펩티드(즉, 성숙 단백질), 리더를 함유한 도1(서열 번호 4), 도2(서열 번호 2) 또는 도3(서열 번호 6)의 폴리펩티드, 리더를 함유하지만 N-말단 메티오닌 잔기가 없는 도1(서열 번호 4), 도2(서열 번호 2) 또는 도3(서열 번호 6)의 폴리펩티드, 리더가 없는 도1(서열 번호 4), 도2(서열 번호 2) 또는 도3(서열 번호 6)의 폴리펩티드, 전술한 것들에 대해 적어도 95% 유사성, 더욱 바람직하게는 적어도 96%,97%,98% 또는 99% 유사성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 본 발명의 추가의 폴리펩티드는 기탁된 cDNA에 의해 암호되는 폴리펩티드에 대해, 도1(서열 번호 4), 도2(서열 번호 2) 또는 도3(서열 번호 6)의 폴리펩티드에 대해 적어도 95% 동일한, 더욱 바람직하게는 적어도 96%,97%,98% 또는 99% 동일한 폴리펩티드를 포함하며, 또한 그러한 폴리펩티드의 적어도 30 아미노산 그리고 더욱 바람직하게는 적어도 50 아미노산을 갖는 부분들을 포함한다.

두 폴리펩티드가 "% 유사성"이 있다는 것은 베스트피트 프로그램(위스콘신 서열 분석 패키지, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711)을 이용하여 두 폴리펩티드의 아미노산 서열을 비교하고 유사성 결정을 위해 디폴트를 설정하여 얻어진 유사성 점수를 말한다. 베스트피트는 Smith와 Waterman의 Advances in Applied Mathematics 2:482-489(1981)의 국소 상동성 알고리즘을 이용하여 두 서열사이의 최상의 상동성 절편을 찾는다.

예를 들어, MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4 폴리펩티드의 기준 아미노산 서열에 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드는 그 폴리펩티드의 아미노산서열이 MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4 폴리펩티드의 기준 아미노산의 각 100 아미노산마다 최대 5개까지의 아미노산 변이를 포함할 수도 있다는 것을 제외하고는 폴리펩티드의 아미노산 서열이 기준 서열과 동일하다는 것을 말한다. 다시 말하면, 기준 아미노산 서열에 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 얻기 위해서는, 기준 서열에서 최대 5%의 아미노산 잔기가 결실되거나, 다른 아미노산으로 치환되거나 또는 기준 서열의 총 아미노산 잔기의 최대 5%의 아미노산 숫자만큼의 아미노산이 기준 서열에 삽입될 수도 있다. 기준 서열의 이러한 변이는 기준 아미노산 서열의 아미노 또는 카르복시 말단 위치에서 일어날 수도 있고 말단 위치사이의 어느곳에서 일어날 수도 있으며, 기준 서열내의 잔기 사이에 개별적으로 흩어져 존재하거나 기준 서열내에 하나 이상의 연속적인 군으로 존재할 수도 있다.

실제적인 문제로서, 임의의 특정 폴리펩티드가 예를 들어 도1(서열 번호4),도2(서열 번호 2),또는 도3(서열 번호6)에 나타난 아미노산 서열에 또는 기탁된 cDNA 클론에 의해 암호되는 아미노산 서열에 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한지 여부는 베스트피트 프로그램(위스콘신 서열 분석 패키지, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711)같은 공지의 컴퓨터 프로그램을 이용하여 결정할 수 있다. 베스트피트나 기타 서열 배열 프로그램을 이용하여 특정 서열이 예를 들어 본 발명의 기준 서열에 95% 동일한지를 결정할 때는, 물론 그 파라미터는 동일성의 백분율이 기준 아미노산 서열의 전장에 대해 계산되고 기준 아미노산 서열의 아미노산 잔기 총수의 최대 5%까지 상동성의 차이가 허용되도록 설정된다.

본 발명의 폴리펩티드는 공지의 방법을 이용하는 SDS-PAGE 젤, 또는 분자체 젤 여과 칼럼에서 분자량 마커로 이용될 수 있다.

후술하는 바처럼, 본 발명의 폴리펩티드는 또한 폴리클로날 항체와 단일 클론 항체를 생성시키기 위해 이용될 수 있으며, 이들은 MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4 단백질 발현을 검출하기 위한 분석에서 유용하며 또는 MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4 단백질 기능을 증진시키거나 억제할 수 있는 아고니스트와 길항 물질로서 유용하다. 또한, 그러한 폴리펩티드는 역시 본 발명에 따른 아고니스트와 길항 물질 후보인, MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4 단백질 결합 단백질을 포착하기 위한 효모 2-하이브리드 시스템에서 이용될 수 있다. 효모 2-하이브리드 시스템은 Fields and Song, Nature 340:245-246(1989)에 설명된다.

MPIF-1, M-CIF 및 MIP-4 에피토프-함유 폴리펩티드

다른 양상에서, 본 발명은 본 발명 폴리펩티드의 에피토프-함유 부분을 포함한 펩티드 또는 폴리펩티드를 제공한다. 이 폴리펩티드 부분의 에피토프는 본 발명 폴리펩티드의 면역원성 또는 항원성 에피토프이다. "면역원성 에피토프"는 전체 단백질이 면역원일때 항체 반응을 유발하는 단백질의 일부를 말한다. 이들 면역원성 에피토프는 그 분자상의 몇 위치에 한정되는 것으로 생각된다. 다른 한편으로는, 항체가 결합할 수 있는 단백질 분자의 부분을 "항원성 에피토프"라고 한다. 하나의 단백질의 면역원성 에피토프의 수는 항원성 에피토프의 수보다 적다. 예를 들어, Geysen et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:3998-4002(1983)을 참조.

항원성 에피토프를 함유한(즉, 항체가 결합할 수 있는 단백질 분자의 부분을 함유한) 펩티드 또는 폴리펩티드의 선별에 대해서는, 단백질 서열의 일부를 모방하는 상대적으로 짧은 합성 펩티드가 부분적으로 모방된 그 단백질과 반응하는 항혈청을 유발할 수 있다고 잘 알려져 있다. Sutcliffe, J.G.,Shinnick, T.M., Green, N. and Learner, R.A., Science 219:660-666(1983)을 참조.

단백질 반응성 혈청을 유발할 수 있는 펩티드는 단백질의 일차 서열로 주로 나타내지며, 간단한 화학적 규칙에 의해 특징지어질 수 있으며, 본래의 단백질의 면역우세 부분이나 아미노 또는 카르복실 말단에 한정되지 않는다. 극히 소수성인 펩티드와 6이하의 잔기의 펩티드는 모방된 단백질에 결합하는 항체를 유도하는 데 있어서 비효과적이다. 더 긴 펩티드, 특히 프롤린 잔기를 함유한 펩티드가 효과적이다. 상기 Sutcliffe et al., 661 참조. 예를 들어, 이 지침에 따라 고안되었으며 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 HA1 폴리펩티드 쇄의 서열의 75%를 지니는 8-39 아미노산 잔기를 함유한 20 펩티드중 18 펩티드가 HA1 단백질 또는 바이러스 자체와 반응하는 항체를 유도했으며, MuLV 폴리머라제로부터의 12펩티드중 12펩티드와 광견병 당단백질로부터의 18펩티드중 18펩티드가 각각의 단백질과 침전되는 항체를 유도했다.

본 발명의 항원성 에피토프-함유 펩티드와 폴리펩티드는 본 발명 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 단일 클론 항체를 비롯한 항체들을 생성시키는데 유용하다. 따라서, 항원 에피토프-함유 펩티드로 면역된 공여자로부터의 비장 세포의 융합에 의해 얻어진 하이브리도마중 다수가 일반적으로 천연의 단백질과 반응성이 있는 항체를 분비한다. 상기 Sutcliffe et al., 663 참조. 항원성 에피토프-함유 펩티드 또는 폴리펩티드에 의해 생성된 항체는 모방된 단백질을 검출하는 데 유용하며, 다른 펩티드에 대한 항체는 번역후 프로세싱을 진행하는 단백질 전구체의 다양한 부분의 운명을 추적하는 데 유용할 수도 있다. 짧은 펩티드(예를 들어 약 9 아미노산)도 면역침전 분석에서 더 큰 펩티드에 결합하여 치환할 수 있음이 알려졌기 때문에, 펩티드와 항-펩티드 항체는 모방된 단백질을 위한 다양한 정량적 또는 정성적 분석, 예를 들어 경쟁적 분석에 이용될 수도 있다. 예를 들어, Wilson et al., Cell 37:767-778(1984) at777 참조. 본 발명의 항-펩티드 항체는 또한 공지된 방법을 이용하는 흡착 크로마토그래피에 의한, 모방된 단백질의 정제에 유용하다.

전술한 지침에 따라 고안된 본 발명의 항원성 에피토프-함유 펩티드와 폴리펩티드는 본 발명 폴리펩티드의 아미노산 서열내에 함유된, 바람직하게는 적어도 7, 더욱 바람직하게는 적어도 9, 가장 바람직하게는 약 15 내지 약 30 아미노산 사이의 서열을 함유한다. 하지만, 본 발명 폴리펩티드의 아미노산 서열의 더 큰 부분즉 약 30 내지 약 50 아미노산을 함유하거나, 또는 최대 본 발명 폴리펩티드의 전체 아미노산 서열까지의 임의의 길이의 펩티드 또는 폴리펩티드 역시, 본 발명의 에피토프-함유 펩티드 또는 폴리펩티드로 간주되며 또한 모방된 단백질과 반응하는 항체를 유도하는 데 유용하다. 바람직하게는, 에피토프-함유 펩티드의 아미노산 서열은 수용액에서 상당한 용해도를 제공하도록 선택되며(즉, 그 서열은 상대적으로 친수성인 잔기를 포함하며 소수성이 큰 잔기는 제외되는 것이 바람직하다), 프롤린 잔기를 포함한 서열이 특히 바람직하다.

MPIF-1-특이적 항체를 생성하기 위해 이용될 수 있는 항원성 폴리펩티드 또는 펩티드의 비제한적 예는 서열 번호 4의 약 21 내지 약 30 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드; 서열 번호 4의 약 31 내지 약 44 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드; 서열 번호 4의 약 49 내지 약 55 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드; 서열 번호 4의 약 59 내지 약 67 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드; 서열 번호 4의 약 72 내지 약 83 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드; 서열 번호 4의 약 86 내지 약 103 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드; 서열 번호 4의 약 110 내지 약 120 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 전술한 바처럼, 발명자들은 상기 폴리펩티드 단편이 MPIF-1 단백질의 항원성 부분임을 결정했다.

M-CIF-특이적 항체를 생성하기 위해 이용될 수 있는 항원성 폴리펩티드 또는 펩티드의 비제한적 예는 서열 번호 2의 약 20 내지 약 36 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드; 서열 번호 2의 약 42 내지 약 52 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드; 서열 번호 2의 약 52 내지 약 64 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드; 서열 번호 2의 약 67 내지 약 75 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드; 서열 번호 2의 약 75 내지 약 84 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드; 서열 번호 2의 약 86 내지 약 93 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 전술한 바처럼, 발명자들은 상기 폴리펩티드 단편이 M-CIF 단백질의 항원성 부분임을 결정했다.

본 발명의 에피토프-함유 펩티드와 폴리펩티드는 본 발명의 핵산 분자를 이용하여, 재조합 수단을 포함한 통상적인 펩티드 또는 폴리펩티드 제조 수단에 의해 생성될 수 있다.예를 들면, 짧은 에피토프-함유 아미노산 서열은 재조합 생산과 정제동안과 항-펩티드 항체 생성을 위한 면역화동안 담체로서 작용하는 더 큰 폴리펩티드에 융합될 수도 있다. 에피토프-함유 펩티드는 또한 공지의 화학 합성에 의해 합성될 수도 있다. 예를 들면, Houghten은 많은 수의 펩티드의 합성을 위한 간단한 방법을 개시하였는 바, HA1 폴리펩티드의 단편의 하나의 아미노산 변이체를 나타내는 248가지의 다른 13잔기 펩티드 10-20mg 을 4주 이내에 제조하고 특징지었다(ELISA-형 결합 연구에 의해).(Houghten, R.A.(1985) General method for the rapid solid phase synthesis of large numbers of peptides: specificity of antigen-antibody interaction at the level of individual amino acids. Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:5131-5135.) 이러한 "Simultaneous Multiple Peptide Synthesis(SMPS)" 방법은 Houghten et al.의 미국 특허 제4,631,211(1986)에 개시되어 있다. 이 방법에서 다양한 펩티드의 고체-상 합성을 위한 개개의 수지는 별도의 용매-투과성 패킷에 함유되어 고체-상 방법에 관계된 다수의 동일한 반복 단계의 적절한 이용을 가능하게 한다. 완전한 수동 과정은 500-1000 또는 그 이상의 합성이 동시에 수행되도록 한다. Houghten et al., supra, at 5134.

본 발명의 바람직한 핵산 단편은 MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4 단백질의 에피토프-함유 부분을 암호하는 핵산 분자를 포함한다.

특히, 본 발명의 MPIF-1의 그러한 핵산 단편은 서열 번호 4의 약 21 내지 약 30 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드; 서열 번호 4의 약 31 내지 약 44 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드; 서열 번호 4의 약 49 내지 약 55 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드; 서열 번호 4의 약 59 내지 약 67 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드; 서열 번호 4의 약 72 내지 약 83 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드; 서열 번호 4의 약 86 내지 약 103 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드; 서열 번호 4의 약 110 내지 약 120 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드;또는 그안의 임의의 범위를 암호하는 핵산 분자를 포함한다.

특히, 본 발명의 M-CIF의 그러한 핵산 단편은 서열 번호 2의 약 20 내지 약 36 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드; 서열 번호 2의 약 42 내지 약 52 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드; 서열 번호 2의 약 52 내지 약 64 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드; 서열 번호 2의 약 67 내지 약 75 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드; 서열 번호 2의 약 75 내지 약 84 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드; 서열 번호 2의 약 86 내지 약 93 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드;또는 그안의 임의의 범위를 암호하는 핵산 분자를 포함한다.

발명자들은 상기 폴리펩티드 단편들이 MPIF-1과 M-CIF 단백질의 항원성 부분임을 결정했다. MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4 단백질의 기타 그러한 에피토프-함유 부분을 결정하는 방법은 후술된다.

본 발명의 에피토프 함유 펩티드와 폴리펩티드는 당해 기술 분야에 공지되어 있는 방법에 따라 항체를 유도하는 데 사용된다. 예를 들면, 수트클리프 등의 전술한 문헌, 윌슨 등의 전술한 문헌, 쵸우, 엠 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:910∼914] 및 브리틀, 에프. 제이. 등의 문헌[J. Gen. Virol. 66:2347-2354(1985)]을 참조할 수 있다. 일반적으로, 동물은 유리 펩티드로 면역화시킬 수 있지만, 항펩티드 항체 역가는 펩티드를 거대 분자 담체, 예를 들면 키홀 림페트 헤마시아닌(KLH) 또는 파상풍 유독소에 결합시켜 면역 자극시킬 수 있다. 예를 들면, 시스테인을 함유하는 펩티드는 m-말레이미도벤조일-N-히드록시숙신이미드 에스테르(MBS)와 같은 링커를 사용하여 담체에 결합시킬 수 있는 반면, 다른 펩티드들은 글루타르알데히드와 같은 더 일반적인 결합제를 사용하여 담체에 결합시킬 수 있다. 토끼, 래트 및 마우스와 같은 동물은 유리 펩티드 또는 담체 결합 펩티드에 의해, 예를 들면 약 100 g의 펩티드 또는 담체 단백질 및 프로인트 보조제를 함유하는 에멀션을 복막내 주사 및/또는 피내 주사함으로써 면역화시킬 수 있다. 예를 들면 고체 표면에 흡착된 유리 펩티드를 사용하는 ELISA 분석법을 이용하여 검출할 수 있는 항펩티드 항체의 유용한 역가를 제공하기 위해서는, 약 2주 간격으로 수회의 면역 자극 주사가 필요할 수 있다. 면역화된 동물로부터 채취한 혈청 중의 항펩티드 항체의 역가는 항펩티드 항체를 선택함으로써, 예를 들면 당해 기술 분야에 공지된 방법에 따라 고체 담체 상에 펩티드를 흡착시키고 선택된 항체를 용출시키므로써 증가시킬 수 있다.

본 발명의 면역원성 에피토프 함유 펩티드, 즉 전체 단백질이 면역원일 경우에 항체 반응을 유도하는 단백질의 부위는 당해 기술 분야에 공지된 방법에 따라 동정한다. 예를 들면, 전술한 게이슨 등의 문헌에는 효소 결합된 면역 흡수 시험에서 반응하기에 충분히 순수한 수백개의 펩티드를 고체 담체 상에서 고속으로 동시 합성하는 방법이 개시되어 있다. 합성된 펩티드와 항체와의 상호 작용은 담체로부터 그들을 분리해 내지 않고도 용이하게 검출된다. 이러한 방식으로 목적하는 단백질의 면역원성 에피토프를 함유하는 펩티드는 당업자들에 의해 용이하게 동정될 수 있다. 예를 들면, 구제역 비루스의 외피 단백질 중에 존재하는 면역학적으로 중요한 에피토프는 게이슨 등에 의해서 단백질의 전체 213개의 아미노산 서열을 포함하는 208개의 가능한 모든 헥사펩티드의 중첩 세트를 합성하여 7개의 아미노산을 분해함으로써 발견하였다. 이어서, 에피토프 내의 매 위치마다 차례로 20개의 아미노산 모두를 치환시킨 펩티드의 완전 치환 세트를 합성하고, 항체와의 반응에 특이성을 나타내는 특정의 아미노산을 결정하였다. 본 발명의 에피토프 함유 펩티드의 펩티드 동족체는 이 방법에 의해 용이하게 제조할 수 있다. 게이슨 등의 미국 특허 제4,708,781호(1987)에는 또한 소정 단백질의 면역원성 에피토프를 함유하는 펩티드를 동정하는 방법이 개시되어 있다.

또한, 게이슨 등의 미국 특허 제5,194,392호(1990)에는 관심 항체의 특정 파라토프(항원 결합 부위)에 상보적인 에피트프의 국소 등가물(즉, "미모토프")인 단량체(아미노산 또는 다른 화합물)의 서열을 검색하거나 결정하는 일반적인 방법이 개시되어 있다. 또한, 게이슨 등의 미국 특허 제4,433,092호(1989)에는 특정의 관심 수용체의 리간드 결합 부위에 상보적인 리간드의 국소 등가물인 단량체의 서열을 검색하거나 결정하는 방법이 개시되어 있다. 유사하게, 퍼알킬화된 올리고펩티드 혼합물에 관한 허그튼 알. 에이 등의 미국 특허 제5,480,971호(1996)에는 선형 C₁∼C₇알킬 퍼알킬화된 올리고펩티드와 그러한 펩티드의 세트 및 라이브러리, 뿐만 아니라 그러한 올리고펩티드 세트 및 라이브러리를 관심 수용체 분자에 우선적으로 결합하는 퍼알킬화된 올리고펩티드의 서열을 결정하는 데 사용하는 방법이 개시되어 있다. 즉, 본 발명의 에피토프 함유 펩티드의 비 펩티드 동족체는 그러한 방법들에 의해 용이하게 제조할 수 있다.

"폴리펩티드 및 펩티드"에 관한 이 설명 부분에서 인용한 각 문헌들의 개시 내용은 모두 본 명세서에서 참고로 인용한다.

전술한 본 발명의 MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4 폴리펩티드 및 이들의 에피토프 함유 단편들이 면역 글로블린(IgG)의 일정 도메인 부위에 결합하여 키메라성 폴리펩티드를 형성할 수 있음은 당업자들에게 자명한 것이다. 이러한 융합 단백질은 정제가 용이하며 생체내에서 증가된 반감기를 나타낸다. 이것은, 예를 들면 인체 CD4-폴리펩피드의 처음 2개의 도메인과 포유 동물의 면역 글로블린의 중쇄 또는 경쇄의 일정 영역의 각종 도메인으로 이루어지는 키메라성 단백질에서 보인 현상이었다[EPA 394,827; 트라우네커 등, Nature 331;84∼86(1988)]. IgG 부분으로 인해 디설파이드 결합 이합체성 구조를 갖는 융합 단백질은 또한 단량체성 MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4 단백질 또는 단백질 단편 단독의 경우에 비해 다른 분자를 결합하고 중화시키는 데 더욱 효과적일 수 있다[파운톨라키스 등, J. Biochem 270:3958∼3964(1995)].

폴리펩티드 정제 및 분리. 재조합 세포 배양물로부터 MPIF-1, M-CIF 및 MIP-4를 회수하고 황산암모늄 또는 에탄올 침전, 산 추출, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로스 크로마토그래피, 소수성 상호 작용 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 히드록시아파타이트 크로마토그래피 및 렉틴 크로마토그래피를 비롯한 방법에 의해 정제한다. 필요에 따라 단백질 재중첩 단계를 이용하여 성숙 단백질의 배열을 완성시킬 수 있다. 마지막으로, 최종 정제 단계에서 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 사용할 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드는 천연적으로 정제된 생성물, 또는 화학적 합성 방법에 의한 생성물 또는 원핵 생물성 또는 진핵 생물성 숙주, 예를 들면, 배양액 상태의 박테리아, 효모, 고등 식물, 곤충 및 포유 동물 세포로부터 재조합 기술에 의해 제조한 생성물일 수 있다. 재조합 제조 방법에 사용된 숙주에 따라, 본 발명의 폴리펩티드는 포유 동물 또는 다른 진핵 생물성 탄수화물에 의해 글리코실화시키거나 글리코실화시키지 않을 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 또한 초기의 메티오닌 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.

항체. 완전한 MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4 단백질 또는 이들의 항원성 폴리펩티드 단편에 대한 본 발명에 유용한 MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4 단백질 특이성 항체를 제조할 수 있으며, 이들은 알부민과 같은 담체 단백질과 함께, 충분히 긴 경우(약 아미노산 25개 이상)에는 담체 없이 동물(예를 들면, 토끼 또는 마우스) 신체에 존재할 수 있다.

본 명세서에 사용된 용어 "항체"(Ab) 또는 "단일 클론 항체"(Mab)는 완전한 분자뿐만 아니라 MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 단편[예를 들면, Fab 및 F(ab')₂단편]을 포함하는 것을 의미한다. Fab 및 F(ab')₂단편은 완전한 항체에서 Fc 단편이 결핍된 것인데, 순환을 통해 보다 신속하게 정화되며, 완전한 항체의 비특이성 조직 결합력이 작을 수 있다[웨일 등, J. Nucl. Med. 24:316∼325(1983)]. 즉, 그러한 단편들이 바람직하다.

폴리펩티드, 이들의 단편 또는 다른 유도체, 또는 이들의 유사체, 또는 이들을 발현하는 세포는 이들에 대한 항체를 제조하는 데 면역원으로서 사용할 수 있다. 그러한 항체는, 예를 들면 폴리 클론 항체 또는 단일 클론 항체일 수 있다. 본 발명은 또한 키메라성 단일쇄 및 인체화된 항체, 뿐만 아니라 Fab 단편, 또는 Fab 발현 라이브러리의 생성물을 포함한다. 그러한 항체 및 단편들을 제조하는 데에는 당해 기술 분야에 공지된 여러 가지 방법들을 이용할 수 있다.

본 발명의 서열에 대응하는 폴리펩티드에 대한 항체 또는 이것의 생체내 수용체는 동물에 폴리펩티드를 직접 주사하여 얻거나, 또는 동물에, 바람직하게는 사람 이외의 동물에 폴리펩티드를 투여하여 얻을 수 있다. 이렇게 얻어진 항체는 폴리펩티드 자체를 결합한다. 이러한 방식으로, 폴리펩티드의 단편만을 암호화하는 서열의 경우에도 본래의 완전 폴리펩티드를 결합하는 항체를 생성시키는 데 사용할 수 있다. 그러한 항체는 그 폴리펩티드를 발현하는 조직으로부터 폴리펩티드를 분리해 내는 데 사용할 수 있다.

단일 클론 항체를 제조하는 데는 연속 세포주 배양물에 의해 제조된 항체를 제공하는 어떤 기술이라도 이용할 수 있다. 그 예에는 하이브리도마 기술(콜러 및 밀스테인, 1975, Nature, 256:495∼497), 트리오마 기술, 인체 B-세포 하이브리도마 기술(코즈보 등, 1983, Immunology today 4:72), 및 인체 단일 클론 항체를 제조하기 위한 EBV-하이브리도마 기술(콜 등, 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, 알란 알. 리스, 인크., pp. 77∼96)이 포함된다.

개시된 단일쇄 항체의 제조 방법들(미국 특허 제4,946,778호)은 본 발명의 면역원성 폴리펩티드 생성물에 대한 단일쇄 항체를 제조하는 데 응용할 수 있다.

본 발명의 항체는 다양한 어떤 방법이라도 이용하여 제조할 수 있다. 예를 들면, MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4 단백질 또는 이들의 항원성 단편을 발현하는 세포는 동물에 투여하여 폴리 클론 항체를 함유하는 혈청의 제조를 유도할 수 있다. 천연 오염 물질을 실질적으로 함유하지 않도록 MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4 단백질의 제제를 제조하고 정제하는 방법이 바람직한 방법이다. 그러한 제제는 더 큰 특이성을 가진 폴리 클론 항혈청을 생성하도록 동물에 주입된다.

본 발명의 항체가 단일 클론 항체(또는 그것의 MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4 단백질 결합 단편)인 방법이 가장 바람직하다. 그러한 단일 클론 항체는 하이브리도마 기법[콜러 등, Nature 256:495(1975); 콜러 등, Eur. J. Immunol. 6:511(1976); 콜러 등, Eur. J. Immunol. 6:292(1976); 햄머링 등, In: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, Elsevier, N.Y.,(1981) pp.563∼681]을 이용하여 제조할 수 있다. 일반적으로, 그러한 방법들은 동물(바람직하게는, 마우스)을 MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4 단백질 항체, 또는 더욱 바람직하게는 MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4 단백질 발현 세포로 면역화시키는 단계를 수반한다. 적합한 세포는 항 MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4 단백질 항체를 결합하는 그들의 용량에 의해 인식할 수 있다. 그러한 세포들은 임의의 적합한 조직 배양 배지 중에서 배양시킬 수 있으나, 10% 소 태아 혈청(약 56℃에서 비활성화된 것)이 보충되고, 약 10 g/l의 비필수 아미노산, 약 1,000 U/ml의 페니실린 및 약 100 g/ml의 스트렙토마이신이 보충된 어얼(Earle)의 변성 이글 배지 중에서 세포를 배양시키는 것이 바람직하다. 그러한 마우스의 비장 세포를 추출하여 적합한 미엘로마 세포주와 융합시킨다. 본 발명에 의하면 적합한 미엘로마 세포주 어떤 것이라도 사용할 수 있으나, 미국 모식균 배양소(ATCC; 미국 메릴랜드주 록빌 소재)로부터 입수할 수 있는 모(母) 미엘로마 세포주(SP2O)를 사용하는 것이 바람직하다. 융합 후, 생성된 하이브리도마 세포를 HAT 배지 중에 선별적으로 유지시킨 후, 원즈 등의 문헌[Gastroenterology 80:225∼232(1981)]에 개시되어 있는 바와 같이 희석을 제한하여 클로닝한다. 그러한 선별법을 통해 제조한 하이브리도마 세포를 분석하여 MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4 단백질 항원을 결합할 수 있는 항체를 분비하는 클론을 동정한다.

대안적으로, MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4 단백질 항원에 결합할 수 있는 추가의 항체는 항-유전 물질형 항체를 사용하는 2 단계 방법을 통해 제조할 수 있다. 이러한 방법은 항체 자체가 항원이라는 사실과, 따라서 제2 항체에 결합하는 항체를 얻을 수 있다는 사실을 이용하는 것이다. 이 방법에 의하면, MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4 단백질 특이성 항체는 동물, 바람직하게는 마우스를 면역화시키는 데 사용된다. 이어서 그러한 동물의 비장 세포를 사용하여 하이브리도마 세포를 제조하고, 하이브리도마 세포를 스크리닝하여 MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4 단백질 특이성 항체에 대한 결합 능력이 MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4 단백질 항원에 의해 차단될 수 있는 항체를 동정한다. 그러한 항체는 MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4 단백질 특이성 항체에 대한 항-유전 물질형 항체를 포함하며, 동물을 면역화시켜서 추가의 MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4 단백질 특이성 항체의 형성을 유도하는 데 사용할 수 있다.

본 발명에 의한 항체의 Fab 및 F(ab')₂및 다른 단편들은 본 명세서에서 설명하는 방법에 따라 사용할 수 있다. 그러한 단편들은 파파인(Fab 단편을 제조하는 경우) 또는 펩신[F(ab')₂단편을 제조하는 경우]을 사용하는 단백질 분해법에 의해 통상적으로 제조된다. 대안적으로, MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4 단백질 결합 단편은 재조합 DNA 기술 또는 합성 화학 기술을 이용하여 제조할 수 있다.

"인간화된" 키메라성 단일 클론 항체를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 그러한 항체는 전술한 단일 클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포로부터 유도된 유전자적 구조물을 사용하여 제조할 수 있다. 키메라성 항체를 제조하는 방법은 당해 기술 분야에 공지되어 있다[참조: 모리슨, Science 229:1202(1985); 오이 등, Bio Techniques 4:214(1986); 캐빌리 등, 미국 특허 제4,816,567호; 타니구치 등, 유럽 특허 제171,496호; 모리슨 등, 유럽 특허 제173,494호; 뉴버거 등, WO 8601533; 로빈슨 등, WO 8702671; 보울리안 등, Nature 312:643(1984); 뉴버거 등, Nature 314:268(1985)].

본 발명의 MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4 단백질 특이성 항체에 대해 적합한 표지의 예는 이하에 제공한다. 적합한 효소 표지의 예에는 말레이트 디하이드로게나제, 스타필로코커스의 뉴클레아제, 델타-5-스테로이드 이소머라제, 효모-알콜 디하이드로게나제, 알파-글리세롤 포스페이트 디하이드로게나제, 트리오스 포스페이트 이소머라제, 페록시다제, 알카리성 포스파타제, 아스파라기나제, 클루코스 옥시다제, 베타-갈락토시다제, 리보누클레아제, 우레아제, 카탈라제, 글루코스-6-포스페이트 디하이드로게나제, 글루코아밀라제 및 아세틸콜린 에스테라제가 포함된다.

적합한 방사성 동위 원소 표지의 예에는³H,¹¹¹In,¹²⁵I,³²P,³⁵S,¹⁴C,⁵¹Cr, 57To,⁵⁸Co,⁵⁹Fe,⁷⁵Se,¹⁵²Eu,⁹⁰Y,⁶⁷Cu,²¹⁷Ci,²¹¹At,²¹²Pb,⁴⁷Sc,¹⁰⁹Pd 등이 포함된다.¹¹¹In은 간에 의한¹²⁵I 또는¹³¹I-표지화된 단일 클론 항체의 탈할로겐화 문제를 피할 수 있기 때문에 생체내 영상화를 이용하는 경우에 바람직한 동위 원소이다. 또한, 이 방사성 뉴클레오티드는 영상화에 보다 유리한 감마 방출 에너지를 갖는다[참조: 퍼킨스 등, Eur. J. Nucl. Med. 10:296∼301(1985); 카라스퀼로 등, J. Nucl. Med. 28:281∼287(1987)].

적합한 비방사성 동위 원소 표지의 예에는¹⁵⁷Gd,⁵⁵Mn,¹⁶²Dy,⁵²Tr 및⁵⁶Fe가 포함된다.

적합한 형광성 표지의 예에는¹⁵²Eu 표지, 형광 표지, 이소티오시아네이트 표지, 로다민 표지, 피코에리트린 표지, 피코시아닌 표지, 알로피코시아닌 표지, o-프탈알데히드 표지 및 플루오레스카민 표지가 포함된다.

적합한 독소 표지의 예에는 디프테리아 독소, 리신 및 콜레라 독소가 포함된다.

화학 발광성 표지의 예에는 발광 표지, 이소발광 표지, 방향족 아크리디늄 에스테르 표지, 이미다졸 표지, 아크리디늄염 표지, 옥살레이트 에스테르 표지, 루시페린 표지, 루시페라제 표지 및 이쿼린 표지가 포함된다.

핵 자기 공명 조영제의 예에는 Gd, Mn 및 철과 같은 중금속 핵이 포함된다.

전술한 표지를 항체에 결합시키는 전형적인 기술은 케네디 등의 문헌[Clin. Chim. Acta 70:1∼31(1976)] 및 슐스 등의 문헌[Clin. Chim. Acta 81:1∼40(1977)]에 의해 제공된다. 슐스 등의 문헌에 개시되어 있는 커플링 기술은 글루타르알데히드법, 페리오데이트법, 디말레이미드법, m-말레이미도벤질-N-히드록시-숙신이미드 에스테르법이며, 이러한 방법들은 모두 본 명세서에서 참고로 인용한다.

염색체 분석. 본 발명의 핵산 분자는 또한 염색체 동정에 유용하다. 서열은 인체 염색체의 특정 부위 또는 개체를 특이적으로 표적화하여 그들과 하이브리드화할 수 있다. 염색체의 특정 부위를 동정하는 것이 요망되고 있다. 현재, 염색체 부위를 표지화하는 데에는 실제 서열 데이타(반복 다형 현상)에 근거한 소수의 염색체 표지 시약을 이용할 수 있다. 본 발명에 의한 염색체에 대한 DNA의 지도 작성은 이러한 서열을 질병과 관련된 유전자와 대비하는 데 중요한 첫번째 단계이다.

이와 관련하여 바람직한 특정의 실시예에 있어서는, 본 명세서에 개시된 cDNA를 사용하여 게놈성 MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4 단백질 유전자를 클로닝한다. 이것은 일반적으로 상업적으로 입수할 수 있는 각종 공지의 기술 및 라이브러리를 사용하여 수행할 수 있다. 게놈성 DNA는 동일한 목적을 위한 공지의 기술을 이용하는 동일계 염색체 지도 작성에 사용된다. 통상적으로, 일반적인 염색체 지도 작성 법에 의하면, 우수한 동일계 하이브리드화 시그날을 제공하는 게놈성 프로브를 동정하기 위해서는 몇번의 시행 착오가 필요할 수 있다.

요약컨대, cDNA로부터 PCR 프라이머(바람직하게는 15∼25 bp)를 제조하여 서열을 염색체에 지도화시킬 수 있다. cDNA의 컴퓨터 분석을 이용하여 게놈성 DNA에서 하나 이상의 엑손에는 미치지 않는 프라이머를 신속히 선별한다. 이어서 그 프라이머를 사용하여 인체 염색체 개체를 함유하는 체세포 하이브리드를 PCR 스크리닝한다. 프라이머에 대응하는 인체 유전자를 함유하는 하이브리드만이 증폭 단편으로서 얻어진다.

체세포 하이브리드의 PCR 지도 작성은 특정 염색체에 특정 DNA를 할당하는 고속 방법이다. 동일 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 본 발명을 실시하면, 유사한 방법으로 특정 염색체로부터의 부분 패널 또는 대형 게놈성 클론 푸울을 사용하여 준국소화를 실현할 수 있다. 염색체에 지도화시키는 데 유사하게 사용할 수 있는 다른 지도 작성 기술에는 동일계 하이브리드화법, 표지화된 유동 분류 염색체에 의한 예비 스크리닝법 및 염색체 특이성-cDNA 라이브러리를 구성하는 하이브리드화에 의한 예비 선별법이 포함된다.

중기 염색체 스프레드에 cDNA 클론을 형광 동일계 하이브리드화("FISH")시키는 기술을 이용하여 염색체의 정확한 위치를 일단계로 제공할 수 있다. 이 기술에서는 50 내지 60 bp 정도의 짧은 cDNA로부터의 프로브를 사용할 수 있다. 이러한 기술은 버마 등의 문헌[Human Chromosomes: A Manual Of Basic Techniques, Pergamon Press, New York(1988)]을 참조할 수 있다.

일단 서열이 염색체의 정확한 위치에 지도화되면, 염색체 상의 서열의 물리적 위치는 유전자 지도 데이타와 대조할 수 있다. 그러한 데이타는, 예를 들면 브이. 맥쿠식의 문헌[Mendelian Inheritance In Man]에서 찾아 볼 수 있으며, 존스 홉킨스 대학교, 웰치 메디칼 라이브러리를 통해 온 라인으로 입수할 수 있다. 동일한 염색체 영역에 지도화된 유전자와 질병간 관계는 결합 분석(물리적 인접 유전자의 공동 유전)을 통해 동정한다.

이어서, 영향을 받은 개체와 영향을 받지 않은 개체 간의 cDNA 또는 게놈 서열의 차이점을 결정하는 것이 필요하다. 임의의 정상 개체에서가 아닌, 영향 받은 개체 중 일부 또는 전부에서 돌연 변이가 발견되면, 돌연 변이는 질병의 원인 요소인 것으로 생각된다.

물리적 지도 작성과 유전자적 지도 작성 기술에 대한 현재의 분해석에 의하면, 질병과 관련된 염색체 영역에 정확하게 국소화된 cDNA는 50 내지 500개의 잠재성 원인 유전자 중 하나일 수 있다. 이것은 1 메가베이스의 지도 작성 분석과 20 kb 당 하나의 유전자를 가정한 것이다.

영향을 받은 개체와 영향을 받지 않은 개체의 비교 방법에는 일반적으로, 염색체 스프레드로부터 볼 수 있거나 그 cDNA 서열에 기초한 PCR을 사용하여 검출할 수 있는 결실 또는 전위와 같은 염색체에서의 구조적 변성을 우선 관찰하는 방법이 포함된다. 궁극적으로, 다형 현상으로부터 돌연 변이의 존재를 확인하고 돌연 변이를 식별하기 위해서는 여러 개체로부터의 유전자를 완전 서열화하는 것이 필요하다.

본 발명은 또한 안티센스 기술을 이용하여 생체내에서 MPIF-1, M-CIF 및 MIP-4를 억제하는 것에 관한 것이다. 안티센스 기술을 이용하여 삼중 나선 형성 또는 안티센스 DNA 또는 RNA를 통해 유전자 발현을 제어할 수 있는데, 이 두 방법은 모두 DNA 또는 RNA에 대한 폴리뉴클레오티드의 결합에 근거한 것이다. 예를 들면, 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열의 5' 암호화 부위는 약 10 내지 40개 염기쌍의 길이를 가진 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드를 고안하는 데 사용할 수 있다. DNA 올리고뉴클레오티드는 전사에 관련된 유전자의 영역에 상보성을 가지므로써 [삼중 나선-참조: 리 등, Nucl. Acids Res., 6:3073(1979); 쿠니 등, Science, 241:456(1988); 및 더반 등, Science, 251:1360(1991)] 전사를 방지하고 MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4를 생성하도록 고안된다. 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드는 생체내에서 mRNA에 하이브리드화하여 mRNA 분자의 MPIF-1, M-CIF 및 MIP-4로의 해독을 차단한다[안티센스 - 오카노 등, J. Neurochem., 56:560(1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, FL(1988)].

대안적으로, 전술한 올리고뉴클레오티드는 안티센스 RNA 또는 DNA를 생체내에서 발현하여 전술한 방식으로 MPIF-1, M-CIF 및 MIP-4의 생성을 억제하도록 당해 기술 분야의 방법에 의해 세포에 전이시킬 수 있다.

따라서, MPIF-1, M-CIF 및 MIP-4에 대한 안티센스 구조물을 사용하여 MPIF-1, M-CIF 및/또는 MIP-4에 의해 유도 또는 항진된 질병, 예를 들면 아테롬성 경화증, 자가 면역, 예를 들면 다발성 경화증 및 인슐린 의존성 당뇨병, 그리고 만성 염증성 및 감염성 질환, 히스타민 매개 알레르기 반응, 류머티스성 관절염, 규폐증, 유육종증, 특발성 폐 섬유증 및 기타 폐의 만성 염증성 질환, 특발성 과다 호산구 증후근, 내독소 쇼크, 히스타민 매개 알레르기 반응, 프로스타글란딘 의존성 열, 및 재생 불량성 빈혈과 기타 골수 부전증 등을 치료할 수 있다.

길항 물질, 작용 물질 및 방법. 본 발명은 또한 본 발명의 케모킨 폴리펩티드에 대한 길항 물질 및 작용 물질을 동정하기 위해 화합물을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다. 작용 물질은 폴리펩티드와 유사한 생물학적 기능을 갖거나, 그것의 기능을 향상시키는 화합물인 한편, 길항 물질은 그러한 기능을 차단하는 화합물이다. 주화성은 본 발명의 폴리펩티드 중 임의의 것으로 주화성 세포를 약 5 ㎛ 크기의 세포를 통과시키기에 충분한 직경의 공극을 가진 필터의 상부에 배치시켜서 분석할 수 있다. 잠재성 작용 물질의 용액을 상부 구간에 적당한 대조 배지가 채워진 챔버의 바닥부에 배치시키고, 시간이 경과함에 따라 다공성 멤브레인으로 또는 그것을 통해 이동하는 세포를 계수하여 작용 물질의 농도 구배를 측정한다.

길항 물질을 분석하는 경우에는, 본 발명의 케모킨 폴리펩티드를 챔버의 바닥부에 배치시키고 잠재성 길항 물질을 첨가하여 세포의 주화성이 방지되는지 여부를 결정한다.

대안적으로, 폴리펩티드의 수용체를 발현하는 포유 동물 세포 또는 멤브레인 제제를 화합물의 존재하에, 예를 들면 방사성 활성 물지로 표지화된 케모킨 폴리펩티드와 함께 배양한다. 그러면 화합물이 그 상호 작용을 차단하는 활성을 측정할 수 있다. 이러한 방식으로 작용 물질을 분석하는 경우에, 케모킨은 존재하지 않을 것이며 작용 물질 자체의 수용체와의 상호 작용 활성을 측정할 수 있다.

잠재성 MPIF-1, MIP-4 및 M-CIF 길항 물질의 예에는 폴리펩티드와 결합하는 항체, 또는 경우에 따라서 폴리펩티드와 결합하는 올리고뉴클레오티드가 포함된다. 잠재성 길항 물질의 다른 예는 폴리펩티드의 음성 우성 돌연 변이체이다. 음성 우성 돌연 변이체는 야생형 폴리펩티드의 수용체에는 결합하나 생물학적 활성을 보유하지는 않는 폴리펩티드이다.

안티센스 기술을 이용하여 제조한 안티센스 구조물은 또한 잠재성 길항 물질이다. 안티센스 기술을 이용하여 삼중 나선 형성 또는 안티센스 DNA 또는 RNA를 통해 유전자 발현을 제어할 수 있는데, 이 두 방법은 모두 DNA 또는 RNA에 대한 폴리뉴클레오티드의 결합에 근거한 것이다. 예를 들면, 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열의 5' 암호화 부위는 약 10 내지 40개 염기쌍의 길이를 가진 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드를 고안하는 데 사용할 수 있다. DNA 올리고뉴클레오티드는 전사에 관련된 유전자의 영역에 상보성을 가지므로써 [삼중 나선-참조: 리 등, Nucl. Acids Res., 6:3073(1979); 쿠니 등, Science, 241:456(1988); 및 더반 등, Science, 251:1360(1991)] 전사를 방지하고 MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4를 생성하도록 고안된다. 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드는 생체내에서 mRNA에 하이브리드화하여 mRNA 분자의 MPIF-1, M-CIF 및 MIP-4로의 해독을 차단한다[안티센스 - 오카노 등, J. Neurochem., 56:560(1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, FL(1988)]. 전술한 올리고뉴클레오티드는 또한 안티센스 RNA 또는 DNA를 생체내에서 발현하여 전술한 방식으로 케모킨 폴리펩티드의 생성을 억제하도록 세포에 전이시킬 수 있다.

다른 잠재성 케모킨 길항 물질은 생물학적 기능은 잃었지만 여전히 폴리펩티드의 수용체를 인식하고 그것에 결합하여 수용체를 효과적으로 차단하는 폴리펩티드의 천연 또는 합성 변성 유사체인 폴리펩티드의 펩티드 유도체이다. 펩티드 유도체의 예에는 작은 펩티드 또는 펩티드 유사 분자가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.

길항 물질은 MPIF-1, M-CIF 및 MIP-4 유도 또는 항진된 질병, 예를 들면 자가 면역 및 만성 염증성 및 감염성 질환을 치료하는 데 사용할 수 있다. 자가 면역 질환의 예에는 다발성 경화증 및 인슐린 의존성 당뇨병이 포함된다.

길항 물질은 또한 단핵 식세포의 가입 및 활성화를 방지함으로써 감염성 질환, 예를 들면 규폐증, 유육종증, 특발성 폐 섬유증을 치료하는 데 사용할 수 있다. 이들은 또한 호산구의 생성 및 이동을 방지함으로써 특발성 과다 호산구 증후군을 치료하는 데 사용할 수 있다. 내독소 쇼크는 또한 대식 세포의 이동과 그들이 본 발명의 케모킨 폴리펩티드를 생성하는 것을 방지함으로써 길항 물질에 의해 치료할 수 있다.

길항 물질은 또한 동맥 벽에서의 단핵 세포 침투를 방지함으로써 아테롬성 경화증을 치료하는 데 사용할 수 있다.

길항 물질은 또한 케모킨 유도 마스트 세포 및 히스타민의 호염기성 과립 분해와 방출을 억제함으로써 히스타민 매개 알레르기 반응 및 면역학적 장애, 예를 들면 후상 알레르기 반응, 만성 두드러기 및 아토피성 피부염을 치료하는 데 사용할 수 있다. 알레르기성 천식, 비염 및 습진과 같은 IgE 매개 알레르기성 반응도 치료할 수 있다.

길항 물질은 또한 상처 부위에 단핵 세포가 공격하는 것을 방지함으로써 만성 및 급성 염증을 치료하는 데 사용할 수 있다. 이들은 또한 만성 및 급성 염증성 폐 질환이 폐의 단핵 식세포의 분리와 관련이 있기 때문에 정상의 폐 대식 세포의 증식을 조절하는 데 사용할 수 있다.

길항 물질은 또한 환자의 관절부에서 단핵 세포가 활액을 공격하는 것을 방지함으로써 류마티스성 관절염을 치료하는 데 사용할 수 있다. 단핵 세포의 유입 및 활성화는 퇴행성 및 염증성 관절염의 발병에 중대한 역할을 한다.

또한 길항 물질은 IL-1 및 TNF에 주로 기인한 유해한 캐스케이드를 저해하여 다른 염증성 시토킨의 생합성을 방지하는 데 사용할 수 있다. 이러한 방식으로, 길항 물질은 염증을 예방하는 데 사용할 수 있다. 길항 물질은 또한 케모킨에 의해 유도된 프로스타글란딘 의존성 열을 억제하는 데 사용할 수 있다.

길항 물질은 또한 골수 부전, 예를 들면 재생 불량성 빈혈 및 골수 형성 이상 증후군을 치료하는 데 사용할 수 있다.

길항 물질은 또한 폐에 호산구가 축적되는 것을 방지함으로써 천식 및 알레르기를 치료하는 데 사용할 수 있다. 또한 길항 물질은 천식성 폐의 두드러진 특징인 상피하 기저부 멤브레인을 치료하는 데 사용할 수 있다.

작용 물질. MPIF-1, M-CIF 및/또는 MIP-4 작용 물질에는 본 명세서에서 설명하는 바와 같은 폴리펩티드 중 임의의 하나 이상과 유사한 활성을 가진 임의의 작은 분자를 포함한다. 에를 들면, MPIF-1 작용 물질은 MPIF-1 활성을 향상시키는 데, 예를 들면 화학 요법 또는 골수 이식을 받고 있는 환자에 있어서 MPIF-1 유도 골수 보호를 향상시키는 데 사용할 수 있다. 다른 예로서, M-CIF 작용 물질은 M-CIF의 여러 가지 작용 활성에 대해 전술한 바와 같은 하나 이상의 항염증 활성, 항 TNFα 활성 등을 제공할 수 있다.

질병의 진단 및 예후. 특정 질병 또는 장애는 후술하는 바와 같이 대응하는 "표준" 포유 동물, 즉 질병 또는 장애를 갖지 않은 동종의 포유 동물과 비교할 때 증가된 레벨의 MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4 단백질 및 MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4 단백질을 암호화하는 mRNA과 관련이 있을 수 있다. 또한, 질병 또는 장애를 갖지 않은 동종의 포유 동물의 혈청과 비교할 때 질병 또는 장애에 걸린 포유 동물로부터 채취한 임의의 체액(예를 들면, 혈청, 혈장, 소변 및 척수액) 중의 MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4 단백질의 레벨는 증가되어 있음을 검출할 수 있다. 즉, 본 발명은 포유 동물 세포 또는 체액에서 MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 레벨을 분석하고, 그 유전자 발현 레벨을 표준 MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4 유전자 발현 레벨과 비교하여 표준치에 비해 증가된 유전자 발현 레벨을 특정 질병 또는 장애의 지표로 하는 것으로 이루어지는 진단 방법을 제공한다.

질병 또는 장애의 진단이 종래의 방법에 따라 이미 이루어진 경우, 본 발명은 예후의 지표로서 유용한 데, 증가된 MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4 유전자 발현을 나타내는 환자는 유전자의 발현 레벨이 낮은 환자에 비해 불량한 임상 결과를 나타낸다.

"MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 수준을 분석한다"함은 제1 생물학적 샘플 중의 MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4 단백질의 레벨 또는 MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4 단백질을 암호화하는 mRAN의 레벨을 직접적으로(예를 들면, 절대 단백질의 레벨 또는 mRNA의 레벨을 측정 또는 평가함으로써) 또는 상대적으로(예를 들면, 제2 생물학적 샘플 중의 MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4 단백질의 레벨 또는 mRNA 레벨과 비교함으로써) 정량적으로 또는 정성적으로 측정하거나 평가하는 것을 의미한다.

제1 생물학적 샘플 중의 MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4 단백질의 레벨 또는 mRNA 레벨는 표준 MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4 단백질의 레벨 또는 mRNA 레벨과 비교하여 측정하거나 평가하는 것이 바람직한데, 표준치는 질병 또는 장애에 걸리지 않은 개체로부터 얻은 제2 생물학적 샘플로부터 취한다. 당해 기술 분야에서 자명한 바와 같이, 일단 표준 MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4 단백질의 레벨 또는 mRNA 레벨을 알면, 비교를 위한 표준으로서 반복적으로 사용할 수 있다.

"생물학적 샘플"이라 함은 MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4 단백질 또는 mRNA를 함유하는 개체, 세포주, 조직 배양물 또는 기타 공급원으로부터 얻은 임의의 생물학적 샘플을 의미한다. 생물학적 샘플에는 분비된 성숙한 MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4 단백질을 함유하는 포유 동물의 체액(예를 들면, 혈청, 혈장, 소변, 활액 및 척수액)과, 난소, 전립선, 심장, 태반, 췌장, 복수, 근육, 피부, 소선, 신장, 간, 비장, 폐, 뼈, 골수, 눈, 말초 신경, 중추 신경, 가슴 및 배꼽의 조직이 포함된다. 포유 동물로부터 조직 생검 및 체액을 얻는 방법은 당해 기술 분야에 공지되어 있다. 생물학적 샘플에 mRNA를 포함시키고자 하는 경우, 바람직한 공급원은 조직 생검이다.

