JPH1070987A - ヒトＴｈ２特異的タンパク質及びこれをコードする遺伝子（Ｅ２６）、並びにこれに関連する形質転換体、組換えベクター及びモノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】ヘルパーＴ細胞のサブセットである、Ｔｈ１と
Ｔｈ２との分布の極性化における知見に基づく、免疫関
連疾患の病勢や病型の特定手段を提供すること。 【解決手段】ヒトＴｈ２にのみ特異的な遺伝子（Ｅ２
６）をサブトラクション法により調製・特定し、この遺
伝子を組み込んだ組換えベクターとこの組換えベクター
で形質転換された形質転換体、この形質転換体に由来す
る上記遺伝子がコードするヒトＴｈ２特異的タンパク
質、さらにはこのヒトＴｈ２特異的タンパク質（Ｅ２
６）を抗原とする抗体を調製して、これらの遺伝子，タ
ンパク質及び抗体等を、Ｔｈ１とＴｈ２との分布の極性
化の特定手段や是正手段として用いること。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、Ｔｈ２特異的タン
パク質及びこれをコードする遺伝子に関する技術分野に
属する発明である。より詳細には、アトピー性疾患の発
症，エイズの劇症化等に深く関わるヘルパーＴ細胞群に
おけるバランスの変化を迅速かつ簡便に特定する手段と
して用いることができる２型ヘルパーＴ細胞にのみ特異
的なタンパク質及びこれをコードする遺伝子に関する。
また、本発明はこの遺伝子を組み込んだ遺伝子発現用組
換えベクター，このベクターで形質転換した形質転換体
に関する技術分野に属する発明である。さらに、本発明
は上記のＴｈ２特異的タンパク質を抗原とするモノクロ
ーナル抗体及びこれを産生するハイブリドーマに関する
技術分野に属する発明である。

【０００２】

【従来の技術】近年、免疫学は驚くべき進歩を見せ、そ
の医学分野における貢献は多大である。免疫学は、感染
免疫，腫瘍免疫，アレルギー，アナフィラキシー等のど
のような免疫反応でも、その促進と抑制の中心的役割を
果たしているのは、マクロファージやリンパ球等が産生
するサイトカインであることを既に明らかにしている。
Mosmann とCoffman らは、マウス脾細胞から樹立した長
期培養可能なＣＤ４⁺Ｔ細胞クローンを、その産生する
サイトカインの違いから異なる２つのサブセットに分類
した（Mosmann,T.R.,et al.,J.Immunol., 136 ,2348(19
86) ）。

【０００３】すなわち、主にＩＬ−４，ＩＬ−５，ＩＬ
−６，ＩＬ−１０及びＩＬ−１３を産生する「Ｔ−help
er２（Ｔｈ２）」と、主にＩＬ−２，ＩＦＮ−γ及びＴ
ＮＦ−βを産生する「Ｔ−helper１（Ｔｈ１）」とに分
類した。ヒトにおいては、当初このようなヘルパーＴ細
胞のサブセットの存在は疑問視されていたが、現在では
その存在が明らかに認められている（Romagnani,S., Im
munology Today 12,256(1991) 等) 。

【０００４】現在、これらのマウスやヒトのヘルパーＴ
細胞サブセットＴｈ２，Ｔｈ１の性状や機能がますます
明らかになりつつあり、多くの免疫反応の調節にあずか
る中心細胞としての生物的意義が注目されている。ま
た、多くの感染症や免疫学的疾患では、患者リンパ球の
Ｔｈ１／Ｔｈ２サブセットの分布において、そのいずれ
かに極端に偏る極性化が起こり、この極性化がその疾患
の病勢や病型に反映していることが示唆されている。

【０００５】例えば、Mycobacterium 感染症において
は、Mycobacterium に対する免疫反応がＤＴＨ（遅延
型）反応を主とした型をとっている場合はＴｈ１優位で
あり、慢性化し進行型を呈する場合にはＴｈ２優位にな
ること、ＨＩＶ感染症においては、Ｔｈ１型のサイト
カインの産生は長期間の非進行性患者に多く、Ｔｈ２へ
の極性化が起こると症状は進行又は劇症化すること及び
アトピー性疾患の患者においては、Ｔｈ２への極性化
が起こると症状が悪化すること等が現在明らかになりつ
つある。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】そこで、本発明が解決
すべき課題は、上記のＴｈ１／Ｔｈ２サブセットの分布
の極性化（以下、Ｔｈ１／Ｔｈ２インバランスという）
における知見に基づいた、免疫関連疾患の病勢や病型の
特定手段を提供することにある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題に
ついて鋭意検討を行った。その結果、Ｔｈ２に特異的な
タンパク質とこれをコードする遺伝子及びＴｈ１に特異
的なタンパク質とこれをコードする遺伝子をそれぞれ特
定，調製することができれば、これを基にして所望する
免疫関連疾患の病勢や病型の特定手段を提供し得ること
を見出し本発明を完成した。本願は、上記遺伝子の内、
ヒトＴｈ２に特異的なタンパク質及びこれをコードする
遺伝子（Ｅ２６）に関連するものである。

