JP2003528815A - 変異体形態の骨髄前駆体阻害因子−２（ｍｐｉｆ−２）を有する疾患状態を処置するための治療組成物および方法 - Google Patents

変異体形態の骨髄前駆体阻害因子−２（ｍｐｉｆ−２）を有する疾患状態を処置するための治療組成物および方法

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Abstract

(57)【要約】 ヒトケモカインβ−６のアゴニストポリペプチドおよびアンタゴニストポリペプチドならびにそのようなポリペプチドをコードするＤＮＡならびに組換え技術によってこのようなポリペプチドを産生するための手順が、開示される。本発明のケモカインβ−６アンタゴニストは、慢性関節リウマチ、肺炎症、アレルギー、喘息、感染性疾患を処置するため、および炎症およびアテローム性動脈硬化症を予防するために使用され得る。ケモカインβ−６のアゴニストおよびアンタゴニストは、化学療法または放射線治療などの治療を受ける患者を骨髄保護するために使用され得る。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の背景） （発明の分野） 本発明は、ヒトケモカインβ−６（Ｃｋβ−６）アゴニストポリペプチドおよ
びヒトケモカインβ−６（Ｃｋβ−６）アンタゴニストポリペプチド、ならびに
このようなポリペプチドをコードするＤＮＡ（ＲＮＡ）、ならびに組換え技術に
よってこのようなポリペプチドを産生するための手順に関する。本発明のケモカ
インβ−６アンタゴニストは、慢性関節リウマチ、肺炎症、アレルギー、喘息、
感染性疾患を処置するため、そして炎症およびアテローム性動脈硬化症を予防す
るために使用され得る。このケモカインβ−６アゴニストおよびケモカインβ−
６アンタゴニストは、化学療法または放射線治療のような治療を受けている患者
を骨髄保護するために使用され得る。ケモカインβ−６（Ｃｋβ−６）はまた、
本明細書中にＭＰＩＦ−２およびエオタキシン−２（ｅｏｔａｘｉｎ−２）（Ｅ
ｏ−２）と称される。
【０００２】 （関連分野） ３つの形態の単球走化性タンパク質、すなわち、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２およ
びＭＣＰ−３が存在する。これらタンパク質の全ては、構造的および機能的に特
徴付けられており、そしてまた、クローン化され、発現されている。ＭＣＰ−１
およびＭＣＰ−２は、白血球（単球、および白血球）を誘引する能力を有し、一
方ＭＣＰ−３はまた、好酸球およびＴリンパ球を誘引する（Ｄａｈｉｎｄｅｒｉ
，Ｅ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９：７５１−７５６（１９９４））。
【０００３】 最初に、ヒト単球特異的誘引因子は、グリア細胞株および単球細胞株から精製
された。Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａ，Ｋ．ら、Ｊ Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６９：１４８
５−１４９０（１９８９）。この因子は、本来は、神経膠腫由来走化性因子（Ｇ
ＤＣＦ）ならびに単球走化性および活性化因子（ＭＣＡＦ）としてＭａｔｓｕｓ
ｈｉｍａらによって称された。この因子は、ここで、ＭＣＰ−１と呼ぶ。ＭＣＰ
−１のｃＤＮＡの引続くクローニングによって、これがマウスＪＥ遺伝子に非常
に類似することが示された。このＪＥ遺伝子は、血小板由来増殖因子によってマ
ウス線維芽細胞において広範囲に誘導され得た。Ｃｏｃｈｒａｎ，Ｂ．Ｈ．ら、
Ｃｅｌｌ ３３：９３９−９４７（１９８３）。マウスＪＥは、ＭＣＰ−１に非
常に類似する。このＭＣＰ−１タンパク質は、共有する６８のＮ末端残基の領域
においてマウスＪＥに６２％同一である。ＪＥおよびＭＣＰ−１が種ホモログで
あることは、広く受け入れられている。
【０００４】 ＪＥ／ＭＣＰ−１を投与することによって脊椎動物における腫瘍形成を抑制す
る方法は、ＰＣＴ出願ＷＯ−９２／２０３７２に、悪性腫瘍の局在した合併症を
処置する方法およびＪＥ／ＭＣＰ−１を投与することによる寄生虫感染と戦う方
法と共に、開示される。悪性腫瘍細胞におけるＪＥ／ＭＣＰ−１タンパク質の発
現は、インビボにおいて腫瘍を形成する細胞の能力を抑制することが、見出され
ている。
【０００５】 ヒトＭＣＰ−１は、推定分子量８，７００ダルトンを有する７６アミノ酸の塩
基性ペプチドである。ＭＣＰ−１は、単球、内皮細胞および線維芽細胞に主に誘
導的に発現される。Ｌｅｏｎａｒｄ，Ｅ．Ｊ．およびＹｏｓｈｉｍｕｒａ，Ｔ．
、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ １１：９７−１０１（１９９０）。この発現を
誘導する因子は、ＩＬ−１、ＴＮＦまたはリポ多糖類処理である。
【０００６】 ＭＣＰ−１の他の特性は、百日咳毒素感受性様式で成熟ヒト好塩基球を強く活
性化する能力を含む。ＭＣＰ−１は、好塩基球によるヒスタミン放出を直接誘導
し得るサイトカインである（Ｂｉｓｃｈｏｆｆ，Ｓ．Ｃ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅ
ｄ．１７５：１２７１−１２７５（１９９２））。さらに、ＭＣＰ−１は、イン
ターロイキン３、インターロイキン５、または顆粒球／マクロファージコロニー
刺激因子で予め処理された好塩基球によるロイコトリエンＣ４の形成を促進する
。ＭＣＰ−１誘導された好塩基球の媒介因子の放出は、アレルギー性炎症および
ＭＣＰ−１を発現する他の病状において重要な役割を果たし得る。
【０００７】 ヒト単球走化性および活性化因子（ＭＣＡＦ）をコードするヌクレオチド配列
を有するクローンは、ＭＣＡＦポリペプチドの一次構造が、２３アミノ酸残基の
推定シグナルペプチド配列および７６アミノ酸残基の成熟ＭＣＡＦ配列を構成す
ることを明らかにする。Ｆｕｒｕｔａｎｉ，Ｙ．Ｈ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉ
ｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕ．１５９：２４９−５５（１９８９）。ヒト神
経膠腫由来の単球走化性因子（ＧＤＣＦ−２）の完全アミノ酸配列がまた、決定
された。このペプチドは、ヒト単球を誘引するが、好中球は誘引しない。ＧＤＣ
Ｆ−２が７６アミノ酸残基を含むことが、立証された。このペプチド鎖は、４つ
の半分のシステイン（ｈａｌｆ−ｃｙｓｔｅｉｎｅ）を、１１位、１２位、３６
位、および５２位に含み、これらは、ジスルフィド架橋でクラスター化されるル
ープ対を生成する。さらに、ＭＣＰ−１遺伝子は、ヒト第１７染色体に指定され
ている。Ｍｅｈｒａｂｉａｎ，Ｍ．Ｒ．ら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ９：２００−３
（１９９１）。
【０００８】 特定のデータは、ＭＣＰ−１の潜在的な役割が動脈壁の単球浸潤の媒介である
ことを示唆する。単球は、泡沫細胞の前駆体としておよび増殖因子媒介の内膜過
形成の潜在的な供給源の両方としてアテローム発生に対して中心的なようである
。Ｎｅｌｋｅｎ，Ｎ．Ａ．ら、Ｊ Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８８：１１２１−
７（１９９１）。ＭＣＰ−１の滑膜産生が、慢性関節リウマチと関連する炎症の
間の単核食細胞の漸増に重要な役割を果たし得ること、および滑膜組織マクロフ
ァージが、このサイトカインの主要な供給源であることがまた、見出されている
。ＭＣＰ−１レベルは、変形性関節症患者からの滑液または他の関節炎を有する
患者由来の滑液と比較して、慢性関節リウマチ患者由来の滑液において有意に高
いことが見出されている。Ｋｏｃｈ，Ａ．Ｅ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ
．９０：７７２−９（１９９２）。
【０００９】 ＭＣＰ−２およびＭＣＰ−３は、炎症誘発性（ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒ
ｙ）タンパク質のサブファミリーに分類され、そしてＭＣＰ−１に機能的に関連
する。なぜなら、これらは、単球を特異的に誘引するが、好中球を誘引しないか
らである。Ｖａｎ Ｄａｍｍｅ，Ｊ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：５９−
６５（１９９２）。ＭＣＰ−３は、ＭＣＰ−１およびＭＣＰ−２のそれぞれに対
して、７１％および５８％のアミノ酸相同性を示す。ＭＣＰ−３は、マクロファ
ージ機能を調節する炎症性サイトカインである。
【００１０】 血液リンパ球産生性幹細胞の移植は、癌および血液学的障害の処置に提案され
ている。多くの研究は、末梢血から収集された造血幹細胞の移植が、骨髄由来幹
細胞の移植に対して利点を有することを示す。循環している幹細胞の数が少ない
ので、多能性骨髄幹細胞の末梢血への流動を誘導する必要性がある。適切な量の
幹細胞を得るために処理される血液の量を減少することは、自家移植手順の使用
を増加し、そして同種移植と関連した対宿主性移植片反応の危険性を排除する。
現在、骨髄ＣＤ３４+幹細胞の血液流動は、細菌発育抑制剤およびＧ−ＣＳＦま
たはＧＭ−ＣＳＦを含む薬剤の組合わせの注射によって得られる。幹細胞流動を
可能にし得る薬物としては、ＩＬ−１、ＩＬ−７、ＩＬ−８、およびＮＩＰ−１
ａが挙げられる。ＩＬ−１およびＩＬ−８の両方は、良好な植付けに危険であり
得る炎症誘発性活性を示す。ＩＬ−７は、長期間、高用量で投与されなければな
らず、そしてＭＩＰ−ｌａは、単一薬剤としてはあまり活性ではなく、Ｇ−ＣＳ
Ｆと組合わせた場合に最高の活性を示す。
【００１１】 （発明の要旨） 本発明の１つの局面に従って、新規な全長または成熟ポリペプチド、ならびに
、生物学的に活性な、診断的または治療的に有用なそのフラグメント、アナログ
および誘導体が提供される。本発明のポリペプチドは、ヒト起源である。
【００１２】 本発明の別の局面に従って、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡを含
む本発明のポリペプチドをコードする単離された核酸分子、ならびに、生物学的
に活性な、診断的または治療的に有用なそのフラグメント、アナログおよび誘導
体が提供される。
【００１３】 本発明はまた、図１に示されるアミノ酸配列（配列番号２）または１９９４年
３月１０日にＡＴＣＣ受託番号第７５７０３として寄託されたｃＤＮＡクローン
によってコードされるアミノ酸配列を有するＣｋβ−６ポリペプチドをコードす
るポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を提供する。このヌクレオチド配
列は、寄託されたＣｋβ−６クローン（配列番号１）（これは、図１に示される
）を少なくとも一部、配列決定することによって、１１９アミノ酸残基のポリペ
プチドをコードするオープンリーディングフレームを含む（これは、約２６アミ
ノ酸残基のリーダーを含む）ことを決定した。成熟Ｃｋβ−６タンパク質のアミ
ノ酸配列を、配列番号２のアミノ酸残基１〜９３のように、図１に示す。
【００１４】 従って、本発明の１つの局面は、以下からなる群から選択されるヌクレオチド
配列を有するポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を提供する：（ａ）図
１の完全アミノ酸配列（配列番号２）を有するＣｋβ−６ポリペプチドをコード
するヌクレオチド配列；（ｂ）Ｎ末端メチオニンを除く図１に示される完全アミ
ノ酸配列（配列番号２）を有するＣｋβ−６ポリペプチドをコードするヌクレオ
チド配列；（ｃ）図１の１−９３位のアミノ酸配列（配列番号２）を有するＣｋ
β−６ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｄ）ＡＴＣＣ受託番号第
７５７０３に含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされる完全アミノ酸配列
を有するＣｋβ−６ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｅ）Ｎ末端
メチオニンを除くＡＴＣＣ受託番号第７５７０３に含まれるｃＤＮＡクローンに
よってコードされる完全アミノ酸配列を有するＣｋβ−６ポリペプチドをコード
するヌクレオチド配列；（ｆ）ＡＴＣＣ受託番号第７５７０３に含まれるｃＤＮ
Ａクローンによってコードされるアミノ酸配列を有する成熟Ｃｋβ−６ポリペプ
チドをコードするヌクレオチド配列；および（ｇ）上記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）
、（ｄ）、（ｅ）または（ｆ）のヌクレオチド配列のいずれかに相補的なヌクレ
オチド配列。
【００１５】 本発明はさらに、図１の推定アミノ酸配列（配列番号２）を有するＣｋβ−６
ポリペプチドまたは寄託されたクローンのｃＤＮＡによってコードされたポリペ
プチドのフラグメント、アナログおよび誘導体をコードする上記のポリヌクレオ
チドの改変体に関する。ポリヌクレオチドの改変体は、ポリヌクレオチドの天然
に存在する対立遺伝子改変体またはポリヌクレオチドの天然に存在しない改変体
であり得る。
【００１６】 本発明のさらなる実施形態は、上記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）
、（ｆ）または（ｇ）のヌクレオチド配列のいずれかに対して、あるいは、上記
（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）または（ｇ）のポリヌクレオ
チドに対して、ストリンジェントなハイブリダイズ条件下で、ハイブリダイズす
るポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０％相同または同一、そして、より
好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であ
るヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を含む
。ハイブリダイズするこれらのポリペプチドは、ストリンジェントなハイブリダ
イゼーション条件下で、Ａのみの残基またはＴのみの残基からなるヌクレオチド
配列を有するポリヌクレオチドに、ハイブリダイズしない。
【００１７】 本発明はまた、組換えベクター（これは、本発明の単離された核酸分子を含む
）および組換えベクターを含む宿主細胞、ならびにこのようなベクターおよび宿
主細胞を作製する方法に関する。
【００１８】 本発明のなおさらなる局面に従って、このタンパク質の発現および引き続くこ
のタンパク質の回収を促進する条件下で、本発明のポリペプチドをコードする核
酸配列を含む組換え原核生物および／または真核生物宿主細胞を培養する工程を
包含する組換え技術によって、このようなポリペプチドを産生するためのプロセ
スが提供される。
【００１９】 本発明はさらに、以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する単離さ
れたＣｋβ−６ポリペプチドを提供する：（ａ）図１に示されるリーダー配列を
含む、完全アミノ酸配列（配列番号２）を有するＣｋβ−６ポリペプチドのアミ
ノ酸配列；（ｂ）Ｎ末端メチオニンを除く、図１に示されるリーダー配列を含む
、完全アミノ酸配列を有するＣｋβ−６ポリペプチドのアミノ酸配列；（ｃ）図
１の１−９３位のアミノ酸配列（配列番号２）を有する成熟Ｃｋβ−６ポリペプ
チド（リーダーなし）のアミノ酸配列；（ｄ）ＡＴＣＣ受託番号第７５７０３に
含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされる、リーダー配列を含む、完全ア
ミノ酸配列を有するＣｋβ−６ポリペプチドのアミノ酸配列；（ｅ）Ｎ末端メチ
オニンを除くＡＴＣＣ受託番号第７５７０３に含まれるｃＤＮＡクローンによっ
てコードされる、リーダー配列を含む、完全アミノ酸配列を有するＣｋβ−６ポ
リペプチドのアミノ酸配列；および（ｆ）ＡＴＣＣ受託番号第７５７０３に含ま
れるｃＤＮＡクローンによってコードされるアミノ酸配列を有する成熟Ｃｋβ−
６ポリペプチドのアミノ酸配列。
【００２０】 本発明のポリペプチドはまた、上記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）
または（ｆ）に記載されるアミノ酸配列に、少なくとも９０％の同一性、そして
、より好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有する相同
なポリペプチド）、ならびに、上記の配列に、少なくとも８０％同一、より好ま
しくは少なくとも９０％同一、さらにより好ましくは少なくとも９５％、９６％
、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含
む。
【００２１】 本発明のこの局面のさらなる実施形態は、上記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ
）、（ｅ）または（ｆ）に記載されるアミノ酸配列を有するＣｋβ−６ポリペプ
チドのエピトープ保有部分のアミノ酸配列を有するペプチドまたはポリペプチド
に関する。本発明のＣｋβ−６ポリペプチドのエピトープ保有部分のアミノ酸配
列を有するペプチドまたはポリペプチドは、少なくとも６つまたは７つ、好まし
くは少なくとも９つ、そしてより好ましくは少なくとも３０アミノ酸〜約５０ア
ミノ酸を有するＣｋβ−６ポリペプチドの一部を含む。しかし、上記の本発明の
ポリペプチドの全アミノ酸配列までの任意の長さおよび全アミノ酸配列を含むエ
ピトープ保有ポリペプチドもまた、本発明に含まれる。
【００２２】 本発明のさらなる核酸実施形態は、上記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（
ｅ）または（ｆ）のアミノ酸配列を有するＣｋβ−６のエピトープ保有部分のア
ミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子に関する。
【００２３】 本発明はまた、別の局面において、Ｃｋβ−６ポリヌクレオチド、プローブ、
ベクター、宿主細胞、ポリペプチド、フラグメント、改変体、誘導体、エピトー
プ保有部分、抗体、アンタゴニストまたはアゴニストを含む薬学的組成物を提供
する。
【００２４】 本発明のなおさらなる局面に従って、このようなポリペプチド、または治療目
的（例えば、幹細胞流動、骨髄保護およびニューロン保護のため、腫瘍を処置す
るため、創傷治癒のため、寄生虫感染と戦うため、および造血を調節するため）
のこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを利用するプロセスが
提供される。
【００２５】 本発明のさらなる局面は、本発明の単離されたＣｋβ−６ポリペプチドまたは
そのアンタゴニストの治療有効量を含む組成物をこのような個体に投与する工程
を包含する体中のＣｋβ−６活性のレベルの増加を必要とする、個体を処置する
ための方法に関する。
【００２６】 本発明のなおさらなる局面は、Ｃｋβ−６アンタゴニストの治療有効量を含む
組成物をこのような個体に投与する工程を包含する、体中のＣｋβ−６活性のレ
ベルの減少を必要とする個体を処置するための方法に関する。本発明における使
用のための好ましいアンタゴニストは、Ｃｋβ−６特異的またはＣＣＲ３レセプ
ター特異的抗体である。
【００２７】 本発明のなおさらなる局面に従って、このようなポリペプチドに対する抗体が
提供される。別の実施形態において、本発明は、上記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、
（ｄ）、（ｅ）または（ｆ）に記載されるアミノ酸配列を有するＣｋβ−６ポリ
ペプチドに特異的に結合する単離された抗体を提供する。
【００２８】 本発明はさらに、本明細書中に記載されるようなアミノ酸配列を有するＣｋβ
−６ポリペプチドに特異的に結合する抗体を単離するための方法を提供する。こ
のような抗体は、以下に記載されるように、診断的にかまたは治療的に有用であ
る。
【００２９】 本発明の別の局面に従って、本発明のポリペプチドを模倣し、そして、第２の
メッセンジャー応答を誘発するレセプターに結合するアゴニストが提供される。
【００３０】 本発明のなお別の局面に従って、例えば、慢性関節リウマチ、肺炎症、ヒスタ
ミン媒介アレルギー反応、感染性疾患、好酸球増多症候群、珪肺症、サルコイド
ーシスの処置において、そして、自己免疫および慢性炎およびアテローム硬化症
を予防するために、このようなポリペプチド（これらは、このようなポリペプチ
ドの作用を阻害するために使用され得る）に対するアンタゴニストが提供される
。あるいは、このようなポリペプチドを使用して、再生不良性貧血、脊髄形成異
常症候群、喘息および関節炎を処置するために、ＩＬ−１およびＴＮＦαの産生
を阻害する。
【００３１】 本発明はまた、幹細胞流動および骨髄保護のためのＣｋβ−６アンタゴニスト
を使用する方法を提供する。
【００３２】 本発明のなおさらなる局面に従って、本発明の核酸配列に特異的にハイブリダ
イズするのに十分な長さの核酸分子を含む核酸プローブが提供される。
【００３３】 本発明のさらに別の局面に従って、本発明のポリペプチドの過小発現または過
剰発現に関連する疾患を検出するための、そしてポリペプチドをコードする核酸
配列中の変異に関連する疾患に対する罹患性を検出するための診断アッセイが提
供される。
【００３４】 本発明のなおさらなる局面に従って、ヒト疾患の処置のための治療および診断
を開発する目的のために、科学的研究（例えば、ＤＮＡの合成およびＤＮＡベク
ターの製造）に関連するインビトロ目的のためのこのようなポリペプチド、また
はこのようなポリペプチドをコードするポリペプチドを利用するためのプロセス
が提供される。
【００３５】 本発明はまた、Ｃｋβ−６ポリペプチドによって誘導される細胞応答を増強ま
たは阻害し得る化合物を同定するためのスクリーニング方法を提供する。この方
法は、Ｃｋβ−６ポリペプチドを発現する細胞を候補化合物と接触させる工程、
細胞応答をアッセイする工程、および候補化合物の非存在下において接触が行な
われる場合、標準細胞応答（アッセイされる標準）と細胞応答を比較する工程を
包含し；それによって、標準に対して増加した細胞応答は、この化合物がアゴニ
ストであることを示し、そして、標準に対して減少した細胞応答は、この化合物
がアンタゴニストであることを示す。
【００３６】 多数の障害について、標準Ｃｋβ−６遺伝子発現レベル；すなわち、疾患を有
さない個体由来の組織または体液におけるＣｋβ−６発現レベルに対して、この
ような障害を有する個体から採取された特定の組織または体液（例えば、血清、
血漿、尿、関節液または髄液）中で、有意に高いかまたは低いレベルのＣｋβ−
６遺伝子発現が検出され得ると考えられている（これは、（ａ）個体の細胞また
は体液のＣｋβ−６遺伝子発現レベルをアッセイすること；（ｂ）Ｃｋβ−６遺
伝子発現レベルを、標準的なＣｋβ−６遺伝子発現レベルと比較することを含み
、それにより標準的な発現レベルと比較した、アッセイされたＣｋβ−６遺伝子
発現レベルにおける増加または減少が、障害の指標である）。このような障害と
しては、白血病、慢性炎症、自己免疫疾患、および固形腫瘍が挙げられる。
【００３７】 本発明のこれらおよび他の局面は、本明細書中の教示から当業者に明らかであ
るべきである。
【００３８】 （好ましい実施形態の詳細な説明） 本発明は、Ｃｋβ−６ポリペプチドをコードする単離されたポリペプチド分子
、もしくはＣｋβ−６ポリペプチド自体を利用する診断組成物または治療組成物
、および方法、ならびにこのような組成物を生成するためのベクター、宿主細胞
および組換えまたは合成方法を提供する。Ｃｋβ−６の他の名称には、ＭＰＩＦ
−２およびｅｏｔｏｘｉｎ−２が含まれる。
【００３９】 （核酸） 本発明の１つの局面によれば、図１の推定アミノ酸配列（配列番号２）を有す
る全長または成熟ポリペプチド、またはアメリカンタイプカルチャーコレクショ
ン、Ｐａｔｅｎｔ Ｄｅｐｏｓｉｔｏｒｙ，１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１１０−２２０９にＡＴ
ＣＣ寄託番号７５７０３として１９９４年３月１０日に寄託されたクローンのｃ
ＤＮＡによってコードされる成熟ポリペプチドをコードする単離された核酸（ポ
リヌクレオチド）が提供される。
【００４０】 本明細書中で参照される寄託物は、特許手続目的のための微生物の寄託の国際
的承認に関するブダペスト条約の条項に拠って維持される。この寄託物は、当業
者の簡便のためのみに提供され、そして寄託物が３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１２のも
とで要求されることの認証ではない。寄託された材料に含まれるポリヌクレオチ
ドの配列、ならびにそれによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、
本明細書中に参考として援用され、そして本明細書中の配列のいずれかの記載と
の何らかの矛盾の場合には、支配的である。寄託された材料を作製、使用または
販売するためには、実施権が必要とされ得、そしてこのような実施権はいずれも
、本明細書中において承諾されない。
【００４１】 本発明のポリヌクレオチドは、活性化された単球ｃＤＮＡライブラリーから発
見された。このポリヌクレオチドは、約１１９アミノ酸長のタンパク質をコード
するオープンリーディングフレームを含み、このうちの最初の２６のアミノ残基
は、推定リーダー配列を構成する。従って、成熟タンパク質は、９３アミノ酸長
であると予測される。これは、マウス単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１ま
たはＪＥ、配列は示さない）およびヒトＭＣＰ−１（配列番号５）に構造的に関
連し、そしてコンピュータプログラムＢｅｓｔｆｉｔによって決定する場合に、
ヒトＭＣＰ−１タンパク質配列全体にわたって、３６％の同一性および５２％の
類似性を示す（図２に示す）。このポリペプチドは、特徴的なモチーフにおいて
全てのケモカインに生じる４つ全てのシステイン残基を含む。これらのシステイ
ン間の間隔は、ヒトＭＣＰ−１およびマウスＭＣＰ−１／ＪＥと比較して保存さ
れており、このことは、この新規な遺伝子がケモカインであることを、強く示唆
する。
【００４２】 本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡの形態またはＤＮＡの形態であり得、こ
のＤＮＡとしては、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および合成ＤＮＡが挙げられる。
ＤＮＡは、二本鎖であっても一本鎖であってもよく、そして一本鎖である場合に
は、コード鎖であっても非コード（アンチセンス）鎖であってもよい。成熟ポリ
ペプチドをコードするコード配列は、図１に示すコード配列（配列番号１）また
は寄託されたクローンの配列と同一であり得るか、または遺伝コードの重複性も
しくは縮重の結果として図１のＤＮＡと同じ成熟ポリペプチド（配列番号１）ま
たは寄託されたｃＤＮＡをコードする、異なるコード配列であり得る。
【００４３】 図１の成熟ポリペプチド（配列番号２）、または寄託されたｃＤＮＡによって
コードされる成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとしては、以下が
挙げられ得るが、それらに限定されない：成熟ポリペプチドに対するコード配列
のみ；成熟ポリペプチドに対するコード配列およびさらなるコード配列（例えば
、リーダー配列または分泌配列あるいはタンパク質配列）；成熟ポリペプチドに
対するコード配列（および必要に応じてさらなるコード配列）および非コード配
列（例えば、成熟ポリペプチドに対するコード配列の５’および／もしくは３’
のイントロンまたは非コード配列。
【００４４】 従って、用語「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」とは、そのポリ
ペプチドに対するコード配列のみを含むポリヌクレオチド、ならびにさらなるコ
ード配列および／または非コード配列を含むポリヌクレオチドを包含する。
【００４５】 他に示さない限り、本明細書中のＤＮＡ分子の配列決定によって決定される全
てのヌクレオチド配列は、自動化ＤＮＡシークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉ
ｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．のモデル３７３のような）を使用して決定され、そ
して本明細書中で決定されるＤＮＡ分子によってコードされるポリペプチドの全
てのアミノ酸配列は、上記のように決定したＤＮＡ配列の翻訳によって推定した
。従って、当該分野において公知であるように、この自動化アプローチによって
任意のＤＮＡ配列決定に関して、本明細書中において決定されるあらゆるヌクレ
オチド配列は、いくらかのエラーを含み得る。自動化によって決定されるヌクレ
オチド配列は、配列決定されるＤＮＡ分子の実際のヌクレオチド配列に対して、
代表的には少なくとも約９０％同一、より代表的には少なくとも約９５％〜少な
くとも約９９．９％同一である。実際の配列は、当該分野において周知の手動Ｄ
ＮＡ配列決定法を含む他のアプローチによってより正確に決定され得る。当該分
野においてまた公知であるように、実際の配列と比較して、決定されるヌクレオ
チド配列における単一の挿入または欠失は、ヌクレオチド配列の翻訳においてフ
レームシフトを引き起こし、その結果、決定されたヌクレオチド配列によってコ
ードされる推定アミノ酸配列は、配列決定されたＤＮＡ分子によって実際にコー
ドされるアミノ酸配列と、このような挿入または欠失の点から開始して、完全に
異なる。
【００４６】 他に示さない限り、本明細書中に記載される各ヌクレオチド配列は、デオキシ
リボヌクレオチド（略号Ａ、Ｇ、ＣおよびＴ）の配列として表される。しかし、
核酸分子またはポリヌクレオチドのヌクレオチド配列によって、ＤＮＡ分子また
はポリヌクレオチドに関しては、デオキシリボヌクレオチドの配列を意図され、
そしてＲＮＡ分子またはポリヌクレオチドに関しては、リボヌクレオチド（Ａ、
Ｇ、ＣおよびＵ）の対応する配列が意図され、ここで、特定されたデオキシリボ
ヌクレオチド配列における各チミジンデオキシリボヌクレオチド（Ｔ）は、リボ
ヌクレオチドウリジン（Ｕ）によって置換される。例えば、デオキシリボヌクレ
オチドの略号を使用して記載される場合に、配列番号１の配列を有するＲＮＡ分
子の参照は、配列番号１の各デオキシリボヌクレオチドＡ、ＧまたはＣが、対応
するリボヌクレオチドＡ、ＧまたはＣで置換されており、そして各デオキシリボ
ヌクレオチドＴがリボヌクレオチドＵで置換されている配列を有する、ＲＮＡ分
子を示すことが意図される。
【００４７】 本明細書中に提供される情報（例えば、図１のヌクレオチド配列）を使用して
、Ｃｋβ−６ポリペプチドをコードする本発明の核酸分子が、標準的なクローニ
ングおよびスクリーニングの手順（例えば、出発材料としてｍＲＮＡを使用して
ｃＤＮＡをクローニングするための方法）を使用して、得られ得る。
【００４８】 本発明は、さらに、図１（配列番号２）に示す推定アミノ酸配列を有するポリ
ペプチド、または寄託されたクローンのｃＤＮＡによってコードされるポリペプ
チドの、フラグメント、アナログおよび誘導体をコードする、本明細書中で上記
されるポリヌクレオチドの改変体に関する。このポリヌクレオチドの改変体は、
このポリヌクレオチドの天然に存在する対立遺伝子改変体であっても、このポリ
ヌクレオチドの天然には存在しない改変体であってもよい。
【００４９】 従って、本発明は、図１（配列番号２）に示すものと同じ成熟ポリペプチド、
または寄託されたクローンのｃＤＮＡによってコードされる同じ成熟ポリペプチ
ドをコードするポリヌクレオチド、ならびに改変体が図１（配列番号２）のポリ
ペプチドまたは寄託されたクローンのｃＤＮＡによってコードされるポリペプチ
ドのフラグメント、誘導体またはアナログをコードするような、ポリヌクレオチ
ドの改変体を含む。このようなヌクレオチド改変体としては、欠失改変体、置換
改変体および付加または挿入改変体が挙げられる。
【００５０】 本明細書中上記で示したように、ポリヌクレオチドは、図１（配列番号１）に
示すコード配列または寄託されたクローンのコード配列の、天然に存在する対立
遺伝子改変体であるコード配列を有し得る。当該分野において公知であるように
、対立遺伝子改変体とは、コードされるポリペプチドの機能を実質的に変化させ
ない、１つ以上のヌクレオチドの置換、欠失または付加を有し得る、ポリヌクレ
オチド配列の変化形態である。
【００５１】 本発明はまた、成熟ポリペプチドのコード配列が、宿主細胞からのポリペプチ
ドの発現および分泌において補助するポリヌクレオチド配列（例えば、細胞から
のポリペプチドの輸送を制御するための分泌配列として機能するリーダー配列）
に同じリーディングフレームで融合され得る、ポリヌクレオチドを含む。リーダ
ー配列を有するポリペプチドは、プレタンパク質であり、そしてポリペプチドの
成熟形態を形成するために、宿主細胞により切断されるリーダー配列を有し得る
。このポリヌクレオチドはまた、成熟タンパク質およびさらなる５’アミノ酸残
基であるプロタンパク質をコードし得る。プロ配列を有する成熟タンパク質は、
プロタンパク質であり、そしてタンパク質の不活性形態である。一旦プロ配列が
切断されると、活性成熟タンパク質が残存する。
【００５２】 従って、例えば、本発明のポリヌクレオチドは、成熟タンパク質、あるいはプ
ロ配列を有するタンパク質またはプロ配列およびプレ配列（リーダー配列）の両
方を有するタンパク質をコードし得る。
【００５３】 本発明のポリヌクレオチドはまた、本発明のポリペプチドの精製を可能にする
マーカー配列のフレーム内に融合されたコード配列を有し得る。マーカー配列は
、細菌宿主の場合にマーカーに融合された成熟ポリペプチドの精製を提供する、
ｐＱＥ−９ベクターにより供給されるヘキサヒスチジンタグであり得る。または
、例えばマーカー配列は、哺乳動物宿主（例えば、ＣＯＳ−７細胞）が使用され
る場合は、ヘマグルチニン（ＨＡ）タグであり得る。ＨＡタグは、インフルエン
ザヘマグルチニンタンパク質に由来するエピトープと一致する（Ｗｉｌｓｏｎ，
Ｉ．ら、Ｃｅｌｌ，３７：７６７（１９８４））。
【００５４】 用語「遺伝子」は、ポリペプチド鎖を産生することに関与するＤＮＡのセグメ
ントを意味する；それは、コード領域の前および後の領域（リーダーおよびトレ
イラー）、ならびに個々のコードセグメント（エキソン）間の介在配列（イント
ロン）を含む。
【００５５】 示されるように、本発明の核酸分子は、ＲＮＡの形態（例えば、ｍＲＮＡ）ま
たはＤＮＡの形態（例えば、クローニングによって得られるかまたは合成により
生成するｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡが挙げられる）であり得る。ＤＮＡは、二
本鎖であっても一本鎖であっても良い。一本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡは、センス
鎖としてもまた公知のコード鎖であっても、アンチセンス鎖とも呼ばれる非コー
ド鎖であってもよい。
【００５６】 用語「単離された」は、その物質が、その本来の環境（例えば、それが天然に
存在する場合は天然の環境）から取り出されていることを意味する。例えば、生
きている動物中に存在する、天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチ
ドは、単離されていないが、天然の系において共存する物質の一部または全てか
ら分離されている同じポリヌクレオチドまたはＤＮＡまたはポリペプチドは、単
離されている。このようなポリヌクレオチドは、ベクターの一部であり得るか、
および／またはこのようなポリヌクレオチドもしくはポリペプチドは、組成物の
一部であり得、そしてこのようなベクターまたは組成物はその天然の環境の一部
ではないという点で、依然として単離されている。単離されたＲＮＡ分子として
は、本発明のＤＮＡ分子のインビボまたはインビトロでのＲＮＡ翻訳産物が挙げ
られる。本発明による単離された核酸分子は、さらに、合成的に生成されるよう
な分子を含む。
【００５７】 本発明の単離された核酸分子としては、Ｃｋβ−６ ｃＤＮＡに対するオープ
ンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むＤＮＡ分子；成熟Ｃｋβ−６タンパク
質に対するコード配列を含むＤＮＡ分子；および上記の配列とは実質的に異なる
が、遺伝コードの縮重に起因して、依然として、Ｃｋβ−６ポリペプチドをコー
ドする配列を含むＤＮＡ分子が挙げられる。もちろん、遺伝コードは当該分野に
おいて周知である。従って、当業者が上記の縮重改変体を生成することは、慣用
的である。
【００５８】 本発明は、さらに、配列間に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも９０％
、そしてより好ましくは少なくとも９５％の同一性が存在する場合に、上記配列
にハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本発明は、特に、ストリンジ
ェントな条件下で、本明細書中上記のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポ
リヌクレオチドに関する。本明細書中において使用される場合に、用語「ストリ
ンジェントな条件」とは、配列間に少なくとも９５％、そして好ましくは少なく
とも９７％の同一性が存在する場合にのみ、ハイブリダイゼーションが起こるこ
とを意味する。好ましい実施形態において、本明細書中上記のポリヌクレオにハ
イブリダイズするポリヌクレオチドは、図１（配列番号１）のｃＤＮＡによって
コードされる成熟ポリペプチドまたは寄託されたｃＤＮＡと実質的に同じ生物学
的機能または活性のいずれかを保持するポリペプチドをコードする。
【００５９】 あるいは、ポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドにハイブリダイズ
する、少なくとも２０塩基、好ましくは３０塩基、より好ましくは少なくとも５
０塩基を有し得、そして本明細書中上記のようにそれに対する同一性を有し、そ
して活性を保持しても保持しなくてもよい。例えば、このようなポリヌクレオチ
ドは、例えば、ポリヌクレオチドの回収のためかまたは診断プローブもしくはＰ
ＣＲプライマーとして、配列番号１のポリヌクレオチドのためのプローブとして
使用され得る。
【００６０】 別の局面において、本発明は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条
件下で、上記の本発明の核酸分子（例えば、ＡＴＣＣ寄託番号７５７０３に含ま
れるｃＤＮＡクローン）のポリヌクレオチドの部分にハイブリダイズするポリヌ
クレオチドを含む、単離された核酸分子を提供する。「ストリンジェントなハイ
ブリダイゼーション条件」は、４２℃での５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１
５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭ クエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭ リン酸ナ
トリウム（ｐＨ７．６）、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液、１０％デキストラン
硫酸、および２０ｇ／ｍｌ変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中での一晩のイン
キュベーション、続いて０．１×ＳＳＣにおける約６５℃でのフィルター洗浄を
意図する。
【００６１】 ポリヌクレオチドの「部分」にハイブリダイズするポリヌクレオチドとは、参
照ポリヌクレオチドの少なくとも約１５ヌクレオチド（ｎｔ）、より好ましくは
少なくとも約２０ｎｔ、なおより好ましくは少なくとも約３０ｎｔ、そしてなお
より好ましくは少なくとも約３０〜７０ｎｔにハイブリダイズするポリヌクレオ
チド（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）を意図する。上記および以下でより詳細
に議論されるように、これらは、診断的なプローブおよびプライマーとして有用
である。
【００６２】 もちろん、参照ポリヌクレオチド（例えば、寄託されたｃＤＮＡクローン）の
より大きな部分（例えば、５０〜７５０ｎｔ長の部分）、または参照ポリヌクレ
オチドの全長にさえハイブリダイズするポリヌクレオチドもまた、本発明による
プローブとして有用である。なぜなら、寄託されたｃＤＮＡのヌクレオチド配列
または図１に示すようなヌクレオチド配列の全てでなければ大部分に対応するポ
リヌクレオチドであるからである。例えば、「長さが少なくとも２０ｎｔ」のポ
リヌクレオチド部分とは、参照ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列に由来する
２０以上の連続したヌクレオチドを意図する。示されるように、このような部分
は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．
およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ
．Ｙ．（１９８９）（この全開示が、本明細書中に参考として援用される）に記
載されるように、従来のＤＮＡハイブリダイゼーション技術によるプローブとし
てか、またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による標的配列の増幅のためのプ
ライマーとしてのいずれかで、診断的に有用である。
【００６３】 Ｃｋβ−６ ｃＤＮＡクローンは寄託され、そしてその決定されたヌクレオチ
ド配列は提供されたので、Ｃｋβ−６ ｃＤＮＡ分子の部分にハイブリダイズす
るポリヌクレオチドを生成することは、当業者に対して慣用的である。例えば、
Ｃｋβ−６ ｃＤＮＡクローンの制限エンドヌクレアーゼ切断または超音波処理
によるせん断が、Ｃｋβ−６ ｃＤＮＡ分子の一部にそれぞれハイブリダイズす
るポリヌクレオチドである種々の大きさのＤＮＡ部分を生成するために、容易に
使用され得る。
【００６４】 あるいは、本発明のこのハイブリダイズするポリヌクレオチドは、公知の技術
により合成的に産生され得る。もちろん、ポリＡ配列（例えば、ｃＤＮＡの３’
末端ポリ（Ａ）トラクト）に、またはＴ（もしくはＵ）残基の相補的なストレッ
チにのみハイブリダイズするポリヌクレオチドは、本発明の核酸の一部にハイブ
リダイズするために使用される本発明のポリヌクレオチドに含まれない。なぜな
ら、このようなポリヌクレオチドは、ポリ（Ａ）ストレッチを含む任意の核酸分
子またはその相補体（例えば、ほとんどすべて二本鎖ｃＤＮＡクローン）にハイ
ブリダイズするからである。
【００６５】 示されるように、Ｃｋβ−６ポリペプチドをコードする本発明の核酸分子は、
それ自体でこの成熟ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸分子；この成
熟ポリペプチドおよび付加配列についてのコード配列（例えば、リーダー配列ま
たは分泌配列（例えば、プレタンパク質配列、またはプロタンパク質配列、また
はプレプロタンパク質配列）をコードするもの）、付加的非コード配列（例えば
、イントロンおよび非コード５’および３’配列（例えば、転写、ｍＲＮＡプロ
セッシング、リボソーム結合およびｍＲＮＡの安定性において役割を果す転写さ
れるが翻訳されない配列（例えば、スプライシングシグナルおよびポリアデニル
化シグナルを含む）を含むがこれらに限定されないもの）、付加的アミノ酸をコ
ードする付加的なコード配列（例えば付加的な機能性を提供するもの）とともに
、上記の付加コード配列を有するか、または有さない、この成熟ポリペプチドの
コード配列を含み得るがこれらに限定されない。従って、このポリペプチドをコ
ードする配列は、マーカー配列（例えば、融合ポリペプチドの精製を容易にする
ペプチドをコードする配列）と融合され得る。本発明のこの局面の特定の好まし
い実施形態において、このマーカーアミノ酸配列は、ヘキサヒスチジンペプチド
であり（例えば、とりわけｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）に提供さ
れるタグ）、その多くは市販されている。Ｇｅｎｔｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８６：８２１−８２４（１９８９）に記述される
ように、例えば、ヘキサヒスチジンは、融合タンパク質の簡便な精製のために提
供される。「ＨＡ」タグは、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ３７：７６７（１９８
４）に記載される、インフルエンザ血球凝集素タンパク質に由来するエピトープ
と対応する、精製に有用な別のペプチドである。以下に議論するように、他のこ
のような融合タンパク質は、少なくとも、Ｎ末端またはＣ末端でＦｃに融合した
Ｃｋβ−６ポリペプチドまたはＣｋβ−６フラグメントを含む。
【００６６】 本発明はさらに、本発明の核酸分子の改変体に関し、これはＣｋβ−６ポリペ
プチドの一部、アナログまたは誘導体をコードする。改変体は、天然の対立遺伝
子改変体のように天然に存在し得る。「対立遺伝子改変体」とは、生物の染色体
上の所定の遺伝子座を占有する遺伝子のいくつかの代替的な形態のひとつを意図
する。Ｇｅｎｅｓ Ｖ，Ｌｅｗｉｎ，Ｂ．編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉ
ｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９４）。天然に存在しない改変体は
、当該分野において公知の変異誘発技術を使用して産生され得る。
【００６７】 そのような改変体は、ヌクレオチドの置換、欠失または付加により産生される
改変体を含む。この置換、欠失または付加は、１つ以上のヌクレオチドを含み得
る。この改変体は、コード領域、非コード領域またはその両方で変更され得る。
コード領域での変化は、保存的または非保存的な、アミノ酸の置換、欠失または
付加を産生し得る。これらの中で特に好ましいものは、サイレントな置換、付加
および欠失であり、これはＣｋβ−６ポリペプチドまたはその部分の特性および
活性を変化させない。この点について、また特に好ましいものは、保存的置換で
ある。最も高度に好ましいものは、本明細書中で記載される、寄託されたｃＤＮ
Ａクローンによってコードされる成熟タンパク質または成熟アミノ酸配列をコー
ドする核酸分子である。
【００６８】 本発明はさらに、配列番号２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドな
らびにそのフラグメント（このフラグメントは少なくとも３０塩基そして好まし
くは少なくとも５０塩基を有する）に対して、少なくとも７０％同一性、好まし
くは９０％同一性そしてより好ましくは少なくとも９５％同一性を有するポリヌ
クレオチド、ならびにこのようなポリヌクレオチドによりコードされるポリペプ
チドに関する。
【００６９】 本発明のさらなる実施形態は、以下のヌクレオチド配列に少なくとも９０％同
一、そしてより好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９
９％同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む、単離した核酸分
子を含む：（ａ）Ｃｋβ−６ポリペプチドまたはフラグメントをコードするヌク
レオチド配列であって、図１（配列番号２）のアミノ酸配列を有し、推定リーダ
ー配列を含む、ヌクレオチド配列；（ｂ）図１（配列番号２）のアミノ酸配列を
有するＣｋβ−６ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、Ｎ末端
メチオニンを除いて推定リーダー配列を含む、ヌクレオチド配列；（ｃ）成熟Ｃ
ｋβ−６ポリペプチド（リーダーが除去された全長ポリヌクレオチド）をコード
するヌクレオチド配列；（ｄ）寄託されたｃＤＮＡクローンによってコードされ
るリーダーを含む完全アミノ酸配列を有する全長ポリペプチドをコードするヌク
レオチド配列；（ｅ）寄託されたｃＤＮＡクローンによってコードされるＮ末端
メチオニンを除いてリーダー配列を含む完全アミノ酸配列を有する全長ポリペプ
チドをコードするヌクレオチド配列；（ｆ）寄託されたｃＤＮＡクローンによっ
てコードされるアミノ酸配列を有する成熟ポリペプチドをコードするヌクレオチ
ド配列；または（ｇ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）または（ｆ）の
ヌクレオチド配列のいずれかに相補的なヌクレオチド配列。
【００７０】 例えば、Ｃｋβ−６ポリペプチドをコードする参照ヌクレオチド配列に少なく
とも、例えば９５％「同一」のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとは
、そのポリヌクレオチド配列が、そのポリペプチドをコードする参照ヌクレオチ
