KR100688051B1 - 각질세포-유래된 인터페론 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 인터페론 부류중의 하나인 신규한 KDI 단백질에 관한 것이다. 특히, "KDI"로 명명된 사람 인터페론 폴리펩티드를 암호화하는 분리된 핵산 분자가 제공된다. 또한, KDI 폴리펩티드 및 이를 제조하기 위한 벡터, 숙주 세포 및 재조합 방법이 제공된다. 또한 본 발명은 KDI 활성의 효능제 및 길항제를 동정하는 스크리닝 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 면역계-관련 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
인터페론, KDI 단백질, 면역계-관련 질환

Description

각질세포-유래된 인터페론{Keratinocyte derived interferon}
본 발명은 인터페론 부류 중의 하나인 폴리펩티드를 암호화하는 신규한 사람 유전자에 관한 것이다. 보다 상세히, 일명 "각질세포-유래된 인터페론" 또는 "KDI"라고 하는 사람 폴리펩티드를 암호화하는 분리된 핵산 분자가 제공된다. 또한, KDI 폴리펩티드 및 이를 제조하기 위한 벡터, 숙주 세포 및 재조합 방법이 제공된다. 또한, 면역계 질환을 탐지하는 진단방법 및 면역계 질환을 치료하는 방법이 제공된다. 또한, 본 발명은 KDI의 효능제 및 길항제를 동정하는 스크리닝 방법에 관한 것이다.
인터페론(IFN)은 아주 다양한 진핵 세포가 각종 자극에 노출되는 경우 분비되는 잘 알려진 사이토킨 부류이다. 인터페론은 이들의 화학적 및 생물학적 특징에 의해 네 그룹으로 분류된다: IFN-알파(백혈구), IFN-베타(섬유아세포), IFN-감마(림프구) 및 IFN-오메가(백혈구). IFN-알파 및 베타는 I형 인터페론으로 알려져 있다. IFN-감마는 II형 또는 면역 인터페론으로 알려져 있다. 사람 게놈에서 단일 작용성 유전자는, IFN-알파 및 IFN-베타와 구조적으로 다소 관련은 있으나 IFN-감마 와는 무관한 단량체 당단백질인 인터페론 오메가(IFN-오메가)를 암호화한다. IFN-오메가는 바이러스-감염된 백혈구에 의해 사람 백혈구 인터페론의 주 성분으로서 분비된다. IFN은 항바이러스, 면역조절 및 항증식 활성을 나타낸다. 인터페론의 임상학적 잠재능은 인정되어 왔으며 이를 요약하면 다음과 같다.
항바이러스성: IFN은 임상학적으로 항바이러스 요법을 위해, 예를 들면 AIDS(Lane, Semin. Oncol. 18:46-52 (Oct. 1991)); 만성 B형 간염, C형 간염(Woo, M.H. and Brunakis, T.G., Ann. Parmacother, 31:330-337 (March 1997); Gibas, A.L., Gastroenterologist, 1:129-142 (June 1993)), D형 간염을 포함하는 바이러스성 간염; 유두종 바이러스(Levine, L.A. et al., Urology 47:553-557 (April 1996)), 헤르페스(Ho, M., Annu. Rev. Med. 38:51-59 (1987)), 바이러스성 뇌염(Wintergerst et al., Infection, 20:207-212 (July 1992))의 치료, 및 비염 및 호흡기 감염(Ho, M., Annu. Rev. Med. 38:51-59 (1987))의 예방에 사용되어 왔다.
항기생충성: IFN은 항기생충 요법으로, 예를 들면, 크립토스포리듐 파르븀 감염(Rehg, J.E., J. Infect. Des. 174:229-232 (July 1996))의 치료를 위해 IFN-감마가 제시되어 왔다.
항세균성: IFN은 임상학적으로 항세균 요법에 사용되어 왔다. 예를 들면, IFN-감마는 다수약물-내성 폐렴(Condos, R. et al., Lancet 349:1513-1515 (1997))의 치료에 사용되어 왔다.
항암: 인터페론 요법이 여러 암(예, 모발상세포 백혈병(Hofmann et al., Cancer Treat. Rev. 12(Suppl. B):33-37 (Dec. 1985)), 급성 골수성 백혈병(Stone, R.M. et al., Am. J. Clin. Oncol. 16:159-163 (April 1993)), 골육종(Strander, H. et al., Acta Oncol. 34:877-880 (1995)), 기저세포 암(Dogan, B. et al., Cancer Lett. 91:215-219 (May 1995)), 신경교종(Fetell, M.R. et al., Cancer 65: 78-83 (Jan. 1990), 신장 세포 암(Aso, Y. et al., Prog. Clin. Biol. Res. 303:653-659 (1989)), 다발성 골수종(Peest, D. et al., Br. J. Haematol. 94:425-432 (Sept. 1996)), 흑색종(Ikic, D. et al., Int. J. Dermatol. 34:872-874 (Dec. 1995)) 및 호지킨병(Rybak, M.E. et al., J. Biol. Response Mod. 9:1-4 (Feb. 1990))의 치료에 사용되어 왔다. 알파 인터페론과 테모졸로미드를 병행 사용하여 진행 암을 상승적으로 치료한 것이 또한 보고되었다(Dugan, M.H.의 국제특허공개 WO9712630).
면역요법: IFN은 임상학적으로 면역요법을 위해, 또는 보다 특정적으로는, 예를 들면 (1) 이식편 대 숙주 거부반응을 방지하거나 (2) 관절염, 다발성 경화증과 같은 자가면역 질환의 진행을 차단하거나, (3) 당뇨병을 경감시키는데 사용되어 왔다. IFN-베타는 미국에서 다발성 경화증의 치료제로서(즉, 면역억제제로서) 판매할 수 있도록 승인되었다. 최근에 다발성 경화증 환자의 경우 I형 인터페론 및 인터루킨-2의 생성이 감소된다는 것이 보고되었다(Wandinger, K.P. et al., J. Neurol. Sci. 149:87-93 (1997)). 또한, 재조합 IFN-알파를 사용한 면역요법(재조합 사람 IL-2와 병용)이 자가 골수 또는 혈액 간세포의 이식후 림프종 환자에게 성공적으로 사용되어 왔으며, 이는 이식후 질환의 회복을 높일 수 있다(Nagler, A. et al., Blood 89: 3951-3959 (June 1997)).
항알레르기: IFN-감마의 투여가 포유류에서 알레르기를 치료하는데 사용되어 왔다(Parkin, J.M 및 Pinching, A.J.의 국제특허공개 WO8701288). 또한, 최근에 알레르기성 천식을 앓고 있는 환자의 경우 IL-12의 생성이 감소되고 IL-12-의존성 IFN-감마의 분비가 감소된다는 것이 증명되었다(van der Pouw Kraan, T.C. et al., J. Immunol. 158:5560-5565 (1997)). 따라서, IFN은 체액 반응을 억제함으로써 알레르기를 치료하는데 유용할 수 있다.
백신 보조: 인터페론은 예방 또는 치료적 예방접종의 경우에 면역반응을 증강시키거나 자극하는 보조제 또는 공동보조제로서 사용될 수 있다(Heath, A.W. and Playfair, J.H.L., Vaccine 10:427-434 (1992)).
여러 용도를 위해, 예를 들면 면역요법 뿐만 아니라 항바이러스, 항기생충, 항세균 또는 항암 요법을 위해 또는 증가된 인터페론 활성이 요구되는 모든 의학적 증세 또는 상태를 위해, 신규한 인터페론 단백질이 개발될 필요가 당업계에 명백히 존재한다.
발명의 요약
본 발명은 서열번호 2로 제시된 완전한 아미노산 서열 또는 1998년 12월 1일에 ATCC 수탁번호 203500으로서 플라스미드 DNA로 기탁된 cDNA 클론에 의해 암호화된 완전한 아미노산 서열을 갖는 KDI 폴리펩티드의 한 부분 이상을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분리된 핵산 분자를 제공한다. 기탁된 KDI 클론(HKAPI15)을 서열분석함으로써 결정된 뉴클레오티드 서열(도 1(서열번호 1)에 도시됨)은 뉴클레오티드 위치 35-37에 N-말단 메티오닌을 암호화하는 개시코돈을 포함하여 207개 아미노산 잔기의 완전한 폴리펩티드를 암호화하는 개방형 판독 프레임을 함유한다. 본 발명의 핵산 분자는 서열번호 2에 제시된 N-말단 메티오닌을 제외한 완전한 아미노산 서열을 암호화하는 것을 포함하며, 이 분자는 또한 KDI 아미노산 서열의 N-말단에 융합된 추가의 아미노산을 암호화할 수 있다.
암호화된 폴리펩티드는 도 1에서 밑줄친 27개 아미노산의 추정 리더 서열을 가지며, 추정된 성숙한 KDI 단백질의 아미노산 서열이 또한 도 1에서 아미노산 잔기 28-207로서 및 서열번호 2에서 잔기 1-207로서 기술되어 있다.
도 1(서열번호 2)의 잔기 165 내지 183은 인터페론 폴리펩티드, 특히 KDI 폴리펩티드에 대한 특징적 서열을 포함한다. 따라서, 도 1의 잔기 165 내지 183을 포함하는 폴리펩티드 및 이러한 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 바람직하다.
따라서, 본 발명의 한 가지 관점은, (a) 서열번호 2의 완전한 아미노산 서열을 갖는 KDI 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열, (b) N-말단 메티오닌을 제외한 서열번호 2의 완전한 아미노산 서열(즉, 서열번호 2의 잔기 2-207)을 갖는 KDI 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열, (c) 서열번호 2에서 잔기 28-207로 제시된 성숙한 KDI 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열, (d) 서열번호 2의 잔기 165-183을 암호화하는 뉴클레오티드 서열, (e) 클론 HKAPI15에 함유된 사람 cDNA에 의해 암호화된 완전한 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열, (f) N-말단 메티오닌을 제외한 클론 HKAPI15에 함유된 사람 cDNA에 의해 암호화된 완전한 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열, (g) 클론 HKAPI15에 함유된 사람 cDNA에 의해 암호화된 성숙한 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 및 (h) 상기 (a), (b), (c), (d), (e), (f) 또는 (g)의 임의의 뉴클레오티드 서열과 상보적인 뉴클레오티드 서열로 이루어진 그룹중에서 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분리된 핵산 분자를 제공한다.
본 발명의 추가의 양태는, 상기 (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g) 또는 (h)의 뉴클레오티드 서열 또는 엄격한 하이브리드화 조건하에서 상기 (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g) 또는 (h)의 폴리뉴클레오티드에 하이브리드를 형성하는 폴리뉴클레오티드와 90% 이상 및 더욱 바람직하게는 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분리된 핵산 분자를 포함한다. 하이브리드를 형성하는 상기 폴리뉴클레오티드는 엄격한 하이브리드화 조건하에서 단지 A 잔기 또는 단지 T 잔기만으로 이루어진 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드와 하이브리드를 형성하지 않는다. 본 발명의 추가의 핵산 양태는 상기 (a), (b), (c), (d), (e), (f) 또는 (g)의 아미노산 서열을 갖는 KDI 폴리펩티드의 에피토프-함유 부분의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분리된 핵산 분자에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 본 발명의 분리된 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터, 당해 재조합 벡터를 함유한 숙주 세포, 및 재조합 기술에 의해 이러한 벡터 및 숙주 세포를 제조하고 이들을 사용하여 KDI 폴리펩티드 또는 펩티드를 생성하는 방법에 관한 것이다.
추가로, 본 발명은, (a) 서열번호 2로 제시된 완전한 아미노산 서열을 갖는 전체 길이의 KDI 폴리펩티드의 아미노산 서열, (b) N-말단 메티오닌을 제외한 서열번호 2로 제시된 완전한 아미노산 서열(즉, 서열번호 2의 잔기 2-207)을 갖는 전체 길이의 KDI 폴리펩티드의 아미노산 서열, (c) 서열번호 2에서 잔기 28-207로 제시된 성숙한 KDI 폴리펩티드의 아미노산 서열, (d) 서열번호 2의 잔기 165-183으로 제시된 아미노산 서열, (e) 클론 HKAPI15에 함유된 사람 cDNA에 의해 암호화된 전체 길이의 KDI 폴리펩티드, (f) N-말단 메티오닌을 제외한 클론 HKAPI15에 함유된 사람 cDNA에 의해 암호화된 전체 길이의 KDI 폴리펩티드, 및 (g) 클론 HKAPI15에 함유된 사람 cDNA에 의해 암호화된 성숙한 KDI 폴리펩티드로 이루어진 그룹중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 분리된 KDI 폴리펩티드를 제공한다. 본 발명의 폴리펩티드는 또한 상기 (a), (b), (c), (d), (e), (f) 또는 (g)에 제시된 것과 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상 및 더 더욱 바람직하게는 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드뿐만 아니라 상기된 것과 90% 이상 및 더욱 바람직하게는 95% 이상 유사한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다.
본 발명의 이 관점에서 추가의 양태는, 상기 (a), (b), (c), (d), (e), (f) 또는 (g)에 제시된 아미노산 서열을 갖는 KDI 폴리펩티드의 에피토프-함유 부분의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드에 관한 것이다. 본 발명의 KDI 폴리펩티드의 에피토프-함유 부분의 아미노산 서열을 갖는 펩티드 또는 폴리펩티드는 6개 또는 7개 이상, 바람직하게는 9개 이상 및 더욱 바람직하게는 약 30개 내지 약 50개의 아미노산을 갖는 상기와 같은 폴리펩티드의 일부분을 포함하나, 또한 상기된 본 발명의 폴리펩티드의 전체 아미노산 서열을 포함하거나 그 이하의 임의의 길이의 에피토프-함유 폴리펩티드도 본 발명에 포함된다.
다른 양태로서, 본 발명은 상기 (a), (b), (c), (d), (e), (f) 또는 (g)에 제시된 아미노산 서열을 갖는 KDI 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 분리된 항체를 제공한다. 또한, 본 발명은 본원에 제시된 아미노산 서열을 갖는 KDI 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 분리하는 방법을 제공한다. 이러한 항체는 하기된 바와 같이 치료학적으로 유용하다.
본 발명은 KDI 폴리펩티드를 포함하고, 예를 들면 바이러스 감염, 기생충 감염, 세균 감염, 암, 자가면역 질환, 다발성 경화증, 림프종 및 알레르기와 같은 면역계 관련 질환을 치료하는데 사용할 수 있는 약제학적 조성물을 제공한다. 또한, 인터페론 폴리펩티드를 필요로 하는 개체를 치료하는 방법이 제공된다.
또한, 본 발명은 KDI 폴리뉴클레오티드 또는 KDI 폴리펩티드를 포함하는, 시험관내 세포, 생체외 세포, 생체내 세포 또는 다세포 유기체에 투여하기 위한 조성물을 제공한다. 본 발명의 이 관점에서 특히 바람직한 양태로서, 본 조성물은 질환의 치료를 위해 숙주 유기체에서 KDI 폴리펩티드를 발현시키기 위한 KDI 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 이 관점에서 특히 바람직한 것은 인터페론의 비정상적 내인성 활성과 연관된 기능장애의 치료를 위해 사람 환자에게서 발현시키는 것이다.
또한, 본 발명은, KDI 폴리펩티드에 의해 증강되는 수용체를 KDI 폴리펩티드의 존재하에 후보 화합물과 접촉시키는 단계; 예를 들면 후보 화합물 및 KDI 폴리펩티드의 존재하에 항바이러스 활성을 검정하는 단계; 및 검정된 활성을 후보 화합물의 부재하에 수용체와 KDI가 접촉되었을 때 검정된 표준 활성 수준과 비교하는 단계를 포함하여, KDI 폴리펩티드의 생물학적 활성을 증가 또는 억제할 수 있는 화합물을 동정하는 스크리닝 방법을 제공한다. 이 검정에서, 표준 수준에 비해 활성이 증가함은 후보 화합물이 KDI 활성의 효능제임을 가리키며, 표준 수준에 비해 활성이 감소함은 상기 화합물이 KDI 활성의 길항제임을 가리킨다.
KDI가 각질세포에서 발현됨이 발견되었다. 그러므로, 본 발명의 핵산은 생물학적 샘플에 존재하는 조직(들) 또는 세포 유형(들)의 차별적 동정을 위한 하이브리드화 탐침으로서 유용하다. 유사하게, 폴리펩티드 및 이에 대한 항체는 조직(들) 또는 세포 유형(들)의 차별적 동정을 위한 면역학적 탐침을 제공하는데 유용하다. 또한, 상기 조직 또는 세포, 특히 면역계의 많은 질환의 경우, "표준" KDI 유전자 발현 수준, 즉 면역계 질환을 지니지 않은 개체로부터 채취된 건강한 조직에서의 KDI 발현 수준과 비교하여 상당히 높거나 낮은 수준의 KDI 유전자 발현이 상기와 같은 질환을 지닌 개체로부터 채취된 특정 조직(예, 암 또는 상처 조직) 또는 체액(예, 혈청, 혈장, 뇨, 활액 또는 척수액)에서 검출될 수 있다. 따라서, 본 발명은, (a) 개체의 세포 또는 체액에서 KDI 유전자 발현 수준을 검정하고, (b) 당해 KDI 유전자 발현 수준을 표준 KDI 유전자 발현 수준과 비교하여, 표준 발현 수준에 비하여 검정된 KDI 유전자 발현 수준이 증가 또는 감소됨을 면역계 질환의 징후로 판단함을 포함하여 상기 질환의 진단중에 유용한 진단 방법을 제공한다.
본 발명의 추가의 관점은, 체내에 인터페론 활성의 증가된 수준을 필요로 하는 개체에게 치료학적 유효량의 본 발명의 분리된 KDI 폴리펩티드 또는 이의 효능제를 포함하는 조성물을 투여함을 포함하여, 체내에 인터페론 활성의 증가된 수준을 필요로 하는 개체를 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 추가의 관점은, 체내에 인터페론 활성의 감소된 수준을 필요로 하는 개체에게 치료학적 유효량의 KDI 길항제를 포함하는 조성물을 투여함을 포함하여, 체내에 인터페론 활성의 감소된 수준을 필요로 하는 개체를 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 사용하기에 바람직한 길항제는 KDI-특이적 항체이다.
도 1은 KDI의 뉴클레오티드 서열(서열번호 1) 및 아미노산 서열(서열번호 2)을 보여준다.
도 2는 컴퓨터 프로그램 베스트피트(Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711)에 의해 판정된, KDI 단백질의 아미노산 서열과 인터페론 오메가에 대한 사람 mRNA의 해독 생성물의 아미노산 서열(서열번호 3)간의 동일 영역을 보여준다.
도 3은 KDI 아미노산 서열의 분석을 보여준다. 알파, 베타, 턴(turn) 및 코일 영역; 친수성 및 소수성; 양쪽친매성 영역; 변동가능 영역; 항원 지수 및 표면 확률이 나타나 있다. "항원 지수-제임슨-울프" 그래프에서, 양성 피크는 KDI 단백질의 고 항원성 영역의 위치(즉, 본 발명의 에피토프-함유 펩티드를 수득할 수 있는 영역)를 가리킨다.
도 4는 본 발명의 KDI 폴리펩티드와 인터페론 폴리펩티드 부류의 수개 다른 일원과의 배열을 보여준다. 사람 인터페론 베타-1(서열번호 4), 사람 태반 인터페론(서열번호 5), 사람 인터페론 오메가(서열번호 6), 사람 인터페론 알파-c(서열번호 7), 사람 인터페론 알파-F(서열번호 8), 사람 인터페론 II-1(서열번호 9), 사람 알파 인터페론-N(서열번호 10), 소 TP-1(서열번호 11), 난(ovi) TP-1(서열번호 12), 돼지 TP(서열번호 13), 사람 인터페론 베타 2a(IL-6)(서열번호 14), 소 인터페론 베타-2(서열번호 15), 소 인터페론 베타-1(서열번호 20), 합성 인터페론 베타-1(서열번호 21)이 나타나 있다. 배열은 PAM250 잔기 중량표와 함께 클러스탈(Clustal) 방법을 사용하여 메갈라인(Megalign) 절차에 따라 만들어졌다. 메갈라인은 DNA스타 프로그램에 포함되어 있다.
본 발명은 서열번호 2로 제시된 아미노산 서열을 갖는 각질세포-유래된 인터페론 폴리펩티드(이하, KDI)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분리된 핵산 분자를 제공한다. 도 1에 도시된 뉴클레오티드 서열(서열번호 1)은, 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(미국 버지니아주 20110-2209, 매나사스, 유니버서티 보울버드 10801 소재)에 1998년 12월 1일에 수탁번호 ATCC 203500으로 기탁된 사람 HKAPI15 cDNA 클론을 서열분석함으로써 수득되었다. 기탁된 cDNA는 플라스미드 pCMVSport 2.0(메릴랜드 게이더스버그 소재 라이프 테크놀로지즈)에 함유되어 있고, 사람 cDNA에 플랭킹되어 있는 SalI/NotI 제한효소의 부위에서 절단될 수 있다.
본 발명의 KDI 단백질은 인터페론 부류의 많은 일원, 특히 IFN-오메가에 대한 사람 mRNA의 해독 생성물과 서열 상동성을 공유한다(도 2)(서열번호 3). IFN-오메가는 시험관내에서 여러 종양 세포주의 증식을 억제하고, 천연 킬러 세포 활성을 자극하며, 제 I형 주요 조직적합성 복합체의 발현을 증강시키고(그러나, 제 II형은 아니다) 미토겐 또는 동종 세포로 자극된 림프구의 증식을 억제한다는 것이 밝혀졌다(Adolf, G.R., Human interferon omega-a review, Mult Scler 1995; 1 Suppl 1:S44-S47). KDI의 발현은 각질세포, 수지상세포 및 단핵세포에서 주로 발견되는 것으로 결정되었으나, 특히 각질세포에서 우세하다. TNF-α 또는 폴리IC에 의한 각질세포의 자극(바이러스성 감염을 자극)은 특이적으로 및 급속히 KDI 전사물의 과발현을 자극한다. IFN-오메가와의 구조적 유사성 및 자극된 바이러스 감염에 반응한 증가된 발현을 근거로, KDI는 IFN-오메가와 다른 인터페론 단백질의 생물학적 활성의 여러 측면, 예를 들면 종양 증식의 억제, 항바이러스 활성, NK 세포 활성화 및 면역계 강화를 공유하는 것으로 인정된다.
핵산 분자
본원의 DNA 분자를 서열 분석함으로써 결정된 모든 뉴클레오티드 서열은 달리 표시되지 않는 한 자동 DNA 시퀀서(예, 캘리포니아 포스터 시티 소재 어플라이드 바이오시스템스 인코포레이티드의 모델 373)를 사용하여 결정되었으며, 본원에 결정된 DNA 분자에 의해 암호화된 폴리펩티드의 모든 아미노산 서열은 상기와 같이 결정된 DNA 서열의 해독에 의해 추정되었다. 그러므로, 이 자동화 방법에 의해 결정된 임의의 DNA 서열에 대해서도 본 분야에 알려진 것처럼, 본원에 결정된 임의의 뉴클레오티드 서열도 약간의 오차를 함유할 수 있다. 자동화에 의해 결정된 뉴클레오티드 서열은 서열분석된 DNA 분자의 실제적인 뉴클레오티드 서열과 전형적으로 약 90% 이상, 더욱 전형적으로는 약 95% 이상 내지 약 99.9% 이상 동일하다. 실제적인 서열은 본 분야에 잘 알려진 수동 DNA 서열분석 방법을 포함한 다른 방법에 의해 더욱 정확하게 결정될 수 있다. 또한 본 분야에 알려진 것처럼 실제적인 서열과 비교하여 결정된 뉴클레오티드 서열에서의 단일 삽입 또는 결실은 뉴클레오티드 서열의 해독에서 프레임 이동을 유발하며 이에 따라 결정된 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 추정 아미노산 서열은 이러한 삽입 또는 결실의 시점에서 출발하여 서열분석된 DNA 분자에 의해 실제적으로 암호화된 아미노산 서열과 완전히 상이하게 될 것이다.