【０００８】すなわち、本発明者は本願において、以下
に掲げる発明を提供するものである。

【０００９】請求項１において、配列番号６で表される
アミノ酸配列のヒトＴｈ２特異的タンパク質を提供す
る。

【００１０】請求項２において、配列番号６で表される
アミノ酸配列の一部のアミノ酸が欠失，置換若しくは付
加されたアミノ酸配列からなり、かつ前記請求項１記載
のヒトＴｈ２特異的タンパク質と実質的に同一の生物学
的活性を有するヒトＴｈ２特異的タンパク質を提供す
る。

【００１１】請求項３において、配列番号６で表される
アミノ酸配列をコードする塩基配列を含むヒトＴｈ２特
異的遺伝子を提供する。

【００１２】請求項４において、配列番号５で表される
塩基配列のヒトＴｈ２特異的遺伝子を提供する。

【００１３】請求項５において、配列番号５で表される
塩基配列の一部の塩基が欠失，置換若しくは付加された
塩基配列からなり、かつストリンジェントな条件下で配
列番号５で表される塩基配列のＤＮＡとハイブリダイズ
し、さらに配列番号６で表されるアミノ酸配列を有する
ヒトＴｈ２特異的タンパク質と実質的に同一の生物学的
活性を有するヒトＴｈ２特異的タンパク質をコードする
ヒトＴｈ２特異的遺伝子を提供する。

【００１４】請求項６において、前記請求項３乃至請求
項５のいずれかの請求項記載のヒトＴｈ２特異的遺伝子
を含有する遺伝子発現用組換えベクターを提供する。

【００１５】請求項７において、前記請求項６記載の遺
伝子発現用組換えベクターで形質転換され、かつこの遺
伝子発現用組換えベクターに含まれているヒトＴｈ２特
異的遺伝子が発現している形質転換体を提供する。

【００１６】請求項８において、前記請求項１又は請求
項２記載のヒトＴｈ２特異的タンパク質のいずれかの部
分を抗原決定基とし、かつヒトＴｈ１特異的タンパク質
との間においては免疫反応性を示さないモノクローナル
抗体を提供する。

【００１７】請求項９において、前記請求項８記載のモ
ノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを提供す
る。

【００１８】

【発明の実施の形態】以下、本発明の実施の形態につい
て説明する。本発明におけるヒトＴｈ２に特異的な遺伝
子〔以下、本発明Ｔｈ２（Ｅ２６）遺伝子という。この
本発明Ｔｈ２（Ｅ２６）遺伝子には、特に断らない限
り、本発明の技術的範囲に入るべき改変ヒトＴｈ２（Ｅ
２６）特異的遺伝子（後述する）が含まれる。〕の由来
となるヒトＴｈ２とは、上記の通り、ヒトヘルパーＴ細
胞のサブセットの一つである。

【００１９】このヒトＴｈ２は、以下のような特徴を有
するヘルパーＴ細胞のサブセットである。 ヒトＴｈ２は、ＩＬ−４及びＩＬ−５を産生するが、
ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−βは産生しない。 ヒトＴｈ２は、ＩＬ−２及びＩＬ−４に反応して増殖
し、ＩＦＮ−γの存在により誘導が抑制される〔これに
対して、他方のサブセットのヒトＴｈ１は、同様にＩＬ
−２（ＩＬ−１２にも）に反応して増殖するが、ヒトＴ
ｈ２とは逆に、ＩＬ−４の存在により誘導が抑制され
る〕。

【００２０】ヒトＴｈ２の表面マーカーは、現在ヒト
Ｔｈ１と明確に区別できる表面マーカーは見出されてお
らず、ヒトＴｈ２はヒトＴｈ１と同様に、ＣＤ４４
^bright，ＣＤ４５ＲＢ^dull，ＬＥＣＡＭ−１^dullの表現
型を有する。 ヒトＴｈ２は、抗体産生を亢進させる。特に、ＩｇＥ
産生を誘導する。 ヒトＴｈ２は、肥満細胞や好酸球の分化や増殖を促進
する。 ヒトＴｈ２は、抗原特異的ＤＴＨを誘起せず、慢性化
し進行型を示す場合に優位となる。

【００２１】本発明Ｔｈ２（Ｅ２６）遺伝子は、例えば
このような特徴を有するヒトＴｈ２クローンを樹立し、
このクローンからヒトＴｈ２のｃＤＮＡライブラリーを
調製して得ることができる。