ド配列の各１００ヌクレオチドあたり５つまでの点変異を含み得ることを除いて
、参照配列に同一であることを意図する。換言すれば、参照ヌクレオチド配列に
少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得る
ためには、参照配列のヌクレオチドの５％までが、欠失され得るか、または別の
ヌクレオチドで置換され得るか、あるいは、参照配列の総ヌクレオチドの５％ま
での数のヌクレオチドが、参照配列に挿入され得る。参照配列のこれらの変異は
、参照ヌクレオチド配列の５’末端位置もしくは３’末端位置で、またはこれら
の末端位置の間のどこかで、参照配列中のヌクレオチドの間に個々に散在してか
、または参照配列内で１つ以上連続する群として散在してかのいずれかで、起こ
り得る。
【００７１】 実際問題としては、任意の特定の核酸分子が、例えば、図１に示すヌクレオチ
ド配列に対してか、または寄託されたｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列に対
して、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同
一であるか否かは、Ｂｅｓｔｆｉｔ ｐｒｏｇｒａｍ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓ
ｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆ
ｏｒ Ｕｎｉｘ（登録商標），Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕ
ｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ，５７５ Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ ５３７１１）のような公知のコンピ
ュータプログラムを使用して従来的に決定され得る。Ｂｅｓｔｆｉｔは、Ｓｍｉ
ｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａ
ｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２：４８２−４８９（１９８１）の局在性相同性アルゴリ
ズムを使用し、２つの配列間の相同性の最善のセグメントを見出す。特定の配列
が、本発明による参照配列と、例えば、９５％同一であるか否かを決定するため
にＢｅｓｔｆｉｔまたは任意の他の配列アラインメントプログラムを使用する場
合、当然、パラメータは、同一性のパーセンテージが、参照ヌクレオチド配列の
全長にわたって算定されるように、そして参照配列におけるヌクレオチドの総数
の５％までのギャップを相同性中に許容するように、設定される。
【００７２】 当業者が理解するように、上で議論した配列決定の誤差の可能性、ならびに異
なる公知のタンパク質におけるリーダーの切断部位についての可変性に起因して
、寄託されたｃＤＮＡによってコードされる実際の成熟Ｃｋβ−６ポリペプチド
は、約９３個のアミノ酸を含むが、８６〜９９個ぐらいの範囲のアミノ酸であり
得；そしてこのタンパク質の実際のリーダー配列は、約２６個のアミノ酸である
が、約２０〜約３３個ぐらいの範囲のアミノ酸であり得る。
【００７３】 このような単離した分子、特にＤＮＡ分子は、染色体とのインサイチュハイブ
リダイゼーションによる遺伝子マッピングのため、および例えば、ノーザンブロ
ット分析によるヒト組織におけるＣｋβ−６の発現を検出するために、プローブ
として有用である。本発明はさらに、本明細書中に記載した単離した核酸分子の
フラグメントに関する。寄託されたＣｋβ−６ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列ま
たは図１（配列番号１）に示されたヌクレオチド配列を有する、単離された核酸
分子のフラグメントは、本明細書中に議論したような診断プローブおよびプライ
マーとして有用である、少なくとも約１５ｎｔ、そしてより好ましくは少なくと
も約２０ｎｔ、さらにより好ましくは少なくとも約３０ｎｔ、そしてなおより好
ましくは、少なくとも約４０ｎｔ長のフラグメントを意図する。もちろん、寄託
されたＣｋβ−６ｃＤＮＡのヌクレオチド配列または図１（配列番号１）に示さ
れたようなヌクレオチド配列の大部分（全てではない場合）に対応するフラグメ
ントのような、より大きいフラグメント５０〜５００ｎｔ長もまた、本発明によ
り有用である。例えば、少なくとも２０ｎｔ長のフラグメントにより、寄託した
ｃＤＮＡのヌクレオチド配列または図１（配列番号１）に示されたようなヌクレ
オチド配列からの２０個以上連続した塩基を含むフラグメントを意図する。この
遺伝子が寄託され、そして図１（配列番号１）に示されるヌクレオチド配列が提
供されるので、このようなＤＮＡフラグメントを作製することは、当業者に慣用
的である。例えば、制限エンドヌクレアーゼ切断または超音波処理によるせん断
は、種々のサイズのフラグメントを作製するために容易に使用され得る。あるい
は、このようなフラグメントは、合成的に作製され得る。
【００７４】 本発明の全長の遺伝子のフラグメントは、ｃＤＮＡライブラリーのためのハイ
ブリダイズプローブとして使用されて全長ｃＤＮＡを単離し得、そしてその遺伝
子と高い配列類似性または類似の生物学的活性を有する他のｃＤＮＡを単離し得
る。好ましくは、この型のプローブは少なくとも３０塩基を有し、そして例えば
、５０以上の塩基を含み得る。プローブはまた、全長転写物に対応するｃＤＮＡ
クローンおよびゲノムクローンまたは調節領域、プロモーター領域、エキソン、
およびイントロンを含む完全遺伝子を含むクローンを同定するために使用され得
る。スクリーニングの例は、オリゴヌクレオチドプローブを合成するための公知
のＤＮＡ配列を使用することにより遺伝子のコード領域を単離することを含む。
本発明の遺伝子の配列に相補的な配列を有する標識オリゴヌクレオチドは、ヒト
ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡのライブラリーをスクリーニングするた
めに使用され、そのプローブがハイブリダイズするライブラリーのメンバーを決
定する。
【００７５】 （ポリペプチドおよびポリペプチドフラグメント） 本発明はさらに、単離したポリペプチドに関連し、それは、図１（配列番号２
）の推定アミノ酸配列を有するか、または寄託されたｃＤＮＡによりコードされ
るアミノ酸配列を有する単離されたポリペプチド、ならびにこのようなポリペプ
チドのフラグメント、アナログおよび誘導体に関する。用語「ペプチド」および
「オリゴペプチド」は、（一般に認識されているように）同義とみなされ、そし
て各々の用語は、文脈がペプチド結合により結合した少なくとも２つのアミノ酸
の鎖を示すことが必要である場合に、互換可能に使用され得る。用語「ポリペプ
チド」は、１０個より多いアミノ酸残基を含む鎖について、本明細書中で使用さ
れる。本明細書中の全てのオリゴペプチドおよびポリペプチドの式または配列は
、アミノ末端からカルボキシ末端の方向に左から右に書かれる。
【００７６】 「Ｃｋβ−６活性を有するポリペプチド」とは、特定の生物学的アッセイにお
いて測定されるような、本発明のＣｋβ−６タンパク質（全長タンパク質または
好ましくは成熟タンパク質のいずれか）の活性に、類似する（同一である必要は
ない）活性を示すポリペプチドを意図する。Ｃｋβ−６タンパク質の活性は、実
施例５、６、７および８に記載されるアッセイによって測定され得る。例えば、
Ｃｋβ−６タンパク質の活性は、下の実施例７に開示されるインビトロ骨髄保護
（ｍｙｅｌｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）アッセイを使用して測定された。
【００７７】 簡単に述べると、系統枯渇集団の細胞（Ｌｉｎ-細胞）を、マウス骨髄から単
離し、そしてＣｋβ−６とともにまたは伴なわないで、複数のサイトカインの存
在下でインキュベートする。４８時間後、１セットのそれぞれの培養物は、５−
Ｆｕを受容し、次いで、インキュベーションをさらに２４時間続け、この時点で
、生存している低増殖能コロニー形成形成細胞（ＬＰＰ−ＣＦＣ）および高増殖
能コロニー形成細胞（ＨＰＰ−ＣＦＣ）の数を、当業者に公知の任意の適切なク
ローン原性アッセイによって決定した。
【００７８】 従って、「Ｃｋβ−６タンパク質活性を有するポリペプチド」は、上記アッセ
イにおいて、Ｃｋβ−６活性を示すポリペプチドを含む。活性の程度は、Ｃｋβ
−６タンパク質の活性と同一である必要はないが、好ましくは「Ｃｋβ−６タン
パク質活性を有するポリペプチド」は、Ｃｋβ−６タンパク質と比較する場合、
実質的に類似の活性を提示する（すなわち、候補ポリペプチドは、参照Ｃｋβ−
６タンパク質と比較して、より高い活性、または約２０分の１未満でない活性、
および好ましくは約１０分の１未満でない活性を提示する）。
【００７９】 本発明は、さらに、図１（配列番号２）のアミノ酸配列を有するか、寄託され
たｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列を有するＣｋβ−６ポリペプチド
、ならびにこのようなポリペプチドのフラグメント、アナログ、および誘導体に
関する。
【００８０】 用語「フラグメント」、「誘導体」および「アナログ」は、図１（配列番号２
）のポリペプチドまたは、寄託されたｃＤＮＡによってコードされるポリペプチ
ドを参照する場合、このようなポリペプチドと基本的に同じ生物学的機能または
活性を保持するポリペプチドを意味する。従って、アナログは、活性な成熟ポリ
ペプチドを産生するためのプロタンパク質部分の切断によって活性化され得るプ
ロタンパク質を包含する。
【００８１】 本発明のポリペプチドは、組換えポリペプチド、天然ポリペプチドまたは合成
ポリペプチドであり得、好ましくは、組換えポリペプチドであり得る。
【００８２】 図１（配列番号２）のポリペプチドあるいは寄託されたｃＤＮＡによりコード
されるポリペプチドのフラグメント、誘導体またはアナログは、（ｉ）その１つ
以上のアミノ酸残基が、保存的アミノ酸残基または非保存的アミノ酸残基（好ま
しくは保存的アミノ酸残基）で置換され、そしてそのような置換アミノ酸残基は
、遺伝コードによってコードされるアミノ酸残基であってもよく、またはそうで
なくてもよい、フラグメント、誘導体またはアナログ、あるいは（ｉｉ）その１
つ以上のアミノ酸残基が置換基を有する、フラグメント、誘導体またはアナログ
、あるいは（ｉｉｉ）その成熟ポリペプチドが他の化合物（例えば、ポリペプチ
ドの半減期を増加させる化合物（例えば、ポリエチレングリコール））と融合さ
れる、フラグメント、誘導体またはアナログ、あるいは（ｉｖ）リーダーもしく
は分泌配列、または成熟ポリペプチドの精製に利用される配列、またはプロタン
パク質配列のような、付加的アミノ酸が成熟ポリペプチドと融合されている、フ
ラグメント、誘導体、またはアナログであり得る。このようなフラグメント、誘
導体およびアナログは、本明細書中の教示から、当業者の範囲内であるとみなさ
れる。
【００８３】 本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、好ましくは、単離された形
で提供され、そして好ましくは均質に精製される。
【００８４】 本発明のポリペプチドは、配列番号２のポリペプチド（特に、成熟ポリペプチ
ド）、ならびに配列番号２のポリペプチドと、少なくとも７０％の類似性（好ま
しくは、少なくとも７０％の同一性）、より好ましくは少なくとも９０％の類似
性（より好ましくは少なくとも９０％の同一性）、そしてさらにより好ましくは
少なくとも９５％の類似性（好ましくは少なくとも９５％の同一性）を有するポ
リペプチドを含み、少なくとも３０アミノ酸、そしてより好ましくは少なくとも
５０アミノ酸を一般的に含むポリペプチドのこのような部分をともなうこのよう
なポリペプチドの部分もまた含む。
【００８５】 当該分野において公知であるように、二つのポリヌクレオチド間の「類似性」
は、１つのポリペプチドのアミノ酸配列およびその保存されたアミノ酸置換を、
第２のポリペプチドの配列と比較することによって決定される。
【００８６】 当然、遺伝子コードの縮重により、当業者は、寄託されたｃＤＮＡ（ＡＴＣＣ
７５７０３）の核酸または図１（配列番号１）に示される核酸配列と、少なくと
も９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一の配列を有する多
くの核酸分子が、「Ｃｋβ−６タンパク質活性を有する」ポリペプチドをコード
することを直ちに認識する。実際、これらヌクレオチド配列の縮重改変体は全て
同じポリペプチドをコードするので、これは上記の比較アッセイを行わずとも当
業者には明らかである。縮重改変体でないこのような核酸分子について、妥当な
数がＣｋβ−６タンパク質活性を有するポリペプチドをコードすることが、当該
分野においてさらに認識される。これは、当業者が、タンパク質機能を有意にも
たらすことは少ないようであるか、または有意にはもたらさないようであるかの
いずれかであるアミノ酸置換（例えば、１つの脂肪族アミノ酸を第２の脂肪族ア
ミノ酸で置換すること）を完全に知っているからである。
【００８７】 例えば、表現型的にサイレントなアミノ酸置換を作製する方法に関するガイダ
ンスが、Ｂｏｗｉｅ．Ｊ．Ｕ．ら、「Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｅｓ
ｓａｇｅ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ
ｔｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ」Ｓｃｉｅｎｃｅ
２４７：１３０６−１３１０（１９９０）に提供されており、その中で著者らは
、変化に対するアミノ酸配列の寛容性を研究するための２つの主なアプローチが
存在することを示す。第１の方法は進化の過程に依存し、ここで変異は自然選択
によって受け入れられるか、または拒絶されるかのいずれかである。第２のアプ
ローチは、遺伝子操作を使用して、クローニングされた遺伝子の特定の位置にア
ミノ酸の変化を導入し、そして選択またはスクリーニングを使用して機能性を維
持する配列を同定する。著者らがいうように、これらの研究は、タンパク質がア
ミノ酸置換に対して驚くべきほど寛容であることを明らかにしてきた。著者らは
さらに、どのアミノ酸変化がタンパク質の特定の位置において許容的である可能
性があるかを示す。例えば、大部分の埋没したアミノ酸残基は、非極性側鎖を必
要とするが、一方、表面側鎖の特徴は一般的にほとんど保存されていない。他の
このような表現型的にサイレントな置換は、Ｂｏｗｉｅ，Ｊ．Ｕ．ら（前出）お
よびそこに引用される参考文献中に記載される。
【００８８】 本発明のポリペプチドのフラグメントまたは部分は、ペプチド合成によって対
応する全長ポリペプチドを作製するために使用され得る；従って、フラグメント
は、全長ポリペプチドを作製するための中間体として使用され得る。本発明のポ
リヌクレオチドのフラグメントまたは部分は、本発明の全長ポリヌクレオチドを
合成するために使用され得る。
【００８９】 翻訳タンパク質の、小胞体の管腔への、周辺腔へのまたは細胞外環境への分泌
について、適切な分泌シグナルが、発現されるポリペプチドに組み込まれ得る。
このシグナルは、このポリペプチドに対して内因性であり得るか、またはこれら
は、異種のシグナルであり得る。
【００９０】 さらに、本発明のポリペプチドはまた、いくつかの場合において、宿主媒介プ
ロセスの結果として、最初の改変されたメチオニン残基を含み得る。従って、一
般に、翻訳開始コドンによってコードされるＮ末端メチオニンが、すべての真核
生物細胞における翻訳後の任意のタンパク質から高い効率で除去されることは当
該分野において周知である。ほとんどのタンパク質におけるＮ末端メチオニンも
また、ほとんどの原核生物において効率的に除去されるが、いくつかのタンパク
質について、この原核生物除去プロセスは、Ｎ末端メチオニンが共有結合してい
るアミノ酸の性質に依存して、非効率的である。従って、Ｎ末端メチオニンを欠
失する全長Ｃｋβ−６ポリペプチドは、具体的に、本発明によって意図される。
さらに、多くの場合において、Ｎ末端メチオニンをＮ末端短縮Ｃｋβ−６ポリペ
プチド（そうでなければ、アミノ末端メチオニンを欠失する）に加えて、例えば
、Ｅ．ｃｏｌｉのような細菌において組換え技術によって効率的な発現を達成す
ることが有益であり得る。
【００９１】 ポリペプチドは、融合タンパク質のような改変された形態で発現され得、そ
して分泌シグナルだけでなく、さらなる異種機能性領域もまた含み得る。例えば
、さらなるアミノ酸（特に荷電アミノ酸）の領域は、精製の間、または連続した
操作および保存の間に、宿主細胞における安定性および持続性を改善するために
、ポリペプチドのＮ末端に付加され得る。また、精製を容易にするためにペプチ
ド部分がポリペプチドに付加され得る。そのような領域は、ポリペプチドの最終
調製の前に除去され得る。とりわけ、分泌または排出を生じるため、安定性を改
善するため、および精製を容易にするためのペプチド部分のポリペプチドへの付
加は、当該分野で公知であり、そして慣用的な技術である。好ましい融合タンパ
ク質は、タンパク質を可溶性にするのに有用な免疫グロブリン由来の異種領域を
含む。例えば、ＥＰ−Ａ−Ｏ ４６４ ５３３（カナダ対応出願第２０４５８６
９号）は、別のヒトタンパク質、またはその一部とともに免疫グロブリン分子の
定常領域の種々の部分を含む融合タンパク質を開示する。多くの場合、融合タン
パク質中のＦｃ部分は、治療および診断における使用に十分に有利であり、従っ
て、例えば改善された薬物動態学的特性を生じる（ＥＰ−Ａ ０２３２ ２６２
）。一方、いくつかの使用について、融合タンパク質が、記載される有利な様式
で、発現され、検出され、そして精製された後に、Ｆｃ部分を欠失し得ることが
望ましい。これは、Ｆｃ部分が、治療および診断における使用に対して障害とな
ると判明する場合（例えば、融合タンパク質が免疫のための抗原として使用され
るべき場合）である。薬物探索において、例えば、ｈＩＬ５−レセプターのよう
なヒトタンパク質は、ｈＩＬ−５のアンタゴニストを同定するための高処理能力
スクリーニングアッセイの目的で、Ｆｃ部分と融合されている。Ｂｅｎｎｅｔｔ
，Ｄ．ら、 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉ
ｏｎ ８：５２−５８（１９９５）；およびＪｏｈａｎｓｏｎ，Ｋら、Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０（１６）：９４５９−９４７１（１９９５）を参照のこ
と。
【００９２】 Ｃｋβ−６タンパク質は、硫酸アンモニウム沈澱またはエタノール沈澱、酸抽
出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマ
トグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグ
ラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマト
グラフィーを含む周知の方法によって組換え細胞培養物から回収され、そして精
製され得る。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）が
精製のために用いられる。本発明のポリペプチドは以下を含む：天然の精製産物
；化学合成手順の産物；および原核生物宿主または真核生物宿主（例えば、細菌
細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を含む）から組
換え技術によって産生された産物。組換え産生手順において用いられる宿主に依
存して、本発明のポリペプチドは、グリコシル化されていてもよく、またはグリ
コシル化されていなくてもよい。さらに、本発明のポリペプチドはまた、いくつ
かの場合、宿主媒介プロセスの結果として、改変された開始メチオニン残基を含
み得る。
【００９３】 本発明のＣｋβ−６／ＭＰＩＦ−２アゴニストおよびアンタゴニストポリペプ
チドを産生する方法は、当該分野で周知であり、そして本明細書中および米国特
許第５，９１２，３２７号に見出され得る。
【００９４】 Ｃｋβ−６ポリペプチドのいくつかのアミノ酸配列は、タンパク質の構造また
は機能に有意な影響を及ぼさずに改変し得ることが、当該分野において認識され
る。配列におけるそのような相違が考慮される場合、活性を決定するタンパク質
上の重要な領域が存在することを覚えておくべきである。一般的に、類似の機能
を果す残基が使用される限り、三次構造を形成する残基を置換することは可能で
ある。他の例において、タンパク質の非重要な領域で変化が生じる場合、残基の
型は、完全に重要でないかもしれない。
【００９５】 従って、本発明はさらに、実質的にＣｋβ−６ポリペプチド活性を示すか、ま
たは以下で議論されるようなタンパク質の一部としてＣｋβ−６タンパク質の領
域を含むＣｋβ−６ポリぺプチドの変化を含む。このような変異体は、欠失、挿
入、反転、反復、および型置換（例えば、ある親水性残基の別のものへの置換（
しかし、概して、強い親水性から強い疎水性への置換でない））を含む。低荷電
アミノ酸または、そのような「中性」アミノ酸の置換は一般的に活性に対してほ
とんど影響を与えない。
【００９６】 代表的に、以下のものが、保存的置換とみなされる；脂肪族アミノ酸Ａｌａ，
Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅ間のあるものから別のものへの置換：ヒドロキシル
残基ＳｅｒおよびＴｈｒの交換、酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの交換、アミド残
基ＡｓｎおよびＧｌｎ間での置換、塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇの交換、なら
びに芳香族残基Ｐｈｅ、Ｔｙｒ間の置換。
【００９７】 荷電アミノ酸の、別の荷電アミノ酸または中性アミノ酸での置換もまた、さら
に特に興味深い。これは、改善された特徴（例えば、より少ない凝集）を有する
タンパク質を生じ得る。凝集の防止は、非常に望ましい。タンパク質の凝集は、
凝集物が免疫原性であり得るため、活性を低下させるだけでなく、薬学的処方物
を調製する場合にもまた問題ともなり得る。（Ｐｉｎｃｋａｒｄら、Ｃｌｉｎ．
Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：３３１−３４０（１９６７）；Ｒｏｂｂｉｎｓら
、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ３６：８３８−８４５（１９８７）；Ｃｌｅｌａｎｄら、
Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙ
ｓｔｅｍｓ １０：３０７−３７７（１９９３））。
【００９８】 アミノ酸の置換はまた、細胞表面レセプターに対するリガンドの結合の選択性
を変化させ得る。例えば、Ｏｓｔａｄｅら、Ｎａｔｕｒｅ ３６１：２６６−２
６８（１９９３）は２つの公知のタイプのＴＮＦレセプターの１つのみへのＴＮ
Ｆ−αの選択的な結合を生じる特定のＴＮＦ−α変異を記載する。
【００９９】 上記で詳細に示したように、表現型的にサイレント（すなわち、機能的に有意
に有害な影響を有するようでない）であるようなアミノ酸変化に関連したさらな
るガイダンスは、Ｂｏｗｉｅ，Ｊ．Ｕ．ら「Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ ｔｈｅ
Ｍｅｓｓａｇｅ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：Ｔｏｌｅｒａｎｃ
ｅ ｔｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ」Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ ２４７：１３０６−１３１０（１９９０）（表１を参照のこと）に見出され
得る。
【０１００】 示されるように、変化は、好ましくは、マイナーな性質のものであり、例えば
タンパク質のフォールディングまたは活性に有意に影響を与えない保存的アミノ
酸置換である（表１を参照のこと）。
【０１０１】
【表１】 当然、当業者が作製するアミノ酸置換の数は、上記に記載したものを含む多く
の因子に依存する。一般的に言うと、本発明の任意の所定のＣｋβ−６ポリペプ
チドに対する置換の数は、５０、４０、３０、２５、２０、１５、１０、９、８
、７、６、５、４、３、２、または１より大きくない。
【０１０２】 当業者に公知の組換えＤＮＡ技術は、新規のタンパク質を作製するために使用
され得る。ムテインおよび欠失タンパク質または融合タンパク質は、例えば、活
性の上昇または安定性の増加を示し得る。さらに、それらは高い収率で精製され
、そして少なくとも特定の精製および保存条件下において、より優れた溶解性を
示し得る。以下に列挙するのは、構築され得る変異体のさらなる例である。
【０１０３】 （Ｃｋβ−６アミノ末端およびカルボキシ末端欠失） インターフェロンγは、このタンパク質のカルボキシ末端から８〜１０個のア
ミノ酸残基を欠失させることにより、１０倍まで高い活性を示す（Ｄｏｂｅｌｉ
ら， Ｊ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：１９９−２１６（１９８８））
。Ｒｏｎら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８（４）：２９８４−２９８８（１
９９３））は、３、８、または２７のＮ末端アミノ酸残基が欠失した場合でさえ
、ヘパリン結合活性を有した改変ＫＧＦタンパク質を報告した。多くの他の例が
、当業者に公知である。
【０１０４】 今回の場合、実施例３の方法に従って産生されたＣ末端Ｃｋβ−切片を含むＣ
ｋβ−６ポリペプチド組成物が、Ｃｋβ−６ポリペプチド活性を保持することが
示されている。さらに、本発明のタンパク質がケモカインポリペプチドファミリ
ーのメンバーであるので、配列番号２（Ｃｙｓ−７）の位置７のシステインまで
のＮ末端アミノ酸の欠失、および配列番号２（Ｃｙｓ−４８）の位置４８のシス
テインまでのＣ末端アミノ酸の欠失は、レセプター結合または標的細胞活性の調
節のようないくらかの生物学的活性を保持し得る。Ｃｙｓ−７またはＣｙｓ−４
８を含むＮ−末端欠失およびＣ−末端欠失をさらに有するポリペプチドは、この
ような生物学的活性を保持することを期待されない。なぜなら、ケモカイン関連
ペプチドにおけるこれらの残基は、レセプター結合およびシグナル伝達に必要と
される構造安定性を提供するジスルフィド架橋を形成することに必要とされるこ
とが、公知であるからである。
【０１０５】 しかし、タンパク質のＮ末端またはＣ末端からの１つ以上のアミノ酸の欠失が
、タンパク質の１つ以上の生物学的機能の損失の改変を生じるとしても、他の生
物学的活性はなお保持され得る。従って、短縮化されたタンパク質の、タンパク
質の完全な形態または成熟形態を認識する抗体を誘導する能力および／またはそ
の抗体に結合する能力は、タンパク質の完全な形態または成熟形態の残基の大部
分より少ない残基がＮ末端またはＣ末端から除去された場合には、一般的に保持
される。完全なタンパク質のＮ末端残基またはＣ末端残基を欠く特定のポリペプ
チドがこのような免疫学的活性を保持するかどうかは、本明細書中に記載される
慣用的な方法、およびそうでなければ当該分野において公知の慣用的な方法によ
って、容易に決定され得る。
【０１０６】 従って、本発明はさらに、配列番号２に示されるＣＫβ−６ポリペプチドのア
ミノ酸配列のアミノ末端から１つ以上の残基（７位のシステイン残基まで）を欠
失したポリペプチドを提供する。同様に、本発明は、配列番号２に示されるポリ
ペプチドＣｋβ−６のアミノ酸配列のカルボキシ末端から４８位のシステインま
で欠失される１以上の残基を有するぽりペプチドを提供する。特に本発明は、配
列番号２の残基ｎ〜９３のアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する（ここで
ｎは１〜７の範囲の整数である）。同様に、本発明は、配列番号２のアミノ酸配
列の残基１〜ｍのアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する（ここで、ｍは、
４８〜９３の範囲の任意の整数である）。
【０１０７】 本発明はまた、アミノ末端およびカルボキシル末端の両方から欠失された１以
上のアミノ酸を有するポリペプチドを提供し、これは、配列番号２の残基ｘ−ｎ
−ｍを有するものとして一般に記載され得る（ここで、上記のようにｎおよびｍ
は整数であり、そしてｘは、ＮＨ2またはメチオニンであり得る）。
【０１０８】 より詳細には、本発明は、以下のアミノ酸残基を有するポリペプチドを提供す
る：
【０１０９】
【化１】 配列番号２の全部。上記のポリペプチドはまた、Ｎ−末端メチオニンを有し得る
。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドがまた、提供される。Ａ
ＣＴＴ寄託番号７５７０３に含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされた完
全Ｃｋβ−６アミノ酸配列の一部からなるポリペプチドをコードするヌクレオチ
ド配列も含む（ここで、この一部は、ＡＴＣＣ寄託番号７５７０３に含まれるｃ
ＤＮＡクローンによってコードされた成熟アミノ酸配列のアミノ末端由来の１〜
約６個のアミノ酸、またはＡＴＣＣ寄託番号７５７０３に含まれるｃＤＮＡクロ
ーンによってコードされた完全アミノ酸配列の、カルボキシ末端由来の１〜約４
５個のアミノ酸、もしくは上記アミノ末端欠失およびカルボキシ末端欠失の任意
の組合せを除く）。上記の欠失変異ポリペプチド形態の全部をコードするポリヌ
クレオチドがまた、提供される。
【０１１０】 特に好ましいＣｋβ−６ Ｃ末端切片は、以下に示される（番号付けは、配列
番号２に示される）： Ｖａｌ（１）〜Ａｌａ（７８）； Ｖａｌ（１）〜Ａｌａ（７６）； Ｖａｌ（１）〜Ａｌａ（７５）；および Ｖａｌ（１）〜Ａｌａ（７３）。
【０１１１】 （アミノ酸の置換） 本発明のさらなる局面はまた、アミノ酸の置換を含む。タンパク質の折り畳み
に有意に影響しない保存的アミノ酸置換が、特に興味深い。当業者に公知の保存
的アミノ酸置換の実施例が、上の表１に記載されている。
【０１１２】 特に興味深いのは、荷電したアミノ酸を、別の荷電したアミノ酸または中性ア
ミノ酸で置換することである。これにより、低い凝集のような改善された特性を
有するタンパク質が得られる。凝集の防止は、高く所望されている。タンパク質
の凝集は、活性を低下させるだけではなく、薬学的処方物を調製する場合にもま
た問題ともなり得る。なぜなら、凝集物は免疫原性であり得るからである（Ｐｉ
ｎｃｋａｒｄら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：３３１−３４０（１
９６７）；Ｒｏｂｂｉｎｓら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ３６：８３８−８４５（１９
８７）；Ｃｌｅｌａｎｄら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒ
ｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ １０：３０７−３７７（１９９３））
。
【０１１３】 Ｃｋβ−６タンパク質は、天然の改変体またはヒトの操作のいずれか由来の、
１個または数個のアミノ酸置換体、欠失体または付加体を含み得る。いくつかの
好ましい変異体の例は、以下である： Ｌｙｓ（４２）〜Ｓｅｒ Ｌｙｓ（４３）〜Ｓｅｒ。 配列番号２の４２位および４３位のこのリジン残基は、他のケモカインに結合す
るヘパリンに必要とされると公知の部位に対応する。これらの置換体は、Ｃｋβ
−６がヘパリンと結合する能力を破壊することによってＣｋβ−６アンタゴニス
トを産生すると期待されている（Ｇｒａｈａｍ，Ｇ．Ｌ．ら，ＥＭＢＯ １５：
６５０６−１５（１９９６））。
【０１１４】 Ａｓｐ（５０）〜Ａｌａ，Ｇｌｙ，Ｓｅｒ，ＴｈｒまたはＭｅｔ， Ａｓｐ（６４）〜Ａｌａ，Ｇｌｙ，Ｓｅｒ，ＴｈｒまたはＭｅｔ， 配列番号２のＡｓｐ−５０およびＡｓｐ−６４の置換体は、このようなポリペプ
チドの二量体化能力を改良することによってＣｋβ−６ポリペプチド活性を増加
すると本明細書中で発明者によって期待されている。
【０１１５】 Ｐｈｅ（４７）〜Ｓｅｒ 実施例３で産生されたポリペプチド組成物は、配列番号２のＰｈｅ−４７をコー
ドするコドン−ＴＴＣ−の改変体を含むと考えられている。このような改変体は
、Ｓｅｒをコードするコドン−ＴＣＣ−においてえら得る。この改変体は、実施
例３に記載されるようにＣｋβ−６ ｃＤＮＡを発現ベクターにサブクローニン
グする間に使用されるポリメラーゼ連鎖反応の間にＴａｇ ＤＮＡポリメラーゼ
によって産生されると考えられる。Ｔａｇポリメラーゼは、完全よりも低い忠実
度を有することが当業者に公知である。
【０１１６】 本発明は、Ｃｋβ−６アゴニストポリペプチドをさらに提供し、ここで、この
ポリペプチドのアミノ末端は、配列番号２の残基２または残基３から選択される
残基であり、そしてこのポリペプチドのカルボキシ末端は、ｍ残基であり、ここ
で、ｍは、配列番号２の残基４８〜残基９３の任意の残基である。本発明に従っ
た特定のＣｋβ−６アゴニストは、以下を含む：Ｖａｌ（１）〜Ａｌａ（７８）
；Ｖａｌ（１）〜Ｖａｌ（７７）；Ｖａｌ（１）〜Ａｌａ（７６）；Ｖａｌ（１
）〜Ａｌａ（７５）；Ｖａｌ（１）〜Ａｌａ（７３）；Ｖａｌ（２）〜Ａｌａ（
７８）；Ｖａｌ（２）〜Ｖａｌ（７７）；Ｖａｌ（２）〜Ａｌａ（７６）；Ｖａ
ｌ（２）〜Ａｌａ（７５）；Ｖａｌ（２）〜Ａｌａ（７３）；Ｉｌｅ（３）〜Ａ
ｌａ（７８）；Ｉｌｅ（３）〜Ｖａｌ（７７）；Ｉｌｅ（３）〜Ａｌａ（７６）
；Ｉｌｅ（３）〜Ａｌａ（７５）；Ｉｌｅ（３）〜Ａｌａ（７３）。本発明のア
ゴニストは、ＮＨ2またはＮ末端に結合したメチオニンであり得る。
【０１１７】 本発明は、Ｃｋβ−６アゴニストにさらに関する。特に、成熟Ｃｋβ−６タン
パク質の最初の３個のＮ末端アミノ酸残基の欠失（すなわち、配列番号２のＶａ
ｌ（１）〜Ｉｌｅ（３）の欠失）は、拮抗活性を有するポリペプチドにおいて生
じる。従って、本発明に従って、Ｃｋβ−６アンタゴニストが提供され、ここで
、このアミノ末端は、配列番号２の残基４であり、そしてカルボキシル末端は、
残基ｍであり、ここで、ｍは、配列番号２の残基４８〜残基９３の任意の残基で
ある。本発明に従った特定のＣｋβ−６アンタゴニストは、以下を含むが、これ
らの限定されない：Ｐｒｏ（４）〜Ａｒｇ（７３）；Ｐｒｏ（４）〜Ａｒｇ（７
５）；Ｐｒｏ（４）〜Ａｌａ（７６）；Ｐｒｏ（４）〜Ａｌａ（７８）。必要に
応じて、本発明のＣｋβ−６アンタゴニストは、Ｎ末端にＭｅｔ残基を含み得る
。
【０１１８】 本発明のＣｋβ−６アンタゴニスト（ＭＰＩＦ−２（Ｐ３０−Ｒ９９）；配列
番号２のＰ４−Ｒ７３）が、Ｃｋβ−６の活性およびＣｋβ−６のアンタゴニス
トだけでなく、他のケモカイン（例えば、Ｃｋβ−１０およびＥｏｔａｘｉｎ）
の活性を阻害することを発見した（以下の実施例１３を参照のこと：ここで、本
発明のＣｋβ−６アンタゴニストポリペプチドが、Ｃｋβ−６、Ｃｋβ−１０、
またはＥｏｔａｘｉｎによって駆動された好酸球走化性を阻害することが示され
た）。Ｃｋβ−６、Ｃｋβ−１０、およびＥｏｔａｘｉｎの全ては、ＣＣＲレセ
プターを介して好酸球での効果を媒介する。従って、本発明のアンタゴニストポ
リペプチドは、この効果を媒介するケモカインに関係なく、ＣＣＲ３レセプター
シグナル伝達を阻害し得る、優性のアンタゴニストを示す。従って、本発明によ
って、ＣＣＲ３レセプターを発現する細胞に本発明の有効量のＣｋβ−６アゴニ
ストを投与する工程を包含する、ＣＣＲ３レセプターシグナル伝達経路を阻害す
るために方法が、提供される。Ｃｋβ−６アゴニストの有効量および好酸球の活
性に起因するいくつかの疾患状態を、以下で議論する。
【０１１９】 本発明のＣｋβ−６アンタゴニスト（ＭＰＩＦ−２（Ｐ３０−Ｒ９９）；配列
番号２のＰ４−Ｒ７３）は、好酸球に対して完全に失活したアゴニスト活性を示
すが、また、骨髄の骨髄プロジェニター細胞のコロニー形成を阻害する完全（お
よびわずかに増強された）能力を保持する（実施例１４を参照のこと）。
【０１２０】 Ｎ末端欠失およびＣ末端欠失を有するＣｋβ−６ポリペプチドを含む、Ｃｋβ
−６ポリペプチドが上記の１以上の置換体を含み得ることが、当業者によって理
解される。
【０１２１】 本発明のポリペプチドは、好ましくは、単独形態で提供され、そして好ましく
は、実質的に精製される。Ｃｋβ−６ポリペプチドの組換え産物は、Ｓｍｉｔｈ
およびＪｏｈｎｓｏｎ，Ｇｅｎｅ６７：３１−４０（１９８８）に記載される、
１工程方法によって実質的に精製され得る。
【０１２２】 本発明のポリペプチドは、リーダーを含む寄託されたｃＤＮＡによってコード
されるポリペプチド、Ｎ末端メチオニンと予測されるリーダーを含む寄託された
ｃＤＮＡによってコードされるポリペプチド、リーダーを差し引いた寄託された
ｃＤＮＡによってコードされる成熟ポリペプチド（すなわち、成熟タンパク質）
、リーダーを含む図１のポリペプチド（配列番号２）、Ｎ末端メチオニンと予想
されるリーダーを含む図１のポリペプチド（配列番号２）、リーダーを差し引い
た図１のポリペプチド（配列番号２）、ならびに上記のポリペプチドに少なくと
も９０％の類似性、より好ましくは少なくとも９５％の類似性、およびさらによ
り好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％の類似性を有す
るポリペプチドを含む。発明のさらなるポリペプチドは、寄託されたｃＤＮＡに
よってコードされるポリペプチドまたは図１（配列番号２）のポリペプチドに、
少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも９０％または９５％同一、さ
らにより好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％同一であ
るポリペプチドを含み、そしてまた、少なくとも３０アミノ酸、およびより好ま
しくは少なくとも５０アミノ酸を有するこのようなポリペプチドの部分を含む。
【０１２３】 ２つのポリペプチドについての「％類似性」によって、Ｂｅｓｔｆｉｔプログ
ラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａ
ｇｅ， Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ（登録商標）， Ｇｅｎｅｔｉ
ｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒ
ｃｈ Ｐａｒｋ， ５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ， Ｍａｄｉｓｏｎ，
ＷＩ ５３７１１）および類似性を決定するための初期設定（ｄｅｆａｕｌｔ
ｓｅｔｔｉｎｇ）を用いて２つのポリペプチドのアミノ酸配列を比較すること
によって生じる類似性の値が意図される。Ｂｅｓｔｆｉｔは、Ｓｍｉｔｈおよび
Ｗａｔｅｒｍａｎ（Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａ
ｔｉｃｓ ２：４８２−４８９ （１９８１））の局所的相同性アルゴリズムを
、２つの配列間の類似性の最適のセグメントを見出すために使用する。
【０１２４】 Ｃｋβ−６ポリペプチドの参照アミノ酸配列に少なくとも、例えば、９５％「
同一な」アミノ酸配列を有するポリペプチドにより、このポリペプチドがＣｋβ
−６ポリペプチドの参照アミノ酸配列の各１００アミノ酸毎に５つまでのアミノ
酸変化を含み得ることを除いて、ポリペプチドのアミノ酸配列は参照配列と同一
であることが意図される。言い換えれば、参照アミノ酸配列に少なくとも９５％
同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るために、参照配列において５％
までのアミノ酸残基が、欠失されるかもしくは別のアミノ酸で置換され得るか、
または参照配列における５％までの総アミノ酸残基の多数のアミノ酸が参照配列
に挿入され得る。これらの参照配列の改変は、参照アミノ酸配列のアミノ末端位
置もしくはカルボキシ末端位置で、または参照配列の残基間で個々に、もしくは
参照配列内で１つ以上の近接したグループ内のいずれかに分散される末端位置の
間のどこかで、起こり得る。
【０１２５】 実際には、任意の特定のポリペプチドが、例えば、図１（配列番号２）に示さ
れるアミノ酸配列、または寄託されたｃＤＮＡクローンによりコードされるアミ
ノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、また
は９９％同一であるかどうかは、Ｂｅｓｔｆｉｔプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉ
ｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ， Ｕｎｉｘ（登録
商標）用バージョン８、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ， ５７５ Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ Ｄｒｉｖｅ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ ５３７１１）のような公知のコン
ピュータープログラムを使用して慣習的に決定され得る。特定の配列が、例えば
、本発明の参照配列に９５％同一であるかどうかを決定するために、Ｂｅｓｔｆ
ｉｔまたは任意の他の配列アラインメントプログラムを使用する場合、当然、同
一性の百分率が参照アミノ酸配列の全長にわたって計算され、そして参照配列内
のアミノ酸残基の総数の５％までの相同性におけるギャップが許容されるような
パラメーターが設定される。
【０１２６】 本発明のポリペプチドは、当業者に周知の方法を用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲ
ルまたは分子ふるいゲル濾過カラムにおいて分子量マーカーとして使用され得る
。
【０１２７】 （免疫原性および抗原性フラグメント） 下記に詳細に記載するように、本発明のポリペプチドはまた、下記のようにＣ
ｋβ−６タンパク質発現を検出するためのアッセイにおいて有用である、または
Ｃｋβ−６タンパク質機能を増強もしくは阻害し得るアゴニストおよびアンタゴ
ニストとして、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を惹起するために
使用され得る。さらに、このようなポリペプチドは、本発明の候補アゴニストお
よびアンタゴニストでもあるＣｋβ−６タンパク質結合タンパク質を「捕獲する
」ための酵母ツーハイブリッドシステムにおいて使用され得る。酵母ツーハイブ
リッドシステムは、ＦｉｅｌｄｓおよびＳｏｎｇ，Ｎａｔｕｒｅ ３４０：２４
５−２４６（１９８９）に記載されている。
【０１２８】 別の局面において、本発明は、本発明のポリペプチドのエピトープ保有部分を
含むペプチドまたはポリペプチドを提供する。このポリペプチド部分のエピトー
プは、本発明のポリペプチドの免疫原性または抗原性エピトープである。「免疫
原性エピトープ」とは、タンパク質全体が免疫原である場合、抗体応答を誘発す
るタンパク質の一部として定義される。これら免疫原性エピトープは、少数の分
子の座位上で制限されると考えられる。一方で、抗体が結合し得るタンパク質分
子の領域は、「抗原性エピトープ」と定義される。タンパク質の免疫原性エピト
ープの数は、一般的に抗原性エピトープの数よりも少ない。例えば、Ｇｅｙｓｅ
ｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：３９９８−４０
０２（１９８３）を参照のこと。
【０１２９】 抗原性エピトープを保有する（すなわち、抗体が結合し得るタンパク質分子の
領域を含む）ペプチドまたはポリペプチドの選択に関して、タンパク質配列の一
部を模倣する比較的短い合成ペプチドが、部分的に模倣されたタンパク質と反応
する抗血清を慣用的に誘発し得ることが当該分野で周知である。例えば、Ｓｕｔ
ｃｌｉｆｆｅ，Ｊ．Ｇ．らＳｃｉｅｎｃｅ ２１９：６６０−６６６（１９８３
）を参照のこと。
【０１３０】 タンパク質反応性血清を誘発し得るペプチドは、タンパク質の一次配列で頻繁
に示され、一連の単純な化学的法則により特徴付けられ得、そしてインタクトな
タンパク質の免疫優性領域（すなわち、免疫原性エピトープ）にも、アミノ末端
またはカルボキシル末端にも、制限されない。極端に疎水性で、かつ６個または
それ以下の残基であるペプチドは、一般的に、模倣タンパク質に結合する抗体の
誘導において非効率的であり；特にプロリン残基を含む、より長いペプチドは通
常、効率的である。Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら（前出）６６１頁を参照のこと。例え
ば、これらガイドラインに従って設計された２０ペプチドのうちの１８のペプチ
ドは、インフルエンザウイルスの赤血球凝集素ＨＡＩポリペプチド鎖の配列の７
５％にわたる８〜３９残基を含み、ＨＡＩタンパク質またはインタクトなウイル
スに反応する抗体を誘導し：そして、ＭｕＬＶポリメラーゼ由来の１２／１２の
ペプチド、および狂犬病糖タンパク質由来の１８／１８のペプチドは、それぞれ
のタンパク質を沈殿させる抗体を誘導した。
【０１３１】 従って、本発明の抗原性エピトープ保有ペプチドおよびポリペプチドは、本発
明のポリペプチドに特異的に結合する抗体（モノクローナル抗体を含む）を惹起
するのに有用である。従って、抗原性エピトープ保有ペプチドにより免疫化した
ドナー由来の脾臓細胞の融合によって得られる高い割合のハイブリドーマが、一
般的にネイティブのタンパク質に反応して抗体を分泌する。Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ
ら（前出）６６３頁を参照のこと。抗原性エピトープ保有ペプチドまたはポリペ
プチドにより惹起されるこの抗体は、模倣タンパク質を検出するのに有用であり
、そして異なるペプチドに対する抗体は、翻訳後プロセッシングを受けるタンパ
ク質前駆体の種々の領域の運命を追跡するために使用され得る。ペプチド抗体お
よび抗ペプチド抗体は、模倣タンパク質についての様々な定性的アッセイまたは
定量的アッセイ（例えば、競合アッセイ）において使用され得る。なぜなら、短
いペプチド（例えば、約９アミノ酸）でさえ、免疫沈降アッセイにおいてより大
きなペプチドと結合および置換し得ることが示されたからである。例えば、Ｗｉ
ｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ３７：７６７−７７８（１９８４）の７７７頁を参照の
こと。本発明の抗ペプチド抗体はまた、模倣タンパク質の精製（例えば、当該分
野で周知の方法を使用する吸着クロマトグラフィーによる）において有用である
。
【０１３２】 上記ガイドラインに従って設計された、本発明の抗原性エピトープ保有ペプチ
ドおよびポリペプチドは、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列内に含まれる、
好ましくは少なくとも７個、より好ましくは少なくとも９個、そして最も好まし
くは約１５〜約３０個の間のアミノ酸の配列を含む。しかし、本発明のポリペプ
チドのアミノ酸配列のより大きな部分（本発明のポリペプチドの約３０から約５
０のアミノ酸を含み、または任意の長さまで、および全てのアミノ酸配列を含む
）を含むペプチドまたはポリペプチドはまた、本発明のエピトープ保有ペプチド
またはポリペプチドであるとみなされ、そして模倣タンパク質に反応する抗体を
誘導するのに有用である。好ましくは、エピトープ保有ペプチドのアミノ酸配列
は、水性溶媒中における実質的な溶解度を提供するために選択され（すなわち、
比較的疎水性の残基および高い疎水性の配列を含む配列は、好ましくは避けられ
る）；そしてプロリン残基を含む配列は特に好ましい。
【０１３３】 Ｃｋβ−６特異的抗体を生成するために使用され得る抗原性ポリペプチドまた
はペプチドの非限定的な例としては、以下が挙げられる：図１（配列番号２）中
のアミノ酸残基およそＶａｌ１２〜およそＶａｌ−２１を含むポリペプチド；図
１（配列番号２）中のアミノ酸残基およそＬｅｕ−２６〜およそＬｙｓ−３４を
含むポリペプチド；図１（配列番号２）中のアミノ酸残基およそＰｈｅ−３９〜
およそＣｙｓ４８を含むポリペプチド；および図１（配列番号２）中のアミノ酸
残基およそＡｓｐ−５０〜およそＧｌｎ−５７を含むポリペプチド。上記のよう
に、本発明者らは、上記ポリペプチドフラグメントがＣｋβ−６タンパク質の抗
原性領域であることを決定した。
【０１３４】 本発明のエピトープ保有ペプチドおよびエピトープ保有ポリペプチドは、本発
明の核酸分子を使用する組換え手段を含む、ペプチドまたはポリペプチドを作製
するための任意の従来の手段によって産生され得る。例えば、短いエピトープ保
有アミノ酸配列は、組換え産生および精製の間、ならびに抗ペプチド抗体を産生
するための免疫化の間にキャリアとして作用するより大きなポリペプチドと融合
され得る。エピトープ保有ペプチドはまた、化学的合成の公知の方法を使用して