핵산 분자 또는 폴리뉴클레오티드의 "뉴클레오티드 서열"은 데옥시리보뉴클레오티드의 서열인 DNA 분자 또는 폴리뉴클레오티드 및 특정된 데옥시리보뉴클레오티드 서열내의 각 티미딘 데옥시리보뉴클레오티드(T)가 리보뉴클레오티드 우리딘(U)로 치환된 상응하는 리보뉴클레오티드 서열(A, G, C 및 U인 RNA분자 또는 폴리뉴클레오티드) 모두에 적용된다.
KDI 폴리펩티드를 암호화한 본 발명의 핵산 분자는, 도 1의 뉴클레오티드 서열(서열번호 1)과 같이 본원에 제공된 정보를 사용하여, 출발물질로서 mRNA를 사용하여 cDNA를 클로닝하는 것과 같은 표준 분자생물학 절차에 따라 수득할 수 있다. 본 발명을 예시하는 것으로 도 1에 제시된 핵산 분자(서열번호 1)는 분리된 각질세포에서 유래된 cDNA 라이브러리에서 발견되었다.
도 1의 KDI DNA의 뉴클레오티드 서열(서열번호 1)은 도 1의 뉴클레오티드 서열(서열번호 1)의 뉴클레오티드 위치 35-37의 개시코돈과 함께 207개 아미노산 잔기의 단백질을 암호화하는 개방형 판독 프레임을 함유한다. 서열번호 2로 제시된 KDI 단백질의 아미노산 서열은 IFN-오메가(도 2)와 약 35% 동일하다. IFN-오메가의 서열은 진뱅크(GenBank)에서 수탁번호 gblA12140으로 입수할 수 있다.
당업자가 인정하는 바와 같이, 상기 논의된 서열분석 오차의 확률로 인해 약 207개 아미노산을 포함하는 기탁된 cDNA에 의해 암호화된 실제적으로 완전한 KDI 폴리펩티드는 어느 정도 더 길 수도 있고 더 짧을 수도 있다. 더욱 일반적으로는, 실제적인 개방형 판독 프레임은 도 1에 나타낸 N-말단의 메티오닌 코돈으로부터 추정된 것(서열번호 1)의 ±20개 아미노산의 범위, 십중팔구는 ±10개 아미노산의 범위일 수 있다.
리더 및 성숙 서열
완전한 KDI 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 2에서 보는 바와 같이 리더 서열 및 성숙한 단백질을 포함한다. 더욱 자세하게는, 본 발명은 KDI 단백질의 성숙 형태를 암호화하는 핵산 분자를 제공한다. 따라서, 시그날 가설에 따라, 일단 조면소포체를 따라 성장하는 단백질 쇄의 수송이 개시되면, 포유류 세포에 의해 분비된 단백질은 시그날 및 분비 리더 서열을 가지며 이는 완전한 폴리펩티드로부터 절단됨으로써 분비된 단백질의 "성숙" 형태가 생성된다. 대부분의 포유류 세포 및 곤충 세포 조차도 동일한 특이성으로 분비된 단백질을 절단한다. 그러나, 일부 경우, 분비된 단백질의 절단이 완전히 일정한 것은 아니며 두 개 이상의 성숙한 단백질 종이 생성된다. 게다가, 분비된 단백질의 절단 특이성은 궁극적으로 완전한 단백질의 일차 구조 (즉 이는 폴리펩티드의 아미노산 서열에 내재되어 있다)에 의해 결정되는 것으로 오래동안 알려져 왔다. 그러므로, 본 발명은 클론 HKAPI15(ATCC 수탁번호 203500)내 사람 cDNA에 의해 암호화된 아미노산 서열을 갖는 성숙한 KDI 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 제공한다. "클론 HKAPI15내 사람 cDNA에 의해 암호화된 아미노산 서열을 갖는 성숙한 KDI 폴리펩티드"는 기탁된 벡터에 함유된 클론의 사람 DNA 서열에 의해 암호화된 완전한 개방형 판독 프레임의 포유류 세포(예, 하기 기술된 COS 세포)에서 발현함으로써 생성된 KDI 단백질의 성숙 형태(들)를 의미한다.
또한, 단백질이 분비 리더뿐만 아니라 이 리더 서열의 절단점을 가지고 있는 지를 추정하는 방법이 이용가능하다. 예를 들면, 맥게흐(McGeoch)의 방법(Virus Res. 3:271-286 (1985))은 완전한 (비절단된) 단백질의 짧은 N-말단 전하 영역 및 뒤이은 비전하 영역으로부터의 정보를 사용한다. 본 하인제(von Heinje)의 방법(Nucleic Acids Res. 14:4683-4690 (1986))은 절단 부위 주변의 잔기, 전형적으로는 잔기 -13 내지 +2(여기서, +1은 성숙한 단백질의 아미노 말단을 가리킨다)로부터의 정보를 사용한다. 알려진 포유류 분비 단백질의 절단점을 추정하는 이들 각 방법의 정확도는 75 내지 80%의 범위이다(상기 본 하인제). 그러나, 상기 두 방법이 항상 주어진 단백질에 대해 동일한 추정 절단점(들)을 생성하는 것은 아니다.
본 발명의 경우, 완전한 KDI 폴리펩티드의 추론된 아미노산 서열은 교토 대학 인스티튜트 포 케미칼 리써치의 켄타 나카이 박사로부터 얻은 컴퓨터 프로그램 "PSORT"에 의해 분석되었는데(참조: K. Nakai and M. Kanehisa, Genomics 14:897-911 (1992)), 상기 프로그램은 아미노산 서열을 기초로 하여 단백질의 세포 위치를 추정하는 전문 시스템이다. 이러한 위치의 컴퓨터 추정의 일부로서, 맥게흐 및 본 하인제의 방법이 혼용된다. 상기 컴퓨터 분석은 서열번호 2로 제시된 완전한 아미노산 서열내에서 하나의 잠재적 절단 부위(즉, 도 1(서열번호 2)에서 잔기 27과 28사이)를 추정하였다. 물론, 천연 효소에 의해 사용된 절단 부위의 정확한 주소는 추정된 절단 부위로부터 약간 변할 수 있으며 종간에 다양할 수 있다. 따라서, 약 잔기 20 내지 약 잔기 34의 성숙한 폴리펩티드가 제공된다. 보다 상세히, 본 발명은 다음과 같이 서열번호 2의 일부분을 갖는 폴리펩티드를 제공한다: 서열번호 2에서 잔기 20-207, 서열번호 2에서 잔기 21-207, 서열번호 2에서 잔기 22-207, 서열번호 2에서 잔기 23-207, 서열번호 2에서 잔기 24-207, 서열번호 2에서 25-207, 서열번호 2에서 잔기 26-207, 서열번호 2에서 잔기 27-207, 서열번호 2에서 잔기 28-207, 서열번호 2에서 잔기 29-207, 서열번호 2에서 잔기 30-207, 서열번호 2에서 잔기 31-207, 서열번호 2에서 잔기 32-207, 서열번호 2에서 잔기 33-207 및 서열 2에서 잔기 34-207. 또한, 본 발명은 이러한 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
언급된 바와 같이, 본 발명의 핵산 분자는 RNA 또는 DNA 형태일 수 있다. DNA는 이본쇄 또는 일본쇄일 수 있다. 일본쇄 DNA 또는 RNA는 센스 쇄로 알려진 암호쇄일 수 있거나 안티-센스 쇄이라고도 하는 비암호쇄일 수 있다.
특정 양태로서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 길이가 300 kb 미만, 200 kb, 100 kb, 50 kb, 10 kb 또는 7.5 kb이다. 추가의 양태로서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 KDI 암호서열중 15개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하지만 KDI 인트론 전부 또는 일부를 포함하지 않는다. 다른 양태로서, KDI 암호서열을 포함하는 핵산은 게놈 플랭킹 유전자의 암호서열(즉, 게놈에서 KDI 암호서열의 5' 또는 3')을 함유하지 않는다.
"분리된" 핵산 분자(들)는 이의 천연 환경으로부터 제거된 핵산 분자 DNA 또는 RNA를 의미한다. 예를 들면, 벡터에 함유된 재조합 DNA 분자는 본 발명의 목적을 위해 분리된 것으로 고려된다. 분리된 DNA 분자의 추가의 예로는 이종 숙주 세포에 유지된 재조합 DNA 분자 또는 용액중의(부분적으로 또는 상당히) 정제된 DNA 분자가 포함된다. 분리된 RNA 분자는 본 발명의 DNA 분자의 생체내 또는 시험관내 RNA 전사물을 포함한다. 그러나, 라이브러리의 다른 일원으로부터 분리되지 않은(예, 해당 클론 및 해당 라이브러리의 다른 일원을 함유한 균질 용액의 형태) 라이브러리의 일원(예, 게놈 또는 cDNA 라이브러리)인 클론 또는 세포 또는 세포 용해물로부터 분리 또는 제거된 염색체(예, 핵형에서와 같이 "염색체 분산")에 함유된 핵산은 본 발명의 목적을 위해 "분리된" 것이 아니다. 본원에 추가로 논의된 바와 같아, 본 발명의 분리된 핵산 분자는 천연적으로, 재조합으로 또는 합성으로 생성할 수 있다.
본 발명의 분리된 핵산 분자는 도 1에 제시된 뉴클레오티드 서열(서열번호 1)의 위치 35-37의 개시코돈과 함께 개방형 판독 프레임(ORF)을 포함하는 DNA 분자를 포함한다.
또한, 서열번호 2의 위치 2-207에 나타낸 N-말단 메티오닌이 결실된 KDI 단백질의 암호서열을 포함하는 DNA 분자가 포함된다.
또한, 본 발명의 분리된 핵산 분자는 상기된 것과 실질적으로 상이한 서열을 포함하지만 유전암호의 축퇴성(degeneracy)으로 인해 여전히 KDI 단백질을 암호화하는 DNA 분자를 포함한다. 물론 유전암호 및 종-특이적 코돈 선호도는 당해 분야에 널리 알려져 있다. 따라서, 당업자가, 예를 들면, 특정 숙주를 위한 코돈 발현을 최적하기 위해(예, 사람 mRNA내 코돈을 이.콜라이와 같은 세균 숙주에서 바람직한 것으로 변형) 상기된 축퇴성 변이를 생성하는 것은 통상적인 것이다.
다른 관점에서, 본 발명은 클론 HKAPI15(ATCC 수탁번호 203500)내에 사람 cDNA에 의해 암호화된 아미노산 서열을 갖는 KDI 폴리펩티드를 암호화하는 분리된 핵산 분자를 제공한다. 바람직하게는, 이 핵산 분자는 상기 기탁된 사람 cDNA에 의해 암호화된 성숙한 폴리펩티드를 암호화할 것이다.
또한, 본 발명은 도 1에 제시된 뉴클레오티드 서열(서열번호 1) 또는 상기 기탁된 클론에 함유된 KDI cDNA의 뉴클레오티드 서열을 갖는 분리된 핵산 분자 또는 상기 서열중 어느 하나에 상보적인 서열을 갖는 핵산 분자를 제공한다. 이러한 분리된 분자, 특히 DNA 분자는 본 발명의 KDI 폴리펩티드의 생성을 위해 유용하며 KDI를 생성하고자 하는 목적으로 벡터로 형질감염된 세포내에서 mRNA를 탐지하기 위한 탐침으로서, 즉 숙주 세포내 이종 유전자의 발현을 결정하는 마커로서 유용하다.
본 발명은 또한 본원에 제시된 뉴클레오티드 서열의 일부를 암호화하는 핵산 분자뿐만 아니라 본원에 제시된 분리된 핵산 분자의 단편에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 서열번호 1의 위치 35-655로 이루어진 서열번호 1의 일부를 나타내는 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 그외 본 발명의 특히 바람직한 폴리뉴클레오티드 단편은 서열번호 1의 뉴클레오티드 잔기
Figure 112001001418144-pct00001
를 포함하거나 또는 이들로 이루어진다. 또 다른 특히 바람직한 본 발명의 폴리뉴클레오티드 단편은 서열번호 1의 뉴클레오티드 잔기
Figure 112001001418144-pct00002
를 포함하거나, 또는 이들로 이루어진다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 약 30개 이상의 연속 뉴클레오티드, 바람직하게는 약 50개 이상의 연속 뉴클레오티드의 임의의 일부를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
보다 일반적으로, 기탁된 cDNA의 뉴클레오티드 서열 또는 도 1에 제시된 뉴클레오티드 서열(서열번호 1)을 갖는 분리된 핵산 분자의 단편은 본원에 논의된 바와 같이 진단 탐침 및 프라이머로서 유용한 약 15개 이상의 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 약 20개 이상의 뉴클레오티드, 더 더욱 바람직하게는 약 30개 이상의 뉴클레오티드 및 훨씬 더 바람직하게는 약 40개 이상의 뉴클레오티드 길이의 단편을 의미한다. 물론, 50 내지 600개의 뉴클레오티드 길이의 큰 단편(400개의 뉴클레오티드, 450개의 뉴클레오티드, 500개의 뉴클레오티드, 550개의 뉴클레오티드 및 600개의 뉴클레오티드의 단편은 15 내지 600개사이의 모든 길이의 단편과 마찬가지로 구체적으로 고려되지만 공간 고려에 대해 구체적으로 인용되지 않을 것이다)은 또한 기탁된 cDNA의 뉴클레오티드 서열 또는 도 1에 제시된 뉴클레오티드 서열(서열번호 1)의 대부분(모두가 그러하지는 않을지라도)에 상응하는 단편과 마찬가지로 본 발명에 따라 유용하다. 예를 들면, 길이가 20개 이상의 뉴클레오티드인 단편은 기탁된 cDNA의 뉴클레오티드 서열 또는 도 1에 제시된 뉴클레오티드 서열(서열번호 1)로부터 20개 이상의 연속 염기를 포함하는 단편을 의미하며, 물론 서열번호 1 또는 기탁된 cDNA로부터의 20+ 연속 염기의 말단에 융합된 서열번호 1(또는 기탁된 cDNA)로부터 유도되지 않은 추가의 핵산 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 바람직한 핵산 단편은 도 3에 기술되고 이하에 상세히 제시된 KDI 폴리펩티드의 에피토프-함유 부분을 암호화하는 핵산 분자를 포함한다.
다른 관점에서, 본 발명은, 엄격한 하이브리드화 조건하에서 상기된 본 발명의 핵산 분자중의 폴리뉴클레오티드, 예를 들면, 클론 HKAPI15(ATCC 수탁번호 203500)내 사람 cDNA의 일부와 하이브리드를 형성하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분리된 핵산 분자를 제공한다. "엄격한 하이브리드화 조건"은 50% 포름아미드, 5 x SSC(750 mM NaCl, 75 mM 삼나트륨 시트레이트), 50 mM 인산나트륨(pH 7.6), 5 x 덴하르트 용액, 10% 덱스트란 설페이트 및 20 μg/ml의 변성되고, 전단된 연어 정자 DNA를 포함하는 용액중에, 42℃에서 밤새 항온처리한 다음, 필터를 약 65℃에서 0.1 x SSC중에서 2회 세척하는 것을 의미한다.
폴리뉴클레오티드의 "일부"와 하이브리드를 형성하는 폴리뉴클레오티드는 기준 폴리뉴클레오티드의 약 15개 이상의 뉴클레오티드(nt), 더욱 바람직하게는 약 20개 이상의 뉴클레오티드, 더 더욱 바람직하게는 약 30개 이상의 뉴클레오티드 및 훨씬 더 바람직하게는 약 30 내지 70(예, 50)개 뉴클레오티드와 하이브리드를 형성하는 폴리뉴클레오티드(DNA 또는 RNA)를 의미한다. 이들은 상기되고 이하에 더욱 자세히 설명된 바와 같이 진단 탐침 및 프라이머로서 유용하다.
"20개 이상의 뉴클레오티드 길이"의 폴리뉴클레오티드 일부는, 예를 들면, 기준 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열(예, 기탁된 cDNA 또는 도 1에 제시된 뉴클레오티드 서열(서열번호 1))로부터의 20개 이상의 연속 뉴클레오티드를 의미한다. 물론, 폴리 A 서열(예, 도 1에 제시된 KDI cDNA(서열번호 1)의 3' 말단 폴리(A) 트랙) 또는 T (또는 U) 잔기의 상보적 연장서열만 하이브리드를 형성하는 폴리뉴클레오티드는, 이러한 폴리뉴클레오티드가 폴리(A) 연장서열 또는 이의 상보적 서열을 함유한 임의의 핵산 분자(예, 특히 임의의 이본쇄 cDNA 클론)와 하이브리드를 형성하기 때문에, 본 발명의 핵산의 일부와 하이브리드를 형성하기 위해 사용된 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 포함되지 않을 것이다.
특정 양태로서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 길이가 100000 kb 미만, 50000 kb, 10000 kb, 1000 kb, 500 kb, 400 kb, 350 kb, 300 kb, 250 kb, 200 kb, 175 kb, 150 kb, 125 kb, 100 kb, 75 kb, 50 kb, 40 kb, 30 kb, 25 kb, 20 kb, 15 kb, 7.5 kb 또는 5 kb이다.
언급된 바와 같이, KDI 폴리펩티드를 암호화하는 본 발명의 핵산 분자는 완전한 폴리펩티드의 아미노산 서열을 암호화한 것 자체 및 완전한 폴리펩티드와 추가 서열에 대한 암호 서열[예, 프리-(pre-), 프로-(pro-) 또는 프리프로-(prepro-) 단백질 서열과 같이 추가된 분비 리더 서열을 암호화한 것]을 포함할 수 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 단백질 서열은, 예를 들면 전사, mRNA 프로세싱(예: 스플리싱 및 폴리아데닐화 시그날), 예컨대 mRNA의 리보좀 결합 및 안정성에 있어서 역할을 하는 전사되고 비해독된 서열과 같은 인트론 및 비암호화 5' 및 3' 서열; 추가의 기능을 제공하는 부가적인 아미노산을 암호화하는 또 다른 암호 서열을 포함하나 이에 한정되지 않는 추가의 비암호 서열과 함께 본 발명의 핵산에 의해 암호화된다.
따라서, 상기 폴리펩티드 암호화 서열은 융합된 폴리펩티드의 정제를 용이하게 하는 펩티드를 암호화하는 서열과 같은 마커 서열에 융합될 수 있다. 본 발명의 이러한 관점에서 특정적으로 바람직한 양태로서, 마커 아미노산 서열은 시판중에 있는 많은 것들 가운데 pQE 벡터(캘리포니아 91311 채스워드 이톤 애비뉴 9295 소재 QLAGEN, Inc.)에 제공된 태그와 같은 헥사-히스티딘 펩티드이다. 문헌[Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824 (1989)]에 제시된 바와 같이, 예를 들면, 헥사-히스티딘은 융합 단백질의 편리한 정제를 제공한다. "HA" 태그는 문헌[Wilson et al., Cell 37:767 (1984)]에 제시된 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질로부터 유도된 에피토프에 상응하는 것으로 정제에 유용한 다른 펩티드이다. 하기된 바와 같이, 다른 그러한 융합 단백질로는 N- 또는 C-말단에서 Fc에 융합된 KDI가 포함된다.
변이체 및 돌연변이 폴리뉴클레오티드
본 발명은 또한 KDI 단백질의 일부, 동족체 또는 유도체를 암호화하는 본 발명의 핵산 분자의 변이체에 관한 것이다. 변이체는 천연 대립형질 변이체와 같이 천연적으로 발생할 수 있다. "대립형질 변이체"는 유기체의 염색체상에서 주어진 유전자좌를 점유하는 수개의 유전자 대체 형태중 하나를 의미한다[Genes II, Lewin, B., ed., John Wiley & Sons, New York (1985)]. 비천연 변이체는 당업계에 공지된 돌연변이유발 기술을 사용하여 생성할 수 있다.
이러한 변이체는 뉴클레오티드 치환, 결실 또는 부가에 의해 생성된 것을 포함한다. 치환, 결실 또는 부가는 하나 이상의 뉴클레오티드가 연루될 수 있다. 변이체는 암호화영역, 비암호화영역 또는 이들 모두에서 일어날 수 있다. 암호화영역에서의 변이는 보존 또는 비보존 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 생성할 수 있다. 이들 가운데 특히 바람직한 것은 KDI 단백질 또는 이의 일부의 특성 및 활성에 변화를 주지 않는 사일런트(silent) 치환, 부가 및 결실이다. 또한 이러한 관점에서 특히 바람직한 것은 보존 치환이다.
추가의 양태는 (a) 서열번호 2의 완전한 아미노산 서열을 갖는 KDI 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열, (b) N-말단 메티오닌을 제외한 서열번호 2의 완전한 아미노산 서열(즉 서열번호 2의 잔기 2-161)을 갖는 KDI 폴리펩티드를 암호화한 뉴클레오티드 서열, (c) 서열번호 2에서 잔기 28-207로 제시된 서열을 갖는 성숙한 KDI 폴리펩티드를 암호화한 뉴클레오티드 서열, (d) 서열번호 2로 제시된 잔기 165-183을 암호화하는 뉴클레오티드 서열, (e) 클론 HKAPI15에 함유된 사람 cDNA에 의해 암호화된 완전한 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열, (f) N-말단 메티오닌을 제외한 클론 HKAPI15에 함유된 사람 cDNA에 의해 암호화된 완전한 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열, (g) 클론 HKAPI15에 함유된 사람 cDNA에 의해 암호화된 성숙한 폴리펩티드의 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 및 (h) 상기 (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g) 및 (h)의 뉴클레오티드 서열중 어느 하나에 상보적인 뉴클레오티드 서열로 이루어진 그룹중에서 선택된 폴리뉴클레오티드와 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분리된 핵산 분자를 포함한다.
본 발명의 추가의 양태는 상기 (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g) 또는 (h)의 뉴클레오티드 서열중 어느 하나와 90% 이상 및 더욱 바람직하게는 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 엄격한 하이브리드화 조건하에서 상기 (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g) 또는 (h)의 폴리뉴클레오티드와 하이브리드를 형성하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분리된 핵산 분자를 포함한다. 하이브리드를 형성하는 이 폴리뉴클레오티드는 단지 A 잔기 또는 단지 T 잔기로 이루어진 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드와 엄격한 하이브리드화 조건하에서 하이브리드를 형성하지 않는다. 본 발명의 추가 핵산 양태는 상기 (a), (b), (c), (d), (e), (f) 또는 (g)의 아미노산 서열을 갖는 KDI 폴리펩티드의 에피토프-함유 부분의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분리된 핵산 분자에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 본 발명의 분리된 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터, 이 재조합 벡터를 함유한 숙주 세포 및 재조합 기술에 의해 이러한 벡터 및 숙주 세포를 제조하고 이들을 사용하여 KDI 폴리펩티드 또는 펩티드를 제조하는 방법에 관한 것이다.