【００２２】Ａ．ヒトＴｈ２クローンの樹立：所望する
ヒトＴｈ２クローンを樹立する前提として、このクロー
ンを含むことが知られているＣＤ４⁺ Ｔ細胞集団を調製
する。この調製方法は、通常公知の方法、例えば"Gianf
ranco, F.D.P.,et al.,J.Clin. Invest.,88,346(1991)"
に記載されている方法に従って調製することが可能であ
る。

【００２３】より具体的には、例えばヒトの全血から末
梢血単核球を分離して、これを種々のＴ細胞活性化因子
により刺激をして、所望するＣＤ４⁺ Ｔ細胞集団を調製
する。Ｔ細胞活性化因子としては、例えばインゲンマメ
由来の植物凝集素（ＰＨＡ）等の非特異的Ｔ細胞活性化
因子；ＩＬ−２，ＩＬ−４，ＩＬ−１２等のサイトカイ
ン；ＰＰＤ，ダニ抽出液等の刺激抗原等を挙げることが
できる。

【００２４】この調製過程を経た後、後述するＣＤ４⁺
Ｔ細胞の単離工程に先立ち、予めＣＤ４⁺ Ｔ細胞以外の
要素、例えばＣＤ８⁺ Ｔ細胞等を除去する工程に付する
ことが好ましい。この除去工程としては、例えば抗ＣＤ
４抗体を結合した磁気ビーズを用いてＣＤ４⁺ Ｔ細胞の
みを濃縮する方法等を挙げることができる。

【００２５】上記誘導過程を経た後、ＣＤ４⁺ Ｔ細胞ク
ローンを単離する。この単離方法も通常公知の方法、例
えば限界希釈法に従ってこの単離を行うことができる。
より具体的には、例えばＰＨＡ及びＩＬ−２を添加した
培地で、細胞をウエル当り０．５〜１０細胞となるよう
に９６穴マイクロプレートに播き、３〜４日毎にＩＬ−
２添加培地で培地交換を続け、増殖が認められた（通常
２〜４週間）細胞について表面マーカーを調べ、ＣＤ４
陽性のクローンのみを選択して、対象となるＣＤ４⁺ Ｔ
細胞クローンとすることができる。このようにして単離
したＣＤ４⁺ Ｔ細胞クローンの中から所望のヒトＴｈ２
クローンを選択・調製することができる。

【００２６】ＣＤ４⁺ Ｔ細胞クローンからのヒトＴｈ２
クローンの選択は、既に知られているヒトＴｈ２とヒト
Ｔｈ１の性質の違いに基づき行われる。すなわち、例え
ば、抗ＣＤ３抗体の刺激に応答してＩＬ−４を産生する
がＩＦＮ−γを産生しないクローンをヒトＴｈ２クロー
ンとして選択することができる（これに対して、逆にＩ
ＦＮ−γを産生するがＩＬ−４を産生しないクローンは
ヒトＴｈ１として選択される）。

【００２７】Ｂ．ヒトＴｈ２に特異的なｃＤＮＡの調製 ヒトＴｈ２のｃＤＮＡとヒトＴｈ１のｃＤＮＡには、双
方に共通する遺伝子配列と、各々において特異的な遺伝
子配列が存在することが予想される。このような状況
下、所望するヒトＴｈ２に特異的なｃＤＮＡを調製する
には、ヒトＴｈ２のｃＤＮＡ集団からヒトＴｈ１のｃＤ
ＮＡと共通なものを除去する、いわゆるサブトラクショ
ン法を用いるのが有利である。

【００２８】このサブトラクション法としては、例えば
デービスらの方法（Davis,M.M.,etal.,Proc. Natl. Aca
d. Sci. U.S.A.,81, 2194(1984)）を挙げることができ
る。この方法はサブトラクションの対象となる一方の素
材のｃＤＮＡと、他方の素材の大過剰のpoly（Ａ）⁺ Ｒ
ＮＡをハイブリダイズさせて、ハイブリダイズせずに残
ったｃＤＮＡをプローブとして、上記一方の素材のｃＤ
ＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、上
記一方の素材に特異的なｃＤＮＡクローンを得る方法で
ある。

【００２９】この方法は、大量のpoly（Ａ）⁺ ＲＮＡを
必要とするという点が、poly（Ａ）⁺ ＲＮＡの素材を大
量に入手することが困難な場合においては実施すること
が困難であるという欠点がある。そこで、比較的少量の
ｐｏｌｙ（Ａ）⁺ ＲＮＡを出発材料としてサブトラクシ
ョンを行うために、ＰＣＲ法を導入する方法も既に報告
されている〔例えば、gene expression screen法（Wan
g,Z. and Brown,D.D.,Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A.,88,
11505(1991)) 等〕。この方法は、上記の方法における
出発材料のｃＤＮＡを一度ＰＣＲ法で増幅することを特
徴とする方法であるが、上記サブトラクション操作とＰ
ＣＲによる増幅操作を繰り返すことで稀少なｍＲＮＡを
クローニングできるという利点を有する方法である。