合成され得る。例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎは大量のペプチドを合成する単純な方
法（例えば、ＨＡ１ポリペプチドのセグメントの単一アミノ酸の改変体を示す、
１０〜２０ｍｇの２４８個の異なる１３残基のペプチドが、４週間未満で調製お
よび特徴付けられた（ＥＬＩＳＡ型結合研究による））を記載した。Ｈｏｕｇｈ
ｔｅｎ Ｒ．Ａ．「Ｇｅｎｅｒａｌ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒａｐｉ
ｄ ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｌａｒｇｅ ｎｕｍ
ｂｅｒｓ ｏｆ ｐｅｐｕｔｉｄｅｓ：ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ａｎｔ
ｉｇｅｎ−ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ａｔ ｔｈｅ ｌｅｖ
ｅｌ ｏｆ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ」、Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ） ８２：５１３１−５１３５（１９８５
）。この「Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓ
ｙｎｔｈｅｓｉｓ（ＳＭＰＳ）」プロセスは、Ｈｏｕｇｈｔｅｎら（１９８６）
の米国特許第４，６３１，２１１号にさらに記載されている。この手順において
、種々のペプチドの固相合成のための個々の樹脂は、分離溶媒浸透性小胞に含ま
れ、固相方法に含まれる多くの同一の反復工程の最適な使用を可能にしている。
完全なマニュアルの手順は、５０〜１０００以上の合成を同時に行うことを可能
にする。Ｈｏｕｇｈｔｅｎら（前出）５１３４頁。
【０１３５】 本発明の好ましい核酸フラグメントは、本発明のＣｋβ−６ポリペプチドのエ
ピトープ保有領域をコードする核酸分子を含む。
【０１３６】 特に、本発明のＣｋβ−６のこのような核酸フラグメントとしては、以下をコ
ードする核酸分子が含まれる：図１（配列番号２）中のアミノ酸残基およそＶａ
ｌ１２〜およそＶａｌ−２１を含むポリペプチド；図１（配列番号２）中のアミ
ノ酸残基およそＬｅｕ−２６〜およそＬｙｓ−３４を含むポリペプチド；図１（
配列番号２）中のアミノ酸残基およそＰｈｅ−３９〜およそＣｙｓ４８を含むポ
リペプチド；および図１（配列番号２）中のアミノ酸残基およそＡｓｐ−５０〜
およそＧｌｎ−５７を含むポリペプチド。
【０１３７】 Ｃｋβ−６ポリペプチドの他のこのようなエピトープ保有タンパク質を決定す
るための方法が、本明細書中に記載される。
【０１３８】 本発明のエピトープ保有ペプチドおよびポリぺプチドは、当該分野で周知の方
法に従って抗体を誘導するために使用される。例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら、
前出；Ｗｉｌｓｏｎら、前出；Ｃｈｏｗ，Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：９１０−９１４；およびＢｉｔｔｌｅ，Ｆ．Ｊ．ら
、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２３４７−２３５４（１９８５）を参照のこ
と。一般的に、動物は、遊離のペプチドで免疫化され得る。しかし、抗ペプチド
抗体力価は高分子キャリア（例えば、キーホールリンペットへモシニアン（ＫＬ
Ｈ）または破傷風トキソイド）へのこのポリペプチドの結合によってブーストさ
れ得る。例えば、システインを含むペプチドは、リンカー（例えば、ｍ−マレイ
ミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ｍ−ｍａｌｅｉｍｉ
ｄｏｂｅｎｚｏｙｌ−Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ ｅｓｔｅｒ
））（ＭＢＳ）を使用してキャリアに結合され得るが、他のペプチドはより一般
的な結合剤（例えば、グルタルアルデヒド）を使用してキャリアに結合され得る
。動物（例えば、ウサギ、ラットおよびマウス）は、遊離のペプチドまたはキャ
リア結合ペプチドのいずれかで、例えば、約１００μｇペプチドまたはキャリア
タンパクおよびフロイントアジュバントを含むエマルジョンの腹腔内注射および
／または経皮注射によって免疫される。様々なブースター注射は、例えば、約２
週間間隔で、抗ペプチド抗体の有用な力価を提供するために必要であり得、この
力価は、例えば、固体表面に吸着した遊離ペプチドを使用するＥＬＩＳＡアッセ
イによって検出され得る。免疫化した動物由来の血清中における抗ペプチド抗体
の力価は、抗ペプチド抗体の選択により増加し得る（例えば、当該分野で周知の
方法に従う固体支持体上のペプチドへの吸着および選択された抗体の溶出によっ
て）。
【０１３９】 本発明の免疫原性エピトープ保有ペプチド、すなわち全タンパク質が免疫原の
場合に抗体応答を誘発するタンパク質の一部は、当該分野で公知の方法によって
同定される。例えば、Ｇｅｙｓｅｎら、前出は、酵素結合免疫吸着アッセイにお
いて反応するために十分な純度である何百というペプチドの固相支持体上におけ
る迅速で同時的な合成についての手順を開示する。次いで、合成したペプチドと
抗体との相互作用は、それらを支持体から取り除くことなく容易に検出される。
このように、所望されるタンパク質の免疫原性エピトープを保有するペプチドは
、慣用的に当業者によって同定され得る。例えば、口蹄疫ウイルスのコートタン
パク質中の免疫学的に重要なエピトープは、Ｇｅｙｓｅｎらによって、そのタン
パク質の全２１３アミノ酸配列をカバーする全２０８の可能なヘキサペプチドの
重複セットの合成による７アミノ酸の分解能で位置付けられた。次いで、全２０
アミノ酸がエピトープ中の全ての位置において順番に置換される、ペプチドの完
全な置換のセットが合成されそして、抗体との反応について特異性を付与する特
定のアミノ酸が決定された。従って、本発明のエピトープ保有ペプチドのペプチ
ドアナログは、この方法によって慣用的に作製され得る。Ｇｅｙｓｅｎに対する
米国特許第４，７０８，７８１号（１９８７）は、所望するタンパク質の免疫原
性エピトープを保有するペプチドを同定するこの方法をさらに記載する。
【０１４０】 さらになお、Ｇｅｙｓｅｎに対する米国特許第５，１９４，３９２号（１９９
０）は、エピトープの位相幾何学的な等価物（すなわち、「ミモトープ（ｍｉｍ
ｏｔｏｐｅ）」であるモノマー（アミノ酸または他の化合物）の配列検出または
配列決定の一般的な方法を記載し、このエピトープは、目的の抗体の特定のパラ
ト−プ（抗原結合部位）に対し相補的である。より一般的には、Ｇｅｙｓｅｎに
対する米国特許第４，４３３，０９２号（１９８９）は、目的の特定のレセプタ
ーのリガンド結合部位に対し相補的なリガンドの組織分布的な等価物であるモノ
マーの配列検出または配列決定の方法を記載する。同様に、過アルキル化オリゴ
ペプチド混合物（Ｐｅｒａｌｋｙｌａｔｅｄ Ｏｌｉｇｏｐｅｐｔｉｄｅ Ｍｉ
ｘｔｕｒｅ）についてのＨｏｕｇｈｔｅｎ，Ｒ．Ａ．ら（１９９６）に対する米
国特許第５，４８０，９７１号は、直鎖Ｃ１−Ｃ７−アルキル 過アルキル化オ
リゴペプチドおよびこのようなペプチドのセットおよびライブラリーを開示し、
ならびにそのようなオリゴペプチドセットおよびライブラリーを、目的のアクセ
プター分子に好ましくは結合する過アルキル化オリゴペプチドの配列を決定する
ために使用するための方法を開示する。従って、本発明のエピトープ保有ペプチ
ドの非ペプチドアナログはまた、これらの方法によって慣用的に作製され得る。
【０１４１】 本節において「ポリペプチドおよびポリペプチドフラグメント」と引用される
各文書の全開示は、本明細書中に参考として援用される。
【０１４２】 当業者が理解するように、上記に記載される本発明のＣｋβ−６ポリペプチド
およびそのエピトープ保有フラグメントは、免疫グロブリン（ＩｇＧ）の定常ド
メインの一部と合わせられ得、キメラポリペプチドを生じる。これらの融合タン
パク質は、精製を容易にし、そしてインビボにおける半減期の増加を示す。これ
は、例えば、ヒトＣＤ−４ポリペプチドの最初の２つのドメインおよび哺乳動物
免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の定常領域の種々のドメインからなるキメラタ
ンパク質について示されてきた（ＥＰＡ ３９４，８２７：Ｔｒａｕｎｅｃｋｅ
ｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３３１：８４−８６（１９８８））。ＩｇＧ部分のために
ジスルフィド連結ダイマー構造を有する融合タンパク質はまた、他の分子の結合
および中和において、モノマーＣｋβ−６欠失変異ポリペプチド単独よりもより
効果的であり得る（Ｆｏｕｎｔｏｕｌａｋｉｓら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０
：３９５８−３９６４（１９９５））。
【０１４３】 （ベクターおよび宿主細胞） 本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、本発明のベクター
を用いて遺伝子操作される宿主細胞、および組換え技術による本発明のポリペプ
チドの産生に関する。
【０１４４】 宿主細胞は、例えば、クローニングベクターまたは発現ベクターであり得る本
発明のベクターを用いて遺伝子操作（形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｅ）または形
質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍ）またはトランスフェクト）される。ベクターは、
例えばプラスミド、ウイルス粒子、ファージなどの形状であり得る。操作された
宿主細胞は、プロモーターの活性化、形質転換体の選択または本発明の遺伝子の
増幅に対して適切なように改変された通常の栄養培地で培養され得る。培養条件
（例えば、温度、ｐＨなど）は、発現に対して選択された宿主細胞とともに以前
に使用された条件であり、そして当業者に対して明白である。
【０１４５】 本発明のポリヌクレオチドは、組換え技術によるポリペプチドの産生に使用さ
れ得る。従って、例えば、ポリヌクレオチドは、ポリペプチドを発現する種々の
発現ベクターの中の任意の１つに含まれ得る。そのようなベクターには、染色体
、非染色体および合成ＤＮＡ配列、例えば、ＳＶ４０の誘導体；細菌性プラスミ
ド；ファージＤＮＡ；バキュロウイルス；酵母プラスミド；プラスミドおよびフ
ァージＤＮＡの組み合わせ由来のベクター、ウイルスＤＮＡ（例えば、ワクシニ
ア、アデノウイルス、鶏痘ウイルスおよび仮性狂犬病）が挙げられる。しかし、
宿主の中で複製可能および生存可能である限り、他の任意のベクターが使用され
得る。
【０１４６】 適切なＤＮＡ配列は、種々の手順によってベクター中に挿入され得る。一般的
に、ＤＮＡ配列は、当該分野で公知の手順によって、適切な制限エンドヌクレア
ーゼ部位の中に挿入される。そのような手順および他の手順は、当業者の範囲内
であると考えられる。
【０１４７】 発現ベクターのＤＮＡ配列は、ｍＲＮＡ合成を指示するために、適切な発現制
御配列（プロモーター）に作動可能に連結される。このようなプロモーターの代
表的な例として、以下が言及され得る；ＬＴＲまたはＳＶ４０プロモーター、Ｅ
．ｃｏｌｉ ｌａｃまたはｔｒｐ、ファージλＰLプロモーター、および原核生
物細胞または真核生物細胞またはそれらのウイルスにおける遺伝子の発現制御を
することが知られている他のプロモーター。発現ベクターはまた、翻訳開始のた
めのリボソーム結合部位および転写ターミネーターを含む。ベクターはまた、発
現を増幅させるための適切な配列を含み得る。
【０１４８】 さらに、発現ベクターは、好ましくは形質転換した宿主細胞の選択に表現形の
形質を与える１以上の選択マーカー遺伝子（真核生物細胞培養については、例え
ば、ジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性、あるいはＥ．ｃｏｌｉ
においては、例えば、テトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性）を含む。
【０１４９】 本明細書中上記の、適切なＤＮＡ配列および適切なプロモーターまたは制御配
列を含むベクターは、適切な宿主を形質転換するために使用されて、宿主がタン
パク質を発現することを可能にし得る。
【０１５０】 適切な宿主の代表的な例としては、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、Ｓ
ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ細胞、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ
細胞）；真菌細胞（例えば酵母）；昆虫細胞（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ
Ｓ２およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｓｆ９）；動物細胞（例えば、ＣＨＯ、ＣＯ
Ｓ、またはＢｏｗｅｓ黒色腫）；アデノウイルス；植物細胞などが言及され得る
。適切な宿主の選択は、本明細書中の教示から当業者の範囲内であるとみなされ
る。
【０１５１】 本発明の実行における発現ベクターの使用に加えて、本発明は、目的のタンパ
ク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたオペレーターエレメ
ントおよびプロモーターエレメントを含む新規の発現ベクターをさらに含む。こ
のようなベクターの１つの例はｐＨＥ４−５（配列番号２１）であり、以下に詳
細を記載する。
【０１５２】 図２１および図２２に要約されるように、ｐＨＥ４−５ベクター（配列番号２
１および２２）の構成要素は以下を包含する：１）選択マーカーとしてのネオマ
イシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、２）Ｅ．ｃｏｌｉ複製起点、３）Ｔ５
ファージプロモーター配列、４）２つのｌａｃオペレーター配列、５）Ｃｋβ−
６ポリペプチド（例えば、配列番号２または６）、そのアンタゴニストまたはア
ゴニストをコードするヌクレオチド配列、６）シャイン−ダルガルノ配列、７）
ラクトースオペロンリプレッサー遺伝子（ｌａｃＩｑ）。複製起点（ｏｒｉＣ）
は、ｐＵＣ１９（ＬＴＩ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）に由来する。プロ
モーター配列およびオペレーター配列は合成的に作製された。核酸配列の合成的
産生は、当該分野において周知である。ＣＬＯＮＴＥＣＨ ９５／９６カタログ
、２１５−２１６頁、ＣＬＯＮＴＥＣＨ、１０２０ Ｅａｓｔ Ｍｅａｄｏｗ
Ｃｉｒｃｌｅ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ ９４３０３。
【０１５３】 上記のように、ｐＨＥ４−５ベクターはｌａｃＩｑ遺伝子を含む。ｌａｃＩｑ
は、ｌａｃオペレーターの堅固な調節を与えるｌａｃＩ遺伝子の対立遺伝子であ
る。Ａｍａｎｎ，Ｅら、Ｇｅｎｅ ６９：３０１−３１５（１９８８）；Ｓｔａ
ｒｋ，Ｍ．、Ｇｅｎｅ ５１：２５５−２６７（１９８７）。ｌａｃＩｑ遺伝子
は、ｌａｃオペレーター配列に結合し、そして下流（すなわち、３’）配列の転
写をブロックするリプレッサータンパク質をコードする。しかし、ｌａｃＩｑ遺
伝子産物は、ラクトースまたは特定のラクトースアナログ（例えば、イソプロピ
ル Ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ））のいずれかの存在下で、ｌ
ａｃオペレーターから分離する。したがって、Ｃｋβ−６タンパク質は、ｐＨＥ
４−５ベクターを含む非誘導宿主細胞において、かなりの量では産生されない。
しかし、ＩＰＴＧのような薬剤の添加によるこれらの宿主細胞の誘導は、結果と
してＣｋβ−６コード配列の発現を生じる。
【０１５４】 ｐＨＥ４−５ベクターのプロモーター／オペレーター配列（配列番号２２）は
、Ｔ５ファージプロモーターおよび２つのｌａｃオペレーター配列を含む。一方
のオペレーターは、転写開始部位に対応して５’に位置し、そして他方は同部位
に対して３’に位置する。これらのオペレーターは、ｌａｃＩｑ遺伝子産物と組
み合わせて存在する場合、ｌａｃオペロン誘導物質（例えば、ＩＰＴＧ）の非存
在下で下流配列の堅固な抑制を与える。ｌａｃオペレーターから下流に位置する
作動可能に連結された配列の発現は、ｌａｃオペロン誘導物質（例えば、ＩＰＴ
Ｇ）の添加によって誘導され得る。ｌａｃＩ誘導物質のｌａｃＩｑタンパク質に
対する結合は、ｌａｃオペレーター配列からのｌａｃＩｑの放出および作動可能
に連結された配列の転写の開始を生じる。遺伝子発現のｌａｃオペロン調節は、
Ｄｅｖｌｉｎ，Ｔ．、ＴＥＸＴＢＯＯＫ ＯＦ ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ Ｗ
ＩＴＨ ＣＬＩＮＩＣＡＬ ＣＯＲＲＥＬＡＴＩＯＮＳ、第４版（１９９７）、
８０２−８０７頁に概説される。
【０１５５】 ｐＨＥ４シリーズのベクターは、Ｃｋβ−６、そのアゴニストまたはアンタゴ
ニストのコード配列以外のｐＨＥ４ａベクターの構成要素の全てを含む。ｐＨＥ
４ａベクターの特徴は、最適化された合成Ｔ５ファージプロモーター、ｌａｃオ
ペレーター、およびシャイン−ダルガルノ配列を含む。さらに、これらの配列は
また、挿入遺伝子の発現が、堅固に調節され得、そして誘導において生じる発現
が高いレベルであるように、最適に間隔を空けられる。
【０１５６】 本発明のタンパク質の産生における使用に対して適切な公知の細菌プロモータ
ーの中には、Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃＩおよびｌａｃＺプロモーター、Ｔ３および
Ｔ７プロモーター、ｇｐｔプロモーター、λＰＲおよびＰＬプロモーターおよび
ｔｒｐプロモーターが挙げられる。適切な真核生物のプロモーターには、ＣＭＶ
最初期プロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、初期ＳＶ４０プロ
モーターおよび後期ＳＶ４０プロモーター、レトロウイルスＬＴＲ（例えば、ラ
ウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のプロモーター）、およびメタロチオネインプロモ
ーター（例えば、マウスメタロチオネインＩプロモーター）が挙げられる。
【０１５７】 ｐＨＥ４−５ベクターはまた、シャイン−ダルガルノ配列をＡＵＧ開始コドン
に対して５’に含む。シャイン−ダルガルノ配列は短い配列であり、一般的に、
ＡＵＧ開始コドンから約１０ヌクレオチド上流（すなわち、５’）に位置する。
これらの配列は、本質的に、真核生物リボソームをＡＵＧ開始コドンに指向する
。
【０１５８】 従って、本発明はまた、本発明のタンパク質の産生に対し有用な発現ベクター
に関する。本発明のこの局面は、ｐＨＥ４−５ベクター（配列番号２１）によっ
て例証される。
【０１５９】 さらに、本発明はまた、上記に広く記載されるような１つ以上の配列を含む組
換え構築物を含む。この構築物は、本発明の配列が順方向または逆方向に挿入さ
れたプラスミドまたはウイルスベクターのようなベクターを含む。本実施形態の
好ましい局面において、この構築物は、例えば、配列に作動可能に連結されたプ
ロモーターを含む調節配列をさらに含む。多くの適切なベクターおよびプロモー
ターは当業者に公知であり、そして市販されている。以下のベクターを例示とし
て挙げる；細菌：ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎ）、ｐＢ
Ｓ、ｐＤ１０、ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ、ｐｓｉＸ１７４、ｐｂｌｕｅｓｃｒｉ
ｐｔ ＳＫ、ｐｂｓｋｓ、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４
６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２
３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）；真核生物：ｐＷ
ＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅ
ｎｅ）、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉｃａ）
。しかし、宿主の中で複製可能かつ生存可能である限り、他の任意のプラスミド
またはベクターが使用され得る。
【０１６０】 プロモーター領域は、ＣＡＴ（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベ
クターまたは選択マーカーを有する他のベクターを用いる任意の所望の遺伝子か
ら選択され得る。２つの適切なベクターは、ｐＫＫ２３２−８およびｐＣＭ７で
ある。特に挙げられる細菌プロモーターとしては、ｌａｃＩ、ｌａｃＺ、Ｔ３、
Ｔ７、ｇｔｐ、λＰR、ＰLおよびｔｒｐが挙げられる。真核細胞プロモーターは
、ＣＭＶ最初期プロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、初期ＳＶ
４０および後期ＳＶ４０、レトロウイルス由来のＬＴＲ、およびマウスメタロチ
オネインＩプロモーターが挙げられる。適切なベクターおよびプロモーターの選
択は、十分に当業者のレベルの中にある。
【０１６１】 さらなる実施形態において、本発明は、上記に記載の構築物を含む宿主細胞に
関する。宿主細胞は、高等真核細胞（例えば、哺乳動物細胞）、もしくは下等真
核細胞（例えば、酵母細胞）であり得るか、または宿主細胞は、原核生物細胞（
例えば、細菌細胞）であり得る。宿主細胞への構築物の導入は、リン酸カルシウ
ムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、
または、エレクトロポレーション（Ｄａｖｉｓ，Ｌ．ら、Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８６））によっても
たらされ得る。
【０１６２】 宿主細胞における構築物は、組換え配列によってコードされる遺伝子産物を産
生する従来の方式で使用され得る。あるいは、本発明のポリペプチドは、従来の
ペプチド合成装置によって合成的に産生され得る。
【０１６３】 成熟タンパク質は、哺乳動物細胞、酵母、細菌、または適切なプロモーターの
制御下にある他の細胞において発現され得る。無細胞翻訳系はまた、本発明のＤ
ＮＡ構築物に由来するＲＮＡを用いるようなタンパク質を産生するために使用さ
れ得る。原核生物および真核生物宿主を用いる使用に対する適切なクローニング
ベクターおよび発現ベクターは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版；Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）によって記載され、この開
示は、本明細書によって参考として援用される。
【０１６４】 高等真核生物による本発明のポリヌクレオチドをコードするＤＮＡの転写物は
、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増加される。エンハン
サーは、シス作用性のＤＮＡエレメントであり、通常約１０〜３００ｂｐであり
、その転写を増加させるためにプロモーターに作用する。例としては、１００〜
２７０ｂｐの複製起点の後半側のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス
初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後半部位のポリオーマエンハンサー
、およびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。
【０１６５】 一般的に、組換え発現ベクターは、複製起点および宿主細胞の形質転換を可能
にする選択マーカー（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのアンピシリン耐性遺伝子およびＳ
．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＴＲＰ１遺伝子）、および下流の構造配列の転写を指
示する高発現遺伝子に由来するプロモーターを含む。このようなプロモーターは
、解糖系の酵素（例えば、とりわけ、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ
）、α因子、酸性ホスファターゼ因子、または熱ショックタンパク質）をコード
するオペロンに由来し得る。異種構造配列は、翻訳開始配列および翻訳終結配列
、および好ましくは細胞膜周辺腔または細胞外培地中へ翻訳タンパク質の分泌を
指示し得るリーダー配列と共に適切な段階で構築される。必要に応じて、異種配
列は、所望の特徴（例えば、発現した組換え産生の安定化または精製の単純化）
を与えるＮ末端認識ペプチドを含む融合タンパク質をコードし得る。
【０１６６】 細菌の使用に対する有用な発現ベクターは、所望のタンパク質をコードする構
造的ＤＮＡ配列を、機能的プロモーターと共に作動可能なリーディング相におい
て、適切な転写開始シグナルおよび転写終結シグナルを一緒に挿入することによ
り構築される。ベクターは、ベクターの維持を確実にするため、および所望であ
れば、宿主中の増幅を与えるための１つ以上の表現型の選択マーカーおよび複製
起点を含む。形質転換に対する適切な原核生物宿主は、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ
ならびにＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属およびＳｔａ
ｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属の様々な種を含むが、しかし他の宿主もまた、選択肢
として使用され得る。
【０１６７】 代表的であるが非制限的な例示として、細菌の使用のための有用な発現ベクタ
ーは、選択マーカーおよび周知のクローニングベクターｐＢＲ３３２（ＡＴＣＣ
３７０１７）の遺伝エレメントを含む市販のプラスミドに由来する細菌複製起点
を含み得る。このような市販のベクターは、例えば、ｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｕｐｐｓａｌａ Ｓｗｅｄｅｎ
）およびＧＥＭ１（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、Ｕ
ＳＡ）を含む。これらのｐＢＲ３２２「バックボーン」区分は、適切なプロモー
ターおよび発現される構造的配列と合わされる。
【０１６８】 以下の適切な宿主株の形質転換および適切な細胞密度に対する宿主株の増殖に
よって、選択されたプロモーターは適切な手段（例えば、温度シフトまたは化学
誘発）によって誘導され、そして細胞はさらなる期間培養される。
【０１６９】 細胞は、代表的に、遠心分離によって収集され、物理的または化学的手段によ
って破壊され、そして生じた粗抽出物はさらなる精製のために保持される。
【０１７０】 タンパク質の発現に使用された微生物の細胞は、凍結融解サイクル、超音波処
理、機械的破壊、または細胞溶解剤の使用（当業者に周知のような方法）を含む
任意の簡便な方法によって破壊され得る。
【０１７１】 種々の哺乳動物細胞培養系はまた、組換えタンパク質を発現するためにも使用
され得る。哺乳動物発現系の例示としては、サル腎臓線維芽細胞のＣＯＳ−７株
（Ｇｌｕｚｍａｎ、Ｃｅｌｌ ２３：１７５（１９８１）によって記載される）
、および適合性を持つベクターの発現が可能な、他の細胞株（例えば、Ｃ１２７
、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、およびＢＨＫ細胞株）が挙げられる。哺乳動物発
現ベクターは、複製起点、適切なプロモーターおよびエンハンサー、そしてまた
任意の必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライシングドナー
部位およびスプライシングアクセプター部位、転写終結配列、および５’隣接非
転写配列を含む。ＳＶ４０スプライシング部位およびポリアデニル化部位に由来
するＤＮＡ配列は、必要とされる非転写遺伝的エレメントを与えるために使用さ
れ得る。
【０１７２】 （ポリペプチド精製および単離） ポリペプチドは、硫安沈澱またはエタノール沈澱、酸抽出、陰イオンまたは陽
イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性
相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシ
アパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーを含む方法
によって組換え細胞培養物から回収され、そして精製され得る。タンパク質再折
り畳み工程は、必要であれば、成熟タンパク質の立体配置の完成において使用さ
れ得る。最後に、高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）が最終精製工程
のために用いられ得る。Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現したＣｋβ−６ポリペプチドを精
製するための特に好ましい方法は、以下の実施例１に記載される。
【０１７３】 本発明のＣｋβ−６／ＭＰＩＦ−２アゴニストおよびアンタゴニストを産生す
る方法は、当該分野で周知であり、そして本明細書および米国特許第５，９１２
，３２７号に見い出され得る。
【０１７４】 本発明のポリペプチドは、天然の精製産物、または化学合成手順の産物、また
は原核生物宿主または真核生物宿主（例えば、培養中の、細菌細胞、酵母細胞、
高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞によって）から組換え技術によっ
て産生された産物であり得る。組換え産生手順において用いられる宿主に依存し
て、本発明のポリペプチドは、グリコシル化されてもよいし、またはグリコシル
化されなくてもよい。本発明のポリペプチドはまた、開始メチオニンアミノ酸残
基を含み得る。
【０１７５】 （治療剤） 本発明のポリペプチドは、種々の免疫刺激機能および炎症機能において、なら
びに多くの疾患状態においてもまた、使用され得る。Ｃｋβ−６は、ケモカイン
ファミリーであり、従って、好酸球および好塩基球のような白血球についての化
学誘引物質である。
【０１７６】 ノーザンブロット分析は、Ｃｋβ−６が、造血起源の組織において主に発現さ
れることを示した。
【０１７７】 本発明のポリペプチドは、創傷治癒の促進に使用され得る。Ｃｋβ−６は、ケ
モカインであるので、これは、創傷領域への標的免疫細胞の浸潤を引き起こす好
酸球および好塩基球のような白血球についての、化学誘引物質である。類似の様
式で、本発明のポリペプチドは、殺菌性白血球の誘引および活性化を介して慢性
感染（例えば、ミコバクテリア性）に対する宿主防御を増強し得る。
【０１７８】 Ｃｋβ−６ポリペプチドはまた、抗腫瘍処置としておよび悪性疾患の局在性の
合併症（例えば、胸水または腹水）を処置するために使用され得る。腫瘍細胞に
注射されたケモカイン発現細胞が、例えば、カポージ肉腫の処置において、腫瘍
の退行を引き起こしたという証拠が存在する。Ｃｋβ−６は、腫瘍退行のための
公知の因子であるＴＮＦ−αを分泌するよう、細胞を誘導し得る。Ｃｋβ−６は
また、他の腫瘍および癌の阻害因子（例えば、ＩＬ−６、ＩＬ−１およびＧ−Ｃ
ＳＦ）を分泌するよう、単球を誘導し得る。
【０１７９】 インビボでのＭＣＰの存在は、住血吸虫症、旋毛虫症および回虫症におけるよ
うな、組織を浸潤する寄生生物の幼虫を殺傷する特有の機能を有する好酸球の存
在下での、局所的増加によって達成される。従って、Ｃｋβ−６は、寄生生物感
染と戦うために使用され得る。
【０１８０】 （造血幹細胞）：本発明者らは、本発明のポリペプチドが、高増殖潜在性のコ
ロニー形成細胞（ＨＰＰ−ＣＦＣ）のインビトロでの増殖および分化を阻害する
ことを見い出した（図４を参照のこと）。本発明のポリペプチドはまた、シトシ
ンアラビノシド（Ａｒａ−Ｃ）および５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）の細胞
傷害性効果からＨＰＰ−ＣＦＣを保護する（図６および７を参照のこと）。これ
らの知見は、Ｃｋβ−６／ＭＰＩＦ−２が、化学療法薬剤の細胞傷害性効果から
造血前駆体を保護する（ｓｐａｒｅ）薬剤としての治療的適用を有することを示
す。
【０１８１】 本発明者らはまた、本発明の特定のＣｋβ−６アンタゴニスト（Ｅｏ−２（Ｐ
Ｐ３０−Ｒ９９）；図２３Ｂおよび表５を参照のこと）が、ＣＣＲ３のＣｋβ−
６アンタゴニストであるにもかかわらず、ヒト骨髄骨髄様前駆細胞コロニー形成
を阻害する、完全かつわずかに増強されたＣｋβ−６の能力を保持することを決
定した（表６を参照のこと）。従って、このＣｋβ−６／ＭＰＩＦ−２アンタゴ
ニストは、化学療法薬剤の細胞傷害性効果から単一または複数の系統の造血前駆
体を保護する薬剤としての治療的適用を有する。
【０１８２】 なおさらなる局面において、本発明は、任意の癌（固形腫瘍によって特徴付け
られる癌を含む）を補助的に処置するための方法を包含する。この方法は、本発
明の有効量のＣｋβ−６／ＭＰＩＦ−２アゴニストおよびアンタゴニストを、癌
を有する患者に投与し、化学療法または放射線療法のような治療の毒性効果から
、骨髄の幹細胞を保護することによる。
【０１８３】 本発明のなお別の局面は、白血病の処置を包含し、これは、その中に増殖性の
白血病細胞を有する造血細胞を、本発明の有効量のＣｋβ−６／ＭＰＩＦ−２ア
ゴニストおよびアンタゴニストで処置し、正常な幹細胞の増殖を阻害する工程、
および骨髄を細胞傷害性薬剤で処置し、白血病細胞を破壊する工程を包含する。
この方法は、骨髄の増殖を刺激する他の薬剤（例えば、コロニー刺激因子）での
骨髄の経過処置によって増強され得る。１つの実施形態において、この方法は、
インビボで実施される。あるいは、この方法はまた、移植のための造血細胞のエ
キソビボでのパージングおよび拡大に有用である。
【０１８４】 なおさらなる局面において、この方法は、増殖中の幹細胞によって引き起こさ
れる任意の障害を有する被験体を処置することを包含する。このような障害（例
えば、乾癬、脊髄形成異常症、いくつかの自己免疫疾患、加齢における免疫抑制
）は、本発明の有効量のＣｋβ−６／ＭＰＩＦ−２アゴニストおよびアンタゴニ
ストを被験体に投与して、問題の幹細胞の増殖を部分的に阻害することによって
処置される。
【０１８５】 本発明は、幹細胞を殺傷または損傷し得る細胞傷害性薬剤からの損傷から、造
血前駆細胞を可逆的に保護するための方法を提供する。この方法は、このような
薬剤に対する曝露が見越される被験体に、本発明の有効量のＣｋβ−６／ＭＰＩ
Ｆ−２アゴニストおよびアンタゴニストを投与する工程を包含する。
【０１８６】 本発明はまた、ヒトまたは動物を処置する方法を提供し、ここで、造血前駆細
胞増殖のインヒビターが、造血前駆細胞の過剰増殖によって引き起こされる免疫
抑制を寛解するよう機能する。
【０１８７】 本発明はまた、ヒトまたは動物を処置する方法を提供し、ここで、上記造血前
駆細胞増殖のインヒビターが、造血前駆細胞が細胞傷害薬剤または照射手段に対
する曝露によって増殖するように誘導された後に投与される。造血前駆細胞は、
通常静止状態であるが、このような曝露後に細胞周期に入るように刺激される。
このことは、造血前駆細胞を、このような細胞傷害薬剤または照射の二次投与に
対してより感受性にし、そして現在の方法は、造血前駆細胞をこの処置から保護
する。
【０１８８】 本発明はまた、ヒトまたは動物を処置する方法を提供し、ここで、上記造血前
駆細胞増殖のインヒビターは、免疫応答を増加する目的のためのワクチン接種前
またはワクチン接種と共に、アジュバントとして投与される。
【０１８９】 本発明はまた、細胞傷害性薬剤または照射処置を受けているヒトまたは動物を
処置する方法を提供し、この方法は、有効量の造血前駆細胞増殖のインヒビター
を投与して、造血前駆細胞を損傷から保護する工程を包含する。
【０１９０】 さらに、本発明は、造血前駆細胞増殖を阻害する方法を提供し、この方法は、
造血細胞に、本発明の少なくとも１つのＣｋβ−６／ＭＰＩＦ−２アゴニストま
たはアンタゴニストおよびアヘン剤レセプター（有利には、アヘン剤レセプター
のμサブクラス）を結合し得る１以上の化合物（例えば、ヘモルフィン（アヘン
剤様活性を示す、ヘモグロビンから単離されたペプチド（例えば、ＩＮＰＲＯＬ
）、Ｔｙｒ−ＭＩＦ−１ファミリーペプチド、カゼイン由来カソモルフィン、チ
トクロムｂ由来ペプチド（チトクロフィン）、ならびにアヘン剤レセプターへの
結合についてスクリーニングされたコンビナトリアルライブラリー由来のペプチ
ド）を接触させる工程を包含する。
【０１９１】 本発明のＣｋβ−６／ＭＰＩＦ−２アゴニストおよびアンタゴニストは、造血
前駆細胞の分裂を可逆的に阻害する。従って、本発明の方法は、患者の造血系に
対する化学療法のような治療の、所望されない副作用の緩和において使用され得
る。これは、癌細胞またはウイルス感染細胞を破壊するために使用される化学療
法剤または照射によって引き起こされる損傷から、幹細胞を保護することによる
。本発明の１つの実施形態において、化学療法剤を疾患細胞に対して作用させな
がら、Ｃｋβ−６／ＭＰＩＦ−２アゴニストまたはアンタゴニストを、造血前駆
細胞の分裂を阻害するのに十分な投薬量で患者に投与する。化学療法剤が、その
機能を果たした後に、Ｃｋβ−６／ＭＰＩＦ−２によって阻害された幹細胞は、
さらなる処置なしで、分裂細胞に復帰する。造血の再生を増強することが所望さ
れる場合、刺激性増殖因子またはサイトカインをさらに使用し得る。
【０１９２】 本発明の別の実施形態において、Ｃｋβ−６／ＭＰＩＦ−２での前処置は、患
者において通常許容される用量以上に、化学療法剤または照射の用量を増加する
ことを可能にする。
【０１９３】 大部分の造血前駆細胞は、通常、静止状態（細胞周期に入っていない（ｎｏｎ
−ｃｙｃｌｉｎｇ））している。しかし、化学療法誘導性の造血損傷に対する代
償的応答として、大部分の幹細胞は、化学療法後に細胞周期（ｃｙｃｌｉｎｇ）
に入り、これが、幹細胞を、細胞傷害性の化学療法または治療的照射の引き続く
用量に対して特に脆弱性にする。このような幹細胞の周期進入を阻害することに
よって、Ｃｋβ−６／ＭＰＩＦ−２処置は、従来の用量または増加用量のいずれ
かでの、引き続く用量の細胞傷害性の化学療法のより早いかまたはより高頻度の
投与を許容する。
【０１９４】 本発明のＣｋβ−６／ＭＰＩＦ−２アゴニストまたはアンタゴニストは、化学
療法または照射のような治療と共に、交互のサイクルで投与され得る。投与のた
めの化学療法剤およびプロトコルは、標準的な臨床的実施における特定の腫瘍型
に対する適合性に従って選択される。必要に応じて、刺激性増殖因子（例えば、
Ｇ−ＣＳＦ、幹細胞因子）を、化学療法または照射処置の後に使用して、造血の
再構成をさらに改善する。
【０１９５】 本発明の別の実施形態において、Ｃｋβ−６／ＭＰＩＦ−２は、移植のための
自己の造血細胞を調製するための方法において使用される。造血細胞を、有効量
のＣｋβ−６／ＭＰＩＦ−２でエキソビボで処理して幹細胞分裂を阻害し、次い
で、その骨髄培養物に有効量の治療（例えば、化学療法剤または照射）を投与す
ることによって癌性細胞がパージされる。周期細胞に特異性を有する化学療法剤
が、好ましい。このように処置された骨髄を、自己ドナーに再注入する。必要に
応じて、患者を、造血を刺激することが公知の薬剤で処置し、患者の造血の再構
成を改善する。
【０１９６】 本発明の別の実施形態において、Ｃｋβ−６／ＭＰＩＦ−２を、白血病の処置
における補助的治療として使用する。例えば、白血病細胞が、Ｃｋβ−６／ＭＰ
ＩＦ−２に対して応答しない疾患状態において、白血病性の造血細胞を、Ｃｋβ
−６／ＭＰＩＦ−２を用いてエキソビボで処理する。正常な幹細胞の増殖は、Ｃ
ｋβ−６／ＭＰＩＦ−２の投与によって妨げられる。従って、増殖中の白血病細
胞が、細胞周期特異的細胞傷害薬剤で処理されている間、正常な幹細胞の集団は
、損傷から保護される。さらに、刺激性サイトカイン（例えば、ＩＬ−３または
ＧＭ−ＣＳＦ）を、必要に応じて投与して、正常な幹細胞をＣｋβ−６／ＭＰＩ
Ｆ−２で保護しながら、薬物または照射での処置の間に白血病細胞に周期進入を
誘導する。患者を、化学療法剤または照射によって処置して白血病細胞を破壊し
、次いで、このパージした骨髄を、患者に移植し戻して造血の再構成を確立する
。
【０１９７】 同様に、血液細胞またはリンパ球に関する重篤なウイルス感染（例えば、ＨＩ
Ｖ感染）を有する患者の処置についての本発明の別の実施形態において、造血細
胞は、Ｃｋβ−６／ＭＰＩＦ−２、続いて抗ウイルス剤、抗ウイルス薬（これは
、感染した細胞を破壊する）、または感染した細胞を除去するための抗体に基づ
く系で、エキソビボ処置される。患者からウイルスの宿主細胞を根絶するための
骨髄切除性（ｍｙｅｌｏａｂｌａｔｉｖｅ）抗ウイルス剤または骨髄切除性化学
療法の後、Ｃｋβ−６／ＭＰＩＦ−２で処置された骨髄細胞は、患者に戻される
。
【０１９８】 白血病のほとんどの場合において、白血病前駆体は、Ｃｋβ−６／ＭＰＩＦ−
２によって影響されない分化した細胞集団であり、従ってこれは上記の方法のよ
うなＣｋβ−６／ＭＰＩＦ−２を使用する方法によって処置される。白血病前駆
体が非常に原始的であり、そしてＣｋβ−６／ＭＰＩＦ−２による阻害に対して
直接的に感受性である場合、白血病細胞の増殖は、有効量のＣｋβ−６／ＭＰＩ
Ｆ−２の投与によって減弱される。
【０１９９】 Ｃｋβ−６／ＭＰＩＦ−２アゴニストおよびアンタゴニストの造血前駆細胞阻
害活性についてアッセイするための方法は、当該分野で周知であり、そして本明
細書および米国特許第５，９３９，３９１号および同第５，９３５，５６５号に
おいて見出され得る。
【０２００】 本発明のポリペプチドは、続く回復および移植におけるその使用のために、造
血前駆細胞を非ヒト宿主およびヒト宿主（好ましくはヒト宿主）の末梢血循環へ
と流動するために使用され得る（実施例５を参照のこと）。本発明のポリペプチ
ドは、末梢血に流動するために有効な量、および末梢血における造血前駆細胞の
量を増加する（特に、末梢血におけるヒト造血幹細胞の量を増加する）のに有効
な量で投与される。例えば、このような細胞は、しばしば、ＣＤ３４＋細胞、高
増殖性潜在的コロニー形成（ＨＰＰ−ＣＦＣ）細胞、コロニー形成単位−顆粒球
／赤血球／単球／巨核球（ｍｅｈａｃａｒｙｏｃｙｔｅ）（ＣＦＵ−ＧＥＭＭ）
細胞、長期的培養開始（ＬＴＣ−ＩＣ）細胞、高増殖性の潜在的静止（ＨＰＰ−
Ｑ）細胞、ＣＤ３４+ ＣＤ３８-細胞、原始的前駆体、多分化能骨髄前駆体、お
よびＣＤ３４+ｋｉｔlowＩＬ−６Ｒlow細胞と呼ばれる。例えば、このポリペプ
チドは、本明細書以下に記載されるような量で投与される。本発明のポリペプチ
ドは、単独でかまたは他の薬剤（例えば、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦ（これ
は、末梢血におけるこのような細胞の増加について有効であることが公知である
））と共に投与され得る。造血前駆細胞の末梢循環への流動は、例えば、癌およ
び血液学的障害の処置のために使用される自己および異種の骨髄移行のために重
要である。
【０２０１】 Ｌｏｎｇらは、全ての増殖性ＣＤ３４+細胞が、ガラクトース特異的な細胞表
面のレクチンを発現する別の亜集団内で見出されることを報告する（米国特許第
５，８５８，７８２号）。
【０２０２】 本発明のアゴニストおよびアンタゴニストによって調節されるさらなる幹細胞
集団としては、例えば、ＣＤ３４＋レクチン＋陽性細胞が挙げられる。ＣＤ３４
＋レクチン＋陽性細胞は、ステイン細胞（ｓｔｅｉｎ ｃｅｌｌ）様の特徴を有
する原始的な造血細胞（長期的培養開始細胞（ＬＴＣ−ＩＣ）、混合細胞質のバ
ースト形成単位／細胞（ＢＦＵ−ｍｉｘ）、ＨＰＰ−ＣＦＣ、およびバースト形
成巨核球前駆細胞（ＢＦＵ−Ｍｋ））、ならびにより成熟した繁殖細胞（ＢＦＵ
−Ｅ、ＣＦＵ−ＧＥＭＭ、ＣＦＵ−Ｍｋ、およびＣＦＵ−ＧＭ）の両方を含む。
Ｌｏｎｇらに従って、４つの公知の原始的な高増殖性潜在的ヒト造血前駆細胞は
、ＬＴＣ−ＩＣ、ＢＦＵ−ｍｉｘ、ＨＰＰ−ＣＦＣ、およびＢＦＵ−Ｍｋを含む
（米国特許第５，８５８，７８２号）。
【０２０３】 実施例１４に示されるように、本発明のポリペプチドは、ＣＦＵ−ＧＥＭＭに
加えて、ＣＦＵ−Ｃのコロニー形成を阻害する。従って、本発明のポリペプチド
を使用して調節され得るさらなる幹細胞集団は、単球細胞（ＣＦＵ−Ｍ）、骨髄
性細胞（ＣＦＵ−Ｇ）、赤血球系細胞（ＣＦＵ−ＥおよびＢＦＵ−Ｅ）ならびに
骨髄性単球細胞（ＣＦＵ−ＧＭ）（集団的に、表６においてＣＦＵ−Ｃと名付け
た）を含む単一系統のコロニーのような前駆体を含む。本発明のポリペプチドは
また、コロニー形成単位巨核球（ＣＦＵ−Ｍｅｇ）細胞を調節するために使用さ
れ得る。
【０２０４】 本発明のポリペプチドはまた、化学治療剤を用いる処置から生じる非ヒトおよ
びヒト宿主（好ましくは、ヒト宿主）における造血前駆細胞の破壊を阻害するた
めに使用され得る。本発明のポリペプチドは、治療（例えば、化学療法）の前、
間、または後に投与され得、そして癌の処置において使用される治療剤のより高
い用量を可能にする。本発明のポリペプチドは、造血前駆細胞の破壊を阻害する
のに有効な量で投与される；例えば、このポリペプチドは、本明細書以下で記載
されるような量で投与される。このポリペプチドは、単独で、または他の薬剤と
共に投与され得る。
【０２０５】 本発明の造血細胞保護組成物は、種々の化学療法剤（アルキル化剤（例えば、
窒素マスタード、エチレンイミン、メチルメラミン、アルキルスルホネート、ニ
トロソ尿素（ｎｉｔｒｏｓｕｏｕｒｅａ）、およびトリアゼン（ｔｒｉａｚｅｎ
ｅ））；抗代謝剤（例えば、葉酸アナログ、ピリミジン（ｐｙｒｉｍｉｎｄｉｎ
ｅ）アナログ（特にフルオロシル（ｆｌｕｏｒｏｃｉｌ）およびシトシンアラビ
ノシド）、およびプリンアナログ）；天然産物（例えば、ビンカアルカロイド、
エピポドピロトキシン（ｅｐｉｐｏｄｏｐｙｌｌｏｔｏｘｉｎ）、抗生物質、酵
素および生物学的応答変更因子）；ならびに種々雑多な産物（例えば、白金配位
錯体、アントラセンジオン（ａｎｔｒａｃｅｎｅｄｉｏｎｅ）、置換された尿素
（例えば、ヒドロキシ尿素）、メチルヒドラジン誘導体、およびアドレノコルチ
コイド抑制剤を含む）との組み合わせにおいて使用され得る。
【０２０６】 本発明の造血細胞保護組成物と共に使用され得るさらなる化学療法剤は、ドキ
ソルビシン、ドセタキセル（ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）およびトポテカン（ｔｏｐｏ
ｔｅｃａｎ）である。
【０２０７】 化学療法剤は、公知の技術に従って、既知濃度で投与され得る。本発明の保護
組成物は、化学療法剤と共に同時投与され得るか、あるいは化学療法剤投与の前
または後のいずれかに、別々に投与され得る。
【０２０８】 本発明は、他の骨髄抑制性の治療および薬剤と組み合わせての、Ｃｋβ−６／
ＭＰＩＦ−２の使用をさらに含む。骨髄刺激物質と組み合わせてのＣｋβ−６／
ＭＰＩＦ−２の使用がさらに含まれる。
【０２０９】 上記のように、化学療法および放射線療法のような治療から生じる１つの主な
厄介な問題は、非病理学的細胞型の破壊である。本発明は、個体における骨髄細
胞増殖を抑制することによって、放射線および化学療法剤のような治療剤からの
骨髄保護のための方法を提供する。これらの方法は、骨髄抑制量のＣｋβ−６／
ＭＰＩＦ−２を、放射線療法または化学療法レジメンの一部として、単独でか、
または以下からなる群から選択される１つ以上のケモカインと一緒にかのいずれ
かで個体に投与する工程を包含する：マクロファージ炎症性タンパク質−１α（
ＭＩＰ−１α）、マクロファージ炎症性タンパク質−２α（ＭＩＰ−２α）、マ
クロファージ抑制因子−１（ＭＰＩＦ−１）、血小板因子４（ＰＦ４）、インタ
ーロイキン−８（ＩＬ−８）、マクロファージ走化性および活性化因子（ＭＣＡ
Ｆ）、ならびにマクロファージ炎症性タンパク質関連タンパク質−２（ＭＲＰ−
２）。従って、本発明の骨髄抑制性組成物は、骨髄抑制効果を提供し、そして骨
髄細胞に有害な影響を有する治療に関して有用である。なぜなら、本発明の骨髄
抑制性組成物が、骨髄細胞を遅い周期の状態にし、これによって、例えば細胞周
期活性剤（例えば、シトシンアラビノシド、ヒドロキシ尿素、５−ＦｕおよびＡ
ｒａ−Ｃ）を使用する放射線療法または化学療法によって引き起こされる細胞損
傷に対する保護を提供する。
【０２１０】 本発明のＣｋβ−６／ＭＰＩＦ−２のアゴニストおよびアンタゴニストはまた
、以下からなる群から選択される少なくとも１つの抑制性化合物を用いて使用さ
れ得る：ＭＩＰ−１α、ＭＰＩＦ−１、ＴＧＦβ、ＴＮＦα、ＩＮＦα、ＩＮＦ
β、ＩＮＦγ、ペンタペプチドのピロＧｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ
、テトラペプチドのＮ−アセチル−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ、およびト
リペプチドのグルタチオン（Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−γＧｌｕ）、ヘモフィン（ｈｅｍ
ｏｒｐｈｉｎｓ）（ＩＮＰＲＯＬのようなヘモグロビンから単離されたペプチド
であって、これはアヘン剤様活性を示す）、Ｔｙｒ−ＭＩＦ−１ファミリーペプ
チド、カゼイン誘導カソモフィン（ｃａｓｏｍｏｒｐｈｉｎ）、チトクロムｂか
ら誘導されるペプチド（チトクロフィン（ｃｙｔｏｃｈｒｏｐｈｉ））、ならび
にアヘン剤レセプターへの結合についてスクリーニングされたコンビナトリアル
ライブラリーから誘導されたペプチド。
【０２１１】 分裂する細胞が優先的に殺傷される複数回の治療の間に骨髄細胞を保護するた
めのＣｋβ−６／ＭＰＩＦ−２の使用が、本発明によってさらに含まれる。この
ような場合、Ｃｋβ−６／ＭＰＩＦ−２は、治療または処置レジメンにおいて、
単一用量または異なる時点に複数用量でのいずれかで、投与され得る。
【０２１２】 一旦、化学療法剤が個体の系を取り払う（ｃｌｅａｒｅ）と、例えば、骨髄刺
激物質（例えば、インターロイキン−１１（ＩＬ−１１）、エリスロポエチン（
ＥＰＯ）、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチ
ン（Ｔｐｏ）、スチール（Ｓｔｅｅｌ）因子（ＳＦ）、ｆｌｔ−３レセプターリ
ガンド（ＦＬ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、エリスロポエチン（Ｅｐｏ）
、およびＴＧＦβのインヒビター）を使用して、Ｃｋβ−６／ＭＰＩＦ−２によ
って保護される前駆細胞の迅速な増幅および分化を刺激することが望ましい。
【０２１３】 本発明のＣｋβ−６／ＭＰＩＦ−２のアゴニストおよびアンタゴニストはまた
、以下からなる群から選択される少なくとも１つの刺激性化合物を用いて（好ま
しくは、前に）使用され得る：ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ
−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、
ＩＬ−１５、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、エリスロポエチン、トロ
ンボポエチン、幹細胞因子、およびｆｌｋ２／ｆｌｔ３リガンド（ＦＬ）、スチ
ール因子（ＳＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、およびＴＧＦβのインヒビ
ター。
【０２１４】 上記のように、Ｃｋβ−６／ＭＰＩＦ−２は、単独で、または１つ以上の骨髄
刺激物質と共に使用され得る。骨髄刺激物質は、細胞周期活性剤を用いる放射線
療法または処置を受ける個体において、骨髄細胞の枯渇後にこの骨髄細胞の増殖
を刺激するために当該分野で現在使用される。例えば、Ｋａｎｎａｎ，Ｖ．ら，
Ｉｎｔ．Ｊ．Ｒａｄｉａｔ．Ｏｎｃｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｐｈｙｓ．３７：１００５
−１０１０（１９９７）；Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔ，Ｍ．ら，Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒ
ｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ １９：５２９−５３７（１９９７）；Ｖａｄｈａ
ｎ−Ｒａｊ，Ｓ．ら，Ａｎｎ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ．１２６：６７３−６８１
（１９９７）；Ｈａｒｋｅｒ，Ｌ．ら，Ｂｌｏｏｄ ８９：１５５−１６５（１
９９７）；Ｂａｓｓｅｒ，Ｒ，ら，Ｌａｎｃｅｔ ３４８：１２７９−１２８１
（１９９６）；Ｇｒｏｓｓｍａｎ，Ａ．ら，Ｂｌｏｏｄ ８８：３３６３−３３
７０（１９９６）；Ｇｏｒｄｏｎ，Ｍ．ら，Ｂｌｏｏｄ ８７：３６１５−３６
２４（１９９６）を参照のこと。Ｃｋβ−６／ＭＰＩＦ−２は、例えば、分裂す
る細胞を殺傷する治療の前に投与され得、そして１つ以上の骨髄刺激物質がこの
ような治療の経過の後または間に投与される。このような場合において、Ｃｋβ
−６／ＭＰＩＦ−２は、この治療から骨髄細胞を保護し、次いで、骨髄刺激物質
の投与は、保護された骨髄細胞集団の増大を生じる。
【０２１５】 骨髄刺激物質は、代表的に、化学療法剤を用いる処置を受ける患者に、治療有
効量で投与される。投与の投薬処方物および形態は、多くの要因（処置される個
体、刺激される細胞の状態、化学療法レジメンにおける処置の段階、および使用
される骨髄刺激物質を含む）によって変化し得る。例えば、ＧＭ−ＧＳＦおよび
Ｇ−ＣＳＦは、それぞれ約１μｇ／体重キログラムおよび５〜１０μｇ／体重キ
ログラムの投薬量で治療的に有効であり、そして皮下注射によって毎日投与され
得る。例えば、Ｋａｎｎａｎ，Ｖ．ら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｒａｄｉａｔ．Ｏｎｃｏｌ
．Ｂｉｏｌ．Ｐｈｙｓ．３７：１００５−１０１０（１９９７）；Ｅｎｇｅｌｈ
ａｒｄｔ，Ｍ．ら，Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ １９：５
２９−５３７（１９９７）；Ｓｎｉｅｃｉｎｓｋｉ，Ｉ．ら，Ｂｌｏｏｄ ８９
：１５２１−１５２８（１９９７）を参照のこと。ＩＬ−１１は、１００μｇ／
体重キログラムまでの範囲の投薬量で毎日皮下注射によって投与され得る。Ｇｏ
ｒｄｏｎ，Ｍ．ら，前出。しかし、１０μｇ／キログラム未満のＩＬ−１１の用
量は、化学療法によって誘導される血小板減少症の減少において有効であると考
えられる。Ｔｐｏは、０．３〜２．５μｇ／体重キログラムの範囲の投薬量での
静脈内注射によって、投与され得る。例えば、Ｖａｄｈａｎ−Ｒａｊ，Ｓ．ら，
Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．１２６：６７３−６８１（１９９７）；Ｈａｒ
ｋｅｒ，Ｌ．ら，Ｂｌｏｏｄ ８９：１５５−１６５（１９９７）を参照のこと
。当業者が認識するように、投与の最適な投薬処方物および形態は、上記の要因
を含む多くの要因によって変化する。さらなる骨髄刺激物質のための投与の投薬
処方物および形態は、当該分野で公知である。
【０２１６】 分裂する細胞を優先的に殺傷する治療に関する処置プロトコルの一部としての
骨髄刺激物質の投与のタイミングはまた、投与の投薬処方物および形態について
の上記の要因によって変化し得る。放射線療法または細胞周期活性剤に関する処
置プロトコルの一部としての、個体への骨髄刺激物質の投与を記載する多くの報
告が公開されている。例えば、Ｖａｄｈａｎ−Ｒａｊ，Ｓ．ら，前出は、化学療
法剤の投与の３週間前の、Ｔｐｏの単一静脈内用量の使用を報告する。Ｐａｐａ
ｄｉｍｉｔｒｏｕ，Ｃ．ら，Ｃａｎｃｅｒ ７９：２３９１−２３９５（１９９
７）およびＷｈｉｔｅｈｅａｄ，Ｒ．ら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１５：２
４１４−２４１９（１９９７）は、数週間の経過にわたって化学療法剤の投与を
含む化学療法処置方法を報告する。これらの各々の場合において、Ｇ−ＣＳＦの
用量は、化学療法剤を用いる処置の最初の日より後であって最後の日より前の複
数の時点で投与される。ＩＬ−１１およびＧＭ−ＣＳＦの両方の同様の使用が、
Ｇｏｒｄｏｎ，Ｍ．ら，前出，およびＭｉｃｈａｅｌ，Ｍ．ら，Ａｍ．Ｊ．Ｃｌ
ｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２０：２５９−２６２（１９９７）において報告される。し
かし、骨髄刺激物質の投与の最適なタイミングは、使用される特定の骨髄刺激物
質およびこれらが投与される条件によって変化することを当業者は認識する。
【０２１７】 従って、分裂する細胞を優先的に殺傷する治療が有する骨髄細胞に対する細胞
傷害効果を緩和するための骨髄刺激物質の投与は、当該分野で公知である。骨髄
刺激物質は、いくつかの経路（静脈内および皮下注入を含む）によって投与され
得る。投与される骨髄刺激物質の濃度は、多数の要因によって広範に変化するが
、一般には０．１〜１００μｇ／体重キログラムの間の範囲であり、そして化学
療法または放射線学的処置レジメンの種々の時点で、単一用量または複数用量で
投与され得る。しかし、骨髄刺激物質は、一般に、化学療法剤の投与または放射
線学的処置の前または後に投与される。当業者が理解するように、骨髄刺激物質
が使用される条件は、特定の骨髄刺激物質および処置レジメンの両方によって変
化する。
【０２１８】 本発明のＣｋβ−６／ＭＰＩＦ−２のアゴニストおよびアンタゴニストは、サ
イクリング幹細胞において、これらを可逆的に未分裂の「静止」状態にすること
によって作用する。静止状態の幹細胞を分裂へと刺激することが望ましい場合（
例えば、癌治療剤（例えば、化学療法剤または放射線）を用いる患者の処置の後
）、コロニー刺激因子および他の造血刺激薬がこの被験体に投与される。このよ
うな因子の例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：Ｍ−ＣＳＦ
（ＣＳＦ−１）、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、巨核球−ＣＳＦ、トロンボポエチ
ン、幹細胞因子または他のサイトカイン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−
３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−
１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、またはエリスロポエチン）。
【０２１９】 特定のケモカイン（例えば、ＭＩＰ−１β、ＭＩＰ−２βおよびＧＲＯ−α）
は、本発明の骨髄抑制組成物の骨髄抑制性の影響を阻害（少なくとも部分的にブ
ロック）する。従って、さらなる実施形態において、本発明は、骨髄抑制を阻害
する方法を提供し、この方法は、ＭＩＰ−１β、ＭＩＰ−２βおよびＧＲＯ−α
からなる群から選択される骨髄抑制性インヒビターの有効量を、骨髄抑制剤Ｃｋ
β−６／ＭＰＩＦ−２（単独でかまたはＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−２α、ＰＦ４、
ＩＬ−８、ＭＣＡＦ、およびＭＲＰ−２のうちの１つ以上と一緒に）に予め暴露
した哺乳動物に投与する工程を包含する。
【０２２０】 当業者が理解するように、Ｃｋβ−６／ＭＰＩＦ−２は、上記のように、一般
に造血性増殖因子の効果を増大するために使用され得る。このような造血性増殖
因子としては、エリスロポエチン（これは、赤血球の産生を刺激する）およびＩ
Ｌ−３（より原始的な幹細胞を刺激する多系統増殖因子）が挙げられ、従って全
ての血液細胞型の数を増加する。他のものとしては、以下が挙げられる：幹細胞
因子；ＧＭ−ＣＳＦ；ならびにＧ−ＣＳＦおよびエリスロポエチン；ＩＬ−３お
よびＳＣＦ；ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦのハイブリッド分子。
【０２２１】 本発明のポリペプチドはまた、造血前駆細胞を保護するために使用され得、こ
れによって造血前駆細胞の破壊から生じ得る疾患（例えば、白血球減少症、骨髄
異常形成症候群および好中球減少）を予防または阻害し得る。
【０２２２】 Ｃｋβ−６／ＭＰＩＦ−２は、その分化を一時的に妨げることによる、未成熟
な造血前駆細胞の増大のために使用され得る。これらの骨髄細胞は、インビトロ
で培養され得る。従って、Ｃｋβ−６／ＭＰＩＦ−２はまた、骨髄移植および／
または遺伝子治療目的のための、インビトロの造血幹細胞のモジュレーターとし
て有用であり得る。幹細胞は珍しく、そして遺伝子治療のために遺伝子を導入す
ることについて最も有用であるため、Ｃｋβ−６／ＭＰＩＦ−２は、幹細胞の富
化された集団を単離するために使用され得る。幹細胞は、細胞毒（例えば、５−
Ｆｕ（これは、分裂する細胞を急速に殺傷する））の存在下で、細胞を培養する
ことによって富化され得、ここでこの幹細胞はＣｋβ−６／ＭＰＩＦ−２によっ
て保護される。これらの幹細胞は、骨髄移植患者に戻され得るか、または、その
後遺伝子治療のために所望の遺伝子のトランスフェクションのために使用され得
る。さらに、Ｃｋβ−６／ＭＰＩＦ−２は、個体に注射され得、これは個体の骨
髄から末梢血への幹細胞の放出を生じる。これらの幹細胞は、自家骨髄移植また
は遺伝子治療のための操作の目的で単離され得る。患者が治療（例えば、化学療
法または放射線治療）を終えた後、この単離された幹細胞はこの患者に戻され得
る。
【０２２３】 骨髄移植（ＢＭＴ）は、種々の血液学的疾患、自己免疫疾患および悪性疾患の
ための処置に有用である；現在の治療は、臍帯血または末梢血（流動されていな
いかまたはＧ−ＣＳＦのような因子で流動されたかのいずれか）、ならびに骨髄
から得られる造血細胞を含む。造血細胞のエキソビボ操作は、原始的な幹細胞を
、移植に適切な集団へ増大するために現在使用されている。この手順の最適化は
、以下を必要とする：（１）造血の長期の再形成を維持し得る十分な数の幹細胞
；（２）異種片対宿主によって誘導されるＴリンパ球の枯渇、および（３）残留
悪性細胞の非存在。この手順は、エキソビボ増大のために幹細胞インヒビター（
例えば、本発明のＣｋβ−６／ＭＰＩＦ−２のアゴニストおよびアンタゴニスト
）を包含することによって最適化され得る。
【０２２４】 残留悪性細胞の除去のために細胞傷害剤を用いる造血細胞の浄化の効果は、正
常な造血細胞（特に、幹細胞）に対するこれらの化合物の毒性に起因して制限さ
れる。浄化の間の正常な細胞の効果的な保護の必要性が存在し；保護は、効果的
なインヒビター（例えば、本発明のＣｋβ−６／ＭＰＩＦ−２アゴニストおよび
アンタゴニスト）を用いて、幹細胞をサイクル外にすることによってなされ得る
。
【０２２５】 末梢血幹細胞（ＰＢＳＣ）は、自家移植のための骨髄についての多くの潜在的
な利点を提供する。腫瘍の介入または以前の放射線治療に起因して適切な骨髄収
集部位を有さない患者は、なおＰＢＳＣの収集を受け得る。血液幹細胞の使用は
、一般的な麻酔および外科的手順に対して十分耐性でない患者におけるこれらの
必要性を排除する。血液細胞を収集するために必要なアフェレーシス技術は効率
的であり、ほとんどの主要な医療センターで広く利用可能である。この方法の主
な制限は、末梢血における幹細胞の低い正常な安定状態の頻度、および薬物また
は増殖因子（例えば、シクロホスファミド、Ｇ−ＣＳＦ、幹細胞因子）を用いる
流動手順後のその高い周期状態の両方である。効果的な幹細胞インヒビター（例
えば、本発明のＣｋβ−６／ＭＰＩＦ−２アゴニストおよびアンタゴニスト）は
、このような細胞を静止状態に戻すのに有用であり、これによって分化を介する
その損失を防ぐ。
【０２２６】 遺伝情報を造血細胞に伝達する能力は、現在臨床設定において利用される。造
血細胞は、この組織のエキソビボ操作および処置におけるアクセスの容易さ、広
範囲にわたる経験のために、および組織に浸透する血液の能力のために、遺伝子
治療のための有用な標的である。さらに、特定のヒト遺伝子欠損の矯正は、ヒト
造血系の原始的な幹細胞に機能的遺伝子を挿入することによって可能であり得る
。
【０２２７】 レトロウイルスベクターまたは遺伝子転移の物理的技術のいずれかを使用する
、ヒト造血細胞への遺伝子の導入についてのいくつかの制限が存在する：（１）
造血組織における幹細胞の低い頻度は、高効率の遺伝子転移技術の開発を必要と
する；そして（２）より迅速なサイクリングの幹細胞は、ベクター感染に対して
より感受性であることが判明したが、増殖因子を用いる幹細胞増殖の刺激による
感染頻度の増加は、長期の遺伝子発現について負の影響を与える（なぜなら、導
入遺伝子を含む細胞は、不可逆的に分化を強制され、そしてその自己複製を失う
ためである）。これらの問題は、分化および自己複製の損失を防止するための幹
細胞インヒビター（例えば、本発明のＣｋβ−６／ＭＰＩＦ−２アゴニストおよ
びアンタゴニスト）の使用によって改善され得る。
【０２２８】 造血（成熟した血液細胞が個体の寿命にわたって産生されるプロセス）（１日
当たり１０11〜１０12の血液細胞のオーダーで産生する）は、厳重に制御される
。血液細胞の発生の間に、細胞：細胞相互作用、造血増殖因子、および他の微小
環境分子は全て、骨髄内の異なる血液細胞系統の産生を調節するために同齢集団
において作用する。造血細胞は、これらの相互作用を媒介する顕著な種々の細胞
表面構造を表す。これらの細胞表面抗原のうち、ＣＤ３４（１０５〜１２０ｋＤ
ａの糖タンパク質）は、ヒト造血細胞の表面上に発現され、従って単離および特
徴づけのための抗原マーカーとして役立つ。ＣＤ３４+細胞集団はまた、短期お
よび長期の両方のインビボ造血再形成が可能である細胞を含む。従って、ＣＤ３
４および／または他の表面マーカーを使用するヒト造血細胞のこのようなサブセ
ットの精製は、骨髄移植におけるその有用性、およびヒト幹細胞の生物学の理解
におけるその有用性について重要である。ヒト造血細胞の機能的特徴付けは、イ
ンビトロアッセイに依存性である。しかし、１０〜２０％のみのＣＤ３４+細胞
が分化して、コロニーまたは分化した子孫のコロニーを生じるので、これらのア
ッセイは、全てのＣＤ３４+細胞がインビトロで機能性であるとは限らないこと
を示す。他の抗原マーカーは、ＣＤ３４と共に使用され、造血細胞をさらに単離
および／または特徴付ける。例えば、ＨＬＡ−ＤＲ組織適合性抗原の発現は、よ
り成熟した造血前駆細胞、およびその非存在を規定し、より原始的な細胞；他の
抗原（例えば、ＣＤ７１、Ｔｈｙ−１またはＣＤ４５Ｒａ）はまた、より原始的
な細胞を標識する。しかし、これらの抗原のいずれも、ＣＤ３４+細胞の機能的
サブセット上に単独で発現されない（すなわち、分化する細胞、それ故、クロー
ン原性細胞）。従って、分化するＣＤ３４+細胞を単独で同定する細胞表面構造
の同定は、臨床的または科学的な目的のためのこれらの細胞の単離についての効
果的な手段を表す。
【０２２９】 ニューロン細胞：本発明のポリペプチドはまた、非ヒトおよびヒト宿主、特に
ヒトにおけるニューロン細胞の変性を阻害するに有効な量で使用され得、この変
性は、アルツハイマー病、パーキンソン病およびＡＩＤＳ関連合併症のようなニ
ューロン変性疾患から生じる。神経変性疾患の例としては、以下が挙げられるが
、これらに限定されない：ＡＩＤＳ痴呆合併症、脱髄疾患、例えば、多発性硬化
症および急性横断脊髄炎；皮質脊髄系の病変のような錐体外路系障害および小脳
障害；脳幹神経節の障害または小脳障害；ハンティングトン舞踏病および老年舞
踏病のような運動過剰性運動障害；薬物誘導運動障害、例えば、ＣＮＳドーパミ
ンレセプターをブロックする薬物によって誘導される障害；運動低下性運動障害
、例えば、パーキンソン病；進行性核上性麻痺；小脳の構造的病変；脊髄小脳性
変性、例えば、脊髄性運動失調、フリートライヒ運動失調、小脳皮質性変性、多
発性全身性変性（Ｍｅｎｃｅｌ，Ｄｅｊｅｒｉｎｅ−Ｔｈｏｍａｓ、Ｓｈｉ−Ｄ
ｒａｇｅｒ、およびＭａｃｈａｄｏ−Ｊｏｓｅｐｈ）；全身性障害（レフサム病
、無β‐リポ蛋白血症、運動失調、毛細血管拡張症、およびミトコンドリア性多
発性全身疾患）；脱髄コア障害、例えば、多発性硬化症、急性横断脊髄炎；およ
び運動単位の疾患、例えば、神経性筋萎縮（前角細胞変性、例えば、筋萎縮性側
索硬化症、乳児脊髄性筋萎縮症、および若年性脊髄性筋萎縮症）；アルツハイマ
ー病；中年層におけるダウン症候群；汎発性レーヴィ体疾患；レーヴィ体型の老
年痴呆；ヴェルニッケ−コルサコフ症候群；慢性アルコール症；クロイツフェル
ト−ヤーコプ病；亜急性硬化性汎脳炎、Ｈａｌｌｅｒｖｏｒｄｅｎ‐Ｓｐａｔｚ
疾患；ならびにボクシング性痴呆（Ｄｅｍｅｎｔｉａ ｐｕｇｉｌｉｓｔｉｃａ
）。１つの好ましい神経変性疾患は、多発性硬化症である。例えば、このポリペ
プチドは、本明細書中以後に記載されるような量で使用され得る。
【０２３０】 さらに、ＭＩＰ−１αレセプターが、ＨＩＶのヒト単球へのエントリーを容易
にする際の補因子として機能し、そしてＴ−リンパ球は、Ｃｋβ−６またはその
改変体が、ＨＩＶエントリーのプロセス、または他のウイルス（特に、レトロウ
イルス）の細胞へのエントリーを妨害し得ることの興味深い可能性を増加すると
いう最近の立証。Ｃｋβ−６は、ウイルスまたはレトロウイルス（これらのエン
トリーが、Ｃｋβ−６レセプターによって容易にされる）についての抗ウイルス
薬剤として使用され得る。
【０２３１】 （表２） （２日後の末梢血、脾臓、および骨髄中の原始造血前駆体の分布に対する、マ
ウスへのＣｋβ−６投与の効果）
【０２３２】
【表２】 ＰＢ＝末梢血、単核細胞 Ｓｐｌ．＝脾臓細胞の低密度画分 ＢＭ＝原始細胞について６倍富化された骨髄画分 ＨＰＰ＝高増殖性の潜在的なコロニー形成細胞 ＬＰＰ＝低増殖性の潜在的なコロニー形成細胞 ＩＭ＝非成熟細胞（骨髄に見られる稀な細胞型）であって、これは、複数のサイ
トカインの存在下で、高度に屈折性（ｒｅｆｒｅｃｔｉｌｅ）の小さい（＜５０
細胞／コロニー）コロニーを生じる；コロニー内の細胞は、水平面においてスタ
ックし、そしてそれらは芽球細胞様の核染色特性を示す ３匹のマウスに、Ｃｋβ−６または生理食塩水のいずれかを用いて毎日ＩＰ注
射した。最初の注射後の４８時間後、血液を、心臓穿刺によって各動物から収集
し、そしてマウスを、骨髄および脾臓を得るために、屠殺した。組織の各々から
の細胞の示された数を、次いで、ｒｍＩＬ−３（５ｎｇ／ｍｌ）、ｒｍＳＣＦ（
５０ｎｇ／ｍｌ）、ｒｈＭ−ＣＳＦ（５ｎｇ／ｍｌ）およびｒｍＩＬ−１ａ（１
０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で、寒天含有培地に、２回プレートし、そして１４日間
インキュベートした。データを各分において３匹の動物からプールし、そして平
均±Ｓ．Ｄとして表現する。
【０２３３】 （表３） （４日後の末梢血、脾臓、および骨髄中の原始造血前駆体の分布に対する、マ
ウスへのＣｋβ−６投与の効果）
【０２３４】
【表３】 ＰＢ＝末梢血、単核細胞 Ｓｐｌ．＝脾臓細胞の低密度画分 ＢＭ＝原始細胞について６倍富化された骨髄画分 ＨＰＰ＝高増殖性の潜在的なコロニー形成細胞 ＬＰＰ＝低増殖性の潜在的なコロニー形成細胞 ＩＭ＝非成熟細胞（骨髄に見られる稀な細胞型）であって、これは、複数のサイ
トカインの存在下で、高度に屈折性（ｒｅｆｒｅｃｔｉｌｅ）の小さい（＜５０
細胞／コロニー）コロニーを生じる；コロニー内の細胞は、水平面においてスタ
ックし、そしてそれらは芽球細胞様の核染色特性を示す ３匹のマウスに、Ｃｋβ−６または生理食塩水のいずれかを用いて毎日ＩＰ注
射した。最初の注射後の９６時間後、血液を、心臓穿刺によって各動物から収集
し、そしてマウスを、骨髄および脾臓を得るために、屠殺した。組織の各々から
の細胞の示された数を、次いで、ｒｍＩＬ−３（５ｎｇ／ｍｌ）、ｒｍＳＣＦ（
５０ｎｇ／ｍｌ）、ｒｈＭ−ＣＳＦ（５ｎｇ／ｍｌ）およびｒｍＩＬ−１ａ（１
０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で、寒天含有培地に、２回プレートし、そして１４日間
インキュベートした。データを各分において３匹の動物からプールし、そして平
均±Ｓ．Ｄとして表現する。
【０２３５】 （表４） （２日後の、Ｃｋβ−６を用いて投与されたマウスにおける、ＦＡＣＳによる
抹消血白血球組成の分析）
【０２３６】
【表４】 ３匹のＣ５７Ｂｌａｃｋマウス（約２０ｇの重量）に、Ｃｋβ−６または生理
食塩水のいずれかを用いて毎日注射（ＩＰ）した。最初の注射後の４８時間後、
血液を、心臓穿刺によって各動物から収集し、そしてマウスを、脾臓および骨髄
細胞を得るために、屠殺した。免疫染色について、各動物からの０．１ｍｌの血
液を、最初に、赤血球を溶解するために、Ｇｅｎ Ｔｒａｋ溶解溶液で処理した
。次いで、有核細胞を、沈降させ、ＰＢＳで洗浄し、そしてＣＤ４５Ｒ、Ｇｒ．
１、Ｍａｃ．１、ＣＤ４およびＣＤ８に対するＰＲ結合モノクローナル抗体とと
もにインキュベートし、そしてフローサイトメトリーのために処理した。少なく
とも１０，０００個の細胞を分析した。データを、適切なチャネル±ＳＤにおけ
る平均％陽性細胞として表現する。
【０２３７】 本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、科学的研究に関連するイン
ビトロ目的、ＤＮＡの合成およびＤＮＡベクターの製造、ならびに治療剤の開発
の目的のため、そしてヒト疾患の処置のための研究試薬として使用され得る。例
えば、Ｃｋβ−６は、それらの分化を阻害することによる、非成熟造血前駆細胞
（例えば、顆粒球、マクロファージまたは単球）の拡張のために使用され得る。
これらの骨髄細胞は、インビトロで培養され得る。
【０２３８】 （レセプター） 本発明は、Ｃｋβ−６に対するレセプターの同定のための方法を提供する。こ
のレセプターをコードする遺伝子は、当業者に公知の多くの方法（例えば、リガ
ンドパンニングおよびＦＡＣＳソーティング（Ｃｏｌｉｇａｎら、Ｃｕｒｒｅｎ
ｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎ．，１（２），第５章、（１９９１
））によって同定され得る。好ましくは、発現クローニングを使用し、ここで、
ポリアデニル化されたＲＮＡをＣｋβ−６に応答する細胞から調製し、そしてこ
のＲＮＡから作製したｃＤＮＡライブラリーをプールに分割し、そしてＣＯＳ細
胞またはＣｋβ−６に応答しない他の細胞をトランスフェクトするために使用す
る。ガラススライド上で増殖するトランスフェクトされた細胞を、標識したＣｋ
β−６に曝す。Ｃｋβ−６を、部位特異的タンパク質キナーゼについての認識部
位のヨウ素化または封入を含む、種々の手段によって標識し得る。固定およびイ
ンキュベーションに続いて、スライドをオートラジオグラフィー分析に供する。
陽性のプールを同定し、そしてサブプールを調製し、そして反復サブプール化お
よび再スクリーニングプロセスを用いて再度トランスフェクトし、最終的に推定
のレセプターをコードする単一のクローンを生じる。レセプター同定のための代
替的なアプローチとして、標識されたリガンドは、細胞膜に光親和的に結合され
得るか、またはレセプター分子を発現する調製物を抽出する。架橋した材料をＰ
ＡＧＥによって分離し、そしてＸ線フィルムに曝す。リガンドレセプターを含有
する標識した複合体を切り出し、ペプチドフラグメントに分解し、そしてタンパ
ク質微量配列決定に供し得る。微量配列決定から得られたアミノ酸配列を使用し
て、縮重オリゴヌクレオチドプローブのセットを設計し、ｃＤＮＡライブラリー
をスクリーニングして推定のレセプターをコードする遺伝子を同定する。
【０２３９】 ケモカインレセプター−３（ＣＣＲ）は、本明細書中のＣｋβ−６レセプター
の１つであると同定されている（以下の、実施例９、１０および１１を参照のこ
と）。ＣＣＲ３はまた、ケモカイン−β−１０（Ｕｇｕｃｃｉｏｎｉ、Ｍ．，ら
，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３：２３７９−２３８４（１９９６）において「Ｍ
ＣＰ−４」として公開される）およびエオタキシンに対するレセプターであるこ
とが知られている。従って、当業者によって期待されるように、ＣＣＲ３に結合
し得るが、シグナル伝達を誘導する能力を欠くＣｋβ−６アンタゴニストがまた
、ケモカイン−β−１０活性およびエオタキシン活性のアンタゴニストであるこ
とがまた期待される。いくつかの活性を以下に記載する。
【０２４０】 （アンタゴニスト、アゴニストおよび方法） ＭＰＩＦ−２は、好酸球および骨髄様前駆体に対する選択および強力な活性を
有するβ−ケモカインである。本発明は、ＭＰＩＦ−２のＮＨ2末端欠失変異体
の生物学的活性を評価して、好酸球および骨髄様前駆体活性について必要な領域
を同定および比較した。Ｎ末端において異なる欠失を有する５つのＭＰＩＦ−２
変異体タンパク質をＥ．ｃｏｌｉにおいて生成し、そしてカルシウム移動、走化
性および好酸球に対するレセプター結合活性、ならびにヒト骨髄性骨髄前駆体の
コロニー形成を阻害するそれらの能力についてアッセイした。好酸球の場合にお
いて、最初の２つのアミノ酸の欠失は、顕著に活性を変更しなかったが、続く切
断は、活性の完全な消失を生じた。ＭＰＩＦ−２変異体の１つ（ＭＰＩＦ−２（
Ｐ３０−Ｒ９９））を、エオタキシンのアンタゴニストに対するアゴニスト、Ｍ
ＰＩＦ−２および好酸球カルシウム流束および走化性アッセイにおけるＭＣＰ−
４機能的応答から変換した。原始好酸球に対する結合研究は、ＭＰＩＦ−２（Ｐ
３０−Ｒ９９）が、競合レセプターアンタゴニストであり、そしてＣＣＲ３を介
するシグナルを脱感作することを示す。驚くべくことに、好酸球に対するアゴニ
スト活性の完全な消失を示すが、ＭＰＩＦ−２（Ｐ３０−Ｒ９９）は、ヒト骨髄
の骨髄様前駆細胞コロニー形成を阻害する完全な、そして多少増強された能力を
維持する。これらの２つの細胞型に対するＭＰＩＦ−２（Ｐ３０−Ｒ９９）を用
いて得られた差示的な請求項１に記載の異物学的応答は、骨髄細胞に存在するさ
らなるレセプターが、ＭＰＩＦ−２の骨髄様前駆体阻害活性を媒介することを示
す（実施例１４を参照のこと）。
【０２４１】 本発明はまた、本発明のアゴニストおよびアンタゴニストを同定するために化
合物をスクリーニングする方法を提供する。アゴニストは、ポリペプチドの類似
の生物学的機能を有するか、この機能を増強する化合物であるが、アンタゴニス
トは、このような機能をブロックする。例として、Ｃｋβ−６を発現する哺乳動
物細胞または膜調製物は、目的の化合物と接触される。次いで、Ｃｋβ−６レセ
プターとの相互作用の後に、既知の第二のメッセンジャー系の応答を生成する化
合物の能力が、測定される。このような第二のメッセンジャー系としては、カル
シウム放出（例えば、実施例９に記載される）、ｃＡＭＰグアニル酸シクラーゼ
、イオンチャネルまたはホスホイノシチド加水分解が挙げられるが、これらに限
定されない。Ｃｋβ−６レセプターに結合し、そして第二のメッセンジャー応答
を惹起する化合物の能力は、その化合物をアゴニストとして同定する。結合する
が第二のメッセンジャー応答を惹起しない化合物は、アンタゴニストとして同定
される。
【０２４２】 化合物が、例えば、放射能によって標識される競合結合アッセイがまた、アン
タゴニストを同定するために使用され得る。このような方法は、当該分野で公知
である。
【０２４３】 アンタゴニストは、Ｃｋβ−６のネガティブドミナント変異体を含む。Ｃｋβ
−６は、テトラマー性ポリペプチドであり、ここで、１つの変異単位がポリペプ
チド全体を非機能的にする。Ｃｋβ−６のネガティブドミナント変異体は、Ｃｋ
β−６レセプターに結合するが、それが結合する細胞（白血球および好酸球）を
活性化し損なう。Ｃｋβ−６のネガティブドミナント変異体を検出するためのア
ッセイは、インビトロ走化性アッセイであり、ここで、ポリビニルピロリドンを
含まないポリカーボネート膜を備えるマルチウェル走化性チャンバーを使用して
、以下の実施例１０に記載されるような、潜在的なアンタゴニストまたはアゴニ
スト分子の存在下および非存在下での、白血球に対するＣｋβ−６の化学誘引活
性を測定する。好ましいアッセイは、例えば、以下の実施例９に記載される、イ
ンビトロカルシウム（Ｃａ2+）放出アッセイである。
【０２４４】 潜在的なアンタゴニストはまた、抗体を含むか、またはいくつかの場合におい
て、オリゴペプチドまたはオリゴヌクレオチドを含み、これらは、ポリペプチド
に結合し、そしてそれがそのレセプターに結合することを阻害する。
【０２４５】 別の潜在的なアンタゴニストは、アンチセンス技術を使用して調製されたアン
チセンス構築物である。アンチセンス技術は、３重螺旋形成あるいはアンチセン
スＤＮＡまたはＲＮＡを介して遺伝子発現を制御するために使用され得、これら
の方法の両方が、ポリヌクレオチドのＤＮＡまたはＲＮＡへの結合に基づく。例
えば、ポリヌクレオチド配列（これは、本発明の成熟ポリペプチドをコードする
）の５’部分は、約１０〜４０塩基長のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチド
を設計するために使用される。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に関係する遺
伝子の領域に相補的であるように設計され（３重螺旋−−Ｌｅｅ，ら，Ｎｕｃｌ
．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．６：３０７３（１９７９）；Ｃｏｏｎｅｙ，ら，Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ ２４１：４５６（１９８８）；およびＤｅｒｖａｎ，ら，Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ２５１：１３６０（１９９１）を参照のこと）、それによって、Ｃｋβ−
６の転写および生成を阻害する。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドは、ｍ
ＲＮＡにインビボでハイブリダイズし、そしてｍＲＮＡ分子のＣｋβ−６ポリペ
プチドへの翻訳をブロックする（アンチセンス−−Ｏｋａｎｏ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏ
ｃｈｅｍ．５６：５６０（１９９１）；Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉ
ｄｅｓ Ａｓ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ
Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１
９８８）を参照のこと）。上記のオリゴヌクレオチドはまた、細胞に送達され得
、その結果、アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡがＣｋβ−６の生成を阻害するた
めに、インビボで発現され得る。
【０２４６】 潜在的なアンタゴニストは、ポリペプチドの活性部位に結合し、そしてｋこの
活性部位を占有し、それによって、通常の生物学的活性が阻害されるように基質
にアクセス可能ではない触媒部位を作製する、小分子を含む。小分子の例として
は、小さいペプチドまたはペプチド様分子が挙げられるが、これらに限定されな
い。
【０２４７】 別の潜在的なアンタゴニストは、ポリペプチドのペプチド誘導体であり、これ
らは、生物学的機能を失っているが、なおもポリペプチドのレセプターを認識し
、そしてそれらの結合し、それによってレセプターを有効にブロックする、ポリ
ペプチドの天然または合成改変アナログである。ペプチド誘導体の例としては、
小さいペプチドまたはペプチド様分子が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２４８】 本明細書に記載されるように、本発明の特定のＣｋβ−６アンタゴニストが図
２３Ｂに示される（Ｅｏ−２（Ｐ３０−Ｒ９９）；表５をまた、参照のこと）。
本発明者らは、このポリペプチドが、ＣＣＲ３シグナル伝達をアンタゴナイズす
るが、これが、ヒト骨髄の骨髄様前駆細胞コロニー形成を阻害する完全な、そし
て多少増強されたＣｋβ−６の能力を維持することを決定した（表６を参照のこ
と）。従って、このＣｋβ−６／ＭＰＩＦ−２アンタゴニストの使用は、Ｃｋβ
−６／ＭＰＩＦ−２アゴニストについて、上記の造血前駆細胞を調節、移動およ
び保護する方法を提供する。
【０２４９】 これらのアンタゴニストは、Ｃｋβ−６誘導または増強されるかのいずれかの
障害（例えば、自己免疫および慢性の炎症性および感染性疾患）を処置するため
に、使用され得る。自己免疫疾患の例としては、多発性硬化症およびインスリン
依存性糖尿病が挙げられる。
【０２５０】 これらのアンタゴニストは、創傷または外傷の部位への好酸球または好塩基球
の誘引を阻害することによって炎症を処置するため、そして正常な肺マクロファ
ージ集団を調節すために、使用され得る。なぜなら、急性および慢性の炎症性肺
疾患は、肺における単核食細胞の壊死巣分離に関係するからである。それらはま
た、慢性関節リウマチを処置するために使用され得る。なぜなら、ＭＣＰレベル
は、慢性関節リウマチ患者のからの滑液において、有意に上昇していることが見
出されており、このことは、Ｃｋβ−６の滑液生成が、好酸球または好塩基球を
誘引し、これらの流入および活性化が、変性関節症および炎症性関節症の両方の
病因において重要である。
【０２５１】 これらのアンタゴニストはまた、アレルギーを予防するために使用され得る。
なぜなら、ＭＣＰが、好塩基球によるヒスタミン放出を直接誘導することが示さ
れているからである。関連する免疫学的障害（後期アレルギー反応、慢性じんま
疹、およびアトピー性皮膚炎を含む）が、アンタゴニストによって処置され、こ
のアンタゴニストは、ケモカイン誘導肥胖細胞および好塩基球の脱顆粒ならびに
ヒスタミンの放出を阻害するのに有効である。ＩｇＥ媒介アレルギー反応（例え
ば、喘息、鼻炎、および湿疹など）がまた処置され得る。アンタゴニストは、成
人呼吸窮迫症候群および気道炎症を処置するために使用され得る。
【０２５２】 アンタゴニストはまた、好酸球生成および移動を阻害することによって、特発
性過剰好酸性症候群を処置するために使用される。内毒素ショックもまた、マク
ロファージの移動および本発明のケモカインポリペプチドのそれらの生成を阻害
することによって、アンタゴニストにより処置され得る。これらのアンタゴニス
トは、薬学的に受容可能なキャリア（例えば、本明細書中に記載されるような）
を含む組成物において使用され得る。
【０２５３】 アンタゴニストはまた、患者の関節中の滑液への、好酸球および好塩基球の誘
引を阻害することによって、慢性関節リウマチを処置するための使用され得る。
【０２５４】 これらのアンタゴニストは、ＩＬ−１およびＴＮＦ（これらは、他の炎症性サ
イトカインの生合成を阻害する）に主に帰する有害なカスケードを妨害するため
に使用され得る。このように、これらのアンタゴニストは、ケモカインによって
誘導されるプロスタグランジン非依存性熱を阻害するために使用され得る。
【０２５５】 これらのアンタゴニストはまた、骨髄不全（例えば、再生不良性貧血および脊
髄形成異常症候群）を処置するために使用され得る。これらのアンタゴニストは
また、ぜん息性肺の顕著な特徴である上皮下基底膜線維症を処置するために使用
され得る。
【０２５６】 Ｃｋβ−６アゴニストは、本明細書中に記載されるような、Ｃｋβ−６ポリペ
プチドに類似する活性を有する任意の小分子を含む。例えば、Ｃｋβ−６アゴニ
ストは、Ｃｋβ−６活性を増強するために使用され得る。例えば、治療（例えば
、化学療法）または骨髄移植を受けている患者におけるＣｋβ−６誘導骨髄保護
を増強するため。
【０２５７】 （薬学的組成物） Ｃｋβ−６薬学的組成物は、本発明の有効量の単離されたＣｋβ−６ポリペプ
チド、アゴニストまたはアンタゴニスト、特に、このような個体におけるＣｋβ
−６活性を増加するのに有効な成熟形態のＣｋβ−６を含む。このような組成物
は、良好な医学的実施に一貫した様式で、個々の患者の臨床状態（特に、Ｃｋβ
−６ポリペプチド単独による処置の副作用）、ポリペプチド組成物の送達の部位
、投与の方法、投与のスケジュール、および実施者に公知の他の因子を考慮して
、処方および投与され得る。従って、本明細書中の目的のための有効量のＣｋβ
−６ポリペプチドは、このような考慮によって決定される。
【０２５８】 本発明のポリペプチド、ならびにアゴニストおよびアンタゴニストは、適切な
薬学的キャリアと組み合わせて、使用され得る。このような組成物は、治療的に
有効量のポリペプチドまたはアゴニストまたはアンタゴニスト、および薬学的に
受容可能なキャリアまたは賦形剤を含む。このようなキャリアは、生理食塩水、
緩衝化生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびそ
れらの組み合わせを含むが、それらに限定されない。この処方物は、投与の形態
に適さなければならない。
【０２５９】 「薬学的に受容可能なキャリア」とは、任意の型の非毒性固体、半固体または
液体のフィラー、希釈剤、カプセル化材料または処方補助剤を意味する。本明細
書中で使用される、用語「非経口」とは、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨下、皮
下および関節内の注射および注入の形態をいう。
【０２６０】 Ｃｋβ−６ポリペプチドはまた、徐方系によって適切に投与される。徐方組成
物の適切な例として、成形された組成物（例えば、フィルムまたはマイクロカプ
セル）の形態の半透性ポリマーマトリクスが挙げられる。徐方マトリクスとして
、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号、欧州特許第５８，４８１号
）、Ｌ−グルタミン酸およびγ−エチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー（Ｓｉ
ｄｍａｎ，Ｕ．，ら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２２：５４７−５５６（１９８
３）、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（Ｒ．Ｌａｎｇｅｒら、Ｊ
．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２７７（１９８１）、お
よびＲ．Ｌａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５（１９８２）
）、エチレンビニルアセテート（Ｒ．Ｌａｎｇｅｒら、Ｉｄ）またはポリ−Ｄ−
（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ１３３，９８８））が挙げられる。徐方性Ｃ
ｋβ−６ポリペプチド組成物はまた、リポソームに包埋されたＣｋβ−６ポリペ
プチドを含む。Ｃｋβ−６ポリペプチドを含むリポソームは、以下のそれ自体公
知の方法によって調製される。ＤＥ３，２１８，１２１；Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８２：３６８８−３６９２（
１９８５）；Ｈｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ（ＵＳＡ）
７７：４０３０−４０３４（１９８０）；ＥＰ５２，３２２；ＥＰ３６，６７６
；ＥＰ８８，０４６；ＥＰ１４３，９４９；ＥＰ１４２，６４１；日本特許出願
８３−１１８００８；米国特許第４，４８５，０４５号および同第４，５４４，
５４５号および；ならびにＥＰ１０２，３２４。通常、リポソームは、小さな（
約２００−８００オングストローム）単層型であり、脂質内容物は、約３０モル
％を超えるコレステロールであり、選択された割合は、最適なＣｋβ−６ポリペ
プチド治療のために調整される。
【０２６１】 非経口投与の場合、１実施形態において、Ｃｋβ−６ポリペプチドは、一般的
に、それを、所望される程度の純度で、単一用量の注射可能な形態（溶液、懸濁
液、またはエマルジョン）で、薬学的に受容可能なキャリア（すなわち、使用さ
れる用量および濃度において、レシピエントに対して非毒性であり、処方物の他
の成分と適合性であるもの）と混合することによって処方される。例えば、この
処方物は、好ましくは、ポリペプチドに対して有毒であることが公知の酸化剤お
よび他の化合物を含まない。
【０２６２】 一般的に、処方物は、Ｃｋβ−６ポリペプチドと、液体キャリアまたは微細に
分割された固体キャリアまたはその両方とを均一にかつ十分に接触させることに
よって調製される。次いで、必要に応じて、この生成物は、所望の処方物に成形
される。好ましくは、このキャリアは、非経口キャリアであり、より好ましくは
、レシピエントの血液と等張性である溶液である。このようなキャリアベシクル
の例として、水、生理食塩水、リンガー溶液、およびデキストロース溶液が挙げ
られる。不揮発性油およびエチルオレエートのような非水性ベシクルはまた、リ
ポソームと同様に、本明細書中で有用である。
【０２６３】 このキャリアは、等張性および化学安定性を改善する物質のような少量の添加
剤を含む。このような物質は、使用される用量および濃度でレシピエントに対し
て非毒性であり、以下のような緩衝剤を含む：リン酸、クエン酸、コハク酸、酢
酸、および他の有機酸またはそれらの塩；アスコルビン酸のような抗酸化剤；低
分子量（約１０残基未満）のポリペプチド（例えば、ポリアルギニンまたはトリ
ペプチド）；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンのようなタンパ
ク質；ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー；グリシン、グルタミン酸
、アスパラギン酸またはアルギニンのようなアミノ酸；単糖類、二糖類、および
他の炭水化物（セルロースまたはそれらの誘導体、グルコース、マンノース、ま
たはデキストリン）；ＥＤＴＡのようなキレート化剤；マンニトールまたはソル
ビトールのような糖アルコール；ナトリウムのような対イオン；および／または
ポリソルベート、ポロキサマー、またはＰＥＧのような非イオン性界面活性剤。
【０２６４】 Ｃｋβ−６ポリペプチドは、代表的に、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍ
ｌ、好ましくは、１〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度で、約３〜８のｐＨで、このような
ベシクルに処方される。特定の上記賦形剤、キャリア、または安定化剤の使用が
、Ｃｋβ−６ポリペプチド塩の形成を生じることが理解される。
【０２６５】 治療投与に使用されるＣｋβ−６ポリペプチドは、滅菌されなければならない
。滅菌は、滅菌濾過膜（例えば、０．２ミクロン膜）を通した濾過によって容易
に達成される。治療Ｃｋβ−６ポリペプチド組成物は、一般に、滅菌アクセスポ
ートを有する容器（例えば、静脈内溶液バッグまたは皮下注射針によって穿通可
能なストッパーを有するバイアル）内に設置される。
【０２６６】 Ｃｋβ−６ポリペプチドは、通常、単一用量容器または複数用量容器（例えば
、再構成のための水溶液または凍結乾燥した処方物としての密封されたアンプル
またはバイアル）に保存される。凍結乾燥した処方物の例として、１０ｍｌバイ
アルに、５ｍｌの滅菌濾過した１％（Ｗ／Ｖ）Ｃｋβ−６ポリペプチド水溶液を
充填し、得られた混合物を凍結乾燥した。注射溶液を、注射用静菌水を使用して
、凍結乾燥したＣｋβ−６ポリペプチドを再構成することによって調製する。
【０２６７】 本発明はまた、本発明の薬学的組成物の１種以上の成分で充填した１つ以上の
容器を備える薬学的パックまたはキットを提供する。このような容器に関して、
薬学的製品または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関によ
って規定された形態の注意が存在し得、この注意は、ヒト投与のための製造、使
用または販売の機関による承認を反映する。さらに、本発明のポリペプチド、ま
たはアゴニストおよびアンタゴニストは、他の治療化合物と組み合わせて使用さ
れ得る。
【０２６８】 （投与の形態） 個体における標準レベルまたは通常レベルのＣｋβ−６活性の減少によって引
き起こされる状態が、Ｃｋβ−６タンパク質の投与によって処置され得ることが
理解される。従って、本発明は、増加したレベルのＣｋβ−６活性を必要とする
個体を処置する方法をさらに提供し、この方法は、本発明の単離されたＣｋβ−
６ポリペプチド（特に、このような個体のＣｋβ−６活性を増加させるのに有効
なＣｋβ−６の成熟形態）の有効量、を含む薬学的組成物をこのような個体に投
与する工程を包含する。
【０２６９】 被験体に投与されるＣｋβ−６の量および投与レジメンは、投与の形態、処置
さる状態および処方する医師の判断のような多くの因子に依存する。薬学的状態
は、特定の徴候の処置および／または予防に有効な量で投与される。一般に、ポ
リペプチドは、少なくとも約１０μｇ／体重１ｋｇの量で投与され、ほとんどの
場合、投与の経路、症状などを考慮して、それらは、一日あたり約１０ｍｇ／体
重１ｋｇを超えない量で投与され、好ましくは、用量は、一日あたり約１０μｇ
／体重１ｋｇ以上である。
【０２７０】 一般的な案として、１回の投与あたり非経口投与されるＣｋβ−６ポリペプチ
ドの薬学的に有効な総量は、上記のとおり、１日あたり患者体重１ｋｇあたり約
１μｇ〜１０ｍｇの範囲であるが、これは治療の裁量に供せられる。さらにより
好ましくは、この用量は、少なくとも０．０１ｍｇ／ｋｇ／日であり、そして最
も好ましくは、ヒトの場合、約０．０１ｍｇ／ｋｇ／日と１ｍｇ／ｋｇ／日との
間である。連続的に与えられる場合、Ｃｋβ−６ポリペプチドは、代表的に、例
えば、ミニポンプを使用して、一日あたり１〜４回の注射または連続的な皮下注
入のいずれかによって、約１μｇ／ｋｇ／時間〜約５０μｇ／ｋｇ／時間の投与
速度で投与される。静脈内注射バッグ溶液もまた、使用され得る。生じる応答に
ついての変化および処置後の間隔を観察するために必要とされる処置の長さは、
所望の効果に依存して変化すると考えられる。