KDI 폴리펩티드를 암호화하는 기준 뉴클레오티드 서열과 예를 들면 95% 이상 "동일한" 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드는 이 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열이 KDI 폴리펩티드를 암호화하는 기준 뉴클레오티드 서열의 100개 뉴클레오티드 당 5 포인트 이하의 돌연변이를 포함할 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열을 제외하고 기준 서열과 동일하다는 것을 의미한다. 다시 말해서, 기준 뉴클레오티드 서열과 95% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 수득하기 위해, 기준 서열에서 뉴클레오티드의 5% 이하가 결실되거나 다른 뉴클레오티드로 치환하거나 기준 서열에서 총 뉴클레오티드의 5%까지 다수의 뉴클레오티드를 기준 서열내로 삽입시킬 수 있다. 기준 서열의 이들 돌연변이는 기준 뉴클레오티드 서열의 5' 또는 3' 말단 위치에서 일어나거나 기준 서열의 뉴클레오티드중에 개별적으로 산재되거나 기준 서열내 하나 이상의 인접 그룹에 산재된 그들 말단 위치 사이의 어디에서나 일어날 수 있다.
실질적인 문제로서, 특정 핵산 분자가, 예를 들면, 도 1에 제시된 뉴클레오티드 서열 또는 기탁된 cDNA 클론의 뉴클레오티드 서열과 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일한지는 통상적으로 베스트피트(Bestfit) 프로그램(Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711)과 같은 공지된 컴퓨터 프로그램을 사용하여 결정할 수 있다. 베스트피트는 스미스 및 워터맨의 국부 상동성 알고리듬을 사용하여 두 서열사이의 최상의 상동성 단편을 찾아낸다(Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981)). 특정 서열이 본 발명의 기준 서열과 예를 들면 95% 동일한지를 결정하기 위해 베스트피트 또는 기타 다른 서열 배열 프로그램을 사용할 때, 물론 동일성의 백분율이 기준 뉴클레오티드 서열의 전체 길이에 대해 계산되고 기준 서열내 뉴클레오티드의 총 수의 5%이하로 상동성의 갭이 허용되도록 변수를 설정한다. 쿼리(query) 서열(본 발명의 서열)과 해당 서열사이의 최상의 전체 정합을 결정하는 바람직한 방법(또한, 전체 서열 배열이라 한다)은 브루트래그 등(Brutlag et al.)의 알고리듬(Comp. App. Biosic. (1990) 6:237-245)을 기초로 FASTDB 컴퓨터 프로그램을 사용하여 결정할 수 있다. 서열 배열에서 쿼리 및 해당 서열은 둘다 DNA 서열이다. RNA 서열은 U를 T로 전환시킴으로써 비교될 수 있다. 언급된 전체 서열 배열의 결과는 동일성 %로 표시된다. 동일성 %를 계산하기 위해 DNA 서열의 FASTDB 배열에 사용되는 바람직한 변수는 다음과 같다: 매트릭스=일원성, k-터플=4, 부정합 벌점=1, 결합 벌점=30, 무작위 그룹 길이=0, 임계 점수=1, 갭 벌점=5, 갭 크기 벌점=0.05, 윈도우 크기=500 또는 해당 뉴클레오티드 서열의 길이중 짧은 것.
해당 서열이 내부 결실때문이 아니라 5' 또는 3' 결실로 인해 쿼리 서열보다 짧은 경우 결과에 대해 수동 교정이 이루어져야 한다. 이것은 FASTDB 프로그램이 동일성 %를 계산할 때 해당 서열의 5' 및 3' 절단을 산정하지 않기 때문이다. 쿼리 서열에 대하여 5' 또는 3' 말단에서 절단된 해당 서열의 경우, 동일성 %는 쿼리 서열의 총 염기의 백분율로서 정합/배열되지 않은 해당 서열의 5' 및 3'인 쿼리 서열의 염기 수를 계산함으로써 교정한다. 뉴클레오티드가 정합/배열되었는지는 FASTDB 서열 배열의 결과로서 결정한다. 그런 다음, 이 백분율을 특정 변수를 사용하여 상기 FASTDB 프로그램에 의해 계산된 동일성 %로부터 공제하여 최종 동일성 % 점수를 얻는다. 이렇게 교정된 점수가 본 발명이 목적을 위해 사용되는 것이다. 동일성 % 점수를 수동으로 조정하기 위한 목적으로 쿼리 서열과 정합/배열되지 않은 것으로 FASTDB 배열에 의해 표시된 해당 서열의 5' 및 3' 염기외의 염기만을 계산한다.
예를 들면, 90개 염기 해당 서열을 100개 염기 쿼리 서열과 배열하여 동일성 %를 결정한다. 결실은 해당 서열의 5' 말단에서 일어나며, 이에 따라 FASTDB 배열은 5' 말단의 최초 10개 염기의 정합/배열을 나타내지 않는다. 10개의 쌍을 이루지 못한 염기는 서열의 10%(정합되지 않은 5' 및 3' 말단에 존재하는 염기의 수/쿼리 서열내 염기의 총 수)를 나타내므로 FASTDB 프로그램에 의해 계산된 동일성 % 점수로부터 10%를 공제한다. 만일 나머지 90개 염기가 완벽하게 정합된 경우 최종 동일성 %는 90%일 것이다. 다른 예로서, 90개 염기 해당 서열이 100개 염기 쿼리 서열과 비교되었다. 이 시점에서 결실은 내부 결실이므로 쿼리와 정합/배열되지 않은 해당 서열의 5' 또는 3'에의 염기는 없다. 이 경우, FASTDB에 의해 계산된 동일성 %는 수동으로 교정되지 않는다. 다시 한번, 쿼리 서열과 정합/배열되지 않은 해당 서열의 5' 및 3' 염기만을 수동으로 교정한다. 본 발명의 목적을 위해 어떠한 다른 수동 교정도 이루어지지 않는다.
본 발명은 KDI 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하고 있는지와는 상관없이 도 1에 제시된 핵산 서열(서열번호 1) 또는 기탁된 DNA의 핵산 서열과 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일한 핵산 분자에 관한 것이다. 이것은 특정 핵산 분자가 KDI 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하지 않는 경우 조차 당업자는 핵산 분자를, 예를 들면, 하이브리드화 탐침 또는 중합효소 연쇄 반응(PCR) 프라이머로 사용하는 방법을 알고 있기 때문이다. KDI 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하지 않는 본 발명의 핵산 분자의 용도는 특히 cDNA 라이브러리에서 대립형질 변이체를 분리하는 것을 포함한다.
그러나, 실제로 KDI 단백질 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 도 1에 제시된 핵산 서열(서열번호 1) 또는 기탁된 DNA의 핵산 서열과 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 서열을 갖는 핵산 분자가 바람직하다. "KDI 활성을 갖는 폴리펩티드"는 특정한 생물학적 검정에 의해 측정한 결과 본 발명의 KDI 단백질의 활성과 유사하나 반드시 동일하지 않은 활성을 나타내는 폴리펩티드를 의미한다. 예를 들면, 본 발명의 KDI 단백질은 시험관내에서 골수 콜로니 형성을 억제하며 티펜타러 엠. 등(Tiefenthaler M. et al.)의 방법에 따라 검정할 수 있다(Interferon Cytokine Res, 1997 Jun; 17(6): 327-329, 이 문헌의 전체 내용은 본원에 참고로 원용된다). 또한, KDI는 미어-슬루이스 에이.알. 등(Mire-Sluis A.R. et al.)에 의해 보고된 검정에 따라 적백혈병 세포주 TF-1의 GM-CSF 유도된 증식을 억제할 수 있다(J. Immunol. Methods 1996 Sep 9; 195(1-2):55-61, 이 문헌의 내용은 본원에 참고로 원용된다). 다른 방법으로서, KDI는 당업자에게 알려진 몇 가지 검정, 예를 들면, 수지야마, 케이. 등(Sugiyama)에 의해 보고된 검정으로 전형적인 항-바이러스 활성에 대해 검정할 수 있다(Yakugaku Zasshi 1995 May; 115(5):390-393).
본 발명의 KDI 단백질은 골수 증식을 억제하고 상기된 검정에서 용량-의존 방식으로 항-바이러스 활성을 보여준다. 따라서, "KDI 단백질 활성을 갖는 폴리펩티드"는 용량-의존 방식으로 상기된 검정에서 임의의 동일한 활성을 또한 나타내는 폴리펩티드를 포함한다. 비록 용량-의존 활성의 정도가 KDI 단백질의 것과 동일할 필요는 없을지라도, 바람직하게는 "KDI 단백질 활성을 갖는 폴리펩티드"는 KDI 단백질과 비교하여 주어진 활성에서 실질적으로 유사한 용량-의존성을 나타낼 것이다(즉, 후보 폴리펩티드는 참조 KDI 단백질에 비하여 약 25배 이하, 바람직하게는 약 10배 이하로 큰 활성을 나타낼 것이다).
물론, 유전암호의 축퇴성으로 인해, 당업자는 기탁된 cDNA의 핵산 서열 또는 도 1에 제시된 핵산 서열(서열번호 1)과 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일한 서열을 갖는 많은 핵산 분자가 "KDI 단백질 활성을 갖는" 폴리펩티드를 암호화할 것임을 즉시 인식할 것이다. 사실, 이들 뉴클레오티드 서열의 축퇴성 변이체는 모두 동일한 폴리펩티드를 암호화하고 있기 때문에, 이것은 상기된 비교 검정을 실시하지 않더라도 당업자에게는 자명할 것이다. 또한, 축퇴성 변이체가 아닌 핵산 분자의 경우 많은 것이 KDI 단백질 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화할 것임은 본 분야에서 추가로 인정될 수 있는 것이다. 이것은 당업자라면 이하에 좀더 기술되어 있듯이 단백질 기능에 별로 또는 유의적으로 영향을 미치지 않는 아미노산 치환(예, 한 개의 지방족 아미노산을 제2의 지방족 아미노산으로 치환)에 대해 충분히 인식하고 있기 때문이다.
벡터 및 숙주 세포
또한, 본 발명은 본 발명의 분리된 DNA 분자를 포함하는 벡터, 당해 재조합 벡터로 유전공학적으로 조작된 숙주 세포 및 재조합 기술에 의해 KDI 폴리펩티드 또는 이의 단편을 생성하는 것에 관한 것이다. 벡터는 예를 들면 파아지, 플라스미드, 바이러스 또는 레트로바이러스 벡터일 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 복제 컴피턴트(competent)이거나 복제 결함일 수 있다. 후자의 경우, 바이러스 증식은 일반적으로 보완적 숙주 세포에서만 발생할 것이다.
폴리뉴클레오티드는 숙주내에서의 증식에 대한 선별 마커를 함유한 벡터에 연결시킬 수 있다. 일반적으로, 플라스미드 벡터는 인산칼슘 침전물과 같은 침전물 또는 하전된 지질과의 복합체로 도입된다. 벡터가 바이러스인 경우, 적절한 패키징 세포주를 사용하여 시험관내에서 패키지한 다음 숙주 세포내로 형질도입시킬 수 있다.
DNA 삽입물은 일부 거명된 파아지 람다 PL 프로모터, 이.콜라이 lac, trp, phoA 및 tac 프로모터, SV40 초기 및 후기 프로모터 및 레트로바이러스 LTR의 프로모터와 같은 적절한 프로모터에 작동적으로 연결되어야 한다. 다른 적합한 프로모터가 당업자에게 알려져 있다. 발현 작제물은 또한 전사 개시 및 종결 부위 및 전사된 영역에서 해독을 위한 리보좀 결합 부위를 함유할 것이다. 작제물에 의해 발현된 전사물의 암호 부분은 바람직하게는 해독될 폴리펩티드의 처음에 해독 개시 코돈 및 해독될 폴리펩티드의 말단에 적절히 위치한 종결 코돈(UAA, UGA 또는 UAG)을 포함할 것이다.
언급된 바와 같이, 발현 벡터는 바람직하게는 한 개 이상의 선별 마커를 포함할 수 있다. 이러한 마커로는 디하이드로폴레이트 리덕타제, 진핵 세포 배양을 위한 G418 또는 네오마이신 내성 및 이.콜라이 및 다른 세균에서 배양하기 위한 테트라사이클린, 카나마이신 또는 앰피실린 내성 유전자가 포함된다. 적절한 숙주의 대표적인 예로는 이.콜라이, 스트렙토마이세스(Streptomyces) 및 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium) 세포와 같은 세균 세포; 효모세포와 같은 진균 세포; 드로소필라(Drosophila) S2 및 스포도프테라(Spodoptera) Sf9 세포와 같은 곤충 세포; CHO, COS, 293 및 보우(Bowes) 흑색종 세포와 같은 동물 세포; 및 식물 세포를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기된 숙주 세포를 위해 적절한 배양 배지 및 조건은 당해 분야에 알려져 있다.
세균에서 사용하기에 바람직한 벡터로는 QLAGEN, Inc.로부터 입수가능한 pQE70, pQE60 및 pQE-9; 스트라타진(Stratagene)으로부터 입수가능한 pBS 벡터, 파아지스크립트 벡터, 블루스크립트 벡터, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A; 및 파머시아(Pharmacia)로부터 입수가능한 ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5가 포함된다. 진핵성 벡터로 바람직한 것은 스트라타진으로부터 입수가능한 pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1 및 pSG; 및 파머시아로부터 입수가능한 pSVK3, pBPV, pMSG 및 pSVL이다. 다른 적합한 벡터는 당업자에게는 곧 자명할 것이다.
숙주 세포내로 작제물 인산칼슘 형질감염, DEAE-덱스트란 매개된 형질감염, 양이온 지질-매개된 형질감염, 전기천공, 형질도입, 감염 또는 다른 방법에 의해 도입될 수 있다. 이러한 방법은 문헌[Davis et al., Basic Methods In Molecular Biology (1986)]과 같은 많은 표준 실험안내서에 기술되어 있다.
폴리펩티드는 융합 단백질과 같은 변형된 형태로 발현될 수 있으며, 분비 시그날뿐만 아니라 추가의 이종 작용 영역을 포함할 수 있다. 예를 들면, 추가의 아미노산, 특히 하전된 아미노산의 영역이 폴리펩티드의 N-말단에 부가되어 정제동안 또는 후속 작업 및 저장동안에 숙주세포에서의 안정성 및 지속성을 향상시킬 수 있다. 또한, 펩티드 잔기를 폴리펩티드에 부가하여 정제를 용이하게 할 수 있다. 이러한 영역은 폴리펩티드의 최종 제조 이전에 제거될 수 있다. 특히 분비 또는 배출을 유도하고, 안정성을 향상시키며, 정제를 용이하게 하기 위해 폴리펩티드에 펩티드 잔기를 부가하는 것은 당해 분야에서는 통상의 기술에 불과하다. 바람직한 융합 단백질은 단백질을 안정화하고 정제하는데 유용한 면역글로불린으로부터의 이종 영역을 포함한다. 예를 들면, EP-A-O 464 533(캐나다 상응특허 2045869)에는 면역글로불린 분자의 불변영역의 여러 일부를 다른 사람 단백질 또는 이의 일부와 함께 포함하는 융합 단백질이 기술되어 있다. 많은 경우, 융합 단백질에서 Fc 부분이 치료 및 진단에 사용하는데 상당히 유리하여서, 예를 들면 약물동력학 특성이 향상된다(EP-A 0232 262). 한편, 일부 용도와 관련하여 융합 단백질이 기술된 유리한 방식으로 발현되고, 검출되며 정제된 후 Fc 부분을 제거할 수 있는 것이 바람직할 수 있다. 이 경우는 Fc 부분이 치료 및 진단에서 사용하는데 장애 요인이 되는 경우로서, 예를 들면 융합 단백질이 면역화를 위한 항원으로서 사용되는 경우이다. 약물의 개발에서, 예를 들면, hIL-5와 같은 사람 단백질이 hIL-5의 길항제를 동정하기 위한 고속처리 스크리닝 검정의 목적상 Fc 부분과 융합되었다[참조: D. Bennett et al., J. Molecular Recognition 8:52-58 (1995) 및 K. Johanson et al., J. Biol. Chem. 270:9459-9471 (1995)].
KDI 단백질은 황산암모늄 또는 에탄올 침전, 산 추출, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로즈 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 하이드록실애퍼타이트 크로마토그래피 및 렉틴 크로마토그래피를 포함한 잘 알려진 방법에 의해 재조합 세포 배양물로부터 회수 및 정제할 수 있다. 보다 바람직하게는, 고성능 액체 크로마토그래피("HPLC")가 정제에 사용된다. 본 발명의 폴리펩티드는 다음을 포함한다: 직접 분리되거나 배양된 것에 상관없이 체액, 조직 및 세포를 포함하는 천연 공급원으로부터 정제된 생성물; 화학 합성 절차의 생성물; 및 예를 들면 세균, 효모, 고등 식물, 곤충 및 포유류 세포를 포함한 원핵 또는 진핵 숙주로부터 재조합 기술에 의해 생성된 산물. 재조합 생성 절차에서 사용된 숙주에 따라, 본 발명의 폴리펩티드는 당화되거나 비당화될 수 있다. 또한, 본 발명의 폴리펩티드는 일부 경우에 숙주-매개된 과정의 결과로서 초기 변형된 메티오닌 잔기를 포함할 수 있다. 따라서, 해독 개시 코돈에 의해 암호화된 N-말단 메티오닌이 일반적으로 모든 진핵 세포에서 해독 후 임의의 단백질로부터 고효율로 제거된다는 것은 본 분야에 잘 알려져 있다. 대부분의 단백질상의 N-말단 메티오닌이 대부분의 원핵세포에서 효율적으로 제거되는 한편, 일부 단백질의 경우 원핵세포 제거 과정은 N-말단 메티오닌이 공유 결합되어 있는 아미노산의 성질에 따라 비효율적이다.
폴리펩티드 및 단편
본 발명은 기탁된 DNA에 의해 암호화된 아미노산 서열 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 분리된 KDI 폴리펩티드 또는 당해 폴리펩티드의 일부를 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드를 추가로 제공한다.
변이체 및 돌연변이 폴리펩티드
KDI 폴리펩티드의 특징을 향상 또는 변형시키기 위해, 단백질 유전공학을 사용할 수 있다. 당업자에게 알려진 재조합 DNA 기술을 사용하여 단일 또는 다수 아미노산 치환, 결실, 부가 또는 융합 단백질을 포함하는 신규한 돌연변이 단백질 또는 뮤테인을 생성할 수 있다. 이렇게 변형된 폴리펩티드는 예를 들면 증강된 활성 또는 증가된 안정성을 나타낼 수 있다. 또한, 이들은 적어도 특정 정제 및 저장 조건하에서 상응하는 천연 폴리펩티드에 비해 고수율로 정제되며, 보다 양호한 용해성을 나타낼 수 있다.
N-말단 및 C-말단 결실 돌연변이체
예를 들면 막 결합된 단백질의 세포외 도메인 또는 분비된 단백질의 성숙 형태(들)를 포함하는 많은 단백질의 경우, 하나 이상의 아미노산이 생물학적 기능의 실질적인 상실없이도 N-말단 또는 C-말단으로부터 결실될 수 있음은 본 분야에 잘 알려져 있다. 예를 들면, 문헌[Ron et al., J. Biol. Chem., 268:2984-2988 (1993)]에는 비록 3, 8 또는 27개 아미노-말단 아미노산 잔기가 결실되었을지라도 헤파린 결합 활성을 가진 변형된 KGF 단백질이 보고되었다. 본 발명의 경우, 본 발명의 단백질이 인터페론 폴리펩티드 부류중의 하나이기 때문에, 서열번호 2에 제시된 위치 59의 시스테인까지의 N-말단 아미노산의 결실은 항바이러스 활성 또는 골수 증식의 억제와 같은 일부의 생물학적 활성을 유지할 수 있다. 서열번호 2의 Cys-59 잔기를 포함하는 추가의 N-말단 결실을 갖는 폴리펩티드는 인터페론-관련된 폴리펩티드에서의 이 잔기가 모든 것이 그러하지는 않지만 이 바로 옆에 위치한 루이신 잔기(잔기 60)와 마찬가지로 그 부류의 많은 일원 가운데 보존되어 있는 것으로 알려져 있기 때문에 그러한 생물학적 활성을 유지하리라고 기대되지 않을 것이다. 위치 59의 시스테인 잔기는 디설파이드 브릿지를 형성하여 수용체 결합 및 시그날 변환에 필요한 구조적 안정성을 제공하는데 필요한 것으로 생각된다.
그러나, 비록 단백질의 N-말단으로부터 한 개 이상의 아미노산 결실이 그 단백질의 하나 이상의 생물학적 기능을 변경 또는 상실시키는 결과를 초래했을지라도, 다른 생물학적 활성은 여전히 유지될 수 있다. 따라서, 단축된 단백질이 완전한 단백질을 인식하는 항체를 유도하고/하거나 그와 결합하는 능력은 일반적으로 완전한 단백질의 잔기 가운데 어느 정도가 N-말단으로부터 제거될 때 유지될 것이다. 완전한 단백질의 N-말단 잔기가 결실된 특정 폴리펩티드가 그러한 면역학적 활성을 유지하는지는 본원에 기술되고 당해 분야에 알려진 통상의 방법에 의해 쉽게 결정할 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한 서열번호 2에 제시된 KDI의 아미노산 서열의 아미노 말단으로부터 Cys-59까지 결실된 하나 이상의 잔기를 갖는 폴리펩티드 및 이러한 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 특히, 본 발명은 서열번호 2의 잔기 n 내지 207의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 제공하는데, 여기서, n은 1 내지 59의 범위에 있는 정수이고, Cys-59는 KDI 단백질의 활성에 필요한 것으로 믿어지는 완전한 KDI 폴리펩티드(서열번호 2)의 N-말단으로부터의 첫 번째 잔기의 위치이다.
보다 상세히, 본 발명은 서열번호 2의 잔기
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56-207, 57-207, 58-207 및 59-207의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 제공한다. 이들 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 또한 제공된다.
유사하게, 생물학적 작용성 C-말단 결실 뮤테인의 많은 예가 알려져 있다. 예를 들면, 인터페론 감마는 이 단백질의 카르복시 말단으로부터 8 내지 10개의 아미노산 잔기가 결실됨으로써 10배까지의 높은 활성을 보여준다(Dobeli et al., J. Biotechnology 7:199-216 (1988)). 본 발명의 경우, 본 발명의 단백질은 인터페론 폴리펩티드 부류의 일원이기 때문에, 서열번호 2에서 위치 183의 트립토판 잔기(W-183)까지의 C-말단 아미노산의 결실은 항바이러스 활성 또는 골수 증식의 억제와 같은 일부의 생물학적 활성을 유지할 수 있다. 서열번호 2의 Ile-183을 포함하는 추가의 C-말단 결실을 가진 폴리펩티드는, 인터페론-연관된 폴리펩티드에서의 이 잔기가 많은 일원 가운데 보존되고 있는 것으로 알려져 있고 수용체 결합 및 시그날 변환에 중요한 것으로 생각되기 때문에, 그러한 생물학적 활성을 유지하리라고는 기대되지 않을 것이다. 게다가, 위치 181의 시스테인 잔기는 고도로 보존되고 있으며 인터페론 부류의 일원의 항바이러스 활성에 필요한 것으로 알려져 있다.
그러나, 비록 단백질의 C-말단으로부터 하나 이상의 아미노산의 결실이 그 단백질의 하나 이상의 생물학적 기능의 상실이라는 변형을 초래할 지라도, 다른 생물학적 활성은 그대로 유지될 수 있다. 따라서, 단축된 단백질이 완전한 단백질을 인식하는 항체를 유도하고/하거나 그와 결합하는 능력은 일반적으로 완전한 단백질의 잔기중 어느 정도가 C-말단으로부터 제거될 경우 유지될 것이다. 완전한 단백질의 C-말단 잔기가 결실된 특정 폴리펩티드가 그러한 면역학적 활성을 유지하는지는 본원에 기술되고 본 분야에 공지된 통상의 방법에 의해 쉽게 결정될 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한 서열번호 2로 제시된 KDI의 아미노산 서열의 카르복시 말단으로부터 서열번호 2의 Trp-183까지의 하나 이상의 아미노산을 가진 폴리펩티드 및 이러한 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 특히, 본 발명은 서열번호 2에서 아미노산 서열의 잔기 1 내지 m의 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드를 제공하는데, 여기서, m은 183 내지 207의 범위에 있는 정수이고 잔기 Trp-183은 KDI 단백질의 활성에 필요한 것으로 믿어지는 완전한 KDI 폴리펩티드(서열번호 2)의 C-말단으로부터의 첫 번째 잔기의 위치이다.