【００３０】本発明においては、一般的に正常のＣＤ４
⁺ Ｔ細胞クローンの大量培養が困難であり、ｃＤＮＡの
鋳型となるｍＲＮＡを大量に確保することが困難である
故、上記のサブトラクション法のうち、例えば上記「ge
ne expression screen法」を用いることが好ましい。

【００３１】より具体的には、通常公知の方法（例え
ば、ｐｏｌｙ（Ａ）⁺ ＲＮＡを鋳型として、逆転写酵素
を用いる方法）でヒトＴｈ２クローン及びヒトＴｈ１ク
ローン由来のｃＤＮＡを調製して、ＰＣＲ法を用いてこ
れらのｃＤＮＡを増幅する。このｃＤＮＡの増幅に際し
ては、ＰＣＲ法による増幅に適した長さのｃＤＮＡ断片
を得るために、予め制限酵素処理や超音波処理をｃＤＮ
Ａに施すことが好ましい。

【００３２】また、ＰＣＲ法による増幅に必要なＰＣＲ
プライマーとして、例えば、ヒトＴｈ２及びヒトＴｈ１
それぞれに異なった塩基配列を有する特異的なプライマ
ーを使用することができる。この特異的なプライマー
は、通常化学合成により調製される。この方法による
と、サブトラクション操作の後にヒトＴｈ２由来のｃＤ
ＮＡのみが増幅され、微量に混入し得るヒトＴｈ１由来
のｃＤＮＡの増幅を最小限に止め得るという点で有利で
ある。

【００３３】この場合は、予めこのＰＣＲ用プライマー
がアニールし得る配列を含んだリンカーを上記ｃＤＮＡ
断片の両端に結合させる必要がある。このため、上記断
片化処理においては、このリンカーが結合し得る末端を
有するｃＤＮＡ断片を提供する制限酵素を用いることが
好ましい。

【００３４】ＰＣＲリンカーを結合した後のヒトＴｈ２
クローン及びヒトＴｈ１クローン由来のｃＤＮＡ断片群
より、ある程度の長さを有する断片をアガロースゲル電
気泳動等の分別手段により選別し、この選別したｃＤＮ
Ａ断片群をＰＣＲ法により増幅し、この増幅済断片をサ
ブトラクションの出発材料とすることができる。

【００３５】このようにして調製したｃＤＮＡ断片群の
うち、ヒトＴｈ２クローン由来のｃＤＮＡ断片群から、
ヒトＴｈ２及びヒトＴｈ１に共通する塩基配列有するｃ
ＤＮＡを除いたｃＤＮＡ断片群を選別して、所望する本
発明ヒトＴｈ２遺伝子を含んだ遺伝子ライブラリーを調
製することができる。

【００３６】この選別方法は、例えば一定量のヒトＴｈ
２クローン由来のｃＤＮＡ断片群に過剰量の標識したヒ
トＴｈ１クローン由来ｃＤＮＡ断片群をハイブリダイズ
させて、この標識に基づいてヒトＴｈ１クローン由来ｃ
ＤＮＡ断片とハイブリダイズしたｃＤＮＡを除去して、
残りの断片をヒトＴｈ２にのみ特異的な遺伝子配列に基
づいたｃＤＮＡ断片として扱う方法を採ることができ
る。

【００３７】ここで用いる標識は、上記選別方法を行う
ことが可能である限り特に限定されないが、可能な限り
標識及び除去が簡便な手段を用いることが好ましいこと
は勿論である。かかる点より、例えばビオチンでｃＤＮ
Ａ断片を標識して、標識されたｃＤＮＡ断片をストレプ
トアビジンに吸着させる手法等を用いることが有利であ
る。

【００３８】なお、上記の手段により選別されたヒトＴ
ｈ２にのみ特異的な遺伝子配列に基づいたｃＤＮＡ断片
を、さらにＰＣＲ法によって増幅させて再び上記の選別
手段を行う過程を繰り返すことによって、所望するｃＤ
ＮＡ断片を濃縮・増幅することができる。

【００３９】このようにして調製した、ｃＤＮＡ断片を
用いて、本発明Ｔｈ２（Ｅ２６）遺伝子を含んだ遺伝子
ライブラリーを得ることができる。かかる遺伝子ライブ
ラリーの調製工程については、通常公知の方法を用いる
ことができる。