【０２７１】 薬学的組成物は、経口、局所、非経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、鼻腔
内または皮内の経路のような従来の様式で投与され得る。
【０２７２】 （遺伝子治療） ポリペプチドおよびポリペプチドであるアゴニストおよびアンタゴニストはま
た、インビボでのこのようなポリペプチドの発現によって本発明に従って使用さ
れ得、これはしばしば、「遺伝子治療」といわれる。
【０２７３】 従って、例えば、患者由来の細胞は、エキソビボでポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）で操作され得、次いで、操作された細
胞は、ポリペプチドで処置された患者に提供される。このような方法は、当該分
野で周知であり、本明細書中の教示から明らかである。例えば、細胞は、本発明
のポリペプチドをコードするＲＮＡを含むレトロウイルスプラスミドベクターの
使用によって操作され得る。
【０２７４】 同様に、細胞は、例えば、当該分野で公知の手順によって、インビボでのポリ
ペプチドの発現のためにインビボで操作され得る。例えば、パッキング細胞は、
本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含むレトロウイルスプラスミドベク
ターで形質転換され、その結果、パッキング細胞は、ここで、目的の遺伝子を含
む感染性ウイルス粒子を産生する。これらのプロデューサー細胞は、インビボで
細胞を操作し、インビボでポリペプチドを発現するために患者に投与され得る。
このような方法によって、本発明のポリペプチドを投与するためのこれらの方法
および他の方法は、本発明の教示から当業者に明らかである。
【０２７５】 上記のレトロウイルスプラスミドベクターが誘導され得るレトロウイルスとし
て、Ｍｏｌｏｎｅｙ Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ、膵臓壊死
ウイルス、Ｒｏｕｓ Ｓａｒｃｏｍａ Ｖｉｒｕｓのようなレトロウイルス、Ｈ
ａｒｖｅｙ Ｓａｒｃｏｍａ Ｖｉｒｕｓ、トリ白血病ウイルス、テナガザル白
血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、アデノウイルス、Ｍｙｅｌｏｐｒｏｌｉ
ｆｅｒａｔｉｖｅ Ｓａｒｃｏｍａ Ｖｉｒｕｓ、および乳房腫瘍ウイルスが挙
げられるが、これらに限定されない。１実施形態において、レトロウイルスプラ
スミドベクターは、Ｍｏｌｏｎｅｙ Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒ
ｕｓから誘導される。
【０２７６】 好ましい実施形態において、レトロウイルス発現ベクター、ｐＭＶ−７は、モ
ロニーネズミ肉腫ウイルスの長い末端反復（ＬＴＲ）によって隣接され、ヘルペ
ス単体ウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ（ｔｋ）プロモーターの制御下で選
択可能な新薬物耐性遺伝子を含む。特異なＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位
は、コード配列の導入を容易にする（Ｋｉｒｓｃｈｍｅｉｅｒ，Ｐ．Ｔ．ら、Ｄ
ＮＡ、７：２１９−２５（１９８８））。
【０２７７】 ベクターは、１つ以上のプロモーターを含む。使用され得る適切なプロモータ
ーとして、レトロウイルスＬＴＲ；ＳＶ４０プロモーター；およびＭｉｌｌｅｒ
ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ７（９）：９８０−９９０に記載されるヒトサ
イトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、または任意の他のプロモーター（
例えば、ヒストン、ｐｏｌ ＩＩＩ、およびｂ−アクチンプロモーターを含むが
、これらに限定されない真核生物細胞プロモーターのような細胞プロモーター）
が挙げられるが、これらに限定されない。使用され得る他のウイルスプロモータ
ーとして、アデノウイルスプロモーター、チミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモータ
ー、およびＢ１９パルボウイルスプロモーターが挙げられるが、これらに限定さ
れない。適切なプロモーターの選択は、本明細書中に含まれる教示から当業者に
明らかである。
【０２７８】 本発明のポリペプチドをコードする核酸配列は、適切なプロモーターの制御下
にある。使用され得る適切なプロモーターとして、アデノウイルスプロモーター
（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター）；または異種プロモーター（
例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター）；呼吸器合胞体ウイル
ス（ＲＳＶ）プロモーター；誘発性プロモーター（例えば、ＭＭＴプロモーター
、メタロチオネインプロモーター）；熱ショックプロモーター；アルブミンプロ
モーター；ＡｐｏＡＩプロモーター；ヒトグロブリンプロモーター；ウイルスチ
ミジンキナーゼプロモーター（例えば、Ｈｅｒｐｅｓ Ｓｉｍｐｌｅｘチミジン
キナーゼプロモーター）；レトロウイルスＬＴＲ（本明細書中で上記の改変され
たレトロウイルスＬＴＲ）；ｂ−アクチンプロモーター；およびヒト成長ホルモ
ンプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。このプロモーターはま
た、ポリペプチドをコードする遺伝子を制御する天然プロモーターであり得る。
【０２７９】 レトロウイルスプラスミドベクターは、プロデューサー細胞株を形成するため
にパッケージング細胞株を形質転換するために使用される。トランスフェクトさ
れ得るパッケージング細胞の例として、ＰＥ５０１、ＰＡ３１７、ｙ−２、ｙ−
ＡＭ、ＰＡ１２、Ｔ１９−１４Ｘ、ＶＴ−１９−１７−Ｈ２、ｙＣＲＥ、ｙＣＲ
ＩＰ、ＧＰ＋Ｅ−８６、ＧＰ＋ｅｎｖＡｍ１２、およびＭｉｌｌｅｒ、Ｈｕｍａ
ｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、第１巻（１９９０）、５〜１４頁（これは、全
体を通して、本明細書中で参考として援用される）に記載されるようなＤＡＮ細
胞株が挙げられるが、これらに限定されない。ベクターは、当該分野で公知の任
意の手段を通してパッケージング細胞を形質転換し得る。このような手段として
、エレクトロポレーション、リポソームの使用、およびＣａＰＯ4沈殿が挙げら
れるが、これらに限定されない。１つの代替において、レトロウイルスプラスミ
ドベクターは、リポソーム内にカプセル化され得るか、または脂質に結合され得
、次いで、宿主に投与される。
【０２８０】 プロデューサー細胞株は、ポリペプチドをコードする核酸配列を含む感染レト
ロウイルスベクター粒子を発生する。次いで、このようなレトロウイルスベクタ
ー粒子は、インビトロまたはインビボのいずれかで、真核生物細胞を形質転換す
るために使用され得る。この形質転換された真核生物細胞は、ポリペプチドをコ
ードする核酸配列を発現する。形質転換され得る真核生物細胞として、胚幹細胞
、胚癌細胞、ならびに、造血幹細胞、肝細胞、線維芽細胞、筋芽細胞、ケラチノ
サイト、内皮細胞、および気管支上皮細胞が挙げられるが、これらに限定されな
い。
【０２８１】 （疾患診断および予知） 以下で議論される特定の疾患または障害は、対応する「標準」哺乳動物、すな
わちこれらの疾患または障害を有しない同じ種の哺乳動物と比較して、改変され
た（向上または低下した）レベルのＣｋβ−６タンパク質およびＣｋβ−６タン
パク質をコードするｍＲＮＡと関連付けられ得る。さらに、改変されたレベルの
Ｃｋβ−６タンパク質が、これらの疾患または障害を有しない同じ種の哺乳動物
由来の血清と比較した場合、疾患または障害を有する哺乳動物由来の特定の体液
（例えば、血清、血漿、尿、および髄液）において検出され得る。従って、本発
明は、診断方法を提供し、この方法は、哺乳動物細胞または体液中のＣｋβ−６
タンパク質をコードする遺伝子の発現レベルをアッセイする工程、および遺伝子
発現レベルを基準Ｃｋβ−６遺伝子発現レベルと比較する工程であって、ここで
、基準と比較した遺伝子発現レベルの改変は、特定の疾患または障害の表示であ
る、工程、を包含する。
【０２８２】 疾患または障害の診断が従来の方法に従ってなされている場合、本発明は、予
知インジケーターとして有用であり、それによって改変されたＣｋβ−６遺伝子
発現を示す患者は、正常に近いレベルで遺伝子を発現する患者に対して悪い臨床
結果を経験する。
【０２８３】 「Ｃｋβ−６タンパク質をコードする遺伝子の発現レベルをアッセイする」と
は、直接的に（例えば、絶対タンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルを決定また
は評価することによって）または相対的に（例えば、第２の生物学的サンプル中
のＣｋβ−６タンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルと比較することによって）
、第１の生物学的サンプル中のＣｋβ−６タンパク質のレベルまたはＣｋβ−６
タンパク質をコードするｍＲＮＡのレベルを定性的にまたは定量的に測定または
評価することを意図する。
【０２８４】 好ましくは、第１の生物学的サンプル中のＣｋβ−６タンパク質レベルまたは
ｍＲＮＡレベルが、測定または評価され、そして基準Ｃｋβ−６タンパク質レベ
ルまたはｍＲＮＡレベルと比較され、この基準は、疾患または障害を有しない個
体から得られた第２の生物学的サンプルから得られる。当該分野で理解されるよ
うに、一旦、基準Ｃｋβ−６タンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルが知られる
と、それは、比較のための基準として繰り返し使用され得る。
【０２８５】 「生物学的サンプル」とは、Ｃｋβ−６タンパク質またはｍＲＮＡを含む、個
体、細胞株、組織培養物、または他の供給源から得られる任意の生物学的サンプ
ルを意図する。生物学的サンプルとして、分泌された成熟Ｃｋβ−６タンパク質
を含む哺乳動物体液（例えば、血清、血漿、尿、滑液および髄液）、および造血
組織が挙げられる。哺乳動物由来の組織生検および体液を得るための方法は、当
該分野で周知である。生物学的サンプルがｍＲＮＡを含む場合、組織生検は好ま
しい供給源である。
【０２８６】 本発明は、哺乳動物における疾患を検出するのに有用である。特に、本発明は
、哺乳動物、好ましくはヒトにおける種々の免疫系関連障害の診断または処置に
有用である間、有用である。このような障害として、腫瘍、癌、および免疫細胞
機能（自己免疫、関節炎、白血病、リンパ腫、免疫抑制、敗血症、創傷治癒、急
性感染および慢性感染、細胞媒介免疫、体液免疫、炎症性腸疾患、骨髄抑制、喘
息など）の任意の非調節が挙げられる。好ましい哺乳動物として、モンキー、サ
ル、ネコ、イヌ、ウシ、ブタ、ウマ、ウサギおよびヒトが挙げられる。ヒトが、
特に好ましい。
【０２８７】 総細胞ＲＮＡは、任意の適切な技術（例えば、Ｃｈｍｃｚｙｎｓｋｉ ａｎｄ
Ｓａｃｃｈｉ， Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２：１５６−１５９（１９
８７）に記載される１工程のグアニジウム−チオシアネート−フェノール−クロ
ロホルム法）を使用して、生物学的サンプルから単離され得る。次いで、Ｃｋβ
−６タンパク質をコードするｍＲＮＡのレベルは、任意の適切な方法を使用して
アッセイされる。これらとして、ノーザンブロット分析、Ｓ１ヌクレアーゼマッ
ピング、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）、ポリメラーゼ鎖反応と組み合わせた逆
転写（ＲＴ−ＰＣＲ）、およびリガーゼ鎖反応と組み合わせた逆転写（ＲＴ−Ｌ
ＣＲ）が挙げられる。
【０２８８】 ノーザンブロット分析は、Ｈａｒａｄａら、Ｃｅｌｌ ６３：３０３−３１２
（１９９０）に記載されるように行われ得る。簡略的には、全ＲＮＡは、上記の
ように、生物学的サンプルから調製される。ノーザンブロットのために、ＲＮＡ
は、適切な緩衝液（例えば、グリオキサール／ジメチルスルホキシド／リン酸ナ
トリウム緩衝液）中で変性され、アガロースゲル電気泳動に供せられ、そしてニ
トロセルロースフィルター上に移される。ＲＮＡがＵＶリンカーによってフィル
ターに連結された後、このフィルターは、ホルムアミド、ＳＳＣ、Ｄｅｎｈａｒ
ｄｔ溶液、変性サケ精子、ＳＤＳ、およびリン酸ナトリウム緩衝剤を含む溶液中
で予めハイブリダイズされる。任意の適切な方法（例えば、３２Ｐ−マルチプラ
イムしたＤＮＡ標識システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））に従って標識されたＣｋβ
−６タンパク質ｃＤＮＡは、プローブとして使用される。一晩、ハイブリダイゼ
ーションした後、このフィルターは洗浄され、Ｘ線フィルムに曝露される。本発
明に従うプローブとしての使用のためのｃＤＮＡは、上記の節に記載され、好ま
しくは、少なくとも１５ｂｐ長である。
【０２８９】 Ｓ１マッピングは、Ｆｕｊｉｔａら、Ｃｅｌｌ４９：３５７−３６７（１９８
７）に記載されるように行われ得る。Ｓ１マッピングにおける使用のためのプロ
ーブＤＮＡを調製するために、上記ｃＤＮＡのセンス鎖がテンプレートとして使
用され、標識化されたアンチセンスを合成する。次いで、アンチセンスＤＮＡは
、適切な制限エンドヌクレアーゼを使用して消化され、所望の長さのＤＮＡプロ
ーブをさらに発生し得る。このようなアンチセンスプローブは、標的ｍＲＮＡ（
すなわち、Ｃｋβ−６タンパク質をコードするｍＲＮＡ）に対応する保護された
バンドを視覚化するために有用である。ノーザンブロット分析は、上記のように
行われ得る。
【０２９０】 好ましくは、Ｃｋβ−６タンパク質をコードするｍＲＮＡのレベルは、Ｍａｋ
ｉｎｏら、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ２：２９５−３０１（１９９０）に記載のＲＴ−
ＰＣＲ法を使用してアッセイされる。この方法によって、ポリアクリルアミドゲ
ルバンド中の「アンプリコン」の放射性は、標的ｍＲＮＡの初期濃度に直線的に
関連される。簡略的には、この方法は、ＲＴプライマーおよび適切な緩衝剤を含
む反応混合物に、生物学的サンプルから単離された全ＲＮＡを添加する工程を包
含する。プライマーアニーリングのためにインキュベートした後、この混合物は
、ＲＴ緩衝剤、ｄＮＴＰ、ＤＴＴ、ＲＮアーゼインヒビターおよび逆転写酵素で
補充され得る。ＲＮＡの逆転写を達成するためのインキュベーション後、次いで
、ＲＴ産生物は、標識されたプライマーを使用してＰＣＲに供せられる。あるい
は、プライマーを標識というより、標識されたｄＮＴＰが、ＰＣＲ反応混合物に
含まれ得る。ＰＣＲ増幅は、従来の技術に従って、ＤＮＡ熱サイクラー（ｔｈｅ
ｒｍａｌ ｃｙｃｌｅｒ）で行われ得る。増幅を行うための適切な数のラウンド
後、ＰＣＲ反応混合物は、ポリアミドゲル上で電気泳動される。このゲルを乾燥
した後、適切なバンド（Ｃｋβ−６タンパク質をコードするｍＲＮＡに対応する
）の放射性は、画像化分析器を使用して定量される。ＲＴおよびＰＣＲ反応成分
および条件、試薬およびゲル濃度、ならびに標識法は、当該分野で周知である。
ＲＴ−ＰＣＲ法におけるバリエーションは、当業者に理解される。
【０２９１】 逆転写された標的ｍＲＮＡを増幅するオリゴヌクレオチドプライマーの任意の
セットが使用され得、そして上記の節に記載されるように示され得る。
【０２９２】 生物学的サンプル中のＣｋβ−６タンパク質レベルのアッセイは、任意の当該
分野で公知の方法を使用して生じ得る。生物学的サンプル中のＣｋβ−６タンパ
ク質レベルをアッセイするのに、抗体ベースの技術が好ましい。例えば、組織内
でのＣｋβ−６タンパク質発現は、古典的な免疫組織学的方法によって研究され
得る。これらにおいて、特異的な認識は、一次抗体（ポリクローナルまたはモノ
クローナル）によって提供されるが、二次検出システムは、蛍光色素、酵素、ま
たは他の複合体化した二次抗体を使用し得る。結果として、病理学的試験のため
の組織切片の免疫組織学的染色が、得られる。組織はまた、Ｗｅｓｔｅｒｎブロ
ットまたはドット／スロットアッセイ（Ｊａｌｋａｎｅｎ，Ｍら、Ｊ．Ｃｅｌｌ
．Ｂｉｏｌ．１０１：９７６−９８５（１９８５）；Ｊａｌｋａｎｅｎ，Ｍら、
Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０５：３０８７−３０９６（１９８７））のための
Ｃｋβ−６タンパク質の遊離のために、例えば、尿素および中性界面活性剤を用
いて抽出され得る。カチオン性固相の使用に基づくこの技術において、Ｃｋβ−
６タンパク質の定量は、基準として単離されたＣｋβ−６タンパク質を使用して
達成され得る。この技術はまた、体液に適用され得る。これらのサンプルを用い
て、Ｃｋβ−６タンパク質のモル濃度は、血清、血漿、尿、髄液などのような異
なる体液について、Ｃｋβ−６タンパク質含有量の基準値を設定するために役立
つ。次いで、Ｃｋβ−６タンパク質の量の通常の見かけは、健常個体からの値を
使用して設定され得、これは、試験被験体から得られる値と比較され得る。
【０２９３】 Ｃｋβ−６タンパク質遺伝子発現を検出するために有用な他の抗体ベースの方
法として、イムノアッセイ（例えば、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）
）およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）が挙げられる。例えば、Ｃｋβ−６タ
ンパク質特異的モノクローナル抗体は、免疫吸着剤および酵素標識プローブとし
て使用され、Ｃｋβ−６タンパク質を検出および定量し得る。サンプル中に存在
するＣｋβ−６タンパク質の量は、線形回帰コンピュータアルゴニズムを使用し
て、標準調製において存在する量を基準にして、計算され得る。別のＥＬＩＳＡ
アッセイにおいて、２種の異なる特異的モノクローナル抗体が使用され、体液中
のＣｋβ−６タンパク質を検出し得る。このアッセイにおいて、抗体の一方は、
免疫吸着剤として使用され、他方は、酵素標識プローブとして使用される。
【０２９４】 上記の技術は本質的に「１工程」または「２工程」アッセイとして行われ得る
。「１工程」アッセイは固定化された抗体にＣｋβ−６タンパク質を接触させる
ことおよび洗浄無しで、標識された抗体に混合物を接触させることを含む。「２
工程」アッセイは、混合物を標識抗体と接触させる前に洗浄することを含む。他
の従来法もまた適切な場合は用いられ得る。アッセイシステムの１つの成分を支
持体に固定化し、それにより、そのシステムの他の成分をその成分と接触させ、
そしてそのサンプルから容易に除去するのを可能にすることが通常望ましい。
【０２９５】 適切な酵素標識としては、例えば、基質と反応することにより過酸化水素の生
成を触媒するオキシダーゼ群由来のものが挙げられる。グルコースオキシダーゼ
は、良好な安定性を有し、そしてその基質（グルコース）が容易に入手可能であ
るため、特に好ましい。オキシダーゼ標識の活性は、酵素標識化抗体／基質反応
により形成される過酸化水素の濃度を測定することによりアッセイされ得る。酵
素に加え、他の適切な標識としては、放射性同位体（例えば、ヨウ素（125Ｉ、1 21 Ｉ）、炭素（14Ｃ）、硫黄（35Ｓ）、トリチウム（3Ｈ）、インジウム（112Ｉ
ｎ）、およびテクネチウム（99ｍＴｃ））、および蛍光標識（例えば、フルオレ
セインおよびローダミン）、ならびにビオチンが挙げられる。
【０２９６】 本発明のポリペプチド、およびこのようなポリペプチドをコードするポリヌク
レオチドは、科学的研究、ＤＮＡの合成およびＤＮＡベクターの製造に関するイ
ンビトロの目的のため、ならびにヒトの疾患の処置のための治療法および診断法
を開発する目的のための研究試薬として使用され得る。例えば、Ｃｋβ−６は、
それらの分化を一時的に妨げることによる、未熟な造血前駆細胞（例えば、顆粒
球、マクロファージ、または単球）の拡大のために使用され得る。これらの骨髄
細胞は、インビトロで培養され得る。
【０２９７】 全長Ｃｋβ−６遺伝子のフラグメントは、全長遺伝子を単離し、そしてこの遺
伝子と高い配列類似性または類似の生物学的活性を有する他の遺伝子を単離する
ための、ｃＤＮＡライブラリーに対するハイブリダイゼーションプローブとして
使用され得る。しかし、好ましくは、プローブは、少なくとも３０の塩基を有し
、そして、例えば、５０以上の塩基を含み得る。プローブはまた、転写物全長に
対応するｃＤＮＡクローン、ならびに調節領域およびプロモーター領域、エキソ
ンおよびイントロンを含む完全な遺伝子を含むゲノムクローン（単数および複数
）を同定するために使用され得る。スクリーンの例は、オリゴヌクレオチドプロ
ーブを合成するための公知のＤＮＡ配列を使用を用いることによって、遺伝子の
コード領域を単離する工程を包含する。本発明の遺伝子の配列と相補的な配列を
有する標識されたオリゴヌクレオチドは、ヒトｃＤＮＡ，ゲノムＤＮＡまたはｍ
ＲＮＡのライブラリをスクリーンし、ライブラリのどのメンバーにプローブがハ
イブリダズするかを決定するために使用される。
【０２９８】 本発明はまた、診断としての本発明の遺伝子の使用に関する。この遺伝子の変
異形態の検出は、Ｃｋβ−６の発現不全に起因する疾患または疾患に対する感受
性の診断を可能にする。
【０２９９】 本発明の遺伝子において変異を保有する個体は、ＤＮＡレベルで種々の技術に
より検出され得る。診断のための核酸は、患者の細胞（血液、尿、唾液、組織生
検、および剖検材料を含むが、限定されない）より得られ得る。ゲノムＤＮＡは
、検出のために直接用いられ得るか、または分析の前にＰＣＲ（Ｓａｉｋｉら、
Ｎａｔｕｒｅ ３２４：１６３−１６６（１９８６））を用いることにより酵素
的に増幅され得る。ＲＮＡまたはｃＤＮＡはまた、同様の目的のために用いられ
得る。例として、Ｃｋβ−６をコードする核酸と相補的なＰＣＲプライマーは、
変異を同定および分析するために用いられ得る。例えば、欠失および挿入は、通
常の遺伝子型と比較して、増幅産物のサイズの変化により検出され得る。点変異
は、増幅したＤＮＡを放射線標識ＲＮＡまたは代替の放射線標識アンチセンスＤ
ＮＡ配列にハイブリダイズさせることにより同定され得る。完全にマッチした配
列は、ＲＮａｓｅ Ａ消化によって、または融解温度の差異によって、ミスマッ
チ二重鎖から区別され得る。
【０３００】 参照遺伝子と変異を有する遺伝子との間の配列差異は、直接的なＤＮＡ配列決
定方法により明らかにされ得る。さらに、クローンＤＮＡセグメントは、特異的
なＤＮＡセグメントを検出するためのプローブとして使用され得る。この方法の
感受性は、ＰＣＲと組み合わされる場合に非常に増強される。例えば、配列決定
プライマーは、二本鎖ＰＣＲ生成物または改変ＰＣＲにより産生される一本鎖テ
ンプレート分子と共に用いられる。配列決定は、放射線標識ヌクレオチドを用い
る従来の手順により、または蛍光タグを用いる自動配列決定手順により行われる
。
【０３０１】 ＤＮＡ配列差異に基づく遺伝子検査は、ゲル（変性剤ありまたはなし）におけ
るＤＮＡフラグメントの電気泳動移動度における変化の検出により達成され得る
。小さい配列欠失および挿入は、高分解能のゲル電気泳動により視覚化され得る
。異なる配列のＤＮＡフラグメントは、異なるＤＮＡフラグメントの移動度が、
それらの特異的な溶融温度または部分的な溶融温度に従って、異なる位置でゲル
において遅延する、変性ホルムアミド勾配ゲル上で区別され得る（例えば、Ｍｙ
ｅｒｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：１２４２（１９８５）を参照のこと）。
【０３０２】 特定の位置での配列変化はまた、ヌクレアーゼ保護アッセイ（例えば、ＲＮａ
ｓｅおよびＳ１保護）または化学切断方法によって明らかにされ得る（例えば、
Ｃｏｔｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８５：４
３９７−４４０１（１９８５））。
【０３０３】 従って、特定のＤＮＡ配列の検出は、ハイブリダイゼーション、ＲＮａｓｅ保
護、化学切断、直接ＤＮＡ配列決定、または制限酵素（例えば、制限酵素ＤＮＡ
断片長の多型（ＲＦＬＰ））の使用のような方法およびゲノムＤＮＡのサザンブ
ロッティングによって達成され得る。
【０３０４】 より慣習的なゲル電気泳動およびＤＮＡ配列決定に加えて、変異はまた、イン
サイチュ分析によって検出され得る。
【０３０５】 本発明はまた、様々な組織における本発明のポリペプチドの変化したレベルを
検出するための診断アッセイに関し、それは、通常のコントロール組織サンプル
と比較したタンパク質の過剰発現は、疾患または疾患に対する感受性（例えば、
腫瘍）の存在を検出し得るからである。宿主に由来するサンプルにおける本発明
のポリペプチドのレベルを検出するために用いられるアッセイは、当業者に周知
であり、そしてこれらのアッセイとしては、放射免疫アッセイ、競合的結合アッ
セイ、ウェスタンブロット分析、ＥＬＩＳＡアッセイおよびサンドイッチアッセ
イが挙げられる。ＥＬＩＳＡアッセイ（Ｃｏｌｉｇａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐ
ｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １（２），第６章，（１９９
１））は、まず、Ｃｋβ−６抗原に特異的な抗体（好ましくは、モノクローナル
抗体）を調製する工程を包含する。さらに、レポーター抗体が、モノクローナル
抗体に対して調製される。レポーター抗体に対して、放射活性、蛍光またはこの
例においては西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素のような検出可能な試薬が結合す
る。サンプルは、ここで、宿主から取り除かれ、そして固体支持体（例えば、ポ
リスチレン皿）上でインキュベートされ、この固体支持体は、サンプルのタンパ
ク質に結合する。次いで、この皿の任意の遊離タンパク質結合部位は、非特異的
タンパク質（例えば、ウシ血清アルブミン）と共にインキュベートすることによ
ってコートされる。次に、モノクローナル抗体は、この皿でインキュベートされ
、この時間の間に、本発明の任意のポリペプチドに結合したモノクローナル抗体
は、このポリスチレン皿に結合する。結合されないモノクローナル抗体はすべて
、緩衝液で洗い流される。西洋ワサビペルオキシダーゼに結合したレポーター抗
体は、ここで、皿に配置され、本発明のポリペプチドに結合する任意のモノクロ
ーナル抗体へのこのレポーター抗体の結合が生じる。次いで、結合しなかったレ
ポーターは、洗い流される。次いで、ペルオキシダーゼ基質がこの皿に添加され
、そして所定の期間に発生した色の量が、標準曲線に対して比較される場合の所
定の量の患者のサンプルにある本発明のポリペプチド量の測定量である。
【０３０６】 競合アッセイが使用され、本発明のポリペプチドに特異的な抗体が固体支持体
に結合され、そして標識されたＣｋβ−６および宿主に由来するサンプルが、固
体支持体を通過され、そして固体支持体に結合した、検出される標識の量は、サ
ンプル中の本発明のポリペプチドの量と相関し得る。
【０３０７】 「サンドイッチ」アッセイは、ＥＬＩＳＡアッセイと類似している。「サンド
イッチ」アッセイにおいて、Ｃｋβ−６は、固体支持体を通過され、そして固体
支持体に結合した抗体に結合する。次いで、第２の抗体がＣｋβ−６に結合する
。次いで、標識されそして第２の抗体に特異的な第３の抗体が、固体支持体を通
過し、そして第２の抗体に結合され、次いで、量が測量され得る。
【０３０８】 本発明は、ケモカインポリペプチドに対するレセプターの同定のための方法を
提供する。このレセプターをコードする遺伝子は、当業者に公知の多数の方法（
例えば、リガンドパニングおよびＦＡＣＳソーティング）により同定され得る（
Ｃｏｌｉｇａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎ．
１（２），第５章，（１９９１））。好ましくは、発現クローニングが使用され
、ここでポリアデニル化されたＲＮＡは、ポリペプチドに応答性の細胞から調製
され、そしてこのＲＮＡから作製されたｃＤＮＡライブラリが、プールに分けら
れ、そしてこのポリペプチドに応答性でないＣＯＳ細胞または他の細胞をトラン
スフェクトする。ガラススライド上で増殖するトランスフェクトされた細胞は、
標識されたポリペプチドに曝露される。このポリペプチドは、部位特異的なタン
パク質キナーゼに対する認識部位のヨウ素化または封入を含む種々の手段によっ
て標識され得る。固定化およびインキュベーションに続いて、このスライドは、
オートラジオグラフィー分析に供される。ポジティブプールが同定され、そして
反復したサブプール化および再スクリーニングプロセスを用いて、サブ−プール
が調製され、そして再トランスフェクトされ、最終的に推定レセプターをコード
する単一のクローンが得られる。
【０３０９】 レセプター同定のための代替的なアプローチとして、標識されたポリペプチド
は、細胞膜に光親和的に結合され得るか、またはレセプター分子を発現する調製
物を抽出する。架橋した材料をＰＡＧＥ分析によって分離し、そしてＸ線フィル
ムに曝す。ポリペプチドレセプターを含有する標識した複合体を切り出し、ペプ
チドフラグメントに分解し、そしてタンパク質微量配列決定に供し得る。微量配
列決定から得られたアミノ酸配列を使用して、縮重オリゴヌクレオチドプローブ
のセットを設計し、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングして推定のレセプタ
ーをコードする遺伝子を同定する。
【０３１０】 （染色体アッセイ） 本発明の核酸はまた、染色体同定に有用である。この配列は、個々のヒト染色
体上の特定の位置に特異的に標的化され、そしてその位置とハイブリダイズし得
る。さらに、染色体上の特定の部位を同定することへの必要性が現在存在する。
実際の配列データ（反復多型性）に基づく染色体マーキング試薬は現在、染色体
位置をマークするのにはほとんど利用可能ではない。本発明に従う染色体へのＤ
ＮＡのマッピングは、それらの配列を、疾患に関連した遺伝子と相関づけること
において重要な第一段階である。
【０３１１】 この点における特定の好ましい実施形態において、本明細書中で開示されるｃ
ＤＮＡは、Ｃｋβ−６タンパク質遺伝子のゲノムＤＮＡをクローニングするため
に用いられる。これは、一般的に市販されている、種々の周知の技術およびライ
ブラリーを用いて達成され得る。この目的のための周知の技術を用いて、インサ
イチュ染色体マッピングのためにゲノムＤＮＡが用られる。代表的には、染色体
マッピングのための慣用的手順に従って、良好なインサイチュハイブリダイゼー
ションシグナルを与えるゲノムプローブを同定するために、いくつかの試行錯誤
が必要とされ得る。
【０３１２】 手短には、配列は、ｃＤＮＡからＰＣＲプライマー（好ましくは、１５〜２５
ｂｐ）を調製することにより、染色体にマッピングされ得る。遺伝子の３’非翻
訳領域のコンピューター分析を用いて、ゲノムＤＮＡにおいて１より多いエキソ
ンにまたがらず、従って、増幅プロセスを複雑化しないプライマーを迅速に選択
する。次いで、これらのプライマーは、個々のヒト染色体を含有する体細胞ハイ
ブリッドのＰＣＲスクリーニングのために用いられる。このプライマーに対応す
るヒト遺伝子を含有するこれらのハイブリッドのみが増幅フラグメントを産生す
る。
【０３１３】 体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピングは特定のＤＮＡを特定の染色体に対応
させるための迅速な手順である。同様のオリゴヌクレオチドプライマーを用いる
本発明を使用し、準局在化（ｓｕｂｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）は、特定の染色
体由来のフラグメントのパネルまたは同類の手法における大きいゲノムクローン
のプールで達成され得る。その染色体にマッピングするために同様に用いられ得
る他のマッピングストラテジーは、インサイチュハイブリダイゼーション、標識
フローソート（ｌａｂｅｌｅｄ ｆｌｏｗ−ｓｏｒｔｅｄ）染色体でのプレスク
リーニング、および染色体特異的ｃＤＮＡライブラリーを構築するためのハイブ
リダイゼーションによる前選択を含む。
【０３１４】 中期染色体スプレッド（ｓｐｒｅａｄ）に対するｃＤＮＡクローンの蛍光イン
サイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を用いて、一工程で、正確な染色
体位置を提供し得る。この技術は、少なくとも５０または６０塩基を有するｃＤ
ＮＡと共に用いられ得る。（この技術の概説については、Ｖｅｒｍａら、Ｈｕｍ
ａｎ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃ
ｈｎｉｑｕｅｓ， Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９
８８）を参照のこと）。
【０３１５】 一旦、配列が正確な染色体位置にマッピングされると、染色体上の配列の物理
的な位置は、遺伝子マップデータと相関づけられ得る。このようなデータは、例
えば、Ｖ． ＭｃＫｕｓｉｃｋ， Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃ
ｅ ｉｎ Ｍａｎ（Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｗｅ
ｌｃｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｌｉｂｒａｒｙからオンラインで入手可能である）に
見出される。次いで、同じ染色体領域にマッピングされた遺伝子と疾患との間の
関係が、連鎖解析（物理的に隣接した遺伝子の同時遺伝）によって同定される。
【０３１６】 次に、罹患個体と非罹患個体との間でのｃＤＮＡまたはゲノム配列における差
異を決定することが必要である。変異がいくつかまたは全ての罹患個体において
認められるが、いずれの正常個体にも認められない場合、その変異は、疾患の原
因因子である可能性が高い。
【０３１７】 物理的マッピングおよび遺伝子マッピング技術の現在の解像度であれば、疾患
と関連する染色体領域に正確に位置決めされるｃＤＮＡは、５０と５００の間の
潜在的な原因遺伝子の１つであり得る（これは、１メガベースマッピング解像度
および２０ｋｂあたり１遺伝子と仮定する）。
【０３１８】 罹患個体と非罹患個体との比較は、一般的に、まず染色体における構造的変化
（例えば、欠失または転座）を探すことを含み、これは、染色体スプレッドによ
り可視であるか、またはそのｃＤＮＡ配列に基づくＰＣＲを用いて検出可能であ
る。究極的には、いくつかの個体由来の遺伝子の完全な配列決定は、変異の存在
を確認し、そして変異を多型性と区別するために必要とされる。
【０３１９】 （抗体） 本発明における使用のためのＣｋβ−６タンパク質特異的抗体は、インタクト
なＣｋβ−６タンパク質またはその抗原性ポリぺプチドフラグメントに対して惹
起され得、これは、アルブミンのようなキャリアタンパク質とともに、またはそ
れが十分に長ければ（少なくとも約２５アミノ酸）、キャリアなしに、動物系（
例えば、ウサギまたはマウス）に対して提示され得る。
【０３２０】 本明細書中で使用される場合、用語「抗体」（Ａｂ）または「モノクローナル
抗体」（Ｍａｂ）は、インタクトな分子、ならびにＭＰＩＦ−１、Ｍ−ＣＩＦま
たはＭＩＰ−４タンパク質に特異的に結合し得る抗体フラグメント（例えば、Ｆ
ａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメント）を含むことが意味される。Ｆａｂおよ
びＦ（ａｂ’）２フラグメントは、インタクトな抗体のＦｃフラグメントを欠失
し、循環からより迅速に除去され、そしてインタクトな抗体のより非特異的でな
い組織結合を有し得る（Ｗａｈｌら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２４：３１６−３
２５（１９８３））。従って、これらのフラグメントが好ましい。
【０３２１】 ポリペプチド、それらのフラグメントもしくは他の誘導体、またはそれらのア
ナログ、あるいはそれらを発現する細胞は、それらに対する抗体を産生する免疫
原として用いられ得る。これらの抗体は、例えば、ポリクロナール抗体またはモ
ノクロナール抗体であり得る。本発明はまた、キメラ抗体、単鎖抗体、およびヒ
ト化抗体、ならびにＦａｂフラグメントまたはＦａｂ発現ライブラリーの産物を
含む。このような抗体およびフラグメントの産生のために、当該分野において公
知の種々の手順が用いられ得る。
【０３２２】 本発明の配列に対応するポリペプチドに対して産生される抗体は、このポリペ
プチドを動物へ直接注射することにより、またはこのポリペプチドを動物（好ま
しくは非ヒト）に投与することにより得られ得る。このようにして得られる抗体
は、次いでポリペプチド自身と結合する。この様式においては、このポリペプチ
ドのフラグメントのみをコードする配列でさえも、天然のポリペプチド全体と結
合する抗体を産生するために用いられ得る。次いで、このような抗体は、このポ
リペプチドを発現する組織からこのポリペプチドを単離するために用いられ得る
。
【０３２３】 抗体、モノクローナルまたはポリクローナルは、標準的な技術によりＣｋβ−
６／ＭＰＩＦ−２ポリペプチドに対して作製される。これらの抗体またはＣｋβ
−６／ＭＰＩＦ−２ポリペプチドは、多くの型が当該分野で公知の検出可能な標
識で標識される。次に、標識されたＣｋβ−６／ＭＰＩＦ−２または抗Ｃｋβ−
６／ＭＰＩＦ−２抗体は、患者に直接投与することにより幹細胞を同定しかつ単
離するための幹細胞マーカーとして診断目的のために使用される。あるいは、こ
れらの標識したポリペプチドまたは抗体は、骨髄の新形成細胞を除去する前にそ
れらの除去を可能にする造血細胞調製物中の幹細胞を同定するために、エキソビ
ボで使用される。さらに、標識または非標識のこのような抗体は、Ｃｋβ−６／
ＭＰＩＦ−２の活性の中和により治療的に、または循環しているＣｋβ−６／Ｍ
ＰＩＦ−２レベルの検出により診断的に使用される。
【０３２４】 モノクローナル抗体の調製のためには、連続した細胞株培養によって産生され
る抗体を提供する任意の技術が使用され得る。例としては、ハイブリドーマ技術
（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９
７（１９７５））、トリオーマ（ｔｒｉｏｍａ）技術、ヒトＢ細胞ハイブリドー
マ技術（Ｋｏｚｂｏｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４：７２（１９
８３））、およびヒトモノクロナール抗体を産生するＥＢＶ−ハイブリドーマ技
術（Ｃｏｌｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａ
ｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ．Ｉｎｃ．（１９８５）、
７７−９６頁）が挙げられる。
【０３２５】 単鎖抗体の産生のために記載された技術（米国特許第４，９４６，７７８号）
は、本発明の免疫原性ポリペプチド産物に対する単鎖抗体を産生するために適応
され得る。また、トランスジェニックマウスは、本発明の免疫原性ポリペプチド
産物に対するヒト化抗原を発現するために用いられ得る。
【０３２６】 本発明の抗体は、任意の種々の方法によって調製され得る。例えば、Ｃｋβ−
６タンパク質またはその抗原性フラグメントを発現する細胞は、ポリクローナル
抗体を含有する血清の産生を誘導するために動物に投与され得る。好ましい方法
において、Ｃｋβ−６タンパク質の調製物が、天然の夾雑物を実質的に含まない
ようにするために調製および精製される。次いで、このような調製物は、より比
活性の大きいポリクローナル抗血清を産生するために動物に導入される。
【０３２７】 最も好ましい方法では、本発明の抗体は、モノクローナル抗体（またはそれら
のＣｋβ−６タンパク質結合フラグメント）である。このようなモノクローナル
抗体は、ハイブリドーマ技術を用いて調製され得る（Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕ
ｒｅ ２５６：４９５（１９７５）； Ｋｏｈｌｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．６：５１１（１９７６）；Ｋｏｈｌｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．６：２９２（１９７６）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ
Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，Ｅｌ
ｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，（１９８１），５６３−６８１頁）。一般に、このよ
うな手順は、動物（好ましくはマウス）をＣｋβ−６タンパク質抗原またはより
好ましくはＣｋβ−６タンパク質発現細胞で免疫する工程を包含する。適切な細
胞は、抗Ｃｋβ−６タンパク質抗体に結合するそれらの能力によって認識され得
る。このような細胞は、任意の組織培養培地において培養され得る。しかしなが
ら、１０％ウシ胎児血清（約５６℃で失活された）を補充し、そして約１０ｇ／
１の非必須アミノ酸、約１，０００Ｕ／ｍｌのペニシリン、および約１００ｇ／
ｍｌのストレプトマイシンを補充したＥａｒｌｅ改変Ｅａｇｌｅ培地において細
胞を培養することが好ましい。このようなマウスの脾細胞を抽出し、そして適切
なミエローマ細胞株と融合する。任意の適切なミエローマ細胞株が、本発明に従
って用いられ得る。しかしながら、アメリカンタイプカルチャーコレクション（
Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手可能な親ミエローマ細胞株（ＳＰ２Ｏ）を用
いることが好ましい。融合後、得られたハイブリドーマ細胞をＨＡＴ培地中で選
択的に維持し、次いで、Ｗａｎｄｓら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ８
０：２２５−２３２（１９８１）により記載されるように、限界希釈によってク
ローニングする。次いで、このような選択によって得られるハイブリドーマ細胞
をアッセイし、Ｃｋβ−６タンパク質抗原を結合し得る抗体を分泌するクローン
を同定する。
【０３２８】 あるいは、Ｃｋβ−６タンパク質抗原に結合し得るさらなる抗体は、抗イディ
オタイプ抗体の使用を介する二段階手順で生成され得る。このような方法は、抗
体がそれ自身抗原であること、および従って、第２の抗体に結合する抗体を得る
ことが可能であることを利用する。この方法に従って、Ｃｋβ−６タンパク質特
異的抗体が、動物（好ましくはマウス）を免疫するために使用される。次いで、
このような動物の脾細胞を用いてハイブリドーマ細胞を生成し、そしてこのハイ
ブリドーマ細胞をスクリーニングして、Ｃｋβ−６タンパク質特異的抗体に結合
する能力がＣｋβ−６タンパク質抗原によってブロックされ得る抗体を産生する
クローンを同定する。このような抗体は、Ｃｋβ−６タンパク質特異的抗体に対
する抗イディオタイプ抗体を含み、そして動物を免疫してさらなるＣｋβ−６タ
ンパク質特異的抗体の形成を誘導するために使用され得る。
【０３２９】 本発明の抗体のＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２および他のフラグメントは、本明
細書中に開示される方法に従って用いられ得ることが理解される。このようなフ
ラグメントは、代表的には、酵素（例えば、パパイン（Ｆａｂフラグメントを生
成する）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを生成する）を用いるタ
ンパク質分解切断によって生成される。あるいは、Ｃｋβ−６タンパク質結合フ
ラグメントは、組換えＤＮＡ技術の適用によってまたは合成化学によって生成さ
れ得る。
【０３３０】 「ヒト化」キメラモノクローナル抗体を使用することが好ましいものであり得
る。このような抗体は、上記のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細
胞に由来する遺伝子構築物を用いて生成され得る。キメラ抗体を生成するための
方法は、当該分野で公知である。総説としては、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ２２９：１２０２（１９８５）；Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ
４：２１４（１９８６）；Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号
；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら、ＥＰ１７１４９６；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、ＥＰ １７
３４９４；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、ＷＯ ８６０１５３３；Ｒｏｂｉｎｓｏｎら
、ＷＯ ８７０２６７１；Ｂｏｕｌｉａｎｎｅら、Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６４
３ （１９８４）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３１４：２６８（１
９８５）を参照のこと。
【０３３１】 本発明のＣｋβ−６タンパク質特異的抗体のさらなる適切な標識は、以下に提
供される。適切な酵素標識の例は、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌク
レアーゼ、Δ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ
、α−グリセロールリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、
ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオ
キシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラー
ゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ、およびアセ
チルコリンエステラーゼを包含する。
【０３３２】 適切な放射性同位体標識の例は、3Ｈ、111Ｉｎ、125Ｉ、131Ｉ、32Ｐ、35Ｓ、14 Ｃ、41Ｃｒ、57Ｔｏ、58Ｃｏ、59Ｆｅ、75Ｓｅ、152Ｅｕ、90Ｙ、67Ｃｕ、217 Ｃｉ、211Ａｔ、212Ｐｂ、47Ｓｃ、109Ｐｄなどを包含する。111Ｉｎは、インビ
ボ画像化が用いられる場合に好ましい同位体である。なぜなら、それは、肝臓に
よる125Ｉまたは131Ｉ−標識化モノクローナル抗体の脱ハロゲンの問題を回避す
るからである。さらに、この放射性ヌクレオチド（ｒａｄｉｏｎｕｃｌｅｏｔｉ
ｄｅ）は、画像化のためにより好ましいγ放射エネルギーを有する（Ｐｅｒｋｉ
ｎｓら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ １０：２９６−３０１ （１９８５）
；Ｃａｒａｓｑｕｉｌｌｏら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２８：２８１−２８７（
１９８７））。
【０３３３】 適切な非放射性同位体標識の例は、157Ｇｄ、55Ｍｎ、162Ｄｙ、52Ｔｒおよび56 Ｆｅを包含する。
【０３３４】 適切な蛍光標識の例は、152Ｅｕ標識、フルオレセイン標識、イソチオシアネ
ート標識、ローダミン標識、フィコエリトリン標識、フィコシアニン標識、アロ
フィコシアニン標識、ｏ−フタルアルデヒド（ｐｈｔｈａｌｄｅｈｙｄｅ）標識
、およびフルオレサミン標識を包含する。
【０３３５】 適切な毒素標識の例は、ジフテリア毒素、リシン、およびコレラ毒素を包含す
る。
【０３３６】 化学蛍光標識の例は、ルミナル標識（ｌｕｍｉｎａｌ ｌａｂｅｌ）、イソル
ミナル標識（ｉｓｏｌｕｍｉｎａｌ ｌａｂｅｌ）、芳香族アクリジニウムエス
テル標識、イミダゾール標識、アクリジニウム塩標識、シュウ酸エステル標識、
ルシフェリン標識、ルシフェラーゼ標識、およびエクオリン標識を包含する。
【０３３７】 核磁気共鳴造影剤の例は、重金属（例えば、Ｇｄ、Ｍｎ、および鉄）を包含す
る。
【０３３８】 上記標識を抗体に結合するための代表的な技術は、Ｋｅｎｎｅｄｙら、Ｃｌｉ
ｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ ７０：１−３１（１９７６）、およびＳｃｈｕｒｓら
、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ ８１：１−４０（１９７７）により提供され
る。後者に言及されるカップリング技術は、グルタルアルデヒド法、過ヨウ素酸
法、ジマレイミド法、ｍ−マレイミドベンジル−Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミ
ドエステル法（これらの方法は全て、本明細書中に参考として援用される）であ
る。
【０３３９】 本発明を以下の実施例を参照にしてさらに記載する；しかし、本発明はそのよ