본 발명은 포유 동물의 질병을 진단하는 데 유용하다. 특히, 본 발명은 포유 동물, 바람직하게는 인체의 각종 면역 체계 관련 장애를 진단 또는 치료하는 데 유용하다. 그러한 장애에는 암, 종양 및 면역 세포 기능의 임의의 조절 부전, 예를 들면 자가 면역, 관절염, 백혈병, 림프종, 면역 억제, 패혈증, 상처 치료, 급성 및 만성 감염증, 세포 매개 면역, 체액성 면역, 염증성 장 질환, 골수 억제 등이 포함되나, 이들에 한정되는 것은 아니다. 바람직한 포유 동물은 원숭이, 유인원, 고양이, 개, 소, 돼지, 말, 토끼 및 사람이다. 특히 사람이 바람직하다.

총 세포 RNA는 코메진스키 및 사키의 문헌[Anal. Biochem. 162:156∼159(1987)]에 개시되어 있는 일단계 구아니디늄-티오시아네이트-페놀-클로로포름법과 같은 임의의 적합한 기술을 이용하여 생물학적 샘플로부터 분리할 수 있다. 이어서 임의의 적합한 방법을 이용하여 MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4 단백질을 암호화하는 mRNA 레벨을 분석한다. 이러한 방법에는 노던 블롯 분석법, S1 누클레아제 지도 작성, 폴리머라제 연쇄 반응(PCR), 폴리머라제 연쇄 반응과 병행하는 역전사법(RT-PCR), 및 리가제 연쇄 반응과 병행하는 역전사법(RT-LCR)이 포함된다.

노던 블롯 분석법은 하라다 등의 문헌[Cell 63:303∼312(1990)]에 개시되어 있는 바대로 수행할 수 있다. 요약컨대, 전술한 바와 같은 생물학적 샘플로부터 총 RNA를 제조한다. 노던 블롯법의 경우, 적당한 완충액(예를 들면, 글리옥살/디메틸 설폭사이드/인산 나트륨 완충액) 중에서 변성시키고, 아가로스 겔 전기 영동 처리한 후, 니트로셀룰로스 필터로 옮긴다. RNA가 UV 링커에 의해 필터에 결합된 후, 필터를 포름아미드, SSC, 덴하르트 용액, 변성 연어 경랍, SDS 및 인산 나트륨 완충액을 함유하는 용액 중에서 예비 하이브리드화시킨다. 임의의 적합한 방법[예를 들면,³²P-다중 전처리 DNA 표지화 시스템(Amersham)]에 따라 표지화된 MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4 단백질 cDNA을 프로브로서 사용한다. 하룻밤 동안 하이브리드화시킨 후, 필터를 세정하고 X-선 필름에 노출시킨다. 본 발명에 따라 프로브로서 사용하기 위한 cDNA는 앞에서 설명하였으며 그 길이가 15 bp 이상인 것이 바람직하다.

S1 지도 작성은 후지타 등의 문헌[Cell 49:357∼367(1987)]에 기술되어 있는 바에 따라 수행할 수 있다. S1 지도 작성에 사용하기 위한 프로브 DNA를 제조하기 위해서, 전술한 cDNA의 센스 가닥을 표지화된 안티센스 DNA를 합성하기 위한 주형으로서 사용한다. 이어서 적합한 제한 엔도누클레아제를 사용하여 안티센스 DNA를 분해시켜서 소정 길이를 가진 추가의 DNA 프로브를 생성시킬 수 있다. 그러한 안티센스 프로브는 표적 mRNA(즉, MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4 단백질을 암호화하는 mRNA)에 대응하는 보호된 밴드를 가시화하는 데 유용하다, 노던 블롯 분석법은 전술한 바와 같이 수행할 수 있다.

MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4 단백질을 암호화하는 mRNA의 레벨는 마키노 등의 문헌[Technique 2:295∼301(1990)]에 개시되어 있는 RT-PCR법을 이용하여 분석하는 것이 바람직하다. 이러한 방법에 의해, 폴리아크릴아미드 겔 밴드에서의 "앰플리콘"의 방사능은 표적 mRNA의 초기 레벨에 직접 비례한다. 요약컨대, 이 방법은 RT 프라이머와 적합한 완충액을 함유하는 반응 혼합물에 생물학적 샘플로부터 분리된 총 RNA를 첨가하는 단계를 포함한다. 프라이머 어니일링을 위해 항온 처리한 후, 혼합물에는 RT 완충액, dNTP, DTT, RNaes 억제제 및 역전사 효소를 보충할 수 있다. 항온 처리하여 RNA의 역전사를 수행한 후, RT 생성물을 표지화된 프라이머를 사용하여 PCR 처리할 수 있다. 대안적으로, 프라이머를 표지화하기보다는 표지화된 dNTP를 PCR 반응 혼합물에 포함시킬 수 있다. 통상의 기술에 따라 DNA 열적 순환기에서 PCR 증폭을 수행할 수 있다. 적정한 횟수의 주기를 거쳐 증폭을 수행한 후, PCR 반응 혼합물은 폴리아크릴아미드 겔상에서 전기 이동 처리한다. 겔을 건조시킨 후, 적당한 밴드(MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4 단백질을 암호화하는 mRNA에 대응하는 밴드)의 방사능을 결상 분석기를 이용하여 정량한다. RT 및 PCR 반응 성분 및 레벨, 시약 및 겔의 레벨, 표지화 방법은 당해 기술 분야에 공지되어 있다. RT-PCR 법의 변경은 당업자들에게 자명한 일이다.

역전사된 표적 mRNA를 증폭시키는 임의의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 사용할 수 있는데, 이것은 앞에서 설명한 바와 같이 고안할 수 있다.

생물학적 샘플 중의 MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4 단백질 레벨을 분석하는 것은 임의의 공지 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 생물학적 샘플 중의 MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4 단백질의 레벨을 분석하는 데는 항체계 기술이 바람직하다. 예를 들면, 조직 내에서의 MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4 단백질 발현을 전통적인 면역 조직학적 방법으로 연구할 수 있다. 이 경우에, 명확한 인식은 1차 항체(폴리 클론 또는 단일 클론)에 의해서 이루어지지만, 2차 검색 시스템으로서 형광, 효소 또는 기타 결합된 2차 항체를 사용할 수 있다. 그 결과, 병리학적 시험을 위한 조직 부위의 면역 조직학적 염색이 얻어진다. 조직은 또한 웨스턴 블롯 또는 도트/슬롯 분석[잘카넨, 엠 등, J. Cell. Biol. 101:976∼985(1985); 잘카넨, 엠. 등, J. Cell. Biol. 105:3087∼3096(1987)]을 위한 MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4 단백질을 분리시키기 위해 우레아 및 중성 세제로 추출할 수 있다. 양이온성 고체 담체를 사용하는 이 기술에 있어서, MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4 단백질의 정량은 표준으로서 분리된 MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4 단백질을 사용하여 수행할 수 있다. 이 기술은 또한 체액에도 적용시킬 수 있다. 이러한 샘플의 경우에, MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4 단백질의 몰 레벨는 다른 체액, 예를 들면 혈청, 혈장, 소변, 척수액 등의 MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4 단백질 함량 표준치를 설정하는 데 도움이 된다. 이어서 건강한 개체로부터 얻은 값을 이용하여 MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4 단백질 함량의 정상치를 설정할 수 있으며, 이것을 시험 대상으로부터 얻은 것들과 비교할 수 있다.

MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4 단백질 유전자 발현을 검색하는 데 유용한 다른 항체계 방법에는 면역 분석법, 예를 들면 효소 결합 면역 흡착 분석(ELISA) 및 방사성 면역 분석(RIA)이 포함된다. 에를 들면, MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4 단백질 특이성 단일 클론 항체는 MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4 단백질을 검출하고 정량하기 위한 면역 흡수제로서, 그리고 효소 표지화된 프로브로서 모두 사용할 수 있다. 샘플에 존재하는 MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4 단백질의 양은 선형 회귀 컴퓨터 알고리즘을 이용하여 표준 제제 중에 존재하는 양과 비교하여 계산할 수 있다. 다른 ELISA분석에 있어서, 두개의 다른 특이성 단일 클론 항체를 사용하여 체액 중의 MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4 단백질을 검출할 수 있다. 이 분석법에 있어서, 하나의 항체를 면역 흡수제로서 사용하고 다른 항체를 효소 표지화된 프로브로서 사용한다.

전술한 기술들은 본질적으로 "일단계" 또는 "이단계"로 수행할 수 있다. "일단계" 분석은 MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4 단백질을 고정화된 항체와 접촉시키고, 세정하지 않은 채 그 혼합물을 표지화된 항체와 접촉시키는 것으로 이루어진다. "이단계" 분석법은 혼합물을 표지화된 항체와 접촉시키기 전에 세정하는 단계를 포함한다. 다른 통상의 방법들도 적절히 이용할 수 있다. 통상적으로 분석 시스템의 한 성분을 담체에 고정시켜서 시스템의 다른 성분들이 그 성분과 접촉하고 샘플로부터 용이하게 제거되도록 하는 것이 바람직하다.

적합한 효소 표지의 예에는 기질과 반응하여 과산화수소의 생성을 촉매화하는 옥시다제군으로부터 유도된 것이 포함된다. 안정성이 우수하며 그것의 기질(글루코스)을 쉽게 구할 수 있기 때문에 글루코스 옥시다제가 특히 바람직하다. 옥시다제 표지의 활성은 효소 표지화된 항체/기질 반응에 의해 형성된 과산화수소의 농도를 측정하여 분석할 수 있다. 효소 이외에, 다른 적합한 표지에는 방사성 동위 원소, 예를 들면 요오드(¹²⁵I,¹²¹I), 탄소(¹⁴C), 황(³⁵S), 삼중 수소(₃H), 인듐(¹¹²In) 및 테크네튬(^99mTc), 형광성 표지, 예를 들면 형광 물질 및 로다민, 그리고 바이오틴이 포함된다.

본 발명의 폴리펩티드와 그러한 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 과학적 연구, DNA의 합성 및 DNA 벡터의 제조와 관련된 생체외 연구를 목적으로 하는, 그리고 인체 질병의 치료를 위한 치료제 및 진단제의 개발을 목적으로 하는 연구 시약으로서 사용할 수 있다. 예를 들면, MPIF-1 및 M-CIF는 미성숙한 조혈성 선조 세포, 예를 들면 과립구, 대식 세포 또는 단핵 세포의 분화를 일시적으로 방지하여 그들을 확장시키는 데 사용할 수 있다. 이러한 골수 세포는 생체외에서 배양시킬 수 있다.

전장 MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4 유전자의 단편들은 전장 유전자를 분리하고 그 유전자와 서열 유사성이 높거나 유사한 생물학적 활성을 갖는 다른 유전자를 분리하기 위한 cDNA 라이브러리의 하이브리드화 프로브로서 사용할 수 있다.그러나, 프로브는 30개 이상의 염기, 예를 들면 50개 이상의 염기를 함유하는 것이 바람직하다. 프로브는 또한 전장 전사체에 대응하는 cDNA 클론과 조절 및 프로모터 영역, 엑손 및 인트론을 포함하는 완전 유전자를 함유하는 게놈성 클론(들)을 동정하는 데 사용할 수 있다. 스크리닝 방법의 일례는 공지된 DNA 서열을 사용하여 유전자의 암호화 영역을 분리하여 올리고뉴클레오티드 프로브를 합성하는 것으로 이루어진다. 본 발명의 유전자의 것에 대해 상보적인 서열을 갖는 표지화된 올리고뉴클레오티드는 인체 cDNA, 게놈성 DNA 또는 mRNA의 라이브러리를 스크리닝하여 프로브가 하이브리드화된 라이브러리의 멤버를 결정하는 데 사용할 수 있다.

본 발명은 또한 핵산 서열에 존재하는 돌연 변이와 관련한 질병 또는 질병에 걸릴 가능성을 검색하기 위한 진단 분석 요소로서 사용하는 방법에 관한 것이다. 그러한 질병은 케모킨 폴리펩티드의 저 형질 발현과 관련이 있다.

MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4에 돌연 변이가 존재하는 개체에 대해서는 여러 가지 기술로 DNA 레벨을 검출할 수 있다. 진단용 핵산은 환자의 세포, 예를 들면 혈액, 소변, 타액, 조직 생검 및 부검 물질로부터 얻을 수 있다. 게놈성 DNA는 검출을 위해 직접 사용하거나 분석 전에 PCR[사이키 등, Nature 324:163∼166(1986)]을 이용하여 효소적으로 증폭시킬 수 있다. RNA 또는 cDNA는 또한 동일한 목적에 사용할 수 있다. 일례로, MPIF-1, M-CIF 및 MIP-4를 암호화하는 핵산에 상보적인 PCR 프라이머는 MPIF-1, M-CIF 및 MIP-4 돌연 변이를 동정하고 분석하는 데 사용할 수 있다. 예를 들면, 정상의 유전자형에 비교한 증폭된 생성물의 크기 변화에 의해 결실 및 삽입을 검출할 수 있다. 점 돌연 변이는 증폭된 DNA를 방사성 표지화된 MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4 RNA에, 대안적으로는 방사성 표지화된 MPIF-1, M-CIF 및 MIP-4 안티센스 DNA 서열에 하이브리드화시켜서 동정할 수 있다. 매치된 서열은 RNaes A 소화 또는 융점의 차이에 의해 매치되지 않은 이중화물과 구별될 수 있는 것이 바람직하다.

DNA 서열의 차이에 근거한 유전자적 시험은 변성제를 사용하거나 사용하지 않고 DNA 단편의 전기 이동성의 변동을 검출할 수 있다. 작은 서열의 결실 및 삽입은 고해상도 겔 전기 영동에 의해 가시화시킬 수 있다. 서열이 다른 DNA 단편은 포름아미드 구배 겔로 변성시켜서 구별할 수 있는데, 다른 DNA 단편의 겔 중에서의 이동성은 그들의 특정 융점 또는 부분 융점에 따라 다른 위치에서 지연된다[참조: 예를 들면, 마이어스 등, Science 230:1242(1985)].

특정 위치에서의 서열 변화는 또한 RNaes 및 SI 보호와 같은 누클레아제 보호 분석법 또는 화학적 분해법[예를 들면, 코튼 등, PNAS, USA 85:4397∼4401(1985)]에 의해 확인할 수 있다.

즉, 특정 DNA 서열의 검출은 하이브리드화, RNaes 보호, 화학적 분해, 직접 DNA 서열화 또는 제한 효소의 이용[예를 들면, 제한 단편 길이 다형 현상(RFLP)] 및 게놈성 DNA의 서던 블롯팅과 같은 방법에 의해 수행할 수 있다.

종래의 겔-전기 영동 및 DNA 서열화 방법과 함께, 돌연 변이는 또한 동일계 분석에 의해 검출될 수도 있다.

본 발명은 또한 정상의 대조 조직 샘플에 비해 과다한 단백질 발현은 질병 또는 질병에 걸릴 가능성, 예를 들면 종양의 존재를 검색할 수 있기 때문에, 각종 조직에서의 MPIF-1, M-CIF 및 MIP-4 단백질의 레벨 변화를 검색하는 진단 분석에 관한 것이다. 숙주로부터 유도된 샘플 중의 MPIF-1, M-CIF 및 MIP-4 단백질의 레벨을 검출하는 데 사용되는 분석법은 당업자들에게 공지되어 있는데, 방사성 면역 분석, 경쟁 결합 분석, 웨스턴 블롯 분석, ELISA 분석 및 "샌드위치" 분석이 포함된다. ELISA 분석[콜리겐 등, Current Protocols in Immunology 1(2), Ch. 6, (1991)]은 우선 MPIF-1, M-CIF 및 MIP-4 항원에 특이성을 갖는 항체, 바람직하게는 단일 클론 항체를 제조하는 단계를 포함한다. 또한 단일 클론 항체에 대한 리포터 항체를 제조한다. 리포터 항체에는 방사성 물질, 형광 또는, 이 실시 태양에서는 서양 고추 냉이 페록시다제 효소와 같은 검출 가능한 시약을 부착시킨다. 숙주로부터 샘플을 제거하고 고체 담체, 예를 들면 샘플 중의 단백질이 결합하는 폴리스티렌 디쉬에서 항온 처리한다. 이어서 디쉬 상에 존재하는 임의의 유리 단백질 결합 부위는 BSA와 같은 비특이성 단백질과 함께 항온 처리하여 피복시킨다. 다음, 단일 클론 항체를 디쉬에서 항온 처리하면, 처리 중에 폴리스티렌 디쉬에 부착된 임의의 MPIF-1, M-CIF 및 MIP-4 단백질에 단일 클론 항체가 부착한다. 결합되지 않은 모든 단일 클론 항체는 완충액으로 세정 제거한다. 서양 고추 냉이 페록시다제에 결합된 리포터 항체를 디쉬에 배치시키면, MPIF-1, M-CIF 및 MIP-4에 결합된 임의의 단일 클론 항체에 리포터 항체가 결합한다. 결합되지 않은 리포터 항체는 세정 제거한다. 이어서 페록시다제 기질을 디쉬에 첨가하고 소정의 시간 내에 나타난 색의 양을 표준 곡선과 비교할 때 환자 샘플의 소정 부피 중에 존재하는 MPIF-1, M-CIF 및 MIP-4 단백질의 양의 척도로 삼는다.

경쟁 분석을 이용할 수도 있는데, 이 방법은 MPIF-1, M-CIF 및 MIP-4 에 특이성을 가진 항체를 고체 담체와 표지화된 MPIF-1, M-CIF 및 MIP-4에 부착시키고 숙주로부터 유도된 샘플을 고체 담체를 통과시켜서, 예를 들면 액체 섬광 크로마토그래피에 의해 검출된 표지의 양을 샘플 중에 존재하는 단백질의 양과 비교할 수 있다.

"샌드위치" 분석은 ELISA 분석과 유사하다. "샌드위치" 분석에서는 MPIF-1, M-CIF 및 MIP-4를 고체 담체를 통과시켜서 고체 담체에 부착된 항체에 결합시킨다. 이어서 제2 항체를 MPIF-1, M-CIF 및 MIP-4에 결합시킨다. 표지화되고 제2 항체에 특이성을 갖는 제3 항체를 고체 담체를 통과시켜서 제2 항체에 결합시키고, 이어서 양을 정량한다.

본 발명은 케모킨 폴리펩티드의 수용체를 동정하는 방법을 제공한다. 수용체를 암호화하는 유전자는 당업자들에게 공지된 여러 가지 방법, 예를 들면 리간드 패닝법 및 FACS 분류법[콜리간 등, Current Protocols in Immun. 1(2), Ch.5,(1991)]에 의해 동정할 수 있다. 폴리아데닐화된 RNA를 폴리펩티드에 반응성인 세포로부터 제조하고, 이 RNA로부터 생성된 cDNA 라이브러리를 푸울로 분할하여 COS 세포 또는 폴리펩티드에 반응성이 없는 다른 세포를 감염시키는 데 사용하는 발현 클로닝법이 바람직하다. 유리 슬라이드 상에서 성장시킨 감염 세포를 표지화된 폴리펩티드에 노출시킨다. 폴리펩티드는 요오드화법 또는 부위 특이성 단백질 키나제의 인식 부위 삽입법을 비롯한 여러 가지 수단을 이용하여 표지화시킬 수 있다. 고정화 및 항온 처리 후에, 슬라이드를 방사선 사진 분석한다. 양성 푸울을 동정하고 서브 푸울을 제조한 다음, 반복 서브 푸울링법 및 재스크리닝법을 이용하여 감염시켜서, 최종적으로 소정의 수용체를 암호화하는 하나의 클론을 얻는다.

수용체를 동정하기 위한 대안적인 방법으로서, 표지화된 폴리펩티드를 수용체 분자를 발현하는 세포 멤브레인 또는 추출물 제제와 광친화성 결합시킬 수 있다. 가교 결합 물질은 PAGE 분석에 의해 분해하고 X-선 필름에 노출시킨다. 폴리펩티드의 수용체를 함유하는 표지화된 착물을 분리하고 펩티드 단편으로 분해하여 단백질 미세 서열화시킨다. 미세 서열화에 의해 얻은 아미노산 서열은 소정의 수용체를 암호화하는 유전자를 동정하는 cDNA 라이브러리를 스크리닝하기 위한 변성 올리고뉴클레오티드 프로브 세트를 고안하는 데 사용한다.

치료법. 본 발명의 폴리펩티드는 여러 가지 면역 조절 작용 및 염증 작용에 사용할 수 있으며, 다수의 질병 상태에 있어서 MPIF-1, M-CIF 및 MIP-4는 케모킨과에 속하기 때문에 이들은 백혈구(단핵 세포, 호중구, T 임파구, 호산구, 호염기구 등)에 화학 친화성을 갖는다.

노던 블롯 분석에 의하면, MPIF-1, M-CIF 및 MIP-4가 우월하게 발현되는 것은 조혈성의 조직이다.

MPIF-1의 치료/진단에의 응용. MPIF-1은 면역 반응 및 염증의 조절에 있어 중요한 작용을 하는 것으로 보인다. 도 19에서는, 리포폴리사카라이드가 인체 단핵 세포로부터의 MPIF-1의 발현을 유도함을 나타내고 있다. 따라서, 내독소의 존재에 대한 반응시에, MPIF-1은 단핵 세포로부터 발현되기 때문에, MPIF-1를 투여하면 숙주의 면역 반응을 조절할 수 있다. MPIF-1는 항염제로서 사용할 수 있다.

도 10에 예시된 바와 같이, THP-1 세포(A) 및 PBMCs(B)에 대한 주화 활성이 중요하다. MPIF-1은 또한 THP-1 세포(도 11)에서 상당한 칼슘 이동을 유도하는데, 이것은 MPIF-1이 단핵 세포에 대해 생물학적 활성을 갖는다는 사실을 나타내는 것이다. 또한 MPIF-1은 인체 단핵 세포에서 용량 의존성 주화성과 칼슘 이동 반응을 유도한다.

또한, 본 발명의 폴리펩티드는, 종양에 주입된 케모킨 발현 세포가, 예를 들면 카포시 육종의 치료시에 종양을 퇴화시켰다는 증거가 있기 때문에, 항종양 요법에 사용할 수 있다. MPIF-1은 공지된 종양 퇴화제인 TNF-α를 분비하는 세포를 유도할 수 있으며, 이 경우에 상기 단백질은 종양 퇴화를 유도하는 데 사용할 수 있다. MPIF-1은 또한 IL-6, IL-1 및 G-CSF와 같은 다른 종양 및 암 억제제를 분비하는 인체 단핵 세포를 유도할 수 있다. 또한, MPIF-1, M-CIF 및 MIP-4는 이들의 화학 주성을 통해 숙주 방어(종양 파괴성) 세포, 예를 들면 세포 독성 T-세포 및 대식 세포의 침입 또는 활성화를 자극하며, 이러한 방식으로 고체 종양을 치료하는 데 사용할 수 있다.

폴리펩티드는 또한 조혈성 세포의 증식 및 분화를 억제하는 데 사용할 수 있기 때문에 화학 치료 중에 화학 요법제로부터 골수 간 세포를 보호하는 데 사용할 수 있다. 도 12 및 13은 MPIF-1가 증식성이 낮은 잠재 콜로니 형성 세포(LPP-CFC)에 의해 콜로니 형성을 억제함을 예시하고 있다. 도 14는 M-CIF가 M-CSF 자극 콜로니 형성을 특이적으로 억제하는 한편, MPIF-1는 그렇지 않음을 예시하고 있다. MPIF-1와 M-CIF는 모두 골수 세포의 성장 및/또는 분화를 상당히 억제하기 때문에, 이 증식 방지 효과는 화학 요법제의 고용량 투여를 가능하게 하며, 이에 따라 더욱 효과적인 화학 요법 치료가 가능하다.

항원 감작된 선조 세포(예를 들면, 과립구 및 대식 세포/단핵 세포)의 준집단에 대한 MPIF-1 및 M-CIF 폴리펩티드의 억제 효과를 이용하여 백혈병 세포의 증식을 치료학적으로 억제할 수 있다.

또한, 본 발명의 발명자들은 MPIF-1와 그의 변형물(예를 들면, MPIF-1△23)이 인체 골수 및 과립구 전구체의 생체내 증식 및 분화를 억제함을 발견하였다. 마찬가지로, 동물 연구 결과, MPIF-1△23은 생체외 및 생체내에서, 예를 들면 증식성 잠재 콜로니 형성 세포(LPP-CFCs) 및 과립구/단핵 세포 항원 감작된 선조 세포의 성장을 억제하는 것으로 나타났다. 이러한 발견은 MPIF-1가, 통용되고 있는 화학 요법제의 세포 독성 효과로부터 초기의 골수양 선조 세포를 보호할 수 있는, 화학 보호제로서의 치료 용도를 갖음을 나타내는 것이다.

MPIF-1과 그의 변형물은 골수양 선조 세포를 선택적으로 억제하는 활성을 갖기 때문에, MPIF-1은 임상적으로 밀접한 관계가 있는 필수 혈소판 증가증(ET), 진성 다혈구증(PV) 또는 병인 불명 골수양 이형성(AMM)과 같은 골수 증식성 장애를 치료하는 데 사용할 수 있다. 각 장애들은 간 세포의 자손 세포가 성장 이익을 제공하는 하나의 조혈성 간 세포의 후천적인 돌연 변이에 기인한 것이다. 이러한 장애질들의 병태 생리는 다른 세포형을 과다 생성한다는 점에서 구별된다. PV의 경우, 적혈구, 과립구 및 거핵구를 과다 생성한다. ET의 경우에는, 정의에서와 같이, 혈소판과 백혈구를 과다 생성한다. AMM은 또한 혈소판 증가증 또는 백혈구 증가증과 골수 섬유증을 나타낸다.

PV 환자의 안정화는 정맥 절개술에 의해 적세포를 제거함으로써 유도할 수 있다. 그러나, ET 환자의 경우에는 증가된 혈소판 농도를 위한 적절한 치료 요법은 없다. 혈소판 증가증의 위험성을 낮추기 위한 여러 가지 골수 억제 요법을 연구한 바 있다. 방사성 인, 히드로시우레아, 알킬화제(부설판 및 클로르암부실), 인터페론 또는 아나그렐라이드에 의한 치료는 모두 상당한 부작용을 나타내었다. 특히, 아나그렐라이드를 제외하고는 각 골수 억제 요법에 의해 급성 백혈병 위험이 높게 나타났다. 아나그렐라이드가 유망한 요법이다. 그러나, 아나그렐라이드에 대한 역반응이 관심사인데, 그것의 급성 독성 잠재성은 확립된 바가 없다. 현재, 인터페론은 비용, 부작용 및 비경구 투여의 불편함 때문에 차선책적인 요법으로 간주되고 있다. 이러한 발견은 그러한 질병들에 대한 요법이 상당히 요망되고 있음을 나타내는 것이다. MPIF-1△23로 예비 치료한 후 5-FU로 치료한 마우스의 생체 연구 결과, 혈소판 선조 세포 증식이 억제되는 것으로 입증되었다.

본 발명은 또한 다른 골수 억제 요법 및 치료제와 병행하는 MPIF-1 및 그 변형물의 용법에 관한 것이다.

도 15, 16 및 17은 사용된 세포 계보의 항원 감작 세포를 제거하고 형성된 세포 집단을 M-CIF 및 MPIF-1와 접촉시켜서 세포의 Mac-1 양성 집단에 약 50% 정도 질병을 일으키게 하였는데, 이것은 M-CIF가 M-CSF 반응성 콜로니 형성 세포의 억제를 유도함을 나타내는 도14의 결과와 일치하는 것이다. 도 17에 도시되어 있는 바와 같이, MPIF-1은 IL-3, GM-CSF 및 M-CSF에 대한 반응시에 콜로니를 형성하는 항원 감작 선조 세포의 활성을 억제한다. 또한, 도 18에 도시되어 있는 바와 같이, MPIF-1의 용량 반응은 콜로니 형성을 억제함을 나타낸다. 이러한 억제는 그러한 인자들에 의해 매개된 분화 시그날의 특이한 파괴에 기인하거나 선조 세포에 대한 세포 독성 영향에 기인할 수 있다. 또한, 실시예 15 및 16은 MPIF-1가 화학 요법제의 세포 독성에 대한 생체외 및 생체내 골수 보호 활성을 갖는다는 사실을 입증하고 있다. 즉, MPIF-1은 화학 요법 치료를 받고 있는 환자의 골수 보호제로서 유용할 수 있다.

전술한 바와 같이, 화학 요법과 방사선 요법으로부터 유래하는 주요한 합병증 중 하나는 비병원성 세포형의 파괴이다. 본 발명은 피검체에서 골수 세포 증식을 억제함으로써, 방사선 및 화학 요법제로부터 골수를 보호하는 방법을 제공한다. 이 방법은 골수 억제 유효량의 MPIF-1을 단독으로 또는 대식세포 염증 단백질-1α(MIP-1α), 대식세포 염증 단백질-2α(MIP-2α), 혈소판 인자4(PF4), 인터루킨-8(IL-8), 대식세포 주화성 및 활성화 인자(MCAF) 및 대식 세포 염증 관련 단백질-2(MRP-2)로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 케모킨과 함께, 방사선 치료법 또는 화학 요법 섭생의 일부분으로서 피검체에게 투여하는 것으로 이루어진다. 따라서, 본 발명의 골수 억제 조성물은 골수 보호 효과를 제공하므로, 골수 세포에 유해한 영향을 미치는 치료법과 함께 사용하는 데 유용하다. 그 까닭은 본 발명의 조성물이 골수 세포에 서서히 순환하는 상태로 배치됨으로써, 예를 들면 세포 순환 활성 약물, 예컨대 시토신 아라비노시드, 히드록시우레아, 5-Fu 및 Ara-C를 사용하는 방사선 요법 또는 화학 요법에 의해 유발된 세포 손상에 대한 보호 효과를 제공하기 때문이다. 일단 화학 요법용 약물이 피검체 계를 소제하면, 예를 들면 골수 촉진 인자, 예컨대 인터루킨-11(IL-11), 에리트로포이에틴(EPO), GM-CSF, G-CSF, 간(stem) 세포 인자(SCF) 및 트로모포이에틴(Tpo)를 사용하여 MPIF-1에 의해 보호한 선조 세포의 신속한 증식과 분화를 촉진하는 것이 바람직하다.

MPIF-1이 생체내에서 화학 요법제의 존재하에 골수 보호 효과를 제공할 수 있는 능력을 하기 실시예 28에서 측정하였다. 실시예 28에 의하면, MPIF-1을 피검체에게 투여한 후에, 화학 요법제를 투여하면, 여러 차례의 5-Fu 치료 주기 이후에도 혈중 혈소판의 회복율이 증가하는 것을 알 수 있다. 또한, 실시예 28에 기재된 실험은 여러 차례의 5-Fu 치료 주기 동안에 MPIF-1은 과립 백혈구를 보다 신속하게 회복시킨다는 사실을 입증한다. 또한, 실시예 28의 실험 결과는 MPIF-1과 G-CSF를 동시 투여할 경우에 합산된 효과를 발휘함을 시사하고 있다.

전술한 바와 같이, 본원 발명자들은 MPIF-1 및 이의 유사체가 시험관내에서 골수로부터 증식 가능성이 낮은 콜로니 형성 세포(LPP-CFC)를 억제하는 효과를 나타낸다는 사실을 발견하였다. LPP-CFC는 과립 백혈구와 단핵구 계통을 유발하는 양성 능력 조혈 선조 세포이다. 또한, MPIF-1은 인간 CD34⁺간세포 유도된 과립 백혈구와 단핵구 콜로니 형성 세포에 의한 콜로니 형성을 가역적으로 억제한다. 본 발명자들의 시험관내 화학 보호 실험에 의하면, MPIF-1△23에 의해 이러한 조혈 선조 세포는 약물 5-플루오로우라실(5-Fu), 시토신 아라비노시드 및 Taxol(등록 상표)의 세포 독성 효과로부터 보호되는 것으로 밝혀졌다.

MPIF-1 유사체(△23)를 생체내 화학 요법 모델에 사용한 결과, 이는 보다 신속하게 골수 선조 세포와 호중구 및 혈소판의 말초 세포 집단을 둘다 신속하게 회복시키는 것으로 입증되었다. 또한, 하기 실시예 16과 28에 나타낸 바와 같이, MPIF-1을 투여하면, 5-Fu로 치료한 실험 동물에서 호중구 감소증 및 혈소판 감소증으로부터 빠른 회복을 유발한다. 따라서, MPIF-1과 이의 유사체는 화학 요법제와 관련된 골수 형성 부전증, 과립구 감소증 및 혈소판 감소증의 기간을 단축시킴으로써, 이와 같은 치료제로 치료를 받고 있는 환자의 감염 가능성을 감소시킨다.

그러므로, 본 발명은 골수 선조 세포를 보호하고, 혈소판과 과립 백혈구의 회복을 촉진하는 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 분열 세포를 우선적으로 사멸하는 치료(예를 들면 방사선 치료 또는 세포 순환 활성 약물을 사용한 치료)를 받고 있는 피검체에게 MPIF-1을 투여하는 것으로 이루어진다. MPIF-1은 생체내에서 분열 세포를 우선적으로 사멸하는 치료법 및 치료제에 대해 골수 보호 효과를 제공하는 데 충분한 양으로 투여한다. "MPIF-1을 투여한다"라 함은 MPIF-1, MPIF-1의 유사체 또는 이들의 혼합물을 치료 유효량으로 투여하는 것을 의미한다. MPIF-1의 투여 방식에 대해서는 이하에 설명하였다.

MPIF-1은 분열 세포를 우선적으로 사멸하는 치료 기간 동안에, 그 이전 또는 이후에 투여할 수 있다. 바람직한 실시예에서, MPIF-1은 방사선 치료를 하거나 세포 순환 활성 약물을 투여하기 전에 투여하며, MPIF-1이 골수 세포의 증식을 억제하는 데 충분한 시간이 소요된다. 또한, 본 발명은 MPIF-1을 사용하여 분열 세포를 우선적으로 사멸하는 여러 차례의 치료 기간 동안에 골수 세포를 보호하는 방법에 관한 것이다. 이 경우에, MPIF-1은 단일의 투여 용량으로 또는 여러번의 투여 용량으로, 치료 또는 치료 섭생중 다양한 시점에서 투여할 수 있다.

전술한 바와 같이, MPIF-1은 단독으로 또는 1종 이상의 골수 촉진 인자와 함께 사용할 수 있다. 골수 촉진 인자라는 용어는 당분야에 통용되는 것으로서, 방사선 치료 또는 세포 순환 활성 약물을 사용한 치료를 받고 있는 피검체에서 골수 세포가 고갈된 이후에 골수 세포의 증식을 촉진하는 것이다. 이에 관해서는, 예컨대 문헌[Kannan, V. 등, Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 37:1005-1010(1997); Engelhardt, M. 등, Bone Marrow Transplant 19:529-537(1997); Vadhan-Raj, S. 등, Ann. Intern. Med., 126: 673-681 (1997); Harker, L. 등, Blood 89:155-165(1997); Bausser, R. 등, Lancet 348:1279-1281(1996); Grossman, A. 등, Blood 88: 3363-3370(1996); Gordon, M. 등, Blood 87:3615-3624(1996)]을 참조할 수 있다. MPIF-1은 예를 들면 분열 세포를 사멸하는 치료를 하기 전에 투여할 수 있으며, 1종 이상의 골수 촉진 인자를 이와 같은 치료를 하는 과정중에 또는 그 이후에 투여한다. 이 경우에, MPIF-1은 골수 세포를 치료제로부터 보호하며, 골수 촉진 인자(들)의 동시 투여는 보호된 골수 세포 집단을 팽창시키는 결과를 유발할 것이다.

골수 촉진 인자는 통상적으로 치료 유효량의 화학 요법제를 사용하는 치료를 받고 있는 환자에게 투여된다. 투여에 사용되는 투여 제제와 방식은 치료되는 대상, 자극하고자 하는 세포의 상태, 화학 요법 섭생에 있어서의 치료 단계 및 사용된 골수 촉진 인자(들)에 따라 달라질 수 있다. GM-GSF 및 G-CSF는 예를 들면 체중 1 킬로그램당 약 1 ㎍ 및 5 ㎍ 내지 10 ㎍의 용량에서 각각 치료 효과가 있으며, 매일 피하 주사에 의해 투여할 수 있다. 이에 관해서는, 문헌 [Kannan, V. 등, Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 37: 1005-1010 (1997), Engelhardt, M. 등, Bone Marrow Transplant 19:529-537 (1997), Sniecinski, I. 등, Blood 89:1521-1528(1997)]을 참조할 수 있다. IL-11은 매일 체중 1 킬로그램당 100 ㎍에 이르는 용량으로 매일 피하 주사에 의해 투여할 수 있다. 이에 관해서는 상기 Gordon, M. et al.의 문헌을 참조할 수 있다. 그러나, 10 ㎍/kg 이하의 IL-11의 용량은 화학 요법에 의해 유발된 혈소판 감소증을 경감시키는 데 유효한 것으로 생각된다. Tpo는 체중 1 킬로그램당 0.3 ㎍ 내지 2.5 ㎍ 범위의 용량으로 정맥내 주사에 의해 투여할 수 있다. 이에 관해서는, 문헌 [Vadhan-Raj, S. 등, Ann. Intern. Med. 126:673-681(1997), Harker, L. 등, Blood 89:155-165(1997)]을 참조할 수 있다. 당업자가 알고 있는 바와 같이, 최적의 투여 제형과 방식은 전술한 것을 비롯한 다수의 인자에 따라 달라질 것이다. 또 다른 골수 촉진 인자에 대한 투여 제형과 투여 방식은 당업자에게 잘 알려져 있다.

또한, 분열 세포를 우선적으로 사멸하는 치료 방법을 포함한 치료 프로토콜의 일부로서 골수 촉진 인자를 투여하는 시기는 앞에서 투여 제형과 투여 방식에 대해 전술한 바와 같은 인자에 따라 달라질 수 있다. 방사선 요법 또는 세포 순환 활성 약물을 사용한 치료 프로토콜의 일부로서 피검체에게 골수 촉진 인자를 투여하는 방법을 개시한 다수의 보고서가 있다. 예를 들면, 상기 Avdhan-Raj, S. 등의 문헌에서는, 화학 요법제를 투여하기 3주 전에 단일 정맥내 투여 용량의 Tpo를 사용하는 방법을 보고하고 있다. 문헌 [Papadimitrou, C. 등, Cancer 79:2391-2395 (1997) 및 Whitehead, R. 등, J. Clin. Oncol. 15:2414-2419(1997)]에서는, 수주의 기간에 걸쳐 화학 요법제를 투여하는 것을 포함하는 화학 요법을 보고하고 있다. 각각의 경우에, G-CSF의 용량은 화학 요법제를 사용하는 치료 초일 이후와 치료 최종일 전의 여러 시점에서 투여한다. 유사하게 IL-11과 GM-SCF를 병용하는 방법이 Gordon, M. 등의 상기 문헌과 문헌 [Michael, M. 등, Am. J. Clin. Oncol. 20:259-262 (1997)]에 개시되어 있다. 그러나, 당업자라면, 골수 촉진 인자를 투여하는 최적 시기가 사용된 특정의 골수 촉진 인자 및 이들의 투여 조건에 따라 달라진다는 것을 알 것이다.

따라서, 골수 촉진 인자를 사용하여 분열 세포를 우선적으로 사멸하는 요법에 의해 유발되는 세포 독성 효과를 경감시키기 위해 골수 촉진 인자를 투여하는 방법은 당업자에게 알려진 것이다. 골수 촉진 인자는 정맥내 및 피하 주사를 비롯한 여러 가지 경로에 의해 투여할 수 있다. 투여되는 골수 촉진 인자의 농도는 여러 가지 인자에 따라 달라지지만, 일반적으로 체중 1 킬로그램당 0.1 ㎍ 내지 100 ㎍의 범위이며, 화학 요법 또는 방사능 치료 섭생의 다양한 시점에서 단일 용량으로 또는 여러 번의 투여 용량으로 투여할 수 있다. 그러나, 골수 촉진 인자는 일반적으로 화학 요법제 또는 방사능 치료제를 투여하기 전이나 후에 투여한다. 당업자에게 알려진 바와 같이, 골수 촉진 인자를 사용하는 조건은 구체적인 골수 촉진 인자 및 치료 섭생에 따라 달라질 것이다.

당업자에게 알려진 바와 같이, MPIF-1을 전술한 바와 같이 조혈 성장 인자의 효능을 증가시키는 데 사용할 수 있다. 이와 같은 조혈 성장 인자로서는 에리트로포이에틴을 들 수 있는데, 이는 적혈구의 생성을 촉진하는 것이며, 이외에도 보다 원시적인 간세포를 자극하여 모든 혈세포형의 수를 증가시키는 다계통 성장 인자를 들 수 있다. 그밖의 것으로는, 간세포 인자 GM-CSF 및 G-CSF와 에리트로포이에틴, IL-3과 CSF, 그리고 GM-CSF와 G-CSF의 하이브리드 분자를 들 수 있다.

본 발명의 골수 억제성 약제 조성물은, 골수 세포의 과다 증식 상태를 유발하는 백혈병을 치료하는 데에도 유용하다. 따라서, 본 발명은 백혈병 환자에게 골수 억제 유효량의 MPIF-1을 단독으로, 또는 MIP-1α, MIP-2α, PF4, IL-8, MCAF 및 MRP-2로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종 이상의 케모킨과 함께 투여하는 것으로 이루어지는, 백혈병의 치료 방법을 제공한다.

"골수양 세포의 증식을 억제"한다는 것은, 골수양 세포의 세포 증식을 감소시키고 및/또는 서서히 순환하는 단계에서 골수양 세포의 백분율을 증가시키는 것을 의미한다. 전술한 바와 같이, "피검체"라는 용어는 포유류, 바람직하게는 인간을 의미한다. 본 발명의 골수 억제성 조성물을 아세토니트릴(ACN)과 함께 예비 항온 처리하면, 상기 케모킨의 골수양 선조 세포 억제에 대한 특이 활성이 현저하게 증가된다. 따라서, 바람직하게는 본 발명의 골수 억제성 조성물을 투여하기 전에, 이를 본 명세서에 참고 인용한 문헌 [Broxmeyer H. E. 등, Ann-Hematol. 71(5): 235-46 (1995)] 및 PCT 공개 공보 WO94/13321호에 개시된 바와 같이, ACN으로 전처리한다.

본 발명의 골수 억제성 조성물은 질소 머스타드, 에틸렌이민, 알킬 설포네이트, 니트로소우레아 및 트리아젠과 같은 알킬화제, 엽산 유사체, 피리미딘 유사체, 구체적으로 플루오로우라실 및 시토신 아라비노시드 및 퓨린 유사체와 같은 항대사물질, 빈카 알칼로이드, 에피포도필로톡신, 항생제, 효소 및 생물학적 응답 조절제와 같은 천연 산물, 그리고 백금 배위 착물, 안트라센디온, 치환된 우레아(예: 히드록시우레아), 메틸 히드라진 유도체 및 아드레노코르티코이드 억제제와 같은 미셀 생성물을 비롯한 각종 화학 요법제와 함께 사용할 수 있다.

화학 요법제는 공지된 기법에 따라 공지의 농도로 투여할 수 있다. 본 발명의 골수 억제성 조성물은 화학 요법제와 동시에, 또는 화학 요법제를 투여하기 전이나 후에 별도로 투여할 수 있다.

특정의 케모킨, 예를 들면 MIP-1β, MIP-2β 및 GRO-α는 본 발명의 골수 억제성 조성물의 골수 억제 효과를 억제한다(적어도 부분적으로 차단한다). 따라서, 또 다른 면에서, 본 발명은 MIP-1β, MIP-2β 및 GRO-α로 이루어진 군 중에서 선택된 유효량의 골수 억제 효과 억제제를 사전에 MIP를 단독으로 또는 MIP와 MIP-1α, MIP-2α, PF4, IL-8, MCAF 및 MRP-2 중 1종 이상과 함께 사용하는 골수 억제제에 노출된 포유류에게 투여하는 것을 포함하여, 골수 억제 효과를 억제하는 방법에 관한 것이다.

당업자에게 알려져 있는 바와 같이, MPIF-1 활성도를 증가시킬 필요가 있는 피검체를 치료하기 위한 MPIF-1 폴리펩티드의 유효량(골수 억제제 또는 골수 억제 효과 억제제를 사용하거나 사용하지 않을 경우 골수 억제에 유효한 MPIF-1 폴리펩티드의 양 포함)은, MPIF-1을 투여하도록 처방한 상황에 따라 실험적으로 결정된다. MPIF-1 활성이 있는 폴리펩티드는 1종 이상의 약학적으로 허용되는 부형제를 사용한 약제 조성물의 형태로 투여할 수 있다.

또한, MPIF-1은 세포 괴사를 유발함으로써, 백혈병과 비정상적으로 증식하는 세포, 예를 들면 종양 세포를 치료하는 데에도 사용할 수 있다. MPIF-1은 조혈 선조 세포의 증식에 있어서 세포 괴사를 일으킨다.

MPIF-1은 미성숙된 조혈 선조 세포, 예를 들면 과립 백혈구, 대식 세포 또는 단핵구의 분화를 일시적으로 방지함으로써, 이들을 팽창시키는 데에도 사용할 수 있다. 이러한 골수 세포는 시험관내에서 배양할 수 있다. 따라서, MPIF-1은 골수 이식 및/또는 유전자 유법에 사용하기 위한 시험관내 조혈 간세포의 조절제로서도 유용하다. 간세포는 드물고 유전자 요법에 유전자를 도입시키는 데 가장 유용하기 때문에, MPIF를 사용하여 간세포의 농축된 집단을 분리시킬 수 있다. 간세포는 세포독소, 예를 들면 분열 세포를 급격하게 사멸하는 5-Fu의 존재하에 세포를 배양함으로써 농축시킬 수 있으며, 이 때 간세포는 MPIF-1에 의해 보호될 것이다. 이러한 간세포는 골수 이식 환자에게 복귀되거나 유전자 요법에서 소정의 유전자를 형질 감염시키는 데 사용할 수 있다. 또한, MPIF-1을 피검체에게 주사하여 피검체의 골수로부터 간세포를 말초 혈액으로 방출할 수 있다. 이러한 간세포는 유전자 요법에서 자원성 골수 이식 또는 조작의 목적으로 분리시킬 수 있다. 환자의 화학 요법 또는 방사선 요법을 완료한 후에, 분리된 간세포를 환자에게 복귀시킬 수 있다.

또한, MPIF-1은 T-림프구뿐만 아니라 대식 세포에도 영향을 미치므로, MPIF-1은 항원 제공 세포(APC)가 바이러스, 박테리아 또는 기타 이종 물질을 수용하고, 이들을 처리하여 면역 반응의 원인 물질인 림프구에 이들을 제공하는 능력을 증가시킬 수 있다. 또한, MPIF-1은 APC와 T-림프구 및 B-림프구와의 상호 작용을 조절할 수 있다. MPIF-1은 항원을 제공하는 동안 동시 조절 시그날을 나타내는데, 이는 응답 세포가 생존하는지, 증식하는지, 분화하는지, 또 다른 시토킨이나 가용성 조절 물질을 분비하는지, 아니면 세포 괴사 또는 세포 사멸의 다른 메카니즘을 유발함으로써 응답 세포를 선택적으로 제거하는지 여부를 시사한다. APC는 HIV의 CD4+ T-림프구로의 전이를 촉진하는 것으로 밝혀졌기 때문에, MPIF-1은 이러한 능력에도 영향을 미쳐서 HIV 또는 기타 APC를 통해 매개되는 바이러스에 의한 림프구의 감염을 방지할 수 있다. APC, T-림프구, 또는 HIV, EBV 또는 기타 임의의 바이러스에 의한 기타 세포형의 초기 감염인 경우에도 마찬가지이다.

또한, 최근에는 MIP-1α 수용체가 인간 단핵구내로의 HIV의 진입을 촉진하는 데 있어서 보조 인자로서 작용하며, T-림프구는 MPIF-1 또는 이의 유사체가 세포내로의 HIV 진입 과정을 방해할 수 있는 중요한 가능성을 유발하는 것으로 입증되었다(실시예 17 참조). 따라서, MPIF-1은 MIP-1α 수용체에 의해 그 진입이 촉진되는 것인 바이러스와 레트로바이러스에 대한 항바이러스제로서 유용하다.

MPIF-1은 T-림프구가 박테리아 및 박테리아 감염뿐만 아니라 이종의 생체에 대항하는 고유한 활성을 자극함으로써 면역 증강 인자로서 작용할 수 있다. 이와 같은 활성은 이종 항원에 대한 정상 응답, 예컨대 알레르기의 감염 및 고형 종양과 백혈병을 비롯한 신생물 또는 양성 성장에 대한 면역 응답에 대해서도 유용하다.

이러한 이유에서, 본 발명은 포유류, 바람직하게는 인간에서 다양한 면역계 관련 장애를 진단 또는 치료하는 데 유용하다. 그와 같은 장애로서는 종양, 암 및 면역 세포 기능의 조절 장애, 예를 들면 자기 면역, 관절염, 백혈병, 림프종, 면역 억제, 패혈증, 외상 치유, 급성 감염증과 만성 감염증, 세포 매개 면역, 호르몬 면역, 염증성 장 질환, 골수 억제 등을 들 수 있다.

M-CIF 치료/진단 용도

M-CIF 활성은 면역 증강 또는 억제, 골수 보호, 간세포 부동화, 급성 염증 억제와 만성 염증 억제 및 백혈병의 치료에 유용하다. 또한, M-CIF는 T-림프구뿐만 아니라 대식 세포에도 영향을 미치므로, M-CIF는 항원 제공 세포(APC)가 바이러스, 박테리아 또는 기타 이종 물질을 수용하여 이들을 처리하고, 이들을 면역 응답에 대한 원인이 되는 림프구에 제공하는 능력을 증가시킨다. 또한, M-CIF는 APC와 T-림프구 및 B-림프구와의 상호 작용을 조절할 수 있다. 예를 들면, M-CIF는 항원을 제공하는 동안 동시 조절 시그날을 나타내는데, 이는 응답 세포가 생존하는지, 증식하는지, 분화하는지, 또 다른 시토킨이나 가용성 조절 물질을 분비하는지, 아니면 세포 괴사 또는 세포 사멸의 다른 메카니즘을 유발함으로써 응답 세포를 선택적으로 제거하는지 여부를 시사한다. APC는 HIV의 CD4+ T-림프구로의 전이를 촉진하는 것으로 밝혀졌기 때문에, M-CIF는 이러한 능력에도 영향을 미쳐서 HIV 또는 기타 APC를 통해 매개되는 바이러스에 의한 림프구의 감염을 방지할 수 있다. APC, T-림프구, 또는 HIV, EBV 또는 기타 임의의 바이러스에 의한 기타 세포형의 초기 감염인 경우에도 마찬가지이다.