【００４０】すなわち、上記ｃＤＮＡ断片を適切な遺伝
子導入用ベクターに組み込み、これを選択した遺伝子導
入用ベクターに応じた宿主に導入することにより所望す
る遺伝子ライブラリーを調製することができる。なお、
この遺伝子導入用ベクターにｃＤＮＡ断片が組み込まれ
たか否かは、このベクターが保有する，例えばlac Ｚ遺
伝子活性によるカラーセレクション等によって確認する
ことができる。

【００４１】ここで用いる導入用ベクターは、特に限定
されず、例えばプラスミドとしては、pBluescript,ｐＵ
Ｃ１８，ｐＢＲ３２２，ｐＢＧＰ１２０，ｐＰＣφ１，
ｐＰＣφ２，ｐＰＣφ３，ｐＭＣ１４０３，ｐＬＧ２０
０，ｐＬＧ３００，ｐＬＧ４００等を；λファージとし
ては、λｇｔ１０，λＺＡＰII等を挙げることができる
が、取扱いの簡便さから上記lac Ｚ遺伝子をマーカーと
して保有するプラスミドを用いることが好ましい。具体
的には、上記導入用ベクターのうち、pBluescript,ｐＵ
Ｃ１８，ｐＢＧＰ１２０等を選択することが好ましい。
なお、この遺伝子ライブラリーの調製工程を市販の遺伝
子ライブラリー調製用キットを用いて行うことも可能で
ある。

【００４２】Ｃ．本発明Ｔｈ２（Ｅ２６）遺伝子の単離 上記のようにして調製した遺伝子ライブラリーから、直
接ＤＮＡを抽出して、それらのうちのいくつかの塩基配
列を決定して、それらの塩基配列から本発明Ｔｈ２（Ｅ
２６）遺伝子を有するクローンを選別することも可能で
あるが、予めさらにクローンを選別して確実に本発明Ｔ
ｈ２（Ｅ２６）遺伝子を有するクローンを特定すること
が好ましい。

【００４３】かかる選別方法としては、通常公知の方法
を用いることができる。たとえば、上記のごとく調製し
た、ヒトＴｈ２に特異的な遺伝子に基づく遺伝子ライブ
ラリー及び別に調製したヒトＴｈ１に特異的な遺伝子に
基づく遺伝子ライブラリーに由来する遺伝子を調製し、
これに標識を施して標識プローブとして、ヒトＴｈ２に
特異的な遺伝子に基づく遺伝子ライブラリーのレプリカ
とハイブリダイズさせて、ヒトＴｈ２に特異的な遺伝子
のプローブとはハイブリダイズするが、ヒトＴｈ１に特
異的な遺伝子のプローブとはハイブリダイズしないクロ
ーンを選別して、このクローンを本発明Ｔｈ２（Ｅ２
６）遺伝子を保有するクローンとして、後述する本発明
Ｔｈ２（Ｅ２６）遺伝子の塩基配列を決定する対象とす
ることができる。

【００４４】なお、さらに慎重を期するために、例えば
ヒトＴｈ２及びヒトＴｈ１の全ＲＮＡ又はpoly（Ａ）⁺
ＲＮＡを用いたノーザンブロッティング法を用いて発現
するｍＲＮＡのパターンを比較して、後述する本発明Ｔ
ｈ２（Ｅ２６）遺伝子の塩基配列を決定する対象となる
クローンを決定付けることもできる。

【００４５】このようにして調製したクローンにおける
本発明Ｔｈ２（Ｅ２６）遺伝子の塩基配列の決定手段は
通常公知の方法を用いて行うことができる。例えば、マ
キサム−ギルバート法（Maxam,A.M.,and Gilbert,W.,Pr
oc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,74,560(1977)），ゲノミック
・シークエンス法（Church,G.M. and Gilbert,W.,Proc.
Natl.Acad.Sci.U.S.A.,81,1991(1984)），マルチプレッ
クス法（Church,G.M. and Kieffer-Higgins,S.,Scienc
e,240,185(1988)），サイクルシークエンス法（Murray,
V.,Nucleic Acids Res.,17,8889(1989)），ジデオキシ
法（Sanger,F.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,74,
5463(1977)）等の方法を用いて、所望する本発明Ｔｈ２
（Ｅ２６）遺伝子の塩基配列を決定することができる。
なお、これらの原理を応用した塩基配列自動解析装置を
用いて、この塩基配列を決定することも勿論可能であ
る。