うな実施例に限定されないことを理解されたい。全ての部または量は、他に明記
しない限り重量基準である。
【０３４０】 以下の実施例の理解を容易にするために、特定頻度現れる方法および／または
用語を記載する。
【０３４１】 「プラスミド」は、大文字および／または数字の前および／または後の小文字
のｐにより示される。本明細書中の出発プラスミドは、市販されるか、制限無く
公的に入手可能であるか、または公開された手順に従って入手可能なプラスミド
から構築され得るかのいずれかである。さらに、記載されるプラスミドと等価の
プラスミドが当該分野で公知であり、そして当業者には明らかである。
【０３４２】 ＤＮＡの「消化」は、ＤＮＡ中の特定の配列でのみ作用する制限酵素でＤＮＡ
を触媒反応的に切断することをいう。本明細書中で使用される種々の制限酵素は
市販されており、そしてそれらの反応条件、補因子、および他の必要条件は当業
者に公知のものが使用された。分析目的には、代表的には１ｍｇのプラスミドま
たはＤＮＡフラグメントが約２単位の酵素とともに約２０ｍｌの緩衝溶液中で使
用される。プラスミド構築のためのＤＮＡフラグメントを単離する目的には、代
表的には５〜５０ｍｇのＤＮＡが２０〜２５０単位の酵素で、より多量の容量中
で消化される。特定の制限酵素のための適切な緩衝液および基質量は、製造者に
より特定される。３７℃にての約１時間のインキュベーション時間が通常使用さ
れるが、しかしこれは供給者の説明書に従って変動させ得る。消化後、反応物を
ポリアクリルアミドゲルで直接電気泳動して所望のフラグメントを単離する。
【０３４３】 切断されたフラグメントのサイズ分離は、Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｄ．ら，Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．８：４０５７（１９８０）により記載された８％
ポリアクリルアミドゲルを使用して行われる。
【０３４４】 「オリゴヌクレオチド」は、１本鎖ポリデオキシヌクレオチドまたは２つの相
補的なポリデオキシヌクレオチド鎖のいずれかをいい、これらは化学的に合成さ
れ得る。そのような合成オリゴヌクレオチドは、５’リン酸を有さず、従ってキ
ナーゼの存在下でリン酸とＡＴＰとを添加しなければ別のオリゴヌクレオチドに
連結しない。合成オリゴヌクレオチドは、脱リン酸されていないフラグメントに
連結する。
【０３４５】 「連結」は、２つの２本鎖核酸フラグメントの間でリン酸ジエステル結合を形
成するプロセスをいう（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ら、同書、１４６頁）。他に提
供されていなければ、連結は公知の緩衝液および条件で、ほぼ等モル量の連結さ
れるべきＤＮＡフラグメント０．５ｍｇあたり１０単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼ
（「リガーゼ」）を用いて達成され得る。
【０３４６】 他に明言しない限り、形質転換はＧｒａｈａｍ，Ｆ．およびＶａｎ ｄｅｒ
Ｅｂ，Ａ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：４５６−４５７（１９７３）の方法に記
載のように実施した。
【０３４７】 （実施例１） （Ｃｋβ−６の細菌発現および精製） 初めに、Ｃｋβ−６ ＡＴＣＣ番号７５７０３をコードするＤＮＡ配列を、処
理されたＣｋβ−６タンパク質（マイナスシグナルペプチド配列）の５’配列お
よび３’配列ならびにＣｋβ−６遺伝子に対して３’側のベクター配列に対応す
るＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅する。Ｃｋβ−６に対応す
る付加的なヌクレオチドを５’配列および３’配列それぞれに付加した。５’オ
リゴヌクレオチドプライマーは配列５’ＴＣＡＧＧＡＴＣＣＣＣＴＡＣＧＧＧＣ
ＴＣＧＴＧＧＴＣ３’（配列番号３）を有し、これは、処理されたタンパク質コ
ドンの推定される末端アミノ酸から始まるＣｋβ−６コード配列の１８ヌクレオ
チドを伴うＢａｍＨＩ制限酵素部位を含む。３’配列３’ＣＧＣＴＣＴＡＧＡＧ
ＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ５’（配列番号４）は、ＸｂａＩ部位に対し
ておよびＣｋβ−６ ＤＮＡ挿入片の３’側に位置するｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ
ベクター配列に対して相補的な配列を含む。この制限酵素部位は、細菌発現ベク
ターｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎ．Ｉｎｃ．，９２５９ Ｅｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ
，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ、９１３１１）上の制限酵素部位に対応する。ｐ
ＱＥ−９は、抗生物質耐性（Ａｍｐr）、細菌の複製起点（ｏｒｉ）、ＩＰＴＧ
調節プロモーターオペレーター（Ｐ／Ｏ）、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）、６
−Ｈｉｓタグおよび制限酵素部位をコードする。次いで、ＢａｍＨＩおよびＸｂ
ａＩを用いてｐＱＥ−９を消化した。増幅した配列をｐＱＥ−９中へ結合し、そ
してヒスチジンタグおよびＲＢＳをコードしている配列とインフレームに挿入し
た。次いで、連結混合物を、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）に記載の手順により、
Ｍ１５／ｒｅｐ４の商標でＱｉａｇｅｎから入手可能なＥ．ｃｏｌｉ株（ｍ１５
／ｒｅｐ４）を形質転換するために用いた。Ｍ１５／ｒｅｐ４はｌａｃＩリプレ
ッサーを発現し、そしてカナマイシン耐性（Ｋａｎr）をもまた与えるプラスミ
ドｐＲＥＰ４の複数のコピーを含む。ＬＢプレート上で増殖する能力により、形
質転換体を同定し、アンピシリン／カナマイシン耐性のコロニーを選択した。プ
ラスミドＤＮＡを単離し、制限分析により確認した。
【０３４８】 所望の構築物を含むクローンは、Ａｍｐ（１００μｇ／ｍｌ）およびＫａｎ（
２５μ／ｍｌ）の両方を、補充されたＬＢ培地における液体培養で一晩（Ｏ／Ｎ
）増殖させた。Ｏ／Ｎ後の培養物を用い、１：１００〜１：２５０の割合で大量
培養に播種した。細胞は、０．４と０．６との間の光学濃度６００（Ｏ．Ｄ．60 0 ）まで増殖した。次いで、ＩＰＴＧ（「イソプロピル−Ｂ−Ｄ−チオガラクト
ピラノシド」）を最終濃度１ｍＭまで加えた。ＩＰＴＧは、ｌａｃＩリプレッサ
ーを不活性化することにより、Ｐ／Ｏの除去を引き起こし、増加された遺伝子発
現を誘導する。細胞は、３〜４時間余分に増殖された。次いで、細胞を、遠心分
離によって収集した。細胞ペレットは、カオトロピック剤６ＭグアニジンＨＣｌ
中で可溶化した。清澄後、６−Ｈｉｓタグを含むタンパク質によりタイトな結合
を可能にする条件下でのニッケルキレート（Ｎｉｃｋｅｌ−Ｃｈｅｌａｔｅ）カ
ラムのクロマトグラフィーにより、この溶液から可溶化Ｃｋβ−６を精製した。
Ｈｏｃｈｕｌｉ．Ｅ．ら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ４１１：１７７
−１８４（１９８４）。Ｃｋβ−６（純度９５％）を６ＭグアニジンＨＣｌ（ｐ
Ｈ ５．０）でカラムから溶出し、そして復元の目的で、３ＭグアニジンＨＣｌ
、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１０ｍＭグルタチオン（還元型）、および２ｍ
Ｍグルタチオン（酸化型）に調整した。この溶液中での１２時間インキュベーシ
ョン後、このタンパク質は、１０ｍＭリン酸ナトリウムで透析した。
【０３４９】 以下の好ましい代替的な方法は、それが封入体の形態で存在する場合の、Ｅ．
ｃｏｌｉにおいて発現されたＣｋβ−６を精製するために使用され得る。他に特
定されない限り、以下の工程はすべて４〜１０℃で行われる。
【０３５０】 Ｅ．ｃｏｌｉ発酵の生産相の完了に際して、細胞培養物を、４〜１０℃に冷却
し、そして細胞を１５，０００ｒｐｍにおける連続的な遠心分離（Ｈｅｒａｅｕ
ｓ Ｓｅｐａｔｅｃｈ）によって収穫する。細胞ペーストの単位重量あたりのタ
ンパク質の予測される収量および必要とされる精製タンパク質の量に基づいて、
細胞ペーストの適切な量（重量による）を、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ
ＥＤＴＡ、ｐＨ ７．４を含む緩衝溶液中に懸濁する。細胞を、高剪断ミキサー
を使用して均質な懸濁液に分散させる。
【０３５１】 次いで、ミクロフルーダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，Ｃｏｒｐ．ま
たはＡＰＶ Ｇａｕｌｉｎ，Ｉｎｃ．）に溶液を通過させる（４０００〜６００
０ｐｓｉ、２回）ことにより、細胞を溶解させる。次いでホモジネートを、Ｎａ
Ｃｌ溶液と混合して最終濃度０．５Ｍ ＮａＣｌにし、その後７０００×ｇで１
５分間遠心分離する。生ずるペレットを、再度０．５Ｍ ＮａＣｌ、１００ｍＭ
Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ ７．４を用いて洗浄する。
【０３５２】 得られる洗浄した封入体を、１．５Ｍ 塩酸グアニジン（ＧｕＨＣｌ）で２〜
４時間可溶化する。７０００×ｇで１５分間遠心分離後、ペレットを捨て去り、
そしてＣｋβ−６ポリペプチドを含む上清を４℃で一晩インキュベートし、さら
なるＧｕＨＣｌ抽出を可能にする。
【０３５３】 タンパク質のネイティブなコンフォメーションの形成を補助する薬剤もまた使
用され得る（例えば、還元剤、酸化剤または塩）（米国特許第５，９１２，３２
７号）。
【０３５４】 不溶性粒子を取り除くための高速遠心分離（３０，０００×ｇ）の後、ＧｕＨ
Ｃｌ可溶化タンパク質を、ＧｕＨＣｌ抽出物と５０ｍＭ ナトリウム、ｐＨ４．
５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡを含む２０容量の緩衝液を、激し
く撹拌しながら迅速に混合することによって、再折り畳みさせる。再折り畳みし
た希釈タンパク質溶液を、さらなる精製工程の前の１２時間、混合することなく
４℃に保つ。
【０３５５】 再折り畳みしたＣｋβ−６ポリペプチド溶液を清澄化するために、あらかじめ
準備した、適切な表面領域に０．１６μｍメンブレンフィルターを備える、４０
ｍＭ 酢酸ナトリウム、ｐＨ６．０で平衡化した接線流濾過ユニット装置（例え
ば、Ｆｉｌｔｒｏｎ）を使用する。濾過した試料を、陽イオン交換樹脂（例えば
、Ｐｏｒｏｓ ＨＳ−５０， Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）
にロードする。カラムを、４０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ ６．０で洗浄し、そ
して同じ緩衝液中の２５０ｍＭ、５００ｍＭ、１０００ｍＭ、および１５００ｍ
Ｍ ＮａＣｌで、段階的な様式で溶出する。溶出液中の２８０ｎｍにおける吸光
度を、連続的にモニターする。画分を収集し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥによって
さらに分析する。
【０３５６】 次いで、Ｃｋβ−６ポリペプチドを含有する画分を、プールし、そして４容量
の水と混合する。次いで、希釈サンプルを、予め調製された強アニオン交換樹脂
（Ｐｏｒｏｓ ＨＱ−５０，Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）お
よび弱アニオン交換樹脂（Ｐｏｒｏｓ ＣＭ−２０，Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ Ｂ
ｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の直列型カラムのセットにロードする。これらのカラムを
、４０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ６．０）で平衡化する。両方のカラムを、４０
ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ６．０）、２００ｍＭ ＮａＣｌで洗浄する。次いで
、このＣＭ−２０カラムを、０．２Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐ
Ｈ６．０）〜１．０Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ６．５）の範
囲の直線勾配の１０カラム容量を用いて溶出する。溶出物の一定なＡ280モニタ
リングの下で、画分を収集する。次いで、Ｃｋβ−６ポリペプチドを含有する画
分（例えば、１６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定される）をプールする。
【０３５７】 生じたＣｋβ−６ポリペプチドは、上記のリフォールディングおよび精製工程
の後で９５％より高い純度を示す。５μｇの精製タンパク質をロードした場合に
、クマシーブルー染色した１６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルからは、いかなる主要な
夾雑物バンドも観察されない。精製タンパク質をまた、内毒素／ＬＰＳ夾雑物に
ついて試験する。代表的に、ＬＰＳ含有量は、ＬＡＬアッセイによると０．１ｎ
ｇ／ｍｌ未満である。
【０３５８】 （実施例２） （ヒト細胞におけるＣｋβ−６の発現パターン） ノーザンブロット分析を、ヒト細胞におけるＣｋβ−６の発現レベルを試験す
るために実施した。総細胞性ＲＮＡサンプルを、ＲＮＡｚｏｌ’Ｂシステム（Ｂ
ｉｏｔｅｃｘ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．６０２３ Ｓｏｕｔｈ Ｌ
ｏｏｐ Ｅａｓｔ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ ７７０３３）を用いて単離した。特
定された各ヒト組織から単離された、約１０μｇの総ＲＮＡを、１％アガロース
ゲル上で分離し、そしてナイロンフィルターにブロットした（Ｓａｍｂｒｏｏｋ
，Ｆｒｉｔｓｃｈ，およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９８９））。標
識反応を、５０ｎｇのＤＮＡフラグメントを用いて、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｐ
ｒｉｍｅ−Ｉｔ ｋｉｔにより実施した。標識したＤＮＡを、Ｓｅｌｅｃｔ−Ｇ
−５０カラム（５ Ｐｒｉｍｅ−３ Ｐｒｉｍｅ，Ｉｎｃ．５６０３ Ａｒａｐ
ａｈｏｅ Ｒｏａｄ，Ｂｏｕｌｄｅｒ，ＣＯ ８０３０３）で精製した。次いで
、このフィルターを、０．５Ｍ ＮａＰＯ4（ｐＨ７．４）および７％ＳＤＳ中
において６５℃にて一晩、１，０００，０００ｃｐｍ／ｍｌの放射性標識化全長
Ｃｋβ−６遺伝子とハイブリダイズさせた。０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを
用いる室温での２回の洗浄および６０℃での２回の洗浄後、次いで、このフィル
ターを、−７０℃にて一晩、増感紙に曝露した。Ｃｋβ−６についてのメッセー
ジＲＮＡは、活性化および非活性化Ｔ細胞、単球、ならびにＴ細胞株が豊富であ
る。
【０３５９】 （実施例３） （バキュロウイルス発現系を用いるＣｋβ−６のクローニングおよび発現） 全長Ｃｋβ−６タンパク質をコードするＤＮＡ配列（ＡＴＣＣ番号７５７０３
）を、この遺伝子の５’および３’配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプ
ライマーを使用して増幅する。
【０３６０】 増幅された配列を、市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」，ＢＩＯ １０１
Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａ．）を使用して、１％アガロースゲルから
単離した。次いで、このフラグメントを増幅産物に対応する制限エンドヌクレア
ーゼで消化し、次いで、１％アガロースゲルにおいて再度精製した。このフラグ
メントを、Ｆ２と命名する。
【０３６１】 ベクターｐＲＧ１（ｐＶＬ９４１ベクターの改変物、以下に考察する）を、バ
キュロウイルス発現系を用いるＣｋβ−６タンパク質の発現のために使用する（
概説として、以下を参照のこと：Ｓｕｍｍｅｒｓ，Ｍ．Ｄ．およびＳｍｉｔｈ，
Ｇ．Ｅ．Ａ ｍａｎｕａｌ ｏｆ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｂａｃｕｌｏｖｉ
ｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｉｎｓｅｃｔ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ
ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ，Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐｅｒｉ
ｍｅｎｔａｌ Ｓｔａｔｉｏｎ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｎｏ．１５５５（１９８７
））。この発現ベクターは、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核
多核体ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）の強力なポリヘドリンプロモーター、続いて、
増幅産物を消化するために使用される制限エンドヌクレアーゼの認識部位を含む
。シミアンウイルス（ＳＶ）４０のポリアデニル化部位を、効率的なポリアデニ
ル化のために使用する。組換えウイルスの容易な選択のために、Ｅ．ｃｏｌｉ由
来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を、ポリヘドリンプロモーターと同じ方向で挿
入し、次いで、このポリヘドリン遺伝子のポリアデニル化シグナルを挿入する。
ポリヘドリン配列は、同時トランスフェクトされた野生型ウイルスＤＮＡの細胞
媒介性相同組換えのためのウイルス配列と両側で隣接する。他の多くのバキュロ
ウイルスベクター（例えば、ｐＡｃ３７３、ｐＶＬ９４１、およびｐＡｃＩＭ１
）が、ｐＲＧ１の代わりに使用され得る。（Ｌｕｃｋｏｗ，Ｖ．Ａ．およびＳｕ
ｍｍｅｒｓ，Ｍ．Ｄ．、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７０：３１−３９）。
【０３６２】 このプラスミドを、制限酵素で消化し、そして当該分野で公知の手順によって
、仔ウシ腸ホスファターゼを用いて脱リン酸化する。次いでＤＮＡを、市販のキ
ット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」ＢＩＯ １０１ Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，
Ｃａ．）を使用して、１％アガロースゲルから単離する。このベクターＤＮＡを
、Ｖ２と命名する。
【０３６３】 フラグメントＦ２および脱リン酸化したプラスミドＶ２を、Ｔ４ ＤＮＡリガ
ーゼを用いて連結する。次いで、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１を形質転換し、そし
て酵素を使用して、Ｃｋβ−６遺伝子を有するプラスミド（ｐＢａｃＣｋβ−６
）を含む細菌を同定する。クローニングしたフラグメントの配列を、ＤＮＡ配列
決定によって確認する。
【０３６４】 ５ｍｇのプラスミドｐＢａｃＣｋβ−６を、リポフェクション法（Ｆｅｌｇｎ
ｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８４：７４１３−
７４１７（１９８７））を使用して、１．０ｍｇの市販の線状化バキュロウイル
ス（「ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ＤＮＡ」，Ｐｈａｒｍ
ｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）と同時トランスフェクトする。
【０３６５】 １ｍｇのＢａｃｕｌｏＧｏｌｄウイルスＤＮＡおよび５ｍｇのプラスミドｐＢ
ａｃＣｋβ−６を、５０ｍｌの無血清グレース培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を含む、マイクロタ
イタープレートの滅菌ウェル中で混合する。その後、１０ｍｌのリポフェクチン
（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ）および９０ｍｌグレース培地を加え、混合し、そして
室温で１５分間インキュベートする。次いで、トランスフェクション混合液を、
無血清グレース培地１ｍｌを有する３５ｍｍ組織培養プレートに播種したＳｆ９
昆虫細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７１１）に滴下して加える。このプレートを前
後に揺らして、新たに添加した溶液を混合する。次いで、このプレートを２７℃
で５時間インキュベートする。５時間後、トランスフェクション溶液をプレート
から除去し、そして１０％ウシ胎仔血清を補充した１ｍｌのグレース昆虫培地を
添加する。このプレートをインキュベーター内に戻し、そしてインキュベーショ
ンを２７℃で４日間継続する。
【０３６６】 ４日後に上清を収集し、ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ、前出によって記載
されたのと同様にプラークアッセイを行う。改変として、「Ｂｌｕｅ Ｇａｌ」
（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ
）を含むアガロースゲルを使用する。これは、青色着色プラークの容易な単離を
可能にする（「プラークアッセイ」の詳細な説明はまた、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇによって配布される、
昆虫細胞培養およびバキュロウイルス学のための使用者ガイド（ｕｓｅｒ’ｓ
ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｉｎｓｅｃｔ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ ｂａ
ｃｕｌｏｖｉｒｏｌｏｇｙ）の中の第９〜１０頁に見出され得る）。
【０３６７】 段階希釈の４日後、この細胞にウイルスを添加し、青色に着色したプラークを
Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆピペッターのチップで拾う。次いで、組換えウイルスを含む
寒天を、２００ｍｌのグレース培地を含むＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブ中で再懸
濁させる。短時間の遠心分離によって、この寒天を除去し、そして組換えバキュ
ロウイルスを含む上清を、３５ｍｍディッシュに播種した昆虫Ｓｆ９細胞に感染
させるために使用する。４日後、これらの培養ディッシュの上清を収集し、次い
で４℃にて保存する。
【０３６８】 １０％熱非働化ＦＢＳを補充したグレース培地中で、Ｓｆ９細胞を増殖させる
。細胞に、２の感染多重度（ＭＯＩ）で、組換えバキュロウイルスＶ−Ｃｋβ−
６を感染させる。６時間後に培地を除去し、そしてメチオニンおよびシステイン
を含まないＳＦ９００ ＩＩ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎ
ｃ．Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）に置き換える。４２時間後、５ｍＣｉの35Ｓ−
メチオニンおよび５ｍＣｉの35Ｓ−システイン（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を添加する
。細胞をさらに１６時間インキュベートし、次いで遠心分離によってこれを収集
する。そして標識化タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフ
ィーによって可視化する。
【０３６９】 本質的に上記手順に従って生成されたＣｋβ−６を、プロテアーゼインヒビタ
ーの存在下において（２０ｍｇ／ｍｌ Ｐｅｆａｂｌｏｃ ＳＣ；Ｂｏｅｈｒｉ
ｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，１ｍｇ／ｍｌロイペプチン，１ｍｇ／ｍｌ Ｅ６
４，および１ｍＭ ＥＤＴＡ）、陽イオン交換クロマトグラフィー、ヘパリンア
フィニティークロマトグラフィー、およびサイズ排除クロマトグラフィー（ｐｏ
ｒｏｓ ５０ ＨＳ，ｐｏｒｏｓ ２０ ＨＥ１，Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ Ｂｉ
ｏｓｙｓｔｅｍ，およびＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ２００ ＨＲ；Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ）によって、無血清昆虫細胞上清から精製した。
【０３７０】 精製タンパク質の分析を、レーザー脱離質量分光法（マトリクス関連（ｍａｔ
ｒｉｘ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）レーザー脱離イオン化−飛行時間）によって、
およびエンドプロテイナーゼＧｌｕＣを用いた部分的タンパク質分解後のエドマ
ン分解（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）によって実施した。
【０３７１】 （実施例４） （遺伝子治療を介した発現） 線維芽細胞は、皮膚生検により被験者から得られる。得られた組織を組織培養
培地中に配置し、小片に分割する。組織の小塊を組織培養フラスコの湿潤表面に
置き、約１０片を各フラスコに置く。このフラスコを倒置し、しっかりと閉め、
室温で一晩放置する。室温で２４時間後、フラスコを反転させ、組織塊をフラス
コの底に固定させたままにし、そして新鮮な培地（例えば、１０％ＦＢＳ、ペニ
シリンおよびストレプトマイシンを含有するＨａｍ’ｓ Ｆ１２培地）を添加す
る。次いで、これを３７℃で約１週間インキュベートする。この時点で、新鮮な
培地を添加し、次いで数日ごとに取り換える。さらに２週間培養した後に、単層
の線維芽細胞が出現する。この単層をトリプシン処理し、さらに大きなフラスコ
にスケールアップする。
【０３７２】 モロニーマウス肉腫ウイルスの長末端反復が隣接するｐＭＶ−７（Ｋｉｒｓｃ
ｈｍｅｉｅｒ，Ｐ．Ｔ．ら、ＤＮＡ，７：２１９−２５（１９８８））をＥｃｏ
ＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、次いで、仔ウシ腸ホスファターゼで処理す
る。線状ベクターをアガロースゲルにおいて分画し、そしてガラスビーズを使用
して精製する。
【０３７３】 本発明のポリペプチドをコードするｃＤＮＡを、それぞれ５’末端配列および
３’末端配列に対応するＰＣＲプライマーを使用して増幅する。この５’プライ
マーはＥｃｏＲＩ部位を含み、そしてこの３’プライマーはさらに、ＨｉｎｄＩ
ＩＩ部位を含む。等量のモロニーマウス肉腫ウイルスの線状骨格ならびに増幅し
たＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼの存
在下で一緒に加える。得られた混合物を、この２つのフラグメントを連結するの
に適した条件下で維持する。連結混合物を使用し、細菌ＨＢ１０１を形質転換す
る。次に、それを、カナマイシンを含む寒天上にプレーティングし、ベクターが
適切に挿入された目的の遺伝子を有することを確認する。
【０３７４】 アンホトロピックｐＡ３１７またはＧＰ＋ａｍ１２パッケージング細胞を、組
織培養において、１０％仔ウシ血清（ＣＳ）、ペニシリンおよびストレプトマイ
シンを含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中でコンフルエントな密度
まで増殖させる。次に、遺伝子を含むＭＳＶベクターを培地に加え、そしてパッ
ケージング細胞をこのベクターで形質導入する。このとき、このパッケージング
細胞は、その遺伝子を含む感染性ウイルス粒子を産生する（ここで、このパッケ
ージング細胞をプロデューサー細胞という）。
【０３７５】 形質導入されたプロデューサー細胞に新鮮な培地を添加し、次いでこの培地を
１０ｃｍプレートのコンフルエントなプロデューサー細胞から収集する。感染性
ウイルス粒子を含む使用済み培地を、ミリポアーフィルターを通して濾過し、は
がれたプロデューサー細胞を除去し、そして、この培地を使用して、線維芽細胞
を感染させる。線維芽細胞のサブコンフルエントなプレートから培地を除去し、
そしてプロデューサー細胞からの培地で速やかに置き換える。この培地を除去し
、そして新鮮な培地と置き換える。ウイルスの力価が高ければ、実質的にすべて
の線維芽細胞が感染され、選択は必要ではない。力価が非常に低ければ、ｎｅｏ
またはｈｉｓのような選択マーカーを有するレトロウイルスベクターを使用する
ことが必要である。
【０３７６】 次に、操作された線維芽細胞を、単独で、またはサイトデックス３マイクロキ
ャリアビーズ（ｃｙｔｏｄｅｘ ３ ｍｉｃｒｏｃａｒｒｉｅｒ ｂｅａｄｓ）
上でコンフルエントまで増殖させた後のいずれかで、宿主に注入する。ここで線
維芽細胞はタンパク質産物を産生する。
【０３７７】 （実施例５） （骨髄幹細胞の流動因子（ｍｏｂｉｌｉｚｅｒ）としてのＣｋβ−６の第１指
示）（骨髄レスキュー（Ｒｅｓｃｕｅ）） 末梢血、脾臓および骨髄における最初の造血前駆体の分布に対するＣｋβ−６
の効果を、１６週齢のＣ５７Ｂ１／６マウス（約２０ｇ）で研究した。第１の実
験では、３匹のマウスに、１ｍｇ／ｋｇのＣｋβ−６を毎日か、または２日間生
理食塩水をｉ．ｐ．注射し、そして最後の注射の２４時間後に分析した。第２の
実験では、別の３匹のマウスに、１ｍｇ／ｋｇのＣｋβ−６を毎日か、または４
日間生理食塩水をｉ．ｐ．注射し、そして最後の注射の２４時間後に分析した。
両方の実験において、各動物の血液は、心臓を穿刺することによって収集され、
そして骨髄および脾臓を得るために、これらのマウスを屠殺した。次いで、各組
織由来の示された数の細胞を、５ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−３，５０ｎｇ／ｍｌ ＳＣ
Ｆ，５ｎｇ／ｍｌ Ｍ−ＣＳＦおよび１０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−１ａの存在下で、
寒天含有培地において二連でプレートし、そして１４日間インキュベートした。
２つの実験において、異なる動物からのデータをプールし、そして平均±Ｓ．Ｄ
．で表した。両方の実験の結果は、Ｃｋβ−６が、幹細胞を骨髄から末梢血に流
動することを示す（表２および３）。第１の実験では、Ｃｋβ−６での処理の２
日後に、末梢血中のＨＰＰ−ＣＦＣ、ＬＰＰ−ＣＦＣおよび未熟細胞の頻度は、
コントロールよりも有意に増加した。脾臓においては、いかなる変化も観察され
ず、そして有意なＨＰＰ−ＣＦＣの減少が、骨髄において観察された（表２）。
第２の実験では、Ｃｋβ−６での処理の４日後に、同じく有意なＨＰＰ−ＣＦＣ
、ＬＰＰ−ＣＦＣおよび未熟細胞の頻度増加が末梢血において観察された。未熟
細胞頻度の有意な増加が、脾臓において観察され、そしてＨＰＰ−ＣＦＣおよび
ＬＰＰ−ＣＦＣの有意な減少が、骨髄において観察された（表３）。特に、Ｃｋ
β−６の注射後の末梢血中における未熟造血細胞の存在に留意することが重要で
ある。Ｃｋβ−６で処理された動物において観察された効果は、毒性に起因しな
い。なぜなら、コントロールおよびＣｋβ−６処理マウスの両方の白血球組成に
関するＦＡＣＳｃａｎプロフィールが同じであったからである（表４）。
【０３７８】 （実施例６） （シトシンアラビノシドに対する骨髄保護因子（ｍｙｅｌｏｐｒｏｔｅｃｔａ
ｎｔ）としてのＣｋβ−６） この実験では、Ｌｉｎ−細胞を、５ｎｇ／ｍｌマウスＩＬ−３、５０ｎｇ／ｍ
ｌマウスＳＣＦ（カラム１）；ＩＬ−３、ＳＣＦおよび１００ｎｇ／ｍｌのＣｋ
β−６（カラム２）；または、ＩＬ−３、ＳＣＦ、および１００ｎｇ／ｍｌの無
関係なタンパク質ＨＧ−２００−３−Ｂ（カラム３）を補充した増殖培地中にプ
レートした（１×１０5細胞／ｍｌ）。４８時間のインキュベーション後、１セ
ットの上記培養物は、５０ｍｇ／ｍｌのＡｒａ−Ｃを受容し、次いで、インキュ
ベーションをさらに２４時間継続した。次いで、細胞を収集し、ＨＢＳＳで３回
洗浄して薬物およびサイトカインを除去し、そして図４に対する説明文に記載の
ように、ＨＰＰ−ＣＦＣおよびＬＰＰ−ＣＦＣの存在についてアッセイした。こ
の結果を、保護の平均％（±ＳＤ）として表す。保護の％は、以下のようにして
算出された：％保護は、Ａｒａ−Ｃの存在下でインキュベートされた培養物中に
見出されたコロニー数を、Ａｒａ−Ｃを伴わずにインキュベートされた培養物中
で見出されたコロニー数によって除算し、１００を乗算するとして表される。３
回のうちの１回の実験からのデータを、図６に示す。すべてのサンプルを、二連
で試験した。
【０３７９】 （実施例７） （５−フルオロウラシルに対する骨髄保護因子としてのＣｋβ−６） マウス骨髄細胞の単核集団は、細胞表面抗原に対して指向されたモノクローナ
ル抗体のパネルを使用するネガティブ選択によって、系列を方向付けられた細胞
を枯渇された。生じた細胞集団（Ｌｉｎ−細胞）を、ＩＬ−３（５ｎｇ／ｍｌ）
、ＳＣＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＧＭ−ＣＳＦ（５ｎｇ／ｍｌ）、Ｍ−ＣＳＦ（５
ｎｇ／ｍｌ）およびＩＬ−１ａ（１０ｎｇ／ｍｌ）を含有する増殖培地中に再懸
濁し（１×１０5細胞／ｍｌ）、そして１ｍｌのこの細胞懸濁液を、培養チュー
ブに分配した。（１）ケモカインを受容しない二連の培養物のセット；（２）１
００ｎｇ／ｍｌのＣｋβ−６を有する二連の培養物；および（３）１００ｎｇ／
ｍｌの無関係のタンパク質を有する二連の培養物。すべての培養物を、組織培養
インキュベーター内で４８時間インキュベートし、この時点で各セットからの１
つの培養物が、１００ｍｇ／ｍｌの５−フルオロウラシルを受容し、そして培養
をさらに２４時間継続した。次いで、細胞を収集し、ＨＢＳＳで３回洗浄し、そ
して図５に対する説明文に記載のように、ＨＰＰ−ＣＦＣおよびＬＰＰ−ＣＦＣ
の存在についてアッセイした。％保護は、５−ＦＵの存在下でインキュベートさ
れた培養物中に検出されたコロニー数を、５−ＦＵを伴わずにインキュベートさ
れた培養物中で見出されたコロニー数によって除算し、１００を乗算するとして
表される。データは、平均±ＳＤとして表される。２回の実験を実施し、そして
各アッセイは二連であった。図７を参照のこと。
【０３８０】 （実施例８） （皮質ニューロン生存（ｃｏｒｔｉｃａｌ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｓｕｒｖｉｖ
ａｌ）に対するＣｋβ−６の効果） 妊娠１７日目のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを屠殺し、そして皮質を
取り出し、そして髄膜を、皮質組織片から注意深く剥離（ｐｅａｌ ａｗａｙ）
した。単一細胞懸濁物を調製し、そして細胞を、５％ウマ血清を含有する培地に
２０，０００細胞／ウェルの密度でプレートした。２４時間後、この血清含有培
地を除去し、そして無血清培地を培養物に添加した。無血清培養物中には、図８
に示されるような濃度のＣｋβ−６が含まれた。使用されたＣｋβ−６は、本願
の配列番号１に示されるポリヌクレオチド配列によってコードされるＣｋβ−６
ポリペプチドである。この培地を一日おきに交換し、そして再度Ｃｋβ−６を添
加した。ニューロンは、生存能力アッセイ前の６日間、培養物中に維持された。
【０３８１】 細胞生存能力を、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓからのｌｉｖｅ／ｄｅａ
ｄ ａｓｓａｙ ｋｉｔを使用してアッセイした。このアッセイは、生存細胞お
よび死滅細胞の同時決定に基づく、二色蛍光細胞生存能力アッセイである。生存
細胞は、ほぼ無蛍光性の細胞浸透カルセインＡＭから強度に蛍光性のカルセイン
への酵素学的変換によって決定される、偏在性の細胞内エステラーゼ活性の存在
によって識別される。ポリカチオン性カルセインは、生存細胞によって十分に保
持され、従って、生存細胞では強度の均一な緑色蛍光を生じる。従って、発光の
読み取り（約５３０ｎｍ）は、培養物中の総細胞数の測定値である。図８に示さ
れるように、生存細胞数は、Ｃｋβ−６濃度が増加するにつれて増加した。
【０３８２】 （実施例９） （白血球応答およびレセプター使用） 単球、リンパ球および好中球を、ドナー血液のバフィコートから単離した。好
酸球および好塩基球を、健常ボランティアの新鮮な静脈血から精製した。
【０３８３】 細胞質ゾルの遊離Ｃａ2+濃度（［Ｃａ2+］ｉ）における変化、および酵素放出
を、ＩＬ−８，ＭＣＰ−１およびＭＣＰ−３と比較して、１３６ｍＭ ＮａＣｌ
，４．８ｍＭ Ｋｃｌ，１ｍＭ ＣａＣｌ2，５ｍＭグルコース，および２０ｍ
Ｍ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）、ならびに１〜１，０００ｎＭ Ｃｋβ−６を含
有する培地において３７℃にて２０分間インキュベーションすることによって、
Ｆｕｒａ−２アセトキシメチルエステル（１０6細胞あたり０．２ｎｍｏｌ）を
負荷した単球、好酸球、リンパ球および好中球中でモニターした。負荷した細胞
を洗浄し、そして同じ培地中に再懸濁し（１０6細胞／ｍｌ）、そして［Ｃａ2+
］ｉ放出蛍光変化を記録した。レセプターの脱感作化を、連続的なケモカイン刺
激後における［Ｃａ2+］ｉ変化をモニタリングすることによって試験した。
【０３８４】 ３つの独立した実験において、好中球、単球、およびＴリンパ球においてＣｋ
β−６の効果は観察されなかったが、好酸球においてかなりの活性が見出された
。これらの細胞において、一方におけるＣｋβ−６と、他方におけるエオタキシ
ン（ｅｏｔａｘｉｎ）、ＭＣＰ−３、ＲＡＮＴＥＳ、またはＭＩＰ−１αとの間
の交差脱感作を、［Ｃａ2+］ｉ変化をモニタリングすることによって研究した。
図９に示されるように、Ｃｋβ−６での好酸球の刺激は、エオタキシンに対する
応答を抑制し、ＭＣＰ−３およびＲＡＮＴＥＳに対する応答を減弱させたが、Ｍ
ＩＰ−１αに対する応答には感知され得るほどの影響を及ぼさなかった。これら
の結果と一致して、Ｃｋβ−６によって誘導された［Ｃａ2+］ｉ上昇は、エオタ
キシンでの先刺激によって抑制され、ＲＡＮＴＥＳまたはＭＣＰ−３での刺激に
よって減少されるが、ＭＩＰ−１αによっては影響を及ぼされない。エオタキシ
ンとの完全な交差脱感作は、Ｃｋβ−６が、ＣＣＲ３を介しても作用することを
示唆する。
【０３８５】 （実施例１０） （インビトロ走化性） 走化性を、好酸球および好塩基球についての５μｍ孔ならびにリンパ球につい
ての３μｍ孔を備えた、ポリビニルピロリドンを含まないポリカーボネート膜（
Ｎｕｃｌｅｏｐｏｒｅ）を使用して、４８ウェルチャンバ（Ｎｅｕｒｏ Ｐｒｏ
ｂｅ，Ｃａｂｉｎ Ｊｏｈｎ，ＭＤ）において評価した。２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ
（ｐＨ７．４）および１％低温殺菌血漿タンパク質溶液を補充したＲＰＭＩ １
６４０（ｔｈｅ Ｃｅｎｔｒａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｗ
ｉｓｓ Ｒｅｄ Ｃｒｏｓｓ）を、細胞懸濁およびケモカイン希釈のために使用
した。５％ＣＯ２下で３７℃での６０分間のインキュベーション後、膜を取り出
し、ＰＢＳの上側で洗浄し、固定し、そして染色した。すべてのアッセイを、三
連で実施し、そして移動した細胞を、１，０００倍率で無作為に選択された５つ
の領域において計数した。自発的な移動を、化学誘引物質の非存在下で決定した
。
【０３８６】 （結果） インビトロ走化性を、ヒト血液単球、Ｔリンパ球、好酸球、および
好塩基球を用いて試験した。単球およびリンパ球に対して活性は見出されなかっ
た（これは、［Ｃａ2+］ｉ変化の欠如と一致する）が、著しい移動が、好酸球お
よび好塩基球で得られた。図１０に示されるように、Ｃｋβ−６は、両方の細胞
型に対して非常に有効な誘引物質である。アッセイを、抗ＣＣＲ３、好酸球およ
び好塩基球の存在下で実施した場合、Ｃｋβ−６に対する走化性は完全に阻害さ
れた。
【０３８７】 （実施例１１） （ヒスタミンおよびロイコトリエンＣ4（ＬＴＣ４）の放出） １２５ｍＭ グルコースおよび０．０２５％ ＢＳＡを含有する、２０ｍＭ
Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）中の好塩基球（０．１〜０．３×１０6細胞／ｍｌ）
を、３７℃まで加温し、抗ＣＣＲ３（１０μｇ／ｍｌ）と共にかまたはなしでＩ
Ｌ−３（１０ｎｇ／ｍｌ）に暴露し、次いで、ケモカインでチャレンジした。２
０分後、このチューブを氷上に置くことによってこの反応を止め、そしてヒスタ
ミンおよびＬＴＣ4を上清中で測定した。ヒスタミン放出は、サンプルの全含有
量の割合として表された（細胞溶解の後に測定）。
【０３８８】 ＬＴＣ4の生成を、図１１に示すように、好塩基球１０6個あたりのナノグラム
で表した。いくつかの非選択ドナー由来のＩＬ−３で予め処理した好塩基球につ
いて、Ｃｋβ−６およびエオタキシンの両方は、最大有効濃度において、ヒスタ
ミンおよびペプチドロイコトリエンの同様の放出を引き起こした。濃度に対する
効果に関する曲線は、エオタキシンが、特にＬＴＣ4放出の誘発因子として、Ｃ
ｋβ−６よりわずかに強力であることを示した。両方のアッセイにおいて、Ｃｋ
β−６は、ＲＡＮＴＥＳおよびＭＩＰ−１αとほぼ同じ程度強力であった（デー
タは示さず）。予測されるように、上記の走化性に対する効果のために、Ｃｋβ
−６に対する放出応答は、抗ＣＣＲ３で予め処理することによって顕著に阻害さ
れた。
【０３８９】 （実施例１２） （インビボ活性） ヒトエオタキシンはサルにおいて活性であり、そして皮内注射の後に好塩基球
の局所蓄積を引き起こすため、アカゲザルにおけるその効果をＣｋβ−６と比較
した。
【０３９０】 ７．５ｋｇの雄性アカゲザルを、１０ｍｇ／ｋｇのＫｅｔａｍｉｎｅ（Ｋｅｔ
ｏｌａｒ，Ｐａｒｋｅ Ｄａｖｉｓ）の筋肉内注射および１５ｍｇ／ｋｇのＮａ Ｔｈｉｏｐｅｎｔａｌ（Ｐｅｎｔｏｔａｌ，Ａｂｂｏｔｔ）の静脈内注射によ
って麻酔した。次いで、１０μｌの発熱物質なしの等張性生理食塩水中のケモカ
イン（１００ｐｍｏｌのエオタキシン、１００および１，０００ＰｍｏｌのＣｋ
β−６）を、背部に皮内注射し、そして８ｍｍ直径の全皮膚厚のパンチ生検を４
時間後に注射部位から採取した。この生検をホルマリン中に固定し、パラフィン
に包埋し、そして５μｍの断片を調製した。この断片をヘマトキシリンおよびエ
オシンで染色し、そして浸潤物を二人の独立した観察者によって評価した。０．
１９×０．１９ｍｍの計数グリッドを使用して、表面血管叢の後毛細管小静脈に
隣接し、これを含む５個のランダムに選択した領域において、６３０倍の倍率で
好塩基球の計数を行し、そして１ｍｍ2あたりの好塩基球の数を計算した。
【０３９１】 図１２に示すように、両方のケモカインを部位あたり１００ｐｍｏｌ注射した
４時間後、効果を有さないベシクルのみ（これは効果を有さない）と比較して、
類似の顕著な好塩基球浸潤が起こった。１０００ｐｍｏｌのＣｋβ−６を適用し
た場合、５０％大きい数の浸潤した好塩基球が計数された。この実験に使用され
るサルは、低い血液好酸球数を有したため（全白血球の０．７％）、この効果は
著しかった。
【０３９２】 （実施例１３） （Ｃｋβ−６アゴニストおよびアンタゴニスト） いくつかの欠失Ｃｋβ−６変異体を構築し、そして［Ｃａ+2］ｉ流動アッセイ
および走化性アッセイを使用して活性についてアッセイした。これらの変異体を
Ｃｋβ−６ヌクレオチド配列に基づいて構築し、ここでコドンはＥ．ｃｏｌｉに
おける発現について最適化された。この構築物は以下のように作製した： （Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＣｋβ−６発現のためのコドン最適化構築物） プライマー１、２、３および４（以下）を使用して初期ＰＣＲを行い、そして
プライマー５および６（以下）を用いてさらに増幅した。この産物をＮｄｅ Ｉ
およびＡｓｐ Ｉで消化し、そしてＥ．ｃｏｌｉ発現のためにｐＨＥ４にクロー
ン化した（図２１を参照のこと）、得られたＣｋβ−６の発現のためのコドン最
適化配列を、配列番号６に示す。
【０３９３】
【化２】 Ｅ．ｃｏｌｉ最適化コドンＣｋβ−６構築物を使用して、Ｎ末端に置いてメチ
オニンを含む以下の欠失変異体を、以下に列挙するプライマーを使用して生成し
た。 ΔＣ１ 配列番号２におけるアミノ酸１〜７３ ΔＣ１ΔＮ１ 配列番号２におけるアミノ酸２〜７３ ΔＣ１ΔＮ２ 配列番号２におけるアミノ酸３〜７３ ΔＣ１ΔＮ３ 配列番号２におけるアミノ酸４〜７３ ΔＣ１ΔＮ４ 配列番号２におけるアミノ酸５〜７３ ΔＣ１ΔＮ５ 配列番号２におけるアミノ酸６〜７３ ΔＣ１ΔＮ６ 配列番号２におけるアミノ酸７〜７３
【０３９４】
【化３】 これらの欠失Ｃｋβ−６変異体のいくつかを、［Ｃａ+2］ｉ流動（ｆｌｕｘ）
アッセイおよび走化性アッセイを使用して活性についてアッセイした。
【０３９５】 （カルシウム流動アッセイ） カルシウム流動アッセイを、本質的に上記の実施例９に記載されるようにして
、好酸球を使用して行った。アッセイしたタンパク質調製物について、ＨＧ００
６０３およびＨＧ００６０５はＮ末端メチオニンを保持し；ＨＧ００６０６、Ｈ
Ｇ００６０８およびＨＧ００６０９はＮ末端メチオニンを有さず；そしてＨＧ０
０６０４において、このタンパク質の約５５％がＮ末端メチオニンを有したこと
に留意するべきである。
【０３９６】 （結果） これらの変異体の４つ（ΔＣ１ΔＮ１、ΔＣ１ΔＮ２、ΔＣ１ΔＮ３、ΔＣ１
ΔＮ５）を、一次好酸球を用いてカルシウム流動アッセイに使用した。ΔＣ１Δ
Ｎ１（ＨＧ００６０４）およびΔＣ１ΔＮ２（ＨＧ００６０５）は、ΔＣ１（Ｈ
Ｇ００６０３）およびエオタキシンと非常に類似した活性を示し、一方ΔＣ１Δ
Ｎ３（ＨＧ００６０６）およびΔＣ１ΔＮ５（ＨＧ００６０８）は、１０００ｎ
ｇ／ｍｌにおいてでさえもこのアッセイにおいて活性を示さなかった（図１４Ａ
および１４Ｂを参照のこと）。
【０３９７】 ΔＣ１ΔＮ１（ＨＧ００６０４）と合わせた場合、ΔＣ１ΔＮ３（ＨＧ００６
０６）はΔＣ１ΔＮ１（ＨＧ００６０４）の活性を阻害し得、一方、ΔＣ１ΔＮ
５（ＨＧ００６０８）はΔＣ１ΔＮ１（ＨＧ００６０４）の活性を阻害し得なか
った（図１５Ａおよび１５Ｂを参照のこと）。さらに、ΔＣ１ΔＮ１、Ｃｋβ−
１０またはエオタキシンと合わせた場合、ΔＣ１ΔＮ３（ＨＧ００６０６）はこ
れらのケモカインの３つ全ての活性を阻害し得た（図１６Ａおよび１６Ｂを参照
のこと）。ΔＣ１ΔＮ３（ＨＧ００６０６）は、これらのケモカインが全て同じ
レセプターのＣＣＲ３を介してシグナルを伝達するという事実に起因して、これ
らの３つ全てのケモカインの有効なアンタゴニストである。
【０３９８】 （インビトロ走化性アッセイ） 細胞を洗浄し、カルセイン（ｃａｌｃｅｉｎ）−ＡＭで標識し、そして９６ウ
ェル使い捨て走化性プレート（ＮｅｕｒｏＰｒｏｂｅ，Ｃａｂｉｎ Ｊｏｈｎ，
ＭＤ）の上部チャンバに分配し、ポリカーボネートフィルター（５〜８μｍ 細
孔サイズ；ＰＶＰなし；ＮｅｕｒｏＰｒｏｂｅ，Ｉｎｃ．）により分離した。細
胞を９０分間（リンパ球）または３時間（好酸球）遊走させ、次いで、遊走した
細胞（フィルターに付着した細胞、および底部チャンバにある細胞の両方）を、
Ｃｙｔｏｆｌｕｏｒ ＩＩ蛍光プレートリーダー（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉ
ｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して定量した。走化性アッセイの値を、使用される様
々な因子と共に観察されるバックグラウンドより上の折り畳み誘発を表す走化性
指数として報告する。アッセイされるタンパク質調製物について、ＨＧ００６０
３およびＨＧ００６０５はＮ末端メチオニンを保持し；ＨＧ００６０６、ＨＧ０
０６０８およびＨＧ００６０９はＮ末端メチオニンを保持せず；そしてＨＧ００
６０４において、このタンパク質の約５５％がＮ末端メチオニンを保持したこと
に留意するべきである。
【０３９９】 （結果） 変異体ΔＣ１ΔＮ１（ＨＧ００６０６）を使用する走化性アッセイは、この短
縮型タンパク質がもはや活性ではないことを示す（図１７）。このタンパク質が
好酸球走化性のアンタゴニストとして働き得るか否かを決定するために、ΔＣ１
（ＨＧ００６０３）、Ｃｋβ−１０またはエオタキシンを用いて、ΔＣ１ΔＮ３
（ＨＧ００６０３）と共にかまたはなしで、実験を行った。ΔＣ１ΔＮ３（ＨＧ
００６０６）（１０００ｎｇ／ｍｌ）を、底部ウェルに増加していく量の他のケ