M-CIF는 면역계를 억제한다. 한가지 메카니즘으로서, M-CIF는 CTLA-4를 통해 T-림프구의 활성을 하향 조절한다. T-세포의 활성화 및 연속하는 분화는 APC로부터 유래하는 2가지 유형의 시그날을 필요로 한다. 이러한 2가지 시그날 중 하나는 항원 독립적인 시그날로서, 이는 T 세포 표면 분자 CD28과 APC상의 B7족 구성원과의 결합에 의해 매개된다. [Allison, Curr. Opin. Immunol. 6:414 (1994), June 등, Immunol. Today 15:321 (1994)]. CD28과는 대조적으로, CTLA-4는 T 세포 응답의 음성 조절에 대해 중요한 인자이다. [Waterhouse 등, Science 270: 985 (1995)]. 최근의 연구에 의하면, T 세포 활성화의 결과는 CD28로부터의 양성 시그날과 CTLA-4로부터의 음성 시그날 사이의 정밀한 평형을 이룬 상호 작용에 의해 결정되는 것으로 제안되어 있다. [Waterhouse 등, Science 270: 985(1995)]. 다수의 연구를 집적한 결과에 의하면, CTLA-4의 봉쇄가 해제되는 반면에, CTLA-4의 응집이 T 세포 응답을 하향 조절하는 억제 시그날을 제공하는 것으로 제안하고 있다. [Allison 등, Science 270: 932-933(1995)]. 또한, CTLA-4 녹아웃(knockout) 마우스의 표현형은 T 세포 응답의 조정에 있어서 CTLA-4에 대한 억제 시그날 기능을 지지한다. [Allison 등, Science 270: 932-933(1995)]. M-CIF는 CTLA-4 세포를 유발하는 것으로 나타나며, 이 CTLA-4 세포는 전술한 바와 같이 공지된 T 세포의 하향 조절 인자이다. 또한, M-CIF는 T 세포의 공지된 하향 조절 인자인 CD8+ 세포를 직접 억제한다.

M-CIF가 T 세포를 하향 조절하는 능력은 박테리아 또는 비루스 및 알레르기에 의한 감염 뿐만 아니라 고형 종양 및 백혈병을 비롯한 신생물 또는 양성 성장에 대한 면역 응답으로부터 이종 항원에 대한 면역 응답을 조정하는 데 유용하다.

이러한 이유에서, 본 발명은 포유류, 바람직하게는 인간에서 각종 면역계 관련 질환을 진단 또는 치료하는 데 유용하다. 이와 같은 질환으로는, 종양, 암 및 면역 세포 기능의 조절 장애, 예를 들면 자기 면역, 관절염, 백혈병, 림프종, 면역 억제, 패혈증, 외상 치유, 급성 감염증과 만성 감염증, 세포 매개 면역, 호르몬 면역, 염증성 장 질환, 골수 억제 등을 들 수 있다.

항염증성 물질의 하나인 M-CIF는 예를 들면, TNFα의 비정상적인 생산과 관련된 질환을 치료하는 데 사용할 수 있다. 이러한 질환으로서는, 패혈증 증후군, 예를 들면 건강 불량 상태, 급성 또는 만성 박테리아 감염으로부터 유발되는 순환성 허탈 및 쇼크, 급성 및 만성 기생충 또는 감염 증상, 예를 들면 박테리아, 바이러스 및 박테리아 감염증, 급성 및 만성 면역 및 자기 면역 병태, 예컨대 전신 루푸스 홍반(SLE) 및 류마티스성 관절염, 알코올 유발 간염, 만성 염증성 병태, 예컨대 사르코이드증과 크론병, 혈관 염증성 병태, 예컨대 파급성 혈관내 응집, 그라프트 대 숙주 병태, 가와사키병, 악성 병태, 예컨대 TNF 분비 종양과 신경 변성 질병을 들 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.

신경 변성 질병으로서는, AIDS 치매 증후군, 탈수초성 질환, 예를 들면 다발성 경화증과 급성 횡형 척수염, 추체외 및 소뇌 장애, 예를 들면 피질 척수계의 병변, 기초 신경절 또는 소뇌 장애, 과운동성 장애, 예컨대 헌팅톤 무도병 및 노인성 무도병, 약물 유발 운동 장애, 예컨대 CNS 도파민 수용체를 차단하는 약물에 의해 유발된 장애, 운동 부전 장애, 예컨대 파킨슨병, 진행성 핵상 마비증, 소뇌 구조 병변, 척수 소뇌 퇴화, 예컨대 척수 실조증, 프리드리히 실조증, 소뇌 피질 변성, 다발성 전신 퇴화 증상(Mencel, Dejerine-Thomas, Shi-Drager and Machado-Joseph), 전신 질환(렙섬병, 무베타지단백혈증, 모세관 확장증 및 미토콘드리아 다계통 질환), 탈수초성 핵 질병, 예컨대 다발성 경화증, 급성 횡형 척수염, 그리고 운동 기관 장애, 예컨대 신경원성 근육 위축증(전각 세포 변성, 예를 들면 근위축성 측삭 경화증, 영아 척수 근육 마비증 및 유년기 척수 근육 마비증), 알츠하이머병, 중년 다운 증후군, 범발성 루이체(Lewy body) 질환, 루이체 유형의 노인성 치매, 베르니크 코르사코프 증후군, 만성 알콜 중독, 크루츠펠트 야곱병, 준급성 경화성 범뇌염, 할레로덴 스파츠병 및 치매증을 들 수 있으나, 이들에 국한되는 것은 아니다. 바람직한 신경 변성 질환은 다발성 경화증이다.

이에 관해서는, 본 명세서에 참고 인용한 문헌[Berkow 등, eds., The Merck Manual, 16th edition, Merck and Co., Rahway, N.J., 1992]을 참조할 수 있다.

전술한 바와 같이, M-CIF는 SLE 및 면역 응답 및 염증과 관련된 기타 질병 상태를 치료하는 데에도 사용할 수 있다. SLE는 사구체신염 및 혈관염을 유발할 수 있는 보체 고정 면역 응집체의 형성을 일으키는 자기 면역 질병이다. [Steinberg, A. D. and Klinman, D.M., Rheum. Dis. Clinics of No. Amer. 14:25(1988)]. SLE 및 사구체 신염 및 혈관염과 관련된 루푸스를 치료하는 데 현재 다수의 시약이 사용되거나 제안되고 있다. 이러한 시약으로서는, 면역 응답을 유발하는 데 필요한 세포 표면 수용체에 대한 특이성이 있는 항체를 들 수 있다. 예를 들면, 안티-CD11a와 안티-CD-54 단일 클론 항체는 실험시 루푸스 신염 치료에 유효한 것으로 밝혀졌다. [Koostra, C. J. 등, Clin. Exp. Immunol. 108:324-332 (1997)]. CD28/CTLA-4 및 이들의 리간드와의 상포 작용을 차단하는 방법도, 루프스와 관련된 면역 응답을 억제하는 수단으로서 제안되었으며, CD80과 CD86 특이성 단일 클론 항체를 투여하면 실험용 동물 모델에서 루푸스의 발병과 진행을 방지하는 것으로 밝혀졌다. [Nakajima, A. 등, Eur. J. Immunol. 25: 3060-3069(1995)]. 또한, 화학 약제가 SLE 및 사구체 신염 및 혈관염과 관련된 루푸스의 치료에 치료 효능이 있는 것으로 밝혀졌다. 이러한 약제로는, 안티폴레이트 화합물(예: 메토트렉세이트 및 MX-68) 및 면역 억제제(예를 들면, 코르티코스테로이드, 시클로포스파이드, 미코페놀레이트 모페틸, 아자티오프린)을 들 수 있다. [Corna, D. 등, Kidney Int. 51:1583-1589(1997), Mihara, M. 등, Int. Arch. Allergy Immunol. 113:454-459 (1997), Gansauge, S. 등, Ann. Rheum. Dis. 56:382-385(1997)]. 또 다른 약제는 비루프스 관련 면역 합병증과 관련된 질병의 치료에 치료 효능이 있다. 이와 같은 화합물의 2가지 부류는 자유 라디칼 스캐빈저(예: OPC-15161) 및 안지오텐신 전환 효소 억제제(예: 퀴나프릴)이다. [Sanaka T. 등, Nephron 76:315-322(1997), Ruiz-Ortega, M. 등, J. Am. Soc. Nephrol. 8:756-768(1997)].

하기 실시예 19 및 29에 나타낸 바와 같이, M-CIF는 세포 매개 면역과 관련된 신장 염증을 억제하고, 신장염 관련 루푸스의 진행을 경감시킨다. 따라서, 본 발명은 M-CIF를 환자에게 투여하는 것을 포함하여, SLE 및 면역 응답과 관련된 기타 질병(예를 들면, 세포 매개 면역 및 면역 복합체의 형성으로부터 유발되는 질병)을 치료하는 방법을 제공한다. M-CIF는 단독의 면역 응답 조절제로서 투여하거나, 면역 응답을 조절하는 1종 이상의 다른 약제와 함께 투여할 수 있다.

따라서, MPIF-1, MIP-4 및 M-CIF를 사용하여, 외상 부위에 대한 표적 면역 세포의 침투를 조절함으로써 외상 치료를 촉진할 수 있다. 유사한 방식으로, 본 발명의 폴리펩티드는 만성 감염, 예를 들면 살미생물성 백혈구의 유인과 활성화를 통한 미코박테리아 감염에 대한 숙주 방어 효과를 증가시킬 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드와, 이 폴리펩티드를 암호화하는 폴리누클레오티드는 합성 연구, DNA 합성 및 DNA 벡터의 제조와 관련된 시험관내 목적으로, 그리고 인간 질병을 치료하기 위한 치료제와 진단제를 개발할 목적으로 연구용 시약으로서 사용할 수 있다. 예를 들면, M-CIF와 MPIF-1은 미성숙된 조혈 선조 세포, 예컨대 과립 백혈구, 대식 세포 또는 단핵구의 분화를 일시적으로 방지하는 방식으로, 이들을 팽창시키는 데 사용할 수 있다. 이러한 골수 세포는 시험관내에서 배양할 수 있다.

폴리펩티드의 또 다른 용도는, 예를 들면 자기 면역 질병과 림프구성 백혈병에 있어서, IL-2 생합성을 통해 T-세포 증식을 억제하는 것이다.

MPIF-1, MIP-4 및 M-CIF는 또한, 표피 각질 세포 증식을 억제하는 데 유용하므로, 건선(각질 세포 과다 증식증)에 있어서 유용성을 갖는데, 피부내의 란게르한스(Langerhans) 세포가 MIP-1α를 생성하는 것으로 밝혀졌기 때문이다.

또한, MIP-1, MIP-4 및 M-CIF는 외상을 치료하는 동안 조직편을 제거하고 연결 조직을 자극하는 염증 세포의 회복을 통해서, 또한 과잉 TGFβ 매개 섬유 조직 증식증을 제어함으로써, 반흔을 예방하는 데 사용할 수 있으며, 또한 이러한 폴리펩티드는 졸중, 혈소판 증가증, 폐 색전증 및 골수 증식성 장애를 치료하는 데 사용할 수 있는데, MPIF-1, MIP-4 및 M-CIF가 혈관 투과능을 증가시키기 때문이다.

약제 조성물

MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4 폴리펩티드 의약 조성물은, 본 발명에 의한 분리된 MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4 폴리펩티드, 특히 성숙한 형태의 MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4를 피검체에 있어서 MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4 활성도를 증가시키는 데 유효한 양으로 포함한다. 이와 같은 조성물은 각 환자의 임상학적 상태(특히, MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4 폴리펩티드만으로 치료할 경우의 부작용), MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4 폴리펩티드 조성물의 전달 부위, 투여 방법, 투여 계획 및 기타 실행자에게 잘 알려진 인자를 고려하여, 약제학상 관용되는 방식에 따라 제제화하여 투약할 수 있다. 본 명세서에서, MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4의 "유효량"이라 함은, 이와 같은 고려 사항에 따라 결정되는 양이다.

본 발명의 폴리펩티드, 길항 물질 또는 동질 작용체는 적합한 약학적 담체와 함께 사용할 수 있다. 이와 같은 조성물은 치료 유효량의 단백질과 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함한다. 상기 담체로서는 완충 염수, 덱스트로스, 물, 글리세롤, 에탄올 및 이들의 혼합물을 들 수 있으나, 이들에 국한되는 것은 아니다. 제제는 투여 방식에 적합한 것이어야 한다.

"약학적으로 허용되는 담체"라 함은 비독성 고체, 반고체 또는 액체 충전제, 희석제, 봉입 물질 또는 임의의 유형의 제제화 보조제를 의미한다. "비경구"라는 용어는 정맥내, 근육내, 복강내, 흉골내, 피하 및 관절내 주사 및 주입을 비롯한 투여 방식을 의미한다.

또한, MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4 폴리펩티드는 서방성 시스템에 의해 투여하는 것이 적합하다. 적합한 서방성 조성물의 예로서는, 성형 제품, 예를 들면 필름 또는 마이크로캡슐 형태의 반투과성 중합체 매트릭스를 들 수 있다. 서방성 매트릭스로서는, 폴리락티드(미국 특허 제3,773,919호, EP 58,481호), L-글루탐산과 감마-에틸-L-글루타메이트의 공중합체(Sidman, U. 등, Biopolymers 22:547-556(1983)), 폴리(2-히드록시에틸 메타크릴레이트)(R. Langer 등, J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277(1981) 및 R. Langer 등, Chem. Tech. 12:98-105(1982)), 에틸렌 비닐 아세테이트(R. Langer 등 동문헌) 또는 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산(EP133,988호)를 들 수 있다. 또한, 서방성 MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4 폴리펩티드 조성물에는 리포솜 형태로 포획된 MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4 폴리펩티드도 포함된다. MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4 폴리펩티드를 함유하는 리포솜은 공지된 방법(DE 3,218,121호, Epstein 등, Proc. Natl. Acad. Sci.(USA) 82:3688-3692(1985), Hwang 등, Proc. Natl. Acad. Sci.(USA) 77:4030-4034(1980), EP 52,322호, EP 36,676호, EP 88,406호, EP 143,949호, EP 142,641호, 일본 특허 출원 공개 83-118008호, 미국 특허 제4,485,045호와 제4,544,545호 및 EP 102,324호)에 따라 제조한다. 통상, 리포솜은 크기가 작은(약 200∼800 옹스트롬) 단층형으로서, 이 중 지질 성분은 약 30 몰% 이상의 콜레스테롤로서, 선택된 분율은 MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4 폴리펩티드 요법을 최적화시키도록 조정된다.

한 실시예에서, 비경구 투여의 경우에는, MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4 폴리펩티드를, 일반적으로 목적하는 순도하에 단위 주사 투여 가능한 형태(용액, 현탁액, 에멀젼)로 약학적으로 허용되는 담체, 예를 들면 사용된 용량 및 농도에서 수용자에게 비독성이며 제제의 기타 성분과 혼화될 수 있는 담체와 함께 혼합시킴으로써 제제화한다. 예를 들면, 제제는 산화제 및 폴리펩티드에 대해 유해한 것으로 알려진 다른 화합물을 포함하지 않는 것이 바람직하다.

일반적으로, 제제는 MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4 폴리펩티드를 액상 담체 또는 미분쇄된 고체 담체 또는 이들 2종의 담체와 함께 균일하고 친밀하게 접촉시킴으로써 제조한다. 이어서, 필요에 따라 생성물을 소정의 제제로 성형한다. 담체는 비경구용 담체, 더욱 바람직하게는 수용자의 혈액과 등장성인 용액인 것이 바람직하다. 이러한 담체 부형제의 예로서는 물, 염수, 링거 용액 및 덱스트로오스 용액을 들 수 있다. 비수성 부형제, 예를 들면 비휘발성 오일과 에틸 올레에이트 및 리포솜도 본 발명의 조성물의 제제화에 유용하다.

담체는, 등장성 및 화학적 안정성을 증가시키는 물질과 같은 소량의 첨가제를 함유하는 것이 바람직하다. 이러한 물질은 사용된 용량과 농도에서 수용자에게 비독성인 것인데, 그 예로서는 인산염, 시트르산염, 숙신산염, 아세트산염 및 기타 유기산 또는 그 염과 같은 완충제, 아스코르브산과 같은 항산화제, 저분자량(잔기 약 10개 이하) 폴리펩티드, 예를 들면 폴리아르기닌 또는 트리펩티드, 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역 글로불린, 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 중합체, 글리신, 글루탐산, 아스파르트산 또는 아르기닌과 같은 아미노산, 모노사카라이드, 디사카라이드 및 기타 탄수화물, 예컨대 셀룰로오스 또는 그 유도체, 글루코오스, 만노스 또는 덱스트린, EDTA와 같은 킬레이트제, 만니톨 또는 소르비톨과 같은 당 알코올, 나트륨과 같은 반대 이온 및/또는 폴리소르베이트, 폴록사머 또는 PEG와 같은 비이온성 계면 활성제를 들 수 있다.

MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4 폴리펩티드는 통상적으로, 전술한 바와 같은 부형제를 사용하여 약 0.1 mg/ml 내지 100 mg/ml, 바람직하게는 1∼10 mg/ml의 농도로, 약 3 내지 8의 pH하에 제제화된다. 전술한 부형제, 담체 또는 안정화제 중 특정한 몇가지를 사용할 경우에는, MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4 폴리펩티드 염이 형성된다.

MPIF-1 및/또는 이의 유사체를 인간의 과증식성 장애를 치료하기 위한 화학 요법 섭생의 일환으로 골수 보호제로서 투여할 경우에, 정맥내 투여용으로 적합한 용량의 범위는 체중 1 kg당 0.01㎍ 내지 10 ㎍이다. 또한, MPIF-1은 체중 1 kg당 0.1 ㎍, 1.0 ㎍ 및 100 ㎍의 용량으로 정맥내 투여할 수도 있다. 동물 연구 실험 데이타의 외삽 결과, 인간의 골수 보호에 적합한 MPIF-1의 용량은 체중 1 kg당 0.016 ㎍인 것으로 나타났다.

또한, MPIF-1 및/또는 이의 유사체는 특정한 기일(예: 3일)동안 매일 1회 투여할 수 있다. 또한, 화학 요법 섭생에 사용할 경우에, MPIF-1은 화학 요법제(들)을 투여하기 전에 인간에게 투여할 수 있다. 예를 들면 MPIF-1은 화학 요법제(들)을 투여하기 1일전, 2일전 및 당일에 투여할 수 있다.

MPIF-1 및/또는 이의 유사체를 골수 증식성 장애의 치료를 목적으로 투여할 경우에, 투여 용량은 MPIF-1을 골수 보호제로서 사용할 경우와 동일하다. 골수 증식성 장애를 치료하기 위해 인간에게 투여할 경우, MPIF-1은 피하 투여할 수 있다.

치료를 위해 투여하는 데 사용되는 MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4 폴리펩티드는 멸균시켜야 한다. 멸균은 멸균 여과막(예: 0.2 미크론 막)을 통해 여과함으로써 수행하는 것이 용이하다. 치료용 MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4 폴리펩티드 조성물은, 일반적으로 멸균 입구를 구비한 용기, 예를 들면 피하 주사 바늘이 관통할 수 있는 스토퍼를 구비한 정맥내 투여 용액 백 또는 바이알에 넣는다.

MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4 폴리펩티드는 통상, 단위 투약용 또는 여러 번의 투약용 용기, 예를 들면 앰플 또는 바이알에 용액 또는 재조합용 동결 건조 제제로서 보관된다. 동결 건조 제제의 예로서, 10 ml 바이알에 멸균 여과된 1%(w/v) MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4 폴리펩티드 수용액을 채워넣고 형성된 혼합물을 동결 건조시킨다. 주입 용액은 동결 건조된 MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4 폴리펩티드를 정균성 주사용수를 사용하여 재조합함으로써 제조한다.

또한, 본 발명은 본 발명의 약제 조성물을 구성하는 1종 이상의 성분을 채워넣은 하나 이상의 용기로 구성된 약제 팩 또는 키트를 제공한다. 이러한 용기에는 약품 또는 생물학적 제품의 제조, 사용 또는 판매를 관할하는 정부 관청에 의해 작성된 서식의 통지서가 첨부될 수 있는데, 이러한 통지서는 당해 관청이 인간 투여용 제품의 제조, 사용 또는 판매를 승인한 사실을 반영하는 것이다. 또한, 본 발명의 폴리펩티드는 기타 치료용 화합물과 함께 사용할 수 있다.

투여 방식

피검체에서 MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4의 표준 또는 정상 활성도가 감소함으로써 유발되는 증상은 MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4 단백질을 투여함으로써 치료할 수 있다. 따라서, 본 발명은 MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4 활성을 증가시킬 필요가 있는 피검체에게, 유효량의 본 발명의 분리된 MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4 폴리펩티드, 특히 전술한 바와 같은 피검체에서 MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4 활성도를 증가시키는 데 유효한 성숙한 형태의 MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4를 포함하는 약제 조성물을 투여함으로써, 상기 피검체를 치료하는 방법을 제공한다.

피검체에게 투여되는 MPIF-1, M-CIF 및 MIP-4의 양과 투약 섭생은 투여 방식, 치료하고자 하는 증상의 특성 및 처방 전문의의 판단과 같은 여러 가지 인자에 좌우될 것이다. 약제 조성물은 특별한 징후를 치료 및/또는 예방하는 데 유효한 양으로 투여한다. 일반적으로, 폴리펩티드는 체중 1 kg당 약 10 ㎍ 이상의 양으로 투여하며, 대부분의 경우에, 폴리펩티드는 1일 체중 1 kg당 약 10 mg/kg을 초과하지 않는 양으로 투여하며, 그 용량은 투여 경로와 증후 등을 고려할 때 1일 체중 1 kg당 약 10 ㎍/kg인 것이 바람직하다.

일반적으로, 1회 투여시 비경구 투여되는 MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4 폴리펩티드의 총 치료 유효량은 1일 환자 체중 1 kg당 약 1 ㎍ 내지 10 mg이지만, 전술한 바와 같이, 이 양은 치료 상황별로 재량에 따라 달라진다. 상기 유효 용량은 0.01 mg/kg/일 이상인 것이 더욱 바람직하고, 인간에 대해서는 약 0.01 mg/kg/일 내지 1 mg/kg/일인 것이 가장 바람직하다. 연속적인 상황에서, MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4 폴리펩티드는, 통상 1일 1회 내지 4회 주사하거나, 미니 펌프 등을 사용하여 연속적으로 피하 주입하는 방식으로, 약 1 ㎍/kg/hr 내지 약 50 ㎍/kg/hr의 용량으로 투여된다. 정맥내 투여용 백을 사용할 수도 있다. 변화를 관찰하는 데 필요한 치료 기간 및 치료후 반응에 대한 간격은 목적하는 효과에 따라 달라진다.

본 발명의 MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4를 함유하는 약제 조성물은 경구, 직장, 비경구, 흉골내, 질내, 복강내, 국소(분말, 연고, 점적액 또는 경피 첩부제 사용), 협측, 또는 구강용 또는 비강용 스프레이에 의해 투여할 수 있다.

유전자 요법

케모킨 폴리펩티드, 그리고 폴리펩티드인 길항제 또는 동질 작용체는 생체내에서 이와 같은 폴리펩티드를 형질 발현시킴으로써, 소위 "유전자 요법"에 의해 본 발명에 따라 사용할 수 있다.

따라서, 예를 들면 환자로부터 얻은 세포를 생체외에서 폴리펩티드를 암호화하는 폴리누클레오티드(DNA 또는 RNA)에 의해 유전 공학적으로 조작하고, 이어서 유전 공학적으로 조작된 세포를 폴리펩티드로 치료하고자 하는 환자에게 제공할 수 있다. 이 방법은 당분야에 잘 알려진 것이다. 예를 들면 당분야에 공지된 절차에 따라 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 RNA를 함유하는 레트로바이러스 입자를 사용함으로써 세포를 유전 공학적으로 조작할 수 있다.

유사하게, 세포는 예를 들면 당분야에 공지된 절차에 따라 생체내에서 폴리펩티드를 형질 발현시키기 위해 생체내에서 유전 공학적으로 조작할 수도 있다. 당분야에 알려진 바와 같이, 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 RNA를 함유하는 레트로바이러스 입자를 생산하기 위한 프로듀서 세포를 환자에게 투여하여, 생체내에서 세포를 유전 공학적으로 조작하고 생체내에서 폴리펩티드를 형질 발현시킬 수 있다. 이러한 방법 및 그 방법에 의해 본 발명의 폴리펩티드를 투여하는 방법 역시 본 발명의 기술 내용으로부터 당업자가 용이하게 파악할 수 있을 것이다. 예를 들면, 세포 처리용 형질 발현 부형제는 레트로바이러스 이외의 것, 예를 들면 적합한 전달용 담체와 혼합한 후에 생체내에서 세포를 유전 공학적으로 조작하는 데 사용할 수 있는 아데노바이러스일 수도 있다.

레트로바이러스 플라스미드 벡터는 레트로바이러스로부터 유도될 수 있으며, 그러한 레트로바이러스로서는 몰로니 쥐 육종 바이러스, 몰로니 쥐 백혈병 바이러스, 비장 괴사 바이러스, 로우스 육종 바이러스 및 하비 육종 바이러스를 들 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.

바람직한 실시예에서, 레트로바이러스 형질 발현 벡터인 pMV-7은 몰로니 쥐 육종 바이러스의 말단기가 긴 반복부(LTR)에 접하며, 헤르페스 심플렉스 바이러스(HSV) 티미딘 키나제(tk) 프로모터의 통제하에 선택적인 내약성 신생 유전자를 함유한다. 특유한 EcoRi 및 HindIII 부위는 암호화 서열의 도입을 용이하게 한다(Kirschmeier, P.T. 등, DNA 7:219-25(1988)).

상기 벡터는 하나 이상의 적합한 프로모터를 포함하는데, 그 예로서는 레트로바이러스 LTR, SV40 프로모터 및 인간 시토메갈로바이러스(CMV) 프로모터(Miller 등, Biotechniques, Vol.7, No.9:980-990(1989) 기재) 또는 기타 임의의 프로모터(예를 들면 세포 프로모터, 예컨대 히스톤, polIII 및 β-액틴 프로모터를 비롯한 진핵 세포 프로모터)를 들 수 있으나, 이들에 국한되는 것은 아니다. 당업자라면, 본 발명의 기술 내용을 통해서 적합한 프로모터를 용이하게 선택할 수 있을 것이다.

본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열은 적합한 프로모터, 예를 들면 바이러스 티미딘 키나제 프로모터, 예컨대 헤르페스 심플렉스 티미딘 키나제 프로모터, 레트로바이러스 LTR, β-액틴 프로모터 및 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 조절하는 천연 프로모터에 의해 조절된다.

레트로바이러스 플라스미드 벡터를 사용하여 패키징 세포주를 형질 변환시켜 프로듀서 세포주를 형성한다. 형질 변환 가능한 패키징 세포의 예로서는 PE501, PA317 및 GP+am12를 들 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 벡터는 당분야에 알려진 임의의 수단에 의해 형질 변환시킬 수 있다. 그러한 수단으로서는, 전기 영동, 리포솜 사용법 및 CaPO₄침전법을 들 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.

프로듀서 세포주는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열(들)을 포함하는 감염성 레트로바이러스 벡터를 포함한다. 이어서 이러한 레트로바이러스 벡터 입자를 사용하여 진핵 세포를 생체내 또는 시험관내에서 형질 변환시킬 수 있다. 형질 변환된 진핵 세포는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열(들)을 형질 발현할 것이다. 형질 변환 가능한 진핵 세포의 예로서는 섬유 아세포와 내피 세포를 들 수 있으나, 이들에 국한되는 것은 아니다.

이하, 본 발명을 실시예에 따라 설명하고자 하나, 후술하는 실시예가 본 발명의 보호 범위를 제한하는 것은 아니다. 특별한 언급이 없는 한, 모든 부와 양은 중량을 기준으로 한 것이다.

하기 실시예의 이해를 용이하게 하기 위해서, 자주 사용하는 방법 및/또는 용어를 설명하고자 한다.

"플라스미드"는 앞에 소문자 p를 기재하고 그 뒤에 대문자 및/또는 수를 기재하여 표시하였다. 본 발명에서 원료 플라스미드는 시판되거나, 일반이 통제없이 구득 가능한 것이거나, 또는 공지의 절차에 따라 구득할 수 있는 플라스미드로부터 작제할 수 있는 것이다. 또한, 당업자라면 이하에 기재된 것과 균등한 플라스미드를 알 수 있을 것이다.

DNA의 "분해"란 DNA 내의 특정 서열에서만 작용하는 제한 효소에 의해 DNA가 접촉 분해되는 것을 의미한다. 본 발명에 사용한 다양한 제한 효소는 시판되고 있으며, 이들의 반응 조건, 보조 인자 및 기타 요건은 당업자에게 알려진 바와 같이 사용하였다. 분석을 위해서, 통상 플라스미드 또는 DNA 분절 1 ㎍을 완충 용액 약 20 ㎕중의 효소 약 2 단위와 함께 사용하였다. 플라스미드 작제용으로 DNA를 분리시키기 위해서는 통상 DNA 5 ㎍ 내지 50 ㎍을 보다 큰 용량으로 효소 20 단위 내지 250 단위를 사용하여 분해시켰다. 특정한 제한 효소에 적절한 완충제와 기질의 양은 제조 업자에 의해 특정된다. 통상 항온 처리 시간은 37℃에서 약 1 시간으로 하였지만, 공급자의 지침에 따라서 달라질 수 있다. 분해시킨 후에, 반응물을 직접 폴리아크릴아미드 겔상에서 전기 영동하여 소정의 분절을 분리시킨다.

분해된 분절의 크기 분류는 문헌 [Goeddel, D. 등, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980)]에 기재된 바와 같이 8% 폴리아크릴아미드 겔을 사용하여 수행한다.

"올리고누클레오티드"는 화학적으로 합성할 수 있는 단일 스트랜드 폴리누클레오티드 또는 2개의 상보되는 폴리데옥시누클레오티드 스트랜드를 의미한다. 이와 같은 합성 올리고누클레오티드는 5" 인산염기가 없으므로, 키나제의 존재하에서 ATP에 의해 인산염을 첨가하지 않는한 다른 올리고누클레오티드에 결찰되지 않을 것이다. 합성 올리고누클레오티드는 탈포스포릴화되지 않은 분절에는 결찰될 것이다.

"결찰"은 2개의 이중 스트랜드 핵산 분절 사이에 포스포디에스테르 결합이 형성되는 과정을 의미한다(Maniatis, T. 등, 동 문헌, p. 146). 특별한 언급이 없는한, 결찰은, 대략 등몰량의 결찰시키고자 하는 DNA 분절 0.5 ㎍당 T4 DNA 리가제("리가제") 10 단위를 사용해서, 공지의 완충제와 조건에 따라 수행할 수 있다.

특별한 언급이 없는한, 형질 전환은 문헌 [Graham, F. 및 Vander Eb, A. Virology, 52:456-457(1973)]에 기재된 방법에 따라 수행하였다.

이상 본 발명을 상세하게 설명하였으며, 이하, 본 발명을 예시한 구체적인 실시예에 따라 본 발명을 더욱 용이하게 파악할 수 있을 것이다. 그러나, 후술하는 실시예는 예시적인 것에 불과할 뿐, 본 발명의 보호 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명에 따라, 신규의 전장 폴리펩티드 또는 성숙한 폴리펩티드인 MPIF-1, MIP-4 및/또는 M-CIF뿐 아니라, 생물학적으로 활성이며 진단학적으로 유용하고 치료적으로 유효한 이들의 단편, 아날로그 및 유도체가 제공된다. 본 발명의 MPIF-1, MIP-4 및 M-CIF는 바람직하게는 동물 유래의, 더욱 바람직하게는 인간 유래의 것이다.

본 발명에 따라, 본발명의 전술한 폴리펩티드를 암호하는 폴리뉴클레오티드(DNA 또는 RNA) 및 분리된 핵산 분자, 예컨대 RNAs, DNAs, cDNAs, 게놈성 DNA 뿐 아니라 생물학적으로 활성이면서 진단학적으로 또는 치료학적으로 유용한 이의 단편, 아날로그 및 이의 유도체를 제공한다.

MPIF-1 폴리뉴클레오티드

본 발명은 도 1(서열 번호 4)에 나타난 아미노산 서열 또는 1994년 2월 9일 ATCC 기탁번호 제75676호로서 박테리아 숙주내에 기탁된 cDNA에 의해 암호화된 아미노산 서열을 가진 MPIF-1 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 함유의 분리된 핵산 분자를 제공한다. 기탁된 MPIF-1 클론을 서열화하여 결정된 뉴클레오티드 서열[도1(서열 번호 3)으로 도시됨]은 120개의 아미노산 잔기로 이루어진 폴리펩티드을 암호화하는 개방 해독틀을 함유하는 데, 이 경우 리더 서열로서 약 21개의 아미노산 잔기도 함께 함유하며, 글리코실화의 정도에 따라 비글리코실화 형태의 성숙한 단백질의 추정된 분자량이 약 11kDa, 및 글리코실화 형태의 성숙한 단백질의 분자량이 약 11-14kDa로 나타난다. 성숙한 PIF-1 단백질의 아미노산 서열은 도1(서열 번호 4)에 도시되어 있다.

그러므로, 본 발명의 하나의 범주는 다음의 (1)(a) 에서 (1)(f)로 구성된 그룹에서 선택한 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 본리된 핵산 분자를 제공한다; (1)(a) 도1(서열 번호 4)의 완전한 아미노산 서열을 갖는 MPIF-1 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열; (1)(b) 도1(서열 번호 4)의 완전한 아미노산 서열을 갖지만 N-말단 메티오닌 잔기는 없는 MPIF-1 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열; (1)(c) 도1(서열 번호 4)의 위치 22-120에서 아미노산 서열을 갖는 성숙한 MPIF-1 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열; (1)(d) ATCC 기탁번호 제75676호에 함유된 cDNA 클론에 의해 암호화된 완전한 아미노산 서열을 갖는 MPIF-1 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열; (1)(e) ATCC 기탁번호 75676에 함유된 cDNA 클론에 의해 암호화된 아미노산 서열을 갖는 성숙한 MPIF-1 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열; (1)(f) 상기 (1)-(a), (b), (c), (d), 또는 (e)의 뉴클레오티드 서열 중 임의의 것에 상보적인 뉴클레오티드 서열.

M-CIF 폴리뉴클레오티드

하나의 범주로서, 본 발명은 도2(서열 번호2)에 나타난 아미노산 서열을 갖는 M-CIF 폴리펩티드 또는 1993년 10월 13일에 제75572호로 기탁된 박테리아 숙주 중의 cDNA 클론에 의해 암호화된 아미노산을 갖는 M-CIF 폴리펩티드를 암호하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분리된 핵산 분자를 제공한다. 도2(서열 번호 1)에 제시된, 기탁된 M-CIF 클론을 서열화하여 결정한 뉴클레오티드 서열은 93개의 아미노산 잔기로 이루어진 폴리펩티드를 암호화하는 개방 해독틀을 함유하는 데, 이 경우 리더 서열로서 약 19개의 아미노산 잔기도 함께 함유하며, 글리코실화의 정도에 따라 비글리코실화 형태의 성숙한 단백질의 추정된 분자량이 약 9kDa, 및 글리코실화 형태의 성숙한 단백질의 분자량이 약 9-14kD임을 나타낸다. 성숙한 M-CIF 단백질의 아미노산 서열은 도2(서열 번호 2)에 도시되어 있다.

그러므로, 본 발명의 한 범주는 다음의 (2)(a) 에서 (2)(f)로 구성된 그룹에서 선택한 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분리된 핵산 분자를 제공한다;(2)(a) 도2서열 번호 2의 완전한 아미노산 서열을 갖는 M-CIF 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열; (2)(b) 도2(서열 번호 2)의 완전한 아미노산 서열을 갖지만 N-말단 메티오닌 잔기는 없는 M-CIF 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열; (2)(c) 도2(서열 번호 2)의 위치 20-93에서 아미노산 서열을 갖는 성숙한 M-CIF 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열; (2)(d) ATCC 기탁번호 제75572호에 함유된 cDNA에 의해 암호화된 완전한 아미노산 서열을 갖는 M-CIF 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열; (2)(e) ATCC 기탁번호 제75572호에 함유된 cDNA 클론에 의해 암호화된 아미노산 서열을 갖는 성숙한 M-CIF 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열; (2)(f) 상기 (2)-(a), (b), (c), (d), 또는 (e)의 뉴클레오티드 서열 중 임의의 것에 상보적인 뉴클레오티드 서열.

MIP-4 폴리뉴클레오티드

하나의 범주로서, 본 발명은 도3(서열 번호 6)에 나타난 아미노산 서열을 갖는 MIP-4 폴리펩티드 또는 1994년 2월 9일에 제75675호로 기탁된 박테리아 숙주중에 기탁된 cDNA에 의해 암호화된 아미노산 서열을 갖는 MIP-4 폴리펩티드를 암호하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분리된 핵산 분자를 제공한다. 기탁된 MIP-4 클론의 서열을 분석하여 결정된 뉴클레오티드 서열(도3에 제시됨, 서열 번호 5)은 89개의 아미노산 잔기로 이루어진 폴리펩티드를 암호화하는 개방 해독틀을 함유하는 데, 이 경우 리더 서열로서 약 20개의 아미노산 잔기도 함께 함유하며, 글리코실화의 정도에 따라 비글리코실화 형태의 성숙한 단백질의 추정된 분자량이 약 8kDa, 및 글리코실화 형태의 성숙한 단백질의 분자량이 약 8-14kDa을 나타낸다. 성숙한 MIP-4 단백질의 아미노산 서열은 도2(서열 번호 6)에 도시되어 있다.

그러므로, 본 발명의 하나의 범주는 다음의 (3)(a) 에서 (3)(f)로 구성된 그룹에서 선택한 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다;(3)(a) 도3(서열 번호 6)의 완전한 아미노산 서열을 갖는 MIP-4 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열; (3)(b) 도3(서열 번호 6)의 완전한 아미노산 서열을 갖지만 N-말단 메티오닌 잔기는 없는 MIP-4 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열; (3)(c) 도3(서열 번호 6)의 위치 21-89에서 아미노산 서열을 갖는 성숙한 MIP-4 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열; (3)(d), ATCC 기탁번호 제75675호에 함유된 cDNA 클론에 의해 암호화된 완전한 아미노산 서열을 갖는 MIP-4 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열; (3)(e) ATCC 기탁번호 제75675호에 함유된 cDNA 클론에 의해 암호화된 완전한 아미노산 서열을 갖는 성숙한 MIP-4 폴리뉴클레오티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열; (3)(f) 상기 (3)-(a), (b), (c), (d), 또는 (e)의 뉴클레오티드 서열 중 임의의 것에 상보적인 뉴클레오티드 서열.

MPIF-1, M-CIF, 및 MIP-4 폴리뉴클레오티드 변형체

본 발명은 또한 도1, 2, 3(서열 번호 2, 4, 및 6)의 추론된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드의 단편, 이의 아날로그 및 이의 유도체 또는 기탁된 클론의 cDNA에 의해 암호화된 폴리펩티드 단편, 아날로그 및 유도체를 암호하는 상술한 폴리뉴클레오티드의 변형체에 관한 것이다. 이 폴리뉴클레오티드의 변형체는 천연 발생의 폴리뉴클레오티드 대립 형질 변형체 또는 비천연 발생의 폴리뉴클레오티드 변형체일 수있다.

상동성이 있는 MPIF-1, M-CIF, 및 MIP-4 폴리뉴클레오티드

본 발명의 분리된 핵산 분자는 전술한 (1)-, (2)- 또는 (3)-(a), (b), (c), (d), (e) 또는 (f)에서 제시한 임의의 뉴클레오티드 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 상동성을 지닌 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 엄격한 하이브리드화 조건하에서 (1)-, (2)- 또는 (3)-(a), (b), (c), (d), (e) 또는 (f)에서 제시한 폴리뉴클레오티드 서열에 하이브리드화할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 상기에서 하이브리드화되는 이들 폴리뉴클레오티드는 엄격한 조건하에서 A 잔기 또는 T 잔기만으로 구성된 뉴클레로티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 하이브리드화하지 않는다.

핵산 프로브

본 발명의 한 범주에 따라, MPIF-1, M-CIF 및/또는 MIP-4 핵산 서열에 특이적으로 하이브리드화할 수 있는 충분한 길이의 핵산 분자를 포함하는 핵산 프로브를 제공한다.

재조합 벡터, 숙주 세포 및 발현

본 발명은 분리된 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터, 이러한 벡터를 함유하는 숙주세포 뿐 아니라 이 벡터를 제조하는 방법 및 제조합 기술에 의해 이들 벡터 및 숙주를 사용하여 MPIF-1, M-CIF, 또는 MIP-4 폴리뉴클레오티드 또는 펩티드를 생산하는 방법을 제공한다.

MPIF-1 폴리펩티드

본 발명은 다른 한 범주에 따라, 다음의 (I)(a)-(I)(e)로 구성된 그룹에서 선택한 아미노산 서열을 갖는 분리된 MPIF-1 폴리펩티드를 제공한다:(I)(a) 도1(서열 번호 4)에 나타난 리더 서열을 비롯하여 완전한 120 개의 아미노산 서열을 갖는 MPIF-1 폴리펩티드의 아미노산 서열; (I)(b) 도1(서열 번호 4)에 나타난 리더 서열을 비롯하여 완전한 120 개의 아미노산 서열을 갖지만 N-말단 메티오닌 잔기는 제외한 MPIF-1 폴리펩티드의 아미노산 서열; (I)(c) 도1(서열 번호 4)의 위치 22-120 에서 아미노산 서열을 갖는 성숙한 MPIF-1 폴리펩티드(리더 서열 없음)의 아미노산 서열; (I)(d) ATCC 기탁번호 제75676호에 함유된 cDNA 클론에 의해 암호화된, 리더 서열을 비롯하여 완전한 아미노산 서열을 갖는 MPIF-1 폴리펩티드의 아미노산 서열; (I)(e) ATCC 기탁번호 제75676호에 함유된 cDNA 콜론에 의해 암호화된, 아미노산 서열을 갖는 성숙한 MPIF-1 폴리펩티드의 아미노산 서열.

M-CIF 폴리펩티드

본 발명은 다른 한 범주에 따라, 본발명은 다음의 (II)(a)-(II)(e)로 구성된 그룹에서 선택한 아미노산 서열을 갖는 분리된 M-CIF 폴리펩티드를 제공한다:(II)(a) 도2(서열 번호 2)에 나타난 리더 서열을 비롯하여 완전한 93 개의 아미노산 서열을 갖는 M-CIF 폴리펩티드의 아미노산 서열; (II)(b) 도2(서열 번호 2)에 나타난 리더 서열을 비롯하여 완전한 93 개의 아미노산 서열을 갖지만 N-말단 메티오닌 잔기는 제외한 M-CIF 폴리펩티드의 아미노산 서열; (II)(c) 도2(서열 번호 2)의 위치 20-93 에서 아미노산 서열을 갖는 성숙한 M-CIF 폴리펩티드(리더 서열 없음)의 아미노산 서열; (II)(d) ATCC 기탁번호 제75572호에 함유된 cDNA 클론에 의해 암호화된, 리더 서열을 비롯하여 완전한 아미노산 서열을 갖는 M-CIF 폴리펩티드의 아미노산 서열; (II)(e) ATCC 기탁번호 75572호에 함유된 cDNA 클론에 의해 암호화된, 아미노산 서열을 갖는 성숙한 M-CIF 폴리펩티드의 아미노산 서열.

MIP-4 폴리펩티드

본 발명은 다른 한 범주에 따라 다음의 (III)(a)-(III)(e)로 구성된 그룹에서 선택한 아미노산 서열을 갖는 분리된 MIP-4 폴리펩티드를 제공한다:(III)(a) 도3(서열 번호 6)에 나타난 리더 서열을 비롯하여 완전한 89 개의 아미노산 서열을 갖는 MIP-4 폴리펩티드의 아미노산 서열; (III)(b) 도3(서열 번호 6)에 나타난 리더 서열을 비롯하여 완전한 89 개의 아미노산 서열을 갖지만 N-말단 메티오닌 잔기는 제외한 MIP-4 폴리펩티드의 아미노산 서열; (III)(c) 도3(서열 번호 6)의 위치 21-89에서 아미노산 서열을 갖는 성숙한 MIP-4 폴리펩티드(리더 서열 없음)의 아미노산 서열; (III)(d) ATCC 기탁번호 제75675호에 함유된 cDNA 클론에 의해 암호화된, 리더 서열을 비롯하여 완전한 아미노산 서열을 갖는 MIP-4 폴리펩티드의 아미노산 서열; (III)(e) ATCC 기탁번호 제75675호에 함유된 cDNA 클론에 의해 암호화된, 아미노산 서열을 갖는 성숙한 MIP-4 폴리펩티드의 아미노산 서열.

상동성이 있는 MPIF-1, M-CIF, 및 MIP-4 폴리펩티드

본 발명의 폴리펩티드는 전술한 (I)-, (II)- 또는 (III)-(a), (b), (c), (d), 또는 (e)에서 제시한 폴리펩티드에 적어도 95%의 상동성이 있는 아미노산을 가진 동질의 폴리펩티드 뿐 아니라 상술된 것과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드도 포함한다.

MPIF-1, M-CIF, 및 MIP-4 에피토프를 갖는 폴리펩티드 및 MPIF-1, M-CIF, 및 MIP-4 에피토프를 암호화하는 폴리뉴클레오티드

본 발명의 한 범주로서, 전술한 (I)-, (II)- 또는 (III)-(a), (b), (c), (d), 또는 (e)에서 제시한 아미노산 서열을 갖는 MPIF-1, M-CIF, 또는 MIP-4 폴리펩티드의 에피토프를 함유하는 부위의 아미노산 서열을 갖는 펩티드 또는 폴리펩티드를 제공한다. 본 발명의 MPIF-1, M-CIF, 또는 MIP-4 폴리펩티드의 에피토프를 함유하는 부위의 아미노산 서열을 갖는 펩티드 또는 폴리펩티드는 적어도 6, 또는 7, 바람직하게는 적어도 9, 더욱 바람직하게는 약 30개의 아미노산 에서 약 50개의 아미노산을 갖는 상기 폴리펩티드 부위를 포함한다. 하지만 본 발명의 아미노산 서열의 전장를 비롯한 어떠한 길이의 에피토프를 함유하는 폴리펩티드도 본 발명의 범주에 속한다.

본 발명의 또 다른 핵산은 전술한 (I)-, (II)- 또는 (III)-(a), (b), (c), (d), 또는 (e)에서 제시한 아미노산 서열을 갖는 MPIF-1, M-CIF, 또는 MIP-4 폴리펩티드의 에피토프를 함유하는 부위의 아미노산 서열을 암화화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분리된 핵산 분자를 의미한다.

MPIF-1, M-CIF, 및 MIP-4 항체

본 발명은 전술한 폴리펩티드에 대한 항체를 제공한다. 좀 더 구체적으로는 본 발명은 전술한 (I)-, (II)- 및/또는 (III)-(a), (b), (c), (d), 또는 (e)에서 제시한 아미노산 서열을 갖는 MPIF-1, M-CIF, 또는 MIP-4 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 분리된 항체를 제공한다.

본 발명은 전술한 아미노산 서열을 갖는 MPIF-1, M-CIF, 또는 MIP-4 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 분리하는 방법을 제공한다. 이러한 항체는 후술되는 바와 같이 진단학적으로 또는 치료학적으로 유용하게 사용된다.

MPIF-1, M-CIF, 및 MIP-4 항체 및 방법

본 발명의 한 범주에 따라, 상기 폴리펩티드의 길항 물질 또는 억제제가 제공된다. 이 길항 물질 또는 억제제는 상기 폴리펩티드의 작용, 예를 들면 동맥경화증, 자동면역 염증 및 만성 염증 그리고 감염성 질환, 히스타민 매개의 알레르기 반응, 과호산구증가 증후군, 규폐증, 사르코이드증, 폐의 염증성 질환, IL-1 및 TNF의 억제작용, 재생불량성 빈혈, 및 골수형성부전 증후군등의 작용을 억제하는 데 사용될 수있다. 또한 이러한 폴리펩티드는 재생불량성 빈혈, 골수형성 부전 증후군, 천식 및 관절염을 치료하기 위해 IL-1 및 TNF-α의 생산을 억제하는 데도 사용될 수있다.

진단 분석법

본 발명의 한 범주에 따라, 상기 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열에서의 변이를 검출하고 폴리펩티드의 과소발현 및 과대발현과 관련된 질환을 검출하기 위한 진단 분석법이 제공된다.

본 발명의 다른 범주에 따라, 인체 질환을 치료하는 진단약 및 치료약을 개발할 목적으로 DNA의 과학적 연구, 이의 합성 및 DNA 벡터의 제조에 관한 실험관내 목적의 연구용 시약으로서 본발명의 폴리펩티드, 이 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 이용하는 방법이 제공된다.

본 발명은 MPIF-1, M-CIF, 또는 MIP-4 폴리펩티드등 의해 유도된 세포 반응을 억제 또는 증진할 수 있는 화합물을 식별하는 스크리닝 방법을 제공하는 데, 이 방법은 MPIF-1, M-CIF, 또는 MIP-4 폴리펩티드를 발현하는 세포를 후보 화합물과 접착시키고, 세포반응을 분석하며, 세포반응을 표준세포 반응(후보 화합물 부재하의 접촉)과 비교하므로써 표준 반응에 대하여 세포반응이 증가되었으면 이는 화합물이 작용 물질이라는 것을 제시하는 것으로 판정하고 표준에 대하여 세포반응이 감소되었으면 이는 화합물이 길항 물질이라는 것을 판정하는 것을 포함한다.

다수 질환의 경우에서, "표준" MPIF-1, M-CIF, 또는 MIP-4 유전자 발현 농도(다수의 질환을 갖고 있지 않은 개체에서 취한 조직 또는 체액에서의 MPIF-1, M-CIF, 또는 MIP-4 발현 농도)와 비교해 볼 때, 이러한 질환을 갖고 있는 개체에서 취한 특정 조직 또는 체액(예, 혈청, 혈장, 뇨, 활액, 또는 척수액)에서 MPIF-1, M-CIF, 또는 MIP-4 유전자 발현이 상당히 높은 농도나 낮은 농도로 검출될 수 있는 것으로 추정된다. 따라서, 본 발명은 질환 진단에 유용한 진단방법을 제공하는 데, 이 방법은 (a) 개체의 세포액 또는 체액에서 MPIF-1, M-CIF, 또는 MIP-4 유전자 발현 농도를 분석하고, (b) MPIF-1, M-CIF, 또는 MIP-4 유전자 발현 농도를 표준 MPIF-1, M-CIF, 또는 MIP-4 유전자 발현 농도와 비교하므로써 표준 발현 레벨과 비교 분석된 MPIF-1, M-CIF, 또는 MIP-4 유전자 발현 레벨의 감소 또는 증가가 질환과 관련있음을 판정하는 것이다. 상기에서 언급한 질환의 예로는 백혈병, 만성 염증, 자동 면역질환 및 고형 종양등이 있다.