【００４６】上記のごとくして決定された本発明Ｔｈ２
（Ｅ２６）遺伝子の塩基配列を基にして、この本発明Ｔ
ｈ２（Ｅ２６）遺伝子そのものを入手することができ
る。すなわち、上記と同様に調製した本発明Ｔｈ２（Ｅ
２６）遺伝子の出所となるヒトＴｈ２のｃＤＮＡを鋳型
とし、上記のごとく決定された本発明Ｔｈ２（Ｅ２６）
遺伝子の５’末端側と３’末端側の配列を含むＤＮＡ断
片をプライマーとして、前出のＰＣＲ法により、本発明
Ｔｈ２（Ｅ２６）遺伝子を大量に増幅させて入手するこ
とができる。

【００４７】また、上記のごとく塩基配列を決定したヒ
トＴｈ２遺伝子断片そのものをプローブとして、ヒトＴ
ｈ２から作出したｃＤＮＡの遺伝子ライブラリーから本
発明Ｔｈ２（Ｅ２６）遺伝子を有するクローンを選別し
て、本発明Ｔｈ２（Ｅ２６）遺伝子の全長を入手する伝
統的な手法を用いることも可能である。

【００４８】さらに、ホスファイト−トリエステル法
（Ikehara,M.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,81,5
956(1984) ）等の通常公知の方法を用いて本発明Ｔｈ２
（Ｅ２６）遺伝子を化学合成することも可能であり、こ
れらの化学合成法を応用したＤＮＡシンセサイザーを用
いて本発明Ｔｈ２（Ｅ２６）遺伝子を合成することも可
能である。

【００４９】なお、このようにして製造する本発明Ｔｈ
２（Ｅ２６）遺伝子の塩基配列の一部を改変して、この
塩基配列の一部の塩基が欠失，置換若しくは付加された
塩基配列からなる改変遺伝子（この本発明Ｔｈ２（Ｅ２
６）遺伝子に対する相同性は、概ね７０％以上である）
の存在を本発明者は認識し、このような改変遺伝子にも
本発明の技術的範囲は及ぶものである。

【００５０】この本発明の技術的範囲が及び得るヒトＴ
ｈ２遺伝子は、ストリンジェントな条件下｛系における
ＤＮＡ同士のハイブリッドが形成しにくい条件〔具体的
には、系の温度（高い程ハイブリッドしにくい）や塩濃
度（低い程ハイブリッドしにくい）や、ホルムアミド等
の変性剤の濃度（高い程ハイブリッドしにくい）等に依
存する〕のことをいう。｝で配列番号５（後述する）で
表される塩基配列のＤＮＡとハイブリダイズし、さらに
配列番号６（後述する）で表されるアミノ酸配列を有す
るヒトＴｈ２特異的タンパク質と実質的に同一の生物学
的活性を有するヒトＴｈ２（Ｅ２６）特異的タンパク質
をコードするヒトＴｈ２特異的遺伝子である。

【００５１】ここにいう「実質的に同一」とは、その生
物学的活性が比較の対象となるヒトＴｈ２（Ｅ２６）特
異的タンパク質の生物学的活性と質的及び／又は量的に
同一性を有することを意味する。具体的なヒトＴｈ２
（Ｅ２６）特異的タンパク質の生物学的活性については
後述する。

【００５２】この遺伝子改変法として、通常公知の方
法、例えばいわゆるサイト−スペシフィックミュータジ
ェネシス（Site-Specific Mutagenesis)（Mark,D.F.,et
al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A., 81,5662(1984) ）等
の方法を用いて、所望の遺伝子改変を行うことができ
る。

【００５３】このようにして入手した本発明Ｔｈ２（Ｅ
２６）遺伝子を用いて、疾患の局所におけるＴｈ１／Ｔ
ｈ２バランスのチェックを行うことができる。すなわ
ち、疾患の局所のｍＲＮＡを抽出して、例えばＲＴ−Ｐ
ＣＲ法（"PCR Protocols, A Guide to Methods and App
lications" Innis, M.A.,et al.,ed.,Academic Press,S
an Diego,1990 ）を用いて、この組織における本発明Ｔ
ｈ２（Ｅ２６）遺伝子の発現の程度を測定して、疾患の
局所におけるＴｈ１／Ｔｈ２バランスのチェックを行う
ことができる。

【００５４】このＴｈ１／Ｔｈ２バランスをチェックす
ることにより、上記従来技術の欄に記載したごとく、Ｔ
ｈ１／Ｔｈ２インバランスが重大な要素となる疾患、例
えばＨＩＶ感染症，アレルギー疾患，各種の感染症等の
症状の推移等をより確実に把握することができる。

【００５５】なお、このＴｈ１／Ｔｈ２バランスのチェ
ックは、後述するヒトＴｈ２のポリクローナル抗体又は
モノクローナル抗体を用いて行うことも勿論可能である
が、ここに示したチェック手段は、これらの抗体を用い
ることが困難な局面、例えば目的のタンパク質の発現量
が極微量である場合等に際して有効なチェック手段であ
る。