보다 상세히, 본 발명은 서열번호 2의 잔기 1-183, 1-184, 1-185, 1-186, 1-187, 1-188, 1-189, 1-190, 1-191, 1-192, 1-193, 1-194, 1-195, 1-196, 1-197, 1-198, 1-199, 1-200, 1-201, 1-202, 1-203, 1-204, 1-205, 1-206 및 1-207의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 제공한다. 또한, 이들 폴리펩티드를 암호화한 폴리뉴클레오티드가 제공된다.
또한, 본 발명은 서열번호 2의 잔기 n 내지 m을 갖는 것으로 일반적으로 기술될 수 있는 아미노 및 카복실 말단 모두로부터 결실된 하나 이상의 아미노산을 갖는 폴리펩티드를 제공하는데, 여기서, n 및 m은 상기된 바와 같은 정수이다. 게다가, 본 발명은 임의로 N-말단 메티오닌을 갖는 그들 돌연변이 폴리펩티드를 제공한다. 따라서, 폴리펩티드는 또한 식 x-n-m(여기서, x는 NH2 또는 Met이고 n 및 m은 상기된 바와 같은 정수이다)으로 기술될 수 있다. 물론 이들 폴리펩티드를 암호화한 폴리뉴클레오티드도 제공된다.
보다 상세히, 본 발명은 바람직하게는 서열번호 2의 잔기
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의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 제공한다. 상기 폴리펩티드의 각각은 추가로 N-말단 메티오닌 잔기를 포함할 수 있다. N-말단 메티오닌 잔기와 함께 또는 이 잔기 없이 그들 폴리펩티드의 각각을 암호화한 폴리뉴클레오티드가 또한 제공된다.
또한, 클론 HKAPI15내 사람 cDNA에 의해 암호화된 완전한 KDI 아미노산 서열의 일부로 이루어진 폴리펩티드가 포함되는데, 여기서, 그 일부는 클론 HKAPI15내 사람 cDNA에 의해 암호화된 완전한 아미노산 서열의 아미노 말단으로부터 1 내지 약 58개 아미노산 또는 카르복시 말단으로부터 1 내지 약 23개 아미노산을 배제하거나 클론 HKAPI15내 사람 cDNA에 의해 암호화된 완전한 아미노산 서열의 상기 아미노 말단과 카르복시 말단 결실물의 임의의 배합물을 배제한다. 또한, 상기 모든 결실 돌연변이 폴리펩티드 형태를 암호화한 폴리뉴클레오티드가 제공된다.
다른 돌연변이체
상기된 단백질의 말단 결실 형태이외에 당업자라면 KDI 폴리펩티드의 일부 아미노산 서열이 단백질의 구조 또는 기능에 현저한 영향을 미치지 않고서 다양화 될 수 있음을 인식할 것이다. 서열에서의 그러한 차이를 고려하는 경우, 활성을 결정하는 단백질상의 중요 영역이 있음을 명심해야 한다.
따라서, 본 발명은 또한 실질적인 KDI 폴리펩티드 활성을 나타내거나 하기 논의된 단백질 부분과 같은 KDI 단백질의 영역을 포함하는 KDI 폴리펩티드의 변이체를 포함한다. 이러한 돌연변이체는 활성에 영향을 거의 미치지 않도록 본 분야에 알려진 일반적인 규칙에 따라 선택된 결실, 삽입, 역전, 반복 및 유형 치환을 포함한다. 예를 들면, 표현형상 사일런트 아미노산 치환물을 만드는 방법에 관한 안내서가 제이. 유. 보비 등(Bowie, J.U. et al.)에 의해 제공되는데["Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions, "Science 247:1306-1310 (1990)], 여기서, 저자는 아미노산의 변화에 대한 내성을 연구하는데 두 가지 주요 방법이 있음을 교시한다. 첫 번째 방법은 돌연변이가 자연선택에 의해 수용되거나 거부되는 진화의 과정에 의존한다. 두 번째 방법은 유전공학을 사용하여 클로닝된 유전자의 특정 위치에 아미노산 변화를 도입하고 선별과 스크리닝을 통해 작용성을 유지하는 서열을 동정하는 것이다.
저자가 진술한 바와 같이, 이들 연구로부터 단백질은 아미노산 치환에 대해 놀랄정도로 내성을 나타내는 것으로 드러났다. 저자는 또한 어느 아미노산 변화가 단백질의 특정 위치에서 허용되는지를 교시한다. 예를 들면, 대부분의 숨겨진 아미노산 잔기는 비극성 측쇄를 요구하는데 반하여 표면 측쇄의 소수 특징은 일반적으로 보존된다. 다른 그러한 표현형상 사일런트 치환이 상기 보비의 문헌에 기술되어 있으며 이 문헌은 본원에 참고로 원용된다. 보존 치환으로서 전형적으로 볼 수 있는 것은 지방족 아미노산 Ala, Val, Leu 및 Ile사이의 상호 치환; 하이드록실 잔기 Ser 및 Thr의 교환; 산성 잔기 Asp 및 Glu의 교환; 아미드 잔기 Asn 및 Gln사이의 치환; 염기성 잔기 Lys 및 Arg의 교환; 및 방향족 잔기 Phe 및 Tyr사이의 치환이다.
그러므로, 서열번호 2의 폴리펩티드의 단편, 유도체 또는 유사체 또는 기탁된 cDNA에 의해 암호화된 것은 (i) 한 개 이상의 아미노산 잔기가 보존되거나 비보존된 아미노산 잔기(바람직하게는 보존된 아미노산 잔기)로 치환되고 그러한 치환된 아미노산 잔기는 유전암호에 의해 암호화된 것이거나 암호화된 것이 아닐 수 있는 것, (ii) 한 개 이상의 아미노산 잔기가 치환체 그룹을 포함하는 것, (iii) KDI 폴리펩티드가 폴리펩티드의 반감기를 증가시켜 주는 화합물(예, 폴리에틸렌 글리콜)과 같은 다른 화합물과 융합된 것 또는 (iv) IgG Fc 융합 영역 펩티드 또는 리더 또는 분비 서열 또는 폴리펩티드의 상기 형태 또는 프로단백질 서열의 정제를 위해 사용되는 서열과 같이 추가의 아미노산이 폴리펩티드의 상기 형태에 융합된 것일 수 있다. 이러한 단편, 유도체 및 동족체는 본원의 교시로부터 본 분야의 숙련가의 범위에 속하는 것으로 간주된다.
따라서, 본 발명의 KDI는 천연 돌연변이 또는 사람의 조작으로부터 한 개이상의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 포함할 수 있다. 언급된 바와 같이, 변화는 단백질의 폴딩 또는 활성에 유의적으로 영향을 미치지 않는 보존 아미노산 치환과 같이 약간의 성질 변화로 나타나는 것이 바람직하다.
본 발명의 KDI 단백질에서 작용에 필수적인 아미노산은 부위-지정된 돌연변이유발 또는 알라닌-스캐닝 돌연변이유발과 같은 본 분야에 알려진 방법에 의해 동정될 수 있다(Cunningham and Wells, Science 244:1081-1085 (1989)). 후자의 절차는 분자내 모든 잔기에서 단일 알라닌 돌연변이를 도입한다. 그런 다음 생성된 돌연변이 분자를 수용체 결합 또는 시험관내 증식 활성과 같은 생물학적 활성에 대해 시험한다.
보다 적은 응집과 같은 고도로 바람직한 개선된 특징을 갖는 단백질을 생성할 수 있는 다른 전하 또는 중성 아미노산으로 하전된 아미노산을 치환시키는 것이 특히 유익하다. 응집은 응집부위가 면역원성일 수 있기 때문에 활성을 감소시킬뿐만 아니라 약제학적 조성물을 제조할 때 또한 문제를 일으킬 수 있다(Pinckard et al., Clin. Exp. Immunol. 2:331-340 (1967); Robbins et al., Diabetes 36: 838-845 (1987); Cleland et al., Crit. Rev. Therapeutic Drug Carrier Systems 10:307-377 (1993)).
아미노산의 치환은 또한 세포 표면 수용체에 리간드의 결합 선택성을 변화시킬 수 있다. 예를 들면, 문헌[Ostade et al., Nature 361:266-268 (1993)]에는 TNF 수용체의 두 개의 공지된 유형중 단지 하나에만 TNF-α의 선택적인 결합을 유도하는 특정 돌연변이가 기술되어 있다. 리간드-수용체 결합에 중요한 부위는 또한 결정, 핵자기공명 또는 광친화성 라벨링과 같은 구조 분석에 의해 결정할 수 있다(Smith et al., J. Mol. Biol. 224:899-904 (1992) 및 de Vos et al., Science 255:306-312 (1992)).
본원에 기술된 각 KDI 폴리펩티드에 대해 특히 바람직한 치환은 위치 192의 아르기닌 잔기에서 라이신으로의 치환(때로 이하에서 "R192K"이라 한다) 및 위치 193에서 시스테인 잔기에서 세린 잔기로의 치환(때로 이하에서 "C193S"라고 한다)이다. 이들 치환은 개별적으로 KDI 폴리펩티드에서 발견할 수 있거나 이들은 동일한 KDI 폴리펩티드에서 일어날 수 있다. 치환을 함유한 상기 모든 KDI 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
본 발명의 폴리펩티드는 바람직하게는 분리된 형태로 제공되며 바람직하게는 실질적으로 정제된다. KDI 폴리펩티드의 재조합적으로 생성된 형태는 문헌[Smith and Johnson, Gene 67:31-40 (1998)]에 기술된 일단계 방법에 의해 실질적으로 정제할 수 있다. 또한, 본 발명의 폴리펩티드는 단백질 정제의 분야에서 잘 알려진 방법으로 본 발명의 항-KDI 항체를 사용하여 천연 또는 재조합 공급원으로부터 정제할 수 있다.
또한, 본 발명은 (a) 서열번호 2로 제시된 완전한 아미노산 서열을 갖는 전체 길이 KDI 폴리펩티드의 아미노산 서열, (b) N-말단 메티오닌을 제외한 서열번호 2로 제시된 완전한 아미노산 서열(즉, 서열번호 2의 잔기 2 내지 207)을 갖는 전체 길이 KDI 폴리펩티드의 아미노산 서열, (c) 서열번호 2에서 잔기 28-207로 제시된 성숙한 KDI 폴리펩티드의 아미노산 서열, (d) 서열번호 2에서 잔기 165-183으로 제시된 아미노산 서열, (e) 클론 HKAPI15에 함유된 사람 cDNA에 의해 암호화된 전체 길이 KDI 폴리펩티드, (f) N-말단 메티오닌을 제외한 클론 HKAPI15에 함유된 사람 cDNA에 의해 암호화된 전체 길이 KDI 폴리펩티드 및 (g) 클론 HKAPI15에 함유된 사람 cDNA에 의해 암호화된 성숙한 KDI 폴리펩티드로 이루어진 그룹중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 분리된 KDI 폴리펩티드를 제공한다.
또한 본 발명의 폴리펩티드는 상기된 것과 90% 이상 유사성, 더욱 바람직하게는 95% 이상 유사성 및 더 더욱 바람직하게는 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 유사성을 갖는 폴리펩티드가 포함된다. 본 발명의 폴리펩티드는 또한 기탁된 DNA에 의해 암호화된 폴리펩티드 또는 서열번호 2의 폴리펩티드와 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 또는 95% 이상, 더 더욱 바람직하게는 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일한 것을 포함하며, 또한 10, 20 또는 30개 이상의 아미노산 및 더욱 바람직하게는 50개 이상의 아미노산을 갖는 그러한 폴리펩티드의 일부를 포함한다.
본 발명의 추가의 양태는 한 개 이상의 보존 아미노산 치환을 함유하지만 50개 이하의 보존 아미노산 치환, 더 더욱 바람직하게는 40개 이하의 보존 아미노산 치환, 훨씬 더 바람직하게는 30개 이하의 보존 아미노산 치환 및 가장 바람직하게는 20개 이하의 보존 아미노산 치환을 함유하는 아미노산 서열을 갖는 KDI 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드에 관한 것이다. 물론, 점점 바람직한 정도의 순서로, 한 개 이상을 함유하지만 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개 이하의 보존 아미노산 치환을 함유하는 KDI 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 펩티드 또는 폴리펩티드가 매우 바람직하다.
두 폴리펩티드의 "유사성 %"는 베스트피트 프로그램(Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711) 및 유사성 결정을 위한 데폴트 세팅을 사용하여 두 폴리펩티드의 아미노산 서열을 비교함으로써 생성된 유사성 점수로 의도된다. 베스트피트는 스미스 및 워터맨의 국부 상동성 알고리듬을 사용하여 두 서열 사이의 최상의 유사성 단편을 찾아낸다(Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981)).
IL-20 폴리펩티드의 기준 아미노산 서열과 예를 들면 95% 이상 "동일한" 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드는 이 폴리펩티드의 아미노산 서열이 IL-20 폴리펩티드의 기준 아미노산 중 각 100개 아미노산 당 5개 이하의 아미노산 변이를 포함할 수 있는 폴리펩티드를 제외하고 쿼리 서열과 동일함을 의미한다. 다시 말해서, 쿼리 아미노산 서열과 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 수득하기 위해, 쿼리 서열에서 아미노산 잔기의 5%까지 결실시키거나 다른 아미노산으로 치환시킬 수 있거나, 기준 서열에서 총 아미노산 잔기중 5%까지의 다수의 아미노산을 기준 서열내로 삽입시킬 수 있다. 기준 서열의 이들 변이는 기준 아미노산 서열의 아미노 또는 카르복시 말단 위치에서 일어나거나, 기준 서열의 잔기중 개별적으로 또는 기준 서열내 하나 이상의 인접 그룹에 산재된 말단 위치사이의 어느 곳에서도 일어날 수 있다.
실질적인 문제로서, 임의의 특정 폴리펩티드가 예를 들면 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열 또는 기탁된 cDNA 클론에 의해 암호화된 아미노산 서열과 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일한지는 통상적으로 베스트피트 프로그램(Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711)과 같은 공지된 컴퓨터 프로그램을 사용하여 결정할 수 있다. 특정 서열이 본 발명의 기준 서열과 예를 들면 95% 동일한지를 결정하기 위해 베스트피트 또는 기타 다른 서열 배열 프로그램을 사용할 때, 물론 동일성의 백분율이 기준 아미노산 서열의 전체 길이에 대해 계산되고 기준 서열내 아미노산 잔기의 총 수의 5%이하의 상동성에서 갭이 허용되도록 변수를 설정한다. 쿼리 서열(본 발명의 서열)과 해당 서열사이의 최상의 전체 정합을 결정하는 바람직한 방법(또한, 전체 서열 배열이라 한다)은 브루트래그의 알고리듬(Comp. App. Biosic. (1990) 6:237-245)을 기초로 FASTDB 컴퓨터 프로그램을 사용하여 결정할 수 있다. 서열 배열에서 쿼리 및 해당 서열은 둘다 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열이다. 언급된 전체 서열 배열의 결과는 동일성 %로 표시된다. FASTDB 아미노산 배열에 사용되는 바람직한 변수는 다음과 같다: 매트릭스=PAM 0, k-터플=2, 부정합 벌점=1, 결합 벌점=20, 무작위 그룹 길이=0, 임계 점수=1, 윈도우 크기=서열 길이, 갭 벌점=5, 갭 크기 벌점=0.05, 윈도우 크기=500 또는 해당 아미노산 서열의 길이중 짧은 것.
해당 서열이 내부 결실 때문이 아니라 N- 또는 C-말단 결실로 인해 쿼리 서열보다 짧은 경우 결과에 대해 수동 교정이 이루어져야 한다. 이것은 FASTDB 프로그램이 전체 동일성 %를 계산할 때 해당 서열의 N- 및 C-말단 절단을 산정하지 않기 때문이다. 쿼리 서열에 대하여 N- 및 C-말단에서 절단된 해당 서열의 경우, 동일성 %는 쿼리 서열의 총 염기의 백분율로서 상응하는 해당 서열과 정합/배열되지 않은 해당 서열의 N- 및 C-말단인 쿼리 서열의 잔기 수를 계산함으로써 교정한다. 잔기가 정합/배열되었는 지는 FASTDB 서열 배열의 결과로서 결정한다. 그런 다음, 이 백분율을 특정 변수를 사용하여 상기 FASTDB 프로그램에 의해 계산된 동일성 %로부터 공제하여 최종 동일성 % 점수를 얻는다. 이러한 최종 동일성 % 점수가 본 발명의 목적을 위해 사용되는 것이다. 쿼리 서열과 정합/배열되지 않은 해당 서열의 N- 및 C-말단의 잔기만이 동일성 % 점수를 수동으로 조절하는 목적에 고려된다. 즉, 해당 서열의 가장 먼 N- 및 C-말단 잔기와의 쿼리 잔기 위치만 고려된다.
예를 들면, 90개 아미노산 잔기 해당 서열을 100개 잔기 쿼리 서열과 배열하여 동일성 %를 결정한다. 결실은 해당 서열의 N-말단에서 일어나며 이에 따라 FASTDB 배열은 N-말단의 최초 10개 잔기의 정합/배열을 나타내지 않는다. 10개의 쌍을 이루지 못한 잔기는 서열의 10%(정합되지 않은 N- 및 C-말단에 존재하는 잔기의 수/쿼리 서열내 잔기의 총 수)를 나타내므로 FASTDB 프로그램에 의해 계산된 동일성 % 점수로부터 10%를 공제한다. 만일 나머지 90개 잔기가 완벽하게 정합된 경우 최종 동일성 %는 90%일 것이다. 다른 예로서, 90개 잔기 해당 서열이 100개 잔기 쿼리 서열과 비교된다. 이 시점에서 결실은 내부 결실이므로 쿼리와 정합/배열되지 않은 해당 서열의 N- 또는 C-말단에의 잔기는 없다. 이 경우, FASTDB에 의해 계산된 동일성 %는 수동으로 교정되지 않는다. 다시 한번, 쿼리 서열과 정합/배열되지 않은 것으로 FASTDB 배열에서 나타난 바와 같이 해당 서열의 N- 및 C-말단외의 잔기 위치만을 수동으로 교정한다. 본 발명의 목적을 위해 어떠한 다른 수동 교정도 이루어지지 않는다.
본 발명의 폴리펩티드는 당업자에게 잘 알려진 방법을 사용하여 SDS-PAGE 겔 또는 분자체 겔 여과 컬럼상에서 분자량 마커로서 사용할 수 있다.
이하에 상세히 기술된 바와 같이, 본 발명의 폴리펩티드는 또한 하기된 바와 같이 KDI 단백질 발현을 검출하기 위한 검정에서 유용하거나 KDI 단백질 작용을 증강 또는 억제할 수 있는 효능제 또는 길항제로서 유용한 폴리클로날 또는 모노클로날 항체를 유도하기 위해 사용할 수 있다. 또한, 이러한 폴리펩티드는 본 발명에 따른 후보 효능제 및 길항제인 KDI 단백질 결합 단백질을 "포착"하기 위해 효모 2-하이브리드 시스템(two-hybrid system)에 사용할 수 있다. 효모 2-하이브리드 시스템은 문헌[Fields and Song, Nature 340:245-246 (1989)]에 기술되어 있다.
에피토프-함유 부분
다른 관점에서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드의 에피토프-함유 부분을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드를 제공한다. 이 폴리펩티드 부분의 에피토프는 본 발명의 폴리펩티드의 면역원성 또는 항원성 에피토프이다. "면역원성 에피토프"는 전체 단백질이 면역원일 때 항체 반응을 나타내는 단백질의 일부로서 정의된다. 다시 말해서, 항체가 결합할 수 있는 단백질 분자의 영역을 "항원성 에피토프"로 정의된다. 단백질의 면역원성 에피토프의 수는 일반적으로 항원성 에피토프의 수보다 적다[참조: Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81;3998-4002 (1983)].
항원성 에피토프를 함유한(즉, 항체가 결합할 수 있는 단백질 분자의 영역을 함유하는) 펩티드 또는 폴리펩티드의 선별과 관련하여, 단백질 서열의 일부를 모사하는 비교적 짧은 합성 펩티드가 통상적으로 부분적으로 모사된 단백질과 반응하는 항혈청을 나타낼 수 있음은 본 분야에서는 잘 알려져 있다[참조: Sutcliffe, J.G., Shinnick, T.M., Green, N. 및 Learner, R.A. (1983) "Antibodies that react with predetermined sites on proteins," Science, 219:660-666]. 단백질-반응성 혈청을 유도할 수 있는 펩티드는 흔히 단백질의 일차 서열로 나타내며 한 세트의 간단한 화학적 규칙에 의해 특성화될 수 있고 완전한 단백질의 면역우성 영역(즉, 면역원성 에피토프) 또는 아미노 또는 카르복실 말단으로 한정되지 않는다. 그러므로, 본 발명의 항원성 에피토프-함유 펩티드 및 폴리펩티드는 본 발명의 폴리펩티드와 특이적으로 결합하는 항체(모노클로날 항체를 포함)를 유도하기에 유용하다[참조: Wilson et al., Cell 37:767-778 (1984)에서 777].
본 발명의 항원성 에피토프-함유 펩티드 및 폴리펩티드는 본 발명의 폴리펩티드의 아미노산 서열내에 함유된 7개 이상, 더욱 바람직하게는 9개 이상 및 가장 바람직하게는 약 15 내지 약 30개 아미노산의 서열을 함유한다. KDI-특이적 항체를 형성하기 위해 사용할 수 있는 항원성 폴리펩티드 또는 펩티드의 비제한적인 예로는 다음과 같은 것이 포함된다: 서열번호 2에서 약 Ser 49 내지 약 Ser 54의 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드; 서열번호 2에서 약 Cys 59 내지 약 Ala 65의 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드; 서열번호 2에서 약 Pro 78 내지 약 Tyr 88의 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드; 서열번호 2에서 약 His 101 내지 약 Gln 113의 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드; 서열번호 2에서 Gln 120 내지 약 Glu 123의 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드; 서열번호 2에서 Cys 128 내지 약 Pro 155의 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드; 서열번호 2에서 약 Leu 160 내지 약 Arg 168의 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드; 서열번호 2에서 약 Asn 171 내지 약 Asp 180의 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드; 서열번호 2에서 약 Val 186 내지 약 Cys 193의 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드; 및 서열번호 2에서 약 Phe 204 내지 약 Lys 207의 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드. 이들 폴리펩티드 단편은 상기 도 3에서 보는 바와 같이 제임슨-울프 항원성 지수의 분석에 의해 KDI 단백질의 항원성 에피토프를 함유하는 것으로 결정되었다.
본 발명의 에피토프-함유 펩티드 및 폴리펩티드는 임의의 통상적인 수단에 의해 생성할 수 있다[참조: Houghten, R.A. (1985) "다수의 펩티드의 일반적인 고체상 고속 합성 방법: 개개 아미노산의 수준에서 항원-항체 상호작용의 특이성" Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:5131-5135]. 이 "동시 다발 펩티드 합성(SMPS)"방법은 또한 Houghten 등의 미국특허 제4,631,211호(1986)에 기술되어 있다.