약학적 조성물

본 발명은 적어도 MPIF-1, M-CIF, 또는 MIP-4중 하나; 폴리뉴클레오티드, 프로브, 벡터, 숙주세포, 폴리펩티드, 단편, 변형체, 유도체, 에피토프 함유 단백질, 항체, 길항 물질 또는 작용 물질을 함유하는 조성물을 제공한다.

치료방법

본 발명의 범주에 따라, 화학요법 사용시에 화학치료제에 대해 골수 간상부 세포를 보호하기 위한 목적, 백혈구 세포를 제거시키기 위한 목적, 면역 반응을 자극시키기 위한 목적, 조혈작용 및 림프구 트래피킹을 조절하기 위한 치료 목적, 건선 및 고형 종양을 치료하기 위한 목적, 내성의 급성 및 만성 염증에 대한 숙주 방어를 증진시키기 위한 목적, 상처 치료를 자극하는 목적으로 상기 폴리펩티드, 또는 이러한 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 이용하는 방법을 제공한다.

본 발명의 또하나의 범주는 본 발명의 분리된 MPIF-1, M-CIF, 또는 MIP-4 폴리펩티드 또는 이의 작용 물질 각각의 치료적 유효량을 함유하는 조성물을 개체에게 투여하여 체내에서 MPIF-1, M-CIF, 또는 MIP-4 활성 레벨을 증가시키는 것이 필요한 개체를 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 범주는 필요한 개체에게 MPIF-1, M-CIF, 또는 MIP-4 길항 물질의 치료적 유효량을 함유하는 조성물을 투여하여 체내에서 MPIF-1, M-CIF, 또는 MIP-4 활성 레벨을 감소시키는 것이 필요한 개체를 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명에 사용하기 위한 바람직한 길항 물질은 각각의 M-CIF 특이적 항체이다.

본 발명의 전술한 범주는 본명세서에 기재된 교시내용을 참고하면 당업자가 용이하게 이해할 수 있는 것들이다.

실시예 1

MPIF-1의 박테리아 형질발현 및 정제

MPIF-1, ATCC #75676를 암호하는 DNA 서열을 먼저, 5'에 상응하는 PCR 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 프로세싱된 MPIF-1 단백질의 서열(마이너스 시그날 펩티드 서열) 및 MPIF-1 유전자에 대한 벡터 서열 3'을 사용하여 증폭시켰다. Bam HI 및 XbaI에 상응하는 추가의 뉴클레오티드를 각각 5' 서열 및 3' 서열에 첨가하였다. 5' 올리고뉴클레오티드 프라이머는 서열 5'-TCAGGATCCGTCACAAAAGATGCAGA-3' (서열 번호:12)을 갖고, BamHI 제한 효소 부위와, 프로세싱된 단백질 코돈의 추정된 말단 아미노산으로 출발하는 18개의 뉴클레오티드 MPIF-1 암호 서열을 순차적으로 함유한다. 3' 서열 5'-CGCTCTAGAGTAAAACGACGGCCAGT-3'(서열 번호:13)은 XbaI 부위에 대한 상보적 서열을 포함한다.

제한 효소 부위는, 박테리아 발현 벡터 pQE-9(캘리포니아주 캐츠워드 소재의 퀴아겐, 인코포레이티드 제공) 상의 제한 효소 부위에 해당한다. pQE-9는 항생 내성(Amp'), 박테리아 복제 기원(ori), IPTC 조절성 프로모터 오퍼레이터(P/O), 리보좀 결합 부위(RBS), 6-His 태그 및 제한 효소 부위를 암호한다. 이후, pQE-9를 BamHI 및 XbaI로 분해시키고, 증폭된 서열을 pQE-9로 결찰시킨 후 히스티딘 태그 및 RBS에 대한 암호 서열과 함께 프레임 내에 삽입시켰다. 이후, 결찰 혼합물을 사용하여 키아겐에서 입수한 이.콜리 균주 15/ret4를 형질 전환시켰다. M15/rep4는, lacI 리프레서를 발현시키고 또한 카나마이신 내성 LB 평판 상에서의 증식능을 통해 동정한 후, 앰피실린/카나마이신 내성 콜로니를 선택하였다. 플라스미드 DNA를 분리한 후 제한 분석을 통해 확인하였다. 목적하는 작제물을 함유하는 클론을 Amp(100 ㎛/ml) 및 Kan(25 ㎛/ml)가 모두 강화된 LB 배지를 사용하여 배양액 중에서 하룻밤동안(O/N) 제한 분석을 실시하여 이것을 확인하였다. O/N 배양물을 사용하여 1:100 내지 1:250의 비율로 큰 배양물을 접종하였다. 이 세포를, 0.4 내지 0.6의 광학 밀도 600(O.D.⁶⁰⁰)까지 증식시켰다. 이어서, IPTG("이소프로필-B-D-티오갈락토피라노시드")를 최종 농도 1 mM로 첨가하였다. lacI 리프레서를 불활성화시킴에 따라 IPTG가 유도되었으며, 이로써 P/O가 유전자의 발현을 증가시킴을 명백히 알 수 있다. 세포를 3 내지 4 시간 동안 더 증식시켰다. 이후, 원심 분리를 통해 세포를 수거한 후, 세포 펠릿을 카오트로픽제인 6M의 구아니딘 HCl 중에 용해시켰다. 세정 후, 6-His 태그를 함유한 단백질에 의한 견고한 결합이 이루어질 수 있는 조건 하에 니켈-킬레이트 컬럼 상에서 크로마토그래피하여 상기 용액으로부터 용해된 MPIF-1을 용해된 MIP-4를 정제하였다(호쿨리 이 외 다수의 문헌 [J. Chromatography 411:177-184(1984)] 참고). MPIF-1 (95%의 순도)를 6M 구아니딘 HCl(pH 5.0) 중의 컬럼으로부터 용출시킨 후, 복귀를 위해 3M 구아니딘 HCl, 100 mM의 인산나트륨, 10 mM의 글루타티온(환원 상태) 및 2 mM의 글루타티온(산화 상태)로 조절하였다. 이 용액에서 12 시간 동안 항온 처리한 후, 단백질을 10 mM의 인산나트륨으로 투석하였다.

대안적으로, 하기 비태그된 프라이머를 사용하여 유전자를 플라스미드 pQE70으로 클로닝하였다.

5' 프라이머: 5' CCC GCA TGC GGG TCA CAA AAG ATG CAG 3'(서열 번호:14)

SphI

3' 프라이머: 5' AAA GGA TCC TCA ATT CTT CCT GGT CTT 3'(서열 번호:15)

BamHI 종지

이.콜리 최적화된 MPIF-1의 작제

이.콜리 형질발현 시스템에서 MPIF-1의 형질발현 수준을 증가시키기 위해, 유전자의 코돈을 고도로 사용되는 이.콜리 코돈에 최적화시켰다. MPIF-1의 최적화된 영역을 합성하기 위해, 일련의 4개 올리고뉴클레오티드, 즉 mpif-1 올리고 번호 1 내지 4(하기 제시됨)를 제조하였다. 이들 중첩되는 올리고를 이하의 조건에서 7라운드 동안 PCR 반응에 사용하였다.

변성 95도 20 초

어닐링 58도 20 초

연장 72도 60 초

7 라운드의 합성 과정 후, 이 영역에 대한 5' 프리이머(ACA TGC ATC CGU GUU ACC AAA GAC GCU GAA ACC GAA UUC AUG AUG UCC(서열 번호: 16) 및 전체 영역에 대한 3' 프라이머(GCC CAA GCT TTC AGT TTT TAC GGC TTT TGA TAC GGG(서열 번호:17)를, 6개의 올리고뉴클레오티드의 개시반응으로부터 얻은 1 미량 역가를 함유한 PCR 반응에 첨가하였다. 이 생성물을 다음 조건을 사용하여 30 라운드 동안 증폭시켰다.

변성 95도 20 초

어닐링 55도 20 초

연장 72도 60 초

이 최종 반응을 통해 제조된 생성물을 SphI 및 HindIII로 제한시키고 pQE70으로 클로닝한 후, SphI 및 HindIII로 절단하였다. 이들 클론을 발현시킨 결과, 상기 제시된 돌연 변이의 발생이 없는 우수한 발현 수준을 나타내 보였다.

mpif 올리고 번호 1:

5' GCA TGC GUG UUA CCA AAG ACG CUG AAA CCG AAU UCA UGA UGU CCA AAC UGC

CGC UGG AAA ACC CGG UUC UGC UGG ACC GUU UCC ACG C3' (서열 번호:18)

mpif-1 올리고 번호 2:

5' GCU GGA AUC CUA CUU CGA AAC CAA CUC CGA AUG CUC CAA ACC GGG UGU UAU

CUU CCU GAC CAA AAA AGG UCG UCG UUU CUG CGC UAA CCC GUC CGA CAA ACA GG

3'(서열 번호:19)

mpif-1 올리고 번호 3:

5' AAG CTT TCA GTT TTT ACG GGT TTT GAT ACG GGT GTC CAG TTT CAG CAT ACG

CAT ACA AAC CTG AAC CTG TTT GTC GGA CGG GTT AGC GC 3'(서열 번호:20)

mpif-1 올리고 번호 4:

5' GGT TTC GAA GTA GGA TTC CAG CAG GGA GCA CGG GAT GGA ACG CGG GGT GTA

GGA GAT GCA GCA GTC AGC GGA GGT AGC GTG GAA ACG GTC CAG C 3'(서열

번호:21)

MPIF-1 결실 돌연변이의 작제

이.콜리 최적화된 MPIF-1 작제물을 사용하여 MPIF-1 유전자의 5' 말단부로부터 결실 돌연변이를 작제하였다. 5' 결실부를 작제하는 데 사용되는 프라이머는 상기 제시된 바와 같다. PCR 증폭 과정은, 이.콜리 최적화된 MPIF-1 작제물에대해 전술한 바와 같이 수행하였다. 델타 17-A qe6, 델타 23, 델타 28의 생성물을 5' 부위에 대해서는 NcoI로, 3' 부위에 대해서는 HindIII로 제한시키고, 플라스미드 pQE60으로 복제한 후 NcoI 및 HindIII를 분해시켰다. 다른 모든 생성물은, 5' 부위는 SphI로, 그리고 3' 부위는 HindIII로 제한시키고 플라스미드 pQE70으로 클로닝한 후 SphI 및 HindIII로 분해시켰다.

사용된 5' 프라이머는 다음과 같았다.

델타 17-A qe6(pQE60)

5' NcoI gc gca g ccatgg aa aac ccg gtt ctg ctg gac 3' (서열 번호:22)

이 결실 돌연변이의 아미노산 서열은 다음과 같다.

MENPVLLDRFHATSADCCISYTPRSIPCSLLESYFETNSECSKPGVIFLTKKGRRFCANPSDKQVQVCMRMLKLDTRIKTRKN(서열번호:23).

델타 16-A qe7(pQE70)

5' SphI gc cat g gcatge tg gaa aac ccg gtt ctg ctg gac(서열 번호:24)

이 결실 돌연변이의 아미노산 서열은 다음과 같다.

MLENPVLLDRFHATSADCCISYTPRSIPCSLLESYFETNSECSKPGVIFLTKKGRRFCANPSDKQVQVCMRMLKLDTRIKTRKN(서열 번호:25)

델타 23(pQE60)

5' Ncol gc gca g ccatgg ac cgt ttc cac gct acc tcc(서열 번호;26)

이 결실 돌연변이의 아미노산 서열은 다음과 같다.

MDRFHATSADCCISYTPRSICSLLESYFETNSECSKPGVIFLTKKGRRFCANPSDKQVQVCMRMLKLDTRIKTRKN(서열 번호:27)

델타 24(pQE70)

5' SphI gcc atg gcatgc gtt tcc acg cta cct cc(서열 번호:28)

이 결실 돌연변이의 아미노산 서열은 다음과 같다.

MRFHATSADCCISYTPRSIPCSLLESYFETNSECSKPGVIFLTKKGRRFCANPSDKQVQVCMRMLKLDTRIKTRKN(서열 번호:8)

델타 28(pQE60)

5' NcoI gcg cag ccatgg cta cct ccg ctg act gct gc(서열 번호:29)

이 결실 돌연변이의 아미노산 서열은 다음과 같다.

MATSADCCISYTPRSIPCSLLESYFETNSECSKPGVIFLTKKGRRFCANPSDKQVQVCMRMLKLDTRIKTRKN(서열 번호:30)

S70의 A로의 돌연 변이(위치 70의 Ser이 Ala로 돌연 변이됨)(pQE 70)

안티센스 ttc gaa gta ggc ttc cag cag (서열 번호:31)

센스 ctg ctg gaa gcc tac ttc gaa(서열 번호:32)

5' Sphl은 gcc atc gcatgc gtg tta cca aag acg ctg aaa cc로 완전 구성됨(서열 번호:33)

이 결실 돌연변이의 아미노산 서열은 다음과 같다.

MRVTKDAETEFMMSKLPLENPVLLDRFHATSADCCISYTPRSIPCSLLEaYFETNSECSKPGVIFLTKKGRRFCANPSDKQVQVCMRMLKLDTRIKTRKN(서열 번호:34)

모든 작제물에는 3' 프라이머를 사용하였다.

3' Hind III

gcc c aagctt tca gt ttt tac ggg ttt tga tac ggg(서열 번호:35)

MPIF-1 서열의 전체 길이(이.콜리 편중된 뉴클레오티드)

MRVTKDAETEFMMSKLPLENPVLLDRFHATSADCCISYTPRSIPCSLLESYFETNSECSKPGVIFLTKKFRRFCANPSDKVQVQVCMRMLKLDTRIKTRKN (서열 번호:7)

실시예 2

MIP-4의 박테리아 형질발현 및 정제

MIP-4 ATCC #75675를 암호하는 DNA 서열을, 프로세싱된 MIP-4 단백질의 5' 서열(마이너스 시그날 펩티드 서열)에 해당하는 PCR 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 증폭시켰다. Bam HI 및 XbaI에 해당하는 추가의 뉴클레오티드를 각각 5' 서열 및 3' 서열에 첨가하였다. 5' 올리고뉴클레오티드 프라이머는 서열 5'-TCAGGATCCTGTGCACAAGTTGGTACC-3' (서열 번호:36)을 갖고, BamHI 제한 효소 부위와, 프로세싱된 단백질 코돈의 추정된 말단 아미노산으로 출발하는 18개의 뉴클레오티드 MIP-1 암호 서열을 순차적으로 함유한다. 3' 서열 5'-CGCTCTAGAGTAAAACGACGGCCAGT-3'(서열 번호:13)은 XbaI 부위에 상보적인 서열을 포함한다.

제한 효소 부위는, 박테리아 발현 벡터 pQE-9(캘리포니아주 캐츠워드 소재의 퀴아겐 인코포레이티드 제공) 상의 제한 효소 부위에 해당한다. pQE-9는 항생 내성(Amp'), 박테리아 복제 기원(ori), IPTG-조절성 프로모터 오퍼레이터(P/O), 리보좀 결합 부위(RBS), 6-His 태그 및 제한 효소 부위를 암호한다. 이후, pE-9를 BamHI 및 XbaI로 분해시키고, 증폭된 서열을 pQE-9로 결찰시킨 후 히스티딘 태그 및 RBS에 대한 암호 서열과 함께 프레임 내에 삽입시킨다. 이후, 결찰 혼합물을 사용하여 키아겐에서 입수한 이.콜리 균주를 형질 전환시켰다. M15/rep4는, lacI 리프레서를 발현시키고 또한 카나마이신 내성(Kan^r)을 부여하는 여러 개의 플라스미드 pREP4 카피를 포함한다. 형질 전환체를 LB 평판 상에서의 증식능을 통해 동정한 후, 앰피실린/카나마이신 내성 콜로니를 선택하였다. 플라스미드 DNA를 분리한 후, Amp(100 ㎛/ml) 및 Kan(25 ㎛/ml)가 모두 강화된 LB 배지를 사용하여 배양액 중에서 하룻밤동안(O/N) 제한 분석을 실시하여 이것을 확인하였다. O/N 배양물을 사용하여 1:100 내지 1:250의 비율로 큰 배양물을 접종하였다. 이 세포를, 0.4 내지 0.6의 광학 밀도 600(O.D.⁶⁰⁰)까지 증식시켰다. 이어서, IPTG("이소프로필-B-D-티오글라토피라노시드")를 최종 농도 1 mM로 첨가하였다. lacI 리프레서를 불활성화시킴에 따라 IPTG가 유도되었으며, 이로써 P/O가 유전자의 발현을 증가시킴을 명백히 알 수 있다. 세포를 3 내지 4 시간 동안 더 증식시켰다. 이후, 원심 분리를 통해 세포를 수거한 후, 카오트로픽제인 6M의 구아니딘 HCl 중에 용해시켰다. 세정 후, 6-His 태그를 함유한 단백질에 의한 견고한 결합이 이루어질 수 있는 조건 하에 니켈-킬레이트 컬럼 상에서 크로마토그래피하여 상기 용액으로부터 용해된 MPIF-1을 용해된 MPIF-1을 정제하였다 (호쿨리 이 외 다수의 문헌 [J. Chromatography 411:177-184(1984)] 참고). MIP-1 (95%의 순도)를 6M 구아니딘 HCl(pH 5.0) 중의 컬럼으로부터 용출시킨 후, 복귀를 위해 3M 구아니딘 HCl, 100 mM의 인산나트륨, 10 mM의 글루타티온(환원 상태) 및 2 mM의 글루타티온(산화 상태)로 조절하였다. 이 용액에서 12 시간 동안 항온 처리한 후, 단백질을 10 mM의 인산나트륨으로 투석하였다.

대안적으로, 하기 비태그된 프라이머를 사용하여 유전자를 플라스미드 pQE60으로 복제하였다.

5' AAA AAG CTT TCA GGC ATT CAG CTT CAG 3'(서열 번호:37) pQE60 (3' 프라이머) HindIII

5' AAA CCA TGG CAC AAG TTG GTA CCA AC 3'(서열 번호:38) pQE 60 (5' 프라이머) NcoI

실시예 3

M-CIF의 박테리아 형질발현 및 정제

M-CIF(ATCC #75572)를 암호하는 DNA 서열을 먼저, 5'에 상응하는 PCR 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 프로세싱된 M-CIF 단백질의 3' 서열(마이너스 시그날 펩티드 서열)을 사용하여 증폭시킨 후, Bam HI 및 XbaI에 상응하는 추가의 뉴클레오티드를 각각 5' 서열 및 3' 서열에 첨가하였다. 5' 올리고뉴클레오티드 프라이머는 서열 5'-GCCCGCGGATCCTCCTCACGGGGACCTTAC-3' (서열 번호:39)을 갖고, BamHI 제한 효소 부위와, 프로세싱된 단백질 코돈의 추정된 말단 아미노산으로 출발하는 15개의 뉴클레오티드 M-CIF 암호 서열을 순차적으로 함유한다. 3' 서열 5'-GCCTGCTCTAGATCAAAGCAGGGAAGCTCCAG-3'(서열 번호:40)은 XbaI 부위에 대한 상보적 서열 및 마지막 20개의 M-CIF 암호 서열을 포함한다.

제한 효소 부위는, 박테리아 발현 벡터 pQE-9(캘리포니아주 91311 캐츠워드 이튼 애비뉴 9259 소재의 퀴아겐 인코포레이티드 제공) 상의 제한 효소 부위에 해당한다. pQE-9는 항생제 내성(Amp'), 박테리아 복제 기원(ori), IPTG-조절성 프로모터 오퍼레이터(P/O), 리보좀 결합 부위(RBS), 6-His 태그 및 제한 효소 부위를 암호한다. 이후, pQE-9를 BamHI 및 XbaI로 분해시키고, 증폭된 서열을 pQE-9로 결찰시킨 후 히스티딘 태그 및 RBS에 대한 암호 서열과 함께 프레임 내에 삽입시킨다. 도 6은 이 배열의 개요도이다. 이후, 결찰 혼합물을 사용하여 키아겐에서 상표명 M15/rep4로 시판되는 이.콜리 균주를 형질 전환시켰다. M15/rep4는, lacI 리프레서를 발현시키고 또한 카나마이신 내성(Kan^r)을 부여하는 여러 개의 플라스미드 pREP4 카피를 포함한다. LB 평판 상에서 형질 전환체의 증식능을 확인한 후, 앰피실린/카나마이신 내성 콜로니를 선별하였다. 플라스미드 DNA를 분리한 후, 제한 분석을 통해 확인하였다. 원하는 작제물을 함유한 클론을, Amp(100 ㎍/ml) 및 Kan(25 ㎍/ml)가 모두 강화된 LB 배지를 사용하여 액체 배양액 중에서 하룻밤동안(O/N) 증식시켰다. O/N 배양물을 사용하여 1:100 내지 1:250의 비율로 큰 배양물을 접종하였다. 이 세포를, 0.4 내지 0.6의 광학 밀도 600(O.D.⁶⁰⁰)로 증식시켰다. 이어서, IPTG("이소프로필-B-D-티오갈락토피라노시드")를 최종 농도 1 mM로 첨가하였다. lacI 리프레서를 불활성화시킴에 따라 IPTG가 유도되었으며, 이로써 P/O가 유전자의 발현을 증가시킴을 명백히 알 수 있다. 세포를 3 내지 4 시간 동안 더 증식시켰다. 이후, 원심 분리를 통해 세포를 수거한 후, 카오트로픽제인 6M의 구아니딘 HCl 중에 용해시켰다. 세정 후, 6-His 태그를 함유한 단백질에 의한 견고한 결합이 이루어질 수 있는 조건 하에 니켈-킬레이트 컬럼 상에서 크로마토그래피하여 상기 용액으로부터 용해된 MPIF-1을 용해된 M-CIF를 정제하였다 (호쿨리 이 외 다수의 문헌 [J. Chromatography 411:177-184(1984)] 참고). M-CIF (95%의 순도)를 6M 구아니딘 HCl(pH 5.0) 중의 컬럼으로부터 용출시킨 후, 복구를 위해 3M 구아니딘 HCl, 100 mM의 인산나트륨, 10 mM의 글루타티온(환원 상태) 및 2 mM의 글루타티온(산화 상태)으로 조절하였다. 이 용액에서 12 시간 동안 항온 처리한 후, 단백질을 10 mM의 인산나트륨으로 투석하였다. 유도 후에, 14 kDa에 해당하는 신규 단백질의 존재는 M-CIF의 발현을 입증한다(도 7).

대안적으로, 하기 비태그된 프라이머를 사용하여 유전자를 플라스미드 pQE60 내로 삽입하였다.

5' 프라이머: 5' AAA TCA TGA CCA AGA CTG AAT CCT CCT 3'(서열 번호:41)

BspHI

3' 프라이머" 5' AAA AAG CTT TCA GTT CTC CTT CAT GTC 3'(서열 번호:42)

HindIII

실시예 4

포유 동물 세포 중의 MPIF-1, M-CIF 또는 MIP-4 단백질 유전자 서열의 일시적 발현에 사용되는 대부분의 벡터는 SV40의 복제 기원을 보유해야 한다. 이로써, 바이러스 DNA 합성의 개시에 필요한 T 항원을 발현하는 여러 개수의 세포 카피(예, COS 세포)로 벡터를 복제할 수 있다. 이러한 목적으로는 어떠한 다른 포유 동물주도 역시 사용할 수 있다.

통상의 포유 동물의 발현 벡터는 프로모터 성분(이것은 mRNA의 전사의 개시를 매개함), 단백질 암호 서열 및 전사의 종결과 전사의 폴리아데닐화에 필요한 시그날을 포함한다. 추가의 성분으로는, 인핸서(enhancers), 코작 서열 및 RNA 스플라이스를 위한 공여 및 수용 부위에 의해 인접한 조정 서열이 있다. 고효율의 전사는, SV40의 초기 및 후기 프로모터, 레트로바이러스(예, RSV, HTLVI, HIVI)의 긴 말단 반복체(LTRs), 및 사이토메갈로바이러스(CMV)의 초기 프로모터에 의해 이루어질 수 있다. 그러나, 세포 시그날이 사용될 수 있다(예, 인간의 액틴 프로모터). 본 발명의 실행시 사용하기 적합한 발현 벡터로는,예를 들어 pSVL 및 pMSG(스웨덴 웁살라 소재의 파마시아 제공), pRSV cat(ATCC 37152), pSV2dhfr(ATCC 37146) 및 pBC12MI(ATCC 67109) 등의 벡터가 있다. 사용 가능한 포유동물의 숙주 세포로는 인간의 HeLa, 283, H9 및 유카르트 세포, 마우스 NIH3T3 및 C127 세포, Cos 1, Cos 7 및 CV1, 아프리카 그린 원숭이 세포, quail QC1-3 세포, 마우스 L 세포 및 중국 햄스터 난소 세포가 있다.

대안적으로, 유전자는, 염색체 내로 통합된 유전자를 함유하는 안정한 세포주에서 발현될 수 있다. 선택 가능한 마커(예, dhfr, gpt, 네오마이신, 하이그로마이신)와 동시 형질 감염시키면, 형질 감염된 세포를 동정하고 분리해 낼 수 있다.

형질 감염된 유전자를 증폭시켜도 역시 암호된 단백질을 다량 발현시킬 수 있다. DHFR(디히드로폴레이트 리덕타제)는, 수백개 또는 심지어 수천개의 해당 유전자 카피를 보유한 세포주를 발현시키는 데 유용한 마커이다. 또 다른 유용한 선택 마커는 효소 글루타민 합성 효소(GS)이다 (머피 외 다수의 문헌 [Biochem J. 227:277-279(1991)], 베빙턴 외 다수의 문헌 [Bio/Technology 10:169-175(1992)] 참고), 이들 마커를 사용하여 포유 동물의 세포를 선택적 배지에서 증식시킨 후, 최고의 내성을 가진 세포를 선별하였다. 이들 세포주는, 염색체 내로 통합된 증폭 유전자(들)를 함유한다. 중국 햄스터 난소(CHO) 세포는 단백질의 제조에 종종 사용된다.

발현 벡터 pC1 및 pC4는 라우스 육종 바이러스의 강한 프로모터(LTR) (쿨렌 외 다수의 문헌 [Molecular and Cellular Biology, 438-447(1985.3)] 참조)와 CMV 인핸서의 단편 (보샤르트 외 다수의 문헌 [Cell 41: 521-530(1985)]을 포함한다. 예를 들어 제한 효소 절단 부위 BamHI, XbaI 및 Asp718을 가진 여러개의 복제 부위는 해당 유전자의 클로닝을 촉진시킨다. 상기 벡터는 3' 인트론 이외에도 래트의 인슐린 전구물질 유전자의 폴리아데닐화 및 종료 시그날을 포함한다.

A, COS 세포 중 재조합 MPIF-1의 발현

플라스미드, CMV-MPIF-1 HA의 발현은, 1) SV40 복제 기원, 2) 앰피실린 내성 유전자, 3) 이.콜리 복제 기원, 4) CMV 프로모터, 폴리링커 부위, SV40 인트론 및 폴리아데닐화 부위를 포함하는 벡터 pcDNAI/Amp(인비트로겐)으로부터 유도된다. 프레임의 3' 단부에 융합된 HA 태그와 전체 MPIF-1 전구 물질을 암호하는 DNA 단편은 벡터의 폴리링커 영역으로 복재되므로, 재조합 단백질 발현은 CMV 프로모터 하에 이루어진다. HA 태그는 전술한 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질로부터 유도된 에피토프에 해당한다 (윌슨, 에이치 외 다수의 문헌 [Cell 37:767(1991)] 참조). 표적 단백질에 HA 태그를 주입시키면 HA 에피토프를 인식하는 항체에 의해 재조합 단백질을 용이하게 검출해낼 수 있다.

플라스미드 작제 기술은 다음과 같다.

MPIF-1을 암호하는 DNA 서열(ATCC # 75676)을 2개의 프라이머를 사용하여 복제한 원래의 EST 상에서 PCR을 통해 작제하였다. 5' 프라이머 5'-GGAAAGCTTATGAAGGTCTCCGTGGCT-3'(서열 번호:43)은 HindIII 부위와, 개시 코돈으로부터 출발하는 MPIF-1 암호 서열의 18개 뉴클레오티드를 순차적으로 포함한다. 3'-서열 5'-CGCTCTAGATCAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAATTCTTCCTGGTCTTGATCC-3'(서열 번호:44)은 Xba I 부위에 대한 상보적 서열, 해독 중지 코톤, HA 태그 및 MPIF-1 암호 서열의 마지막 20개의 뉴클레오티드(중지 코돈 제외)를 포함한다. 따라서, PCR 생성물은 HindIII 부위, MPIF-1 암호 서열, 프레임에 결합된 HA 태그, HA 태그 뒤의 해독 종료 중지 코돈 및 XbaI 부위를 순서대로 포함한다. PCR 증폭된 DNA 단편 및 벡터, 즉 pcDNAI/Amp를 HindIII 및 XbaI 제한 효소로 분해시킨 후 결찰시켰다. 결찰 혼합물은 이.콜리 균주 SURE(캘리포니아 92037, 라졸라 노스 토레이 파인스 로드 11099 소재의 스트라타젠 클로닝 시스템스에서 입수)로 형질 전환시키고, 이 형질 전환된 배양물은 앰피실린 배지 평판 상에 평판배양하여 내성 콜로니를 선별하였다. 형질 전환물로부터 플라스미드 DNA를 분리시키고 교정 단편의 존재에 대해 제한 분석을 통해 검사하였다. 재조합체 MPIF-1의 발현을 위해, DEAE-DEXTRAN 방법 (제이 샘브룩, 이 프리취, 티 매니아티스의 문헌 [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory Press,(1989)] 참고)을 통해 발현 벡터로 형질 감염시켰다. MPIF-1-HA 단백질의 발현은, 방사능 표지 및 면역 침전화법 (이 할로우, 디 레인의 문헌 [Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1988)] 참고)을 통해 감지하였다. 세포를 형질 감염 2 일후³⁵S-시스테인으로 8 시간 동안 표지시켰다. 이후, 배양 배지를 수거하고, 세포를 세제(RIPA) 완충액(150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.1% SDS, 1% NP-40, 0.5% DOC, 50 mM 트리스, pH 7.5)(윌슨 아이 외 다수의 문헌 [Id, 37:767(1984)] 참고)을 사용하여 용해시켰다. 세포 용해물과 배양 배지를 모두 HA 특이적 모노클론 항체로 침전화시켰다. 침전된 단백질은 15% SDS-PAGE 겔 상에서 분석하였다.

B. CHO 세포의 클로닝 및 발현

MPIF-1 단백질의 발현에는 벡터 pC1을 사용하였다. 플라스미드 pC1은 플라스미드 pSV2-dhfr(ATCC 기탁 번호 37146)의 유도체이다. 이들 플라미드는 모두 SV 40 초기 프로모터의 조절 하에 마우스의 DHFR 유전자를 함유한다. 디히드로폴레이트 활성이 결여된 중국 햄스터 난소 또는 다른 부위의 세포(상기 플라미드로 형질 감염된 것)는, 화학치료제인 메토트렉세이트가 강화된 선별 배지(알파 마이너스 MEM, 라이프 테크놀로지스 제공) 중에서 이들 세포를 증식시키는 방식으로 선별할 수 있다. 메토트렉세이트(MTX)에 내성을 가진 세포 중의 DHFR 유전자의 증폭에 대해서는 여러 문서에 제시되어 있다(예를 들어, 알트, 에프 더블유, 켈렘스, 알 엠, 버티노, 제이 알, 및 쉼케, 알 티의 문헌 [J. Biol, Chem, 253:1357-1370(1978)], 햄린, 제이엘 및 마, 씨의 [Biochem. et Biophys. Acta, 1097:107-143(1990)], 페이지, 엠 제이 및 신덴햄 엠 에이의 문헌 [Biotechnology Vol.9:64-68(1991)] 참고). 증가하는 농도의 MTX 중에서 증식한 세포는, DHFR 유전자의 증폭 결과로서 표적 효소(DHFR)를 과다 생성시킴으로써 약물에 대해 내성을 갖게 된다. 제2 유전자가 DHFR 유전자에 결합하면, 대개 동시 증폭되어 과다하게 발현된다. 당해 기술 분야에서는 1,000 개 이상의 유전자 카피를 보유한 세포주를 개발되었다. 이후, 메토트렉세이트를 배출시키면, 세포주가 염색체(들) 내에 통합된 증폭 유전자를 포함하게 된다.

플라미드 pC1은 해당 유전자의 발현을 위해, 라우스 육종 바이러스 (쿨렌 외 다수의 문헌 [Molecular and Celluar Biology, 1985.3: 438-4470] 참고)와, 인간의 사이토메갈로바이러스(CMV)의 즉시 초기 유전자의 인핸서로부터 분리된 단편 (보샤르트 외 다수의 문헌 [Cell 41:521-530, 1985] 참고)을 포함한다. 프로모터의 다운스트림에는, 유전자를 삽입시킬 수 있는 단일 제한 효소분해 부위. 즉 BamHI와 인슐린 전구물질 유전자의 3' 인트론 및 폴리아데닐화 부위가 존재한다. 예를 들어, 사람의 β-액틴 프로모터, SV 40 초기 또는 후기 프로모터 또는 다른 레트로바이러스(예, HIV 및 HTLVI)로부터의 긴 말단 반복체 등의 다른 고효율 프로모터를 발현에 사용할 수도 있다. mRNA의 폴리아데닐화를 위해, 예를 들어 사람의 성잘 호르몬 또는 글로빈 유전자로부터의 다른 시그날도 역시 사용할 수 있다.

염색체 내에 통합된 해당 유전자를 보유하는 적당한 세포주도 또한 gpt, G418 또는 하이그로마이신 등의 선택 가능한 마커와 함께 동시 형질 감염시 선택될 수 있다. 초기에는 1종 이상의 선택 가능한 마커(예, G418 + 메토트렉세이트)를 사용하는 것이 유리하다.

플라스미드 pC1을 제한 효소 BamHI로 분해시킨 후, 당업계에 공지된 방법을 통해 소의 장내 인산염을 사용하여 탈인산화시켰다. 이후, 벡터를 1% 아가로즈 겔로부터 분리시켰다.

MPIF-1(ATCC 번호 75676)을 암호하는 DNA 서열은, 유전자의 5' 서열 및 3' 서열에 해당하는 PCR 올리고뉴클레오펩티드 프라이머를 사용하여 증폭시켰다.

5' 프라이머의 서열은, 밑줄친 BamH1 제한 효소 부위를 포함하는 이하에 기재된 서열(서열 번호:45)과 도 1의 MPIF-1 단백질을 암호하는 서열의 일부(서열 번호:3)를 포함한다.

5' AAA GGA TCC GCC ACC ATG AAG GTC TCC GTG GTC 3'

BamHI KOZAK

이하에 기재된 바와 같이 발현 벡터내로 삽입시키면, 사람의 MPIF-1을 암호하는 증폭된 단편의 5' 말단은 효율적인 시그날 펩티드를 제공한다. 코작, 엠의 문헌 [J. Mol. Biol. 196:947-950(1987)]에 기재된 바와 같이 진핵 세포 중의 해독을 개시하는 데 효율적인 시그날을 작제물의 벡터 부분에 적절히 배치한다.

3' 프라이머는 종지 코돈을 포함하는 도 1에 기재되어 있는 MPIF-1 암호 서열(서열 번호 3)에 상보성을 갖는 뉴클레오티드 부분 및 Asp718 제한 부위를 포함하는 5' AAA GGA TCC TCA ATT CTT CCA GGT CTT 3'(서열 번호:46)의 서열을 갖는다. BamHI 종지

증폭된 단편은 전술한 바와 같은 1% 아가로스 겔로부터 분리한 후, 엔도뉴클레아제 BamHI 및 Asp718로 분해시키고, 다시 1% 아가로스 겔상에서 정제하였다.

분리된 단편 및 탈인산화된 벡터는 T4 DNA 라가아제로 결찰시킨다. 이.콜리 HB101 세포를 형질변형시킨 후, 박테리아는 제한 효소 BamHI를 사용한 정확한 배향으로 삽입된 플라스미드 pC1를 포함하는 것으로 밝혀졌다. 삽입된 유전자의 서열은 DNA 서열 분석에 의해 확인한다.

CHO-DHFR 세포의 형질감염

활성 DHFR 효소가 결여된 중국산 햄스터의 난소 세포를 형질감염에 사용하였다. 리포펙션법(문헌: Felgner 등, 상동)을 사용하여 플라스미드 pSVneo 0.5 ㎍으로 발현 플라스미드 C1 5 ㎍을 동시형질감염시켰다. 플라스미드 pSV2-neo는 우성의 선택가능한 마커, 즉 G418을 비롯하여 항생물질 군에 대한 내성을 부여하는 Tn5 암호 효소로부터의 유전자 neo를 포함한다. 세포는 G418 1 mg/ml가 보충된 알파 마이너스 MEM에 접종된다. 2 일 후, 세포를 트립신처리하고, 하이브리도마 클로닝 평판(독일의 그레이너)에 접종시키며, 10 내지 14일 동안 배양한다. 이 기간이 경과한 후, 단일 클론을 트립신처리하고, 6-웰 페트리 접시에서 여러가지 농도의 메토트렉세이트(25 nM, 50 nM, 100 nM, 200 nM, 400 nM)를 사용하여 접종시킨다. 최고 농도의 메토트렉세이트로 배양된 클론을 더 고 농도의 메토트렉세이트(500 nM, 1 μM, 2 μM, 5 μM)를 함유하는 6-웰 평판으로 옮기었다. 클론이 100 μM의 농도에서 배양될 때까지 동일한 절차를 반복하였다.

목적하는 유전자 산물의 발현은 웨스턴 블롯 분석법 및 SDS-PAGE로 분석하였다.

실시예 5

A. COS 세포에서의 재조합 MIP-4의 발현

플라스미드, CMV-MIP-4 HA의 발현은 1) SV40 복제 기원, 2) 앰피실린 내성 유전자, 3) 이.콜리 복제 기원, 4) CMV 프로모터에 이어서 폴리링커 영역, SV40 인트론 및 폴리아데닐화 부위를 포함하는 벡트 pcDNAI/Amp(인비트로겐)로부터 유도된다. 프레임에서 3' 말단에 융합된 HA 태그 및 전체 MIP-4 전구체를 암호화하는 DNA 단편을 벡터의 폴리링커 영역으로 클로닝시키고, 재조합 단백질 발현은 CMV 프로모터 아래에서 실시된다. HA 태그는 전술한 바와 같은 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질로부터 유도된 에피토프에 상응한다. 문헌[윌슨, 에이치. 등, Cell 37:767 (1984)]. HA 태그를 표적 단백질로 주입시키면 HA 에피토프를 인식하는 항체로 재조합 단백질의 검출이 용이하게 된다.

플라스미드 작제 단계는 하기와 같다.

MIP-4에 대해 암호화하는 DNA 서열 ATCC 번호 75675는 2 개의 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 형성되며, 이중 5' 프라이머 5'-GGAAAGCTTATGAAGGGCCTTG CAGCTGCC-3'(서열 번호 47)는 HindIII 부위에 이어서 개시 코돈으로부터 출발한 MIP-4 암호 서열의 20 뉴클레오티드를 포함하며, 3' 서열 5'-CGCTCTAGATCAABCGTAGT CTGGGACGTCGTATGGGTAGGCATTCAGCTTCAGGTC-3'(서열 번호 48)는 Xba I 부위에 상보성을 갖는 서열, 해독 종지 코돈, HA 태그 및 MIP-4 암호 서열(종지 코돈은 포함하지 않음)의 마지막 19 뉴클레오티드를 포함한다. 그래서, PCR 산물은 HindIII 부위, MIP-4 코드 서열에 이어서 프레임에 융합된 HA 태그, HA 태그뒤의 해독 종료 종지 코돈 및 XbaI 부위를 포함한다. PCR 증폭된 DNA 단편 및 벡터, pcDNAI/Amp는 HindIII 및 XbaI 제한 효소로 분해하고 결찰시킨다. 결찰 혼합물을 이.콜리 숙주 SURE(미국 캘리포니아주 라 졸라에 소재하는 스트라타젠 클로닝 시스템즈에서 입수)로 형질전환시키고, 형질전환된 배양액을 앰피실린 배지 평판에서 평판배양시키며, 내성 콜로니를 선택한다. 플라스미드 DNA를 형질전환체로부터 분리시키고, 제한 분석으로 정확한 단편의 존재 여부에 대해 검사하였다. 재조합 MIP-4의 발현의 경우, DEAN-DEXTRAN법을 이용하여 발현 벡터로 COS 세포를 형질감염시켰다. 문헌[제이. 샘브룩, 이, 에리히, 티. 마니아티스, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 콜드 스프링 래버러토리 프레스 (1989)]. MIP-4-HA 단백질의 발현은 방사선 표지화 및 면역침강법으로 검출한다. 문헌[이. 하로우, 디.레인, Antibodies: A Laboratory Manual, 콜드 스프링 래버러토리 프레스 (1988)]. 형질감염 이틀 경과후 세포를³⁵S-시스테인으로 8 시간 동안 표지화시켰다. 배양 배지을 수집하고, 세포를 세제[RIPA 완충액(150 mM NaCl, 1 % NP-40, 0.1 % SDS, 1 % NP-40, 0.5 % DOC, 50 mM Tris, pH 7.5), (윌슨 에이치. 등, Cell 37:767 (1984)]로 용해시켰다. 세포 용해물 및 배양 배지 모두는 HA 특이성 단일 클론 항체로 침강시켰다. 침강된 단백질은 15 %의 SDS-PAGE 겔상에서 분석하였다.

B. CHO 세포에서의 클로닝 및 발현

벡터 pC1은 MIP-4 단백질의 발현에 사용한다. 플라스미드 pC1은 플라스미드 pSV2-dhfr(ATCC 수탁 번호 37146)의 유도체이다. 두 플라스미드는 SV40 초기 프로모터의 조절하에 마우스 DHFR 유전자를 포함한다. 이들 플라스미드로 형질감염시킨 중국산 햄스터의 디히드로폴레이트 활성이 결여된 난소 세포 및 기타의 세포는 화학요법제인 메토트렉세이트가 보충된 선별 배지(알파 마이너스 MEM, 라이프 테크놀로지즈)내에서 세포를 배양시켜 선택할 수 있다. 매토트렉세이트(MTX)에 내성을 갖는 세포내의 DHFR 유전자의 증폭은 공지의 문헌[예, Alt, F.W., Kellems, R.M. Bertino, J.R. 및 Schirnke, R.T., 1978, J. Biol. Chem. 253:1357-1370, Hamlin, J.L. 및 Ma, C. 1990, Biochem et Biophys. Acta, 1097:107-143, Page, M.J. 및 Sydenham, M.A. 1991, Biotechnology Vol. 9:64-68]에 기재되어 있다. MTX의 농도를 증가시켜 배양한 세포는 DHFR 유전자의 증폭의 결과로서 표적 효소 DHFR를 과잉 생산하므로써 약물에 대한 내성을 형성한다. 제2유전자가 DHFR 유전자에 결합되는 경우, 이는 일반적으로 동시증폭되고 과잉으로 발현하게 된다. 유전자의 1,000 이상의 카피물을 수반하는 세포주가 개발되어 있다. 그 결과, 메토트랙세이트가 배출되는 경우, 세포주는 염색체(들)로 통합되는 증폭 유전자를 포함한다.

플라스미드 pC1은 해당 유전자의 발현에 대해서 라우스 육종 바이러스 (Rouse Sarcoma Virus)의 긴 말단 반복부(LTR)의 강한 프로모터[쿨렌 등, Molecular and Cellular Biology, 1985년 3월:438-4470]와 인간의 사이토메갈로바이러스(CMV)의 즉시 초기 유전자의 인핸서로부터 분리된 단편[문헌 보사트 등, Cell 41:521-530, 1985]를 포함한다. 프로모터의 다운스트림에는 상기 유전자의 삽입을 가능케 하는 단일 제한 효소 절단 부위인 BamHI, 3' 인트론 및 래트의 프레프로인슐린 유전자의 폴리아데닐화 부위가 위치한다. 다른 고 효율의 프로모터는 발현에 사용될 수 있는데, 예를 들면 인간의 β-악틴 프로모터, SV40 초기 또는 후기의 프로모터 또는 레트로바이러스(예를 들면 HIV 및 HTLVI)로부터의 장 말단 반복부에 대해 사용될 수 있다. mRNA의 폴리아데닐화의 경우, 예를 들면 인간의 성장 호르몬 또는 글로빈 유전자로부터의 기타의 시그날을 마찬가지로 사용할 수 있다.

염색체로 통합되는 유전자를 갖는 안정한 세포주는 또한 선택가능한 마커, 예를 들면 gpt, G418 또는 하이그로마이신을 사용한 동시형질감염시 선택될 수 있다. 초반부에 1 이상의 선택 가능한 마커, 예를 들면 G418 플러스 메토트렉세이트를 사용하는 것이 이롭다.

당업계에 공지된 기법에 의해 플라스미드 pC1을 제한 효소 BamHI를 사용하여 분해한 후, 송아지 장내 포스페이트를 사용하여 탈인산화시켰다. 벡터를 1 %의 아가로스 겔로부터 분리한다.

MIP-4, ATCC 번호 75675를 암호화하는 DNA 서열을 유전자의 5' 및 3' 서열에 상응하는 PCR 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 증폭시킨다.

5' 프라이머는 도 3에 기재되어 있는 MIP-4 단백질을 암호화하는 서열(서열 번호 5) 부분 및 밑줄친 BamHI 제한 효소 부위를 포함하는 서열

5' AAA GGA TCC GCC ACC ATG AAG GGC CTT GCA AGC 3'(서열 번호:49)을 갖는다. BamHI KOZAK

전술한 바와 같이, 발현 벡터로 삽입하여 인간의 MIP-4를 암호화하는 증폭된 단편의 5' 말단이 충분한 시그날 펩티드를 제공한다. 진핵 세포에서의 해독의 개시에 충분한 시그날은 문헌[코작, 엠., J. Mol. Biol. 196:947-950 (1987)]에 기재된 바와 같이 작제물의 벡터 부분에 적절하게 위치한다.

3' 프라이머는 Asp718 제한 부위에 이어서 종지 코돈을 포함하는 도 3에 기재되어 있는 MIP-4 코드 서열(서열 번호 5)의 부분에 상보성을 갖는 뉴클레오티드 부분을 포함하는 서열

5' AAA GGA TCC TCA GGC ATT CAG CTT CAG 3'(서열 번호:50)을 갖는다. BamHI 종지

증폭된 단편을 전술한 바와 같이 1 %의 아가로스 겔로부터 분리한 후, 엔도뉴클레아제 BamHI 및 Asp718로 분해하고, 다시 1 %의 아가로스 겔상에서 정제한다.

분리된 단편 및 탈인산화된 벡터를 T4 DNA 리가제로 결찰시켰다. 이.콜리 HB101 세포를 형질전환시키고, 박테리아는 제한 효소 BamHI를 사용한 정확한 배향으로 삽입된 플라스미드 pC1을 포함하는 것으로 밝혀졌다.

CHO-DHFR 세포의 형질전환

활성 DHFR 효소가 결여된 중국산 햄스터의 난소 세포를 형질감염에 사용하였다. 리포펙션법(문헌: Felgner 등, 상동)을 사용하여 플라스미드 pSV2neo 0.5 ㎍으로 발현 플라스미드 C1 5 ㎍을 동시형질감염시켰다. 플라스미드 pSV2-neo는 우성의 선택가능한 마커, 즉 G418을 포함한 항생물질 군에 내성을 부여하는 Tn5 암호 효소로부터의 유전자 neo를 포함한다. 세포는 G418 1 mg/ml가 보충된 알파 마이너스 MEM에 접종된다. 2 일 후, 세포를 트립신처리하고, 하이브리도마 클로닝 평판(독일의 그레이너)에서 접종시키며, 10 내지 14일 동안 배양한다. 이 기간이 경과한 후, 단일 클론을 트립신처리하고, 6-웰 페트리 접시에서 여러가지 농도의 메토트렉세이트(25 nM, 50 nM, 100 nM, 200 nM, 400 nM)를 사용하여 접종시킨다. 최고 농도의 메토트렉세이트로 배양된 클론을 더 고 농도의 메토트렉세이트(500 nM, 1 μM, 2 μM, 5 μM)를 함유하는 새로운 6-웰 평판으로 옮기었다. 클론이 100 μM의 농도에서 배양될 때까지 동일한 절차를 반복하였다.

소정의 유전자 산물의 발현은 웨스턴 블롯 분석법 및 SDS-PAGE로 분석하였다.

실시예 6

A. COS 세포에서의 재조합 M-CIF의 발현

플라스미드, CMV-M-CIF HA의 발현은 1) SV40 복제 기원, 2) 앰피실린 내성 유전자, 3) 이.콜리 복제 기원, 4) CMV 프로모터에 이어서 폴리링커 영역, SV40 인트론 및 폴리아데닐화 부위를 포함하는 벡트 pcDNAI/Amp(인비트로겐)로부터 유도된다. 프레임에서 3' 말단에 융합된 HA 태그 및 전체 M-CIF 전구체를 암호화하는 DNA 단편을 벡터의 폴리링커 영역으로 클로닝시키고, 재조합 단백질 발현은 CMV 프로모터 아래에서 실시된다. HA 태그는 전술한 바와 같은 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질로부터 유도된 에피토프에 해당한다. 문헌[윌슨, 에이치. 등, Cell 37:767 (1984)]. HA 태그를 표적 단백질로 주입시키면 HA 에피토프를 인식하는 항체로 재조합 단백질의 검출이 용이하게 된다.

플라스미드 작제 단계는 하기와 같다.