【００５６】Ｄ．本発明ヒトＴｈ２（Ｅ２６）タンパク
質の製造：さらに、このようにして入手した、本発明Ｔ
ｈ２（Ｅ２６）遺伝子を用いて、組換えヒトＴｈ２特異
的タンパク質〔以下、本発明ヒトＴｈ２（Ｅ２６）タン
パク質という。この本発明ヒトＴｈ２（Ｅ２６）タンパ
ク質には、特に断らない限り上記の改変遺伝子から翻訳
され得るヒトＴｈ２特異的タンパク質が含まれ、勿論こ
れらの改変遺伝子から翻訳され得る改変タンパク質は、
改変されていない本発明ヒトＴｈ２（Ｅ２６）タンパク
質と実質的に同一の生物学的活性を有する。〕を製造す
ることができる。この本発明ヒトＴｈ２（Ｅ２６）タン
パク質は、上記本発明Ｔｈ２（Ｅ２６）遺伝子を利用し
て、通常公知の一般的な遺伝子組換え技術に従って製造
することができる。

【００５７】より具体的には、本発明Ｔｈ２（Ｅ２６）
遺伝子が発現可能な形態の遺伝子発現用ベクターに本発
明Ｔｈ２（Ｅ２６）遺伝子を組み込み、この遺伝子発現
用ベクターの性質に応じた宿主にこの組換えベクターを
導入して形質転換し、この形質転換体を培養等すること
により所望の本発明ヒトＴｈ２（Ｅ２６）タンパク質を
製造することができる。

【００５８】ここで用いる遺伝子発現用ベクターは、通
常発現しようとする遺伝子の上流域にプロモーター，エ
ンハンサー，及び下流域に転写終了配列等を保有するも
のを用いるのが好適である。

【００５９】また、本発明Ｔｈ２（Ｅ２６）遺伝子の発
現は、直接発現系に限らず、例えばβ−ガラクトシダー
ゼ遺伝子，グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ遺伝
子やチオレドキシン遺伝子を利用した融合タンパク質発
現系とすることもできる。

【００６０】かかる遺伝子発現用ベクターとしては、例
えば宿主を大腸菌とするものとしては、ｐＱＥ，ｐＧＥ
Ｘ，ｐＴ７−７，ｐＭＡＬ，ｐＴｒｘＦｕｓ，ｐＥＴ，
ｐＮＴ２６ＣII等を例示することができる。また、宿主
を枯草菌とするものとしては、ｐＰＬ６０８，ｐＮＣ
３，ｐＳＭ２３，ｐＫＨ８０等を例示することができ
る。

【００６１】また、宿主を酵母とするものとしては、ｐ
ＧＴ５，ｐＤＢ２４８Ｘ，ｐＡＲＴ１，ｐＲＥＰ１，Ｙ
Ｅｐ１３，ＹＲｐ７，ＹＣｐ５０等を例示することがで
きる。

【００６２】また、宿主を哺乳動物細胞又は昆虫細胞と
するものとしては、ｐ９１０２３，ｐＣＤＭ８，ｐｃＤ
Ｌ−ＳＲα２９６，ｐＢＣＭＧＳＮｅｏ，ｐＳＶ２ｄｈ
ｆｒ，ｐＳＶｄｈｆｒ，ｐＡｃ３７３，ｐＡｃＹＭ１，
ｐＲｃ／ＣＭＶ，ｐＲＥＰ４，ｐｃＤＮＡＩ等を例示す
ることができる。

【００６３】これらの遺伝子発現ベクターは、本発明ヒ
トＴｈ２（Ｅ２６）タンパク質を発現させる目的に応じ
て選択することができる。例えば大量に本発明ヒトＴｈ
２（Ｅ２６）タンパク質を発現させることを企図する場
合には、宿主として大腸菌，枯草菌又は酵母等を選択し
得る遺伝子発現ベクターを選択するのが好ましく、少量
でも確実に活性を有するように本発明ヒトＴｈ２（Ｅ２
６）タンパク質を発現させることを企図する場合には、
哺乳動物細胞や昆虫細胞を宿主として選択し得る遺伝子
発現ベクターを選択するのが好ましい。

【００６４】上記のように既存の遺伝子発現ベクターを
選択することも可能であるが、目的に応じて適宜遺伝子
発現ベクターを作出して、これを用いることも勿論可能
である。なお、これらの遺伝子発現用組換えベクターも
本発明の技術的範囲に入るものである。

【００６５】本発明Ｔｈ２（Ｅ２６）遺伝子を組み込ん
だ上記遺伝子発現用ベクターの宿主細胞への導入及びこ
れによる形質転換法は、一般的な方法、例えば宿主細胞
が大腸菌や枯草菌である場合には、塩化カルシウム法や
エレクトロポレーション法等を；宿主が哺乳動物細胞や
昆虫細胞の場合はリン酸カルシウム法，エレクトロポレ
ーション法又はリポソーム法等の手段により行うことが
できる。