본 발명의 에피토프-함유 펩티드 및 폴리펩티드는 본 분야에 잘 알려진 방법에 따라 항체를 유도하는데 사용할 수 있다[참조: 상기 Sutcliffe et al.; 상기 Wilson et al.; Chow, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:910-914; 및 Bittle, F.J. et al., J. Gen. Virol. 66:2347-2354 (1985)]. 본 발명의 면역원성 에피토프-함유 펩티드(즉, 전체 단백질이 면역원일 때 항체 반응을 나타내는 단백질의 일부)는 본 분야에 공지된 방법에 따라 동정한다[참조: 상기 Geysen et al.]. 또한, Geysen의 미국특허 제5,194,392호(1990)에는 해당 항체의 특정 파라토프(항원 결합 부위)에 상보적인 에피토프의 위상 균등물(즉, "미모토프")인 단량체의 서열(아미노산 또는 다른 화합물)을 검출 또는 결정하는 일반적인 방법이 기술되어 있다. 더욱 일반적으로, Geysen의 미국특허 제4,433,092호 (1989)에는 해당 특정 수용체의 리간드 결합 부위와 상보적인 리간드의 위상 균등물인 단량체의 서열을 검출 또는 결정하는 방법이 기술되어 있다. 유사하게, 과알킬화 올리고펩티드 혼합물에 관한 Houghten, R.A.의 미국특허 제5,480,971호(1996)에는 직쇄 C1-C7-알킬 과알킬화 올리고펩티드 및 이러한 펩티드의 세트 및 라이브러리뿐만 아니라 이러한 올리고펩티드 세트 및 라이브러리를 사용하여 해당 수용체 분자와 우선적으로 결합하는 과알킬화 올리고펩티드의 서열을 결정하는 방법이 기술되어 있다. 따라서, 본 발명의 에피토프-함유 펩티드의 비-펩티드 유사체는 또한 이들 방법에 의해 통상적으로 제조될 수 있다.
융합 단백질
당업자에 의해 인지될 수 있는 바와 같이, 본 발명의 KDI 폴리펩티드 및 상기된 이의 에피토프-함유 단편을 면역글로불린(IgG)의 불변 도메인의 일부와 결합시켜 키메릭 폴리펩티드를 수득할 수 있다. 이들 융합 단백질은 정제를 촉진하며 증가된 생체내 반감기를 나타낸다. 이것은 예를 들면 사람 CD4-폴리펩티드의 처음 두 도메인 및 포유류 면역글로불린의 중쇄 또는 경쇄의 불변 영역의 여러 도메인으로 이루어진 키메릭 단백질에 대해 제시되어 왔다(EP A 394,827; Traunecker et al., Nature 331:84-86 (1988)). IgG 부분으로 인해 디설파이드-연결된 이량체 구조를 갖는 융합 단백질은 또한 단독의 단량체 KDI 단백질 또는 단백질 단편보다 다른 분자에 결합하고 중화시키는데 있어서 보다 효율적일 수 있다(Fountoulakis et al., J. Biochem. 270:3958-3964 (1995)).
항체
동물계(예, 토끼 또는 마우스)에 알부민과 같은 담체 단백질과 함께 제시될 수 있거나 완전한 KDI 단백질 또는 이의 항원성 폴리펩티드 단편이 충분히 긴 경우(약 25개 이상의 아미노산) 담체 없이 완전한 KDI 단백질 또는 이의 항원성 폴리펩티드 단편에 대해 본 발명에 사용하기 위한 KDI-단백질 특이적 항체를 생성할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "항체"(Ab) 또는 "모노클로날 항체"(Mab)는 KDI 단백질과 특이적으로 결합할 수 있는 항체 단편(예, Fab 및 F(ab')2 단편)뿐만 아니라 완전한 분자를 포함함을 의미한다. Fab 및 F(ab')2 단편은 완전한 항체에서 Fc 단편이 결핍되고 순환계로부터 보다 급속히 제거되며 완전한 항체의 보다 약한 비특이적 조직 결합을 가질 수 있다(Wahl et al., J. Nucl. Med. 24:316-325 (1983)). 따라서, 이들 단편이 바람직하다.
본 발명의 항체는 여러 방법으로 제조할 수 있다. 예를 들면, 폴리클로날 항체를 함유한 혈청의 생성을 유도하기 위해 KDI 단백질 또는 이의 항원성 단편을 발현하는 세포를 동물에 투여할 수 있다. 바람직한 방법으로서, KDI 단백질 제제를 제조하고 정제하여 실질적으로 천연 오염물로부터 유리되도록 한다. 그런 다음 보다 큰 특이적 활성의 폴리클로날 항혈청을 생성하기 위해 그러한 제제를 동물내로 도입시킨다.
가장 바람직한 방법으로, 본 발명의 항체는 모노클로날 항체(또는 이의 KDI 단백질 결합 단편)이다. 이러한 모노클로날 항체는 하이브리도마 기술을 사용하여 제조할 수 있다(Kohler et al., Nature 256:495 (1975); Kohler et al., Eur. J. Immunol. 6:511 (1976); Kohler et al., Eur. J. Immunol. 6:292 (1976); Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, Elsevier, N.Y., (1981) pp. 563-681). 일반적으로, 그러한 절차는 동물(바람직하게는 마우스)을 KDI 단백질 항원, 또는 더욱 바람직하게는 KDI 단백질-발현 세포로 면역화하는 것을 포함한다. 적합한 세포는 이들이 항-KDI 단백질 항체와 결합하는 능력에 의해 인식될 수 있다. 이러한 세포는 임의의 적합한 조직 배양 배지에서 배양시킬 수 있다. 그러나, 10% 태아 소 혈청(약 56℃에서 불활성화됨) 및 약 10 g/l의 비필수 아미노산, 약 1,000 U/ml의 페니실린 및 약 100 μg/ml의 스트렙토마이신이 보충된 이얼(Earle) 변형 이글(Eagle) 배지에서 세포를 배양하는 것이 바람직하다. 그러한 마우스의 비장세포를 추출하고 적합한 골수종 세포주와 융합시킨다. 어떠한 적합한 골수종 세포주도 본 발명에 따라 사용할 수 있다. 그러나, 매릴랜드 락빌 소재 더 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션으로부터 입수가능한 모 골수종 세포주(SP2O)를 사용하는 것이 바람직하다. 융합 후, 생성된 하이브리도마 세포를 HAT 배지에서 선별적으로 유지시킨 다음 문헌[Wands et al., Gastroenterology 80:225-232 (1981)]에 기술된 바와 같이 한정 희석으로 클로닝시킨다. 이어서, 그러한 선별을 통해 수득된 하이브리도마 세포를 검정하여 KDI 단백질 항원과 결합할 수 있는 항체를 분비하는 클론을 동정한다.
다른 방법으로서, KDI 단백질 항원과 결합할 수 있는 추가의 항체를 항-이디오타입(idiotype) 항체의 사용을 통해 두-단계 절차로 생성할 수 있다. 이러한 방법은 항체가 그 자체로 항원이고 그럼으로써 제2 항체와 결합하는 항체를 수득할 수 있다는 사실을 이용한다. 이 방법에 따르면, KDI-단백질 특이적 항체를 사용하여 동물, 바람직하게는 마우스를 면역화시킨다. 그런 다음 그러한 동물의 비장세포를 사용하여 하이브리도마 세포를 생성하고, 하이브리도마 세포를 스크리닝하여 KDI 단백질-특이적 항체와 결합하는 능력이 KDI 단백질 항원에 의해 차단될 수 있는 항체를 생성하는 클론을 동정한다. 이러한 항체는 KDI 단백질-특이적 항체에 대한 항-이디오타입 항체를 포함하며 동물을 면역화하는데 사용하여 추가의 KDI 단백질-특이적 항체의 형성을 유도할 수 있다.
본 발명의 항체의 Fab 및 F(ab')2 및 다른 단편이 본원에 기술된 방법에 따라 사용될 수 있음은 명백할 것이다. 이러한 단편은 전형적으로 파파인(papain)(Fab 단편의 생성) 또는 펩신(F(ab')2 단편의 생성)과 같은 효소를 사용한 단백질분해성 절단에 의해 생성한다. 다른 방법으로서, KDI 단백질-결합 단편은 재조합 DNA 기술을 응용하거나 화학적 합성을 통해 제조할 수 있다.
항-KDI를 사람의 생체내에서 사용하는 경우, "사람화" 키메릭 모노클로날 항체를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 항체는 상기된 모노클로날 항체를 생성하는 하이브리도마 세포-유래된 유전자 작제물을 사용하여 생성할 수 있다. 키메릭 항체를 생성하는 방법은 본 분야에 공지되어 있다[참조: Morrison, Science 229:1202 (1985); Oi et al., BioTechniques 4:214 (1986); Cabilly 등의 미국특허 제4,816,567호; Taniguchi 등의 유럽특허 제171496호; Morrison 등의 유럽특허 제173494호; Neuberger 등의 WO8601533; Robinson 등의 WO8702671; Boulianne et al., Nature 312:643 (1984); Neuberger et al., Nature 314:268 (1985)].
면역계-연관된 질환
치료
또한 본 발명의 KDI 단백질은 인터페론 부류의 일원이기 때문에 KDI를 개체의 세포, 조직 또는 신체에 첨가할 때 그 단백질이 상기 개체의 표적 세포에 대해 생리학적인 활성을 나타낼 것은 당업자라면 당연히 인식할 것이다. 따라서, 개체에게서 인터페론 활성이 표준 또는 정상 수준보다 감소되어서 유발된 증세, 특히 면역계 질환은 KDI 폴리펩티드의 투여에 의해 치료될 수 있음은 명백할 것이다. 그러므로, 본 발명은 또한 인터페론의 증가된 수준을 필요로 하는 개체에게 인터페론 활성 수준을 증가시키기에 유효한 양의 본 발명에 따른 분리된 KDI 폴리펩티드를 포함하는 약제학적 조성물을 투여함을 포함하여, 상기 개체를 치료하는 방법을 제공한다.
IFN-알파 및 IFN-베타의 생물학적 활성을 매개하는 사람 부류 I IFN 수용체 복합체는 또한 IFN-오메가와 결합하고 KDI와 결합할 것으로 예상된다. 따라서, KDI는 임상학적으로 항바이러스 요법을 위해, 예를 들면 AIDS, 만성 B형 간염을 포함한 바이러스성 감염, C형 간염, 유두종 바이러스, 바이러스성 뇌염의 치료 및 비염 및 호흡기 감염의 예방에 사용할 수 있다.
KDI는 또한 많은 암(예, 모발상세포 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 골육종, 기저세포 암, 신경교종, 신장 세포 암, 다발성 골수종, 흑색종 및 호지킨병)의 치 료에 유용하다.
KDI는 천연 킬러 세포 활성을 자극하는 것으로 믿어진다. 따라서, KDI는 기생충 및 세균 감염을 치료하기 위해, 예를 들면 크립토스포리듐 파르붐(Cryptosporidium parvum) 감염 및 다수약물-내성 폐렴을 치료하는데 사용할 수 있다.
KDI는 또한 면역치료제로서, 더욱 특정적으로는 면역억제제로서 유용한 것으로 믿어진다. 예를 들면, KDI는 미토겐 또는 동종이형 세포, 골수 선조 세포 및 기타 골수 세포로 자극된 림프구의 증식을 억제하는 것으로 믿어진다. 따라서, KDI는 화학요법전에 투여했을 때 예방제로서 유용하며 또한 림프구, 골수 선조 세포 및 골수 간세포의 과증식을 치료하기 위해, 예를 들면 만성 골수성 백혈병의 치료에 사용할 수 있다. KDI 폴리펩티드는 또한 이식편 대 숙주 거부반응을 예방하거나 관절염, 다발성 경화증 또는 당뇨병과 같은 자가면역 질환의 진행을 경감시키기 위해 사용할 수 있다. KDI는 또한 예를 들면 체액 반응을 억제함으로써 포유류에서 알레르기를 치료하는데 유용하다.
KDI는 예방 또는 치료 백신화의 경우에 면역 반응을 증강 또는 자극하기 위한 보조제 또는 공동보조제로서 사용할 수 있다.
또한, 항감염 요법을 필요로 하는 환자에게 유효량의 본 발명에 따른 폴리펩티드를 투여함을 포함하여, 환자에게서 감염을 치료하는 방법이 제공된다. 바람직한 양태로서, 감염은 바이러스성, 세균성 또는 기생충 병인에 의한 것이다. 특히 바람직한 양태로서, 감염은 바이러스성 감염이다.
또한, 항암 요법을 필요로 하는 환자에게 유효량의 본 발명에 따른 폴리펩티드를 투여함을 포함하여, 환자에게서 암을 치료하는 방법이 제공된다.
또한, 면역요법을 필요로 하는 환자에게 유효량의 본 발명에 따른 폴리펩티드를 투여함을 포함하는 면역요법이 제공된다.
제형
KDI 폴리펩티드 조성물은 개인 환자의 임상 증세(특히, KDI 폴리펩티드만으로의 치료에 따른 부작용), KDI 폴리펩티드 조성물의 전달 부위, 투여 방법, 투여 일정 및 전문가에게 알려진 다른 요인을 고려하여 양호환 의학적 실시와 일치하는 양상으로 제형되고 투약될 것이다. 따라서, 이러한 고려에 따라 본 발명의 목적상 KDI 폴리펩티드의 "유효량"은 결정된다.
일반적인 제안으로서, 투여량당 비경구 투여된 KDI 폴리펩티드의 총 약제학적 유효량은 비록 상기 주지된 바와 같이 치료학상의 판단에 따라 변할 수 있을 지라도 환자 체중의 약 1 μg/kg/일 내지 10 mg/kg/일의 범위일 것이다. 보다 바람직하게는, 이 용량은 적어도 0.01 mg/kg/일이고, 가장 바람직하게는 사람의 경우 호르몬에 대해 약 0.01 내지 1 mg/kg/일이다. 연속하여 투여하는 경우, KDI 폴리펩티드는 전형적으로 1일 1 내지 4회 주사 또는 연속 피하 주입(예, 미니 펌프 사용)에 의해 약 1 μg/kg/시간 내지 약 50 μg/kg/시간의 용량 속도로 투여한다. 또한, 정맥내 낭(bag) 용액이 사용될 수 있다. 변화를 관찰하는데 필요한 치료 기간 및 치료 후 반응이 일어나는 간격은 목적하는 효과에 따라 다양하다.
본 발명의 KDI를 함유한 약제학적 조성물은 경구, 직장, 비경구, 시스테몰내로(intracistemally), 질내, 복강내, 국부(산제, 연고제, 점적제 또는 경피 패치), 구강 또는 경구 또는 비내 분무로 투여할 수 있다. "약제학적으로 허용되는 담체"는 모든 유형의 무독성 고체, 반고체 또는 액체 충진제, 희석제, 캡슐화제 또는 제형 보조제를 의미한다. 본원에 사용된 용어 "비경구"는 정맥내, 근육내, 복강내, 흉골내, 피하 및 관절내 주사 및 주입을 포함하는 투여 방식을 가리킨다.
KDI 폴리펩티드는 적합하게는 또한 서방출 시스템에 의해 투여된다. 서방출성 조성물의 적합한 예로는 필름 또는 미세캡슐과 같은 모형의 반투과성 중합체 매트릭스가 포함된다. 서방출 매트릭스로는 폴리락티드(USP 제3,773,919호, EP 제58,481호), L-글루탐산과 감마-에틸-L-글루타메이트의 공중합체(Sidman, U. et al., Biopolymers 22:547-556 (1983)), 폴리(2-하이드록시에틸 메타크릴레이트)[R. Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277 (1981) 및 R. Langer, Chem. Tech. 12:98-105 (1982)], 에틸렌 비닐 아세테이트(R. Langer et al., Id.) 또는 폴리-D-(-)-3-하이드록시부티르산(EP 제133,988호)이 포함된다. 서방출 KDI 폴리펩티드 조성물은 또한 리포좀내에 고정된 KDI 폴리펩티드를 포함한다. KDI 폴리펩티드를 함유한 리포좀은 공지 방법[DE 제3,218,121호; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 82:3688-3692 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 77:4030-4034 (1980); EP 52,322; EP 36,676; EP 88,046; EP 143,949; EP 142,641; 일본특허원 제83-118008호; USP 제4,485,045호 및 제4,544,545호 및 EP 제102,324호]에 의해 제조된다. 보통, 리포좀은 작은(약 200-800 Å) 단층판(unilamella) 형이며 이 속의 지질 함량은 약 30 몰% 이상의 콜레스테롤이고 선택된 비율은 최적의 KDI 폴리펩티드 요법을 위해 조절될 수 있다.
비경구 투여의 경우, 한 가지 양태로서, KDI 폴리펩티드는 일반적으로 원하는 정도의 순도를 지닌 폴리펩티드를 약제학적으로 허용되는 담체(즉, 사용된 투여량 및 농도에서 수혜자에게 무독성이고 제형의 다른 성분과 혼화가능한 담체)와 단위 용량 주사 형태(용액, 현탁액 또는 에멀젼)로 혼합함으로써 제형된다. 예를 들면, 제형은 바람직하게는 산화제 및 폴리펩티드에 유해한 것으로 알려진 기타 화합물을 포함하지 않는다.
일반적으로, 제형은 KDI 폴리펩티드를 액체 담체 또는 미분 고체 담체 또는 이들 모두와 균일하게 고루 접촉시킴으로써 제조된다. 이어서, 필요한 경우, 생성물을 원하는 제형으로 성형한다. 바람직하게는 담체는 비경구 담체이고, 더욱 바람직하게는 수여자의 혈액과 등장성인 용액이다. 이러한 담체 비히클의 예로는 물, 염수, 링겔 용액 및 덱스트로즈 용액이 포함된다. 불휘발성 오일 및 에틸 올레이트와 같은 비수성 비히클뿐만 아니라 리포좀이 또한 유용하다.
담체는 적합하게는 등장성 및 화학 안정성을 증가시키는 물질과 같은 소량의 첨가제를 함유한다. 이러한 물질은 사용된 투여량 및 농도에서 수혜자에게 무독성이고, 인산염, 시트레이트, 석시네이트, 아세트산 및 기타 유기산 또는 이들의 염과 같은 완충제; 아스코르브산과 같은 산화방지제; 폴리아르기닌 또는 트리펩티드와 같은 저분자량(약 10개 이하의 잔기) 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 중합체; 글리신, 글루탐산, 아스파트산 또는 아르기닌과 같은 아미노산; 셀룰로즈 또는 이의 유도체, 글루코즈, 만노즈 또는 덱스트린을 포함하는 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트화제; 만니톨 또는 솔비톨과 같은 당 알코올; 나트륨과 같은 짝이온; 및/또는 폴리솔베이트, 폴록사머 또는 PEG와 같은 비이온성 계면활성제가 포함된다.
KDI 폴리펩티드는 전형적으로 그러한 비히클내에서 약 0.1 mg/ml 내지 100 mg/ml, 바람직하게는 1 내지 10 mg/ml의 농도로, 약 3 내지 8의 pH로 제형된다. 상기 부형제, 담체 또는 안정화제를 사용했을 때 KDI 폴리펩티드 염이 형성된다는 것은 이해될 수 있을 것이다.
치료상 투여를 위해 사용되는 KDI 폴리펩티드는 멸균되어야 한다. 멸균은 멸균 여과 막(예, 0.2 마이크론 막)을 통해 여과시킴으로써 쉽게 달성된다. 치료학적 KDI 폴리펩티드 조성물은 멸균 통로를 갖는 용기(예, 피하주사기에 의해 마개가 관통되도록 만든 정맥 주사 용액 낭 또는 바이알)에 넣는다.
보통 KDI 폴리펩티드는 수용액 또는 재구성용 동결건조 제제로서 단위 또는 수회-투여 용기(예, 밀폐된 앰풀 또는 바이알)에 저장될 것이다. 동결건조 제제의 예로서, 10 ml 바이알에는 5 ml의 멸균-여과된 1%(w/v) 수성 KDI 폴리펩티드 용액이 충진되며 생성된 혼합물은 동결건조된다. 주입 용액은 정균성 주사용수를 사용하여 동결건조된 KDI 폴리펩티드를 재구성함으로써 제조한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 약제학적 조성물의 하나 이상의 성분으로 충진된 하나 이상의 용기를 포함하는 약제학적 팩 또는 키트를 제공한다. 이러한 용기(들)는 약제 또는 생물학적 생성물의 제조, 사용 또는 판매를 통제하는 정부 당국에 의해 규정된 형태내에서 이루어져야 하며, 그러한 규정하에서 사람에게 투여할 수 있도록 제조, 사용 및 판매의 승인이 당국에 의해 허가된다. 또한, 본 발명의 폴리펩티드는 다른 치료 화합물과 병용하여 사용할 수 있다.
효능제 및 길항제 - 검정 및 분자
본 발명은 또한 수용체 분자와 같은 KDI-결합 분자와의 상호작용과 같이 세포에 대한 KDI의 작용을 증가 또는 차단하는 화합물을 스크리닝하여 동정하는 방법을 제공한다. 효능제는 KDI의 천연 생물학적 작용을 증가시키거나 KDI와 유사한 양상으로 작용하는 화합물인 반면, 길항제는 그러한 작용을 감소시키거나 제거한다.
이 양태의 다른 관점에서, 본 발명은 KDI 폴리펩티드와 특이적으로 결합하는 수용체 단백질 또는 기타 리간드-결합 단백질을 동정하는 방법을 제공한다. 예를 들면, 막 또는 이의 제제와 같은 세포 격실은 KDI와 결합하는 분자를 발현하는 세포로부터 제조할 수 있다. 제제는 표지된 KDI와 항온처리한다. KDI 및 수용체 또는 다른 결합 단백질과 결합된 KDI의 복합체는 본 분야에 공지된 통상의 방법에 따라 분리하고 특징을 확인한다. 다른 방법으로서, KDI 폴리펩티드는 고체 지지체에 결합시킬 수 있으며 이에 따라 세포로부터 용해된 결합 분자를 컬럼에 결합시킨 다음 통상적인 방법에 따라 용출하고 특징을 확인한다.
효능제 또는 길항제에 대한 본 발명의 검정에서, 막 또는 이의 제제와 같은 세포 격실은 KDI에 의해 조절된 시그날링 또는 조절 경로의 분자와 같이 KDI에 결합하는 분자를 발현하는 세포로부터 제조할 수 있다. 제제는 KDI 효능제 또는 길항제일 수 있는 후보 분자의 부재 또는 존재하에 표지된 KDI와 함께 항온처리한다. 후보 분자가 결합 분자에 결합하는 능력은 표지된 리간드의 감소된 결합으로 반영된다. KDI 결합 분자와의 결합에 미치는 KDI의 영향을 유도하지 않으면서 결합하는 분자는 십중팔구 양호한 길항제이다. 잘 결합하고 KDI와 동일하거나 밀접하게 연관이 있는 효과를 나타내는 분자는 효능제이다.
잠재적 효능제 및 길항제의 KDI-유사 효과는, 예를 들면, 후보분자를 세포 또는 적절한 세포 제제와 상호작용시킨 후 제2 전령 시스템의 활성을 결정하고, 이 효과를 KDI 또는 이와 동일한 효과를 나타내는 분자의 것과 비교함으로써 측정할 수 있다. 이 관점에서 유용할 수 있는 제2 전령 시스템으로는 AMP 구아닐레이트 사이클라제, 이온 채널 또는 포스포이노시티드 가수분해 제2 전령 시스템이 포함되나 이에 한정되는 것은 아니다.
KDI 길항제에 대한 검정의 다른 예는 KDI 및 잠재적 길항제를 막-결합된 KDI 수용체 분자 또는 재조합 KDI 수용체 분자와 경쟁 억제 검정을 위해 적당한 조건하에서 결합시키는 경쟁 검정이다. KDI는 예를 들면 방사성으로 표지시켜 수용체 분자에 결합된 KDI 분자의 수를 정확하게 결정하여 잠재적 길항제의 효능을 평가할 수 있다.