モカインと共に、走化性チャンバの上部ウェルおよび底部ウェルの両方に添加し
た。図１８ＡおよびＢに示すように、ΔＣ１ΔＮ３（ＨＧ００６０６）は、ΔＣ
１（ＨＧ００６０３）によって指向される好酸球の走化性を阻害し得なかった。
さらに、ΔＣ１ΔＮ３（ＨＧ００６０６）は、エオタキシン（図１９ＡおよびＢ
）およびＣｋβ−１０（図２０ＡおよびＢ）駆動型走化性の両方を阻害し得た。
これらのケモカインの全ては、ＣＣＲ３レセプターを介して好酸球に対するそれ
らの効果を媒介するため、この効果を媒介するケモカインに関係なく、ΔＣ１Δ
Ｎ３（ＨＧ００６０６）は、このレセプターを介するシグナル伝達を阻害し得る
優性アンタゴニストを表す。
【０４００】 （結論） これらの結果は、ΔＣ１ΔＮ３が、ＣＣＲ３レセプター媒介性シグナル伝達経
路のアンタゴニストであり、そして好酸球または好塩基球の活性化に起因する任
意の状態の処置のために有用であることを示す。これはほとんどの前炎症状態（
急性および慢性の両方）、ならびにアレルギー性応答（喘息、気道炎症、成人呼
吸促進症候群および一般的なアレルギーを含む）を含む。これはさらに、Ｃｋβ
−６、Ｃｋβ−１０またはエオタキシンの過剰発現に起因する任意の疾患状態を
含む。なぜなら、ΔＣ１ΔＮ３は、全てのこれらのケモカインの活性を阻害する
からである。さらに、ΔＣ１ΔＮ３はまた、ＣＣＲ３レセプターの過剰発現およ
び／または過剰活性化から生じる状態を処置するために使用され得る。
【０４０１】 （実施例１４） （改変形態のＭＰＩＦ−２に対する好酸球および骨髄前駆体の差示的応答性） ケモカインは、様々な細胞型（造血前駆体および成熟循環白血球を含む）の多
様な機能を有する分泌タンパク質のファミリーである（Ｌｕｓｔｅｒ，Ａ．Ｄ．
，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３８：４３６（１９９８）；Ｂｒｏｘｍｅｙｅ
ｒ，Ｈ．Ｅ．，およびＣ．Ｈ．Ｋｉｍ．，「Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ａｎｄ Ｈｅ
ｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ」、Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ、Ｒ
ｏｌｌｉｎｓ，Ｂ．Ｊ．ら、Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ
，ＮＪ，２６３頁（１９９９）；Ｋｅｌｌｅｒ，Ｊ．Ｒ．ら、「Ｔｒａｎｓｆｏ
ｒｍｉｎｇ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ−β，Ｔｕｍｏｒ Ｎｅｃｒｏｓｉｓ
Ｆａｃｔｏｒ α，ａｎｄ Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒ
ｙ Ｐｒｏｔｅｉｎ−１α ａｒｅ Ｂｉｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ Ｒｅｇｕｌ
ａｔｏｒｓ ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ」、
Ｃｏｌｏｎｙ Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇａｒｌａｎｄ，Ｊ．Ｍ．ら編
、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，４４５頁（１９９７
））。ケモカインレセプターは、適切なリガンドにより結合された場合に細胞内
カルシウム流動を引き起こす７個の膜貫通Ｇタンパク質結合レセプターである（
Ｍｕｒｐｈｙ，Ｐ．Ｍ．，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒ
ｅｖ．７：４７（１９９６））。これらのレセプターの１つである、ＣＣケモカ
インレセプター３（ＣＣＲ３）は、好酸球および好塩基球において高度に発現さ
れ、そしてβケモカインエオタキシンおよびＭＰＩＦ−２の作用を媒介する（Ｆ
ｏｒｓｓｍａｎｎ，Ｕ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８５：２１７１（１９９７
）；Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ，Ｂ．Ｌ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３：２３４９
（１９９６）；Ｐｏｎａｔｈ，Ｐ．Ｄ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３：２４
３７（１９９６）；Ｕｇｕｃｃｉｏｎｉ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ
．１００：１１３７（１９９７）；Ｐｏｎａｔｈ，Ｐ．Ｄ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．
Ｉｎｖｅｓｔ．９７：６０４（１９９６）；Ｙａｍａｄａ，Ｈ．ら、Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２３１：３６５（１９９７）；
Ｋｉｔａｕｒａ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：７７２５（１９９
６）；Ｐａｔｅｌ，Ｖ．Ｐ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８５：１１６３（１９
９７）；Ｗｈｉｔｅ，Ｊ．Ｒ．ら、Ｊ．Ｌｅｕｋ．Ｂｉｏｌ．６２：６６７（１
９９７））。
【０４０２】 アレルギー反応に関連する細胞（好酸球、好塩基球、Ｔｈ−２リンパ球）に対
するエオタキシンおよびＭＰＩＦ−２の高い選択性は独特であある。エオタキシ
ンは、機能活性に基づいて数年前に同定された（Ｊｏｓｅ，Ｐ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｅ
ｘｐ．Ｍｅｄ．１７９：８８１（１９９４））が、ＭＰＩＦ−２は大スケールの
ｃＤＮＡ配列決定の試みの一部として、活性化単球ライブラリーにおいて発見さ
れ、そして最初はＣｋβ−６と命名された。これが、高度な増殖性潜在的コロニ
ー形成細胞によるコロニー形成を抑制することが見出された後、機能的に、これ
は骨髄前駆体阻害因子、すなわち、ＭＰＩＦ−２として記載される（Ｐａｔｅｌ
，Ｖ．Ｐ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８５：１１６３（１９９７））。ケモカ
インレセプターの利用研究は、ＭＰＩＦ−２は、エオタキシンおよびＭＣＰ−４
に匹敵する細胞内カルシウムの一過性の上昇を引き起こすことを示し、そして好
塩基球についての骨髄交差脱感作研究は、ＭＰＩＦ−２がＣＣＲ３を介してシグ
ナル伝達することを示す（Ｐａｔｅｌ，Ｖ．Ｐ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８
５：１１６３（１９９７））。ＭＰＩＦ−２は構造的にエオタキシンから離れて
いる（３９％同一のアミノ酸）が、これはエオタキシン、エオタキシン−２とし
て分類される。なぜなら、これはエオタキシンレセプター、ＣＣＲ３によって、
活性化好酸球に対する高レベルの選択性を共有するからである（Ｆｏｒｓｓｍａ
ｎｎ，Ｕ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８５：２１７１（１９９７）；Ｐａｔｅ
ｌ，Ｖ．Ｐ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８５：１１６３（１９９７）；Ｗｈｉ
ｔｅ，Ｊ．Ｒ．ら、Ｊ．Ｌｅｕｋ．Ｂｉｏｌ．６２：６６７（１９９７））。利
用可能なデータは、ＭＰＩＦ−２がＣＣＲ３を介して好酸球に作用することを指
示するが、ＭＰＩＦ−２の骨髄前駆体阻害活性を媒介する骨髄細胞上のレセプタ
ーは、未だ特徴付けされていない。
【０４０３】 ケモカインのＮＨ2末端切断の生物学的効果を調査するために設計された研究
は、差示的レセプターの使用および変化した生物学的活性の重要な例を示す。Ｒ
ＡＮＴＥＳの切断物は、ＣＣＲ１およびＣＣＲ３によって媒介される走化性活性
を軽減するが、ＣＣＲ５によって媒介される抗ＨＩＶ−１活性を増強する（Ｓｔ
ｒｕｙｆ．Ｓ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：１２６２（１９９８）
；Ｓｃｈｏｌｓ，Ｄ．ら、Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓ．３９：１７５〜１８７
（１９９８））。マクロファージ由来のケモカイン（ＭＤＣ）の場合において、
同定されていないがさらなるＭＤＣレセプターの関与が、このケモカインの切断
された形態（ＭＤＣ（３−６９））の分析によって示唆される（Ｓｔｒｕｙｆ，
Ｓ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：２６７２（１９９８））。ＭＤＣ（３−
６９）は、リンパ球について減少した走化性活性を示すが、ＨＩＶ阻害活性の増
強は、末梢血単核細胞の同じケモカイン形態を用いて観察された。減少した走化
性活性は、公知のＭＤＣレセプター、ＣＣＲ４への結合の損失に起因するようで
あるが、抗ウイルス効果の増強は、第２の特徴付けされていないＭＤＣレセプタ
ーの仮説を指示する。
【０４０４】 本発明者らは、ＭＰＩＦ−２のＮＨ2末端改変の、その生物学的活性に対する
効果を決定した。ＭＰＩＦ−２の様々な切断物を、好酸球カルシウム移動、走化
性研究および結合研究において、ＣＣＲ３と相互作用する能力について特徴付け
た。さらに、各欠失変異体の生物学的活性を、ヒト骨髄コロニー形成アッセイに
おいて特徴付けた。本発明者らは、ＭＰＩＦ−２のアミノ酸末端の変化は、好酸
球および骨髄細胞に対する生物学的活性に差示的に影響を与えることを示した。
本発明者らはさらに、ＭＰＩＦ−２、ＭＰＩＦ−２（Ｐ３０−Ｒ９９）の切断形
態を同定し、同時に、好酸球上で機能的に不活性であり、骨髄細胞において骨髄
阻害活性を保持することを同定した。
【０４０５】 （材料および方法） （ＭＰＩＦ−２の細菌発現および変異体の産生） ＭＰＩＦ−２の細菌発現について、コドンの使用法を、Ｅ．ｃｏｌｉにおける
発現について最適化した。ＭＰＩＦ−２の成熟タンパク質配列を含むＰＣＲ生成
フラグメント（Ｄｉｌｌｏｎ，Ｐ．Ｊ．およびＣ．Ａ．Ｒｏｓｅｎ．，Ｂｉｏｔ
ｅｃｈｉｑｕｅｓ ９：２９８（１９９０））を、ＮｄｅＩ／Ａｓｐ７１８消化
の後に、細菌発現ベクターｐＨＥ４に連結した。次いで、この発現ベクターを使
用して、適切なプライマーを使用して、様々な欠失変異体を生成した。異なるＭ
ＰＩＦ−２変異体のＤＮＡを保有するプラスミド（ｐＨＥ４）を、化学的に適合
性のカンナマイシン耐性のＥ．ｃｏｌｉ（ＳＧ１３００９株）に形質転換した（
Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ
（１９８２））。
【０４０６】 ＭＰＩＦ−２変異体の精製方法は、Ｅ．ｃｏｌｉからのケモカインの精製のた
めに開発されたプロセスの改変である。類似の発現および精製プロトコルを、６
個の変異体に使用したため、本発明者らは、これらの変異体のうちただ１つ（Ｍ
ＰＩＦ−２（Ｖ２７−Ｒ９９））を精製するために使用した方法について、次に
記載する。形質転換細胞を５Ｌの発酵槽で増殖し、そしてＩＰＴＧで誘発した。
収集した細胞ペーストを、緩衝液Ａ（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ ７．６、２
５ｍＭ ＥＤＴＡ）中に０．１ｇ／ｍｌで再懸濁し、そしてマイクロ流動化器を
２回通すことによって溶解した。細胞溶解物を遠心分離し（８５００ｒｐｍ、２
０分）、そして封入体ペレットを、１．７５Ｍ グアニジンヒドロクロリドを含
む１０倍の緩衝液Ａに可溶化した。この溶液を、予め冷却したリフォールディン
グ緩衝液（１００ｍＭ 酢酸ナトリウム、ｐＨ ４．５、１００ｍＭ ＮａＣｌ
、２ｍＭ ＥＤＴＡ）で１０倍に希釈し、そして遠心分離によって浄化し（９０
００ｒｐｍ、２０分）、そして濾過した（０．４５μｍ）。第１にＰＯＲＯＳＨ
ＩＳ５０カラム上に捕捉し、次いでＮａＣｌ段階勾配（０．３Ｍ、０．５Ｍ、０
．７５Ｍおよび１．５Ｍ）を使用して溶出し、次いでこれをタンデム型のＰＯＲ
ＯＳ ＨＱ５０／ＰＯＲＯＳ ＣＭ２０カラムに充填し、そして直線のＮａＣｌ
勾配（０．１５Ｍ〜１Ｍ）で溶出し、そして最後に、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５カラ
ム上で研磨することによってこのタンパク質を精製した。適切な画分をプールし
、そしてＮＨ2末端配列決定に供し（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ４９４ Ｐｒ
ｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）（Ｈｅｗｉｃｋ，Ｒ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ
．Ｃｈｅｍ．２５６：７９９１（１９８１））、ＨＰＬＣ（Ｂｒｏｗｎｌｅｅ
ＲＰ３００ カラム、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｓｙｓｔｅｍ
ＧＯＬＤ）およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｌｅａｍｍｌｉ，Ｕ．Ｋ．Ｎａｔｕｒｅ
２２７：６８０（１９７０））に供して、純度を確認した。タンパク質の濃度
を、Ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋ
ｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を使用して決定した。
【０４０７】 （好酸球精製および機能的アッセイ） 好酸球を、単一のドナーロイコパック（ｌｅｕｋｏｐａｋ）（Ａｍｅｒｉｃａ
ｎ Ｒｅｄ Ｃｒｏｓｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ）から以前に記載されたよ
うに精製し（Ｈａｎｓｅｌ，Ｔ．Ｔ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１４
５：１０５（１９９１））、そしてシトスピン（ｃｙｔｏｓｐｉｎ）調製物を染
色することによって評価されるように、９０％以上の純度であった。Ｃａ2+流動
化研究について、好酸球を３０分間室温で、緩衝液（１ｍＭ ＣａＣｌ2、１ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ2、１２５ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、０．５ｍＭ グルコ
ース、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ ７．４、０．０２５％ ＢＳＡ）中５×１
０6細胞／ｍｌにつき２．０μＭのフラ−２ＡＭで負荷した。細胞を負荷緩衝液
中で洗浄し、１０6細胞／ｍｌで再懸濁した。細胞内Ｃａ2+の変化によって引き
起こされる蛍光シグナルを、３４０および３８０ｎｍのフラ励起、および５１０
ｎｍの発光をモニタリングすることによって、蛍光分光光時計（Ｆ−２０００；
Ｈｉｔａｃｈｉ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ
）で測定した。
【０４０８】 走化性アッセイを、上記のように実施した（Ｐａｔｅｌ，Ｖ．Ｐ．ら、Ｊ．Ｅ
ｘｐ．Ｍｅｄ．１８５：１１６３（１９９７））。簡単には、増加する濃度のア
ゴニストを、単独でかまたは１０ｎｇ／ｍｌまたは１００ｎｇ／ｍｌのいずれか
のＭＰＩＦ−２（Ｐ３０−Ｒ９９）の存在下でかのいずれかで底部チャンバに添
加した。９６ウェル走化性プレートフィルター（Ｎｅｕｒｏ Ｐｒｏｂｅ，Ｃａ
ｂｉｎ Ｊｏｈｎ，ＭＤ）に充填する前に、好酸球を、緩衝液中でか、またはＭ
ＰＩＦ−２（Ｐ３０−Ｒ９９）と共にのいずれかで、３７℃で３０分間インキュ
ベートした。組換えヒトエオタキシンは、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅ
ａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）製であり、そして組換えヒトＭＣＰ−４は、ＰｅｐｒｏＴ
ｅｃｈ（Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ，ＮＪ）製であった。
【０４０９】 （レセプター結合アッセイ） レセプター結合アッセイを、わずかに変更して記載されるように行った（Ｐｏ
ｎａｔｈ，Ｐ．Ｄ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３：２４３７（１９９６））
。２×１０5好酸球／ウェル、および０．１ｎＭ 125Ｉ−エオタキシンまたは12 5 Ｉ−ＭＣＰ−４および１ｎＭ 125Ｉ−ＭＰＩＦ−２（ｓｐ．ａｃｔ．２０００
Ｃｉ／ｍｍｏｌ、Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ，Ｉ
Ｌ）を使用して、アッセイを行った。好酸球を結合緩衝液（５０ｍＭ Ｈｅｐｅ
ｓ、ｐＨ ７．５、１ｍＭ ＣａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．５％ ＢＳＡ
、０．０５％ アジ化ナトリウム）に再懸濁し、そして９６ウェルプレートに移
した。１００μｌの全反応容量中で、コールドの競合的ケモカインの非存在下ま
たは存在下で、ヨウ素化ケモカインを添加した。結合反応を、室温で６０分間行
った。これらの細胞を０．１％ＰＥＩで予め処理したフィルタープレート（ロプ
ロジン（ｌｏｐｒｏｄｙｎｅ）膜を有するＳｉｌｅｎｔ Ｓｃｒｅｅｎ、Ｎａｌ
ｇｅ Ｎｕｎｃ）に移し、そして０．５Ｍ ＮａＣｌを含む結合緩衝液で３回迅
速に洗浄した。このプレートを乾燥し、そして各ウェルにおいて、５０μｌの液
体シンチラント（ｓｃｉｎｔｉｌｌａｎｔ）の添加の後に、計数した。
【０４１０】 （低密度ヒト骨髄細胞の精製およびコロニー形成の測定） 新しいヒト骨髄細胞（ＢＭＣ）を、ＢｉｏｗｉｔｔａｋｅｒのＰｏｉｅｔｉｃ
ｓ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）から得た。２％ ＦＢＳ（ＩＭＤＭ／２
％）を補充したＩＭＤＭに細胞を再懸濁し、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ分離培地
（１，０７７ｇ／ｍｌ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ
）上に層状にし、そして２０℃で３０分間８００×ｇで遠心分離した。界面から
低密度（ＬＤ）ＢＭＣを収集し、洗浄し、そしてＩＭＤＭ／２％ ＦＢＳに再懸
濁した。
【０４１１】 クローン原性潜在性の決定のために、１プレートにつき合計１０4のＬＤ Ｍ
ＢＣを、単層メチルセルソールベースの培地（ＭｅｔｈｏｃｕｌｔTM ＧＦ Ｈ
４４３４，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅ
ｒ，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｃｏｌｕｍｂｉａ，Ｃａｎａｄａ）を使用して、三重で培
養し、この培地は以下の増殖因子を含んだ：５０ｎｇ／ｍｌ ｒｈＳＣＦ、１０
ｎｇ／ｍｌ ｒｈＧＭ−ＣＳＦ、１０ｎｇ／ｍｌ ｒｈＩＬ−３、３Ｕｎｉｔ／
ｍｌ Ｅｐｏ。様々な用量のＭＰＩＦ−２を各群に添加した。各培地を、３７℃
、５％ＣＯ2で、１８日間インキュベートし、その後５０個以上の細胞を含むコ
ロニーを数えた。顆粒球、赤血球、巨核球、およびマクロファージ系統を含む多
分化能コロニーを、ＣＦＵ−ＧＥＭＭとしてスコア付けし、ここで、単核細胞（
ＣＦＵ−Ｍ）、骨髄細胞（ＣＦＵ−Ｇ）、赤血球細胞（ＣＦＵ−ＥおよびＢＦＵ
−Ｅ）および骨髄単球細胞（ＣＦＵ−ＧＭ）を含む単一の系統のコロニーを、Ｃ
ＦＵ−Ｃと命名した。
【０４１２】 （結果） （ＭＰＩＦ−２のＮＨ2末端短縮変異体の生成） ＭＰＩＦ−２のＮＨ2末端短
縮変異体を生成するために、成熟ＭＰＩＦ−２タンパク質をコードするｃＤＮＡ
を発現ベクター中にクローニングし、そして全長および欠失変異体のＰＣＲ生成
のためのテンプレートとして使用した。次いで、各クローンを、Ｅ．ｃｏｌｉに
おいて発現させそして精製した。生成された野生型タンパク質および変異体タン
パク質は、Ｒ９９へのカルボキシ末端短縮型であった。なぜなら、これは、哺乳
動物細胞産生調製物中に存在するＭＰＩＦ−２の最も短い形態を示すことが示さ
れたからである（Ｆｏｒｓｓｍａｎｎ，Ｕ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８５：
２１７１（１９９７））。図２３Ａおよび２３Ｂは、精製タンパク質のＳＤＳ−
ＰＡＧＥ分析、推定アミノ酸配列、および観察されたＮ末端を示す。表５は、変
異体、ならびに配列番号２の対応するアミノ酸位置を列挙する。ＮＨ2末端配列
決定に加え、各タンパク質の分子量を、質量分析により決定した。ＭＰＩＦ−２
（Ｖ２７−Ｒ９９）は、ＭＰＩＦ−２の成熟分泌形態を示し、これには、新規な
メチオニン残基がアミノ末端に保持されており、Ｅ．ｃｏｌｉ発現系におけるタ
ンパク質発現を容易にし、そしてこれは本明細書中でＭＰＩＦ−２の成熟形態と
呼ばれる。本明細書に示される研究ならびに本発明者らの未公開の観察に基づき
、このメチオニンおよびＲ９９へのカルボキシ末端短縮は、ＮＨ2末端メチオニ
ンを欠くかもしくはＣ末端短縮のいずれかのＣＨＯ由来物質と比較した場合、抗
酸球カルシウム移動アッセイにおけるＭＰＩＦ−２の活性に対して何の明らかな
効果も有さない（準備中の原稿）。
【０４１３】 （カルシウム移動アッセイにおけるＭＰＩＦ−２変異体の分析） 精製した変
体タンパク質を、新たに単離したヒト抗酸球を使用してカルシウム流出（ｆｌｕ
ｘ）アッセイにおいて試験した。図２４Ａに示されるように、バリン２８および
イソロイシン２９までの短縮（変異体タンパク質ＭＰＩＦ−２（Ｖ２８−Ｒ９９
）およびＭＰＩＦ−２（Ｉ２９−Ｒ９９））は、成熟ＭＰＩＦ−２（Ｖ２７−Ｒ
９９）に匹敵するカルシウム流出アッセイにおける活性を有する変異体を生じた
が、ＭＰＩＦ−２（Ｉ２９−Ｒ９９）により送達されるシグナルはわずかに減弱
した。しかし、Ｐ３０を超えるさらなる短縮（変異体タンパク質ＭＰＩＦ−２（
Ｒ３０−Ｒ９９）、ＭＰＩＦ−２（Ｒ３２−Ｒ９９）、およびＭＰＩＦ−２（Ｃ
３３−Ｒ９９））は、このアッセイにおいて検出可能な活性を示さない変異体を
生じた。
【０４１４】 これらのタンパク質を、抗酸球カルシウム移動応答の相互脱感授性においても
アッセイした。予測されるように、ＭＰＩＦ−２（Ｖ２７−Ｒ９９）、ＭＰＩＦ
−２（Ｖ２８−Ｒ９９）およびＭＰＩＦ−２（Ｉ２９−Ｒ９９）はすべて、エオ
タキシン、ＭＰＩＦ−２（Ｖ２７−Ｒ９９）およびＭＣＰ−４により送達される
シグナルを脱感授性する能力を示した（示さず）。興味深いことに、その変異体
のうちの１つ（カルシウム流出を惹起する能力を失ったＭＰＩＦ−２（Ｒ３０−
Ｒ９９））は、続くシグナルに対して抗酸球を脱感授性する能力を保持した。Ｍ
ＰＩＦ−２（Ｐ３０−Ｒ９９）は、エオタキシン、ＭＰＩＦ−２（Ｖ２７−Ｒ９
９）およびＭＣＰ−４により送達されるシグナルに対して抗酸球を部分的にかも
しくは完全に脱感授性した（図２Ｂ）。成熟ＭＰＩＦ−２（Ｖ２７−Ｒ９９）ま
たはＭＣＰ−４のいずれかに対する応答の完全な脱感授性は、５００倍過剰のＭ
ＰＩＦ−２（Ｒ３０−Ｒ９９）での細胞の事前処理の際に達成できた（本明細書
中のデータ、ならびに非公開結果）。エオタキシンの場合、全用量応答分析は、
そのエオタキシン応答の部分的脱感授性のみが達成可能であり、それが既知のリ
ガンドの間でＣＣＲ３について最高の結合親和性を有するエオタキシンにおそら
く起因することを示す。ＭＣＰ−３およびＲＡＮＴＥＳを含む他の公知のＣＣＲ
３リガンドのうち、ＭＰＩＦ−２（Ｐ３０−Ｒ９９）がなおより強力であり、５
０〜１００倍過剰で使用した場合にこれらの２つのアゴニストにより送達される
細胞応答を脱感授性した（データは示さず）。
【０４１５】 （抗酸球走化性アッセイにおけるＭＰＩＦ−２変異体の分析） カルシウム流
出自体を誘導することなくＣＣＲ３リガンドにより惹起されるカルシウム流出シ
グナルを脱感授性するＭＰＩＦ−２（Ｐ３０−Ｒ９９）の能力は、この変異体は
シグナルを送達することなくＣＣＲ３を結合し得ることを示唆した。この可能性
をさらに調査するために、ＭＰＩＦ−２（Ｐ３０−Ｒ９９）および他の変異体を
、抗酸球走化性アッセイにおいて試験した。図２５Ａにおいて示されるように、
ＭＰＩＦ−２（Ｖ２７−Ｒ９９）、ＭＰＩＦ−２（Ｖ２８−Ｒ９９）、およびＭ
ＰＩＦ−２（Ｉ２９−Ｒ９９）はすべて、抗酸球の移動を指令し、ＭＰＩＦ−２
（Ｉ２９−Ｒ９９）を用いて観察された用量応答曲線におけるシフトは、カルシ
ウム流出アッセイにおいてこの変異体を用いて観察されたわずかな減弱に類似し
た。カルシウム流出実験において得られる結果と相関して、ＭＰＩＦ−２（Ｐ３
０−Ｒ９９）、ＭＰＩＦ−２（Ｐ３２−Ｒ９９）およびＭＰＩＦ−２（Ｃ３３−
Ｒ９９）は、抗酸球走化性についてのアゴニストとしての活性を失った。
【０４１６】 ＭＰＩＦ−２（Ｐ３０−Ｒ９９）が機能性アンタゴニストとして挙動し得るか
または移動研究においてアゴニストケモカインに対して抗酸球を脱感授性し得る
かを決定するために、この変異体を、走化性アッセイにおいてエオタキシン、Ｍ
ＰＩＦ−２（Ｖ２７−Ｒ９９）、およびＭＣＰ−４と組み合わせて試験した。図
２５Ｂにおいて示されるように、１００ｎｇ／ｍｌのＭＰＩＦ−２（Ｐ３０−Ｒ
９９）に事前に曝露した抗酸球を、これらのＣＣＲ３アゴニストリガンドのうち
の３つすべてにより誘導されるその後の走化性応答に対して脱感授性した。１０
ｎｇ／ｍｌで使用した場合、ＭＰＩＦ−２（Ｐ３０−Ｒ９９）は、比較的弱い効
果を示したが、走化性を部分的に阻害した（図２５Ｂ）。対照的に、ＭＰＩＦ−
２（Ｐ３２−Ｒ９９）およびＭＰＩＦ−２（Ｃ３３−Ｒ９９）は、１０００ｎｇ
／ｍｌ程度の高さの濃度でさえ、走化性アッセイにおいてアンタゴニストとして
作用しなかった。ＭＰＩＦ−２（Ｐ３０−Ｒ９９）が、エオタキシン走化性応答
をより効率的に阻害するがエオタキシンカルシウム応答を部分的にしか阻害しな
い能力は、走化性アッセイ前のＭＰＩＦ−２（Ｐ３０−Ｒ９９）に対する抗酸球
のより長い曝露、ならびにケモカイン勾配を感じるために必要な重要な数のレセ
プター部位のより効率的な脱感授性もしくはダウンレギュレーションにおそらく
起因する。
【０４１７】 （ＭＰＩＦ−２変異体のＣＣＲ３結合プロフィール） カルシウム流出および
走化性実験における脱感授性プロフィールは、ＭＰＩＦ−２（Ｐ３０−Ｒ９９）
が、ＣＣＲ３についてのアンタゴニストであり得ることを示唆した。これがＣＣ
Ｒ３レセプターへの結合に関与するか否かを決定するために、競合結合研究を、
放射性標識したエオタキシン、ＭＰＩＦ−２（Ｖ２７−Ｒ９９）またはＭＣＰ−
４を使用して、一次抗酸球に対して実施した。予期されるように、エオタキシン
は放射性エオタキシンを効率的に置換したが、ＭＩＰ−１βはそうしなかった（
図２６Ａ）；５０％の放射性標識エオタキシンが、５ｎＭ非放射性（ｃｏｌｄ）
エオタキシンで置換され、そして９５％が１００ｎＭ非放射性エオタキシンで置
換された。ＭＰＩＦ−２はまた、エオタキシンを置換したが、連続的に短縮され
るにつれて、結合について競合する能力を次第に失った。唯一の例外は、エオタ
キシンもしくはＭＰＩＦ−２（Ｖ２７−Ｒ９９）とほとんど同じ程度効率的にエ
オタキシン結合について競合することができる、ＭＰＩＦ−２（Ｐ３０−Ｒ９９
）であった（図４Ａ）。ＭＰＩＦ−２（Ｐ３０−Ｒ９９）はまた、ＣＣＲ３への
ＭＣＰ−４およびＭＰＩＦ−２（Ｖ２７−Ｒ９９）の両方の結合について効率的
な競合因子であった（図２６Ｂおよび２６Ｃ）。抗酸球への結合についてエオタ
キシン、ＭＰＩＦ−２（Ｖ２７−Ｒ９９）およびＭＣＰ−４とＭＰＩＦ−２（Ｐ
３０−Ｒ９９）が競合できたという事実は、機能性アッセイにおけるこの変異体
のアンタゴニスト効果は、おそらくこの変異体がＣＣＲ３レセプターを占有する
能力に起因することを示唆する。
【０４１８】 （ヒト骨髄系前駆体に対するＭＰＩＦ−２変異体の活性） 骨髄前駆体細胞は
、別のＭＰＩＦ−２応答性細胞集団を示す。これに関し、以前の研究は、ＭＰＩ
Ｆ−２が、マウスおよびヒトの骨髄系前駆体によるコロニー形成の強力なインヒ
ビターであることを示す（Ｐａｔｅｌ，Ｖ．Ｐ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８
５：１１６３（１９９７））。ここで、ＭＰＩＦ−２（Ｐ３０−Ｒ９９）を競合
的ＣＣＲ３アンタゴニストとしてそして抗酸球に対して機能的に不活性であると
して同定したが、本発明者らは、ヒト骨髄細胞に対するＭＰＩＦ−２の阻害効果
がＣＣＲ３により媒介される場合に、ＭＰＩＦ−２（Ｐ３０−Ｒ９９）が、成熟
ＭＰＩＦ−２（Ｖ２７−Ｒ９９）と比較して骨髄系前駆体細胞のコロニー形成を
阻害する能力を失うからと理由付けた。このことを調査するために、ＭＰＩＦ−
２（Ｐ３０−Ｒ９９）および他の変異体を、一連のヒト骨髄前駆体細胞コロニー
形成アッセイにおいて試験した。表６における結果は、ＭＰＩＦ−２の成熟形態
（ＭＰＩＦ−２（Ｖ２７−Ｒ９９））がＣＦＵ−ＣおよびＣＦＵ−ＧＥＭＭの両
方のコロニー形成について阻害性であったことを示す。抗酸球を用いるアッセイ
において観察されるように、最初の２つのバリンの切断を伴う変異体であるＭＰ
ＩＦ−２（Ｖ２８−Ｒ９９）およびＭＰＩＦ−２（Ｉ２９−Ｒ９９）は、成熟Ｍ
ＰＩＦ−２形態として挙動し、ヒト骨髄コロニー形成に対して阻害作用を示す。
予期せぬことに、ＭＰＩＦ−２（Ｐ３０−Ｒ９９）を用いて抗酸球に対して観察
される活性の完全な損失とは異なり、この変異体は、ヒト骨髄コロニー形成を阻
害する完全な能力を保持した。この知見は、ヒトＣＦＵ−ＣおよびＣＦＵ−ＧＥ
ＭＭのコロニーアッセイの両方において観察され、同様にマウス細胞に対するア
ッセイにおいても観察された（データは示さず）。変異体ＭＰＩＦ−２（Ｐ３２
−Ｒ９９）およびＭＰＩＦ−２（Ｐ３３−Ｒ９９）により例示されるさらなるア
ミノ酸の短縮は、骨髄系前駆体に対する阻害活性の損失を生じた（表６）。
【０４１９】 （考察） 本研究において、本発明者らは、ＭＰＩＦ−２のアミノ末端における改変が好
酸球およびヒト骨髄造血前駆体細胞に対する生物学的活性に影響を与えるか否か
を調査した。この結果は、ＭＰＩＦ−のＮＨ2末端短縮変異体が、好酸球および
骨髄細胞に対して異なる生物学的活性を提示することを示す。好酸球に対して、
最初の２アミノ酸の欠失を有するＭＰＩＦ−２変異体（ＭＰＩＦ−２（Ｖ２８〜
Ｒ９９）およびＭＰＩＦ−２（１２９〜Ｒ９９））は、成熟タンパク質形態（Ｍ
ＰＩＦ−２（Ｖ２７〜Ｒ９９））に類似した機能活性を保持する。最初の２つの
ＮＨ2末端バリン残基を超えたＭＰＩＦ−２のさらなる短縮は、好酸球に対して
アゴニスト活性を欠くＭＰＩＦ−２タンパク質をもたらす。これらの変異体のう
ちの１つであるＭＰＩＦ−２（Ｐ３０〜Ｒ９９）を、一次の好酸球に対するレセ
プター競合結合研究において、ＣＣＲ３アンタゴニストとして同定した。この変
異体は、インビトロでの好酸球流動研究において機能的アンタゴニストであり、
好酸球ＣＣＲ３結合ケモカインのエオタキシン、ＭＰＩＦ−２およびＭＣＰ−４
の活性をブロックする。カルシウム流動および走化性において好酸球に対するア
ゴニスト活性の欠損を示すが、ＭＰＩＦ２（Ｐ３０〜Ｒ９９）は、骨髄前駆体細
胞コロニー形成を阻害する能力を保持し、骨髄細胞に対するさらなるＭＰＩＦ−
２レセプターが存在する可能性を暗示する。
【０４２０】 以前の研究は、ケモカインのＮＨ2末端領域の残基が、レセプター活性化に重
要であることを示す。大多数のケモカインに関して、構造−機能分析は、このケ
モカイン−レセプター活性化が少なくとも２つの異なるレセプターサブサイトに
対する結合ならびに細胞内の適切なＧタンパク質の存在を必要とするモデルを支
持する（Ｓｉｃｉｌｉａｎｏ，Ｓ．Ｊ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ ９１：１２１４（１９９４）；Ｗｅｌｌｓ，Ｔ．Ｎ．Ｃ．ら、Ｊ
．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．５９：５３（１９９６）；Ｃｌａｒｋ−Ｌｅｗｉｓ
，Ｉ．ら、Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．５７：７０３（１９９５））。第１の
相互作用は、フレキシブルな短縮されていないＮＨ2末端の結合を促進するため
の埋没したレセプター部位へおそらく曝露する、最初のＣＣモチーフ後のループ
領域のレセプター結合を含む。レセプター認識および／または活性化のためのＣ
ＣケモカインのＮＨ2末端領域におけるアミノ酸残基の重要性は、ＭＣＰ−１お
よびＲＡＮＴＥＳに関して最良に特徴付けられている。このケモカインのＮＨ2
末端の包括的なマッピングは、ＭＣＰ−１の最初の１０個のＮＨ2末端アミノ酸
内での欠失が、そのレセプターに結合するが活性化しないＭＣＰ−１をもたらす
ことを示す（Ｃｌａｒｋ−Ｌｅｗｉｓ，Ｉ．ら、Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．
５７：７０３（１９９５）；Ｚｈａｎｇ，Ｙ．Ｊ．ら、Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ
．２６９：１５９１８（１９９４）；Ｇｏｎｇ，Ｊ．Ｈ．およびＣｌａｒｋ−Ｌ
ｅｗｉｓ，Ｉ．、Ｊ Ｅｘｐ．Ｍｅｄ １８１：６３１（１９９５））。アミノ
酸欠失によって媒介される生物学的活性における変更に加えて、ＲＡＮＴＥＳの
ＮＨ2末端へのメチオニン付加は、強力かつ選択的なアンタゴニストを生成する
（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ，Ａ．Ｅ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２５９
９（１９９６）；Ｅｉｓｎｅｒ，Ｊ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：
２８９２（１９９７））。ここで、本発明者らは、ＭＰＩＦ−２に関して、成熟
ＭＰＩＦ−２タンパク質のＮＨ2末端へのメチオニン付加（ＭＰＩＦ−２ Ｖ２
７−Ｒ９９）が、ｍｅｔ−ＲＡＮＴＥＳの場合に観察されたようなアンタゴニス
ト活性を与えないことを示す。さらに、最初のＮＨ2末端残基（バリン）の損失
は、好酸球カルシウムに対するＭＰＩＦ−２の機能的活性および走化性活性を有
意に変更しない。第２のＮＨ2末端アミノ酸（バリン）の除去の際、本発明者ら
は、走化性能力の減少に注目し、そして第３の残基（イソロイシン）の除去の際
に、観察される活性の完全な損失に注目する。
【０４２１】 エオタキシンおよびＭＰＩＦ−２は類似した機能活性および好酸球に対する高
い選択性を共有するが、これらがアミノ酸配列に限定された類似性（３９％同一
性）を示すことは、注目に値する。ＭＰＩＦ−２は、最初の対のシステインの前
に、短い６アミノ酸のＮＨ2末端配列を有する。このＮＨ2末端配列は、現在同定
されたＣＣＲ３リガンドのうちの最も短いＮＨ2末端活性化ドメインである。６
アミノ酸のこのストレッチにおける他のＣＣＲ３リガンド（例えば、エオタキシ
ンおよびＭＣＰ−４）との類似性は、最初のシステイン対の３アミノ酸上流にあ
るプロリンに制限される。本発明者らの結果は、このプロリンの構造完全性の維
持が、近接したアミノ酸の欠失がＭＰＩＦ−２を機能的に不活性にするように、
ＣＣＲ３レセプター活性化に重要であることを示す。本発明者らは、エオタキシ
ンまたはＭＣＰ−４のこの保存されたプロリンに対する短縮が、ＣＣＲ３の機能
的活性の類似した損失をもたらすと予想する。
【０４２２】 好酸球での知見とは異なり、最初の３アミノ酸の損失は、ＭＰＩＦ−２の骨髄
阻害活性に影響を与えなかった。代わりに、わずかに増強された阻害活性を、競
合的ＣＣＲ３アンタゴニストであるＮＨ2末端短縮変異体（ＭＰＩＦ−２（Ｐ３
０〜Ｒ９９））で観察する。ＭＰＩＦ−２Ｎ末端からのさらなるアミノ酸の欠失
は、骨髄阻害能力を阻害する。これらの結果は、骨髄細胞に対する第２の（未だ
同定されていない）ＭＰＩＦ−２レセプターの存在を実証する。他のＣＣＲ３ア
ゴニストリガンド（ＭＣＰ−４、ＲＡＮＴＥＳ、およびＭＣＰ−３を含む）が、
報告されたようにインビトロにおいてヒト造血コロニー形成に対して阻害活性を
欠くという観測と、これらの知見は一致する（Ｂｒｏｘｍｅｙｅｒ，Ｈ．Ｅ．お
よびＣ．Ｈ．Ｋｉｍ．「Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ａｎｄ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓ
ｉｓ」Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ、Ｒｏｌｌｉｎｓ，Ｂ．Ｊ
．、編、Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ、２６３頁（
１９９９））。さらに、以前の研究において、ＭＰＩＦ−２は、マウス前駆体細
胞コロニー形成に対して非常に強力な用量依存的阻害活性を示し（５０ｎｇ／ｍ
ｌ ＭＰＩＦ−２は、ＨＰＰ−ＣＦＣコロニー形成を８０％減少した）、一方、
未公開の本発明者らの知見は、類似した濃度のＭＰＩＦ−２（Ｖ２７〜Ｒ９９）
がマウス好酸球においてカルシウム流動を弱く刺激することを実証する。
【０４２３】 骨髄細胞に対するＭＰＩＦ−２レセプターの性質は、完全には特徴付けられて
いない。ＣＣＲ３の場合、発現は、好酸球、好塩基球、Ｔｈ２リンパ球、および
ミクログリア細胞を含むいくつかの細胞型で検出可能であり、骨髄細胞に対する
発現に関する報告はほとんどない。ヒト造血細胞におけるＣＣＲ３発現の近年の
分析では骨髄単核細胞に対する発現を明らかにしなかったが（Ｌｅｅ，Ｂ．ら、
Ｂｌｏｏｄ ９３：１１４５（１９９９））、アトピー性喘息を有する患者由来
の骨髄好酸球に対する増加したＣＣＲ３発現の報告があること（Ｚｅｉｂｅｃｏ
ｇｌｏｕ，Ｋ．ら、Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０３：
９９（１９９９）；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｄ．Ｓ．ら、Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌ
ｅｒｇｙＩｍｍｕｎｏｌ．１１８：９８（１９９９））は、興味深い。マウス系
において、ＣＣＲ３発現は、０．５〜２％のみの骨髄細胞に対して報告され、こ
れらの細胞は、好酸球系列の細胞のようである（Ｇｒｉｍａｌｄｉ，Ｊ．Ｃ．ら
、Ｊ．Ｌｅｕｋ．Ｂｉｏｌ．６５：８４６（１９９９））。マウス前骨髄球また
は芽細胞集団において発現は、観察されない（Ｇｒｉｍａｌｄｉ，Ｊ．Ｃ．ら、
Ｊ．Ｌｅｕｋ．Ｂｉｏｌ．６５：８４６（１９９９））。ヒト骨髄におけるＣＣ
Ｒ３の発現をさらに探索することおよびＭＰＩＦ−２が好酸球系列の未成熟骨髄
細胞の生物学的活性および成熟を変更する方法を決定することは、興味深い。Ｃ
ＣＲ３ノックアウトマウスから単離された造血細胞に対するＭＰＩＦ−２活性の
分析は、類似した手段が、複数のレセプターを用いてシグナルを送るケモカイン
の優性レセプターを同定する際に助力する場合、この効果を媒介する際のＣＣＲ
３の役割にさならる洞察を提供する（Ｂｒｏｘｍｅｙｅｒ，Ｈ．Ｅ．およびＣ．
Ｈ．Ｋｉｍ．「Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ａｎｄ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ」Ｃ
ｈｅｍｏｋｉｎｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ，Ｒｏｌｌｉｎｓ，Ｂ．Ｊ．ら、Ｔ
ｈｅ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ、２６３頁（１９９９）
）。
【０４２４】 短縮形態のＭＰＩＦ−２の機能的特性を規定する本研究は、複雑な生物学的プ
ロセスにおける種々のＭＰＩＦ−２ケモカイン形態の役割の理解に重要である。
天然に存在する短縮形態のケモカインの近年の同定は、インビボでの成熟ケモカ
イン形態のＮＨ２末端プロセシングに関する重要な生理学的役割を示す。このよ
うな結論に関する支持は、哺乳動物細胞型（白血球、肉腫細胞および皮膚線維芽
細胞を含む）からの天然の短縮形態であるいくつかのＣＣケモカインの単離から
生じる（Ｓｔｒｕｙｆ，Ｓ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：１２６２
（１９９８）；Ｇｒｉｍａｌｄｉ，Ｊ．Ｃ．ら、Ｊ．Ｌｅｕｋ．Ｂｉｏｌ．６５
：８４６（１９９９）；Ｎｏｓｏ，Ｎ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６：１９
４６（１９９６））。１つのこのような形態のＲＡＮＴＥＳ（３〜６８）は、劇
的に減少されたＣＣＲ１およびＣＣＲ３に対するアゴニスト活性を示すが、ＣＣ
Ｒ５に対する活性は維持する（Ｓｔｒｕｙｆ，Ｓ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．２８：１２６２（１９９８）；Ｓｃｈｏｌｓ，Ｄ．ら、Ａｎｔｉｖｉｒａ
ｌ Ｒｅｓ．３９：１７５−１８７（１９９８））。天然のＮＨ2末端短縮形態
のＭＣＰ−２（ＭＣＰ−２（６〜７６））は、機能的に不活性であり、代わりに
、インタクトなＭＣＰ−２、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−３およびＲＡＮＴＥＳ機能的
応答のアンタゴニストとして作用する（Ｐｒｏｏｓｔ，Ｐ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．１６０：４０３４（１９９８））。Ｎ末端に３アミノ酸までの欠失を有す
る短縮形態のエオタキシンが存在する（Ｎｏｓｏ，Ｎ．、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．２５３：１１４（１９９８））。ケモカインの生理学的プロセシングは
、他のものに加えてＣＤ２６／ジぺプチジル−ペプチダーゼＩＶのようなプロテ
アーゼによって達成され得る。このようなプロセシングは、ケモカイン能力およ
び標的細胞選択性を調節するための重要な動的機構を示す。従って、生理学的状
態または病態学的状態における天然に存在するＮＨ2末端短縮形態のＭＰＩＦ−
２の検出は、重要な手段である。
【０４２５】 要約すると、本発明者らのデータは、ＭＰＩＦ−２のＮ末端の完全な構造−機
能分析を提供する。短縮変異体を、ＭＰＩＦ−２応答性細胞（好酸球および骨髄
前駆体細胞を含む）に対してアッセイした。本研究の結果は、いくつかの重要な
情報の断片を提供する。最初に、いくつかの他のケモカインで観察されたように
、ＭＰＩＦ−２は、構造化されていないＮ末端のアミノ酸が生物学的活性に重要
であるモデルに適合する。アミノ酸３０におけるプロリンの構造的な維持は、好
酸球に対するアゴニスト活性の保存に重要なようであり；この残基へのペプチド
の短縮は、ＭＰＩＦ−２を好酸球カルシウム流動および走化性アッセイにおいて
アゴニストから機能的アンタゴニストに変換する。第２に、このプロリン残基の
構造完全性は、好酸球ＣＣＲ３アンタゴニスト（ＭＰＩＦ−２（Ｐ３０〜Ｒ９９
））において例示されるその欠失が骨髄細胞に対してその活性を排除しないよう
に、骨髄前駆体細胞に対する阻害活性に関して重要でない。これらの知見は、骨
髄区分におけるさらなるＭＰＩＦ−２レセプターの存在と一致し、そしてこのレ
セプターの性質をさらに特徴付けより理解するための研究は、進行中である。
【０４２６】 （表５） ＭＰＩＦ−２の改変形態および配列番号２の対応する位置 改変ＭＰＩＦ−２ 配列番号２のアミノ酸位置 Ｖ２７−Ｒ９９ Ｖ１−Ｒ７３ Ｖ２８−Ｒ９９ Ｖ２−Ｒ７３ Ｉ２９−Ｒ９９ Ｉ３−Ｒ７３ Ｐ３０−Ｒ９９ Ｐ４−Ｒ７３ Ｐ３２−Ｒ９９ Ｐ６−Ｒ７３ Ｃ３３−Ｒ７３ Ｃ７−Ｒ７３ 本発明は、上記の説明および実施例に特に記載される場合以外は、別な方法で
実施され得ることが明らかである。
【０４２７】 本発明の多数の改変およびバリエーションは、上記の教示を考慮して可能であ
り、従って、添付の特許請求の範囲の範囲内である。
【０４２８】 本明細書中に引用される全ての刊行物（特許、特許出願、学術誌の記事、実験
の手引書、書籍、または他の文書を含む）の全開示は、本明細書によって参考と
して援用される。以下の出願がまた、本明細書中に参考として援用される。米国
特許出願第６０／１６１，４００（１９９９年１０月２５日出願）；ＰＣＴ／Ｕ
Ｓ９４／０５３８４（１９９４年５月１６日出願）；０８／４２４，４２５（１
９９５年４月２１日出願）；０８／４７９，１２６（１９９５年６月７日出願）
；ＰＣＴ／ＵＳ９６／１００８７（１９９６年６月７日出願）；０８／７２６，
８３０（１９９６年１０月８日出願）；０９／０４４，８５５（１９９８年３月
２０日出願）；０９／０４４，８５６（１９９８年３月２０日出願）；０９／４
５３，４１６（１９９９年１２月３日出願）；６０／０４２，２６９（１９９７
年３月３１日出願）；０８／９９５，１５６（１９９７年１２月１９日出願）；
および０９／４１９，２８１（１９９９年１０月１５日出願）。
【０４２９】 （表６．インビトロにおけるヒト造血前駆体コロニー形成に対するＭＰＩＦ−
２短縮形態の効果）
【０４３０】
【表５】 骨髄単核細胞を、サイトカインカクテルの存在下で培養し、そして材料および方
法に記載されたようなケモカインの濃度を示す。データは、３連のプレートから
のコントロール±ＳＤの平均％として表現する。コントロール値を、サイトカイ
ンカクテル単独の存在下で培養した骨髄単核細胞から得た。実験番号１における
コントロールコロニーの値は、：８３＋／−４．２ ＣＦＵ−Ｃ コロニー／プ
レートおよび１６＋／−１．０ ＣＦＵ−ＧＥＭＭコロニー／プレートであり；
実験番号２においては：６１＋／−５．５ ＣＦＵ−Ｃコロニー／プレートおよ
び１２＋／−０．６ ＣＦＵ−ＧＥＭＭコロニー／プレートであった。
【０４３１】 以下の図面は本発明の実施形態を例示するものであって、特許請求の範囲によ
って含まれるような本発明の範囲を制限することを意味するのではない。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、Ｃｋβ−６のｃＤＮＡ配列（配列番号１）および対応する決定された
アミノ酸配列（配列番号２）を示す。１１９アミノ酸配列が、全長タンパク質で
あり、最初のおよそ２６アミノ酸がリーダー配列（下線部）を示しており、その
結果、このタンパク質の成熟形態は、９３アミノ酸長である。アミノ酸について
標準的な一文字略語を使用する。
【図２】 図２は、本発明のポリペプチドとヒトＭＣＰ−１（配列番号５）との間のアミ
ノ酸配列相同性の比較を示す。Ｃｋβ−６は、コンピュータープログラムＢｅｓ
ｔｆｉｔによって決定されるように、ヒトＭＣＰ−１と３６％の同一性および５
２％の類似性を示す。
【図３】 図３は、本発明のポリペプチドの好中球（ＰＭＮ）および末梢血単核細胞（Ｐ
ＢＭＣ）に対する走化性活性を示す。好中球および末梢血単核細胞を末梢血液か
ら単離し、ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭを用いてロードし、そして、９６ウェル、単回
使用神経プローブ走化性チャンバーにおける走化性について使用した。Ｃｋβ−
６とインキュベートして９０分後、このチャンバーを取り外し、フィルター風乾
し、そして、膜を介して移行する細胞の数を、ｃｙｔｏｆｌｕｏｒＩＩで定量し
た。
【図４】 図４は、Ｃｋβ−６が、高増殖性潜在コロニー形成細胞（ＨＰＰ−ＣＦＣ）（
Ａ）の増殖および分化を阻害し、そして、低増殖性潜在コロニー形成細胞（ＨＰ
Ｐ−ＣＦＣ）（Ｂ）に対して効果的ではないことを示す。これらの実験では、低
密度の、非粘着性骨髄細胞由来の１，５００個の細胞を、５ｎｇ／ｍｌマウスＩ
Ｌ−３、１００ｎｇ／ｍｌマウスＳＣＦ、１０ｎｇ／ｍｌマウスＩＬ−１ａ、５
ｎｇ／ｍｌヒトＭ−ＣＳＦで充填し、および示された濃度のＣｋβ−６で充填し
たかまたは充填していない寒天培地でプレートした。コロニーをインキュベート
１４日後に記録した。３回実験を行った。結果をコロニー平均値±ＳＤとして示
す。無関係のタンパク質は、影響しなかった。
【図５】 図５は、運命付けられた前駆細胞を除去することによって、原始Ｌｉｎ細胞に
おける濃縮された骨髄細胞に対するＣｋβ−６の影響を示す（抗体抗−ＣＤ１１
ｂ、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５ＲおよびＧｒ．−１）。パネルＡは、５ｎｇ／ｍ
ｌ ＩＬ−３、１００ｎｇ／ｍｌ ＳＣＦ、１０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−１ａ、５ｎ
ｇ／ｍｌ Ｍ−ＣＳＦで充填された寒天培地でプレートされた骨髄細胞（カラム
１）およびＬｉｎ細胞（カラム２）におけるＬＰＰ−ＣＦＣ／ＨＰＰ−ＣＦＣの
割合±ＳＤを示す。カラム３、４、および５は、５ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−３および