M-CIF에 대해 암호화하는 DNA 서열 ATCC 번호 75572는 2 개의 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 형성되며, 이중 5' 프라이머 5'-GGAAAGCTTATGAAGATTCCGTGGCTGC-3'(서열 번호 51)는 HindIII 부위에 이어서 개시 코돈으로부터 출발한 M-CIF 암호 서열의 20 뉴클레오티드를 포함하며, 3' 서열 5'-CGCTCTAGATCAAGCGTAGTCTGGGAC GTCGTATGGGTAGTTCTCCTTCATGTCCTTG-3'(서열 번호 52)는 Xba I 부위에 상보성을 갖는 서열, 해독 종지 코돈, HA 태그 및 M-CIF 암호 서열(종지 코돈은 포함하지 않음)의 마지막 19 뉴클레오티드를 포함한다. 그래서, PCR 산물은 HindIII 부위, M-CIF 코드 서열에 이어서 프레임에 융합된 HA 태그, HA 태그뒤의 해독 종료 종지 코돈 및 XbaI 부위를 포함한다. PCR 증폭된 DNA 단편 및 벡터, pcDNAI/Amp는 HindIII 및 XbaI 제한 효소로 분해하고 결찰시킨다. 결찰 혼합물을 이.콜리 숙주 SURE(미국 캘리포니아주 라 졸라에 소재하는 스트라타젠 클로닝 시스템즈에서 입수)로 형질전환시키고, 형질전환된 배양액을 앰피실린 배지 평판에서 평판배양시키며, 내성 콜로니를 선택한다. 플라스미드 DNA를 형질전환체로부터 분리시키고, 제한 분석으로 정확한 단편의 존재 여부에 대해 검사하였다. 재조합 M-CIF의 발현의 경우, DEAN-DEXTRAN법으로 발현 벡터로 COS 세포를 형질감염시켰다. 문헌[제이. 샘브룩, 이, 에리히, 티. 마니아티스, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 콜드 스프링 래버러토리 프레스 (1989)]. M-CIF-HA 단백질의 발현은 방사선 표지화 및 면역침강법으로 검출한다. 문헌[이. 하로우, 디.레인, Antibodies: A Laboratory Manual, 콜드 스프링 래버러토리 프레스 (1988)]. 형질감염 이틀 경과후 세포를³⁵S-시스테인으로 8 시간 동안 표지화시켰다. 배양 배지을 수집하고, 세포를 세제[RIPA 완충액(150 mM NaCl, 1 % NP-40, 0.1 % SDS, 1 % NP-40, 0.5 % DOC, 50 mM Tris, pH 7.5), (윌슨 에이치. 등, Cell 37:767 (1984)]로 용해시켰다. 세포 용해믈 및 배양 배지 모두는 HA 특이성 단일 클론 항체로 침강시켰다. 침강된 단백질은 15 %의 SDS-PAGE 겔상에서 분석하였다.

B. CHO 세포에서의 콜로닝 및 발현

벡터 pC1은 M-CIF 단백질의 발현에 사용한다. 플라스미드 pC1은 플라스미드 pSV2-dhfr(ATCC 수탁 번호 37146)의 유도체이다. 두 플라스미드는 SV40 초기 프로모터의 조절하에 마우스 DHFR 유전자를 포함한다. 이들 플라스미드로 형질감염시킨 중국산 햄스터의 디히드로폴레이트 활성이 결여된 난소 세포 및 기타의 세포는 화학요법제인 메토트렉세이트가 보충된 선별 배지(알파 마이너스 MEM, 라이프 테크놀로지즈)내에서 세포를 배양시켜 선택할 수 있다. 매토트렉세이트(MTX)에 내성을 갖는 세포내의 DHFR 유전자의 증폭은 공지의 문헌[예, Alt, F.W., Kellems, R.M. Bertino, J.R. 및 Schirnke, R.T., 1978, J. Biol. Chem. 253:1357-1370, Hamlin, J.L. 및 Ma, C. 1990, Biochem et Biophys. Acta, 1097:107-143, Page, M.J. 및 Sydenham, M.A. 1991, Biotechnology Vol. 9:64-68]에 기재되어 있다. MTX의 농도를 증가시켜 배양한 세포는 DHFR 유전자의 증폭의 결과로서 표적 효소 DHFR를 과잉 생산하므로써 약물에 대한 내성을 형성한다. 제2유전자가 DHFR 유전자에 결합되는 경우, 이는 일반적으로 동시증폭되고 과잉으로 발현하게 된다. 유전자의 1,000 이상의 카피물을 수반하는 세포주가 개발되어 있다. 그 결과, 메토트랙세이트가 배출되는 경우, 세포주는 염색체(들)로 삽입되는 증폭 유전자를 포함한다.

플라스미드 pC1은 유전자의 발현에 대해서 라우스 육종 바이러스의 긴 말단 반복부(LTR)의 강한 프로모터[쿨렌 등, Molecular and Cellular Biology, 1985년 3월:438-4470]와 인간의 사이토메갈로바이러스(CMV)의 즉시 초기 유전자의 인핸서로부터 분리된 단편[문헌: 보사트 등, Cell 41:521-530, 1985]을 포함한다. 프로모터의 다운스트림에는 상기 유전자의 삽입을 가능케 하는 단일 제한 효소 절단 부위인 BamHI, 3' 인트론 및 래트의 프레프로인슐린 유전자의 폴리아데닐화 부위가 위치한다. 다른 고 효율의 프로모터는 발현에 사용될 수 있는데, 예를 들면 인간의 β-악틴 프로모터, SV40 초기 또는 후반기의 프로모터 또는 기타의 레트로바이러스(예를 들면 HIV 및 HTLVI)로부터의 장 말단 반복부에 대해 사용될 수 있다. mRNA의 폴리아데닐화의 경우, 예를 들면 인간의 성장 호르몬 또는 글로빈 유전자로부터의 기타의 시그날을 마찬가지로 사용할 수 있다.

염색체로 통합되는 유전자를 갖는 안정한 세포주는 또한 선택가능한 마커, 예를 들면 gpt, G418 또는 하이그로마이신을 사용한 동시형질감염시 선택될 수 있다. 초반부에 1 이상의 선택 가능한 마커, 예를 들면 G418 플러스 메토트렉세이트를 사용하는 것이 이롭다.

당업계에 공지된 기법에 의해 플라스미드 pC1을 제한 효소 BamHI를 사용하여 분해한 후, 송아지 장내 포스페이트를 사용하여 탈인산화시켰다. 벡터를 1 %의 아가로스 겔로부터 분리한다.

M-CIF, ATCC 번호 75572를 암호화하는 DNA 서열을 유전자의 5' 및 3' 서열에 상응하는 PCR 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 증폭시킨다.

5' 프라이머는 도 2에 기재되어 있는 M-CIF의 서열(서열 번호 1) 및 밑줄친 BamHI 제한 효소 부위를 포함하는 서열

5' AAA GGA TCC GCC ACC ATG AAG ATC TCC GTG GCT 3'(서열 번호:53)을 갖는다. BamHI KOZAK

전술한 바와 같이, 발현 벡터로 삽입하여 인간의 M-CIF를 암호화하는 증폭된 단편의 5' 말단이 충분한 시그날 펩티드를 제공한다. 진핵 세포에서의 변위의 개시에 충분한 시그날은 문헌[코작, 엠., J. Mol. Biol. 196:947-950 (1987)]에 기재된 바와 같이 작제물의 벡터 부분에 적절하게 위치한다.

3' 프라이머는 Asp718 제한 부위 및 종지 코돈을 포함하는 도 2에 기재되어 있는 M-CIF 코드 서열(서열 번호 1)의 부분을 포함하는 서열

5' AAA GGA TCC TCA GTT CTC CTT CAT GTC CTT 3'(서열 번호:54)을 갖는다.

BamHI 종지

증폭된 단편을 전술한 바와 같이 1 %의 아가로스 겔로부터 분리한 후, 엔도뉴클레아제 BamHI 및 Asp718로 분해하고, 다시 1 %의 아가로스 겔상에서 정제한다.

분리된 단편 및 탈인산화된 벡터를 T4 DNA 리가제로 결찰시켰다. 이.콜리 HB101 세포를 형질전환시키고, 박테리아는 제한 효소 BamHI를 사용한 정확한 배향으로 삽입된 플라스미드 pC1을 포함하는 것으로 밝혀졌다. 삽입된 유전자의 서열은 DNA 서열화에 의해 확인된다.

CHO-DHFR 세포의 형질전환

활성 DHFR 효소가 결여된 중국산 햄스터의 난소 세포를 형질감염에 사용하였다. 리포펙션법(문헌: Felgner 등, 상동)을 사용하여 플라스미드 pSVneo 0.5 ㎍으로 발현 플라스미드 C1 5 ㎍을 동시형질감염시켰다. 플라스미드 pSV2-neo는 우성의 선택가능한 마커, 즉 G418을 포함한 항생물질 군에 내성을 부여하는 Tn5을 암호하는 효소로부터의 유전자 neo를 포함한다. 세포는 G418 1 mg/ml가 보충된 알파 마이너스 MEM에 접종된다. 2 일 후, 세포를 트립신처리하고, 하이브리도마 클로닝 평판(독일의 그레이너)에서 접종시키며, 10 내지 14일 동안 배양한다. 이 기간이 경과한 후, 단일 클론을 트립신처리하고, 6-웰 페트리 접시에서 여러가지 농도의 메토트렉세이트(25 nM, 50 nM, 100 nM, 200 nM, 400 nM)를 사용하여 접종시킨다. 최고 농도의 메토트렉세이트로 배양된 클론을 더 고 농도의 메토트렉세이트(500 nM, 1 μM, 2 μM, 5 μM)를 함유하는 새로운 6-웰 평판으로 옮기었다. 클론이 100 μM의 농도에서 배양될 때까지 동일한 절차를 반복하였다.

소정의 유전자 산물의 발현은 웨스턴 블롯 분석법 및 SDS-PAGE로 분석하였다.

실시예 7

인간의 조직에서의 M-CIF의 발현 패턴

노턴 블롯팅 분석법을 사용하여 인간의 조직에서의 M-CIF의 발현 레벨을 검사하였다. 총 세포 RNA 샘플을 상표명 RNAzol^TMB 시스템(미국 텍사스주 휴스턴의 바이오텍스 래보러토리즈, 인코포레이티드)을 사용하여 분리하였다. 인간의 조직 각각으로부터 분리한 약 10 ㎍의 RNA 전체를 1 % 아가로스 겔상에서 분리하고, 나일론 필터상에서 블롯팅시켰다. 문헌[샘브룩, 에리히, 마니아티스, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 콜드 스프링 하버 프레스 (1989)]. 스트라타젠 프라임-잇 키트에 따라서 DNA 단편 50 ng을 사용하여 표지화 반응을 실시하였다. 표지된 DNA를 셀렉트-G-50 컬럼을 사용하여 정제하였다. (미국 콜로라도주 불더에 소재하는 5 프라임-3 프라임, 인코포레이티드). NaPO₄0.5 M, pH 7.4 및 SDS 7 %내에서 1 ml당 1,000,000 cpm으로 65℃에서 밤새 필터를 방사선 표지된 전장 M-CIF 유전자로 하이브리드화하였다. 실온에서 2 회, 60℃에서 2 회 0.5×SSC, 0.1% SDS로 세척한 후, 필터를 강화 스크린을 사용하여 -70℃에서 밤새 노출시켰다.

실시예 8

인간의 조직에서의 MPIF-1의 발현 패턴

노턴 블롯팅 분석법을 사용하여 인간의 조직에서의 MPIF-1의 발현 레벨을 검사하였다. 총 세포성 RNA 샘플을 상표명 RNAzol^tmB 시스템(미국 텍사스주 77033 휴스턴 사우쓰 루프 이스트 6023에 소재하는 바이오텍스 래보러토리즈, 인코포레이티드)을 사용하여 분리하였다. 인간의 조직 각각으로부터 분리한 약 10 ㎍의 RNA 전체를 1% 아가로스 겔상에서 분리하고, 나일론 필터상에서 블롯팅시켰다. 문헌[샘브룩, 에리히, 마니아티스, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 콜드 스프링 하버 프레스 (1989)]. 스트라타젠 프라임-잇 키트에 따라서 DNA 단편 50 ng을 사용하여 표지화 반응을 실시하였다. 표지된 DNA를 셀렉트-G-50 컬럼을 사용하여 정제하였다. (미국 콜로라도주 80303 불더, 아라파호 로드 5603에 소재하는 5 프라임-3 프라임, 인코포레이티드). NaPO₄0.5 M, pH 7.4 및 SDS 7 %내에서 1 ml당 1,000,000 cpm으로 65℃에서 밤새 필터를 방사선 표지된 전장 MPIF-1 유전자로 하이브리드화하였다. 실온에서 2 회, 60℃에서 2 회 0.5×SSC, 0.1% SDS로 세척한 후, 필터를 강화 스크린을 사용하여 -70℃에서 밤새 노출시켰다.

실시예 9

인간의 세포에서의 MIP-4의 발현 패턴

노턴 블롯팅 분석법을 사용하여 인간의 조직에서의 MIP-4의 발현도를 검사하였다. 총 세포성 RNA 샘플을 상표명 RNAzol^TMB 시스템(미국 텍사스주 77033 휴스턴 사우쓰 루프 이스트 6023에 소재하는 바이오텍스 래보러토리즈, 인코포레이티드)을 사용하여 분리하였다. 인간의 조직 각각으로부터 분리한 약 10 ㎍의 RNA 전체를 1% 아가로스 겔상에서 분리하고, 나일론 필터상에서 블롯팅시켰다. 문헌[샘브룩, 에리히, 마니아티스, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 콜드 스프링 하버 프레스 (1989)]. 스트라타젠 프라임-잇 키트에 따라서 DNA 단편 50 ng을 사용하여 표지화 반응을 실시하였다. 표지된 DNA를 셀렉트-G-50 컬럼을 사용하여 정제하였다. (미국 콜로라도주 80303 불더, 아라파호 로드 5603에 소재하는 5 프라임-3 프라임, 인코포레이티드). NaPO₄0.5 M, pH 7.4 및 SDS 7 %내에서 1 ml당 1,000,000 cpm으로 65℃에서 밤새 필터를 방사선 표지된 전장 MIP-4 유전자로 하이브리드화하였다. 실온에서 2 회, 60℃에서 2 회 0.5×SSC, 0.1% SDS로 세척한 후, 필터를 강화 스크린을 사용하여 -70℃에서 밤새 노출시켰다. 도 6 참조.

실시예 10

바쿨로바이러스 발현계를 사용한 케모킨 MPIF-1의 발현 및 정제

MPIF-1 cDNA를 발현하도록 고안된 재조합 바쿨로바이러스를 사용하여 SF9 세포를 감염시켰다. 세포를 MOI 2로 감염시키고, 28℃에서 72-96 시간 동안 항온배양시켰다. 감염된 배양액으로부터의 세포성 조직파편을 저속 원심분리로 제거하였다. 20 ㎍/ml의 페파블록 SC, 1 ㎍/ml의 류펩틴, 1 ㎍/ml의 E-64 및 1 mM의 EDTA의 최종 농도로 상청액에 프로테아제 억제제 칵테일을 첨가하였다. 15% SDS-PAGE 겔만의 상청액 20∼30 ㎕를 장입하여 상청액내의 MPIF-1의 농도를 모니터하였다. MPIF-1을 볼 수 있는 9 Kd 밴드로 검출하였으며, 이는 1 ℓ당 수 ㎎의 발현 레벨에 해당하는 것이다. MPIF-1을 3 단계의 정제 단계:헤파린 결합 친화 크로마토그래피를 통해 추가로 정제하였다. 바쿨로바이러스 배양액의 상청액을 100 mM의 HEPES/MES/NaOAc pH 6을 포함하는 1/3 부피의 완충액과 혼합하고, 0.22 ㎛ 막을 통해 여과하였다. 샘플을 헤파린 결합 컬럼(HEI 포로스 20, 바이-퍼셉티브 시스템 인코포레이티드)에 가하였다. pH 6의 50 mM HEPES/MES/NaOAc내의 NaCl 500 mM에 50의 선형 구배의 양이온 교환 크로마토그래피로 약 300 mM의 NaCl에서 MPIF-1을 용출시켰다. 헤파린 크로마토그래피로부터의 MPIF-1이 풍부한 것을 pH 6의 HEPES/MES/NaOAc 50 mM를 포함하는 완충액으로 5 배 희석하였다. 생성된 혼합물을 양이온 교화 컬럼(S/M 포로스 20, 바이오퍼셉티브 세스템 인코포레이티드)에 가하였다. pH 6의 50 mM HEPES/MES/NaOAc내의 NaCl 300 mM에 25의 선형 구배의 크기 배제 크로마토그래피로 250 mM의 NaCl에서 MPIF-1을 용출시켰다. 양이온 교환 컬럼 크로마토그래피에 이어서, MPIF-1을 크기 배제 컬럼(HW50, TOSO HAAS, 1.4×45 cm)에 가하여 추가로 정제하였다. MPIF-1를 13.7 Kd의 분자량 표준물(RNase A)에 가까운 부위에서 분별시켰으며, 이는 단백질의 이합체 형태에 해당한다.

전술한 3 단계의 정제에 이어서, 생성된 MPIF-1은 SDS-PAGE 겔의 코마지 블루 염색으로 검출하여 90 % 이상이 순수한 것으로 나타났다(도 9).

정제한 MPIF-1을 내독소/LPS 오염에 대해 테스트하였다. LAL 분석(바이오 휘태커)에 의하면 LPS 함량이 0.1 ng/ml 미만인 것으로 나타났다.

실시예 11

골수 세포로부터 새로 분리해낸 M-CSF 및 SCF 자극된 콜로니 형성에 대한 바쿨로바이러스 발현된 M-CIF 및 MPIF-1의 효과

개체군 밀도가 낮은 마우스 골수 세포를 37℃에서 1 시간 동안 처리 조직 배양 접시에서 항온배양하여 단핵구, 대식세포 및, 플라스틱 표면에 부착된 기타의 세포를 제거하였다. 비부착성 개체군의 세포를 도 14에 제시된 인자의 존재 또는 부재하에 성장 배지을 포함한 아가내에서 평판배양하였다(1 접시당 10,000 세포). 배양액을 10 일동안 37℃에서 (88 % N₂, 5 % CO₂및 7 % O₂) 항온배양하고, 도립 현미경하에서 콜로니를 계수하였다. 데이터는 콜로니의 평균수로 기재하고, 3회 반복한 분석으로부터 얻었다.

실시예 12

IL-3 및 SCF에 의해 자극된 증식에 영향을 미치는 MPIF-1 및 M-CIF의 효과와 골수 세포의 계열 집단의 분화

원시 조혈 선조 세포 중에 풍부한 마우스 골수 세포 집단을 음성 선별 절차를 사용하여 얻었는데, 여기서 대부분 혈통의 항원 감작 세포를 단일클론 항체(안티-cdIIb, CD4, CD8, CD-45R 및 Gr-1 항원)의 패널과 자석 비이드를 사용하여 제거하였다. 형성된 세포(혈통 제거된 세포)집단을 지시된 케모킨(50 mg/ml)의 유무 하에 IL-3(5 ng/ml)과 간세포 인자(stem cell factor: SCF)(100 ng/ml)로 추가 보충한 성장 배지 중에서 평판 배양시켰다(5×10⁴세포/㎖). 습도 조절된 배양기(5% CO₂, 7% O₂및 88% N₂로 이루어진 환경)에서 30℃로 7일간 항온 처리한 후, 세포를 수거하여 HPP-CFC와 미성숙한 선조 세포에 대하여 분석 시험하였다. 또한, 세포를 FACScan에 의한 특정 분화 항원의 발현에 대해 분석하였다. 콜로니 데이타를 콜로니 (+/- SD)의 수 평균으로서 표시하고, 세포의 각 집단에 대해 6개의 접시에서 수행한 분석 시험으로부터 얻었다(도 15).

실시예 13

MPIF-1은 IL-3, M-CSF 및 GM-CSF에 대한 반응에서 콜로니 형성을 억제한다.

마우스 골수 세포를 대퇴골과 경골로부터 관류해 내어 피콜(ficoll) 밀도 구배로 분리한 다음, 단핵구를 플라스틱 부착(plastic adherence)에 의해 제거하였다. 형성된 세포 집단을 IL-3(5 ng/ml), GM-CSF(5 ng/ml), M-CSF(10 ng/ml) 및 G-CSF(10 ng/ml)로 추가 보충한 MEM계 배지 중에서 밤새 동안 항온 처리하였다. 이러한 세포를 M-CIF 50 ng/ml의 유무와 함께 IL-3(5 ng/ml), GM-CSF(5 ng/ml) 또는 M-CSF( 5 ng/ml)의 존재 하에 아가계 콜로니 형성 분석 시험에서 접시당 1,000 세포로 평판 배양하였다. 데이타는 콜로니 형성을 특정한 인자 단독에 의해 형성된 콜로니 수의 백분율로서 표시하였다. 2회 실험에 의해, 각 실험에 대한 표준 편차를 나타내는 오차 막대를 사용하여 데이타를 중복 수행한 접시의 평균 값으로서 도시하였다(도 17).

실시예 14

유전자 치료법에 의한 발현

섬유아세포를 피부 생검의 목적물로부터 얻었다. 형성된 조직을 조직 배양 배지에 넣어 작은 조각으로 분리하였다. 조직의 작은 조각들을 조직 배양 플라스크의 젖은 표면 상에 놓는데, 약 10 조각을 각각의 플라스크에 넣었다. 플라스크를 뒤집어 단단히 밀봉한 다음, 실온에서 밤새 동안 방치하였다, 실온에서 24 시간이 경과한 후, 플라스크를 다시 정상으로 되돌려 놓고, 조직의 조각을 플라스크 바닥에 고정한 다음, 신선한 배지(예를 들면, Ham's F12 배지, 이 배지는 10% FBS, 페니실린 및 스트렙토마이신을 함유함)를 첨가하였다. 이어서, 이것을 약 1주 동안 37℃로 항온 처리하였다. 이 때 신선한 배지를 첨가하는데, 연속적으로 3일 내지 5일 마다 교체하였다. 배양을 2주 더 한 후, 섬유아세포의 단일 층이 나타나기 시작하였다. 이 단일 층을 트립신으로 분해하고, 보다 큰 플라스크 내로 넣어 단계를 높였다.

몰로니(Moloney) 쥐의 육종 바이러스의 장쇄 말단 반복부와 인접해 있는 pMV-7(Kirschmeier, P.T. 등, DNA 7: 219-25(1988))를 EcoRI와 HindIII로 분해 처리하고, 이어서 송아지 장의 인산효소로 분해 처리하였다. 선형 벡터를 아가로스 겔 상에서 분류하고, 유리 비이드를 사용하여 정제하였다.

본 발명의 폴리펩티드를 암호화한 cDNA를 각각 5' 및 3' 말단 서열에 해당하는 PCR 프라이머를 사용하여 증폭시켰다. 5' 프라이머는 EcoRI 부위를 함유하고, 3' 프라이머는 HindIII 부위를 함유하고 있다. 동량의 몰로니 쥐의 육종 바이러스 선형 골격과 EcoRI 및 HindIII 단편을 함께 T4 DNA 리가제의 존재 하에 첨가하였다. 형성된 혼합물을 상기 2종 단편의 결찰(ligation)에 적합한 조건 하에 유지시켰다. 결찰 혼합물을 사용하여 박테리아 HB101를 형질 변환시킨 후, 벡터가 적절하게 삽입된 중요 유전자를 가지고 있는지를 확인할 목적으로 카나마이신을 함유하는 아가 상에 놓았다.

양쪽성pA 317 또는 GP+am12 패키징 세포(packaging cell)를 조직 배양에 성장시켜 DMEM(Dulbeccol's Modified Eagles Medium)내의 밀도를 10% 송아지 혈청(CS), 페니실린 및 스트렙토마이신으로 융합시켰다. 이어서, 유전자를 함유한 MSV 벡터를 배지에 첨가하여 패키징 세포를 벡터에 의해 형질 도입하였다. 이 때 패키징 세포는 유전자를 함유한 감염성 바이러스 입자를 생산한다(여기서, 패키징 세포는 생산자 세포로서 언급된다).

신선한 배지를 형질 도입된 생산자 세포에 첨가하고, 이어서 융합(confluent) 생산자 세포의 10 cm 배피 평판으로부터 수거하였다. 감염성 바이러스 입자를 함유하고 있는 소모된 배지를 밀리포어(millipore) 필터를 통해 여과시켜 분리된 생산자 세포를 제거한 후, 이 배지를 사용하여 섬유아세포를 감염시켰다. 배지를 섬유아세포의 보조 융합 평판(sub-confluent plate)으로부터 제거하고, 생산자 세포로부터 연유한 배지로 신속하게 교체하였다. 이 배지를 제거하고, 신선한 배지로 교체하였다. 바이러스의 역가가 높을 경우, 실제 모든 섬유아세포가 감염되어 선별이 불필요하다. 역가가 너무 낮은 경우, 선별 가능한 마커, 예를 들면 neo 또는 his를 가지고 있는 레트로바이러스 벡터를 사용할 필요가 있었다.

조작된 섬유아세포를 숙주에게 단독으로 주입하거나 또는 사이토덱스 3 마이크로담체(cytodex 3 microcarrier) 비이드 상에 융합할 수 있도록 성장시킨 후 숙주에게 주입하였다.

실시예 15

시험관내 골수 보호(Myeloprotection)

상기 입증된 바와 같이, MPIF-1은 LPP-CFC(저 증식능 콜로니 형성 세포)의 유효한 억제제로서, 과립 세포 및 단핵구 혈통을 생성하는 골수양 선조 세포이다. MPIF-1이 화학 요법 약물에 작용하는 세포 주기의 세포 독성으로부터 LPP-CFC에 대한 보호 기능을 제공한다는 것을 입증하기 위해서, 세포(Lin-Cell; 혈통 세포)의 혈통 제거된 집단을 마우스 골수 세포로부터 분리하여 MPIF-1의 유무와 함께 복수 시토킨의 존재 하에서 항온 처리하였다. 48 시간이 경과한 후, 각 배양액의 한 세트에 5-Fu를 접종한 후, 계속해서 24시간을 더 항온 처리하였는데, 이 때 생존한 LPP-CFC의 수를 클론원성 분석 시험에 의해 측정하였다. 도 21A에 도시되어 있는 바와 같이, LPP-CFC의 ∼40%는 MPIF-1의 존재 하에서 5-Fu에 의해 유발된 세포 독성으로부터 보호되었지만, MPIF-1의 부재 하에서 또는 비관련된 단백질의 존재 하에서는 LLP-CFC가 거의 보호(＜5%)되지 않았다. HPP-CFC(고 증식능 콜로니 형성 세포)는 동일한 배양 조건 하에서 MPIF-1에 의해 보호되지 않았는데, 이것은 MPIF-1 보호 효과의 특이성을 입증한 것이다.

화학 요법 약물로서 5-Fu 대신 Ara-C을 사용하여 유사한 실험을 하였다. 도 21B에 도시되어 있는 바와 같이, LPP-CFC의 극적인 보호는 야생형의 MPIF-1과 돌연 변이 MPIF-1(즉, 돌연변이-1, 이 돌연 변이에 대한 상세한 설명은 실시예 17 참조)에 대해 이루어 졌다. 따라서, MPIF-1은 화학 요법 약물인 5-Fu와 Ara-C에 의해 유발되는 세포 독성으로부터 LPP-CFC를 보호할 수 있다.

실시예 16

생체내 골수 보호

시험관내 골수 보호 결과에 따르면, 골수 내의 중요 세포 유형이 화학 요법에 의한 치료 기간 동안 MPIF-1에 의해 보호될 경우, 세포 독성 약물에 의해 유도되는 골수 독성, 즉 화학 요법으로 치료 받고 있는 암 환자에게서 관찰되는 심한 부작용은 경감될 수 있다. 생체내 골수 보호를 입증하기 위해서, 2가지 유형의 실험을 마우스에서 수행하였다. 한가지 유형의 실험에 있어서, 마우스의 군(군-4)에 3일 동안 24 시간 간격으로 매일 MPIF-1(1.0 mg/kg)을 복강내(I.P.) 주입하였고, 마찬가지로 3일 째 되는 날 이들 마우스에게 5-Fu를 150 mg/kg으로 복강내 주입하였다. 동물에게 염수(군-1), 단독 MPIF-1(군-2) 또는 단독 5-Fu(군-3)를 주입하여 대조군으로서 사용하였다. 이어서, 각 군으로부터 취한 4 마리 동물에게 5-Fu를 투한지 3일, 6일 및 10일째 되는 날 치사시킨 다음, 말초 혈액에 존재하는 백혈구(WBC)의 수를 측정하였다. 도 22에 도시되어 있는 바와 같이, MPIF-1의 단독 주입은 WBC 수에 거의 영향을 거의 미치지 못하였다. 예상한 바와 같이, 5-Fu 처리후 6일째에 순환 중의 WBC 수에서 있어서 급격한 감소를 유도하였다. 5-Fu를 투여하기 전에 MPIF-1로 처리한 동물은 5-Fu 단독으로 치료한 동물에 비하여 혈중 WBC 수가 2배 이상으로 나타났다는 것은 중요하다. 따라서, 5-Fu로 처리하기 전에 마우스를 MPIF-1로 처리한 것은 호중구 감소증으로부터 급격한 회복을 유도하였다.

골수 내의 조혈 간세포 및 다능성(multipotential) 선조 세포는 화학 요법에 의해 수반되는 모든 조혈 계통을 회복시키는 역할을 한다. 정상 개체에서, 이들 세포는 빈번하게 분열되지 않으므로, 화학 요법 약물의 단일 투여량으로 피해를 입지 않는다. 그러나, 이들 세포는 그러한 약물의 제 2의 투여량을 제 1 투여량이 투여된지 3일 이내에 투여할 경우 치사되는데, 그 이유는 골수내의 중요 선조 세포 유형이 상기 기간 동안 급격하게 분열되기 때문이다.

MPIF-1가 골수 내의 세포 유형을 보호할 수 있는지의 여부를 입증하기 위해서, 다음과 같은 실험을 수행하였다. 실험은 3 군(1군 당 6마리임)을 사용하여 수행하였는데, 각각의 군을 다음과 같이 처리하였다. 군-1은 1일, 2일 및 3일 째에 염수를 주입하고, 군-2는 0일과 3일 째에 5-Fu를 주입하며, 군-3은 0일과 3일 째에 5-Fu과 1일, 2일 및 3일 째 MPIF-1을 주입하였다.(도 23을 참조). 골수를 6일과 9일 째에 수거한 다음, 당업자에게 잘 알려진 클론원성 분석 시험을 이용하여 HPP-CFC 빈도와 LPP-CFC 빈도를 측정하였다. 결과에 따르면, 5-Fu의 제2 투여량을 투여하기 전에 MPIF-1을 투여하는 것은 5-Fu 단독으로 처리한 동물에 비하여 9일 째의 HPP-CFC 빈도와 LPP-CFC 빈도의 신속한 회복을 유도하였다, (도 24 참조).

실시예 17

MPIF-1 돌연변이에 관한 연구

N-말단로부터 절단된 다수의 MPIF-1 변이체를 확인하고 특성화하였다. 에드만 분해에 의해 결정된 이러한 변이체의 아미노산 말단 서열은, 도 25에서 제시되어 있다. 예를 들면, 돌연 변이-2, 돌연변이-3. 돌연변이-7 및 돌연변이-8은 MPIF-1의 성숙한 형태를 정제하는 동안 자발적으로 발생하는데, 이러한 제제는 제제 K0871이라고 불리운다. 마찬가지로, 돌연변이-2. 돌연변이-3, 돌연변이-4 및 돌연변이-5는 정제된 MPIF-1 제제(제제 HG00300-B7)의 또 다른 회분(batch)에서 발견되었다. 이들 변이체를 서로 정제하는 것이 불가능하기 때문에, 제제 K0871과 제제 HG00300-B7는 하기 설명하고 있는 실험에서와 같이 사용하였다. N-말단 메티오닌을 제외하고는 아미노 말단 서열에 대해서 돌연변이-3과 동일한 돌연변이-6을 시험관내 돌연 변이 생성에 의해 생성시켰다. N-말단 메티오닌을 제외하고는 야생형과 동일한 돌연변이-1도 돌연 변이 생성에 의해 생성시켰다. 또한 대안적인 MPIF-1 스플라이스 형태(돌연변이-9), 즉 137개의 아미노산으로 이루어진 단백질(도 26A)을 암호화한 그 돌연변이-9의 cDNA 클론이 발견되었다(도 25를 참조). 돌연변이-9에 대한 아미노산 서열을 MPIF-1의 아미노산 서열과 비교하면, MPIF-1 서열에서는 잔기 45와 잔기 46 사이에 18개의 아미노산이 삽입되어 있었고, MPIF-1의 아르기닌 46이 소실되어 있었다(도 26B). 하기에서는 이들 MPIF-1 돌연변이 단백질의 생물학적 활성을 요약하였다.

세포내의 칼슘 이동성. 전술한 실시예에서, MPIF-1 단백질은 단핵구 내에서 칼슘을 이동시킬 수 있음을 설명하였다. 야생형 및 돌연 변이 MPIF-1 단백질은 양성 대조군으로서 인간 MIP-1α를 사용하여 인간의 단핵구 내의 세포내 칼슘 이동을 유도하는 능력에 대하여 시험하였다. 실험을 다음과 같이 수행하였다. 인간의 단핵구는 용출법에 의해 분리한 다음, 1 mM CaCl₂, 2 mM MgSO₄, 5 mM 글루코스 및 10 mM HEPES, pH7.4를 함유하고, 2.5 mM 인도-1/아세톡시메틸에스테르를 함유하는 HBSS 1 ml 중에 존재하는 1×10⁶세포를 37℃에서 30분 동안 항온 처리함으로써, 인도-1/아세톡시메틸에스테르를 적재하였다. 이어서, 세포를 HBSS로 세척하고, 동일한 완충액 중에 5×10⁵세포/ml로 재현탁시킨 다음, 지정 단백질의 다양한 농도로 37℃에서 자극하였다. 세포내 칼슘((Ca⁺⁺)i)의 변화에 반응하여 유도되는 형광성 시그날을 330 nm에서의 인도-1 들 뜸 현상 및 405 nm와 485 nm에서의 방출 현상을 모니터링하는 Hatchi F-2000 형광성 분광분석기 상에서 측정하였다.

결과에 따르면, 제제 K0871, 제제 HG00300-B7 및 돌연변이-9는 야생형보다 10배 더 큰 활성을 나타내었지만, 돌연변이-6은 야생형과 구별할 수 없었으며, 돌연변이-1은 야생형보다 약 2배 더 큰 활성을 나타내었다.(도 27을 참조). MIP-1α와 MPIF-1은 주요 아미노산 서열에 대해 45%가 동일하기 때문에, 이들이 동일한 수용체와 반응하였는지의 여부를 결정하는 데에 중요하다. 이러한 가능성을 검증하기 위해서, MIP-1α에 의해 유도되는 칼슘 이동을 탈감작시키는 MPIF-1의 성능을 연구하였다. 도 28A와 도 28B에 의하면, MIP-1α 및 MPIF-1 야생형 단백질은 단핵구내의 칼슘을 이동시키는 각각의 능력을 탈감작시킬 수 있었으나, MCP-4(또 다른 베타 케모킨)는 그러지 아니하였다.

유사한 실험에 있어서, 제제 K0871, 제제 HG00300-B7 및 돌연변이-1, 돌연변이-6 및 돌연변이-9는 MIP-1α에 의해 유도된 칼슘 이동을 차단할 수 있었다. 이러한 실험을 다음과 같이 수행하였다. 지시된 단백질 100 ng/ml에 대한 인간 단핵구의 칼슘 이동 반응을 도 27에서 설명하고 있는 실험에 대해 상기 지시한 바와 같이 측정하였다. 탈감작 연구를 위해, 단핵구를 먼저 1개의 인자에 노출시키고, 제1 처리에 대한 반응이 기준선까지 복귀될 때, 제2 인자를 동일한 세포에 첨가하였다. 제2 인자에 전혀 반응이 없는 것은 (-) 표시로 하고, 제1 인자에 자극성 반응이 있는 것은 (+) 표시로 나타내었다.(도 29를 참조).

따라서, MPIF-1 및 이것의 돌연변이는 MIP-1α에 대한 세포 표면 수용체의 성분과 반응하거나 공유하게 된다. 최근 입증된 바에 의하면, MIP-1α 수용체는 HIV가 인간 단핵구 내로의 유입되는 것을 용이하게 하는데 보조 인자로서 작용하고, T-림프구는 MPIF-1 또는 이것의 돌연변이가 HIV의 세포내 유입 과정을 방해할 수 있다는 흥미로운 가능성을 제기하였다.

주화성(chemotaxis). 인간의 말초 혈액 중의 단핵 세포(PBMC) 분류물(이것은 주로 림프구와 단핵구로 구성됨)의 주화성은, 96-웰 뉴로프로브 주화성 챔버(96-well neuroprobe chemotaxis chamber)에서 MPIF-1 및 이것의 돌연변이의 다양한 농도에 대한 반응으로 측정하였다. 실험을 다음과 같이 수행하였다. 세포를 0.1% BSA 함유 HBSS(HBSS/BSA) 중에서 3회 세척하고, 표지화하기 위하여 2×10⁶/ml로 재현탁하였다. Cacein-AM(분자 프로브)를 첨가하여 최종 농도 1mM로 만든 다음, 세포를 37℃에서 30분 동안 항온 처리하였다. 이와 같이 항온 처리한 후, 세포를 HBSS/BSA 중에서 3회 세척하였다. 표지화된 세포를 8×10⁶/ml로 재현탁시키고, 이 현탁액 25 ml(2×10⁵세포)를 96 웰 주화성 평판의 각각의 상부 체임버 내로 분배하였다. 주화성 약물을 각 웰의 하부 체임버에 다양한 농도로 분배하였다. 상부 및 하부 체임버를 폴리카보네이트 필터(공극 크기 3 mm ∼5 mm, PVP 무함유, NeuroProbe, Inc.의 제품)에 의해 분리하였다. 세포를 45분 내지 90분 동안 이동시킨 후, 이동된 세포(필터의 하부 표면에 부착되거나 또는 하부 체임버내에 존재하는 세포)의 수를 사이토플루오로(Cytofluor) 11 평판 판독기(PerSeptive Biosystem)를 사용하여 정량하였다. 그 값은 최대 활성이 괄호 안에 표시된 배경에 존재하는 상대적 만곡 유도 부분에 의해 관찰되는 농도로 표시한다.

도 30에 도시되어 있는 결과에 의하면, 제제 K0871과 제제 HG00300-B7은 야생형보다 더 유효한 주화성의 유도제이나, 돌연변이-1과 돌연변이-6은 야생형과 거의 분별할 수 없었다.

LPP-CFC에 의한 콜로니 형성에 미치는 영향. LPP-CFC에 의한 콜로니 형성에 미치는 MPIF-1의 영향을 측정하기 위해서, 마우스 골수 세포의 한정된 수를, 복수개의 시토킨(cytokin)으로 추가 보충한 배지를 함유하는 연질 아가 중에서 MPIF-1 돌연변이의 다양하 농도의 유무 하에서 평판 배양하였다. 실험을 다음과 같이 수행하였다. 마우스 골수 세포의 저밀도 집단을, 재조합 쥐의 시토킨 IL-3(5 ng/ml), SCF(100 ng/ml), IL-1 알파(10 ng/ml) 및 M-CSF(5 ng/ml)의 존재 하에서 지시된 MPIF-1 돌연변이를 다양한 농도로 함유 또는 함유하지 않은 아가 함유 배지중에서 평판 배양하였다(1,500 세포/3.5 cm 직경 접시). 이어서, 접시를 조직 배양의 배양기의 배양기에서 14일 동안 항온 처리하는데, 이 때 LPP-CFC 콜로니를 도립 현미경 하에 수치화하였다. 도 31에 도시된 데이타는 각 조건 하에 중복하여 분석 시험을 하는 복수개의 상이한 실험으로부터 수집하여 나타내었다.

형성된 데이타에 의하면, 제제 K0871과 제제 HG00300-B7에서 50% 최대 억제율에 요구되는 유효 농도는 야생형의 것보다 20배 내지 100배 낮았고, 돌연변이-6의 경우보다 2배 내지 10배 낮았다.(도 31을 참조). 따라서, MPIF-1 단백질의 N-말단 아미노산의 결실은 분자의 성능을 향상시켰다.

실시예 18

리포다당류 유도 치사 패혈증의 M-CIF 보호

인간에게 중요한 이환율 및 사망율을 초래하는 질병인 패혈성 쇼크는 혈액성 박테라아성 감염에 대한 반응에서 시토킨의 조절 불가능한 방출에 기인한다. 박테라아성 내독소는 그람 양성 패혈 쇼크[Morrison & Ryan, Annu. Rev. Med. 38;417(1987); Wolff & Benett, N. Engl. J. Med. 291: 733(1974)]의 병인론에서 중요한 인자로서 인지되고 있는데, 상기 쇼크는 TNF-a 및 기타 시토킨의 생성인 경우 내독소에 대한 반응에서 대식 세포에 의해 매개된다[Freudenberg 등, Infect. Immun. 51:891(1986), Tracey 등, Nature(Lond). 330: 662(1987)].

M-CIF는 단핵구/대식 세포에 대한 시험관내 주화성 활성을 전혀 갖지 않고 T-림프구에 대한 주화성 활성을 일부 갖는 베타-케모킨류의 신규한 구성원이다. M-CIF는 이것이 MIP-1α 및 RANTES[Schulz-Knappe 등, J. Exp. Med. 183:295(1996)]와 공유하는 수용체를 통한 세포내 Ca⁺⁺변화에 대해 단핵구/대식 세포를 유도한다는 것을 제외하고는, 대부분의 백혈구에 비활성이다. 또한, MIP-1α는 M-CSF 유도 전단구 콜로니 형성에 영향을 미치는 강한 억제성 효과를 가지고 있는 것으로 나타났다(Kreider 등, Abstract for The International Society for Interferon and Cytokine Research, Geneva, Switzerland, 1996).

본 연구에 있어서, 본 발명자들은 동물 모델에 있어서 내독소에 의해 유도되는 패혈성 쇼크에 영향을 미치는 M-CIF의 효과를 검토하고자 한다. 일부 실험에서, 박테리아성 독소의 효과[Peavy 등, J. Immunol. 105: 1453(1970)]에 대한 마우스의 공지된 자연적인 저항력을 제외하고, 본 발명자들은 D-갈락토스아민[Galano 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 76: 5939(1979); Lehmann 등, J. Exp. Med. 165: 657(1987)]으로 선처리하여 마우스의 감작성을 증가시켰다. 본 발명자들은 잠복성의 패혈성 마우스를 M-CIF로 처리하는 체계적 처리는 LPS-유도 치사 쇼크를 현저하게 억제한다는 것을 밝혀 냈다.

재료 및 방법

화합물 및 시약. 내독소 LPS(E. coli 0127: B8로부터 유도됨)와 D-갈락토스아민을 시그마 케미칼 컴파니(미국, 미조리주 세인트 루이스 소재)로부터 구입하였다. 재조합 인간의 M-CIF는 단백질 발현 및 정제 목적으로 한 3개의 상이한 벡터 시스템, 즉 바큘로바이러스, E. coli 및 CHO 세포를 이용하여 제조하였다. 생체내 용도를 위한 최종 단백질 제제는 SDS-PAGE 분석에 의해 측정되는 바와 같이, 90% 이상의 M-CIF를 함유하였는데, 4.0 EU/mg 이하의 내독소 농도를 가지고 있었다.

실험에 사용되는 M-CIF의 회분(batch) 및 벡터
M-CIF 벡터	회분 번호	순도(SDS-PAGE)(%)	내독소 레벨(EU/mg)	완충액 함량(NaOAc; NaCl)
1. 바큘로바이러스	B8	＞95	4.0	40 mM, pH 5.5, 500 mM
2. 바큘로바이러스	B9	＞95	0.2	40 mM, pH 5.5, 150 mM
3. 바큘로바이러스	B11`	＞90	2.4	40 mM, pH 5.5, 150 mM
4. E.coli	E1	95	0.04	40 mM, pH 6.0, 400 mM
5. CHO	C1	＞95	0.75	50 mM, pH 6.5, 500 mM

동물. Balb/c 및 CF-1 마우스(미국 인디아나주 인디아나폴리스 소재의 Harlan Sprague Dawley로부터 구입함)와 Balb/c scid/scid(SCID) 마우스(미국 매릴랜드주 프레드릭 소재, Animal Production Facility at National Cancer Institute/Charles River로부터 구입함)을 사용하여 3가지 실험을 하였다. 모든 마우스는 연령이 8 내지 12주인 것을 사용하였고, 수돗물에 자유롭게 접근하도록 하고 표준 실험실 식이법을 유지 보존하였다. 동물은 12시간의 광 주기(오전 6시부터 오후 6시까지 광을 비추어줌)로 실내에 필터 톱을 구비한 플라스틱 분리 칸막이 우리에서 조정된 조건 하에 두고 22℃ 온도 및 65% 습도로 유지되는 방 내에서 실험하기 전 1 주일 이상 사육하였다.

실험 설계. 0일 째 된 날, D-gal로 감작시키기 전(LPS 투여하기 1시간 전)에 노르말 농도의 염수 중에 용해된 다양한 투여량으로 LPS를 복강내(i.p.) 주입하여 마우스 내의 치사 패혈증을 유발시켰다. 다양한 벡터/회분으로로부터 취한 M-CIF를 상이한 투여량으로 연속 3일, 즉 -1일, 0일(LPS 투여하기 1시간 전) 및 1일 동안 매일 복강내(i.P.) 주입하였다. 완충액(40 mM 아세트산 나트륨, pH 5.5; 150 mM NaCl)을 접종한 마우스는 질병 대조군으로서 사용하였다. 동물을 LPS 항원 투여 후 120 시간 동안에 이환율 및 사망율에 대해 매일 3회 모니터하였다. 마우스의 생존율은 (생존한 마우스의 수/총 마우스)×100%로서 계산하였다.

결과

Balb/c 마우스내 패혈증 쇼크의 2가지 동물 모델에서 M-CIF의 효과

치사 쇼크의 제1 모델을 LPS(25 mg/kg, i.p.)로 마우스에 주입하여 유도하였다. 이러한 모델에서, 동물 85%가 LPS 주입한지 52시간 만에 죽었다. 3일 동안 매일 M-CIF(3 mg/kg, i.p.)로 치료한 것은 완충액 대조군의 것과 비교하여 40% 정도 치시율을 억제하였다(도 32). 치사 패혈증의 제2 모델은 D-gal(20 mg/마우스, i,p.) 감작시킨 후 1 시간 경과한 다음, LPS(1 ㎍/마우스, i.p.)를 마우스에 주입함으로써, 유도하였는데, 모든 동물은 LPS 투여한지 8시간 이내에 전부 죽었다. 마우스를 M-CIF(1 mg/kg. i.p.)로 3일 동안 유사한 투여 섭생으로 예비치료한 것은 염수 대조군의 것에 비하여 50% 치사율을 억제하였는데, 단일 투여 치료는 마우스의 25% 치사율만을 억제하였다. 또한, M-CIF를 LPS(1 ㎍/마우스) 또는 D-gal(20 mg/마우스)과 함께 사용하여 치료하는 연합 치료는 동물에 있어서 이환율 및 사망율 징후를 전혀 나타내지 않았는데, 이것은 M-CIF 제제 중의 내독소 레벨을 무시할 수 있을 정도임을 의미한다(표 2).

군	균주	M-CIF ip1 mg/kg	D-gal ip20 mg	LPS ip1 ㎍	NaCl ip1 ml	생존율(생존수/총수)
						8hr 이내	11hr 이내	22hr 이내
1	BALBL/c	-	+	+	-1, 0, +1	0/4	0/4	ND
2	BALBL/c	0	+	+	+	2/4	1/4	ND
3	BALBL/c	-1, 0, +1	+	+	-	2/4	2/4	ND
4	BALBL/c	-1, 0, +1	+	+	-	4/4	4/4	ND
5	BALBL/c	-1, 0, +1	+	-	-	4/4	4/4	ND
마우스는 연속 3일, 즉 LPS 투여하기 1일 전인 -1일, LPS 투여하기 1시간 전인 0일, 및 LPS 투여한 후의 1일(-1일, 0일, +1일) 동안 약물을 투여하였다. ND=수행하지 않음

패혈증에 대한 M-CIF의 억제 효과는 동물주와 무관한다. 또한, CF-1 마우스를 D-gal 감작된 LPS 유도 치사 쇼크 모델에 사용하였다. Balb/c 마우스와 달리, CF-1 마우스의 50%만이 염수 대조군에서 LPS투여한 후 11시간이 되어 치사를 나타내기 시작하였고, 연속 3일 동안 일일 용량으로 M-CIF를 추가 투여하면 모든 마우스가 죽는 것을 억제하였다(표 3). 이 실험 결과에 의하면, 인간 M-CIF는 쥐의 동족체와 아주 밀접할 수 있고, 패혈증에 대한 M-CIF의 보호 효과는 동물주 선택성이기보다는 오히려 광범위한 일반 현상이다.

그룹	균주	M-CIF 복강내1 ㎎/㎏	D-gal 복강내20 ㎎	LPS 복강내1 ㎍	NaCl 복강내0.1 ㎖	8시간 생존한 개체수/총수	11시간 생존한 개체수/총수	22시간 생존한 개체수/총수
1	CF-I	-	+	+	-2,-1,0	4/4	2/4	2/4
2	CF-I	-2,-1,0	+	+	-	4/4	4/4	4/4
3	CF-I	-2,-1,0	-	+	-	5/5	5/5	5/5
3일 연속, 즉 LPS 투여 2일전(-2일), LPS 투여 1일전(-1일) 및 LPS 투여 1시간 전(0일)에 마우스에 주입하였다(-2, -1, 0).

LPS 투여량에 따른 M-CIF의 패혈증 쇼크 예방 효과.

대규모 실험에서, Balb/c 마우스에게 LPS 일회 투여량(25 ㎎/㎏)을 복강내로 투여하였는데, 이 그룹에서의 치사율은 90%였다(도 33). M-CIF 10 ㎎/㎏로 매일 3일 연속하여 사전 처리하므로써 치사율이 70% 까지 예방되었다(도 36).

치사성 패혈증에 대한 M-CIF의 투여량 의존 효과,

이 대규모 실험은 LPS를 25 ㎎/㎏ 투여한 Balb/c 마우스에 기초한 것이다. LPS를 주입한 지 48 시간 내에 완충제 대조군은 100% 치사하였다. 대조적으로, M-CIF 1 ㎎/㎏으로 처리한 마우스는 동일한 기간 내에 아직 40%가 생존하였으며, 5일째에 이 그룹의 모든 마우스가 치사하였다. 또한, M-CIF를 3 및 10 ㎎/㎏으로 투여하는 경우 마우스의 치사성 쇼크를 각각 50% 와 65% 예방하였다(도 34).

Balb/c SCID 마우스의 패혈증을 예방할 수 있는 M-CIF.

B 및 T 림프구가 결핍되어 있는 SCID 마우스에게 LPS 20, 30, 40 또는 50 ㎎/㎏을 복강내 주입하여 최적 치사율을 측정하였다. 정상의 Balb/c 마우스와 달리, LPS 20 ㎎/㎏이 주입된 마우스는 M-CIF 처리(n = 8) 유무에 관계없이 죽지 않았다. LPS 30 ㎎/㎏ 그룹에서는 단지 30%만 치사한다는 것이 관찰되었으며, M-CIF 3 ㎎/㎏로 추가 처리하므로써 모든 SCID 마우스의 쇼크를 방지하였다. LPS 투여량을 추가로 40 ㎎/㎏까지 증가시킴에 따라, 면역 결핍성 마우스의 완충 대조 그룹은 80%의 치사율을 나타내었으며, M-CIF 3 ㎎/㎏로 3일간 연속하여 추가 처리하므로써 마우스의 치사를 40% 방지하였다(도 35A 및 도 35B). LPS 투여량이 50 ㎎/㎏인 경우, 정상의 Balb/c 마우스와 마찬가지로 완충제 대조군에서의 모든 SCID 마우스가 24 시간내에 치사하였으며, 추가의 M-CIF 처리에 의해서도 5 마리의 동물중 한 마리도 치사를 막을 수 없었다.