잠재적 길항제로는 본 발명의 폴리펩티드와 결합하고 그럼으로써 그의 활성을 억제 또는 소멸시키는 소형 유기 분자, 펩티드, 폴리펩티드 및 항체가 포함된다. 또한 잠재적 길항제는 KDI-유도된 활성을 유도하지 않으면서 수용체 분자와 같은 결합 분자상의 동일한 부위에 결합하고 그럼으로써 KDI를 결합으로부터 배제시켜 KDI의 작용을 억제하는 소형 유기 분자, 펩티드, 폴리펩티드(예, 밀접하게 관련된 단백질) 또는 항체일 수 있다.
다른 잠재적 길항제로는 안티센스 분자가 포함된다. 안티센스 기술을 사용하여 안티센스 DNA 또는 RNA를 통해 또는 삼중-나선 형성을 통해 유전자 발현을 조절할 수 있다. 안티센스 기술은 예를 들면 문헌[Okano, J. Neurochem. 56:560 (1991); "Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression." CRC Press, Boca Raton, FL (1988)]에 기술되어 있다. 삼중 나선 형성은 예를 들면 문헌[Lee et al., Nucleic Acids Research 6:3073 (1979); Cooney et al., Science 241:456 (1988); 및 Dervan et al., Science 251: 1360 (1991)]에 기술되어 있다. 이 방법은 상보적인 DNA 또는 RNA에 폴리뉴클레오티드의 결합을 기초로 하고 있다. 예를 들면, 본 발명의 성숙한 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 5' 암호화 부분을 사용하여 길이가 약 10 내지 40개 염기 쌍인 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드를 디자인할 수 있다. DNA 올리고뉴클레오티드는 전사에 연루된 유전자의 영역에 상보되도록 디자인하며 그럼으로써 KDI의 전사 및 생성을 억제한다. 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드는 생체내에서 mRNA와 하이브리드를 형성하고 KDI 폴리펩티드로의 mRNA 분자의 해독을 차단한다. 상기된 올리고뉴클레오티드는 또한 세포에 전달시켜 안티센스 RNA 또는 DNA가 생체내에서 발현되어 KDI 단백질의 생성을 억제시킬 수 있다.
효능제 및 길항제는 상기된 바와 같이 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 조성물에 사용할 수 있다.
길항제는, 예를 들면, 골수 및 조혈 선조 세포를 자극하는 화학요법 후 인터페론 활성을 억제하기 위해 사용할 수 있다. 상기 임의의 길항제는 이하에 기술된 바와 같이 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 조성물에 사용할 수 있다.
본 발명을 일반적으로 기술하면서, 하기 실시예를 통해 좀더 쉽게 이해될 수 있도록 예시될 것이나, 이들 실시예로 본 발명이 한정되는 것으로 이해되어서는 안된다.
실시예
실시예 1: 이.콜라이에서의 KDI의 클로닝 및 발현
본 실시예에서 세균성 발현을 위해 신규한 pHE4 계열의 세균성 발현 벡터, 특히 pHE4a 벡터가 사용된다(캘리포니아 91311, 채트워드 이톤 애비뉴 9259 소재 QIAGEN, Inc.). pHE4-5/KDI 벡터 플라스미드 DNA는 특이한 제한효소 부위 NdeI 및 Asp718사이에 삽입된 KDI 암호화 폴리뉴클레오티드(도 1)를 함유한다. 이 작제물은 1998년 2월 25일에 ATCC에 수탁번호 209645로 기탁되었으며 이에 당업자는 용이하게 이용할 수 있다.
pHE4a 세균성 발현 벡터는 선별을 위한 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자, 이.콜라이 복제원, T5 파아지 프로모터 서열, 2개의 lac 오퍼레이터 서열, 샤인-달가르노(Shine-Delgarno) 서열 및 락토즈 오페론 억제인자 유전자(lacIq)를 포함한다. 이들 요소는 폴리펩티드를 암호화하는 삽입된 DNA 단편이 폴리펩티드의 아미노 말단에 공유 결합된 6개의 His 잔기(즉, "6 X His 태그")를 갖는 폴리펩티드를 발현하도록 배열된다.
성숙한 KDI 단백질을 암호화하는 DNA 서열은 KDI 단백질의 목적 부분의 아미노 말단 서열 및 cDNA 암호서열의 기탁된 작제물 3'내 서열에 어닐링하는 PCR 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 증폭시킨다. pHE4a 벡터내의 클로닝을 용이하게 하기 위한 제한 부위를 함유한 추가의 뉴클레오티드를 5' 및 3' 프라이머 서열에 각각 첨가한다.
KDI 단백질 암호화 영역을 클로닝하기 위해, 5' 프라이머는 밑줄친 NdeI 제한 부위를 함유한 서열 5' GGCCGCATATGCTGGACTGTAACTTACTG 3'(서열번호 16)을 갖는다. 물론 당업자라면 단백질 암호 서열에서 5' 프라이머가 시작하는 점을 다양하게 하여 완전한 KDI 단백질의 임의의 목적 부분을 암호화하는 DNA 단편을 증폭시킬 수 있음을 인식할 것이다. 3' 프라이머는 밑줄친 Asp718 제한 부위를 함유한 서열 5' GGCCGCGGTACCTTATTTCCTCCTGAATAGAGC 3'(서열번호 17)을 갖는다.
증폭된 KDI DNA 단편을 NdeI 및 Asp718로 분해시킨 후 이것과 선형 플라스미드를 서로 연결시킨다. 제한 분해된 pHE4a 벡터내로 KDI DNA을 삽입시킴으로써, IPTG-유도성 프로모터로부터 하류에 KDI 단백질 암호화 영역이 위치하게 되고 개시 AUG 및 6개의 히스티딘 코돈을 보유한 상태로 프레임을 유지한다.
샘브룩(Sambrook)과 동료들(Molecular Cloning : a Laboratory Manual, 2nd Edition : Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY(1989))이 교시한 바와 같은 표준 절차에 따라 연결 혼합물로 컴피턴트 이.콜라이 세포를 형질전환시킨다. 이.콜라이 균주 M15/rep4는 lac 억제인자를 발현하고 카나마이신 내성("Kanr")을 부여하는 플라스미드 pREP4의 다수 복제물을 포함하는 것으로서, 본원에 기술된 예시적인 실시예를 실시하는데 사용하였다. 이 균주는 KDI 단백질의 발현에 적합한 다수의 균주 중에서 유일하게 시판되는 것이다(상기 QIAGEN, Inc.). 앰피실린과 카나마이신을 함유하는 LB 평판 상에서의 증식성을 토대로 형질전환체를 동정한다. 내성 콜로니로부터 플라스미드 DNA를 분리하고, 클로닝된 DNA의 실체를 제한효소 분석, PCR 및 DNA 서열분석으로 확인한다.
목적한 작제물을 함유하는 클론을 앰피실린(100㎍/㎖)과 카나마이신(25㎍/㎖)이 보충된 LB 배지중에서 밤새("O/N") 액체배양한다. 이 O/N 배양물을 사용하여 대량 배양물에 약 1:25 내지 1:250의 희석률로 접종시킨다. 세포를 600nm("OD600")에서의 광학 밀도가 0.4 내지 0.6이 될 때까지 증식시킨다. 이어서 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드("IPTG")를 최종 농도가 1mM이 되게 첨가하여 lac 억제인자를 불활성화시켜 lac 억제인자 민감성 프로모터로부터 전사를 유도한다. 그 다음, 세포를 3 내지 4 시간 동안 추가로 항온처리한다. 그 후, 세포를 원심분리로 수거한다.
그 다음, 세포를 6M 구아니딘-HCl(pH 8) 중에서 4℃하에 3 내지 4 시간 동안 교반한다. 원심분리로 세포 찌꺼기는 제거하고, KDI 폴리펩티드를 함유하는 상층액은 니켈-니트릴로-트리아세트산("Ni-NTA") 친화성 수지 컬럼(QIAGEN, Inc.) 상에 충진한다. 6xHis 태그를 가진 단백질은 Ni-NTA 수지에 높은 친화성으로 결합하고, 간단한 일단계 절차(참조: The QIAexpressionist, 1995, QIAGEN, Inc.) 참조)로 정제할 수 있다. 간략히 설명하면, 상층액을 6M 구아니딘-HCl(pH 8) 중의 컬럼에 충진하고, 컬럼을 먼저 6M 구아니딘-HCl(pH 8)의 10배 부피로 세척한 뒤, 6M 구아니딘-HCl(pH 6)의 10배 부피로 세척하고, 마지막으로 6M 구아니딘-HCl(pH 5)을 사용하여 KDI를 용출시킨다.
정제된 단백질을 그 다음 인산염 완충 식염수(PBS) 또는 50mM 아세트산 나트륨, pH 6 완충액 + 200mM NaCl에 대하여 투석하여 복원시킨다. 또는, 상기 단백질을 Ni-NTA 컬럼 상에 고정시킨 상태로 성공적으로 재폴딩시킬 수 있다. 바람직한 조건은 다음과 같다: 프로테아제 억제제를 함유하는 500mM NaCl, 20% 글리세롤, 20mM Tris/HCl(pH 7.4) 중에서 선형 6M 내지 1M 우레아 구배를 사용하여 복원시킨다. 복원은 1.5시간 이상 동안 실시되어야 한다. 복원 후, 단백질은 250mM 이미다졸을 첨가하여 용출시킬 수 있다. 이미다졸은 마지막으로 PBS 또는 50mM 아세트산나트륨(pH6) 완충액 + 200mM NaCl에 대해 투석하여 제거한다. 정제된 단백질은 4℃에 저장하거나 또는 -80℃에서 동결시킨다.
하기의 대안은 KDI가 봉입체 형태로 존재시 이.콜라이 중에서 발현된 KDI를 정제하는데 사용할 수 있다. 별다른 설명이 없는 한, 다음 단계는 모두 4 내지 10℃에서 실시된다.
이.콜라이 발효의 생산 단계가 완료된 즉시, 세포 배양물을 4 내지 10℃로 냉각시키고, 15,000 rpm에서 연속 원심분리하여 세포를 수거한다(Heraeus Sepatech). 세포 페이스트의 단위 중량 당 단백질의 예상 수율과 정제 단백질의 필요량에 근거하여, 중량을 기준으로 하는 세포 페이스트의 적당량을 100mM Tris, 50mM EDTA(pH 7.4)를 함유하는 완충 용액에 현탁시킨다. 세포를 고전단 혼합기를 사용하여 분산시켜 균일한 현탁액으로 만든다.
이어서 상기 세포를 4000 내지 6000 psi에서 마이크로플루다이저(Microfluidics, Corp. 또는 APV Gaulin,Inc.)를 통해 용액을 2회 통과시켜 용균시킨다. 균질액을 그 다음 최종 농도가 0.5M NaCl이 되게 NaCl 용액과 혼합한 뒤, 7000 x g에서 15분 동안 원심분리한다. 수득한 펠릿을 다시 0.5M NaCl, 100mM Tris, 50mM EDTA(pH 7.4)를 사용하여 세척한다.
수득한 세척된 봉입체를 1.5M 구아니딘 염산염(GuHCl)으로 2 내지 4시간 동안 용해시킨다. 7000xg에서 15분 동안 원심분리한 후, 펠릿을 제거하고, KDI 폴리펩티드 함유 상층액을 4℃에서 밤새 항온처리하여 추가로 GuHCl을 추출할 수 있다.
고속 원심분리(30,000xg)하여 불용성 입자를 제거한 후, GuHCl 추출물을 50mM 나트륨(pH 4.5), 150mM NaCl, 2mM EDTA를 함유하는 완충액의 20배 부피와 강력한 교반하에 신속하게 혼합하여 GuHCl로 용해된 단백질을 재폴딩시킨다. 추가 정제 단계를 실시하기 전에, 재폴딩되고 희석된 단백질 용액을 혼합함이 없이 12시간 동안 4℃에 방치하였다.
재폴딩된 KDI 폴리펩티드 용액을 청정화하기 위하여, 사전에 준비한 적당한 표면적의 0.16㎛ 막 필터(예, Filtron)를 설치하고, 40mM 아세트산나트륨(pH 6.0)으로 평형화시킨 접촉형 여과 유니트를 이용한다. 여과된 시료를 양이온 교환 수지(예, Poros HS-50, Perseptive Biosystems) 상에 충진한다. 컬럼은 40mM 아세트산나트륨(pH 6.0)으로 세척하고, 동일한 완충액 중에 NaCl을 250mM, 500mM, 1000mM 및 1500mM 농도로 용해시킨 용액으로 단계적으로 용출시킨다. 용출액은 280 nm 흡광도로 연속 모니터한다. 분획을 수거하고, SDS-PAGE로 추가로 분석한다.
그 다음, KDI 폴리펩티드를 함유하는 분획을 모아서, 4배 부피량의 물과 혼합한다. 희석된 시료를, 사전에 준비된 강음이온 교환 수지(Poros HQ-50, Perseptive Biosystems)와 약음이온 교환 수지(Poros CM-20, Perseptive Biosystems)의 직렬 컬럼 세트 상에 충진한다. 이 컬럼들은 40mM 아세트산나트륨(pH 6.0)으로 평형화시킨다. 양 컬럼을 40mM 아세트산나트륨(pH 6,0), 200mM NaCl로 세척한다. 그 다음, CM-20 컬럼은 0.2M NaCl, 50mM 아세트산나트륨(pH 6.0) 내지 1.0M NaCl, 50mM 아세트산나트륨(pH 6.5) 범위의 선형 구배를 10배 컬럼 부피량으로 사용하여 용출시킨다. 분획은 용출물을 일정하게 A280 모니터하면서 수거한다. 그 다음, KDI 폴리펩티드를 함유하는 분획(예컨대, 16% SDS-PAGE로 측정)을 모은다.
수득된 KDI 폴리펩티드는 전술한 재폴딩과 정제 단계 이후 95% 이상의 순도를 나타낸다. 정제 단백질 5㎍을 충진한 경우 쿠마시 블루(Commassie blue) 염색된 16% SDS-PAGE 겔로부터 주된 오염물 밴드는 관찰되지 않는다. 또한 정제 단백질에 대해 내독소/LPS 오염을 시험하고, LAL 분석에 따른 LPS 함량은 전형적으로 0.1 ng/㎖ 이하이다.
다음과 같은 대안은 KDI가 봉입체 형태로 존재시 이.콜라이 중에서 발현된 KDI를 정제하는데 사용할 수 있다. 별다른 설명이 없는 한, 다음 단계는 모두 4 내지 10℃에서 실시된다.
이.콜라이 발효의 생산 단계가 완료된 즉시, 세포 배양물을 4 내지 10℃로 냉각시키고, 15,000 rpm에서 연속 원심분리하여 세포를 수거한다(Heraeus Sepatech). 세포 페이스트의 단위 중량 당 단백질의 예상 수율과 정제 단백질의 필요량에 근거하여, 중량을 기준으로 하는 세포 페이스트의 적당량을 100mM Tris, 50mM EDTA(pH 7.4)를 함유하는 완충 용액에 현탁시킨다. 세포를 고전단 혼합기를 사용하여 분산시켜 균일한 현탁액으로 만든다.
이 세포를 4000 내지 6000 psi에서 마이크로플루다이저(Microfluidics, Corp. 또는 APV Gaulin,Inc.)를 통해 용액을 2회 통과시켜 용균시킨다. 균질액을 그 다음 최종 농도가 0.5M NaCl이 되게 NaCl 용액과 혼합한 뒤, 7000 x g에서 15분 동안 원심분리한다. 얻어지는 펠릿을 다시 0.5M NaCl, 100mM Tris, 50mM EDTA(pH 7.4)를 사용하여 세척한다.
수득한 세척된 봉입체를 1.5M 구아니딘 염산염(GuHCl)으로 2 내지 4시간 동안 용해시킨다. 7000xg에서 15분 동안 원심분리한 후, 펠릿을 제거하고, KDI 폴리펩티드 함유 상층액을 4℃에서 밤새 항온처리하여 추가로 GuHCl을 추출한다.
고속 원심분리(30,000xg)하여 불용성 입자를 제거한 후, GuHCl 추출물을 50mM 나트륨(pH 4.5), 150mM NaCl, 2mM EDTA를 함유하는 완충액의 20배 부피와 강력한 교반하에 신속하게 혼합하여 GuHCl-용해된 단백질을 재폴딩시킨다. 추가 정제 단계를 실시하기 전에, 재폴딩되고 희석된 단백질 용액을 혼합함이 없이 12시간 동안 4℃에 방치하였다.
재폴딩된 KDI 폴리펩티드 용액을 청정화하기 위하여, 사전에 준비한 적당한 표면적의 0.16㎛ 막 필터(예, Filtron)를 설치하고, 40mM 아세트산나트륨(pH 6.0)으로 평형화시킨 접촉형 여과 유니트를 이용한다. 여과된 시료를 양이온 교환 수지(예, Poros HS-50, Perseptive Biosystems) 상에 충진한다. 컬럼은 40mM 아세트산나트륨(pH 6.0)으로 세척하고, 이 완충액 중에 NaCl을 250mM, 500mM, 1000mM 및 1500mM 농도로 용해시킨 용액으로 단계적으로 용출시킨다. 용출액은 280 nm 흡광도로 연속 모니터한다. 분획을 수거하고, SDS-PAGE로 추가로 분석한다.
그 다음, KDI 폴리펩티드를 함유하는 분획을 모아서, 4배 부피량의 물과 혼합한다. 희석된 시료를, 사전에 준비된 강음이온 교환 수지(Poros HQ-50, Perseptive Biosystems)와 약음이온 교환 수지(Poros CM-20, Perseptive Biosystems)의 직렬 컬럼 세트 상에 충진한다. 이 컬럼들은 40mM 아세트산나트륨(pH 6.0)으로 평형화시킨다. 양 컬럼을 40mM 아세트산나트륨(pH 6,0), 200mM NaCl로 세척한다. 그 다음, CM-20 컬럼은 0.2M NaCl, 50mM 아세트산나트륨(pH 6.0) 내지 1.0M NaCl, 50mM 아세트산나트륨(pH 6.5) 범위의 선형 구배를 10배 컬럼 부피량으로 사용하여 용출시킨다. 분획은 용출물을 일정하게 A280 모니터하면서 수거한다. 그 다음, KDI 폴리펩티드를 함유하는 분획(예컨대, 16% SDS-PAGE로 측정)을 모은다.
수득된 KDI 폴리펩티드는 전술한 재폴딩과 정제 단계 이후 95% 이상의 순도를 나타낸다. 정제 단백질 5㎍을 충진한 경우 쿠마시 블루 염색된 16% SDS-PAGE 겔에서 주된 오염물 밴드는 관찰되지 않는다. 또한 정제 단백질로 내독소/LPS 오염을 시험하고, LAL 분석에 따른 LPS 함량은 일반적으로 0.1 ng/㎖ 이하이다.
본 발명에 의해 다중 KDI 발현 작제물은 여러 시스템에서 다양한 크기의 KDI 폴리펩티드가 용이하게 생산되도록 제조하였다. 이.콜라이-기초로 한 작제물로는 다음과 같은 것이 있다. (1) pQE9:KDI.S27-K207(서열 번호 2의 아미노산 27 내지 207을 발현함); (2) pHE4:KDI.S27-K207(서열 번호 2의 아미노산 27 내지 207을 발현함); pHE4:KDI.A23-K207(서열 번호 2의 아미노산 23 내지 207을 발현함); (4) pHE4:KDI.G24-K207(서열 번호 2의 아미노산 24 내지 207을 발현함); 및 (5) pHE4:KDI.C30-K207(서열 번호 2의 아미노산 30 내지 207을 발현함).
실시예 2: 바큘로바이러스 발현계에서의 KDI 단백질의 클로닝과 발현
본 실시예에서는, 플라스미드 셔틀 벡터 pA2 GP를 사용하여 KDI를 암호화하는 클로닝된 DNA를 바큘로바이러스 리더와 섬머스 등[Summers et al., A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Precedures, Texas Agricultural Experimental Station Bulletin No.1555(1987)]이 교시한 표준 방법을 사용하여 바큘로바이러스에 삽입하여 KOI 단백질을 발현한다. 이 발현 벡터는 오토그라파 칼리포니카(Autographa californica) 핵 다면체 바이러스(AcMNPV)의 강한 폴리헤드린 프로모터와, 그 다음 바큘로바이러스 gp67 단백질의 분비 시그날 펩티드(리더) 및 BamHI, XbaI 및 Asp718과 같은 편리한 제한 부위를 함유한다. 시미안(simian) 바이러스 40("SV40")의 폴리아데닐화 부위는 효율적인 폴리아데닐화에 사용된다. 재조합 바이러스를 용이하게 선별하기 위하여, 플라스미드에는 약한 드로소필라 프로모터 제어하의 이.콜라이 유래의 베타-갈락토시다제 유전자를 동일 배향으로 함유하고 있고, 그 다음 폴리헤드린 유전자의 폴리아데닐화 시그날이 포함되어 있다. 삽입된 유전자는 야생형 바이러스 DNA와 세포 매개의 상동 재조합용 바이러스 서열에 의해 양측면 상에 플랭킹되고, 클로닝된 폴리뉴클레오티드를 발현하는 생존 바이러스를 생성한다.
이러한 벡터 외에도, 작제물이 요구되는 바와 같은 시그날 펩티드와 프레임-유지 AUG(in-frame AUG)를 포함하여 전사, 해독, 분비 등을 위한 적당히 위치된 시그날을 제공하기만 한다면, 기타 다른 다양한 바큘로바이러스 벡터는, 예컨대 당업자라면 쉽게 알 수 있는 pAc373, pVL941 및 pAcIM1 등도 사용할 수 있다. 이러한 벡터에 대해서는, 문헌[Luckow et al., Virology 170:31-39(1998)]에 설명되어 있다.
기탁된 클론에서 성숙한 KDI 단백질을 암호하는 cDNA 서열은, 서열 번호 2에 제시된 서열 중 AUG 개시 코돈과 천연 관련 리더 서열이 결실된 것으로, 유전자의 5' 서열과 3' 서열에 상응하는 PCR 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 증폭시킨다. 5' 프라이머의 서열은 5' GGCCGGGATCCGCCATCATGAGCACCAAACCTGATATG 3'(서열번호 18) 로서, 밑줄친 부분은 BamHI 제한 효소 부위이다. 3' 프라이머의 서열은 5'GGCCGCGGTACCTTATTTCCTCCTGAATAGAGC 3'(서열번호 19)로서, 밑줄친 부분은 Asp718 제한 부위이다.
증폭된 단편은 시판되고 있는 키트("Geneclean" BIO 101 Inc., 미국 캘리포니아주 라졸라에 소재)를 사용하여 1% 아가로스 겔로부터 분리한다. 그 다음, 단편 을 BamHI과 Asp718로 분해하고, 다시 1% 아가로스 겔 상에서 정제한다.
플라스미드를 제한 효소 BamHI 및 Asp718로 분해하고, 경우에 따라 당해 기술 분야에 공지된 통상의 방법에 따라 소 내장 포스파타제를 사용하여 탈인산화시킬 수 있다. 그 다음, DNA를 시판용 키트 ("Geneclean" BIO 101 Inc., 미국 캘리포니아주 라졸라에 소재)를 사용하여 1% 아가로스 겔로부터 분리한다.