１００ｎｇ／ｍｌ ＳＣＦ（カラム３）、ＩＬ−３、ＳＣＦおよび５０ｎｇ／ｍ
ｌ Ｃｋβ−６（カラム４）またはＩＬ−３、ＳＣＦおよび５０ｎｇ／ｍｌの無
関係のタンパク質を使用して培養した。６日後、培養物をＨＰＰ−ＣＦＣおよび
ＬＰＰ−ＣＦＣについてアッセイした。パネルＢは、６日のインキュベーション
後の細胞性を示す。
【図６】 図６は、Ｃｋβ−６は、インビトロでのシトシンアラビノシド（Ａｒａ−Ｃ）
の細胞障害性効果から、ＨＰＰ−ＣＦＣを保護するが、ＬＰＰ−ＣＦＣについて
保護しないことを示す。
【図７】 図７は、Ｃｋβ−６は、インビトロでの５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）の
細胞障害性効果から、ＨＰＰ−ＣＦＣを保護するが、ＬＰＰ−ＣＦＣを保護しな
いことを示す。
【図８】 図８は、Ｃｋβ−６および塩基性ＦＧＦの皮質ニューロン生存に対する影響を
示す。
【図９】 図９は、ヒト好酸球によってカルシウム放出に対するＣｋβ−６および他のケ
モカインの効果を示す。
【図１０】 図１０は、インビトロで、ヒト好酸球および好塩基球について化学誘引物質と
して作用するＣｋβ−６の能力を示す。また、これらの細胞型の移動性反応を阻
害するＣＣＲ３レセプター（抗ＣＣＲ）に対して指向されるモノクローナル抗体
の能力が示される。
【図１１】 図１１は、ヒト好酸球からのヒスタミンおよびＬＴＣ４放出の効果およびこの
ような活性を阻害するための抗ＣＣＲ３の能力を示す。
【図１２】 図１２は、インビボで化学誘引物質として作用するＣｋβ−６の能力を示す。
【図１３】 図１３は、Ｃｋβ−６アミノ酸配列の分析を示す。α、β、ターンおよびコイ
ル領域；疎水性および親水性；両親媒性領域；可曉性領域；抗原性指標および表
面可能性が示される。この「抗原性指数−Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ」グラフに
おいて、ポジティブピークは、Ｃｋβ−６タンパク質の高度に抗原性領域の位置
を示す（すなわち、本発明のエピトープ保有ペプチドが獲得され得る領域）。
【図１４Ａ】 図１４Ａは、ＨＧ００６０４およびＨＧ００６０５が好酸球についてアゴニス
トであるが、ＨＧ００６０６およびＨＧ００６０８はそうでないことを示す。実
施例９に記載されるように、好酸球は、カルシウム流動アッセイのために使用し
た。種々のケモカイン（エオタキシンを含む）は、示された濃度で使用した。パ
ネルＡおよびＢは、２つの個々のドナーで得られた結果を示す。
【図１４Ｂ】 図１４Ｂは、ＨＧ００６０４およびＨＧ００６０５が好酸球についてアゴニス
トであるが、ＨＧ００６０６およびＨＧ００６０８はそうでないことを示す。実
施例９に記載されるように、好酸球は、カルシウム流動アッセイのために使用し
た。種々のケモカイン（エオタキシンを含む）は、示された濃度で使用した。パ
ネルＡおよびＢは、２つの個々のドナーで得られた結果を示す。
【図１５Ａ】 図１５Ａは、ＨＧ００６０６はＨＧ００６０４のアンタゴニストであるが、Ｈ
Ｇ００６０８はそうでないことを示す。実施例９に記載されるように、好酸球は
、カルシウム流動アッセイについて使用される。ＨＧ００６０４は、１０００ｎ
ｇ／ｍｌのＨＧ００６０６またはＨＧ００６０６８を用いてかまたは用いずに、
１０、１００、および１００ｎｇ／ｍｌで使用した。示されるように、ＨＧ００
６０６の存在は、１０または１００ｎｇ／ｍｌのＨＧ００６０４によって指向さ
れるカルシウム流動を減少させた。同一条件下で、ＨＧ００６０６８は、全く効
果を示さなかった。パネルＡおよびＢは、２つの個体のドナーを用いて得られた
結果を示す。
【図１５Ｂ】 図１５Ｂは、ＨＧ００６０６はＨＧ００６０４のアンタゴニストであるが、Ｈ
Ｇ００６０８はそうでないことを示す。実施例９に記載されるように、好酸球は
、カルシウム流動アッセイについて使用される。ＨＧ００６０４は、１０００ｎ
ｇ／ｍｌのＨＧ００６０６またはＨＧ００６０６８を用いてかまたは用いずに、
１０、１００、および１００ｎｇ／ｍｌで使用した。示されるように、ＨＧ００
６０６の存在は、１０または１００ｎｇ／ｍｌのＨＧ００６０４によって指向さ
れるカルシウム流動を減少させた。同一条件下で、ＨＧ００６０６８は、全く効
果を示さなかった。パネルＡおよびＢは、２つの個体のドナーを用いて得られた
結果を示す。
【図１６Ａ】 図１６Ａは、ＨＧ００６０６がＨＧ００６０４、エオタキシンおよびＣｋβ―
１０のアンタゴニストであることを示す。実施例９に記載されるように、好酸球
をカルシウム流動アッセイについて使用した。ＨＧ００６０４、エオタキシンお
よびＣｋβ―１０を、１０００ｎｇ／ｍｌのＨＧ００６０６を用いてかまたは用
いずに、１０、１００、および１００ｎｇ／ｍｌで使用した。示されるように、
ＨＧ００６０６の存在は、１０または１００ｎｇ／ｍｌのＨＧ００６０４および
ＣｋＢｅｔａ−１０によって指向されるカルシウム流動および１０ｎｇ／ｍｌの
エオタキシンによって指向されるカルシウム流動を減少させた。パネルＡおよび
Ｂは、２つの個々のドナーで得られた結果を示す。
【図１６Ｂ】 図１６Ｂは、ＨＧ００６０６がＨＧ００６０４、エオタキシンおよびＣｋβ―
１０のアンタゴニストであることを示す。実施例９に記載されるように、好酸球
をカルシウム流動アッセイについて使用した。ＨＧ００６０４、エオタキシンお
よびＣｋβ―１０を、１０００ｎｇ／ｍｌのＨＧ００６０６を用いてかまたは用
いずに、１０、１００、および１００ｎｇ／ｍｌで使用した。示されるように、
ＨＧ００６０６の存在は、１０または１００ｎｇ／ｍｌのＨＧ００６０４および
ＣｋＢｅｔａ−１０によって指向されるカルシウム流動および１０ｎｇ／ｍｌの
エオタキシンによって指向されるカルシウム流動を減少させた。パネルＡおよび
Ｂは、２つの個々のドナーで得られた結果を示す。
【図１７】 図１７は、ＨＧ００６０３は、好酸球に対して走化性であるが、ＨＧ００６０
６は走化性ではないことを示す。好酸球を、実施例１３に記載するような走化性
アッセイのために使用した。エオタキシン（黒丸）、ＨＧ００６０３（黒四角）
、またはＨＧ００６０６（白三角）に応答しての走化性を、走化性指標として
表し、そして個々の実験を三連で実施した場合の５〜７の別個の実験の平均を示
す。
【図１８Ａ】 図１８Ａは、ＨＧ００６０６がＨＧ００６０３のアンタゴニストとして作用す
ることを示す。好酸球を、実施例１３に記載するような走化性アッセイのために
使用した。ＨＧ００６０３（黒丸）またはＨＧ００６０３＋ＨＧ００６０６（黒
菱形）に応答しての走化性を、三連で実施した１つの代表的な実験からの走化性
指標として表す。ＨＧ００６０３を、示される濃度で走化性チャンバの底部ウェ
ルに添加し、同時に、１０００ｎｇ／ｍｌのＨＧ００６０６を底部ウェルとフィ
ルタの頂部との両方に添加した。パネルＡおよびＢは、２人の別個のドナーを用
いて得られた結果を示す。
【図１８Ｂ】 図１８Ｂは、ＨＧ００６０６がＨＧ００６０３のアンタゴニストとして作用す
ることを示す。好酸球を、実施例１３に記載するような走化性アッセイのために
使用した。ＨＧ００６０３（黒丸）またはＨＧ００６０３＋ＨＧ００６０６（黒
菱形）に応答しての走化性を、三連で実施した１つの代表的な実験からの走化性
指標として表す。ＨＧ００６０３を、示される濃度で走化性チャンバの底部ウェ
ルに添加し、同時に、１０００ｎｇ／ｍｌのＨＧ００６０６を底部ウェルとフィ
ルタの頂部との両方に添加した。パネルＡおよびＢは、２人の別個のドナーを用
いて得られた結果を示す。
【図１９Ａ】 図１９Ａは、ＨＧ００６０６がエオタキシンのアンタゴニストとして作用する
ことを示す。好酸球を、実施例１３に記載するような走化性アッセイのために使
用した。エオタキシン（黒丸）またはエオタキシン＋ＨＧ００６０６（黒菱形）
に応答しての走化性を、三連で実施した１つの代表的な実験からの走化性指標と
して表す。エオタキシンを、示される濃度で走化性チャンバの底部ウェルに添加
し、同時に、１０００ｎｇ／ｍｌのＨＧ００６０６を底部ウェルとフィルタの頂
部との両方に添加した。パネルＡおよびＢは、２人の別個のドナーを用いて得ら
れた結果を示す。
【図１９Ｂ】 図１９Ｂは、ＨＧ００６０６がエオタキシンのアンタゴニストとして作用する
ことを示す。好酸球を、実施例１３に記載するような走化性アッセイのために使
用した。エオタキシン（黒丸）またはエオタキシン＋ＨＧ００６０６（黒菱形）
に応答しての走化性を、三連で実施した１つの代表的な実験からの走化性指標と
して表す。エオタキシンを、示される濃度で走化性チャンバの底部ウェルに添加
し、同時に、１０００ｎｇ／ｍｌのＨＧ００６０６を底部ウェルとフィルタの頂
部との両方に添加した。パネルＡおよびＢは、２人の別個のドナーを用いて得ら
れた結果を示す。
【図２０Ａ】 図２０Ａは、ＨＧ００６０６がＣｋβ−１０のアンタゴニストとして作用する
ことを示す。好酸球を、実施例１３に記載するような走化性アッセイのために使
用した。Ｃｋβ−１０（黒丸）またはＣｋβ−１０＋ＨＧ００６０６（黒菱形）
に応答しての走化性を、三連で実施した１つの代表的な実験からの走化性指標と
して表す。Ｃｋβ−１０を、示される濃度で走化性チャンバの底部ウェルに添加
し、同時に、１０００ｎｇ／ｍｌのＨＧ００６０６を底部ウェルとフィルタの頂
部との両方に添加した。パネルＡおよびＢは、２人の別個のドナーを用いて得ら
れた結果を示す。
【図２０Ｂ】 図２０Ｂは、ＨＧ００６０６がＣｋβ−１０のアンタゴニストとして作用する
ことを示す。好酸球を、実施例１３に記載するような走化性アッセイのために使
用した。Ｃｋβ−１０（黒丸）またはＣｋβ−１０＋ＨＧ００６０６（黒菱形）
に応答しての走化性を、三連で実施した１つの代表的な実験からの走化性指標と
して表す。Ｃｋβ−１０を、示される濃度で走化性チャンバの底部ウェルに添加
し、同時に、１０００ｎｇ／ｍｌのＨＧ００６０６を底部ウェルとフィルタの頂
部との両方に添加した。パネルＡおよびＢは、２人の別個のドナーを用いて得ら
れた結果を示す。
【図２１】 図２１は、ｐＨＥ４−５発現ベクター（配列番号２１）およびサブクローニン
グされたＣｋβ−６ ｃＤＮＡコード配列の模式図を示す。カナマイシン耐性マ
ーカー遺伝子、Ｃｋβ−６コード配列、ｏｒｉＣ配列、およびｌａｃＩｑコード
配列の位置が示されている。
【図２２】 図２２は、ｐＨＥプロモーターの調節エレメントのヌクレオチド配列（配列番
号２２）を示す。２つのｌａｃオペレーター配列、Ｓｈｉｎｅ−Ｄｅｌｇａｒｎ
ｏ配列（Ｓ／Ｄ）、ならびに末端のＨｉｎｄＩＩＩ制限部位およびＮｄｅＩ制限
部位（斜字）が示されている。
【図２３】 図２３Ａおよび２３Ｂは、ＭＰＩＦ−２のアミノ末端短縮変異体の特徴付けを
示す。変異体ｃＤＮＡ構築物は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現された。次いで、発
現されたタンパク質を精製し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分析した。（パ
ネルＡ）６種の精製したタンパク質全てを用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（ＭＷ＝
分子量マーカー）。各変異体についての番号付けによる命名は、メチオニン残基
を１として開始して始まる。（パネルＢ）各変異体のコードされそして観察され
たＮＨ2末端配列が示される。示されるように、組換えｍＲＮＡの効率的な翻訳
のために付加されたメチオニン残基は、タンパク質調製物のいくつかについてＥ
．ｃｏｌｉにおいて自発的に切断されたが、他のものについては切断されなかっ
た。配列番号２の対応するアミノ酸の位置については、表５を参照のこと。
【図２４】 図２４Ａおよび２４Ｂは、ＭＰＩＦ−２変異体を用いての好酸球カルシウム流
動を示す。（パネルＡ）種々のＭＰＩＦ−２短縮変異体を、１００ｎｇ／ｍｌに
おいてカルシウム流動アッセイにおいて使用した。各ケモカインを、約５０秒に
おいて添加した。（パネルＢ）脱感作実験のために、エオタキシン、ＭＰＩＦ−
２（Ｖ２７−Ｒ９９）およびＭＣＰ−４を、１０ｎｇ／ｍｌ単独（左側のパネル
）でかまたはＭＰＩＦ−２（Ｐ３０−Ｒ９９）に続いて５ｍｇ／ｍｌ（右側のパ
ネル）で使用した。
【図２５】 図２５Ａおよび２５Ｂは、ＭＰＩＦ−２（Ｐ３０−Ｒ９９）が、ヒト抗酸球の
走化性を、エオタキシン、ＭＰＩＦ−２（Ｖ２７−１１９９）、およびＭＣＰ−
４に応答してブロックすることを示す。（パネルＡ）ＭＰＩＦ−２短縮変異体を
、好酸球走化性アッセイにおいて、示される濃度で使用した。値は、３以上の実
験からの平均の走化性指標を示す。（パネルＢ）エオタキシン、ＭＰＩＦ−２（
Ｖ２７−Ｒ９９）およびＭＣＰ−４を、次第に増加する濃度で、単独（丸）また
は１０ｎｇ／ｍｌ（逆三角形）もしくは１００ｎｇ／ｍｌ（三角形）のＭＰＩＦ
−２（Ｐ３０−Ｒ９９）との組み合わせにおいて使用した。
【図２６】 図２６Ａ〜２６Ｃは、ＭＰＩＦ−２（Ｐ３０−Ｒ９９）が、レセプター結合に
関してエオタキシン、ＭＰＩＦ−２（Ｖ２７−Ｒ９９）およびＭＣＰ−４と競合
することを示す。ヒト抗酸球を、０．１ｎＭ放射線標識エオタキシン（Ａ）、Ｍ
ＣＰ−４（Ｂ）、または１．０ｎＭ ＭＰＩＦ−２（Ｖ２７−Ｒ９９）（Ｃ）を
用いるレセプター結合研究のために使用した。コールドの競合物を、各パネルに
示す濃度で添加した。パネルＡおよびＢにおける白四角は、それぞれエオタキシ
ンおよびＭＣＰ−４を表し、他の記号は、ＭＰＩＦ−２（Ｖ２７−Ｒ９９）（黒
四角）、ＭＰＩＦ−２（Ｖ２８−Ｒ９９）（白丸）、ＭＰＩＦ−２（１２９−Ｒ
９９）（黒丸）、ＭＰＩＦ−２（Ｐ３０−Ｒ９９）（白三角）、ＭＰＩＦ−２（
Ｐ３２−Ｒ９９）（黒三角）、ＭＰＩＦ−２（Ｃ３３−Ｒ９９）（白菱形）、お
よびＭＩＰ−ｌβ（黒菱形）を表す。
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】平成１４年５月２７日（２００２．５．２７）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８１】 本発明者らはまた、本発明の特定のＣｋβ−６アンタゴニスト（Ｅｏ−２（Ｐ
Ｐ３０−Ｒ９９）；図２３および表５を参照のこと）が、ＣＣＲ３のＣｋβ−６
アンタゴニストであるにもかかわらず、ヒト骨髄骨髄様前駆細胞コロニー形成を
阻害する、完全かつわずかに増強されたＣｋβ−６の能力を保持することを決定
した（表６を参照のこと）。従って、このＣｋβ−６／ＭＰＩＦ−２アンタゴニ
ストは、化学療法薬剤の細胞傷害性効果から単一または複数の系統の造血前駆体
を保護する薬剤としての治療的適用を有する。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２４８】 本明細書に記載されるように、本発明の特定のＣｋβ−６アンタゴニストが図
２３に示される（Ｅｏ−２（Ｐ３０−Ｒ９９）；表５をまた、参照のこと）。本
発明者らは、このポリペプチドが、ＣＣＲ３シグナル伝達をアンタゴナイズする
が、これが、ヒト骨髄の骨髄様前駆細胞コロニー形成を阻害する完全な、そして
多少増強されたＣｋβ−６の能力を維持することを決定した（表６を参照のこと
）。従って、このＣｋβ−６／ＭＰＩＦ−２アンタゴニストの使用は、Ｃｋβ−
６／ＭＰＩＦ−２アゴニストについて、上記の造血前駆細胞を調節、移動および
保護する方法を提供する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４１２】 （結果） （ＭＰＩＦ−２のＮＨ2末端短縮変異体の生成） ＭＰＩＦ−２のＮＨ2末端短
縮変異体を生成するために、成熟ＭＰＩＦ−２タンパク質をコードするｃＤＮＡ
を発現ベクター中にクローニングし、そして全長および欠失変異体のＰＣＲ生成
のためのテンプレートとして使用した。次いで、各クローンを、Ｅ．ｃｏｌｉに
おいて発現させそして精製した。生成された野生型タンパク質および変異体タン
パク質は、Ｒ９９へのカルボキシ末端短縮型であった。なぜなら、これは、哺乳
動物細胞産生調製物中に存在するＭＰＩＦ−２の最も短い形態を示すことが示さ
れたからである（Ｆｏｒｓｓｍａｎｎ，Ｕ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８５：
２１７１（１９９７））。図２３は、精製タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析、
推定アミノ酸配列、および観察されたＮ末端を示す。表５は、変異体、ならびに
配列番号２の対応するアミノ酸位置を列挙する。ＮＨ2末端配列決定に加え、各
タンパク質の分子量を、質量分析により決定した。ＭＰＩＦ−２（Ｖ２７−Ｒ９
９）は、ＭＰＩＦ−２の成熟分泌形態を示し、これには、新規なメチオニン残基
がアミノ末端に保持されており、Ｅ．ｃｏｌｉ発現系におけるタンパク質発現を
容易にし、そしてこれは本明細書中でＭＰＩＦ−２の成熟形態と呼ばれる。本明
細書に示される研究ならびに本発明者らの未公開の観察に基づき、このメチオニ
ンおよびＲ９９へのカルボキシ末端短縮は、ＮＨ2末端メチオニンを欠くかもし
くはＣ末端短縮のいずれかのＣＨＯ由来物質と比較した場合、抗酸球カルシウム
移動アッセイにおけるＭＰＩＦ−２の活性に対して何の明らかな効果も有さない
（準備中の原稿）。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４１４】 これらのタンパク質を、抗酸球カルシウム移動応答の相互脱感授性においても
アッセイした。予測されるように、ＭＰＩＦ−２（Ｖ２７−Ｒ９９）、ＭＰＩＦ
−２（Ｖ２８−Ｒ９９）およびＭＰＩＦ−２（Ｉ２９−Ｒ９９）はすべて、エオ
タキシン、ＭＰＩＦ−２（Ｖ２７−Ｒ９９）およびＭＣＰ−４により送達される
シグナルを脱感授性する能力を示した（示さず）。興味深いことに、その変異体
のうちの１つ（カルシウム流出を惹起する能力を失ったＭＰＩＦ−２（Ｒ３０−
Ｒ９９））は、続くシグナルに対して抗酸球を脱感授性する能力を保持した。Ｍ
ＰＩＦ−２（Ｐ３０−Ｒ９９）は、エオタキシン、ＭＰＩＦ−２（Ｖ２７−Ｒ９
９）およびＭＣＰ−４により送達されるシグナルに対して抗酸球を部分的にかも
しくは完全に脱感授性した（図２４Ｂ〜Ｇ）。成熟ＭＰＩＦ−２（Ｖ２７−Ｒ９
９）またはＭＣＰ−４のいずれかに対する応答の完全な脱感授性は、５００倍過
剰のＭＰＩＦ−２（Ｒ３０−Ｒ９９）での細胞の事前処理の際に達成できた（本
明細書中のデータ、ならびに非公開結果）。エオタキシンの場合、全用量応答分
析は、そのエオタキシン応答の部分的脱感授性のみが達成可能であり、それが既
知のリガンドの間でＣＣＲ３について最高の結合親和性を有するエオタキシンに
おそらく起因することを示す。ＭＣＰ−３およびＲＡＮＴＥＳを含む他の公知の
ＣＣＲ３リガンドのうち、ＭＰＩＦ−２（Ｐ３０−Ｒ９９）がなおより強力であ
り、５０〜１００倍過剰で使用した場合にこれらの２つのアゴニストにより送達
される細胞応答を脱感授性した（データは示さず）。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４１６】 ＭＰＩＦ−２（Ｐ３０−Ｒ９９）が機能性アンタゴニストとして挙動し得るか
または移動研究においてアゴニストケモカインに対して抗酸球を脱感授性し得る
かを決定するために、この変異体を、走化性アッセイにおいてエオタキシン、Ｍ
ＰＩＦ−２（Ｖ２７−Ｒ９９）、およびＭＣＰ−４と組み合わせて試験した。図
２５Ｂ〜２５Ｄにおいて示されるように、１００ｎｇ／ｍｌのＭＰＩＦ−２（Ｐ
３０−Ｒ９９）に事前に曝露した抗酸球を、これらのＣＣＲ３アゴニストリガン
ドのうちの３つすべてにより誘導されるその後の走化性応答に対して脱感授性し
た。１０ｎｇ／ｍｌで使用した場合、ＭＰＩＦ−２（Ｐ３０−Ｒ９９）は、比較
的弱い効果を示したが、走化性を部分的に阻害した（図２５Ｂ〜２５Ｄ）。対照
的に、ＭＰＩＦ−２（Ｐ３２−Ｒ９９）およびＭＰＩＦ−２（Ｃ３３−Ｒ９９）
は、１０００ｎｇ／ｍｌ程度の高さの濃度でさえ、走化性アッセイにおいてアン
タゴニストとして作用しなかった。ＭＰＩＦ−２（Ｐ３０−Ｒ９９）が、エオタ
キシン走化性応答をより効率的に阻害するがエオタキシンカルシウム応答を部分
的にしか阻害しない能力は、走化性アッセイ前のＭＰＩＦ−２（Ｐ３０−Ｒ９９
）に対する抗酸球のより長い曝露、ならびにケモカイン勾配を感じるために必要
な重要な数のレセプター部位のより効率的な脱感授性もしくはダウンレギュレー
ションにおそらく起因する。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４１７】 （ＭＰＩＦ−２変異体のＣＣＲ３結合プロフィール） カルシウム流出および
走化性実験における脱感授性プロフィールは、ＭＰＩＦ−２（Ｐ３０−Ｒ９９）
が、ＣＣＲ３についてのアンタゴニストであり得ることを示唆した。これがＣＣ
Ｒ３レセプターへの結合に関与するか否かを決定するために、競合結合研究を、
放射性標識したエオタキシン、ＭＰＩＦ−２（Ｖ２７−Ｒ９９）またはＭＣＰ−
４を使用して、一次抗酸球に対して実施した。予期されるように、エオタキシン
は放射性エオタキシンを効率的に置換したが、ＭＩＰ−１βはそうしなかった（
図２６Ａ）；５０％の放射性標識エオタキシンが、５ｎＭ非放射性（ｃｏｌｄ）
エオタキシンで置換され、そして９５％が１００ｎＭ非放射性エオタキシンで置
換された。ＭＰＩＦ−２はまた、エオタキシンを置換したが、連続的に短縮され
るにつれて、結合について競合する能力を次第に失った。唯一の例外は、エオタ
キシンもしくはＭＰＩＦ−２（Ｖ２７−Ｒ９９）とほとんど同じ程度効率的にエ
オタキシン結合について競合することができる、ＭＰＩＦ−２（Ｐ３０−Ｒ９９
）であった（図２６Ａ）。ＭＰＩＦ−２（Ｐ３０−Ｒ９９）はまた、ＣＣＲ３へ
のＭＣＰ−４およびＭＰＩＦ−２（Ｖ２７−Ｒ９９）の両方の結合について効率
的な競合因子であった（図２６Ｂおよび２６Ｃ）。抗酸球への結合についてエオ
タキシン、ＭＰＩＦ−２（Ｖ２７−Ｒ９９）およびＭＣＰ−４とＭＰＩＦ−２（
Ｐ３０−Ｒ９９）が競合できたという事実は、機能性アッセイにおけるこの変異
体のアンタゴニスト効果は、おそらくこの変異体がＣＣＲ３レセプターを占有す
る能力に起因することを示唆する。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図４】 図４Ａ〜４Ｂは、Ｃｋβ−６が、高増殖性潜在コロニー形成細胞（ＨＰＰ−Ｃ
ＦＣ）（Ａ）の増殖および分化を阻害し、そして、低増殖性潜在コロニー形成細
胞（ＨＰＰ−ＣＦＣ）（Ｂ）に対して効果的ではないことを示す。これらの実験
では、低密度の、非粘着性骨髄細胞由来の１，５００個の細胞を、５ｎｇ／ｍｌ
マウスＩＬ−３、１００ｎｇ／ｍｌマウスＳＣＦ、１０ｎｇ／ｍｌマウスＩＬ−
１ａ、５ｎｇ／ｍｌヒトＭ−ＣＳＦで充填し、および示された濃度のＣｋβ−６
で充填したかまたは充填していない寒天培地でプレートした。コロニーをインキ
ュベート１４日後に記録した。３回実験を行った。結果をコロニー平均値±ＳＤ
として示す。無関係のタンパク質は、影響しなかった。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図５】 図５Ａ〜５Ｂは、運命付けられた前駆細胞を除去することによって、原始Ｌｉ
ｎ細胞における濃縮された骨髄細胞に対するＣｋβ−６の影響を示す（抗体抗−
ＣＤ１１ｂ、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５ＲおよびＧｒ．−１）。パネルＡは、５
ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−３、１００ｎｇ／ｍｌ ＳＣＦ、１０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−１
ａ、５ｎｇ／ｍｌ Ｍ−ＣＳＦで充填された寒天培地でプレートされた骨髄細胞
（カラム１）およびＬｉｎ細胞（カラム２）におけるＬＰＰ−ＣＦＣ／ＨＰＰ−
ＣＦＣの割合±ＳＤを示す。カラム３、４、および５は、５ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−
３および１００ｎｇ／ｍｌ ＳＣＦ（カラム３）、ＩＬ−３、ＳＣＦおよび５０
ｎｇ／ｍｌ Ｃｋβ−６（カラム４）またはＩＬ−３、ＳＣＦおよび５０ｎｇ／
ｍｌの無関係のタンパク質を使用して培養した。６日後、培養物をＨＰＰ−ＣＦ
ＣおよびＬＰＰ−ＣＦＣについてアッセイした。パネルＢは、６日のインキュベ
ーション後の細胞性を示す。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１０】 図１０Ａ〜１０Ｂは、インビトロで、ヒト好酸球および好塩基球について化学
誘引物質として作用するＣｋβ−６の能力を示す。また、これらの細胞型の移動
性反応を阻害するＣＣＲ３レセプター（抗ＣＣＲ）に対して指向されるモノクロ
ーナル抗体の能力が示される。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１１】 図１１Ａ〜１１Ｄは、ヒト好酸球からのヒスタミンおよびＬＴＣ４放出の効果
およびこのような活性を阻害するための抗ＣＣＲ３の能力を示す。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図１４Ａ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１４Ａ】 図１４Ａ〜１４Ｂは、ＨＧ００６０４およびＨＧ００６０５が好酸球について
アゴニストであるが、ＨＧ００６０６およびＨＧ００６０８はそうでないことを
示す。実施例９に記載されるように、好酸球は、カルシウム流動アッセイのため
に使用した。種々のケモカイン（エオタキシンを含む）は、示された濃度で使用
した。パネルＡおよびＢは、２つの個々のドナーで得られた結果を示す。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図１４Ｂ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１４Ｂ】 図１４Ａ〜１４Ｂは、ＨＧ００６０４およびＨＧ００６０５が好酸球について
アゴニストであるが、ＨＧ００６０６およびＨＧ００６０８はそうでないことを
示す。実施例９に記載されるように、好酸球は、カルシウム流動アッセイのため
に使用した。種々のケモカイン（エオタキシンを含む）は、示された濃度で使用
した。パネルＡおよびＢは、２つの個々のドナーで得られた結果を示す。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図１５Ａ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１５Ａ】 図１５Ａ〜１５Ｂは、ＨＧ００６０６はＨＧ００６０４のアンタゴニストであ
るが、ＨＧ００６０８はそうでないことを示す。実施例９に記載されるように、
好酸球は、カルシウム流動アッセイについて使用される。ＨＧ００６０４は、１
０００ｎｇ／ｍｌのＨＧ００６０６またはＨＧ００６０６８を用いてかまたは用
いずに、１０、１００、および１００ｎｇ／ｍｌで使用した。示されるように、
ＨＧ００６０６の存在は、１０または１００ｎｇ／ｍｌのＨＧ００６０４によっ
て指向されるカルシウム流動を減少させた。同一条件下で、ＨＧ００６０６８は
、全く効果を示さなかった。パネルＡおよびＢは、２つの個体のドナーを用いて
得られた結果を示す。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図１５Ｂ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１５Ｂ】 図１５Ａ〜１５Ｂは、ＨＧ００６０６はＨＧ００６０４のアンタゴニストであ
るが、ＨＧ００６０８はそうでないことを示す。実施例９に記載されるように、
好酸球は、カルシウム流動アッセイについて使用される。ＨＧ００６０４は、１
０００ｎｇ／ｍｌのＨＧ００６０６またはＨＧ００６０６８を用いてかまたは用
いずに、１０、１００、および１００ｎｇ／ｍｌで使用した。示されるように、
ＨＧ００６０６の存在は、１０または１００ｎｇ／ｍｌのＨＧ００６０４によっ
て指向されるカルシウム流動を減少させた。同一条件下で、ＨＧ００６０６８は
、全く効果を示さなかった。パネルＡおよびＢは、２つの個体のドナーを用いて
得られた結果を示す。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図１６Ａ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１６Ａ】 図１６Ａ〜１６Ｂは、ＨＧ００６０６がＨＧ００６０４、エオタキシンおよび
Ｃｋβ―１０のアンタゴニストであることを示す。実施例９に記載されるように
、好酸球をカルシウム流動アッセイについて使用した。ＨＧ００６０４、エオタ
キシンおよびＣｋβ―１０を、１０００ｎｇ／ｍｌのＨＧ００６０６を用いてか
または用いずに、１０、１００、および１００ｎｇ／ｍｌで使用した。示される
ように、ＨＧ００６０６の存在は、１０または１００ｎｇ／ｍｌのＨＧ００６０
４およびＣｋＢｅｔａ−１０によって指向されるカルシウム流動および１０ｎｇ
／ｍｌのエオタキシンによって指向されるカルシウム流動を減少させた。パネル
ＡおよびＢは、２つの個々のドナーで得られた結果を示す。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図１６Ｂ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１６Ｂ】 図１６Ａ〜１６Ｂは、ＨＧ００６０６がＨＧ００６０４、エオタキシンおよび
Ｃｋβ―１０のアンタゴニストであることを示す。実施例９に記載されるように
、好酸球をカルシウム流動アッセイについて使用した。ＨＧ００６０４、エオタ
キシンおよびＣｋβ―１０を、１０００ｎｇ／ｍｌのＨＧ００６０６を用いてか
または用いずに、１０、１００、および１００ｎｇ／ｍｌで使用した。示される
ように、ＨＧ００６０６の存在は、１０または１００ｎｇ／ｍｌのＨＧ００６０
４およびＣｋＢｅｔａ−１０によって指向されるカルシウム流動および１０ｎｇ
／ｍｌのエオタキシンによって指向されるカルシウム流動を減少させた。パネル
ＡおよびＢは、２つの個々のドナーで得られた結果を示す。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図１８Ａ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１８Ａ】 図１８Ａ〜１８Ｂは、ＨＧ００６０６がＨＧ００６０３のアンタゴニストとし
て作用することを示す。好酸球を、実施例１３に記載するような走化性アッセイ
のために使用した。ＨＧ００６０３（黒丸）またはＨＧ００６０３＋ＨＧ００６
０６（黒菱形）に応答しての走化性を、三連で実施した１つの代表的な実験から
の走化性指標として表す。ＨＧ００６０３を、示される濃度で走化性チャンバの
底部ウェルに添加し、同時に、１０００ｎｇ／ｍｌのＨＧ００６０６を底部ウェ
ルとフィルタの頂部との両方に添加した。パネルＡおよびＢは、２人の別個のド
ナーを用いて得られた結果を示す。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図１８Ｂ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１８Ｂ】 図１８Ａ〜１８Ｂは、ＨＧ００６０６がＨＧ００６０３のアンタゴニストとし
て作用することを示す。好酸球を、実施例１３に記載するような走化性アッセイ
のために使用した。ＨＧ００６０３（黒丸）またはＨＧ００６０３＋ＨＧ００６
０６（黒菱形）に応答しての走化性を、三連で実施した１つの代表的な実験から
の走化性指標として表す。ＨＧ００６０３を、示される濃度で走化性チャンバの
底部ウェルに添加し、同時に、１０００ｎｇ／ｍｌのＨＧ００６０６を底部ウェ
ルとフィルタの頂部との両方に添加した。パネルＡおよびＢは、２人の別個のド
ナーを用いて得られた結果を示す。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図１９Ａ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１９Ａ】 図１９Ａ〜１９Ｂは、ＨＧ００６０６がエオタキシンのアンタゴニストとして
作用することを示す。好酸球を、実施例１３に記載するような走化性アッセイの
ために使用した。エオタキシン（黒丸）またはエオタキシン＋ＨＧ００６０６（
黒菱形）に応答しての走化性を、三連で実施した１つの代表的な実験からの走化
性指標として表す。エオタキシンを、示される濃度で走化性チャンバの底部ウェ
ルに添加し、同時に、１０００ｎｇ／ｍｌのＨＧ００６０６を底部ウェルとフィ
ルタの頂部との両方に添加した。パネルＡおよびＢは、２人の別個のドナーを用
いて得られた結果を示す。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図１９Ｂ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１９Ｂ】 図１９Ａ〜１９Ｂは、ＨＧ００６０６がエオタキシンのアンタゴニストとして
作用することを示す。好酸球を、実施例１３に記載するような走化性アッセイの
ために使用した。エオタキシン（黒丸）またはエオタキシン＋ＨＧ００６０６（
黒菱形）に応答しての走化性を、三連で実施した１つの代表的な実験からの走化
性指標として表す。エオタキシンを、示される濃度で走化性チャンバの底部ウェ
ルに添加し、同時に、１０００ｎｇ／ｍｌのＨＧ００６０６を底部ウェルとフィ
ルタの頂部との両方に添加した。パネルＡおよびＢは、２人の別個のドナーを用
いて得られた結果を示す。
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図２０Ａ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２０Ａ】 図２０Ａ〜２０Ｂは、ＨＧ００６０６がＣｋβ−１０のアンタゴニストとして
作用することを示す。好酸球を、実施例１３に記載するような走化性アッセイの
ために使用した。Ｃｋβ−１０（黒丸）またはＣｋβ−１０＋ＨＧ００６０６（
黒菱形）に応答しての走化性を、三連で実施した１つの代表的な実験からの走化
性指標として表す。Ｃｋβ−１０を、示される濃度で走化性チャンバの底部ウェ
ルに添加し、同時に、１０００ｎｇ／ｍｌのＨＧ００６０６を底部ウェルとフィ
ルタの頂部との両方に添加した。パネルＡおよびＢは、２人の別個のドナーを用
いて得られた結果を示す。
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図２０Ｂ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２０Ｂ】 図２０Ａ〜２０Ｂは、ＨＧ００６０６がＣｋβ−１０のアンタゴニストとして
作用することを示す。好酸球を、実施例１３に記載するような走化性アッセイの
ために使用した。Ｃｋβ−１０（黒丸）またはＣｋβ−１０＋ＨＧ００６０６（
黒菱形）に応答しての走化性を、三連で実施した１つの代表的な実験からの走化
性指標として表す。Ｃｋβ−１０を、示される濃度で走化性チャンバの底部ウェ
ルに添加し、同時に、１０００ｎｇ／ｍｌのＨＧ００６０６を底部ウェルとフィ
ルタの頂部との両方に添加した。パネルＡおよびＢは、２人の別個のドナーを用
いて得られた結果を示す。
【手続補正２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２３】 図２３は、ＭＰＩＦ−２のアミノ末端短縮変異体の特徴付けを示す。変異体ｃ
ＤＮＡ構築物は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現された。次いで、発現されたタンパ
ク質を精製し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分析した。（上部）６種の精製
したタンパク質全てを用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（ＭＷ＝分子量マーカー）。
各変異体についての番号付けによる命名は、メチオニン残基を１として開始して
始まる。（下部）各変異体のコードされそして観察されたＮＨ2末端配列が示さ
れる。示されるように、組換えｍＲＮＡの効率的な翻訳のために付加されたメチ
オニン残基は、タンパク質調製物のいくつかについてＥ．ｃｏｌｉにおいて自発
的に切断されたが、他のものについては切断されなかった。配列番号２の対応す
るアミノ酸の位置については、表５を参照のこと。
【手続補正２４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２４】 図２４Ａ〜２４Ｇは、ＭＰＩＦ−２変異体を用いての好酸球カルシウム流動を
示す。（パネルＡ）種々のＭＰＩＦ−２短縮変異体を、１００ｎｇ／ｍｌにおい
てカルシウム流動アッセイにおいて使用した。各ケモカインを、約５０秒におい
て添加した。（パネルＢ〜Ｇ）脱感作実験のために、エオタキシン、ＭＰＩＦ−
２（Ｖ２７−Ｒ９９）およびＭＣＰ−４を、１０ｎｇ／ｍｌ単独（左側のパネル
）でかまたはＭＰＩＦ−２（Ｐ３０−Ｒ９９）に続いて５ｍｇ／ｍｌ（右側のパ
ネル）で使用した。
【手続補正２５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２５】 図２５Ａ〜２５Ｄは、ＭＰＩＦ−２（Ｐ３０−Ｒ９９）が、ヒト抗酸球の走化
性を、エオタキシン、ＭＰＩＦ−２（Ｖ２７−１１９９）、およびＭＣＰ−４に
応答してブロックすることを示す。（パネルＡ）ＭＰＩＦ−２短縮変異体を、好
酸球走化性アッセイにおいて、示される濃度で使用した。値は、３以上の実験か
らの平均の走化性指標を示す。（パネルＢ〜Ｄ）エオタキシン、ＭＰＩＦ−２（
Ｖ２７−Ｒ９９）およびＭＣＰ−４を、次第に増加する濃度で、単独（丸）また
は１０ｎｇ／ｍｌ（逆三角形）もしくは１００ｎｇ／ｍｌ（三角形）のＭＰＩＦ
−２（Ｐ３０−Ｒ９９）との組み合わせにおいて使用した。
【手続補正２６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【図１５Ａ】
【図１５Ｂ】
【図１６Ａ】
【図１６Ｂ】
【図１７】
【図１８Ａ】
【図１８Ｂ】
【図１９Ａ】
【図１９Ｂ】
【図２０Ａ】
【図２０Ｂ】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 48/00 Ａ６１Ｐ 19/08 Ａ６１Ｐ 19/08 35/00 35/00 35/02 35/02 43/00 １０７ 43/00 １０７ Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ // Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 グルゼゴルゼフスキー， クルジストフ ジェイ． アメリカ合衆国 メリーランド 20879， モンゴメリー ビレッジ， ホブ ヒル ウェイ 20040 (72)発明者 サルセド， セオドラ ダブリュー． アメリカ合衆国 メリーランド 20886， ゲイザースバーグ， フェザーツリー テラス 9810 (72)発明者 クレイダー， ブレント エル． アメリカ合衆国 マサチューセッツ 01730， ベッドフォード， デイビス ロード ４ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA21 CA02 DA02 EA02 HA17 4B065 AA93X AA93Y AB01 BA01 CA24 CA44 4C084 AA02 AA06 AA07 AA13 AA17 BA01 BA08 BA20 BA23 CA17 DA01 MA01 NA14 ZA962 ZB222 ZB262 ZB272 4C085 AA13 AA14 CC32 EE01 GG01 4C086 AA01 AA02 AA03 AA04 EA16 MA01 MA04 NA14 ZA96 ZB22 ZB26 ZB27

Claims (8)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 骨髄保護方法であって、有効量のポリペプチドを治療を受け
    ている個体に投与する工程を包含し、ここで、該ポリペプチドは、以下： （ａ）配列番号２の残基１〜３の欠失を有する、配列番号２のアミノ酸配列を
    含む骨髄前駆体阻害因子−２（ＭＰＩＦ−２）のＮ末端欠失変異体であって、こ
    こで、該欠失変異体のカルボキシ末端は、残基ｍであり、ここで、ｍは、配列番
    号２の残基４８〜残基９３の任意の残基である、骨髄前駆体阻害因子−２のＮ末
    端欠失変異体；ならびに （ｂ）配列番号２のＰｒｏ（４）からＡｒｇ（７３）への、（ａ）のＭＰＩＦ
    −２欠失変異体； （ｃ）少なくとも１つのアミノ酸置換以外は（ａ）または（ｂ）の変異体に同
    一である、ＭＰＩＦ−２欠失変異体； （ｄ）該アミノ酸置換が減少した陽性電荷を有するポリペプチドをもたらす、
    （ｃ）のＭＰＩＦ−２欠失変異体； （ｅ）好酸球の活性化または移動を阻害する、（ｃ）、（ｄ）、または（ｅ）
    のＭＰＩＦ−２欠失変異体； （ｆ）好塩基球の活性化または移動を阻害する、（ｃ）、（ｄ）、または（ｅ
    ）のＭＰＩＦ−２欠失変異体； （ｇ）ケモカインレセプター−３に結合する、（ｃ）、（ｄ）、または（ｅ）
    のＭＰＩＦ−２欠失変異体；および （ｈ）該Ｎ末端にＭｅｔ残基をさらに含む、（ａ）〜（ｇ）のいずれか１つの
    ＭＰＩＦ−２欠失変異体 からなる群から選択される、 方法。
  2. 【請求項２】 前記個体が化学療法または照射治療を受けている、請求項１
    に記載の方法。
  3. 【請求項３】 造血幹細胞を調製する方法であって、そのような細胞を有効
    量のポリペプチドと接触させる工程を包含し、ここで、該ポリペプチドは、以下
    ： （ａ）配列番号２の残基１〜３の欠失を有する、配列番号２のアミノ酸配列を
    含む骨髄前駆体阻害因子−２（ＭＰＩＦ−２）のＮ末端欠失変異体であって、こ
    こで、該欠失変異体のカルボキシ末端は、残基ｍであり、ここで、ｍは、配列番
    号２の残基４８〜残基９３の任意の残基である、骨髄前駆体阻害因子−２のＮ末
    端欠失変異体；ならびに （ｂ）配列番号２のＰｒｏ（４）からＡｒｇ（７３）への、（ａ）のＭＰＩＦ
    −２欠失変異体； （ｃ）少なくとも１つのアミノ酸置換以外は（ａ）または（ｂ）の変異体に同
    一である、ＭＰＩＦ−２欠失変異体； （ｄ）該アミノ酸置換が減少した陽性電荷を有するポリペプチドをもたらす、
    （ｃ）のＭＰＩＦ−２欠失変異体； （ｅ）好酸球の活性化または移動を阻害する、（ｃ）、（ｄ）、または（ｅ）
    のＭＰＩＦ−２欠失変異体； （ｆ）好塩基球の活性化または移動を阻害する、（ｃ）、（ｄ）、または（ｅ
    ）のＭＰＩＦ−２欠失変異体； （ｇ）ケモカインレセプター−３に結合する、（ｃ）、（ｄ）、または（ｅ）
    のＭＰＩＦ−２欠失変異体；および （ｈ）該Ｎ末端にＭｅｔ残基をさらに含む、（ａ）〜（ｇ）のいずれか１つの
    ＭＰＩＦ−２欠失変異体 からなる群から選択される、 方法。
  4. 【請求項４】 前記造血幹細胞が、ＣＦＵ−Ｃ細胞、ＣＦＵ−ＧＥＭＭ細胞
    、運命付けられた前駆体細胞、ＣＦＵ−Ｍ細胞、ＣＦＵ−Ｇ細胞、ＣＦＵ−Ｅ細
    胞、ＢＦＵ−Ｅ細胞、ＣＦＵ−ＧＭ細胞、ＣＦＵ−Ｍｅｇ細胞、ＬＴＣ−ＩＣ細
    胞、ＢＦＵ−ｍｉｘ細胞、ＨＰＰ−ＣＦＣ細胞、ＢＦＵ−Ｍｋ細胞、およびＣＤ
    ３４＋レクチン＋細胞からなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
  5. 【請求項５】 造血幹細胞のエキソビボ拡大の方法であって、骨髄を有効量
    のポリペプチドと接触させる工程を包含し、ここで、該ポリペプチドは、以下： （ａ）配列番号２の残基１〜３の欠失を有する、配列番号２のアミノ酸配列を
    含む骨髄前駆体阻害因子−２（ＭＰＩＦ−２）のＮ末端欠失変異体であって、こ
    こで、該欠失変異体のカルボキシ末端は、残基ｍであり、ここで、ｍは、配列番
    号２の残基４８〜残基９３の任意の残基である、骨髄前駆体阻害因子−２のＮ末
    端欠失変異体；ならびに （ｂ）配列番号２のＰｒｏ（４）からＡｒｇ（７３）への、（ａ）のＭＰＩＦ
    −２欠失変異体； （ｃ）少なくとも１つのアミノ酸置換以外は（ａ）または（ｂ）の変異体に同
    一である、ＭＰＩＦ−２欠失変異体； （ｄ）該アミノ酸置換が減少した陽性電荷を有するポリペプチドをもたらす、
    （ｃ）のＭＰＩＦ−２欠失変異体； （ｅ）好酸球の活性化または移動を阻害する、（ｃ）、（ｄ）、または（ｅ）
    のＭＰＩＦ−２欠失変異体； （ｆ）好塩基球の活性化または移動を阻害する、（ｃ）、（ｄ）、または（ｅ
    ）のＭＰＩＦ−２欠失変異体； （ｇ）ケモカインレセプター−３に結合する、（ｃ）、（ｄ）、または（ｅ）
    のＭＰＩＦ−２欠失変異体；および （ｈ）該Ｎ末端にＭｅｔ残基をさらに含む、（ａ）〜（ｇ）のいずれか１つの
    ＭＰＩＦ−２欠失変異体 からなる群から選択される、 方法。
  6. 【請求項６】 白血病細胞の増殖を阻害する方法であって、有効量のポリペ
    プチドを個体に投与する工程を包含し、ここで、該ポリペプチドは、以下： （ａ）配列番号２の残基１〜３の欠失を有する、配列番号２のアミノ酸配列を
    含む骨髄前駆体阻害因子−２（ＭＰＩＦ−２）のＮ末端欠失変異体であって、こ
    こで、該欠失変異体のカルボキシ末端は、残基ｍであり、ここで、ｍは、配列番
    号２の残基４８〜残基９３の任意の残基である、骨髄前駆体阻害因子−２のＮ末
    端欠失変異体；ならびに （ｂ）配列番号２のＰｒｏ（４）からＡｒｇ（７３）への、（ａ）のＭＰＩＦ
    −２欠失変異体； （ｃ）少なくとも１つのアミノ酸置換以外は（ａ）または（ｂ）の変異体に同
    一である、ＭＰＩＦ−２欠失変異体； （ｄ）該アミノ酸置換が減少した陽性電荷を有するポリペプチドをもたらす、
    （ｃ）のＭＰＩＦ−２欠失変異体； （ｅ）好酸球の活性化または移動を阻害する、（ｃ）、（ｄ）、または（ｅ）
    のＭＰＩＦ−２欠失変異体； （ｆ）好塩基球の活性化または移動を阻害する、（ｃ）、（ｄ）、または（ｅ
    ）のＭＰＩＦ−２欠失変異体； （ｇ）ケモカインレセプター−３に結合する、（ｃ）、（ｄ）、または（ｅ）
    のＭＰＩＦ−２欠失変異体；および （ｈ）該Ｎ末端にＭｅｔ残基をさらに含む、（ａ）〜（ｇ）のいずれか１つの
    ＭＰＩＦ−２欠失変異体 からなる群から選択される、 方法。
  7. 【請求項７】 ＨＰＰ−ＣＦＣ細胞を増殖する方法であって、このような細
    胞を有効量のポリペプチドと接触させる工程を包含し、ここで、該ポリペプチド
    は、以下： （ａ）配列番号２の残基１〜３の欠失を有する、配列番号２のアミノ酸配列を
    含む骨髄前駆体阻害因子−２（ＭＰＩＦ−２）のＮ末端欠失変異体であって、こ
    こで、該欠失変異体のカルボキシ末端は、残基ｍであり、ここで、ｍは、配列番
    号２の残基４８〜残基９３の任意の残基である、骨髄前駆体阻害因子−２のＮ末
    端欠失変異体；ならびに （ｂ）配列番号２のＰｒｏ（４）からＡｒｇ（７３）への、（ａ）のＭＰＩＦ
    −２欠失変異体； （ｃ）少なくとも１つのアミノ酸置換以外は（ａ）または（ｂ）の変異体に同
    一である、ＭＰＩＦ−２欠失変異体； （ｄ）該アミノ酸置換が減少した陽性電荷を有するポリペプチドをもたらす、
    （ｃ）のＭＰＩＦ−２欠失変異体； （ｅ）好酸球の活性化または移動を阻害する、（ｃ）、（ｄ）、または（ｅ）
    のＭＰＩＦ−２欠失変異体； （ｆ）好塩基球の活性化または移動を阻害する、（ｃ）、（ｄ）、または（ｅ
    ）のＭＰＩＦ−２欠失変異体； （ｇ）ケモカインレセプター−３に結合する、（ｃ）、（ｄ）、または（ｅ）
    のＭＰＩＦ−２欠失変異体；および （ｈ）該Ｎ末端にＭｅｔ残基をさらに含む、（ａ）〜（ｇ）のいずれか１つの
    ＭＰＩＦ−２欠失変異体 からなる群から選択される、 方法。
  8. 【請求項８】 幹細胞移動の方法であって、有効量のポリペプチドを個体に
    投与する工程を包含し、ここで、該ポリペプチドは、以下： （ａ）配列番号２の残基１〜３の欠失を有する、配列番号２のアミノ酸配列を
    含む骨髄前駆体阻害因子−２（ＭＰＩＦ−２）のＮ末端欠失変異体であって、こ
    こで、該欠失変異体のカルボキシ末端は、残基ｍであり、ここで、ｍは、配列番
    号２の残基４８〜残基９３の任意の残基である、骨髄前駆体阻害因子−２のＮ末
    端欠失変異体；ならびに （ｂ）配列番号２のＰｒｏ（４）からＡｒｇ（７３）への、（ａ）のＭＰＩＦ
    −２欠失変異体； （ｃ）少なくとも１つのアミノ酸置換以外は（ａ）または（ｂ）の変異体に同
    一である、ＭＰＩＦ−２欠失変異体； （ｄ）該アミノ酸置換が減少した陽性電荷を有するポリペプチドをもたらす、
    （ｃ）のＭＰＩＦ−２欠失変異体； （ｅ）好酸球の活性化または移動を阻害する、（ｃ）、（ｄ）、または（ｅ）
    のＭＰＩＦ−２欠失変異体； （ｆ）好塩基球の活性化または移動を阻害する、（ｃ）、（ｄ）、または（ｅ
    ）のＭＰＩＦ−２欠失変異体； （ｇ）ケモカインレセプター−３に結合する、（ｃ）、（ｄ）、または（ｅ）
    のＭＰＩＦ−２欠失変異体；および （ｈ）該Ｎ末端にＭｅｔ残基をさらに含む、（ａ）〜（ｇ）のいずれか１つの
    ＭＰＩＦ−２欠失変異体 からなる群から選択される、 方法。
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