상이한 벡터 제제로 제조된 M-CIF의 일관된 패혈증 억제 효과.

이. 콜리 및 CHO 발현 벡터로 제조된 M-CIF 단백질을 Balb/c 마우스에서 LPS 유도된 치사성 패혈증에 대해 시험하였다. 25 ㎎/㎏ LPS 투여한 후 48 시간 내에 100% 치사율을 보이는 완충제 대조군에 비해, CHO 벡터로부터 유도된 M-CIF(1 ㎎/㎏)는 동일한 기간 동안 마우스 치사율을 60% 까지 억제하였으며, LPS 주입후 3일 내에는 50% 억제하였다. 또한, 이. 콜리 벡터로부터 얻은 단백질을 동일한 양으로 투여하므로써 마우스의 치사성 쇼크를 25% 까지 억제하였다. 그러나, 이 M-CIF 제제는 서로 다른 두개의 벡터로부터 유도된 물질에 비해 덜 강력하므로, 단백질 발현 및 정제 과정(도 36) 중 큰 변화가 일어날 수 있다(도 36).

실시예 19

신장 손상시 M-CIF의 변조

TNF-α가 사구체 손상의 몇가지 유형의 병인론에 연관된다는 것을 알았으며[Martin, 등., Clin. Exp. Immunol. 2:283-288(1995); Ortiz, 등., Adv. Nephrol. Necker. Hosp. 24:53-77(1995); Karkar 등., Kidney Int. 44:967-973(1993); Nikolic-Paterson, 등., Kidney Int. 45:S79-S82(1994); Egido, 등., Kidney Int. 43:S59-S64(1993)], 장세뇨관 신장염, 섬유증 및 신장의 동종이식편 거부반응[Baud, 등., Miner. Electrolyte Metab. 21:336-341(1995); Tang, 등., Lab. Inbest. 70:631-638(1994); Wilson, in The Kidney, Brenner, ed., Philadelphia, W. B. Saunders Company, p. 1253(1996); Perkins, 등., in The Kidney, Brenner, ed. Philadelphia, W. B. Saunders Company, p. 2576(1996)]에서 중요한 역할을 할 수 있다. 신장 질병의 개시 및 진행을 변형시키는 데 있어서 M-CIF의 효능을 조사하기 위해, 반월형 사구체신염, 병소 사구체경화증, 대상(帶狀) 사구체경화증(FSGS) 및 약물 유도된 간질성 신염에 대한 동물 모델을 사용하였다.

항 GBM 질병 모델을, 특히 사구체 반월형을 전개하기 쉬운 래트(WKY)의 균주에서 유도하였다[Huang 등., Kidney Int 46:69-78(1994); Bolton 등., Kidney Int 44:294-306(1993)]. 이 연구에서 사용된 항체는 뉴질랜드산 화이트 토끼 암컷에서얻었다. 이 토끼을 최하 멤브레인에 풍부한 신장 침전물로 반복하여 면역시켰다[Schreiner, 등., J.Exp. Med. 147:369-384(1978)]. 그 면역 혈청을 56℃에서 30 분간 열불활성화하고 래트 적혈 세포를 흡수시켜서 얻은 혈청을 신독성의 혈청(NTS)이라 칭하였다. 정상의 WKY 래트 수컷(125 ∼150 g)에게 NTS를 이하신염 유발성 투여량으로 일회 정맥내 주사하였다. 투여량은 루이스(Lewis) 래트에서 즉각적인 사구체 손상을 일으키지 않도록 선택한다.

공지된 방법에 따라, NTS를 WKY 래트에 투여하면, 30 분내에 대식세포는 사구체를 침윤시키며, 10 일간에 걸쳐 개체수가 증가한다. 48 시간내에 사구체 세포과다 현상이 반드시 나타나서 6일째에는 괴사하며 초기의 반월형이 형성된다. NTS를 투여한 지 10 일째에 사구체의 대부분이 확산하여 증식성 사구체신염을 보였다.

질병 진행을 변경시키는 M-CIF의 효능을 시험하기 위해, 래트에게 NTS를 투여한 후, 매일 M-CIF 또는 위약(僞藥)을 복강내 주사하였다. 단백뇨와 TNF α농도를 각각 평가하기 위해 뇨와 혈청을 매일 수거하여 질병 진행을 모니터하였다. TNS 투여 후 30분 내지 10일의 다양한 기간으로, 래트를 치사시키고, 대식세포 및 T세포에 대해 특이적인 시판용 단일클론 항체를 사용하여 동결 구간을 면역조직학적 검사를 하여 평가하므로써 그 침윤 세포를 감정하였다.

만성 아미노뉴클레오시드 신증의 모델을 진행성 병소 사구체경화증 및 대상성 사구체경화증의 기본형으로 사용하였다. 이 모델에서, 대식세포는 신장 피질을 침윤시켰는데, 이 때 TNF- α농도가 증가하였으며, 내피 수용체 유전자 발현이 증가되는 것이 밝혀졌다[Diamond, 등., Am. J. Pathol. 141:887-894(1992); Diamond, 등., Lab. Invest. 64:21-28(1991); Nakamura 등., J. Am. Soc. Nephrol. 5:1585-1590(1995)]. 체중 125 내지 150 g의 스프라구-다우리 래트 수컷을 이 연구에 사용하였다. 이들 래트에 푸로마이신 아미노뉴클레오시드(50 ㎎/㎏; 미국 미주리주 세인트 루이스에 소재한 시그마 케미칼 컴파니)를 3 분간 우경정맥을 통해 일회 정맥내 주입하였다. 2 주내에 동물은 단백뇨와 심각한 관장 이상을 보였으며 대식세포의 유입을 보였다. 단백뇨 기간은 감소될 것이며 그 후, 18 주 까지 다시 나타날 것이다. 이 때, 사구체의 44%가 병소 사구체경화증과 대상 사구체경화증을 나타낸다[Diamond, 등., Kidney Int. 32:671-677(1987)].

이 진행성 신장 손상을 막는 M-CIF의 성능을 시험하기 위해, 래트에 푸로마이신 아미노뉴클레오시드를 정맥내로 주입한 후, M-CIF 또는 위약 중 어느 하나를 매일 복강내 주입하였다. TNF-α의 단백뇨와 혈청 농도를 18 주 연구 기간동안 소정의 간격으로 모니터하였다. 다양한 시점에서 래트를 치사시키고 대식세포 및 T-세포에 대한 시판하는 단일클론 항체를 사용하여 신장 구간에서 신장 피질 침윤을 검사하였다. 형태 이상 정도는 눈을 가린 유형의 두 개체에 의해, 그리고 컴퓨터화된 체형측정 단위를 사용하는 것에 의해 헤마톡실린 및 에오신으로 염색한 표준 파라핀 구간에서 평가하였다.

육아종 형성을 유도하는 신장 세관에 대한 세포 중재된 면역 손상 모델을 통해 약물 유도된 간질 신염을 회복시키는 M-CIF의 효능을 평가하였다. 140-180 g의 브라운 노르웨이 래트 수컷을 전술한 바와 같이 이 모델로 사용하였다[Rennke,등., Kidney Int. 45:1044-1056(1994)]. 헵텐계 분자(ABA)를 표적 항원으로 사용하였다. 면역원(ABA-KLH)을 생성하기 위해, p-아르사닐산(미국 뉴욕주 록체스터에 소재한 이스트맨 코닥 컴파니) 31.4 ㎎을 1 N HCl 2.5 ㎖ 중에 용해한 후, 아질산나트륨을 서서히 첨가하여 디아조화함으로써 ABA를 활성화하였다. 붕산염 완충 염수 20 ㎖ 중에 500 ㎎을 용해시키고, pH를 9,2로 조절하므로써 열쇠고리 꽃양산조개 헤모시아닌(KLH)(미국 캘리포니아주 라졸리에 소재한 칼비오켐 코포레이션)의 용액을 제조하였다. 디아조화된 아르사닐산을 서서히 첨가하고, 60 분후에 그 혼합물을 인산염 완충 염수에 대해 투석하였다. 얻어진 ABA-KLH를 사용할 때 까지 -20℃에서 분획으로 동결시켰다.

H37Ra 미코박테리움 투베르쿨로시스(미국 미시간주 디트로이트에 소재한 디프코 라보라토리즈) 5 ㎎/㎖를 함유하는 완전 프로인트 보조액 중에 유화시킨 ABA-KLH 1 ㎎을 래트의 꼬리 하부 피하내로 접종하였다. 접종 후 10 일째에 왼쪽 신장을 0.05 ㎎/㎖ 베라파밀, 활성화 ABA(pH 8.1의 붕산염 완충 염수 용액 중의 4 mM 용액) 2 ㎖ 및 0.05 ㎎/㎖ 베라파밀을 함유하는 인산염 완충 염수 1 ㎖을 사용하여 연속적으로 신장 피질을 통해 관류하였다.

이를 달성하기 위해, 레트를 마취시켜서, 가열된 수술 테이블 상에 놓고, 개복 수술을 실시 하였다. 왼쪽 신장관을 분리하고, 헐거운 덫을 왼쪽 신장 정맥 및 복대동맥 둘레에 위치시켰다. 왼쪽 신장 동맥에 30 게이지 니들을 구비한 캐눌라를 삽입하고, 대동맥과 신장 정맥 둘레의 덫을 폐쇄하였다. 그 후, 1.1 ㎖/분의 속도로 왼쪽 신장의 탈체 관류가 일어났으며, 그 후, 유출물을 일시적으로 결찰된 완쪽 신장 정맥의 개구를 통해 배수하였다. 울혈을 회복하고 결찰사를 방출한 후, 1 내지 2 분내에 신장을 재관류하였다. 24 시간내에, 다형핵 백혈구 및 단핵 세포로 구성된 온화하지만 확산성인 염증성 세포 침윤물이 생성되었다. 5 일까지는, 단핵구 및 대식세포가 주류를 이루었다. 이 때(5 일), 신장 피질 75%가 육아종 염증과 관련되었다.

이 모델에서 M-CIF의 효능을 시험하기 위해, M-CIF 또는 위약을 복강내로 매일 투여하였다. 다양한 시간으로 래트를 치사시키고, TNF-α의 혈청 농도를 정량하고, 염증성 과정과 연관한 신장 피질 양을 컴퓨터화 체형측정 단위를 사용하여 헤마톡실린 및 에오신으로 염색한 표준 파라핀 구간에서 평가하였다. 침윤성 염증 세포를 단핵구/대식세포에 대한 시판용 단일클론 항체를 사용하여 조직학적 구간에서 확인하였다. M-CIF는 신장 손상시, 감소된 염증을 제공할 것으로 예측된다.

실시예 20

M-CIF에 의한 레트의 보강 관절염에서의 만성 괄절 염증 방지

류마티스양 관절염에서, 통증 및 팽윤은 현재 시판하는 약물에 의해 대개 제어될 수 있으나, 이 질병과 관련한 진행성 관절 파괴를 중지시키는 것은 어렵다. 그러므로, 뼈 및 연골 파괴에 근거한 세포 메카니즘 및 분자 메카니즘을 더욱 구체적으로 억제하는 경우, 많은 노력을 요하였다. 레트에서의 프로인트의 보조액 유도된 관절염 모델은 증식성 활막염과, 궁극적으로 연골 및 뼈 부식을 초래하는 극도의 팽윤이 존재하므로 관절염 환자들과 많은 특징을 공유한다[Pearson & Wood, Arthritis Rheum. 2:440(1959); Jones & Ward, Arthritis Rheum. 6:23(1963)]. 인간의 류마티스양 관절염에서와 같이, 대식세포는 보조 관절염을 갖는 래트의 염증성 활액막 중에 풍부하게 존재한다[Johnson 등., Arthritis Rheum. 29:1122(1986)]. 대식세포는 조직-분해 효소 또는 전구 염증성 시토킨을 분비하는 것에 의한 조직 파괴의 대사인자 세포로서[Lopex-Bote 등., Arthritis Rheum. 31:769(1988)] 또는 항원 추진 응답의경로에서 면역 조절 기능에 의한 조직 파괴의 대사인자 세포로서[Unanue & Allen, Science 236:551(1987)] 관절염에서 중요한 역활을 하는 것으로 여겨진다. 이 동물 모델은 뒷발 팽윤(급성 염증의 척도로서) 및 만성 관절 손상에 대한 연골 및 뼈의 조직병원성 변형 분량을 정량하므로써 항 염증성 약물 및 면역 억제 약물을 감지하는 데 사용되어 왔다. 이 연구에서, 연구자들은 보조 관절염 래트 모델에서, 급성 및 만성 염증성 관절염 모두에 대한 M-CIF의 효과를 시험하였다.

0 일째에, 다자란 수컷 루이스 래트(120∼150 g)에게 미코박테리움 부티리컴(미국 미시간주 디트로이트에 소재한 디프코 랩)을 5 ㎎/㎖의 농도로 광유에 첨가하므로써 제조한 완전 프로인트 보조액을 꼬리 아래의 피부내로 주입하였다. M-CIF 또는 그 완충액을 래트의 복강내로 매일 전술한 바와 같이 0 일 내지 16 일 또는 0 일 내지 40 일동안 주입하였다. 투여량 1 ㎎/㎖로 인도메타신 또는 그것의 메틸셀룰로오스 부형제를 다른 그룹의 래트에 매일 경구 투여하였다. 뒷발이 팽윤하는 것을 체적변동기록계 챔버(미국 뉴욕주 트로이에 소재한 바속소 일렉트로닉스)를 사용하여 측정하였다. 뒷발 부피는 양 뒷발의 부피의 평균 및 발 부피의 % 변화로서 표현하였다.

실험의 끝무렵에, 복사뼈 및 발목 관절을 절개하여 조직학적 평가를 하였다. 두명의 연구가는 하기 파라미터, 즉 혈관 확장, 섬유증/섬유증식증, 과형성/비대증, 혈관주위 림프양 응집, 판누스 형성, 연골 파괴 및 뼈 파괴를 통해 눈을 가린 유형으로 병인성 변화와 뼈 및 연골의 변형을 평가하였다. 변화의 정도와 분포를 분화시키는 데 사용되는 주관적인 반정량의 점수 시스템을 다음과 같이 정의하였다: 0 = 정상; 0.5 = 약함; 1 = 중간 정도; 2 = 심함; 및 3 = 매우 심함.

첫번째 연구에서, 0 일 내지 16 일동안 동물을 처리하였다. 그것들의 복사뼈에서 14 일째(시험한 첫번째 기간)에 팽윤이 나타났으며 16 일 내지 20 일이었을 때 최대로 심각한 정도에 도달하였다. 이 기간 후, 급성 염증은 서서히 진정되었다. 복사뼈 팽윤에 대한 M-CIF의 효과를 도 37에 도시하였다. 모든 M-CIF 투여량에서 뒷발 팽윤은 중간 정도로 감소하였으나, 인도메타신은 부종을 더욱 효과적으로 감소시켰다. 예비 연구에서, 각 그룹에서 두마리 동물로부터 얻은 다리들을 조직병리학적 점수로서 평가하였으며 그 결과를 도 38에 도시하였다. 급성 특징과 만성 특징을 모두 고려하여, 0 일로부터 16 일동안 M-CIF로 처리된 동물들은 완충제 대조근에 비해 총 관절 염증이 현저히 감소하는 것을 보여주었다.

이러한 결과를 근거로, 래트를 실험 기간 내내(0 일로부터 40 일 까지) 매일 처리하는 두번째 실험적인 프로토콜을 사용하였다. 이 연구의 끝 부분에, 한 그룹당 5 마리 동물로부터 얻은 다리에 대해 조직병리학적 평가를 하였다. M-CIF를 매일 3 ㎎/㎏의 투여량으로 투여하는 경우, 그것의 완충제 대조군에 비해 만성 활막염이 현저히 감소하였으며(도 39), 뼈 및 연골 부식이 현저히 감소하였다(도 40). 인도메타신은 만성 관절염의 조직병리학에 있어서 어떠한 효과도 보여주지 못했다. 그러므로, M-CIF는 비록 만성 부종에는 단지 완화적인 영향만을 미치나, 관절염의 만성 특징에 현저한 억제 효과를 보여주며, 가장 중요하게는 뼈 및 연골 부식을 뚜렸하게 억제하였다.

DBA/l 마우스에서의 유형 II 콜라겐-유도 관절염 전개를 예방하는 M-CIF 처리.

소의 유형 II 콜라겐과 완전 프로인트 보조액으로 된 용액 2 ㎎/㎖와 동일한 부피를 사용하여 에멀션을 제조하였다. 5 내지 6 주된 DBA/lLacJ 마우스 암컷의 꼬리 아래에 상기 에멀션 100 ㎕를 피부내로 접종하였다. 18 일 후, 마우스들을 10마리씩 3개의 그룹으로 나누고, 복강내로 인도메타신, M-CIF 또는 대조 완충액을 각각 3 ㎎/㎖ 씩 주사하였다. 이 주사 과정을 14일간 반복하였다. 이 처리를 시작한 지 2일만에(연구를 시작한지는 20일 됨) 마우스에게 LPS 60 ㎍을 총부피 100 ㎕의 a.s.c 주사액으로 투여하였다. 동물들을 검사하고 그것의 임상적 상태를 하기 점수 시스템을 사용하여 관절염의 전개에 대해 반정량하였다.

빈도수=(영향을 받은 하나 이상의 뒷발을 가진 마우스 수/마우스 총수)×100

임상적 경중도 점수 상태

0.5 -발가락이 하나 이상 팽윤함

1.0 -모든 발이 팽윤함

2.0 -염증 진정 후 변형이 관찰됨

3.0 -관절강직: 발의 관절 기능 완절 소실

도 41에 도시된 바와 같이, 약 70%의 마우스가 M-CIF와 그것의 완충제 처리된 군에서 LPS 투여후 4 내지 10일째에 급성 발 부종을 나타내었다. 그러나, 이러한 급성 염증의 심각성은 완충제 처리된 군에서 보다 M-CIF 처리된 마우스에서 덜 현저하였다(도 42). 시간 경과에 따라, 완충제 처리된 그룹의 빈도수 및 심각성이 증가하는 한편, M-CIF 처리된 동물에서는 개선되었다. 양성 대조군으로 사용되는 인도메타신 또한 빈도수와 심각성 모두에서의 감소는 예측한 바와 같이 효과적이었다.

토론.

보조약 및 콜라겐 유도 관절염은 통상의 임상학적 특징 및 조직병리학적 특징을 갖는 류마티스양 관절염의 실험 모델에서 광범위하게 사용된다. 류마티스양 관절염에서, 고통과 팽윤은 일반적으로 현재 입수 가능한 약물에 의해 조절될 수 있으나, 이 질병과 관련한 진행성 관절 파괴를 중지시키는 것은 어려웠다. 그러므로, 뼈 및 연골 파괴에 근거한 세포 메카니즘 및 분자 메카니즘의 더욱 구체적으로 억제하는 경우, 많은 노력을 요하여 왔다. 관절염의 만성 특징에 대한 M-CIF의 억제 효과, 가장 중요하게는 관절 기형 및 파괴를 유도하는 뼈 및 연골 부식에 대한 억제 효과는 M-CIF가 인간의 류마티스양 관절염과 같은 만성 염증성 관절염에 대한 치료제로서 탁월하다는 것을 암시한다. 비록 M-CIF만이 급성 부종에 대해 완화적인 효과를 갖기는 하나, M-CIF와 NSAID을 병용한 치료는 급성 상태의 관절염(예, 고통 및 팽윤)과 진행성 관절 파괴 모두에 유리할 수 있다. 따라서, M-CIF는 염증 및 고통과 같은 관절염의 만성적인 특징을 억제한다는 사실을 알았다.

실시예 21

전신계 TNF-α생성에 미치는 M-CIF의 억제 효과

패혈증 쇼크는 이환율 및 사망률이 높은 질병으로서, 혈액을 지닌 박테리아 감염에 감응하여 시토킨의 방출이 조절되지 않음에 따른 것이다. 박테리아성 내독소는 그램 음성 패혈증 쇼크의 병인론에서 주요 인자로서 인식된다[Morris & Ryan, Annu. Rev. Med. 38:417- 1987; Wolff & Bentett, N. Engl. J. Med. 291:733(1974)]. 그것은 TNF-α 및 기타 시토킨을 생성하기 위한 내독소에 대해 감응하는 대식세포에 의해 중재되는 것으로 보인다[Freudenberg 등., Infect. Immun 51:891(1986); Tracey 등., Nature(Lond). 330:662(2987)].

초기의 연구는 M-CIF로 마우스를 전신계 치료하므로써 2가지 동물 모델에서 LPS 유도된 치사성 쇼크를 크게 예방한다는 것을 보여준다. TNF-α생성은 패혈증 쇼크에서 중추적인 역할을 하므로, 본 연구가들은 M-CIF가 TNF-α생성을 방해하는지에 대해 의문을 가졌으며, 이로써 생체내에서 TNF-α중재된 내독성 쇼크가 억제되었다.

생체내.

7 내지 8주 된 암컷 Balb/c 마우스에게 첫날(0 일)에 염수 중의, 이. 콜리 혈청형 0127:B8(미국 미주리주 세인트 루이스에 소재한 시그마 케미칼 컴파니)로부터 얻은 리포폴리사카라이드(LPS) 25 ㎎/㎏을 투여하였다. M-CIF 또는 그것의 완충액을 LPS 주입 1 일 전과 1 시간 전에 복강내 투여하였다. 4 마리의 마우스로 이루어진 그룹은 LPS 투여한 지, 1, 2 및 4 시간째에 치사시켰다. 혈청을 역 신경총(retorbital plexus)으로부터 얻었으며 미국 매사츄세츠주 캠브리지에 소재한 겐짐 코포레이션에서 구입한 ELISA 키트를 사용하여 TNF-α농도를 측정하였다. 제조업자들이 설명한 바대로 분석을 수행하였다. 각각의 시료를 1:4로 희석하고, 복제 웰내에서 분석하였으며, 그 결과를 짝을 이루지 않은 T 시험을 통해 분석하였다. 데이타를 평균값 + SEM으로 표현하였다.

도 43에 도시한 바와 같이, 완충제 대조군에서의 혈청 TNF-α농도는 LPS 주입후 1 시간일 때 가장 높았으며, 그 후, 빠르게 감소하였다. 대조적으로, M-CIF 3 ㎎/㎏을 주입한 마우스는 LPS 주입후 1 시간째에 완충액 대조군에서 보다 그 혈청 내에서의 TNF-α의 농도가 현저히 낮았다. M-CIF 1 ㎎/㎏로 처리한 동물들은 그 농도가 감소되었으나, 통계학적으로 현저한 차이를 보이지는 않았다.

전신계 TNF-α생성에 M-CIF가 미치는 억제 효과는 M-CIF가 LPS 유도된 마우스의 패혈증 쇼크를 막는 메카니즘의 일면이 될 것으로 예상되며, 이 효과는 류마티스양 관절염 및 골관절염과 같은 자가면역 염증성 질병을 치료하는 유리할 것이다.

시험관내.

4 내지 6 주 된 암컷 Balb/c 마우스들을 한 그룹당 10 마리씩 2 그룹으로 만들었다. 그 그룹에게 부형제 대조군을 복강내로 주사하거나 또는 M-CIF 3 ㎎/㎏을 이틀 연속으로 주사하였다. 두번째 주사한 지 1 시간 후, 마우스를 치사시켜서 존재하는 세포를 수거하기 위해 복막 공동 관류법을 실시하였다. 그 후, 세포들을 세척하고 배양 배지(RPMI 1640/20% FBS) 내에서 밀도 1 ×10⁶(세포)/㎖로 재현탁시켰다. 그 후, 세포를 48개의 웰 플레이트에 평판배양하고 LPS의 존재(1 및 10 ng/㎖) 또는 부재하에서 하룻밤동안 항온시켰다. 18 시간 후, 각 웰로부터 얻은 상청액을 수거하여 동결 상태로 사용전까지 저장하였다. 상청액 중의 TNF-α함량을 측정하기 위해 제조업자(미국 매사츄세츠 캠브리지에 소재한 겐짐 다이아그노스틱스)가 명시한 바대로 ELISA 법을 실행하였다. 도 44에 도시한 바와 같이, M-CIF 처리된 동물로부터 분리한 후, 시험관내에서 LPS로 처리한 세포는 대조 마우스로부터 분리한 세포가 분비하는 것 보다 통계학적으로 현저히 낮은 분량의 TNF-α를 분비하였다.

따라서, M-CIF는 생체내에서 TNF-α생성을 억제하는 성능을 갖는다. 이 활성은 독성 염증 및 만성 염증에 대해 매우 유리할 것이다. 전술한 TNF-α농도를 순환시키면서 데이타로 취합하므로써, 메카니즘의 일면을 설명할 수 있는데 이 메카니즘에 의해 M-CIF는 LPS 유도된 패혈증을 예방한다. TNF-α농도 증가는 광범위한 면역 세포 질병 또는 반응과 관계하므로, M-CIF 치료는 본 명세서에서 전술한 바와 같은 질병 증세에 대해 사용할 수 있다.

최근 연구에서는, TNF-α또는 가용성 TNF-α수용체에 대한 항체를 사용하므로써 TNF-α활성을 억제하는 효과를 입증하였다. 이들 질병은 급성 췌장염, 동종이식편 거부, 비인슐린 의존성 당뇨병(NIDDM), 천식, 피부에서의 지연성 과민 반응, 폐 섬유증 및 허혈/재관류 손상을 들 수 있다. 대조적으로, TNF-α는 간 재생에 파라크린 역할을 하며 일부 환경에서는 피부 및 심장 동종이식편 거부반응을 억제한다. 따라서, M-CIF 또는 그것의 작용물질은 이러한 질병 증상에 유리할 것으로 기대된다.

실시예 22

생체내 T-림프구에 대한 주화성 물질로서의 M-CIF

4 내지 6 주 된 암컷 Balb/c 마우스들을 한 그룹당 10 마리씩 4 그룹으로 만들었다. 그 그룹에게 부형제 대조군을 복강내로 주사하여 M-CIF 미처리하거나 또는 6 일간 연속으로 M-CIF 1 또는 3 ㎎/㎏을 주사하였다. 7 일째에 마우스를 치사시켜서 존재하는 세포를 수거하기 위해 복막 공동 관류법을 실시하였다. 총 세포수를 계산하고, 세포들을 다음과 같은 단일클론 항체의 패널들을 사용하여 세포 표면 염색을 수행하였다. CD3, CD4, CD8, Macl, GR1, B220, MHC 클래스 II, CD14, CD45 및 CD5(미국 캘리포니아주 산디에고에 소재한 파르밍겐).

도 45에 도시한 바와 같이, 복강내의 총 세포 수가 미처리 또는 부형제 처리된 대조군에 비해 2 내지 3 배 증가하였다. 이는 CD4, CD5 및 CD8에 대한 세포 표면을 염색에 의해 알 수 있는 바와 같이, T-림프구의 유입에 기인한 것으로 보인다. CD4 양성 세포의 급격한 증가(도 46 )뿐 아니라 CD5와 CD8 세포에서도 급격한 증가가 일어나서 T-림프구의 상대적인 숫자가 순 증가하였다(도 47(2)). 또한, MHC 클래스 II 양성이며, Macl 클래스 II 양성인 세포들의 아군집% 감소에 대응하여 Macl 양성이며, MHC 클래스 II 음성인, 복강내 세포들의 아군집은 현저히 증가하였다(도 48). 이는 또한 복강내의 MHC 클래스 II 음성이며, Macl 양성인 세포의 총 숫자에 반영된다(도 49).

따라서, M-CIF는 생체내 T-림프구에 대한 주화성 인자라는 것을 알았다. 이는 CD4, CD8 또는 T-세포의 아군집에 대해 가능하다. 이를 토대로, M-CIF는 이들 면역 세포 군집의 유인 및/또는 활성화로부터 유리한 질병 증상에 유리할 수 있다. 이는 박테리아 감염 또는 비루스 감염, 암 등을 들 수 있다. 또한, M-CIF가 CD4 림프구의 Th1 또는 Th2 서브클래스에 대해 특이적인 효과를 갖는다면, 이들 세포로부터 시토킨의 정상적인 생성은 변경될 수 있으며, 단핵구, 대식세포, 호산성 세포 및 기타 면역 세포와 같은 기타 면역 세포에 큰 영향을 미칠 수 있다.

Macl 양성 세포의 MHC 클래스 II 음성의 아군집이 M-CIF 처리 동물에서 증가한다는 사실은 이들 동물내의 단핵구 군집이 비활성화된 세포를 더 높은 %로 함유한다는 것을 암시한다. 이는 M-CIF 처리된 동물의 복막 세포가 LPS에 대해 감응하는 더 적은 양의 TNF-αFMF를 생성한다는 것을 보여주는 데이타와 일치한다.

실시예 23

MPIF-1에 의해 유도된 생체내 근원 세포 가동화

MPIF-1가 생체내에서 근원세포 가동화를 자극한다는 것을 입증하기 위해, 다음과 같은 실험을 수행하였다. 여섯마리의 마우스를 각 처리 그룹(C57Black 6/J, 암컷, 약 6 주령)으로서 사용하였다. 그 마우스의 복강내로 염수(부형제 대조군) 또는 MPIF-1를 마우스 1 마리당 5 ㎍으로 주사하였다. 30 분 후, 마우스의 피를 취해 코울터 계수기로 WBC에 대해 분석하였다. 그 후, 각 그룹의 6 마리의 동물 모두로부터 얻은 혈액을 수거하여 FACScan에 의해 Gr. 1+ 세포 및 CD34. Sca-1+ 이중 양성 세포들에 대해 분석하였다. WBC 계수는 평균 ±S.D.로서 표현하였고 FACScan 데이타는 전체 세포의 %로 표현하였다. CD34 Sca-1 + 이중 양성 세포는 조혈성 근원 세포인 것으로 예측되는 특성들을 보인다고 여겨지므로, 도 50에 도시한 결과는 근원 세포 가동화기로 사용할 수 있다.

실시예 24

M-CIF의 정제

CHO 발현 시스템으로부터의 정제

중국 햄스터 난소 세포에서 M-CIF를 발현시킨 후, 다음 과정을 거쳐 단백질을 정제하였다. 특별히 언급하지 않는한 정제 과정은 모두 5 내지 10℃에서 수행하였다. 형질 감염된 CHO 세포를 미세담체 배양 시스템(시토덱스 I, 파르마시아)을 사용하여 4 일간 HGS-CHO-3 배지 중에서 성장시켰다. 조정 배지를 저속 원심 분리하여 수확하므로써 세포 및 세포 조직파편을 제거하였다. 아세트산으로 pH를 7.0으로 조절한 후, 조정 배지를 인산염 완충 염수(PBS), pH 7.0으로 사전 평형화시킨 강한 양이온 교환 컬럼(Poros HS-50, Perseptive Biosystems Inc.) 상에 적재하였다. 그 후, 컬럼을 280 ㎚에서의 흡광도가 0.01 O.D.(10 CV) 이하가 될 때 까지동일한 완충액으로 세척하였다. 컬럼을 인산염 완충 염수, pH 7.0 중의 1 M NaCl로 세척하므로써 소정의 단백질을 용출시켰다. 그 후, 분획들을 4 내지 20% 구배 겔들을 통해 SDS-PAGE로 분석하여 소정의 폴리펩티드의 존재를 확인하였다.

M-CIF를 함유하는 분획으로 푸울을 형성한 후, 50 mM의 아세트산나트륨 및 150 mM의 NaCl을 함유하는 "크기 분리 완충액"(pH 6.0)으로 평형화된 Superdex-75 수지(파마시아)의 겔 여과 컬럼에 적재시켰다. 적재된 샘플은 컬럼 용적의 10%(V/V) 미만이었다. 샘플을 컬럼 내로 침투시킨 후, 동일한 완충액을 사용하여 겔 투과 매트릭스로부터 단백질을 용출시켰다. 분획을 수거하여, 유출액의 280 nm에서의 흡광도를 계속해서 관찰하였다. 이어서, A280에 의해 용출된 물질을 함유하는 것으로 확인된 분획을 SDS-PAGE로 분석하였다. M-CIF를 함유하는 분획을 0.62 컬럼 부피의 중심에 있는 피크에서 용출시킨 후 푸울을 형성시켰다.

겔 투과 크로마토그래피로부터 얻어진 푸울을 이룬 분획을 강 음이온(다공성 HQ-50, 퍼셉티드 바이오시스템즈)와 약 음이온(다공성 CM-20) 교환 컬럼 세트 상에 직렬 형태로 도포하였다. 상기 2개의 컬럼을 미리 평형화시킨 상태에서, 샘플을 적재시킨 후 50 mM의 아세트산나트륨 완충액(pH 6.0)으로 세정하였다. 이후, 양이온 교환 컬럼(CM-20)을 0.3M NaCl로 세정한 후 동일한 완충 시스템에서 0.3 M 내지 0.8 M의 NaCl 구배 용출 방식으로 용출시켰다. 용출된 분획은 SDS-PAGE로 분석하고, 해당 단백질을 함유한 분획은 혼합하였다.

상기 정제 단계 이후 얻어진 M-CIF는, SDS-PAGE 겔의 코마씨 블루 염색을 통해 측정한 결과 순도가 95% 이상이었다. 정제된 단백질은 또한 내독소/LPS 오염화에 대해서도 시험하였다. LPS 함량은, LAL 분석에 따른 정제된 단백질의 0.1 ng/mg 미만이었다.

M-CIF를 정제하는 데에는 대안적인 정제법도 또한 사용하였다. 이 방법은 하기 단계들을 포함하며, 특별한 언급이 없는 한 모든 과정은 5∼10℃에서 수행하였다.

CHO 배양물의 제조 과정을 완료한 후 저속 원심분리를 통해 세포/세포 잔편을 제거하여 조정 배지를 얻었다. 아세트산을 첨가하여 배지의 pH를 7.0으로 조절한 후, 인산염 완충 염수(PBS)(pH 7.0)로 예비 평형화된 강 양이온 교환 컬럼(다공성 HS-50, 퍼셉티브 바이오시스템스, 인코포레이티드) 상에 배지를 적재시켰다. 이후, 280 nm에서의 흡광도가 0.01 O.D.(10 CV) 미만이 될때까지 상기 컬럼을 동일한 완충액으로 세정하였다. 인산염 완충 염수(pH 7.0) 중의 1M NaCl로 컬럼을 세정하여 원하는 단백질을 용출시켰다. 이후, SDS-PAGE를 사용하여 4 내지 20%의 구배 겔을 통해 분획을 분석하여 M-CIF의 존재를 확인하였다.

이후, M-CIF를 함유하는 분획으로 푸울을 형성한 후, 10 mM의 아세트산나트륨(pH 6.5)를 4 부피%로 첨가하였다. 이후, 희석된 샘플을 이전에 제조한 강 음이온(다공성 HQ-50, 퍼셉티브 바이어시스템스) 및 약 음이온(다공성 CM-20, 퍼셉티드 바이오시스템즈) 교환 수지로 이루어진 직렬 컬럼 세트 상에 적재시켰다. 상기 컬럼을 50 mM의 아세트산나트륨(pH 6.5)으로 평형화시켰다. CM-20 컬럼을 0.2 M NaCl, 50 mM의 아세트산나트륨(pH 6.5) 5 컬럼 부피로 세정한 후, 0.2 M NaCl, 50 mM의 아세트산나트륨(pH 6.5) 내지 1.0 M NaCl 50 mM 아세트산나트륨(pH 6.5)의 10 컬럼 부피의 직선형 구배를 통해 용출시켰다. 용출제를 일정하게 A280으로 관찰하면서 분획을 수거하였다. 이어서, 해당 단백질을 함유한 분획(4∼20%의 SDS-PAGE로 측정)을 수거하였다.

이어서, M-CIF를 함유한 혼합 분획을, 100 mM의 NaCl, 50 mM의 아세트산나트륨(pH 6.5)로 평형화된 크기 배제 컬럼(Superdex-75, 파마시아) 상에 적재시켰다(V/V, 컬럼 부피의 5%). 샘플을 컬럼에 통과시킨 후, 100 mM의 NaCl, 50 mM의 아세트산나트륨(pH 6.5)을 사용하여 겔 투과 매트릭스로부터 용출시켰다. 분획을 수거하고, 용출액의 280 nm에서의 흡광도를 계속해서 관찰하였다. 이후, 용출된 물질을 함유하는 것으로 A₂₈₀에 의해 확인된 분획을 SDS-PAGE로 분석하였다. 이어서, M-CIF를 함유한 분획을 수거하였다.

상기 3단계의 정제 과정 후 얻은 M-CIF는, SDS-PAGE 겔의 코마씨 블루 염색법을 통해 측정한 결과 순도가 95% 이상이었다. 정제된 단백질은 또한 내독소/LPS 오염화에 대해서도 시험하였다. 정제된 단백질의 LAL 분석에 따른 LPS 함량은 0.1 ng/mg 미만이었다.

이. 콜리로부터 M-CIE의 정제

정제 과정에는 다음 단계들이 수반되며, 특별한 언급이 없는 한 모든 과정은 4∼10℃에서 수행하였다.

이.콜리 발효의 제조 과정을 완료한 후, 세포 배양물을 4∼10℃로 냉각시키고, 15,000 rpm (헤래우스 세파테크) 하의 연속 원심를 통해 세포를 수거하였다. 세포 페이스트의 단위 중량 당 단백질의 예상 수율과 필요한 정제 단백질의 양에 근거하여, 100 mM의 트리스, 50 mM의 EDTA를 함유하는 완충 용액(pH 7.4) 중에 적당량의 세포 페이스트를 현탁시켰다. 고전단 혼합기를 사용하여 세포를 균질한 용액으로 분산시켰다.

이어서, 상기 용액을 마이크로유동화기(APV 골린, 인코포레이티드 또는 마이크로푸이딕스 코포레이션 제공)에 4000∼6000 psi로 2회 통과시켜 세포를 용해시켰다. 이후, 균질화물을 NaCl 용액과 0.5 M NaCl의 최종 농도로 혼합한 후 15 분 동안 7000 g에서 원심 분리시켰다. 생성된 펠릿을 다시 0.5 M의 NaCl, 100 mM의 트리스, 50 mM의 EDTA(pH 7.4)를 사용하여 다시 세정하였다.

세정된 함유물은 1.5 M 구아니딘 염산염(GuHCl)로 2 내지 4 시간 동안 용해시켰다. 15 분 동안 7000 g 원심 분리시킨 후, 펠렛을 폐기시키고, M-CIF 함유 상등액을 다시 GuHCl로 추출하기 위해 하룻밤동안 4℃에서 방치하였다.

고속 원심 분리를 통해(30000 g) 불용성 입자를 제거한 후, 강력히 교반하면서 50 mM의 나트륨(pH 4.5), 150 mM의 NaCl, 2 mM의 EDTA를 함유한 완충액 20 부피와 GuHCl 추출물을 급속히 혼합하여 GuHCl 가용화된 단백질을 재중첩시킨다. 재중첩된 희석 단백질 용액을 추가로 정제시키기 전에 12 시간 동안 혼합하지 않고 4℃로 유지시켰다.

재중첩된 M-CIF 용액을 세정하는 데에는, 적당한 표면적을 가진 0.16 ㎛의 막 필터(필트론)가 설치되어 있고 40 mM의 아세트산나트륨, pH6.0에 의해 평형화된 이전에 제조된 접선 여과 유닛을 사용하였다. 여과된 샘플을 다공성 HS-50 수지(퍼셉티브 바이오시스템즈)의 양이온 교환기 상에 적재시켰다. 이어서, 컬럼을 40 mM의 아세트산나트륨(pH 6.0)으로 세정하고, 동일한 완충액 중에서 단계별로 250 mM, 500 mM, 1000 mM 및 1500 mM의 NaCl으로 용출시켰다. 용출액의 280 nm에서의 흡광도를 연속적으로 관찰하였다. 분획을 수거하여 SDS-PAGE로 더 분석하였다.

원하는 단백질을 함유한 분획을 수거하여 4 부피의 물과 혼합하였다. 희석된 샘플은 이어서 이전에 제조한 강 음이온(다공성 HQ-50, 퍼셉티브 바이오시스템즈)과 약 음이온(다공성 CM-20, 퍼셉티드 바이오시스텝즈) 교환 수지의 직렬 컬럼 세트 상에 적재시켰다. 상기 2개의 컬럼은 40 mM의 아세트산나트륨(pH 6.0)으로 평형화시켰다. 상기 2개의 컬럼에서 모두 40 mM의 아세트산나트륨(pH 6.0), 200 mM의 NaCl로 세정하였다. 이후, 0.2 M의 NaCl, 50 mM의 아세트산나트륨(pH 6.0) 내지 1.0 M의 NaCl, 50 mM의 아세트산나트륨(pH 6.5) 범위의 10 컬럼 부피 직선형 구배 방식을 사용하여 CM-20 컬럼을 용출시켰다. 용출액을 A280으로 일정하게 관찰하면서 분획을 수거하였다. 이어서, 해당 단백질을 함유한 분획(16% SDS-PAGE로 측정)을 수거하였다.

상기 재중첩 및 정제 단계 이후 생성된 M-CIF의 순도는 95% 이상이었다. 5 ㎍의 정제된 단백질을 적재시키자, 코마씨 블루 염색된 16% SDS-PAGE 겔로부터 주요 오염물 밴드가 전혀 관찰되지 않았다. 또한, 정제된 단백질은 내독소/LPS 오염화에 대해서도 시험하였다. LAL 분석 결과, LPS 함량은 0.1 ng/ml 미만이었다.

실시예 25

인간 세포 및 마우스 세포의 M-CSF 자극에 의한 콜로니 형성을 투여량 의존 방식으로 억제하는 M-CIF

본 명세서에 기재된 바와 같이 선조 세포를 분리한 후 프로세싱하였다. 쥐의 대퇴골 및 경골로부터 골수 세포를 분리하고, 피콜 분리한 후 플라스틱 접착 세포를 고갈시켰다. 양 세포군을, 지시된 농도에서 M-CIF의 존재 하에 또는 부재 하에 M-CSF(5 ng/ml)가 있는 아가 함유 배지 중에 평판배양하였다. 데이타는, 샘플에 대해 2회에 걸쳐 측정한 평균 콜로니수 +/- S.D.로서 표현하였다,

마우스의 골수 세포에 대한 클론원성 분석

CFU-M 콜로니 형성 분석을 2층의 아가 배양 시스템에서 수행하였다. 지시된 농도의 M-CIF 또는 대조 베타족 케모킨의 존재 또는 부재 하에 20%의 FBS(미주리 세인트루이스 소재의 시그마 티슈 컬쳐 프로덕츠 제공), 0.5% Difco 및 15 ng/ml의 M-CSF가 강화된 MEM 배지를 사용하여 3.5 cm 직경의 조직 배양 접시에서 하부층을 제조하였다. 이어서, 0.3%의 아가을 함유하고 시토킨을 함유하지 않은 점을 제외하고는 상기된 바와 같이 한전 배지에서 제조한 쥐의 골수 세포 현탁액(10⁴세포/접시) 0.5 ml를 상기 층에 중첩시켰다. 이후, 상기 접시를 조직 배양 항온기(37℃, 88% N₂, 5% CO₂, 및 7% O₂)에서 7 일 동안 항온 처리한 후, 도립 현미경으로 CFU-M 콜로니의 수를 계측하였다.

인간의 CD34'에서 유도된 세포에 대한 클론원성 분석

새로 정제한 CD34' 세포(5x10⁴세포/ml)를, 인간의 IL-3(10 ng/ml) 및 인간의 SCF(50 ng/ml)가 강화된 Myelocult H5100 증식 배지(캐나다 뱅쿠버 소재의 스템 셀 테크놀로지스 인코포레이티드 제공)에서 4 일 동안 배양시켰다. 생성된 조혈 선조 세포군을 계측한 후, 1 ml의 MethoCult 배지(캐나다 뱅쿠버 소재의 스템 셀 테크놀로지스 인코포레이티드 제공) 중의 1,000 개의 세포를, 지시된 농도의 M-CIF 또는 대조 베타족 케모킨의 존재 하에 또는 부재 하에 M-CSF(10 ng/ml)가 강화된 3.5 cm 직경의 조직 배양 접시에 도말하였다. 항온기(37℃, 88% N₂, 5% CO₂, 및 7% O₂)에서 14 일후 도립 현미경을 사용하여 콜로니의 수를 계측하였다.

실시예 26

기나이 피그에 있어 수술에 의한 골관절염 모델에서 M-CIF의 평가

M-CIF가 골관절염(OA)의 발병 및 진행을 지연시킨다는 점을 입증하기 위해, 하틀리 기니아 피그에 있어 수술에 의해 유발된 OA 모델을 사용하였다. OA 실험에서 기니아 피그를 사용하는 방법은 재연 가능하며 적절한 특징적인 OA 모델이다. 이 종은 노화에 따라 자발적으로 골관절염이 발생하는 것으로 나타났다. 수술에 의해 유도된 관절의 불안정성은, 무릎 관절에 대한 생물 기계적 하중을 변경시켜 OA를 유발시킨다. 이 모델에서 관찰되는 병리학적 변화는 인간의 OA에서 관찰되는 바와 유사하다 ( 매콕, 에스 씨 외 다수의 문헌 [J. Exp. Pathol. 71(2): 279-93(1990)], 벤델, 에이 엠 외 다수의 문헌 [Vet Pathol. 28: 207-215(1991)], 지메네즈, 피 에이 외 다수의 문헌 [Inflam. Res. 44(2): 129-130(1995)] 참조).

케타민(40 mg/kg), 크실라진(5 mg/kg), 펜타닐(0.06 mg/kg) 및 수술후 부프리노르핀(0.05 mg/kg)로 피하 마취시킨 생후 8주된 수컷의 하틀리 기니아 피그(5 마리)에 대해 수술하였다. 수술 전 12 시간 동안 기니아 피그를 절식시켰다. 피부감염 및 수술 동안, 그리고 수술 후에 기니아 피그를 가열 패드 상에 고정시켰다. 상기 기니아 피그의 우측 무릎 관절 피막을 10호 블레이드를 사용하여 절개하였다. 중앙 반월판 상의 근막을 절개하고, 중간 측부 인대 및 중앙 절개부를 퇴축시켜다. 이후, Tyrel 마이크로 절개용 후크를 사용하여 전방 중앙 반월판을 분리시키고, 전방부를 15호 블레이드로 절개하였다. 간절 피막은 연속 5-0 Vicrylt로 봉합하였다. 2개의 봉합 클립을 사용하여 피부를 봉합한 후 수술 후 4일 째에 제거하였다. 상기 기니아 피그의 체중은 실험 시작 시점 및 그 후 2 주마다 측정하였다.

M-CIF 및 위약을 수술 당일부터 6 주 동안 매일 복강내 투여하였다. 비처리 대조군, 위약군 및 M-CIF 처리군을 사용하였다. 안락사 이전 연구 말기에 방사선 촬영을 실시하였다. 실험 말기에, 나트륨 펜토바비탈(300 mg/kg)을 과량 투여하여 실험 동물을 모두 안락사시켰다. 무릎 관절을 수거하여 4 일 동안 10% 포르말린에 보관한 후 4 일 동안 PBS(pH 7.2) 중의 20% 포름산 중에서 탈회시켰다. 5 간격으로 절편을 절단하여 사프라닌 O, 패스트 그린 및 헤마토실린으로 염색하였다.

만킨 기록 시스템을 사용하여 조직 병리학적 평가를 실시하였다 (만킨의 문헌 [H.J., Orth, Clin. North America 2:19-30(1971)] 참조).

실시예 27

래트에 있어 육아종성 소장결장염의 펩티도글리칸-다당류 중합체 모델에서 M-CIF의 평가

M-CIF가 육아종성 소장결장염의 발병 및 진행을 지연시킨다는 것을 입증하기 위해, 수술에 의해 유도된 루이스 래트의 결장염 모델을 사용하였다. 결장염 실험에 루이스 래트를 사용하는 방법은 소장 결장염에 대한 적당하고 재연 가능한 특징적인 모델이다. 루이스 래트종은, 말단 회장, 파이어반, 맹장 및 말단 직장의 여러 부위에 펩티도글리칸-다당류(PG-PS)를 수술에 의해 이식한 후 소장 결장염에 걸리기 쉬운 것으로 밝혀졌다. 수술에 의해 PG-PS를 이식하면, 1일 내지 2 일째 가장 심하고 7∼9 일동안 휴지 상태로 유지된 후, 12 일 내지 17 일째에는 4개월 이하 동안 지속될 수 있는 활성 염증과 함께 자발적으로 재발하는 급성 소장 결장염이 유발된다 (엘슨 외 다수의 문헌 [Gastroenterol. 109:1344-1367 (1965)] 참조). 만성 염증의 발병은 T-세포에 의한 면역 반응, 잘 분해되지 않는 PG-PS, 및 유전자 숙주 감수성에 좌우된다 (사토 외 다수의 문헌 [Methods: A Companion to Methods in Enzymology 9:233-247 (1996)] 참고). 이 모델에서 관찰되는 면역 반응은 인간의 소장 결장에서 관찰되는 반응과 유사하였다.

수술은, 케타민(40 mg/kg), 크실라진(5 mg/kg), 펜타닐(0.06 mg/kg) 및 수술 후 부프레노르핀(0.05 mg/kg)로 경피 마취시킨 130∼170 g의 루이스 래트(10 마리)를 대상으로 실시하였다. 상기 루이스 래트는 피부 살균 및 수술 중, 그리고 수술 후에 가열 패드 상에 고정시켰다. 복부를 통해 10호 블레이드를 사용하여 6∼8 cm로 절개하여 회장, 맹장 및 직장을 노출시켰다. 래트에 대해 PG-APS(45 mg의 건중량 및 15 mg의 람노즈/체중(g))를 기관 벽내에(장하막 조직 내로) 주사하였다. 각 부위에 0.05 ml(총 투여량의 1/10)를 회맹부 판 기부 2 cm 및 4 cm, 2개의 원부 파이어반, 4개의 중앙 맹장 부위, 맹장 말단의 림프구 응집체에 주사한 후 수술 후 4일 째 제거하였다. 래트의 체중은 실험 시작 지점과 그후 5 일마다 측정하였다. 염증 정도는, 발목 관절의 팽윤 정도를 형태학상으로 평가하여 측정하였다. 발목 관절의 크기는 소장 내 감염의 존재에 대한 확실한 지시 인자로서 밝혀졌다.

M-CIF와 위약은 수술 시작 후 4주 동안 매일 (복강내) 투여하였다. 비처리 대조군, 위약군 및 M-CIF 군으로 시험하였다.

안락사 2 시간 전에, 래트에 BrdU(100 mg/mg, 복강내 투여)를 주사하였다. 실험 말기에 CO₂로 질식시켜 래트를 치사시켰다. 원부 회장, 맹장 및 원부 직장으로부터 취한 샘플을 10% 포르말린에 고정시켰다. 절편을 절단한 후 H&E, 무시카르민, 트리크롬 및 안티-BrdU 항체로 염색하였다. 사르토 스코어링 시스템을 사용하여 조직 병리학적 평가를 실시하였다 (사르토 외 다수의 문헌 [Methods: A Comparison to Methods in Enzymology 9:233-247(1996) 참고).