상기 단편과 상기 탈인산화된 플라스미드를 T4 DNA 리가제를 이용하여 함께 연결시킨다. 이 연결 혼합물로 이.콜라이 HB101 또는 다른 적합한 이.콜라이 숙주, 예컨대, XL-1 Blue세포(Stratagene Cloning Systems, 미국 캘리포니아주 라졸라 소재)를 형질전환시키고, 배양 평판 상에 도말한다. 각 콜로니에서 얻은 DNA를 BamHI 과 Asp718로 분해하고, 그 분해 생성물을 겔 전기영동으로 분석하여 사람 KDI 유전자를 가진 플라스미드를 함유하는 세균을 동정한다. 클로닝된 단편의 서열은 DNA 서열분석으로 확인한다. 이 플라스미드는 pA2GPKDI로 명명한다.
이 플라스미드 pA2GPKDI 5㎍를, 시판되고 있는 선형화된 바큘로바이러스 DNA("BaculoGold™baculovirus DNA", Pharmingen, 미국 캘리포니아주 산디에고 소재) 1.0㎍과 함께, 문헌[Felgner et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 84:7413-7417(1987)]에 기재된 리포펙션 방법을 사용하여 동시형질감염시킨다. BaculoGold™바이러스 DNA 1㎍과 플라스미드 pA2GPKD1 5㎍을, 무혈청 그레이스 배지(Life Technologies Inc., 미국 매릴랜드주 개터스버그 소재) 50㎕를 함유하는 미량역가 평판의 멸균 웰에서 혼합한다. 그 다음, 리포펙틴 10㎕와 그레이스 배지 90㎕를 첨가하고, 혼합한 뒤, 실온에서 15분 동안 항온처리한다. 그 후, 형질감염 혼합물을, 무혈청 그레이스 배지 1㎖를 함유하는 35㎜ 조직 배양평판에 접종된 Sf9 곤충 세포(ATCC CRL 1711)에 적가한다. 이 평판을 그 다음 27℃에서 5시간 동안 항온처리한다. 그 후, 형질감염 용액을 평판에서 제거하고, 10% 태내 송아지 혈청이 보충된 그레이스 곤충 배지 1㎖를 첨가한다. 배양은 27℃에서 4일 동안 계속한다.
4일 후, 상층액을 수거하고, 플라그 분석을 문헌[Summers and Smith, 상기 설명 참조]에 기재된 바와 같이 실시한다. "Blue Gal"(Life Technologies Inc., 개터스버그)이 첨가된 아가로스 겔을 사용하여 청색화된 플라그를 생산하는 gal 발현 클론을 용이하게 동정하고 분리할 수 있다. (이러한 유형의 "플라그 검정법"에 대해서는 라이프 테크놀로지스 인크(개터스버그)에서 배포한 곤충 세포 배양과 바큘로바이러스학에 관한 사용자 지침서 9 내지 10쪽에 상세하게 설명되어 있다). 적절히 항온처리한 후, 청색화된 플라그를 마이크로피펫기(예, 에펜도르프)의 팁으로 취한다. 재조합 바이러스를 함유하는 아가를 그레이스 배지 200㎕를 함유하는 미량원심분리 튜브에 재현탁시키고, 재조합 바큘로바이러스를 함유하는 현탁액을 사용하여, 35㎜ 접시에 접종된 Sf9 세포를 감염시킨다. 4일 후, 이 배양 접시의 상층액을 수거하고, 그 다음 4℃에 보관한다. 재조합 바이러스를 V-KDI로 명명하였다.
KDI 유전자의 발현을 입증하기 위하여, Sf9 세포를 10% 열-불활성화된 FBS가 보충된 그레이스 배지에서 증식시킨다. 이 세포를 재조합 바큘로바이러스 V-KDI로 감염다중도("MOI")가 약 2가 되게 감염시킨다. 방사능표지된 단백질이 필요하다면, 6 시간 후 상기 배지를 제거하고, 메티오닌과 시스테인이 제거된 SF900 II 배지(미국 매릴랜드주 락빌에 소재하는 Life Technologies Inc. 제품)로 교체한다. 42 시간 후, 35S-메티오닌 5μCi와 35S-시스테인(Amersham 제품) 5μCi를 첨가한다. 이 세포를 16 시간 동안 추가로 항온처리한 뒤, 원심분리하여 수거한다. 상층액 중의 단백질 뿐만 아니라 세포내 단백질도 SDS-PAGE에 이어서 자동방사능촬영(방사능표지된 경우)으로 분석한다.
정제된 단백질의 아미노 말단에 존재하는 아미노산 서열의 미량서열분석을 사용하여 KDI 단백질의 아미노 말단 서열을 결정할 수도 있다.
다른 바큘로바이러스 발현 작제물은 다음과 같이 작제하였다. (1) pA2:KDI(서열번호 2의 잔기 1 내지 207을 발현함); (2) pA2.KDI.M7-K207(서열번호 2의 잔기 7 내지 207을 발현함); (3) pA2gp.KDI.L28-K207(서열번호 2의 잔기 28 내지 207을 발현함); (4) pA2gp.KDI.C30-K207(서열번호 2의 잔기 30 내지 207을 발현함); 및 (5) pA2.KDI.M1-R192(서열번호 2의 잔기 1 내지 192를 발현함).
실시예 3 : 포유류 세포에서의 KDI의 클로닝 및 발현
전형적인, 포유류 발현 벡터는 mRNA의 전사 개시를 매개하는 프로모터 요소, 단백질 암호 서열 및 전사물의 전사와 폴리아데닐화의 종결에 필요한 시그날을 함유한다. 또 다른 요소로서, 인헨서, 코자크 서열 및 RNA 스플라이싱을 위한 공여체 부위와 수용체 부위에 플랭킹된 개재 서열을 포함한다. 고 효율의 전사는 SV40 유래의 전기 및 후기 프로모터, 레트로바이러스(예, RSV, HTLV1, HIV1) 유래의 장말단 반복체(LTR) 및 사이토메가로바이러스(CMV)의 초기 프로모터에 의해 이루어질 수 있다. 그러나, 세포성 요소(예. 사람 액틴 프로모토)가 또한 사용될 수 있다. 본 발명의 실시에 적합한 발현 벡터로는, 예컨대 pSVL 및 pMSG(스웨덴 웁살라 소재의 파머시아 제품), pRSVcat(ATCC 37152), pSV2dhfr(ATCC 37146) 및 pBC12MI(ATCC 67109) 등의 벡터를 포함한다. 사용될 수 있는 포유류 숙주 세포로는 사람 헬라 293, H9 및 쥬르캣(Jurkat) 세포, 마우스 NIH3T3 및 C127 세포, Cos 1, Cos 7 및 CV1, 메추라기 QC1-3 세포, 마우스 L 세포 및 차이니스 햄스터 난소(CHO) 세포가 포함된다.
대안으로, 상기 유전자는 염색체 중에 통합된 유전자를 함유하는 적합한 세포주 중에서 발현될 수 있다. dhfr, gpt, 네오마이신, 하이그로마이신과 같은 적합한 마커로 동시형질감염시키면 형질감염된 세포를 동정 및 분리할 수 있다.
형질감염된 유전자는 또한 다량의 암호화된 단백질을 발현하도록 증폭시킬 수 있다. DHFR(디하이드로폴레이트 환원효소) 마커는 수백 또는 심지어 수천 복사체의 목적 유전자를 운반하는 세포주를 개발하는데 유용하다. 다른 유용한 선택 마커는 효소 글루타민 신타제(GS)[Murphy et al., Biochem.J.227:277-279(1991); Bebbington et al., Bio/Technology 10:169-175(1992)]이다. 이 마커를 사용하여 포유류 세포를 선택 배지에서 증식시키고, 내성이 가장 큰 세포를 선별한다. 이 세포주는 염색체 중에 통합된 증폭 유전자(들)를 함유한다. 단백질의 생산에는 차이니스 햄스터 난소(CHO) 및 NSO 세포가 종종 사용된다.
발현 벡터 pC1 및 pC4는 로우스(Rous) 육종 바이러스의 강력한 프로모터(LTR)[Cullen et al., Molecular and Cellular Biology, 438-447(March, 1985)]와 CMV 인헨서 단편[Boshart et al., Cell 41:521-530(1985)]을 함유한다. 제한 효소 절단 부위 BamHI, XbaI 및 Asp718 등을 보유한 복수 클로닝 부위는 목적 유전자의 클로닝을 용이하게 한다. 또한, 벡터에는 3' 인트론이외에 랫트 프리프로인슐린 유전자의 폴리아데닐화 및 종결 시그날을 함유한다.
CHO 세포에서의 클로닝 및 발현
KDI 폴리펩티드의 발현을 위해 벡터 pC4-Sig를 사용한다. 플라스미드 pC4-Sig는 플라스미드 pSV2-dhfr(ATCC 수탁번호 제37146호)의 유도체이다. 이것은 다수 클로닝 부위로부터 상류에 케모킨 베타-8(참조: US95/09508)로부터의 분비 리더 서열에 대한 암호 영역을 함유하며 삽입된 이종 DNA와 프레임내에 위치하도록 고안되어 있다. 이 플라스미드는 SV40 초기 프로모터의 조절하에 마우스 DHFR 유전자를 함유한다. 이들 플라스미드로 형질감염되고 디하이드로폴레이트 활성이 결여된 차이니스 햄스터 난소 세포 또는 다른 세포는 이들 세포를 화학요법제 메토트렉세이트가 보충된 선별 배지(알파 마이너스 MEM, Life Technologies)에서 성장시켜 선별할 수 있다. 메토트렉세이트(MTX)에 대해 내성을 나타내는 세포내 DHFR 유전자의 증폭은 익히 공지되어 있다[참조: Alt, F.W., Kellems, R.W., Bertino, J.R., and Schimke, R.T., 1978, J. Biol. Chem. 253:1357-1370, Hamlin, J.L. and Ma, C. 1990, Biochem. et Biophys. Acta, 1097:107-143, Page, M.J. and Sydenham, M.A. 1991, Biotechnology 9:64-68]. MTX의 증가하는 농도에서 성장된 세포는 DHFR 유전자의 증폭 결과로서 표적 효소 DHFR을 과다생성함으로써 약물에 대해 내성을 개발한다. 만일 제2 유전자가 DHFR 유전자에 연결되어 있는 경우, 이 유전자는 보통 함께 증폭되고 과발현된다. 이 방법을 사용하여 증폭된 유전자의 1000개 이상의 복제체를 함유한 세포주를 개발할 수 있음은 본 분야에 알려져 있다. 이어서, 메토트렉세이트를 제거했을 때 숙주 세포의 한 개이상의 염색체(들)내로 통합된 증폭된 유전자를 함유한 세포주가 수득된다.
플라스미드 pC4는 해당 유전자를 발현시키기 위해 로우스 육종 바이러스(Cullen et al., Molecular and Cellular Biology, March 1985:438-447)의 장말단 반복서열(LTR) + 사람 사이토메갈로바이러스(CMV)의 초기 유전자의 인핸서로부터 분리된 단편(Boshart et al., Cell 41:521-530 (1985))의 강력한 프로모터를 함유한다. 프로모터의 하류에 유전자의 통합을 허용하는 다음과 같은 단일 제한효소 부위가 위치한다: BamHI, Xba I 및 Asp718. 이들 클로닝 부위 뒤에 플라스미드는 랫트 프리프로인슐린 유전자의 3' 인트론 및 폴리아데닐화 부위를 함유한다. 또한, 다른 고 효능 프로모터(예, 사람 β-액틴 프로모터, SV40 초기 또는 후기 프로모터 또는 다른 레트로바이러스(예, HIV 및 HTLVI)로부터의 장말단 반복서열)가 발현을 위해 사용될 수 있다. 포유류 세포에서 조절된 방식으로 KDI 폴리펩티드를 발현시키기 위해 클론텍 테트-오프(Clontech's Tet-Off) 및 테트-온(Tet-On) 유전자 발현 시스템 및 유사한 시스템을 사용할 수 있다(Gossen, M., & Bujard, H. 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-5551). mRNA의 폴리아데닐화를 위해 예를 들면 사람 성장 호르몬 또는 글로빈 유전자로부터의 다른 시그날을 또한 사용할 수 있다. 염색체내로 통합된 해당 유전자를 함유한 안정한 세포주는 또한 gpt, G418 또는 하이그로마이신과 같은 선별 마커로 동시형질감염시킴으로써 선별할 수 있다. 출발점에 하나 이상의 선별 마커(예, G418 + 메토트렉세이트)를 사용하는 것이 유리하다.
플라스미드 pC4를 제한 효소 BamHI 및 Asp718로 분해시킨 다음 본 분야에 공지된 절차에 의해 송아지 장 포스페이트를 사용하여 탈인산화시킨다. 이어서, 벡터를 1% 아가로즈 겔로부터 분리한다.
KDI 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 서열은 이 유전자의 목적하는 부분의 5' 및 3' 서열에 상응하는 PCR 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 증폭시킨다. 밑줄친 BamHI 부위, 코자크 서열 및 AUG 개시 코돈을 함유한 5' 프라이머는 다음의 서열을 갖는다:
5' GGCCGGGATCCGCCATCATGAGCACCAAACCTGATATG 3'(서열번호 18). 밑줄친 Asp718 제한 부위를 함유한 3' 프라이머는 다음의 서열을 갖는다:
5' GGCCGCGGTACCTTATTTCCTCCTGAATAGAGC 3' (서열번호 19).
증폭된 단편을 엔도뉴클레아제 BamHI 및 Asp718로 분해시키고 이어서 1% 아가로즈 겔에서 재차 정제한다. 분리된 단편과 탈인산화된 벡터를 T4 DNA 리가제로 연결시킨다. 이어서, 이.콜라이 HB101 또는 XL-1 블루 세포를 형질전환시키고 예를 들면 제한 효소 분석을 이용하여 플라스미드 pC4내로 삽입된 단편을 함유한 세균을 동정한다.
활성 DHFR이 결여된 차이니즈 햄스터 난소 세포를 형질감염을 위해 사용한다. 5 μg의 발현 플라스미드 pC4를 0.5 μg의 플라스미드 pSVneo와 함께 리포펙틴을 사용하여 동시형질감염시킨다(상기 Felgner et al.). 플라스미드 pSV2-neo는 우성 선별 마커로서 G418을 포함하는 일군의 항생물질에 대해 내성을 제공하는 효소를 암호화하는 Tn5로부터의 neo 유전자를 함유한다. 세포를 1 mg/ml의 G418로 보충된 알파 마이너스 MEM에 접종한다. 2일 후, 세포를 트립신으로 처리하고 10, 25 또는 50 ng/ml의 메토트렉세이트 + 1 mg/ml의 G418이 보충된 알파 마이너스 MEM을 갖는 하이브리도마 클로닝 평판(독일 소재 Greiner)에 접종시킨다. 약 10 내지 14일 후 단일 클론을 트립신으로 처리한 다음 상이한 농도의 메토트렉세이트(50 nM, 100 nM, 200 nM, 400 nM, 800 nM)를 사용하여 6-웰 페트리 디쉬 또는 10 ml 플라스크에 접종한다. 그런 다음 최고 농도의 메토트렉세이트에서 성장한 클론을 훨씬 더 고 농도의 메토트렉세이트(1 μM, 2 μM, 5 μM, 10 mM, 20 mM)를 함유한 새로운 6-웰 평판으로 옮긴다. 100 내지 200 μM의 농도에서 성장하는 클론이 수득될 때까지 동일한 절차를 반복한다. 목적하는 유전자 생성물의 발현을, 예를 들면, SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 또는 역상 HPLC 분석으로 분석한다.
작제된 다른 포유류 발현 벡터는 다음과 같다: (1) pC4:KDI(서열번호 2의 잔기 1-207을 발현함); (2) pC4sp:KDI.C30-K207(이종 시그날 펩티드(케모킨 베타-8(MPIF-1) 시그날 펩티드)에 이어 KDI의 아미노산 잔기 30-207을 발현함); 및 (3) pC4sp:KDI.L28-K207(이종 시그날 펩티드(케모킨 베타-8(MPIF-1) 시그날 펩티드에 이어 KDI의 아미노산 잔기 28-207을 발현함).
본 발명은 상기 설명 및 실시예에 특정적으로 기술된 바와는 다른 방식으로 실시될 수 있음은 자명할 것이다. 상기 기술의 측면에서 본 발명의 많은 변형 및 변화가 가능하며 이에 따라 그러한 변형 및 변화는 첨부된 청구범위에 속한다.
본원에 기술된 모든 문헌(특허, 특허원, 저널 논문, 실험 지침서, 서적 또는 기타 서류를 포함함)의 전체 내용은 본원에 참고로 원용된다.
Figure 112001001418144-pct00008
<110> HUMAN GENOME SCIENCES, INC. <120> Keratinocyte derived interferon <130> 5-1998-084740-7 <150> US 60/093,643 <151> 1998-07-21 <160> 21 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1170 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (35)..(655) <400> 1 ccacgcgtcc gggatttttt agcttgcaaa aaaa atg agc acc aaa cct 49 Met Ser Thr Lys Pro 1 5 gat atg att caa aag tgt ttg tgg ctt gag atc ctt atg ggt ata ttc 97 Asp Met Ile Gln Lys Cys Leu Trp Leu Glu Ile Leu Met Gly Ile Phe 10 15 20 att gct ggc acc cta tcc ctg gac tgt aac tta ctg aac gtt cac ctg 145 Ile Ala Gly Thr Leu Ser Leu Asp Cys Asn Leu Leu Asn Val His Leu 25 30 35 aga aga gtc acc tgg caa aat ctg aga cat ctg agt agt atg agc aat 193 Arg Arg Val Thr Trp Gln Asn Leu Arg His Leu Ser Ser Met Ser Asn 40 45 50 tca ttt cct gta gaa tgt cta cga gaa aac ata gct ttt gag ttg ccc 241 Ser Phe Pro Val Glu Cys Leu Arg Glu Asn Ile Ala Phe Glu Leu Pro 55 60 65 caa gag ttt ctg caa tac acc caa cct atg aag agg gac atc aag aag 289 Gln Glu Phe Leu Gln Tyr Thr Gln 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Thr Leu Val Leu Leu His Gln Met Arg Arg Ile Ser 35 40 45 Pro Phe Leu Cys Leu Lys Asp Arg Arg Asp Phe Arg Phe Pro Gln Glu 50 55 60 Met Val Lys Gly Ser Gln Leu Gln Lys Ala His Val Met Ser Val Leu 65 70 75 80 His Glu Met Leu Gln Gln Ile Phe Ser Leu Phe His Thr Glu Arg Ser 85 90 95 Ser Ala Ala Trp Asn Met Thr Leu Leu Asp Gln Leu His Thr Glu Leu 100 105 110 His Gln Gln Leu Gln His Leu Glu Thr Cys Leu Leu Gln Val Val Gly 115 120 125 Glu Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ile Ser Ser Val Pro Gln Leu Ser Ser 130 135 140 Leu Glu Leu Arg Arg Tyr Phe His Arg Ile Asp Asn Phe Leu Lys Glu 145 150 155 160 Lys Lys Tyr Ser Asp Cys Ala Trp Glu Ile Val Arg Val Glu Ile Arg 165 170 175 Arg Cys Leu Tyr Tyr Phe Tyr Lys Phe Thr Ala Leu Pro Ala Leu Thr 180 185 190 Leu Arg Arg Tyr Phe Gln Gly Ile Arg Val Tyr Leu Lys Glu Lys Lys 195 200 205 Tyr Ser Asp Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Met Glu Ile Met Lys Ser 210 215 220 Leu Phe Leu Ser Thr Asn Met Gln Glu Arg Leu Arg Ser Lys 225 230 235 <210> 4 <211> 187 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Thr Asn Lys Cys Leu Leu Gln Ile Ala Leu Leu Leu Cys Phe Ser 1 5 10 15 Thr Thr Ala Leu Ser Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg 20 25 30 Ser Ser Asn Phe Gln Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg 35 40 45 Leu Glu Tyr Cys Leu Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu 50 55 60 Ile Lys Gln Leu Gln Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile 65 70 75 80 Tyr Glu Met Leu Gln Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser 85 90 95 Ser Thr Gly Trp Asn Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val 100 105 110 Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu 115 120 125 Lys Glu Asp Phe Thr Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys 130 135 140 Arg Tyr Tyr Gly Arg Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser 145 150 155 160 His Cys Ala Trp Thr Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr 165 170 175 Phe Ile Asn Arg Leu Thr Gly Tyr Leu Arg Asn 180 185 <210> 5 <211> 194 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Met Ala Phe Val Leu Ser Leu Leu Met Ala Leu Val Leu Val Ser Tyr 1 5 10 15 Gly Pro Phe Gly Ser Leu Gly Cys Asp Leu Ser Gln Asn His Val Leu 20 25 30 Val Gly Arg Lys Asn Leu Arg Leu Leu Asp Glu Met Arg Arg Leu Ser 35 40 45 Pro His Phe Cys Leu Gln Asp Arg Lys Asp Phe Ala Leu Pro Gln Glu 50 55 60 Met Val Glu Gly Gly Gln Leu Gln Glu Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu 65 70 75 80 His Glu Met Leu Gln Gln Ser Phe Asn Leu Phe His Thr Glu His Ser 85 90 95 Ser Ala Ala Trp Asp Thr Thr Leu Leu Glu Pro Cys Arg Thr Gly Leu 100 105 110 His Gln Gln Leu Asp Asn Leu Asp Ala Cys Leu Gly Gln Val Met Gly 115 120 125 Glu Glu Asp Ser Ala Leu Gly Arg Thr Gly Pro Leu Ala Leu Lys Arg 130 135 140 Tyr Phe Gln Gly Ile His Val Tyr Leu Lys Glu Lys Gly Tyr Ser Asp 145 150 155 160 Cys Ala Trp Glu Thr Val Arg Leu Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Ser 165 170 175 Leu Ile Ser Leu Gln Glu Arg Leu Arg Met Met Asp Gly Asp Leu Ser 180 185 190 Ser Pro <210> 6 <211> 245 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Met Ala Leu Leu Phe Pro Leu Leu Ala Ala Leu Val Met Thr Ser Tyr 1 5 10 15 Ser Pro Val Gly Ser Leu Gly Cys Asp Leu Pro Gln Asn His Gly Leu 20 25 30 Leu Ser Arg Asn Thr Leu Val Leu Leu His Gln Met Arg Arg Ile Ser 35 40 45 Pro Phe Leu Cys Leu Lys Asp Arg Arg Asp Phe Arg Phe Pro Gln Glu 50 55 60 Met Val Lys Gly Ser Gln Leu Gln Lys Ala His Val Met Ser Val Leu 65 70 75 80 His Glu Met Leu Gln Gln Ile Phe Ser Leu Phe His Thr Glu Arg Ser 85 90 95 Ser Ala Ala Trp Asn Met Thr Leu Leu Asp Gln Leu His Thr Glu Leu 100 105 110 His Gln Gln Leu Gln His Leu Glu Thr Cys Leu Leu Gln Val Val Gly 115 120 125 Glu Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ile Ser Ser Val Pro Gln Leu Ser Ser 130 135 140 Leu Glu Leu Arg Arg Tyr Phe His Arg Ile Asp Asn Phe Leu Lys Glu 145 150 155 160 Lys Lys Tyr Ser Asp Cys Ala Trp Glu Ile Val Arg Val Glu Ile Arg 165 170 175 Arg Cys Leu Tyr Tyr Phe Tyr Lys Phe Thr Ala Leu Pro Ala Leu Thr 180 185 190 Leu Arg Arg Tyr Phe Gln Gly Ile Arg Val Tyr Leu Lys Glu Lys Lys 195 200 205 Tyr Ser Asp Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Met Glu Ile Met Lys Ser 210 215 220 Leu Phe Leu Ser Thr Asn Met Gln Glu Arg Leu Arg Ser Lys Asp Arg 225 230 235 240 Asp Leu Gly Ser Ser 245 <210> 7 <211> 189 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Met Ala Leu Ser Phe Ser Leu Leu Met Ala Val Leu Val Leu Ser Tyr 1 5 10 15 Lys Ser Ile Cys Ser Leu Gly Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu 20 25 30 Gly Asn Arg Arg Ala Leu Ile Leu Leu Gly Gln Met Gly Arg Ile Ser 35 40 45 Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp Arg His Asp Phe Arg Ile Pro Gln Glu 50 55 60 Glu Phe Asp Gly Asn Gln Phe Gln Asp Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu 65 70 75 80 His Glu Met Ile Gln Gln Thr Phe Asn Leu Phe Ser Thr Glu Asp Ser 85 90 95 Ser Ala Ala Trp Glu Gln Ser Leu Leu Glu Lys Phe Ser Thr Glu Leu 100 105 110 Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly 115 120 125 Val Glu Glu Thr Pro Leu Met Asn Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg 130 135 140 Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Ile Glu Arg Lys Tyr Ser 145 150 155 160 Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Leu Ser 165 170 175 Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys Arg Leu Arg Arg Lys Asp 180 185 <210> 8 <211> 189 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Met Ala Leu Ser Phe Ser Leu Leu Met Ala Val Leu Val Leu Ser Tyr 1 5 10 15 Lys Ser Ile Cys Ser Leu Gly Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu 20 25 30 Gly Asn Arg Arg Ala Leu Ile Leu Leu Ala Gln Met Gly Arg Ile Ser 35 40 45 Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu 50 55 60 Glu Phe Asp Gly Asn Gln Phe Gln Lys Ala His Val Met Ser Val Leu 65 70 75 80 His Glu Met Leu Gln Gln Ile Phe Ser Leu Phe His Thr Glu Arg Ser 85 90 95 Ser Ala Ala Trp Glu Gln Ser Leu Leu Glu Lys Phe Ser Thr Glu Leu 100 105 110 Asn Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly 115 120 125 Val Glu Glu Thr Pro Leu Met Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Lys 130 135 140 Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser 145 150 155 160 Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser 165 170 175 Leu Ser Lys Ile Phe Gln Glu Arg Leu Arg Arg Lys Glu 180 185 <210> 9 <211> 195 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Met Ala Leu Leu Phe Pro Leu Leu Ala Ala Leu Val Met Thr Ser Tyr 1 5 10 15 Ser Pro Val Gly Ser Leu Gly Cys Asp Leu Pro Gln Asn His Gly Leu 20 25 30 Leu Ser Arg Asn Thr Leu Val Leu Leu His Gln Met Arg Arg Ile Ser 35 40 45 Pro Phe Leu Cys Leu Lys Asp Arg Arg Asp Phe Arg Phe