실시예 28

혈소판 및 과립구의 보다 빠른 회복을 초래하는 5-Fu 치료 과정 동안의 MPIF-1 처리

화학 치료법에 따른 2개의 주요 합병증은 호중구 감소증(혈액 내 호중구수의 감소)및 혈소판 감소증(혈소판 감소)이다. 병원에서는 현재 호중구 감소증을 완화시키는 데 자극 인자(G-CSF)를 사용하고 있다. G-CSF는 시험관 내에서 콜로니 형성 단위-과립구(CFU-G)를 통해 콜로니 형성을 촉진시키고 동물 모델에서 과립구 생성을 촉진시키는 것으로 공지되어 있다. 혈소판 형성소(Tpo)는 임상 실험에서 혈소판 감소증을 경감시키기 위한 목적을 갖는다. Tpo는 시험관 내에서 콜로니 형성 단위-거핵구(CFU-Meg)에 의해 콜로니 형성을 촉진시키고, 동물에서 실험적으로 유도된 혈소판 감소증에서 혈소판의 생성을 촉진시키는 것으로 공지되어 있다. 임상 치료시 G-CSF의 주요 제약점 중 하나는, 여러 차례의 화학 치료를 받는 환자에 있어 호중구 감소증을 경감시키는 데 효과적이지 않다는 점이다. 이것은, G-CSF가 작용하는 표적 세포인 골수 중에 CFU-G가 고갈되는 데 기인된 것이다. Tpo는 또한 처음 임상 실험 결과를 통해 지시된 바와 동일한 운명을 겪는다. 화학 치료 중에 G-CSF 및 Tpo 표적 세포의 고갈을 예방할 수 있는 임의의 제제는 임상적으로 상당한 가치가 있다. 하기 제시된 데이타는, MPIF가 이 임상적 요건에 부합될 수 있음을 시사해준다.

상기 실시예에서 MPIF-1은 시험관 내에서 양성능의 과립구/단구 골수양 선조 세포에 의해 콜로니 형성을 억제하는 것으로 밝혀진 바 있다. 특히, 실시예 15 내지 16는, MPIF-1이 시험관내 및 생체내에서 5-Fu에 의한 세포독성으로부터 원시적 다성능의 골수양 선조 세포를 보호하는 것을 입증해주는 데이타를 제공한다. 이들 다성능의 선조 세포는 CFU-G 및 CFU-Meg를 비롯한 모든 골수양계의 보다 많은 수임 선조 세포를 발생시키는 것으로 예상된다. 하기 실험은, 2회 또는 3회의 5-Fu 치료 중에 MPIF-1로 처리하면 혈소판 및 과립구가 보다 빠르게 회복된다는 점을 입증하기 위해 실시하였다.

재료 및 방법

평균 체중이 19.4 g(±1.1 S.D., n=150)인 암컷 C57BL6 마우스(생후 7 내지 10주령)를 사용하였다. 모든 마우스는, 실험 과정 전반에 걸쳐 표준 식이를 사용하고 낮/밤 사이클의 사육 조건 및 온도 하에 사육하였다. MPIF-1 제제(HG00304-E6)는, 숙성 단백질의 23 N-말단 아미노산이 결여된 절단 형태의 MPIF-1(즉, N-말단 Met가 첨가된 도 25의 MPIF-1 돌연변이체-3)로서, 이.콜리로부터 제조하였다. 임상 등급의 G-CSF(Neupogen, 등록상표)는 쉐디 그로브 파마시아(매릴랜드 주 20850 락빌 소재)로부터 구입하였다(Neurpogen, 등록상표는 암겐 인코포레이티드의 암겐 센터(미국 캘리포니아주 91320 사우전드 옥스 소재)에서 제조된다). 5-플루오로우라실(5-Fu)은 시그마 케미칼스에서 구입하였으며, 이것은 사용 직전에 온수에 용해시켜 새로 제조하였다. MPIF-1 용액은, 일반 식염수로 희석하여 새로 제조하였다. 마찬가지로, G-CSF는 10 mM의 아세트산나트륨, 5%(wt/v)의 만니톨, 0.004%(v/v)의 Tween 80으로 구성된 완충액(pH 4.0) 중에 G-CSF를 희석시켰다. 마우스 CD41a, Gra.1 및 Mac.1 항원에 대한 적절한 플루오로크롬 결합된 래트의 모노클론 항체를 파밍겐에서 구입하였다.

5군의 마우스(1군 당 30 마리의 마우스로 구성)는 다음과 같이 처리하였다.

1군은 2일 전, 1일 전, 당일, 6일 째, 7일 째 및 8일 째에 0.1 ml의 일반 식염수를 복강내에 주사하여 일반 대조군으로 사용하였다.

2군은 당일 및 8일째에 0.2 ml의 5-Fu 용액을 복강내에 주사하였다(100 mg/체중(g)).

3군은 2군에서와 같이 5-Fu를 주사하고 또한 2일전, 1일전, 당일, 6일째, 7일째 및 8일째에 0.1 ml의 MPIF-1 용액(1.0 mg/체중(kg))을 복강내에 주사하였다.

4군은 2군에서와 같이 5-Fu를 주사하고 또한 1일째, 2일째, 3일째, 9일째, 10일째 및 11일째에 0.1 ml의 G-CSF 용액(0.5 mg/체중(kg))을 복강내에 주사하였다.

5군은 2군에서와 같이 5-Fu를, 3군에서와 같이 MPIF-1를, 그리고 4군에서와 같이 G-CSF를 주사하였다.

각군으로부터 6 마리를 선별하여, 말초 혈액 및 골수의 레벨에서 혈소판 및 과립구의 회복도를 관측하기 위해 지시된 날자에 분석하였다. 5-Fu를 처음 주사한 후 6일 및 8일째에 분석한 마우스에 대해서는 MPIF-1 또는 5-FU로 2차 처리하지 않았다.

EDTA 피복관 내의 역궤도동으로부터 말초 혈액을 수거한 직후 FACS 밴티지를 통해 분석하여 혈소판(CD41a에 양성)의 수 및 과립구(Gra.1 및 Mac.1에 대한 이중 양성 세포)의 수를 측정하였다. 여기서 사용된 동물 종류와 분석 방법에 의하면 절대 개수를 구할 수 있다. 대신 과립구는 총 백혈구의 백분율로서 표현하며, 혈소판은 분류기에서 15 초당 CD41a 양성 경우로서 산정하였다. 이후, 마우스를 치사시키고 표준 방법을 사용하여 골수 세포를 취하였다. 또한 FACS를 통해 골수 세포를 분석하여 골수 중의 Gra.1 및 Mac.1 이중 양성 세포군 백분율을 관측하였다. 이들 항원이 과립구계에서 형질 발현되기 시작하는 단계가 정확히 알려진 것은 아니기 때문에, 골수 중의 Gra.1 및 Mac.1 이중 양성 세포는 이들 발현 및 성숙 단계와 관련하여 이질적인 것으로 예상된다.

골수는 또한, 시험관 내 클론원성 분석법을 사용하여 클론원성 선조 세포의 빈도를 측정하기 위해 분석하였다. 간략히 2층의 아가 배양 시스템에서 고 증식능 콜로니 형성 세포(HPP-CFC) 및 저 증식능 콜로니 형성 세포(LLP-CFC) 분석을 실시하였다. 하층은, 20%의 FBS, 0.5%의 Difco 아가, 7.5 ng/ml mIL-3, 75 ng/ml의 mSCF, 7.5 ng/ml의 hM-CSF 및 15 ng/ml의 mIL-1α가 강화된 MEM 1 ml를 사용하여 3.5 cm 직경의 접시에서 제조하였다. 이어서, 이 층에, 20%의 FBS 및 0.3%의 아가이 강화된 MEM 중에 2,000 세포/접시가 함유되도록 쥐의 골수 세포 현탁액 0.5 ml를 중첩시켰다. 상부 아가은 약 15 분동안 실온에서 고형화시켰다. 이후, 상기 접시를 14 일 동안 조직 배양 항온기(37℃, 88% N₂, 5% CO₂, 및 7% O₂)에서 항온 처리하고, 도립 현미경을 사용하여 콜로니를 계측하였다. 이 실험에서는 콜로니의 총 계수를 보고하였다.

FACS 데이타는 시점 당 각 군의 3마리 동물로부터 산출한 물질을 분석하여 구한 한편, 클론원성 분석은, 시점 당 각 군의 6마리로부터 얻은 세포를 사용하여 수행하였다. 최종적으로, 실험의 1군에서 그 날동안 얻은 자료점은 염수를 주입한 정상 마우스(군 1)로부터 얻은 값을 나타낸다.

결과

말초 혈액 중의 혈소판 회복도를 관측하기 위해, CD41a 양성 세포의 정상 상태 레벨을 FACS 밴티지로 측정하였다. 도 51에 도시된 바와 같이, 5-Fu 이전에 MPIF-1로 처리한 경우(3군), 5-Fu + 식염수로 처리한 마우스(2군)에서 관찰되는 것보다 훨씬 빠르고 강하게 회복되었다. 예상된 바와 같이, G-CSF로 처리한 마우스(4군)의 혈소판 회복 속도는 5-Fu + 식염수로 처리한 마우스에서 관찰되는 결과와 차이가 없었다. 또한, 5-Fu 처리한 마우스(5군)에 G-CSF와 MPIF-1을 함께 투여한 경우, MPIF-1로만 처리한 마우스(3군)에서 관찰되는 결과와 비교할 때 전체적인 정상 상태 레벨에는 거의 영향이 없었다. 따라서, 5-Fu 처리 이전에 마우스를 MPIF로 예비 처리한 경우 말초 혈액 중의 혈소판이 급속히 회복되었다.

말초 혈액 중의 과립구 회복도는, 혈액 중에서 정상 상태의 Gra.1 및 Mac.1 이중 양성 세포수를 측정하여 관측하였다. 도 52에 도시된 바와 같이, 마우스를 5-Fu로 처리한 경우에는, 5-Fu를 1차 및 2차 처리한 후 6일째 정상 상태의 혈액 중 Gra.1 및 Mac.1 이중 양성 세포의 정상 레벨이 급격히 감소하였다. MPIF-1 예비 처리는 2가지의 잇점을 제공하는 데, 첫째 5-Fu+염수 처리한 마우스 군(2군)에서 관찰되는 것과 비교하여 호중구 감소증의 정도(Gra.1 및 Mac.1 이중 양성 세포의 고갈 정도)가 훨씬 적다는 점과, 둘째 회복도가 훨씬 빠르다는 점이다. 예상되는 바와 같이, 5-Fu 처리 후 G-CSF를 투여하면(4 군) 혈액중 Gra.1 및 Mac.1 이중 양성 세포가 급속히 회복된다. G-SCF 처리한 마우스에서의 호중구 감소증 회복 정도는 8일 째에 MPIF-1 처리한 마우스(3 군)에서 관찰되는 것 보다 작다. MPIF-1와 G-CSF의 동시 투여(5군)가 과립구 고갈 및 회복도에 미치는 영향은, 이들 쥐가 MPIF-1 또는 G-CSF만으로 처리한 마우스에서 관찰되는 것보다 혈액 중의 Gra.1 및 Mac.1 이중 양성 세포의 정상 상태 레벨이 훨씬 높다는 점에서 상당히 경이적이다. 따라서, 도 52에 도시된 바와 같이, MPIF-1 및 G-CSF는 이들을 함께 투여했을 때 추가의 효과를 발휘할 수도 있다.

상기 지시된 바와 같이, 골수 레벨에서의 회복도는 FACS 벤티지법 및 클론원성 분석법을 통해 관측하였다. FAC를 사용하여 얻은 결과는 도 53에 도시하였다. 예상한 바와 같이, 5-Fu 처리된 골수(2군) 중의 Gra.1 및 Mac.1 이중 양성 세포군의 레벨은 6일 내지 14일에 걸쳐 상당히 저하된 후 16일까지 정상 레벨으로 회복되었다. 마우스를 5-Fu로 처리하기 전에 MPIF-1로 처리한 경우(3 군)에는, 5-Fu에 의한 Gra.1 및 Mac. 1 이중 양성 세포의 고갈 효과가 소멸되었다. 놀랍게도, G-CSF(4군)는 1차 5-Fu 투여(2차는 아님)에 반응하여 Gra.1 및 Mac.1 이중 양성 세포의 고갈을 방지할 수 있다. 이러한 효과는 G-CSF 표적 세포의 유용성 및 G-CSF 투여 시점에 기인된다. MPIF-1과 G-CSF로 함께 처리한 마우스(5 군)에서도 유사한 반응이 나타나긴 하나, 1차 5-Fu 처리 후 8일 째 회복 정도는 MPIF-1 또는 G-CSF만으로 처리한 마우스에서 관찰되는 정도보다 훨씬 높았다.

클론원성 분석 데이타는 도 54에 도시하였다. 골수 중의 선조 세포 빈도는 실험 기간 중 14일 전체에 걸쳐 5-Fu에 대해 반응하여 계속 감소하였으며, 16일째 약간 회복되었다. 이러한 선조 세포의 빈도 감소는, 5-Fu로 처리하기 전에 MPIF-1로 처리한 마우스에서는 사라졌다. 이와는 달리, 마우스를 G-CSF로 처리하는 것은, 정상 골수 또는 MPIF-1 처리 골수 중의 선조 세포 빈도를 유지시키는 데 효과적이지 못하다. G-CSF와 MPIF-1을 함께 투여함에 따라 골수 중의 선조 세포 빈도에 미치는 영향은 복잡하게 나타난다.

실시예 29

rhM-CIF 처리에 의해 MRL lpr/lpr 마우스에서의 루푸스 신장염 개선

전신 홍반성 루푸스(SLE)는, 병원성 자가 항체의 과다 생성 및 생명을 위협하는 사구체신염 및 맥관염을 유도할 수 있는 보충 고정 면역 응집물의 형성을 특징으로 하는 다기관 관련 자가 면역 질환이다 (스타인버그, 에이 디 및 클리만, 디 엠의 문헌 [Rheum. Dis. Clinics of No. Amer. 14:25 (1988)] 참고).

MRL lpr/lpr 마우스는, 세포 소멸성 fas 수용체의 돌연변이로 인해 (와타나베 후쿠나가, 알 외 다수의 문헌 [Nature 356:314-317 (1992)] 참고), 인간의 SLE와 혈청학적 및 면역 병리학적으로 중요한 유사성을 가진 자가 면역 질환이 자발적으로 발생한다 (앤드류스, 비 에스 외 다수의 문헌 [J. Exp. Med. 148:1198(1978)] 참고). 이 쥐 모델을 광범위하게 분석한 결과, 각종 자가항원에 대한 높은 자가 항체 역가, 사구체 신염, 관절염, 맥관염 및 조발사를 비롯한 인간의 루푸스의 병인에 대해 다각적인 통찰이 이루어졌다 (테오필로폴로스, 에이 엔 및 딕슨, 에프 제이의 문헌 [Immunol. Rev. 55;179 (1981)]. 다코스키, 에이 외 다수의 문헌 [Clin. Exp. Immunol. 72:91(1988)] 참고).

MRL lpr/lpr 마우스에 있어 비정상적 마크로파지와 다른 세포 및 분자 결함은 자가 면역 질환의 병인과 연관이 있다 (코헨, 피 엘 및 아이젠버그, 알 에이의 문헌 [Annu, Rev. Immunol. 9:243-269(1991)] 참고). MRL lpr/lpr 마우스는 많은 복막 마크로파지를 가지며, 이 마우스의 마크로파지는 정상 마우스의 것보다 더 활성화된 상태로 존재한다 (켈리, 브이 이 및 로스, 제이 비의 문헌 [J. Immunol. 129:923(1982)], 당부 에이 피 외 다수의 문헌 [J. Immunol. 138:1757(1987)] 참고). 또한, MRL lpr/lpr 마크로파지는 전구 염증 시토킨(예, IL-1 및 TNF-α)을 많은 양으로 생성시킨다. 마크로파지는 정상의 신장 사구체에 거의 존재하지 않으나, 단백뇨 전의 MRL lpr/lpr 사구체 중에서 발견할 수 있으며 사구체신염이 진행됨에 따라 보다 많이 존재하게 된다.

새로운 β-케모킨인 rhM-CIE는 주화성 활성이 약하고, MIP-1α 및 RANTES와 공유하는 수용체를 통해 단세포의 세포내 Ca⁺⁺의 흐름을 유도하는 점을 제외하고는 대부분의 백혈구에서 비활성을 갖는다 (슐츠 크나페 피 외 다수의 문헌 [J. Exp. Med. 183:195(1996)] 참고). 또한, rhM-CIF는 M-CSF 유도 전구 단세포 콜로니 형성에 대해 강한 선택적 억제 효과를 갖는다 (인터내쇼날 사이토킨 협회 및 인터내쇼날 소사이어티 포 인터페론 및 사이토킨 리서취의 1차 합동 미팅(1996)에서 크레이더 비 엘 외 다수에 의한 구두 발표 "A beta-family chemokine which specifically inhibits M-CSF mediated colony formation." 참고). 본 발명의 초기 생체내 연구에 의해, rhM-CIF가 LPS 이.콜리 박테리아 또는 살아있는 이.콜리 박테리아에 의한 유도된 마크로파지 매개의 치명적 패혈증에 유의적인 보호 효과를 가지며, 이 효과는 마우스에 있어 TNFα의 감소 및 IL-10 혈청 레벨의 증가에 적어도 부분적으로 기인한다 (The Role of Chemokines on Leucocyte Trafficking and Disease (1997)과 관련된 케이스톤 심포지움(1997)에서의 창 제이 외 다수의 구두 및 포스터 발표 "Selective modulation of TNF-αand IL-10 by rhM-CIF(HCC)-1 correlated with its protective effect in LPS-mediated lethal sepsis in SCID mice" 참고). 완만한 그리고 심각한 관절 손상에 대한 rhM-CIF의 상당한 치료 효과는 또한 죄의 콜라겐에 의한 관절염 및 래트의 보조 관절염 모델에서 모두 관찰된 바 있다 ( ILAR Congress of Rheumatology(1997)에서의 창 제이 외 다수의 발표 "Protection of Progressive Joint Destruction by rhM-CIF(HCC-1) in a Rat Model of Adjuvant Arthritis."' 61회 National Meeting of American College of Rheumatology(1997)에 제출된 스텀 비 외 다수의 초록 "Ameliirative effect of rhM-CIF(HCC-1) in collagen-induced arthritis in mice" 참고).

본 발명의 연구를 통해, MRL lpr/lpr 마우스에서의 자발적인 루푸스 모델에 대한 rhM-CIE의 잠재적 효과를 검토하였다. 루푸스 신장염 발병의 전 과정 동안 rhM-CIF로 예방 치료한 결과, 사구체의 손상 및 신경화증이 상당히 완화되었으며, 단백질 캐스트의 형성을 감소시킴으로써 신장 기능을 보호하였다. rhM-CIF나 메토트렉세이트 모두, 신장 이외의 다른 기관에서의 심각한 질환에 기인된 것으로 추정되는 조발사에 대해 유의적인 영향을 미치지 않았다.

재료 및 방법

동물

암컷 MRL lpr/lpr 마우스를 잭슨 연구소(미국 메인주 바 하버 소재)에서 입수하였고, 실험에 사용하기 전에 적어도 일주일 동안 HGS 동물 편의 시설에서 추천된 표준에 따라 사육하였다.

화학물질

아메토프테린(메토트렉사이트)을 시그마 케미칼스(미국 미조리주 세인트 루이스 소재)에서 입수하였다. 생리적 식염수를 아보트 랩(미국 일리노이주 노스 시카고 소재)에서 입수하였다. 재조합 인체 M-CIF(배취 B9)를 바큘로바이러스 벡터에서 발현시켰고, 분자량 8.677 Kd로 SDS-PAGE에 의해 정제하였다. 이어서, 단백질을 NaOAc 40 mM, NaCl 150 mM을 포함하고, 0.2 EU/mg 미만의 내독소를 지닌 pH 5.5의 완충액에 용해시켰다.

실험 설계

한 그룹당 8 내지 9 마리의 50 MRL lpr/lpr 마우스에 완충액 중의 rhM-CIF 또는 생리식염수 중의 메토트렉사이트를 매일(월요일부터 금요일까지) 투여하되(1 또는 5 mg/kg, i.p.), 사망의 징후가 나타나지 않는 8주 연령에서 시작하여 14주간 실시한다. 완충액 또는 생리식염수를 수용하는 마우스를 질병 대조군으로 하였다. 완충액에서 처리된 그룹에서 치사율이 50%에 이를때까지 동물의 주간 또는 격주간 임상 증후군 및 이병율을 모니터하였다. 남아있는 동물은 전부 신장의 조직병리학을 평가하기 위하여 실험의 말기에 죽였다.

조직병리학 분석

신장을 둘다 제거한 직후에 파라핀 매립 및 절개하기 위하여 10% 중성 완충 포르말린에 넣었다. 포괄적인 조사를 하기 위하여 조직 절편을 헤마토크실린과 에오신 및 PAS와 트리크롬으로 염색시켰다. 신장 병소의 병리학적 평가를 멀티블라인디드 절차로 수행하였다. 모든 슬라이드를 관찰한 후에 일반적인 결과에 따라, 주관적인 등급계를 사용하여 하기 조직병리학적 특징에 따라 0, +/-, +, ++, +++, ++++로 나타냄으로써 변화도 및 변화 분포의 차이를 허용하였다.

1) 불규칙한 세포과다 및 거대화, 기초 막 농후화, 핵붕괴, 섬유증 및 유리질화, 보맨 캡슐의 반월 형성 및 섬유증 등의 사구체 병소;

2) 세관의 루멘에서 단백질 캐스트의 형성(병소 심각성의 평가를 용이하게 하기 위하여, 단백질 캐스트 형성을 여기서 분화시키고, 심지어 사구체 모세 소방의 기초 막의 투과성을 증가시키는데 기여함) 및 실질적인 위측증 및 세관의 대상성 비대증 및 확장증을 비롯한 관형 병소;

3) 염증성 침윤, 림프종 혈관주위염, 간질성 섬유증을 비롯한 간질 병소;

4) 과립상 신경화증 등의 육안적인 외관.

반정량 분석을 하기 등급계를 사용하여 수행하였다.

0 = 0; +/- = 1; + = 2; ++ = 4; +++ = 6; 및 ++++ = 8.

개별적인 조직병리학 평가를 완결한 후, 슬라이드를 해독하고 치료 양생에 대하여 병리학적 변화를 해석하기 위한 각각의 그룹으로 분류하였다.

대식세포 면역조직화학적 분석

MRL lpr/lpr 신장으로부터 파라핀 절편을 표준 면역조직화학적 기술에 따라 마우스(F4/80) 대식세포 항원(미국 캘리포니아주 샌프란시스코에 소재한 칼택 연구소)에 대한 특이 래트 모노크로날 항체를 사용하여 대식세포에 대하여 염색하였다. 신장에서 대식세포 침윤도를 평가하기 위한 기준은 상기에서 언급한 기준과 유사하다(0 내지 ++++).

통계 분석

마우스 생존율 %를 생존 마우스/총 마우스 ×100%의 수치로 평가하였다. 조직병리학 데이터의 분석을 실험의 말기에 생존한 마우스가 4 마리 이상인 그룹에 대해서만 수행하였다. 병리학적 특징의 차이에 대한 P값, 평균 등급 및 SEM을 InStat 통계 소프트웨어로 개별적으로 또는 함께 계산하였다.

결과

rhM-CIF가 MRL lpr/lpr 마우스의 생존에 미치는 영향

천연 자가면역 MRL lpr/lpr 마우스를 rhM-CIF의 B11 배취가 고갈될때 완충액 또는 생리식염수 중의 메토트렉사이트(1 또는 5 mg/kg, i.p.)로 매일(월요일부터 금요일까지) 14주간 처리하였다. 질병 발생 대조군으로서 사용한 완충액으로 처리한 그룹과 비교하면, rhM-CIF 처리 결과는 실험의 말기에서 완충액으로 처리한 그룹의 치사율이 56%에 도달하고, rhM-CIF 1mg/kg으로 처리된 그룹에서 생존율이 63%이었다는 것을 제외하고는 16주의 실험 기간 중의 생존율은 유사한 것으로 관찰되었다(도 55). rhM-CIF 처리와 마찬가지로, 낮은 투여량의 메토트렉사이트(1 mg/kg)로 처리한 그룹은 약 20% 보호되는 때인 실험의 마지막 주까지 생리식염수 그룹과 평행한 패턴을 나타내었다. 그러나, 높은 투여량의 메토트렉사이트(5 mg/kg)로 처리한 그룹은 치사율이 가속되었고, 이는 축적된 독성에 그 원인이 있는 것으로 여겨진다(도 56).

rhM-CIF 치료에 의해 MRL lpr/lpr 신장에서 단백질 캐스트의 감소

조직병리학적 평가에 의해 측정된 단백질 캐스트 정보를 신장 기능을 평가하기 위한 단백뇨에 대한 별도의 측정치로서 선택하였다. 단지 3개의 그룹(완충액, 1 mg/kg의 rhM-CIF 및 메토트렉사이트)만이 이 파일럿 실험의 말기에서 4마리의 마우스가 생존하였고, 이는 이들의 후속 조직 분석용으로 사용하였다. 도 57에 나타낸 바와 같이, 완충액 대조군은 헨레계제, 원위곡 세뇨관, 집합세관 및 MRL lpr/lpr 신장의 세관 루멘에서 보다 많은 양의 단백질과 세포상 캐스트를 나타내었다. 이와는 반대로, rhM-CIF(1 mg/kg)로 처리된 마우스에서는 단지 소량의 단백질 캐스트가 발견되었고, 메토트렉사이트(1 mg/kg) 그룹에서 한마리의 마우스가 심한 단백질 캐스트 형성을 나타내었으나, 다른 세마리의 마우스는 이 병리학적 특징이 전반적으로 없었다. rhM-CIF에 의한 단백질 캐스트 형성의 감소는 완충액 그룹과 비교할 때 통계적 유의성(p = 0.02)을 가진다.

사구체 병소에 대한 rhM-CIF의 경감 효과

사구체 병소, 특히 모세관 소방 및 사구체의 기초 막의 병소는 이 루푸스 모델에서 중요한 특징을 나타내었다. 완충액 대조군에서 생존한 동물의 반(두 마리)은 거의 모든 가시적인 사구체에서 심각한 손상을 나타내었고, 이는 보맨 캡슐에서 대식세포의 과다증식 및 반월의 과도한 생성; PAS 염색에 의해 입증된 소방에서의 사구체간질 세포 증식 증식; 핵 파괴에 기인한 핵붕괴, "루프상 병소"를 야기하는 기초 막의 농후화, 보맨 캡슐에서 적혈구 세포의 누출 및 섬유증 및/또는 유리질화로 나타내었다. 그 외에도, 완전 또는 부분 기능장애 사구체는 피질 영역에서 과도하게 분포되었다. 반월 형성, 체벽 및 내장층의 유착 및 보맨 캡슐의 섬유증은 백분율 측면에서 사구체 병소와 같이 심각하였다. 이 그룹에서 다른 두마리의 마우스는 심각한 병소가 훨씬 적은 것으로 나타났다. 이와는 반대로, rhM-CIF(1 mg/kg)으로 처리된 생존 마우스(3/5)의 대부분은 완충액 대조군의 약 50% 치사율을 나타내었고, 다른 것(2/5)은 매우 약한 손상만을 나타내거나 명백한 사구체 병소가 없었다. 비교적 심각한 사구체 병소를 나타낸 동물이 단지 하나라는 점을 제외하고는 메토트렉사이트로 처리한 생존 마우스(3/4)의 대부분이 유사한 온건한 병소를 나타내었다. rhM-CIF로 처리된 마우스에서 사구체 병소의 감소는 완충액 대조군에 비해 통계적 유의성(p = 0.01)을 가진다(도 58).

rhM-CIF로 지연된 신경화증의 발생

진행성 및 장기간 루푸스 사구체신염은 사구체 및 세관의 대상성 비대증 및 병소 위축에 기인한 신경증을 궁극적으로 유도한다. 마지막 단계의 특징은 완충액 대조군으로 처리한 4마리의 마우스 중 두마리에 심각하였고, 이들 신장의 표면은 제모 피혁과 비슷한 반점을 나타내었다. 나머지 두마리 마우스는 이러한 진행 변화를 나타내지 않았다. 이에 비해, rhM-CIF로 처리된 그룹의 마우스 중에는 세관의 완만한 위축이 가끔 관찰된다는 점을 제외하고는 명백한 신경화증을 나타낸 것은 하나도 없었다. 더우기, 메토트렉사이트 그룹(n=4)에서 단지 한마리의 마우스만이 경화 특징의 진행 상태를 나타내었고, 나머지 세마리의 마우스는 신경화증을 나타내지 않았다. 통계 분석은 완충액 대조군에서 신경화증의 심각성이 rhM-CIF 및 메토트렉사이트로 처리된 그룹의 심각성보다 현저히 크다는 것을 보여준다(도 59).

rhM-CIF에 의해 MRL lpr/lpr 신장에서 대식세포의 침윤이 적절히 억제됨

MRL lpr/lpr 신장에서 대식세포의 존재는 진행성 사구체신염의 중요한 징후이다. 면역조직화학 분석은 대식세포가 완충액으로 처리된 마우스의 신자에 과도하게 침윤됨을 나타내었다. 심각성은 전술한 다른 병리학적 특징과 대등하였다. 큰 신장 병소를 지닌 두마리 마우스는 대부분 심한 대식세포 침윤을 나타내었다. 이들은 보맨 캡슐의 증식성 상피 세포와 혼합된 사구체 반월에서, 사구체주위 영역에서, 네프론의 간극 및 혈관주위 침윤 영역에서 나타난다. 상기 그룹에서 나머지 세마리 마우스는 온건하거나 또는 마일드한 대식세포 침윤을 나타내었고, 이는 이들의 병소 심각성과 대등하였다. 그러나, 메토트렉사이트 처리 그룹의 마일드한 조직 병리학적 병소를 가진 2마리의 마우스는 상대적으로 높은 등급의 대식 세포 침윤을 나타내었다. 이 그룹에서 가장 심각한 마우스가 가장 심한 대식세포의 침윤을 나타내었다. rhM-CIF 그룹에서, 대식세포의 외관은 완충액 그룹에 비해 적당하게 억제된 것으로 보이며, p값이 0.08일지라도, 최저 통계적 유의성을 가진다.

MRL lpr/lpr 신장에서 림프구 침윤 및 혈관주위에 대한 rhM-CIF의 결핍 효과

신장의 개재성 조직에서 림프양의 다량 및 확산 침윤은 이러한 MRL lpr/lpr 모델에서 다른 주요한 병리학적 특징이다. 이들 침윤은 주로 혈관주위(소엽간 동맥 또는 심지어 궁상 동맥 등의 큰 동맥) 영역, 사구체주위 영역 및 간극에서 발견된다. 간극에서 림프양 세포 침윤은 완충액 대조용에서 더욱 심한 것으로 관찰되는데, 그 이유는 다량 위축 세관 때문이다. 그러나, 이들의 사구체 병소는 매우 마일드하지만, 대량의 침윤은 rhM-CIF 및 메토트렉사이트로 처리된 마우스의 사구체주위 영역에서 발견되었다. 침윤의 세포 유형은 다르다. 혈관주위 영역(특히, 큰 동맥 주위)에서, 대부분의 세포는 림프아세포 및 단핵아세포이었다. 침윤의 전체 영상은 림프양 세포의 다수 세포상 종류로 나타내었고, 이는 대형 림프 노드(데이타는 나타나지 않음)에서 나타난 세포상 분류화와 유사하였다. 완충액, rhM-CIF 및 메토트렉사이트로 처리된 그룹들 중에서 반정량 및 비교 결과, 혈관주위 및 사구체주위의 차이는 명백하지 않았다(도 61).

논고

이 파일럿 실험에서, 실험의 말기에 신장 조직병리학으로 평가된 단백질 캐스트 형성은 신장 기능을 평가하기 위하여 단백뇨에 대하여 다른 특징으로 선택되었다. 예비 결과는 루푸스 신장염 발생의 과정 중에 14 중 동안 rhM-CIF로 예방 처리한 결과 연령이 5 내지 6 개월된 MRL lpr/lpr 신장에서 단백질 캐스트 형성의 큰 감소 및 사구체 병소와 신경화증의 개량을 나타내었다. 그러나, rhM-CIF는 신장염 및/또는 혈관에서 유도된 조기 사망에 거의 또는 전혀 영향을 미치지 않았다.

MRL lpr/lpr 신장 사구체에서 비정상적으로 활성화된 대식세포의 존재는 루푸스 신장염의 병인과 관련이 있고, 신장에서 M-CSF mRNA 전사량 및 MRL lpr/lpr 마우스의 혈관순환계에서 M-CSF 단백질의 증가는 대식세포 침윤 및 활성화와 관련이 있을 수 있다[Yui, M.A. 등, Amer. J. Path. 139:255(1991)]. rhM-CIF 처리 결과 MRL lpr/lpr 신장에서 대식세포 침윤을 적당히 억제하더라도, 조직 파괴의 원인이 되는 M-CSF 매개 신장 대식세포 기능에 rhM-CIF가 미치는 영향은 불명확하다. 그러나, 이전의 연구 결과, rhM-CIF는 (1) M-CSF 유도된 전단구 콜로니 형성을 억제하고, (2) LPS 유도의 대식세포로 매개된 치명적 패혈증을 예방하며, (3) 조직적으로 생체내 TNF-α의 감소 조절 및 IL-10 증가 조절에 효과적이다. 이들 결론은 모두 rhM-CIF가 루푸스 신장염을 개선시키는 효과를 갖는 증거가 된다.

신장의 간극 조직에서 림프구의 다량 침윤은 인체 SLE와는 구별되는 MRL lpr/lpr 마우스의 독특한 병리학적 특징이고, 이는 임의의 면역 또는 자가면역 반응 중에 림프구의 클론 결실에서 fas 수용체 결핍을 유발한다. MRL lpr/lpr 신장에서 림프구 침윤에 대한 rhM-CIF의 효과의 결핍은 rhM-CIF가 MRL lpr/lpr 림프구의 이동, 활성화 및 클론 확장 효과를 억제하지 않는다고 여겨진다. 실제로, rhM-CIF는 생체내 활성화 T 림프구에 대한 주화성을 나타내었다.

요약

예비 연구 결과는 자연 자가면역 질병의 발생 중에 rhM-CIF, 유사 메토트렉사이트의 지연 처리는 단백질 캐스트 형성, 사구체 병소 및 궁극적으로 MRL lpr/lpr 신장에서의 신경화증을 감소시킴으로써 루푸스 신장염의 진행을 크게 개선시킴을 나타내었다. 그러나, rhM-CIF, 유사 메토트렉사이트는 신장염 및/또는 혈관 유도 조기 사망에는 거의 또는 전혀 영향을 미치지 않았다.

잠복기 병리학 표의 개요

하기 표(표 4, 5 및 6)에는 생체외 및 생체내 일차 및 이차 병리학 연구를 요약하였다.

표 5, 6 및 8에서 인용된 배취들에 대한 표 요약어. MPIF-1 배치는 다성분 코드로 표기하였고, 이는 단백질이 발현된 유기체와 발현된 산물 형태의 유기체를 나타낸다(예, 성숙, 전장 또는 변형체). 표기 뒤의 하이픈 후에 있는 문자는 단백질이 발현된 유기체 또는 발현에 사용된 벡터 중 하나를 의미한다(즉, B = 바큘로바이러스, C = CHO 세포, E = 이. 콜리). 하이픈에 선행하는 마지막 세개의 숫자는 발현된 단백질의 형태 또는 변형체을 나타낸다(즉, 300 = 전장 MPIF-1, 301 = MPIF-1Δ17 변형체, 302 = 성숙한 아미노산 서열의 아민 말단에 첨가된 메티오닌 잔기를 갖는 성숙한 MPIF-1, 304 = MPIF-1Δ23 변형체, 311 = 전장 MPIF-1). 따라서, 배취 표기는 발현된 MPIF-1 단백질의 형태, 상기 단백질이 숙주 세포로부터 분비되었는지의 여부 및 분리된 단백질의 형태(존재하는 경우)를 나타낸다. 예를 들어, HG00300-B5는 전장 MPIF-1 단백질이 바큘로바이러스 벡터를 사용하여 발현된 것을 의미한다. 게다가, 이 시스템을 사용하여 발현된 MPIF-1은 곤충 숙주 세포에 의해 진행되기 때문에, 이 단백질의 분리된 형태는 성숙한 MPIF-1이다.

전술한 명명법에 한 예외는 배취 HG00300-B7에서 일어난다. 이 배취는 4개의 상이한 MPIF-1의 혼합물을 포함한다. 본 발명자들은 이들 폴리펩티드가 정제 공정 중에 발생한 MPIF-1의 단백질 분해에 의한 절단의 결과로서 생성되었다. 배치 HG00300-B7에 존재하는 MPIF-1 변형체들은 실시예 17에 기재되어 있다.

일차 병리학-시험관내

실험 개요	세포 유형	MPIF-1Δ23 투여량	화학약품	결과
마우스 골수를 사용하는 콜로니 형성에 MPIF-1 또는 MPIF-1Δ23이 미치는 영향	HPP-CFCLPP-CFC	0.01~100 ng/㎖	무	·MPIF-1 및 MPIF-1Δ23은 둘다 LPP-CFCs의 빈도수의 투여량 의존 감소를 유도함·시험한 모든 농도에서 MPIF-1Δ23이 MPIF-1 보다 더 효과적임·동종형 둘다 HPP-CFCs의 빈도수에 큰 영향을 미치지 않음
MPIF-1Δ23이 인간 조혈 선조 세포의 증식에 미치는 형향	CD34+, 인간 코드 혈액	1~1000 ng/㎖	무	·MPIF-1Δ23 치료 결과 세포 생존율은 20% 내지 40%로 억제됨·이 결과는 MPIF-1Δ23이 골수양의 조상 억제 인자임을 시사함
MPIF-1Δ23에 의해 표적화된 특이 선조 세포 유형의 결정	CD34+, 인간	50 ng/㎖	무	·MPIF-1Δ23은 CFU-GM 및 CFU-혼합의 형성을 억제함(50% 내지 64%)·BFU-E, CFU-G, CFU-M 및 CFU-Meg의 형성은 억제되지 않음·MPIF-1Δ23는 인간 과립구/단핵구 선조 세포의 억제제로서 정의됨
마우스 골수에 대한 MPIF-1Δ23의 억제 효과 특성화	마우스 골수	50 ng/㎖	무	·MPIF-1Δ23은 골수양 CFU-GM 콜로니의 빈도수를 대조군의 30%로 감소시킴·LLP-CFC 콜로니의 빈도수는 대조군의 24%로 감소됨·MPIF-1Δ23은 CFU-E, BFU-E 및 HPP-CFU 콜로니의 형성을 억제하지 않음
5-FU의 세포독성 효과로부터 골수 세포의 혈통 고갈 진행을 예방하는 MPIF-1Δ23의 성능 측정	마우스 골수	무	5-FU	·MPIF-1Δ23은 5-FU로 유도된 세포독성으로부터 40% 내지 50%의 LPP-CFC를 예방함·MPIF-1Δ23은 HPP-CFC를 보호하지 않음

일차 병리학-생체내

실험 개요	종	MPIF-1 배취	MPIF-1 투여량, 스케줄, 경로	화학약품	투여량, 스케줄, 경로	최종 결과
주위 혈액 및 골수에서 HPP-CFC 및 LPP-CFC의 빈도수에 대한 MPIF-1 또는 MPIF-1Δ23의 생체내 효과	마우스	HG00300-B5HG00304-E2	0.5 mg/kg/2일간 8 시간 간격으로 1일 2회 복강내 투여	무	무	·MPIF-1Δ23은 골수에서 LPP-CFC의 빈도수를 크게 감소시킴·혈액 중의 LPP-CFC의 빈도수에 대한 MPIF-1Δ23의 효과는 변화됨·MPIF-1Δ23은 HPP-CFC의 빈도수에는 영향을 미치지 않음
5-FU의 세포독성 효과에 반하여 보하기 위한 최적 MPIF-1Δ23 투여 스케줄의 결정	마우스	HG00304-E2	1 mg/kg, -3∼0 일 사이에 변화 가능, 복강내	5-FU	150 mg/kg, 0일, 복강내	·-2일,-1일 및 0일에 제공된 MPIF-1Δ23은 5-FU의 세포독성 효과에 대하여 골수를 가장 효과적으로 보호함
5-FU 이후에 골수 회복에 대한 MPIF-1Δ23의 투여량 의존성 측정	마우스	HG00304-E6	0.01 내지 10 mg/kg, -2,-1,0 일, 복강내	5-FU	150 mg/kg, 복강내	·투여량 의존 반응은 4일에 관찰되었고, 시험된 최소 투여량(0.01 mg/kg)에서 최상으로 회복됨·투여 반응은 6일에 관찰되지 않음·종 모양의 투여량 반응 곡선은 8일에 얻어졌고, 최적 활성도는 0.1 mg/kg에서 관찰됨
세포독성 치료로부터 세포내 골수양 선조 세포를 보호하기 위한 MPIF-1Δ23의 성능 측정	마우스	HG00304-E6	1 mg/kg, -2,-1,0 일, 복강내	5-FU	150 mg/kg, 0일, 복강내	·MPIF-1Δ23으로 처리된 쥐의 골수로부터 콜로니 형성은 5-FU로 처리한지 7일 후에 회복됨·5-FU 단독으로 처리된 쥐로부터 골수 콜로니의 형성은 이 시점에서 회복을 나타내지 않음
화학치료의 다중 사이클에 대한 MPIF-1Δ23의 예방 효과 측정	마우스	HG00304-E6	1 mg/kg, -2,-1, 0, 6, 7, 8일, 복강내	5-FU	100 mg/kg, 0 및 8 일, 복강내	·5-FU의 2회 주기 후에 MPIF-1Δ23은 선조 세포를 보호함·대부분의 급격한 보호는 5-Fu의 제2 사이클 후에 관찰됨·MPIF-1Δ23의 화학적보호 효과는 혈액 중의 조혈세포에서 유도된 CD45+세포의 수가 증가함으로써 말초에서 입증됨

화학치료의 다중 주기 후에 골수 콜로니, 신장염 및 혈소판의 회복을 가속시키는 MPIF-1Δ23의 성능 측정,G-CSF와 배합된 MPIF-1Δ23의 성능 측정

마우스

HG00304-E6

1 mg/kg, -2,-1, 0, 6,7,8 일, 복강내

5-FUG-CSF

100 mg/kg, 0 및 8 일, 복강내0.5 mg/kg, 1,2,3,9,10 및 11일

·Gr-1 및 Mac-1 이중 양성 세포의 결실에 의해 측정할 때 호중구감소증의 정도는 크게 감소되었고, 회복 속도는 5-FU으로만 처리된 쥐에 비해 MPIF-1 및 5-FU로 처리된 쥐에서 더욱 신속함. 5-FU로 처리한 후 G-CSF로 처리한 결과 혈액 중의 이중 양성 세포의 회복은 신속해짐. G-CSF로 처리된 마우스에서 회복 정도는 8일에서 MPIF-1로 처리된 마우스에서 관찰된 것보다 크게 감소하였음.·MPIF-1 및 G-CSF로 처리된 마우스는 MPIF-1 또는 G-CSF 단독으로 처리된 것보다 혈액중의 양성 세포의 정상상태의 레벨이 더 높았다. 5-FU로 처리된 마우스의 골수로부터 콜로니 형성은 크게 감소됨·5-FU로 처리하기 전에 MPIF-1로 처리하여 콜로니 형성에 대한 5-FU의 효과를 없앴음. MPIF-1 및 5-FU로 처리된 마우스에서 혈소판의 회복은 5-FU 단독으로 처리한 것보다 더 신속하고 더 강함. G-CSF의 첨가는 더 이상 효과 없음

이차 병리학-시험관내

실험 개요	세포 유형	MPIF-1 배취	MPIF-1 투여량 범위	결과
MPIF-1 또는 MPIF-1Δ23에 의한 칼슘 이동화의 측정	T 세포, B 세포, 단핵구, 호중구, 호염기체, 수상 세포, NK 세포 THP-1 세포	HG00300-B7HG00302-E2HG00302-E3HG00304-E2HG00304-E3HG00304-E6HG00304-E7HG00301-C1HG00311-C1	1 ~ 1000 ng/㎖	·100 ng/㎖에서 단핵구 및 수상 세포 중에 검출할만한 반응이 관찰됨·단핵 세포주 THP-1은 MPIF-1Δ23에 대하여 100 ng/㎖에서 최대 효과로 반응함

실험 개요	세포 유형	MPIF-1 배취	MPIF-1 투여량 범위	결과
MPIF-1Δ23의 주화성 활성의 측정	T 세포, 단핵구, 호중구, 림프구, 호산구, 호염기체, NK 세포, 혈소판	HG00300-B5HG00300-B7HG00302-E1HG00302-E2HG00303-E1HG00304-E2HG00304-E6HG00304-E7	0.1 ~ 1000 ng/㎖	·10 ng/㎖에서 최대 반응을 나타내는 휴지 T 세포에서 자극된 MPIF-1Δ23 주화성·MPIF-1Δ23은 100 ng/㎖에서 최대 효과를 나타내는 새로 유리된 단핵구에 대하여 주화성임·약한 주화성 반응은 호중구에서 관찰됨. 실험된 다른 세포들에서는 반응이 관찰되지 않음
MPIF-1 또는 MPIF-1Δ23이 단핵구에 미치는 영향	단핵구	HG00300-B7HG00302-E1HG00302-E2HG00302-E3HG00304-E3HG00304-E6HG00301-C1HG00311-C1	0.5 ~ 1000 ng/㎖	·유도된 MPIF-1Δ23은 적었지만, 새로 유리된 단핵구로부터 리소좀의 N-아세틸-β-D-글루코시다제의 방출은 가변성임·MPIF-1Δ23은 리소좀 효소 엘라스타제, 글루크로미다제 및 마일러퍼옥시다제의 방출에 영향을 미치지 않음·MPIF-1Δ23은 IL-1β, TNF-α, IL-10 또는 IL-12를 분리하기 위하여 단핵구를 유도하지 않음·MPIF-1Δ23은 활성화된 대식세포의 세포독성 활성 또는 상화성 파열에 영향을 미치지 않음
MPIF-1 또는 MPIF-1Δ23이 히스타민 방출에 미치는 영향	호염기체, 인간	HG00300-B5HG00300-B7HG00302-E2HG00304-E6	1 ~ 1000 ng/㎖	·MPIF-1 및 MPIF-1Δ23은 호염기체로부터 히스타민 방출을 유도하지 않음
MPIF-1 또는 MPIF-1Δ23이 NK 세포 매개 사멸에 미치는 영향	NK 세포, 인간	HG00302-E1HG00300-B7	1 ~ 100 ng/㎖	·MPIF-1 및 MPIF-1Δ23은 K562 세포의 IL-2 자극된 NK 세포 매개 사멸에 영향을 미치지 않음
MPIF-1 또는 MPIF-1Δ23이 혈소판 회합에 미치는 영향	혈소판, 인간	HG00302-E1HG00300-B7	0.1 ~ 100 ng/㎖	·MPIF-1Δ23은 혈소판 회합을 유도하거나 또는 조절하지 않음

실험 개요	세포 유형	MPIF-1 배취	MPIF-1 투여량 범위	결과
MPIF-1Δ23이 형질전환되지 않은 인간 세포의 성장에 미치는 영향	섬유아세포, 성상 세포, 쉬반 세포, 평활근 세포, 정맥 및 미세혈관 내피 세포, 골수, B 세포, T 세포, 단핵구, 호중구, 각질세포	HG00300-B7HG00300-B5HG00302-E1	0.1 ~ 1000 ng/㎖	·MPIF-1Δ23은 실험된 세포들의 증식을 유도, 강화 또는 억제하지 않는다.
MPIF-1 또는 MPIF-1Δ23이 IL-6 및 프로스타글란딘의 방출에 미치는 영향	인간 일차 내피 세포, 폐 섬유아세포 및 대동맥 평활근 세포	HG00300-B5HG00300-B7HG00302-E1HG00300-E2HG00304-E2HG00301-C1	0.1 ~ 1000 ng/㎖	·MPIF-1 및 MPIF-1Δ23은 IL-6 또는 프로스타글란딘의 방출에 영향을 미치지 않음
MPIF-1Δ23이 모세혈관의 형성에 미치는 영향	일차 미세혈관 내피 세포	HG00300-B7	0.1 ~ 10 ng/㎖	· MPIF-1Δ23은 시험관내 모세혈관의 형성을 유도하지 않음
MPIF-1이 내피 세포의 융합 단층을 통해 침윤하는 종양 세포의 성능에 미치는 영향	일차 내피 세포	HG00304-E2	1 ~ 100 ng/㎖	·효과 없음
MPIF-1 또는 MPIF-1Δ23이 말초 혈액 단핵 세포 또는 과립구를 IL-1로 활성화된 내피에 유착되는데 미치는 영향	일차 내피 세포	HG00300-B5HG00300-B5HG00304-E6HG00304-E7HG00301-C1	0.1 ~ 100 ng/㎖	·효과 없음

실시예 30

pHE4-5 발현 벡터를 사용하는 MPIF-1Δ23의 제조, 회수 및 정제

MPIF-1은 신규의 인간 β-케모킨이다. MPIF-1의 성숙형은 분자량이 11.2 kDa인 99 아미노산 펩티드로서 분리된다. 길이 중의 절단형(MPIF-1Δ23) 76 아미노산은 MPIF-1의 초기 발현 연구 중에 동정되었다. 바큘로바이러스 발현계에서, MPIF-1Δ23은 연속적으로 단리되고 서브클론화된다. 생리학적 분석 결과, 절단형은 전장 대응부보다 더 큰 활성을 갖는다는 것을 알 수 있다.

클로닝 및 발현

대동맥 내피 상보성 데옥시리보뉴클레산 라이브러리로부터 단리된 MPIF-1Δ23 유전자는 단일의 제한 효소 절단 부위 NdeI 및 Asp 718에서 발현 벡터 pHE4로 서브클로화되었고(도 62), 이.콜리 균주 SG 13009(미국 매릴랜드주 베데스다 소재의 수잔 고츠맨, 내쇼날 인스티튜트 오브 헬스에서 시판함)에서 유도된 K12로 형질전환되었다. 이.콜리 균주 외에도, pHE4를 사용하여 단백질 발현을 하기 위한 적당한 숙주로서 제공될 수 있는 것은 균주 DH5α및 W3110(ATCC 수탁 번호 27325)이다. pHE4 벡터는 두개의 lac 오퍼레이터를 갖는 강한 합성 촉진체를 포함한다. 이 촉진체로부터의 발현은 lac 리프레서의 존재에 의해 조절되고, 이소프로필 B-D-티오갈락토피라노사이드(IPTG) 또는 락토스를 사용하여 유도된다. 또한, 플라스미드는 MPIF-1Δ23 유전자의 하방에 합성 전사 말단체와 유효한 리보좀 결합 부위를 포함한다. 또한, 상기 벡터는 pUC 플라스미드의 복제 영역과 네오마이신포스포트랜스퍼라제 유전자를 포함하여 형질전환된 박테리아에서 카나마이신 내성을 제공한다.

제조 방법

발효 공정의 개요

MPIF-1Δ23에 대한 발효 공정은 하기 단계들로 나타내었고, 도 63에 도시하였다.

마스터 종자 은행

MPIF-1Δ23을 발현하는 플라스미드로 형질전환된 이.콜리의 마스터 세포 은행(MCB)은 굿 매뉴팩춰링 프랙틱스에서 제조되었다. 상기 은행은 글리세롤을 함유하는 배지에서 동결 보존물로서 제조하고, -80℃에서 냉동시켰다. 제조후에, 상기 MCB를 다른 미소 유기체를 갖는 오염물 또는 파아지의 부재를 검사하기 위하여 실험하였다.

제1 종자 단계

제1 종자 단계 배양물을 접종물 제조 배지를 함유하는 배플형 진탕 플라스크에서 제조하였다. 상기 진탕 플라스크는 해동된 종자 원료를 1:2000 희석에서 접종시키고, 상기 진탕기를 225 rpm, 37℃에서 12 시간 동안 유지시켰다.

생성 단계

생성 단계 배양물을 DO₂, pH, 온도 및 영양 공급 조절기가 장착된 100 리터들이 공급 배취 발효기에서 제조하였다. 상기 생성 배지(37℃)는 제1 종자 단계 배양물로 접종하여 600 nm에서 광학 밀도(OD) 0.20 단위/밀리미터를 제공하였다. 상기 배양물이 600 nm에서 10 + 또는 - 2 단위/밀리미터에 도달할 때, 단백질 발현은 IPTG(최종 농도 20 mM)의 첨가로 유도되었다. 세포는 유도된지 4 시간 후에 수거하였다.

세포 수거 단계

박테리아는 연속 유동 원심기를 사용하여 18,000 g에서 원심분리함으로써 회수하였다. 산출된 세포 페이스트는 -80℃에서 보관하였다.

MPIF-1Δ23의 회수

MPIF-1Δ23의 회수는 도 64에 개략적으로 도시하였다.

세포 용해

이.콜리 세포 페이스트를 해동시키고, 10배 부피량의 재현탁 완충액에서 재현탁시켰다. 이어서, 상기 세포를 분열시킨 다음 7000 psi에서 균질화기를 (2회) 통과시켰다.

봉입체 세척

상기 세포 용해물에 NaCl을 첨가하여 최종 농도가 0.5 M이 되도록 한 다음, 0.45 ㎛ 막을 사용하는 접선류 여과에 의해 2배로 농축시켰다. 남아있는 잔류물을 3 부피량의 세척액 2 완충액(100 mM 트리스-HCl, 500 mM NaCl 및 25 mM EDTA-Na₂) 및 1부피량의 세척액 1(100 mM 트리스-HCl, 25 mM EDTA-Na₂) 순으로 2회 여과하였다. 잔류물을 세척액 1 완충액으로 2배 희석하고, 불용성 분획을 연속 원심분리에 의해 수집하였다. 별법으로, 봉입체는 원심분리에 의해 세척될 수 있다.

봉입체 가용화

다음과 같은 원심분리에서 얻어진 펠릿을 9배로 충전된 봉입체 부피의 가용화 완충액(100 mM 트리스-HCl, 1.75M 구아니딘-HCl 및 25 mM EDTA-Na₂)에 현탁시켰다. 이 현탁액을 실온에서 먼저 2 내지 4 시간 동안 교반한 다음, 2 내지 10℃에서 12 내지 18 시간동안 교반하였다.

재중첩

현탁액을 원심분리하고, 상청액을 수집한 다음, 9배 부피량의 재중첩 완충액(100 mM 나트륨 아세테이트, 125 mM NaCl 및 2 mM EDTA-Na₂)과 혼합시켰다. 희석된 물질을 침전물이 침전되도록 약 2 시간(2 내지 10℃) 동안 유지시켰다. 이 물질을 여과한 다음, 처리 직후 또는 최대 72 시간 동안 보관시킨 다음 처리하였다.

정제

HS-50 양이온 교환 크로마토그래피

MPIF-1Δ23의 정제는 도 65에 개략적으로 도시하였다. 여과물을 50 mM NaOAc, 150 mM NaCl, pH 5.8 내지 6.2로 평형화된 POROS HS-50 칼럼에 적재하였다. 단백질을 NaCl(300 내지 1500 mM)로 단계식으로 용출시켰다. 분획을 500 mM NaCl로 용출시키고, 모은다음, 주사용 물로 2배 희석시켰다.

HQ-50/CM-20 음이온/양이온 교환 크로마토그래피

하기 HS-50 크로마토그래피에서 얻어진 수집 분획을 CM-1 완충액으로 평형화된 직렬 칼럼 세트(CM-20 칼럼 뒤에 HQ-50 칼럼이 위치함)에 적재하였다. MPIF-1Δ23을 NaCl(100 내지 900 mM)로 CM-20 칼럼에서 용출시켰다. 용출된 분획을 나트륨 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기이동(SDS-PAGE) 및 역상 고성능 액체 크로마토그래피로 분석하고, MPIF-1Δ23을 함유하는 분획을 모아서 초여과 또는 부가의 HS-50 칼럼을 통해 농축시켰다.

크기 배제 크로마토그래피

CM-20 용출물을 S-100 완충액으로 평형화시킨 Sephacryl-100 HR에 적재하였다. 분획을 수집하고, SDS-PAGE 및 역상 HPLC로 분석하였다. MPIF-1Δ23을 함유하는 분획을 모아서 0.2 ㎛ 필터를 사용하여 멸균 여과시킨 다음 2 내지 10℃에서 저장하였다.

대형 물질에 대한 규정

하기 표 7에 수록된 규정은 대형 MPIF-1Δ23에 대하여 나타내었다.

대형 MPIF-1Δ23의 방출에 대한 시험 및 실험적인 규정

정의	규정
외관	투명, 무색 용액
pH	5.8 ±0.2
BCA에 의한 단백질 농도	1~5 mg/㎖
순도*역상 HPLC크기 배제 HPLCSDS-PAGE(쿠마씨 블루 염색)환원 조건비환원 조건	≥90%≥90%≥90%≥90%
잔기 DNA	≤100 pg/mg 단백질
내독소LAL(Limulus amebocyte lysate) 겔 응괴	≤10 EU/mg 단백질
미생물 정량법(Ca+2이동화 분석에 의해 평가됨)	보고서 결과
* MPIF-1Δ23 제조물의 순도는 표준 기준물에 필적하며, 그 규정은 최근에 정의됨

약물 제품에 대한 규정

가공된 약물 제품은 상기 표 7에서 대형 물질에 대하여 기재된 바와 같이 모든 규정에 부합하고, 멸균 처리한다(21CRF610.12).

단핵구에서 세포내 Ca2+을 이동시키는 MPIF-1의 성능과 상관관계가 있는 콜로니 형성의 MPIF-1Δ23 매개 억제

MPIF-1Δ23은 시험관내 연질 아가(soft agar) 분석에서 LPP-CFC 콜로니 형성을 억제하고, THP-1 세포(인간 골수단핵 세포주)를 비롯한 단핵구에서 세포내 칼슘의 이동을 유도한다. 두가지 분석은 정제 및 안정성 연구에서 MPIF-1Δ23의 생리학적 활성을 평가하는데 사용하였다. LPP-CFC 분석에서, 새로 단리된 쥐 골수 세포는 다중 시토킨(5 ng/㎖ IL-3, 50 ng/㎖ SCF, 5 ng/㎖ M-CSF 및 10 ng/㎖ IL-1α)의 존재하에 연질 아가에서 평판배양하였다. 배양물을 14일간 배양시킨 후, 콜로니를 도립 현미경을 사용하여 평가하였다.

칼슘 이동화 분석은 새로 단리된 인간 단구체 또는 Fura-2(0.2 nM/밀리언)으로 적재된 THP-1 세포를 사용한다. 세포들이 MPIF-1Δ23으로 자극되면, Ca²⁺이동화는 형광측정계로 평가하였다. Ca²⁺이동화 분석은 MPIF-1Δ23 제조물의 활성을 나타내는 신속한 지표이다(표 8).

단핵구에서 세포내 Ca²⁺을 이동시키는 MPIF-1의 성능과 상관관계가 있는 콜로니 형성의 MPIF-1Δ23 매개 억제

MPIF-1 작제물/배취/조건	Ca2+이동화(ng/㎖)*	LPP-CFC 억제(ng/㎖)**
MPIF-1/HG00300-B5	1000	20~40
MPIF-1Δ23/HG00304-E2, 4℃에서 3개월간 보관	100	5~10
MPIF-1Δ23/HG00304, 1 주간 보관	100	5~10
MPIF-1Δ23/HG00304, 4 주간 보관	100	5~10
MPIF-1Δ23/HG00302-E2, 4℃에서 3개월간 보관	1000	>100
MPIF-1Δ23/HG00304-E3, CM 칼럼에서 첫번째 피크	100	5~10
MPIF-1Δ23/HG00304-E4, CM 칼럼에서 두번째 피크	100	5~10
MPIF-1Δ23/HG00304-E3, CM 칼럼에서 세번째 피크	>1000	>1000
* 인간 단핵구 및/또는 THP-1 세포에서 칼슘을 이동시키는데 필요한 최소 농도** 대조용에 비해 LPP-CFC 콜로니 형성의 50% 억제를 제공하는 농도

제제 및 보관

대형 MPIF-1Δ23을 무균상태로 제조하였고, 액상 제제는 멸균의 일회 사용 제품이다. 단백질을 50 mM 나트륨 아세테이트, 125 mM NaCl, pH 5.8의 완충액에서 완충시키고, 5 ㎖ Wheaton 타입 1 유리 바이엘에 충전시키고, 2 내지 8℃에서 보관하였다.

안정성

안정성 연구는 -80℃, 2 내지 8℃, 20 내지 25℃ 및 2 내지 8℃의 온도에서 나트륨 아세테이트로 pH 5, 6 및 7로 완충시킨 단백질 농도 1.0 mg/㎖를 사용하여 수행하였다. MPIF-1Δ23은 pH 5 내지 7의 10 mM 나트륨 아세테이트, 125 mM NaCl의 용액에서 2 내지 8℃에서 저장시킬 때 6 개월 이상 안정한 것으로 확인되었다. 최근 연구에서, 시료를 외관, 단백질 농도, 순도[SDS-PAGE (환원 및 비환원); 역상 및 크기 배제 HPLC] 및 활성(Ca²⁺이동화 생체분석)에 대하여 평가하여 전술한 규정에 부합시킨다.

잠복기 독물학 연구에 사용된 MPIF-1Δ23 배취(HG00300-E10)에 대한 안정성 연구를 시작하였다. 상기 연구에 사용된 MPIF-1Δ23 배취는 50 mM NaOAc, 125 mM NaCl, pH 5.9 중의 단백질 농도 4.0 mg/㎖로 조제하였다. 저장 조건은 상대 습도 60%에서 -80℃, 2 내지 8℃, 25℃ 및 37℃이고, 상대 습도 75%에서 45℃이다. 안정성 연구 기간은 25℃에서 12 개월, 37℃에서 6 개월 및 45℃에서 1 개월이다. 안정성은 외관, pH, 단백질 농도, 순도[SDS-PAGE (환원 및 비환원); 역상 및 크기 배제 HPLC] 및 활성(Ca²⁺이동화 생체 분석)에 대하여 평가하였다. 내독소 분석 및 바이오버든(bioburden) 시험은 선택된 시점에서 수행한다.

본 발명은 전술한 설명 및 실시예에 기재된 것과는 다른 방식으로 실시할 수 있음이 명백하다.

본 발명의 다양한 변경 및 수정이 본 발명의 기술적 사상의 범위내에서 가능하다.

본 명세서에 인용된 모든 특허 문헌들 및 출판물은 본 명세서에서 참고로 인용되고 있다.

[서열 목록]

(1) 서열 정보:

(i) 출원인: 휴먼 게놈 사이언시즈, 인코포레이티드

미국 매릴랜드주 20850 록빌 키 웨스트 애비뉴 9410

출원인/발명자: 겐츠 라이너 엘., 파텔 빅람,

크라이더 브렌트 엘., 장 준,

안토나시오 마이클, 멘드릭 도나,

지메네즈 파블로

(ii) 발명의 명칭: 골수양 선조 세포 억제 인자-1(MPIF-1), 단핵구 콜로니 억제 인자(M-CIF) 및 대식 세포 억제 인자-4(MIP-4)를 이용하여 질병 상태를치료하기 위한 치료 조성물 및 치료 방법

(iii) 서열의 수:57

(vi) 서신 주소:

(A) 수신인: 스턴, 케슬러, 골드스타인 & 팍스, 피.엘.엘.씨.

(B) 스트리트: 슈트 600 노스웨스트주 뉴욕 애비뉴 1100

(C) 도시명: 워싱톤

(D) 주명: DC

(E) 국가명: 미국

(F) 우편 번호: 20005-3934

(v) 컴퓨터 판독형:

(A) 매체형: 플로피 디스크

(B) 컴퓨터: IBM PC 호환 가능

(C) 작동체계: PC-DOS/MS-DOS

(D) 소프트웨어: PatentIn Release #1.0, Version #1.30

(vi) 본 출원의 자료:

(A) 출원 번호;

(B) 출원일;

(C) 분류기호:

(vii) 본 출원의 자료:

(A) 출원 번호; US 60/027,299

(B) 출원일; 1996년 9월 30일

(vii) 본 출원의 자료:

(A) 출원 번호; US 60/027,300

(B) 출원일; 1996년 9월 30일

(viii) 대리인/대리회사 정보:

(A) 성명: 스테프 에릭 케이

(B) 등록 번호: 36,688

(C) 참조/서류 번호: 1488.033PC09

(ix) 통신 정보:

(A) 전화 번호: 202-371-2600

(B) 팩스 번호: 202-371-2540

(2) 서열 번호 1에 관한 정보:

(i) 서열의 특성

(A) 길이 : 282 염기쌍

(B) 서열의 종류: 핵산

(C) 쇄의 수: 2본쇄

(D) 토폴로지: 양형태

(ii) 분자의 종류: DNA(게놈)

(ix) 특징:

(A) 명칭/키: CDS

(B) 존재 위치:1..279

[서열 1a]

[서열 1b]

(2) 서열 번호 2에 관한 정보:

(i) 서열의 특성

(A) 길이 : 93 아미노산

(B) 서열의 종류: 아미노산

(D) 토폴로지: 직선

(ii) 분자의 종류: 단백질

[서열 2]

(2) 서열 번호 3에 관한 정보:

(i) 서열의 특성

(A) 길이 : 363 염기쌍

(B) 서열의 종류: 핵산

(C) 쇄의 수: 2본쇄

(D) 토폴로지: 양형태

(ii) 분자의 종류: DNA(게놈)

(ix) 특징:

(A) 명칭/키: CDS

(B) 존재 위치:1..360

[서열 3a]

[서열 3b]

(2) 서열 번호 4에 관한 정보:

(i) 서열의 특성

(A) 길이 : 120 아미노산

(B) 서열의 종류: 아미노산

(D) 토폴로지: 직선

(ii) 분자의 종류: 단백질

[서열 4]

(2) 서열 번호 5에 관한 정보:

(i) 서열의 특성

(A) 길이 : 270 염기쌍

(B) 서열의 종류: 핵산

(C) 쇄의 수: 2본쇄

(D) 토폴로지: 직선

(ii) 분자의 종류: DNA(게놈)

(ix) 특징:

(A) 명칭/키: CDS

(B) 존재 위치:1..267

[서열 5]

(2) 서열 번호 6에 관한 정보:

(i) 서열의 특성

(A) 길이 : 89 아미노산

(B) 서열의 종류: 아미노산

(D) 토폴로지: 직선

(ii) 분자의 종류: 단백질

[서열 6]

(2) 서열 번호 7에 관한 정보:

(i) 서열의 특성

(A) 길이 : 100 아미노산

(B) 서열의 종류: 핵산

(C) 쇄의 수: 관련 없음

(D) 토폴로지: 직선

(ii) 분자의 종류: 펩티드

[서열 7]

(2) 서열 번호 8에 관한 정보:

(i) 서열의 특성

(A) 길이 : 76 아미노산

(B) 서열의 종류: 아미노산

(C) 쇄의 수: 관련 없음

(D) 토폴로지: 직선

(ii) 분자의 종류: 펩티드

[서열 8a]

[서열 8b]

(2) 서열 번호 9에 관한 정보:

(i) 서열의 특성

(A) 길이 : 78 아미노산

(B) 서열의 종류: 아미노산

(C) 쇄의 수: 관련 없음

(D) 토폴로지: 직선

(ii) 분자의 종류: 단백질

[서열 9]

(2) 서열 번호 10에 관한 정보:

(i) 서열의 특성

(A) 길이 : 599 염기쌍

(B) 서열의 종류: 핵산

(C) 쇄의 수: 2본쇄

(D) 토폴로지: 양형태

(ii) 분자의 종류: DNA(게놈)

(ix) 특징:

(A) 명칭/키: CDS

(B) 존재 위치:35..445

[서열 10a]

[서열 10b]

(2) 서열 번호 11에 관한 정보:

(i) 서열의 특성

(A) 길이 : 137 아미노산

(B) 서열의 종류: 아미노산

(D) 토폴로지: 직선

(ii) 분자의 종류: 단백질

[서열 11a]

[서열 11b]

(2) 서열 번호 12에 관한 정보:

(i) 서열의 특성

(A) 길이 : 26 염기쌍

(B) 서열의 종류: 핵산

(C) 쇄의 수: 1본쇄

(D) 토폴로지: 직선

(ii) 분자의 종류: cDNA

[서열 12]

(2) 서열 번호 13에 관한 정보:

(i) 서열의 특성

(A) 길이 : 26 염기쌍

(B) 서열의 종류: 핵산

(C) 쇄의 수: 1본쇄

(D) 토폴로지: 직선

(ii) 분자의 종류: cDNA

[서열 13]

(2) 서열 번호 14에 관한 정보:

(i) 서열의 특성

(A) 길이 : 27 염기쌍

(B) 서열의 종류: 핵산

(C) 쇄의 수: 1본쇄

(D) 토폴로지: 직선

(ii) 분자의 종류: cDNA

[서열 14]

(2) 서열 번호 15에 관한 정보:

(i) 서열의 특성

(A) 길이 : 27 염기쌍

(B) 서열의 종류: 핵산

(C) 쇄의 수: 1본쇄

(D) 토폴로지: 직선

(ii) 분자의 종류: cDNA

[서열 15]

(2) 서열 번호 16에 관한 정보:

(i) 서열의 특성

(A) 길이 : 48 염기쌍

(B) 서열의 종류: 핵산

(C) 쇄의 수: 1본쇄

(D) 토폴로지: 직선

(ii) 분자의 종류: cDNA

[서열 16]

(2) 서열 번호 17에 관한 정보:

(i) 서열의 특성

(A) 길이 : 36 염기쌍

(B) 서열의 종류: 핵산

(C) 쇄의 수: 1본쇄

(D) 토폴로지: 직선

(ii) 분자의 종류: cDNA

[서열 17]

(2) 서열 번호 18에 관한 정보:

(i) 서열의 특성

(A) 길이 : 88 염기쌍

(B) 서열의 종류: 핵산

(C) 쇄의 수: 1본쇄

(D) 토폴로지: 직선

(ii) 분자의 종류: cDNA

[서열 18]

(2) 서열 번호 19에 관한 정보:

(i) 서열의 특성

(A) 길이 : 104 염기쌍

(B) 서열의 종류: 핵산

(C) 쇄의 수: 1본쇄

(D) 토폴로지: 직선

(ii) 분자의 종류: cDNA

[서열 19]

(2) 서열 번호 20에 관한 정보:

(i) 서열의 특성

(A) 길이 : 89 염기쌍

(B) 서열의 종류: 핵산

(C) 쇄의 수: 1본쇄

(D) 토폴로지: 직선

(ii) 분자의 종류: cDNA

[서열 20]

(2) 서열 번호 21에 관한 정보:

(i) 서열의 특성

(A) 길이 : 94 염기쌍

(B) 서열의 종류: 핵산

(C) 쇄의 수: 1본쇄

(D) 토폴로지: 직선

(ii) 분자의 종류: cDNA

[서열 21]

(2) 서열 번호 22에 관한 정보:

(i) 서열의 특성

(A) 길이 : 32 염기쌍

(B) 서열의 종류: 핵산

(C) 쇄의 수: 1본쇄

(D) 토폴로지: 직선

(ii) 분자의 종류: cDNA

[서열 22]

(2) 서열 번호 23에 관한 정보:

(i) 서열의 특성

(A) 길이 : 83 아미노산

(B) 서열의 종류: 아미노산

(C) 쇄의 수: 관련 없음

(D) 토폴로지: 직선

(ii) 분자의 종류: 펩티드

[서열 23]

(2) 서열 번호 24에 관한 정보:

(i) 서열의 특성

(A) 길이 : 35 염기쌍

(B) 서열의 종류: 핵산

(C) 쇄의 수: 1본쇄

(D) 토폴로지: 직선

(ii) 분자의 종류: cDNA

[서열 24]

(2) 서열 번호 25에 관한 정보:

(i) 서열의 특성

(A) 길이 : 84 아미노산

(B) 서열의 종류: 아미노산

(C) 쇄의 수: 관련 없음

(D) 토폴로지: 직선

(ii) 분자의 종류: 펩티드

[서열 25]

(2) 서열 번호 26에 관한 정보:

(i) 서열의 특성

(A) 길이 : 32 염기쌍

(B) 서열의 종류: 핵산

(C) 쇄의 수: 1본쇄

(D) 토폴로지: 직선

(ii) 분자의 종류: cDNA

[서열 26]

(2) 서열 번호 27에 관한 정보:

(i) 서열의 특성

(A) 길이 : 77 아미노산

(B) 서열의 종류: 아미노산

(C) 쇄의 수: 관련 없음

(D) 토폴로지: 직선

(ii) 분자의 종류: 펩티드

[서열 27]

(2) 서열 번호 28에 관한 정보:

(i) 서열의 특성

(A) 길이 : 29 염기쌍

(B) 서열의 종류: 핵산

(C) 쇄의 수: 1본쇄

(D) 토폴로지: 직선

(ii) 분자의 종류: cDNA

[서열 28]

(2) 서열 번호 29에 관한 정보:

(i) 서열의 특성

(A) 길이 : 32 염기쌍

(B) 서열의 종류: 핵산

(C) 쇄의 수: 1본쇄

(D) 토폴로지: 직선

(ii) 분자의 종류: cDNA

[서열 29]

(2) 서열 번호 30에 관한 정보:

(i) 서열의 특성

(A) 길이 : 73 아미노산

(B) 서열의 종류: 아미노산

(C) 쇄의 수: 관련 없음

(D) 토폴로지: 직선

(ii) 분자의 종류: 펩티드

[서열 30]

(2) 서열 번호 31에 관한 정보:

(i) 서열의 특성

(A) 길이 : 21 염기쌍

(B) 서열의 종류: 핵산

(C) 쇄의 수: 1본쇄

(D) 토폴로지: 직선

(ii) 분자의 종류: cDNA

[서열 31]

(2) 서열 번호 32에 관한 정보:

(i) 서열의 특성

(A) 길이 : 21 염기쌍

(B) 서열의 종류: 핵산

(C) 쇄의 수: 1본쇄

(D) 토폴로지: 직선

(ii) 분자의 종류: cDNA

[서열 32]

(2) 서열 번호 33에 관한 정보:

(i) 서열의 특성

(A) 길이 : 35 염기쌍

(B) 서열의 종류: 핵산

(C) 쇄의 수: 1본쇄

(D) 토폴로지: 직선

(ii) 분자의 종류: cDNA

[서열 33]

(2) 서열 번호 34에 관한 정보:

(i) 서열의 특성

(A) 길이 : 100 아미노산

(B) 서열의 종류: 아미노산

(C) 쇄의 수: 관련 없음

(D) 토폴로지: 직선

(ii) 분자의 종류: 펩티드

[서열 34]

(2) 서열 번호 35에 관한 정보:

(i) 서열의 특성

(A) 길이 : 36 염기쌍

(B) 서열의 종류: 핵산

(C) 쇄의 수: 1본쇄

(D) 토폴로지: 직선

(ii) 분자의 종류: cDNA

[서열 35]

(2) 서열 번호 36에 관한 정보:

(i) 서열의 특성

(A) 길이 : 27 염기쌍

(B) 서열의 종류: 핵산

(C) 쇄의 수: 1본쇄

(D) 토폴로지: 직선

(ii) 분자의 종류: cDNA

[서열 36]

(2) 서열 번호 37에 관한 정보:

(i) 서열의 특성

(A) 길이 : 27 염기쌍

(B) 서열의 종류: 핵산

(C) 쇄의 수: 1본쇄

(D) 토폴로지: 직선

(ii) 분자의 종류: cDNA

[서열 37]

(2) 서열 번호 38에 관한 정보:

(i) 서열의 특성

(A) 길이 : 26 염기쌍

(B) 서열의 종류: 핵산

(C) 쇄의 수: 1본쇄

(D) 토폴로지: 직선

(ii) 분자의 종류: cDNA

[서열 38]

(2) 서열 번호 39에 관한 정보:

(i) 서열의 특성

(A) 길이 : 30 염기쌍

(B) 서열의 종류: 핵산

(C) 쇄의 수: 1본쇄

(D) 토폴로지: 직선

(ii) 분자의 종류: cDNA

[서열 39]

(2) 서열 번호 40에 관한 정보:

(i) 서열의 특성

(A) 길이 : 32 염기쌍

(B) 서열의 종류: 핵산

(C) 쇄의 수: 1본쇄

(D) 토폴로지: 직선

(ii) 분자의 종류: cDNA

[서열 40]

(2) 서열 번호 41에 관한 정보:

(i) 서열의 특성

(A) 길이 : 27 염기쌍

(B) 서열의 종류: 핵산

(C) 쇄의 수: 1본쇄

(D) 토폴로지: 직선

(ii) 분자의 종류: cDNA

[서열 41]

(2) 서열 번호 42에 관한 정보:

(i) 서열의 특성

(A) 길이 : 27 염기쌍

(B) 서열의 종류: 핵산

(C) 쇄의 수: 1본쇄

(D) 토폴로지: 직선

(ii) 분자의 종류: cDNA

[서열 42]

(2) 서열 번호 43에 관한 정보:

(i) 서열의 특성

(A) 길이 : 27 염기쌍

(B) 서열의 종류: 핵산

(C) 쇄의 수: 1본쇄

(D) 토폴로지: 직선

(ii) 분자의 종류: cDNA

[서열 43]

(2) 서열 번호 44에 관한 정보:

(i) 서열의 특성

(A) 길이 : 59 염기쌍

(B) 서열의 종류: 핵산

(C) 쇄의 수: 1본쇄

(D) 토폴로지: 직선

(ii) 분자의 종류: cDNA

[서열 44]

(2) 서열 번호 45에 관한 정보:

(i) 서열의 특성

(A) 길이 : 33 염기쌍

(B) 서열의 종류: 핵산

(C) 쇄의 수: 1본쇄

(D) 토폴로지: 직선

(ii) 분자의 종류: cDNA

[서열 45]

(2) 서열 번호 46에 관한 정보:

(i) 서열의 특성

(A) 길이 : 27 염기쌍

(B) 서열의 종류: 핵산

(C) 쇄의 수: 1본쇄

(D) 토폴로지: 직선

(ii) 분자의 종류: cDNA

[서열 46]

(2) 서열 번호 47에 관한 정보:

(i) 서열의 특성

(A) 길이 : 30 염기쌍

(B) 서열의 종류: 핵산

(C) 쇄의 수: 1본쇄

(D) 토폴로지: 직선

(ii) 분자의 종류: cDNA

[서열 47]

(2) 서열 번호 48에 관한 정보:

(i) 서열의 특성

(A) 길이 : 57 염기쌍

(B) 서열의 종류: 핵산

(C) 쇄의 수: 1본쇄

(D) 토폴로지: 직선

(ii) 분자의 종류: cDNA

[서열 48]

(2) 서열 번호 49에 관한 정보:

(i) 서열의 특성

(A) 길이 : 33 염기쌍

(B) 서열의 종류: 핵산

(C) 쇄의 수: 1본쇄

(D) 토폴로지: 직선

(ii) 분자의 종류: cDNA

[서열 49]

(2) 서열 번호 50에 관한 정보:

(i) 서열의 특성

(A) 길이 : 27 염기쌍

(B) 서열의 종류: 핵산

(C) 쇄의 수: 1본쇄

(D) 토폴로지: 직선

(ii) 분자의 종류: cDNA

[서열 50]

(2) 서열 번호 51에 관한 정보:

(i) 서열의 특성

(A) 길이 : 28 염기쌍

(B) 서열의 종류: 핵산

(C) 쇄의 수: 1본쇄

(D) 토폴로지: 직선

(ii) 분자의 종류: cDNA

[서열 51]

(2) 서열 번호 52에 관한 정보:

(i) 서열의 특성

(A) 길이 : 58 염기쌍

(B) 서열의 종류: 핵산

(C) 쇄의 수: 1본쇄

(D) 토폴로지: 직선

(ii) 분자의 종류: cDNA

[서열 52]

(2) 서열 번호 53에 관한 정보:

(i) 서열의 특성

(A) 길이 : 33 염기쌍

(B) 서열의 종류: 핵산

(C) 쇄의 수: 1본쇄

(D) 토폴로지: 직선

(ii) 분자의 종류: cDNA

[서열 53]

(2) 서열 번호 54에 관한 정보:

(i) 서열의 특성

(A) 길이 : 30 염기쌍

(B) 서열의 종류: 핵산

(C) 쇄의 수: 1본쇄

(D) 토폴로지: 직선

(ii) 분자의 종류: cDNA

[서열 54]

(2) 서열 번호 55에 관한 정보:

(i) 서열의 특성

(A) 길이 : 92 아미노산

(B) 서열의 종류: 아미노산

(C) 쇄의 수: 관련 없음

(D) 토폴로지: 직선

(ii) 분자의 종류: 단백질

[서열 55]

(2) 서열 번호 56에 관한 정보:

(i) 서열의 특성

(A) 길이 : 4208 염기쌍

(B) 서열의 종류: 핵산

(C) 쇄의 수: 2본쇄

(D) 토폴로지: 직선

(ii) 분자의 종류: DNA(게놈)

[서열 56a]

[서열 56b]

[서열 56c]

(2) 서열 번호 57에 관한 정보:

(i) 서열의 특성

(A) 길이 : 112 염기쌍

(B) 서열의 종류: 핵산

(C) 쇄의 수: 2본쇄

(D) 토폴로지: 직선

(ii) 분자의 종류: DNA(게놈)

[서열 57]

Claims (81)

1. (a) 서열 번호 4의 최초 22개 N-말단 아미노산 잔기 이상 내지 최초 53개 N-말단 아미노산 잔기 이하인 결실부를 갖는 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 골수양 선조 세포 억제 인자-1(MPIF-1) N-말단 결실 돌연변이;

   (b) 서열 번호 4의 마지막 C-말단 아미노산 잔기 이상 내지 마지막 52개 C-말단 아미노산 잔기 이하인 결실부를 갖는 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하며, N-말단 아미노산 잔기가 서열 번호 4의 아미노산 잔기 1(Met) 또는 22(Arg)인 MPIF-1 C-말단 결실 돌연변이;

   (c) 서열 번호 4의 최초 22개 N-말단 아미노산 잔기 이상 내지 최초 53개 N-말단 아미노산 잔기 이하인 결실부와, 서열 번호 4의 마지막 C-말단 아미노산 잔기 이상 내지 마지막 52개 C-말단 아미노산 잔기 이하인 결실부를 갖는 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 MPIF-1 N-말단 및 C-말단 결실 돌연변이;

   (d) (a)의 MPIF-1 결실 돌연변이의 아미노산 서열과 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드;

   (e) (b)의 MPIF-1 결실 돌연변이의 아미노산 서열과 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드;

   (f) (c)의 MPIF-1 결실 돌연변이의 아미노산 서열과 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드;

   (g) 1개 이상의 아미노산 치환외에 (a)의 MPIF-1 결실 돌연변이의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드;

   (h) 1개 이상의 아미노산 치환외에 (b)의 MPIF-1 결실 돌연변이의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드; 및

   (i) 1개 이상의 아미노산 치환외에 (c)의 MPIF-1 결실 돌연변이의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드로 구성된 군에서 선택된 폴리펩티드의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하여 골수양 선조 세포의 증식 또는 분화를 억제하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 개체가 인간인 것이 특징인 방법.
3. 제1항에 있어서, 골수양 선조 세포가 저 증식능 콜로니 형성 세포(LPP-CFC)인 것이 특징인 방법.
4. 제1항에 있어서, 골수양 선조 세포가 콜로니 형성 유니트 과립구 및 단핵구 세포(CFU-GM)인 것이 특징인 방법.
5. 제1항에 있어서, 상기 개체가 분열 세포를 죽이는 치료를 진행하는 것이 특징인 방법.
6. 제5항에 있어서, 상기 치료가 화학 치료 또는 방사선 치료에서 선택되는 것이 특징인 방법.
7. 제6항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 치료전에 투여되는 것이 특징인 방법.
8. 제7항에 있어서, 치료 후에 골수자극제를 더 투여하는 것이 특징인 방법.
9. 제8항에 있어서, 골수자극제가 과립구 콜로니 자극 인자, 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자, 인터루킨-11 및 트롬보포이에틴으로 구성된 군에서 선택되는 것이 특징인 방법.
10. 제6항에 있어서, 상기 폴리펩티드의 투여가 혈소판 또는 과립구의 회복을 가속시키는 것이 특징인 방법.
11. 제10항에 있어서, 상기 혈소판 또는 과립구의 회복 가속화로 혈소판감소증 또는 호중구감소증을 경감시키는 것이 특징인 방법.
12. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 골수증식성 질병을 치료하기 위해 투여되는 것이 특징인 방법.
13. 제12항에 있어서, 상기 질병이 본태성 혈소판 증가증(ET), 진성 다혈구증(PV) 및 병인불명 골수양화생(AMM)으로 구성된 군에서 선택되는 것이 특징인 방법.
14. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 (a)인 것이 특징인 방법.
15. 제14항에 있어서, 상기 돌연변이가 최초 37개 N-말단 아미노산 잔기 이상 내지 최초 53개 N-말단 아미노산 잔기 이하의 결실부를 가지는 것이 특징인 방법.
16. 제15항에 있어서, 상기 돌연변이가 최초 48개 N-말단 아미노산 잔기 이상 내지 최초 53개 N-말단 아미노산 잔기 이하의 결실부를 가지는 것이 특징인 방법.
17. 제15항에 있어서, 상기 돌연변이가 최초 37개 N-말단 아미노산 잔기 이상 내지 최초 48 N-말단 아미노산 잔기 이하의 결실부를 가지는 것이 특징인 방법.
18. 제17항에 있어서, 상기 돌연변이가 Leu(38)∼Asn(120); Glu(39)∼Asn(120); Leu(44)∼Asn(120); Asp(45)∼Asn(120); Arg(46)∼Asn(120); His(48)∼Asn(120); Ala(49)∼Asn(120)으로 구성된 군에서 선택된 서열 번호 4에 기재된 바와 같은 아미노산을 가지는 것이 특징인 방법.
19. 제18항에 있어서, 상기 돌연변이가 아미노산 서열 Asp(45)∼Asn(120)을 가지는 것이 특징인 방법.
20. 제14항에 있어서, 상기 돌연변이의 아미노산 서열이 N-말단에 첨가된 아미노산 Met를 포함하는 것이 특징인 방법.
21. 제15항에 있어서, 상기 돌연변이의 아미노산 서열이 N-말단에 첨가된 아미노산 Met를 포함하는 것이 특징인 방법.
22. 제16항에 있어서, 상기 돌연변이의 아미노산 서열이 N-말단에 첨가된 아미노산 Met를 포함하는 것이 특징인 방법.
23. 제17항에 있어서, 상기 돌연변이의 아미노산 서열이 N-말단에 첨가된 아미노산 Met를 포함하는 것이 특징인 방법.
24. 제18항에 있어서, 상기 돌연변이의 아미노산 서열이 N-말단에 첨가된 아미노산 Met를 포함하는 것이 특징인 방법.
25. 제19항에 있어서, 상기 돌연변이의 아미노산 서열이 N-말단에 첨가된 아미노산 Met를 포함하는 것이 특징인 방법.
26. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 (d)인 것이 특징인 방법.
27. 제26항에 있어서, 상기 아미노산 서열이 (a)에 기재된 MPIF-1 N-말단 결실 돌연변이의 아미노산 서열과 97% 이상 동일한 것이 특징인 방법.
28. 제27항에 있어서, 상기 아미노산 서열이 (a)에 기재된 MPIF-1 N-말단 결실 돌연변이의 아미노산 서열과 99% 이상 동일한 것이 특징인 방법.
29. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 (g)인 것이 특징인 방법.
30. 제29항에 있어서, 하나 이상의 아미노산 치환이 Asp(45)Ala; Asp(45)Gly; Asp(45)Ser; Asp(45)Thr; Asp(45)Met; Asp(53)Ala; Asp(53)Gly; Asp(53)Ser; Asp(53)Thr; Asp(53)Met; Ser(51)Gly; Ser(34)Gly; Pro(60)Thr 및 Ser(70)Ala으로 구성된 군에서 선택되는 것이 특징인 방법.
31. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 (b)인 것이 특징인 방법.
32. 제31항에 있어서, 상기 돌연변이가 마지막 15개 C-말단 아미노산 잔기 이상 내지 마지막 52개 C-말단 아미노산 잔기 이하의 결실부를 가지는 것이 특징인 방법.
33. 제32항에 있어서, 상기 돌연변이가 마지막 20개 C-말단 아미노산 잔기 이상 내지 마지막 52개 C-말단 아미노산 잔기 이하의 결실부를 가지는 것이 특징인 방법.
34. 제33항에 있어서, 상기 돌연변이가 마지막 36개 C-말단 아미노산 잔기 이상 내지 마지막 52개 C-말단 아미노산 잔기 이하의 결실부를 가지는 것이 특징인 방법.
35. 제34항에 있어서, 상기 돌연변이가 마지막 41개 C-말단 아미노산 잔기 이상 내지 마지막 52개 C-말단 아미노산 잔기 이하의 결실부를 가지는 것이 특징인 방법.
36. 제31항에 있어서, 상기 돌연변이가 마지막 48개 C-말단 아미노산 잔기 이상 내지 마지막 52개 C-말단 아미노산 잔기 이하의 결실부를 가지는 것이 특징인 방법.
37. 제31항에 있어서, 상기 아미노산 서열이 N-말단에 첨가된 아미노산 Met을 포함하는 것이 특징인 방법.
38. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 (e)인 것이 특징인 방법.
39. 제38항에 있어서, 상기 아미노산 서열이 (b)에 기재된 MPIF-1 C-말단 결실 돌연변이의 아미노산 서열과 97% 이상 동일한 것이 특징인 방법.
40. 제39항에 있어서, 상기 아미노산 서열이 (b)에 기재된 MPIF-1 C-말단 결실 돌연변이의 아미노산 서열과 99% 이상 동일한 것이 특징인 방법.
41. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 (h)인 것이 특징인 방법.
42. 제41항에 있어서, 하나 이상의 아미노산 치환이 Asp(45)Ala; Asp(45)Gly; Asp(45)Ser; Asp(45)Thr; Asp(45)Met; Asp(53)Ala; Asp(53)Gly; Asp(53)Ser; Asp(53)Thr; Asp(53)Met; Ser(51)Gly; Ser(34)Gly; Pro(60)Thr; Ser(70)Ala; Ala(21)Met; Thr(24)Ala; Lys(25)Asn; Asp(26)Ala; Glu(30)Gln; Glu(28)Gln으로 구성된 군에서 선택되는 것이 특징인 방법.
43. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 (c)인 것이 특징인 방법.
44. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 (f)인 것이 특징인 방법.
45. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 (i)인 것이 특징인 방법.
46. (a) 서열 번호 4의 최초 22개 N-말단 아미노산 잔기 이상 내지 최초 53개 N-말단 아미노산 잔기 이하의 결실부를 갖는 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 골수양 선조 세포 억제 인자-1(MPIF-1) N-말단 결실 돌연변이;

    (b) (a)에 기재된 MPIF-1 결실 돌연변이의 아미노산 서열과 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드; 및

    (c) 1개 이상의 아미노산 치환외에 (a)에 기재된 MPIF-1 결실 돌연변이의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드로 구성된 군에서 선택되며, 서열 번호 4에 기재된 바와 같은 Glu(39)∼Asn(120); Leu(44)∼Asn(120); Asp(45)∼Asn(120) 및 Arg(46)∼Asn(120)으로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하지 않고 골수양 선조 세포의 증식 또는 분화를 억제하는 것이 특징인 분리된 폴리펩티드.
47. 제46항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 (a)인 것이 특징인 분리된 폴리펩티드.
48. 제47항에 있어서, 상기 돌연변이가 최초 37개 N-말단 아미노산 잔기 이상 내지 최초 53개 N-말단 아미노산 잔기 이하의 결실부를 가지는 것이 특징인 분리된 폴리펩티드.
49. 제48항에 있어서, 상기 돌연변이가 최초 48개 N-말단 아미노산 잔기 이상 내지 최초 53개 N-말단 아미노산 잔기 이하의 결실부를 가지는 것이 특징인 분리된 폴리펩티드.
50. 제49항에 있어서, 상기 돌연변이가 최초 37개 N-말단 아미노산 잔기 이상 내지 최초 48개 N-말단 아미노산 잔기 이하의 결실부를 가지는 것이 특징인 분리된 폴리펩티드.
51. 제50항에 있어서, 상기 돌연변이가 서열 번호 4에 도시된 바와 같은 Leu(38)∼Asn(120); His(48)∼Asn(120); 및 Ala(49)∼Asn(120)으로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 가지는 것이 특징인 분리된 폴리펩티드.
52. 제47항에 있어서, 상기 돌연변이의 아미노산 서열이 N-말단에 첨가된 아미노산 Met를 포함하는 것이 특징인 분리된 폴리펩티드.
53. 제48항에 있어서, 상기 돌연변이의 아미노산 서열이 N-말단에 첨가된 아미노산 Met를 포함하는 것이 특징인 분리된 폴리펩티드.
54. 제49항에 있어서, 상기 돌연변이의 아미노산 서열이 N-말단에 첨가된 아미노산 Met를 포함하는 것이 특징인 분리된 폴리펩티드.
55. 제50항에 있어서, 상기 돌연변이의 아미노산 서열이 N-말단에 첨가된 아미노산 Met를 포함하는 것이 특징인 분리된 폴리펩티드.
56. 제51항에 있어서, 상기 돌연변이의 아미노산 서열이 N-말단에 첨가된 아미노산 Met를 포함하는 것이 특징인 분리된 폴리펩티드.
57. 제46항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 (b)인 것이 특징인 방법.
58. 제57항에 있어서, 상기 아미노산 서열이 (a)에 기재된 MPIF-1 N-말단 결실 돌연변이의 아미노산 서열과 97% 이상 동일한 것이 특징인 분리된 폴리펩티드.
59. 제58항에 있어서, 상기 아미노산 서열이 (a)에 기재된 MPIF-1 N-말단 결실 돌연변이의 아미노산 서열과 99% 이상 동일한 것이 특징인 분리된 폴리펩티드.
60. 제46항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 (c)인 것이 특징인 분리된 폴리펩티드.
61. 제60항에 있어서, 하나 이상의 아미노산 치환이 Asp(45)Ala; Asp(45)Gly; Asp(45)Ser; Asp(45)Thr; Asp(45)Met; Asp(53)Ala; Asp(53)Gly; Asp(53)Ser; Asp(53)Thr; Asp(53)Met; Ser(51)Gly; Ser(34)Gly; Pro(60)Thr 및 Ser(70)Ala으로 구성된 군에서 선택되는 것이 특징인 분리된 폴리펩티드.
62. 제46항에 있어서, 재조합 숙주 세포내에서 생산되거나 함유되어 있는 것이 특징인 분리된 폴리펩티드.
63. 제62항에 있어서, 상기 숙주 세포가 이.콜리(E.coli)인 것이 특징인 분리된 폴리펩티드.
64. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 약학적 허용 담체 또는 부형체와 함께 투여되는 것이 특징인 방법.
65. 제46항에 있어서, 약학적 허용 담체 또는 부형체가 함께 사용되는 것이 특징인 분리된 폴리펩티드.
66. 제46항에 기재된 폴리펩티드를 암호하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
67. 제66항에 있어서, DNA인 것이 특징인 분리된 폴리뉴클레오티드.
68. 제66항에 기재된 폴리뉴클레오티드를 벡터내로 삽입하는 단계를 포함하여 재조합 벡터를 제조하는 방법.
69. 제68항에 기재된 방법으로 제조한 재조합 벡터.
70. 제69항에 기재된 재조합 벡터를 숙주 세포내로 도입하는 단계를 포함하여 재조합 숙주 세포를 제조하는 방법.
71. 제70항에 기재된 방법으로 제조된 재조합 숙주 세포.
72. 제46항에 있어서,

    폴리펩티드를 암호하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 숙주 세포내로 도입하는 단계;

    숙주 세포를 배양하는 단계; 및

    폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는 방법으로 제조된 분리된 폴리펩티드.
73. 벡터가 발현되는 조건하에 제71항에 기재된 재조합 숙주 세포를 배양하는 단계;

    폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는 폴리펩티드를 생성하는 방법.
74. (a) 서열 번호 4의 마지막 C-말단 아미노산 잔기 이상 내지 마지막 52개 C-말단 아미노산 잔기 이하의 결실부를 가지는 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하며, N-말단 아미노산 잔기가 서열 번호 4의 아미노산 잔기 1(Met) 또는 22(Arg)인 MPIF-1 C-말단 결실 돌연변이;

    (b) (a)에 기재된 MPIF-1 결실 돌연변이의 아미노산 서열과 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드; 및

    (c) 1개 이상의 아미노산 치환외에 (a)에 기재된 MPIF-1 결실 돌연변이의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드를 포함하는 군에서 선택된 분리된 폴리펩티드.
75. (a) 서열 번호 4의 최초 22개 N-말단 아미노산 잔기 이상 내지 최초 53개 N-말단 아미노산 잔기 이하의 결실부와, 서열 번호 4의 마지막 C-말단 아미노산 잔기 이상 내지 마지막 52개 C-말단 아미노산 잔기 이하의 결실부를 가지는 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 MPIF-1 N-말단 및 C-말단 결실 돌연변이;

    (b) (a)에 기재된 MPIF-1 결실 돌연변이의 아미노산 서열과 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드; 및

    (c) 1개 이상의 아미노산 치환외에 (a)에 기재된 MPIF-1 결실 돌연변이의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드로 구성된 군에서 선택된 분리된 폴리펩티드.
76. (a) 서열 번호 11의 최초 45개 N-말단 아미노산 잔기 이상 내지 최초 59개 N-말단 아미노산 잔기 이하의 결실부를 갖는 서열 번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 골수양 선조 세포 억제 인자-1(MPIF-1) 접목 변형체의 N-말단 결실 돌연변이;

    (b) (a)에 기재된 돌연변이의 아미노산 서열과 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드; 및

    (c) 1개 이상의 아미노산 치환외에 (a)에 기재된 결실 돌연변이의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드로 구성된 군에서 선택되는 것이 특징인 분리된 폴리펩티드.
77. 제76항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 (a)인 것이 특징인 분리된 폴리펩티드.
78. 제77항에 있어서, 상기 돌연변이가 서열 번호 11에 도시된 바와 같은 Met(46)∼Asn(137); Pro(54)∼Asn(137); 및 His(60)∼Asn(137)으로 구성된 군에서 선택된 아미노산을 가지는 것이 특징인 분리된 폴리펩티드.
79. (a) 서열 번호 2의 최초 20개 N-말단 아미노산 잔기 이상 내지 최초 40개 N-말단 아미노산 잔기 이하의 결실부를 갖는 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 단핵구 콜로니 억제 인자(MCIF) N-말단 결실 돌연변이;

    (b) 서열 번호 2의 마지막 C-말단 아미노산 잔기 이상 내지 마지막 25개 C-말단 아미노산 잔기 이하의 결실부를 가지는 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하며, N-말단 아미노산 잔기가 서열 번호 2의 아미노산 잔기 1(Met) 또는 20(Thr)인 M-CIF C-말단 결실 돌연변이;

    (c) 서열 번호 2의 최초 20개 N-말단 아미노산 잔기 이상 내지 최초 40개 N-말단 아미노산 잔기 이하의 결실부와, 서열 번호 2의 마지막 C-말단 아미노산 잔기 이상 내지 마지막 25개 C-말단 아미노산 잔기 이하의 결실부를 가지는 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 M-CIF N-말단 및 C-말단 결실 돌연변이;

    (d) (a)에 기재된 M-CIF 결실 돌연변이의 아미노산 서열과 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드;

    (e) (b)에 기재된 M-CIF 결실 돌연변이의 아미노산 서열과 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드;

    (f) (c)에 기재된 M-CIF 결실 돌연변이의 아미노산 서열과 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드;

    (g) 1개 이상의 아미노산 치환외에 (a)에 기재된 M-CIF 결실 돌연변이의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드;

    (h) 1개 이상의 아미노산 치환외에 (b)에 기재된 M-CIF 결실 돌연변이의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드; 및

    (i) 1개 이상의 아미노산 치환외에 (c)에 기재된 M-CIF 결실 돌연변이의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드를 포함하는 군에서 선택되는 것이 특징인 분리된 폴리펩티드.
80. 폴리펩티드가 (a) 골수보호; (b) 조혈 선조 세포의 증식 억제; (c) 패혈증 치료; (d) TNF-α 생성 억제; (e) 신장 손상 치료; (f) 관절염 또는 관절 염증 치료; (g) 소장결장염 치료; (h) 루프스 치료로 구성된 군에서 선택된 용도를 위해 투여되는 것이 특징인 제79항에 기재된 폴리펩티드의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하여 개체를 치료하는 방법.
81. (a) 서열 번호 2의 아미노산 1∼93;

    (b) 서열 번호 2의 아미노산 20∼93;

    (c) (a)의 아미노산 서열과 95% 이상 동일한 아미노산 서열;

    (d) (b)의 아미노산 서열과 95% 이상 동일한 아미노산 서열;

    (e) 하나 이상의 보존성 아미노산 치환 외에 (a)와 동일한 아미노산 서열;

    (f) 하나 이상의 보존성 아미노산 치환 외에 (b)와 동일한 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택된 서열을 포함하고, (a)패혈증 치료; (b) TNF-α생성 억제; (c) 신장 손상 치료; (d) 관절염 또는 관절 염증 치료; (e) 소장결장염 치료 및 (f) 루프스 치료로 구성된 군에서 선택된 용도를 위해 투여되는 것이 특징인 분리된 폴리펩티드를 유효량으로 개체에게 투여하여 개체를 치료하는 방법.