Pro Gln Glu 50 55 60 Met Val Lys Gly Ser Gln Leu Gln Lys Ala His Val Met Ser Val Leu 65 70 75 80 His Glu Met Leu Gln Gln Ile Phe Ser Leu Phe His Thr Glu Arg Ser 85 90 95 Ser Ala Ala Trp Asn Met Thr Leu Leu Asp Gln Leu His Thr Glu Leu 100 105 110 His Gln Gln Leu Gln His Leu Glu Thr Cys Leu Leu Gln Val Val Gly 115 120 125 Glu Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ile Ser Ser Pro Ala Leu Thr Leu Arg 130 135 140 Arg Tyr Phe Gln Gly Ile Arg Val Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser 145 150 155 160 Asp Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Met Glu Ile Met Lys Ser Leu Phe 165 170 175 Leu Ser Thr Asn Met Gln Glu Arg Leu Arg Ser Lys Asp Arg Asp Leu 180 185 190 Gly Ser Ser 195 <210> 10 <211> 378 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Met Pro Leu Ser Phe Ser Leu Leu Met Ala Val Leu Val Leu Ser Tyr 1 5 10 15 Lys Ser Ile Cys Ser Leu Gly Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu 20 25 30 Gly Asn Arg Arg Ala Trp Ile Leu Leu Ala Gln Met Gly Arg Ile Ser 35 40 45 His Phe Ser Cys Leu Lys Asp Arg Tyr Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu 50 55 60 Val Phe Asp Gly Asn Gln Phe Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Ala Phe 65 70 75 80 His Glu Met Ile Gln Gln Thr Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser 85 90 95 Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Ile Glu Leu 100 105 110 Phe Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Thr Gln Glu Val Gly 115 120 125 Val Glu Glu Ile Ala Leu Met Asn Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg 130 135 140 Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Met Gly Lys Lys Tyr Ser 145 150 155 160 Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser 165 170 175 Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys Gly Leu Arg Arg Lys Asp Met Pro Leu 180 185 190 Ser Phe Ser Leu Leu Met Ala Val Leu Val Leu Ser Tyr Lys Ser Ile 195 200 205 Cys Ser Leu Gly Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg 210 215 220 Arg Ala Trp Ile Leu Leu Ala Gln Met Gly Arg Ile Ser His Phe Ser 225 230 235 240 Cys Leu Lys Asp Arg Tyr Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Val Phe Asp 245 250 255 Gly Asn Gln Phe Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Ala Phe His Glu Met 260 265 270 Ile Gln Gln Thr Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala 275 280 285 Trp Asp Glu Thr Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln 290 295 300 Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Thr Gln Glu Val Gly Val Glu Glu 305 310 315 320 Ile Ala Leu Met Asn Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe 325 330 335 Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Met Gly Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala 340 345 350 Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr 355 360 365 Asn Leu Gln Lys Gly Leu Arg Arg Lys Asp 370 375 <210> 11 <211> 195 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Met Ala Phe Val Leu Ser Leu Leu Met Ala Leu Val Leu Val Ser Tyr 1 5 10 15 Gly Pro Gly Arg Ser Leu Gly Cys Tyr Leu Ser Glu Asp His Met Leu 20 25 30 Gly Ala Arg Glu Asn Leu Arg Leu Leu Ala Arg Met Asn Arg Leu Ser 35 40 45 Pro His Pro Cys Leu Gln Asp Arg Lys Asp Phe Gly Leu Pro Gln Glu 50 55 60 Met Val Glu Gly Asn Gln Leu Gln Lys Asp Gln Ala Ile Ser Val Leu 65 70 75 80 His Glu Met Leu Gln Gln Cys Phe Asn Leu Phe Tyr Thr Glu His Ser 85 90 95 Ser Ala Ala Trp Asn Thr Thr Leu Leu Glu Gln Leu Cys Thr Gly Leu 100 105 110 Gln Gln Gln Leu Glu Asp Leu Asp Ala Cys Leu Gly Pro Val Met Gly 115 120 125 Glu Lys Asp Ser Asp Met Gly Arg Met Gly Pro Ile Leu Thr Val Lys 130 135 140 Lys Tyr Phe Gln Gly Ile His Val Tyr Leu Lys Glu Lys Glu Tyr Ser 145 150 155 160 Asp Cys Ala Trp Glu Ile Ile Arg Met Glu Met Met Arg Ala Leu Ser 165 170 175 Ser Ser Thr Thr Leu Gln Lys Arg Leu Arg Lys Met Gly Gly Asp Leu 180 185 190 Asn Ser Leu 195 <210> 12 <211> 196 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Met Ala Phe Val Leu Ser Leu Leu Met Ala Leu Val Leu Val Ser Tyr 1 5 10 15 Gly Pro Gly Gly Ser Leu Gly Cys Tyr Leu Ser Gln Arg Leu Met Leu 20 25 30 Asp Ala Arg Glu Asn Leu Lys Leu Leu Glu Pro Met Asn Arg Leu Ser 35 40 45 Pro His Ser Cys Leu Gln Asp Arg Lys Asp Phe Gly Leu Pro Gln Glu 50 55 60 Met Val Glu Gly Asp Gln Leu Gln Lys Asp Gln Ala Phe Pro Val Leu 65 70 75 80 Tyr Glu Met Leu Gln Gln Thr Phe Asn Leu Phe His Thr Glu His Ser 85 90 95 Ser Ala Ala Trp Asp Thr Thr Leu Leu Glu Gln Leu Cys Thr Gly Leu 100 105 110 Gln Gln Gln Leu Glu Asp Leu Asp Thr Cys Cys Arg Gly Gln Val Met 115 120 125 Gly Glu Glu Asp Ser Glu Leu Gly Asn Met Asp Pro Ile Val Thr Val 130 135 140 Lys Lys Tyr Phe Gln Gly Ile Tyr Asp Tyr Leu Gln Glu Lys Gly Tyr 145 150 155 160 Ser Asp Cys Ala Trp Glu Ile Val Arg Val Glu Met Met Arg Ala Leu 165 170 175 Thr Val Ser Thr Thr Leu Gln Lys Arg Leu Thr Lys Met Gly Gly Asp 180 185 190 Leu Asn Ser Pro 195 <210> 13 <211> 170 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Met Ala Gln Ile Tyr Leu Val Met Ala Gly Val Met Leu Cys Ser Ile 1 5 10 15 Ser Val Cys Phe Leu Asp Gln Asn Leu Ser Ala Val His Cys Val Glu 20 25 30 Lys Arg Glu Ile Phe Lys His Leu Gln Glu Ile Lys Lys Ile Pro Ser 35 40 45 Gln Leu Cys Leu Lys Asp Arg Ile Asp Phe Lys Phe Pro Trp Lys Arg 50 55 60 Glu Ser Ile Thr Gln Leu Gln Lys Asp Gln Ala Phe Pro Val Leu Tyr 65 70 75 80 Glu Met Leu Gln Gln Thr Phe Asn Leu Phe His Thr Glu His Ser Ser 85 90 95 Ala Ala Trp Asn Thr Thr Leu Leu Asp Gln Leu Leu Ser Ser Leu Asp 100 105 110 Leu Gly Leu Arg Arg Leu Glu His Met Lys Lys Asp Asn Met Asp Cys 115 120 125 Pro His Val Gly Ser Ala Leu Arg Lys Tyr Phe Gln Gly Ile Gly Leu 130 135 140 Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Ile Val Arg 145 150 155 160 Val Glu Ile Glu Arg Cys Phe Ser Leu Thr 165 170 <210> 14 <211> 212 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Met Asn Ser Phe Ser Thr Ser Ala Phe Gly Pro Val Ala Phe Ser Leu 1 5 10 15 Gly Leu Leu Leu Val Leu Pro Ala Ala Phe Pro Ala Pro Val Pro Pro 20 25 30 Gly Glu Asp Ser Lys Asp Val Ala Ala Pro His Arg Gln Pro Leu Thr 35 40 45 Ser Ser Glu Arg Ile Asp Lys Gln Ile Arg Tyr Ile Leu Asp Gly Ile 50 55 60 Ser Ala Leu Arg Lys Glu Thr Cys Asn Lys Ser Asn Met Cys Glu Ser 65 70 75 80 Ser Lys Glu Ala Leu Ala Glu Asn Asn Leu Asn Leu Pro Lys Met Ala 85 90 95 Lys Glu Asp Gly Cys Phe Gln Ser Gly Phe Asn Glu Glu Thr Cys Leu 100 105 110 Val Lys Ile Ile Thr Gly Leu Leu Glu Phe Glu Val Tyr Leu Glu Tyr 115 120 125 Leu Gln Asn Arg Phe Glu Ser Ser Glu Glu Gln Ala Arg Ala Val Gln 130 135 140 Met Ser Thr Lys Val Leu Ile Gln Phe Leu Gln Lys Lys Ala Lys Asn 145 150 155 160 Leu Asp Ala Ile Thr Thr Pro Asp Pro Thr Thr Asn Ala Ser Leu Leu 165 170 175 Thr Lys Leu Gln Ala Gln Asn Gln Trp Leu Gln Asp Met Thr Thr His 180 185 190 Leu Ile Leu Arg Ser Phe Lys Glu Phe Leu Gln Ser Ser Leu Arg Ala 195 200 205 Leu Arg Gln Met 210 <210> 15 <211> 186 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Met Thr His Arg Cys Leu Leu Gln Met Val Leu Leu Leu Cys Phe Ser 1 5 10 15 Thr Thr Ala Leu Ser Arg Ser Tyr Ser Leu Leu Arg Phe Gln Gln Arg 20 25 30 Arg Ser Leu Ala Leu Cys Gln Lys Leu Leu Arg Gln Leu Pro Ser Thr 35 40 45 Pro Gln His Cys Leu Glu Ala Arg Met Asp Phe Gln Met Pro Glu Glu 50 55 60 Met Lys Gln Ala Gln Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ile Leu Val Ile 65 70 75 80 Tyr Glu Met Leu Gln Gln Ile Phe Asn Ile Leu Thr Arg Asp Phe Ser 85 90 95 Ser Thr Gly Trp Ser Glu Thr Ile Ile Glu Asp Leu Leu Glu Glu Leu 100 105 110 Tyr Glu Gln Met Asn His Leu Glu Pro Ile Gln Lys Glu Ile Met Gln 115 120 125 Lys Gln Asn Ser Thr Met Gly Asp Thr Thr Val Leu His Leu Arg Lys 130 135 140 Tyr Tyr Phe Asn Leu Val Gln Tyr Leu Lys Ser Lys Glu Tyr Asn Arg 145 150 155 160 Cys Ala Trp Thr Val Val Arg Val Gln Ile Leu Arg Asn Phe Ser Phe 165 170 175 Leu Thr Arg Leu Thr Gly Tyr Leu Arg Glu 180 185 <210> 16 <211> 29 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 16 ggccgcatat gctggactgt aacttactg 29 <210> 17 <211> 33 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 17 ggccgcggta ccttatttcc tcctgaatag agc 33 <210> 18 <211> 38 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 18 ggccgggatc cgccatcatg agcaccaaac ctgatatg 38 <210> 19 <211> 33 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 19 ggccgcggta ccttatttcc tcctgaatag agc 33 <210> 20 <211> 156 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Met Thr Tyr Arg Cys Leu Leu Gln Met Val Leu Leu Leu Cys Phe Ser 1 5 10 15 Thr Thr Ala Leu Ser Arg Ser Tyr Ser Leu Leu Arg Phe Gln Gln Arg 20 25 30 Gln Ser Leu Lys Glu Cys Gln Lys Leu Leu Gly Gln Leu Pro Ser Thr 35 40 45 Ser Gln His Cys Leu Glu Ala Arg Met Asp Phe Gln Met Pro Glu Glu 50 55 60 Met Lys Gln Glu Gln Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ile Leu Val Met 65 70 75 80 Tyr Glu Val Leu Gln His Ile Phe Gly Ile Leu Thr Arg Asp Phe Ser 85 90 95 Ser Thr Gly Trp Asn Ser Thr Thr Glu Asp Thr Ile Val Pro His Leu 100 105 110 Gly Lys Tyr Tyr Phe Asn Leu Met Gln Tyr Leu Glu Ser Lys Glu Tyr 115 120 125 Asp Arg Cys Ala Trp Thr Val Val Gln Val Gln Ile Leu Thr Asn Val 130 135 140 Ser Phe Leu Met Arg Leu Thr Gly Tyr Val Arg Asp 145 150 155 <210> 21 <211> 166 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg Ser Ser Asn Phe Gln 1 5 10 15 Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr Cys Leu 20 25 30 Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gln Leu Gln 35 40 45 Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu Gln 50 55 60 Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn 65 70 75 80 Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn 85 90 95 His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr 100 105 110 Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg 115 120 125 Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr 130 135 140 Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu 145 150 155 160 Thr Gly Tyr Leu Gly Asn 165

Claims (62)

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  21. (a) 서열 번호 2에 제시된 아미노산 잔기 +1 내지 +207로 구성되는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산;
    (b) 서열 번호 2에 제시된 아미노산 잔기 +28 내지 +207 또는 +30 내지 +207로 구성되는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산;
    (c) 서열 번호 2에 제시된 아미노산 잔기 +165 내지 +183, +49 내지 +54, +59 내지 +65, +78 내지 +88, +101 내지 +113, +120 내지 +123, +128 내지 +155, +160 내지 +168, +171 내지 +180, +186 내지 +193, +204 내지 +207, +7 내지 +207 또는 +30 내지 +192로 구성되는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산;
    (d) 위치 192에서 아르기닌 잔기가 리신 잔기로 치환되고/되거나 위치 193에서 시스테인 잔기가 세린 잔기로 치환되는, 서열 번호 2에 제시된 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산;
    (e) 서열 번호 2의 아미노산 잔기 n(여기서, n은 +1 내지 +59의 정수이다) 내지 +207로 구성되는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산;
    (f) 서열 번호 2의 아미노산 잔기 +1 내지 m(여기서, m은 +183 내지 +207의 정수이다)으로 구성되는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산;
    (g) 서열 번호 2의 아미노산 잔기 n 내지 m(여기서, n은 +1 내지 +59의 정수이고, m은 +183 내지 +207의 정수이다)으로 구성되는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산;
    (h) (a) 내지 (g)중 임의의 하나로 정의되는, KDI 활성을 지닌 폴리펩티드의 단편으로 구성되는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산;
    (i) 적어도 성숙한 형태의 폴리펩티드를 암호화하는 서열 번호 1의 암호 서열의 부분으로 구성되는 핵산;
    (j) 서열 번호 1의 40개 이상의 연속된 뉴클레오티드의 핵산;
    (k) 서열 번호 1의 50개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성되는 (j)의 핵산;
    (l) 서열 번호 2의 30개 이상의 연속된 아미노산으로 구성되는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산;
    (m) 서열 번호 2의 50개 이상의 연속된 아미노산으로 구성되는 폴리펩티드를 암호화하는 (l)의 핵산;
    (q) N-말단 메티오닌을 암호화하지 않는 (a) 내지 (m)의 핵산;
    (r) N-말단 메티오닌을 암호화하는 (a) 내지 (m)의 핵산; 및
    (s) (a) 내지 (m), (q) 및 (r)의 핵산에 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진 그룹에서 선택된 핵산으로 구성되는 폴리뉴클레오티드.
  22. (a) ATCC 수탁번호 제203500호에 함유된 cDNA에 의해 암호화되는 전체 길이의 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산;
    (b) ATCC 수탁번호 제203500호에 함유된 cDNA에 의해 암호화되는 성숙한 폴리펩티드로 구성되는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산;
    (c) ATCC 수탁번호 제203500호에 함유된 cDNA에 의해 암호화되는 인터페론의 특징적 서열 또는 에피토프의 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산;
    (d) 전체 길이의 아미노산 서열의 N-말단에서 58개까지의 아미노산 잔기를 제외한, ATCC 수탁번호 제203500호에 함유된 cDNA에 의해 암호화되는 전체 길이의 아미노산 서열의 부분으로 구성되는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산;
    (e) 전체 길이의 아미노산 서열의 C-말단에서 23개까지의 아미노산 잔기를 제외한, ATCC 수탁번호 제203500호에 함유된 cDNA에 의해 암호화되는 전체 길이의 아미노산 서열의 부분으로 구성되는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산;
    (f) 전체 길이의 아미노산 서열의 N-말단에서 58개까지의 아미노산 잔기를 제외하고 C-말단에서 23개까지의 아미노산 잔기를 제외한, ATCC 수탁번호 제203500호에 함유된 cDNA에 의해 암호화되는 전체 길이의 아미노산 서열의 부분으로 구성되는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산;
    (g) KDI 활성을 지닌, ATCC 수탁번호 제203500호에 함유된 cDNA에 의해 암호화되는 전체 길이의 아미노산 서열의 단편으로 구성되는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산;
    (h) 적어도 성숙한 형태의 폴리펩티드를 암호화하는 ATCC 수탁번호 제203500호에 함유된 cDNA의 암호 서열로 구성되는 핵산;
    (i) ATCC 수탁번호 제203500호에 함유된 cDNA의 40개 이상의 연속된 뉴클레오티드의 핵산;
    (j) ATCC 수탁번호 제203500호에 함유된 cDNA의 50개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성되는 (i)의 핵산;
    (k) ATCC 수탁번호 제203500호에 함유된 cDNA에 의해 암호화되는 30개 이상의 연속된 아미노산으로 구성되는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산;
    (l) ATCC 수탁번호 제203500호에 함유된 cDNA에 의해 암호화되는 50개 이상의 연속된 아미노산으로 구성되는 폴리펩티드를 암호화하는 (k)의 핵산;
    (p) N-말단 메티오닌을 암호화하지 않는 (a) 내지 (l)의 핵산;
    (q) N-말단 메티오닌을 암호화하는 (a) 내지 (l)의 핵산; 및
    (r) (a) 내지 (l), (p) 및 (q)의 핵산에 대해 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진 그룹에서 선택된 핵산으로 구성되는 폴리뉴클레오티드.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서, DNA, RNA, cDNA 또는 게놈 DNA인 폴리뉴클레오티드.
  24. 제21항 또는 제22항에 있어서, 이중쇄 또는 일본쇄인 폴리뉴클레오티드.
  25. 제21항 또는 제22항에 있어서, 이종 폴리뉴클레오티드와 융합된 폴리뉴클레오티드.
  26. 제25항에 있어서, 이종 폴리뉴클레오티드가 이종 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
  27. 제21항 또는 제22항에 있어서, 표지화된 폴리뉴클레오티드.
  28. 제21항 또는 제22항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  29. 제28항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 조절 제어 서열에 작동적으로 연결된 벡터.
  30. 제28항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  31. 제21항 또는 제22항의 폴리뉴클레오티드로 유전자 조작된 숙주 세포.
  32. 제30항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 이종 조절 제어 서열에 작동적으로 연결된 숙주 세포.
  33. 제30항에 있어서, 원핵 세포, 진핵 세포, 균류 세포(fungal cell), 곤충 세포, 동물 세포, 포유류 세포, Cos 세포, CHO 세포 또는 이. 콜라이(E. coli) 세포인 숙주 세포.
  34. 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드가 발현되는 조건 하에서 제30항의 숙주 세포를 배양하고 당해 폴리펩티드를 회수함을 포함하는, 폴리펩티드를 생성하는 방법.
  35. 제21항 또는 제22항의 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드를 발현하고 당해 폴리펩티드를 회수함을 포함하는, 폴리펩티드를 생성하는 방법.
  36. 제21항 또는 제22항의 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드.
  37. 제36항에 있어서, 화학적으로 합성된 폴리펩티드.
  38. 제36항에 있어서, 표지화되거나, 변형되거나, 당화되거나 페길화된 폴리펩티드.
  39. 제38항에 있어서, 표지가 방사성동위원소 표지인 폴리펩티드.
  40. 제36항에 있어서, 이종 폴리펩티드에 융합된 폴리펩티드.
  41. 제40항에 있어서, IgG Fc 영역에 융합된 폴리펩티드.
  42. 제36항에 있어서, N-말단 메티오닌이 결실된 폴리펩티드.
  43. 제36항에 있어서, N-말단 메티오닌을 가지는 폴리펩티드.
  44. 제36항에 있어서, 고정된 폴리펩티드.
  45. 제36항의 폴리펩티드를 특이적으로 인식하는 항체.
  46. 제36항의 폴리펩티드의 항-이디오타입 항체인 항체.
  47. 제45항에 있어서, 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 키메릭 항체, 사람화된 항체 또는 Fab 단편인 항체.
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  54. 화학 요법 후 인터페론 활성을 억제하거나 골수 또는 조혈 선조 세포의 증식을 자극하기 위한, 제45항의 항체와 임의로 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
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  60. (a) 후보 화합물을 함유하는 제제와 제36항의 폴리펩티드를 접촉시키는 단계; 및
    (b) 제36항의 폴리펩티드와 결합하는 상기 화합물을 동정하거나 검출하는 단계를 포함하는, 제36항의 폴리펩티드에 결합하는 화합물을 동정하거나 검출하는 방법.
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