【００６６】このようにして得られる形質転換体を常法
に従い培養することにより、所望する本発明ヒトＴｈ２
（Ｅ２６）タンパク質が蓄積される（このような形質転
換体も本発明の技術的範囲に含まれる）。かかる培養に
用いられる培地は、宿主の性質に応じて適宜選択するこ
とができるが、例えば宿主が大腸菌である場合には、Ｌ
Ｂ培地やＴＢ培地等が、宿主が哺乳動物細胞の場合に
は、ＲＰＭＩ１６４０培地等を適宜用いることができ
る。

【００６７】この培養により得られる培養物からの本発
明ヒトＴｈ２（Ｅ２６）タンパク質の単離及び精製は、
常法に従い行うことが可能であり、例えば培養物を、本
発明ヒトＴｈ２（Ｅ２６）タンパク質の物理的及び／又
は化学的性質を利用した各種の処理操作を用いて行うこ
とが可能である。

【００６８】具体的には、タンパク沈澱剤による処理，
限外濾過，ゲル濾過，高速液体クロマトグラフィー，遠
心分離，電気泳動，特異抗体を用いたアフィニティクロ
マトグラフィー，透析法等を単独で又はこれらの方法を
組み合わせて用いることができる。このようにして、本
発明ヒトＴｈ２（Ｅ２６）タンパク質を単離、精製する
ことが可能である。

【００６９】なお、上記の本発明Ｔｈ２（Ｅ２６）遺伝
子発現系において、宿主として患者自身から分離したＴ
細胞又は骨髄細胞等を本発明Ｔｈ２（Ｅ２６）遺伝子で
形質転換して、この形質転換体を患者に戻すことによ
り、いわゆる遺伝子治療に利用することが可能である。
この場合の発現用ベクターとしては、例えばレトロウイ
ルスやアデノウイルス等のウイルスベクター等を挙げる
ことができる。

【００７０】この形質転換細胞を用いて行う遺伝子治療
は、Ｔｈ１優位のＴｈ１／Ｔｈ２インバランスに陥って
いることが重大な原因となる疾病の患者に対して行うこ
とができる。具体的には、例えば多発性硬化症やリウマ
チ様関節炎等の自己免疫疾患に上記形質転換細胞を投与
して、これによりこれらの疾患の重大な原因となってい
るＴｈ１優位のＴｈ１／Ｔｈ２インバランスを、投与し
た形質転換細胞にヒトＴｈ２（Ｅ２６）タンパク質を患
者の体内で発現させることにより遺伝子治療を行うこと
ができる。

【００７１】Ｅ．本発明ヒトＴｈ２（Ｅ２６）タンパク
質に対する抗体の製造：本発明は、上記本発明ヒトＴｈ
２（Ｅ２６）タンパク質に対する抗体にも関する。すな
わち、本発明ポリクローナル抗体は、ヒトＴｈ２（Ｅ２
６）タンパク質を免疫抗原として免疫した動物に由来す
る免疫血清から製造することができる。

【００７２】ここで使用される免疫抗原としてのヒトＴ
ｈ２（Ｅ２６）タンパク質は、特に限定されるものでは
なく、上記のごとく調製される本発明Ｔｈ２（Ｅ２６）
遺伝子（その塩基配列の一部を改変したものも含む）が
コードする本発明ヒトＴｈ２（Ｅ２６）タンパク質を用
い得ることは勿論のこと、本発明Ｔｈ２（Ｅ２６）遺伝
子の一部断片がコードする本発明ヒトＴｈ２（Ｅ２６）
タンパク質断片や本発明ヒトＴｈ２（Ｅ２６）タンパク
質に直接酵素処理等を施して、又は化学合成して得られ
る本発明ヒトＴｈ２（Ｅ２６）タンパク質の部分ペプチ
ドをも本発明ポリクローナル抗体を製造する上での免疫
抗原とすることができる。

【００７３】また、免疫動物と同種・同系統の動物由来
の細胞株を、ヒトＴｈ２タンパク質〔本発明ヒトＴｈ２
（Ｅ２６）タンパク質を含む〕又はその一部をコードす
る遺伝子を組み込んだ発現ベクターを導入して形質転換
して、この形質転換細胞をその免疫動物に移植すること
により本発明ポリクローナル抗体を調製することができ
る。すなわち、形質転換細胞を移植した動物の体内で、
持続的に上記ヒトＴｈ２タンパク質がその形質転換細胞
で作られ、それに対する抗体が産生されて、これを本発
明ポリクローナル抗体とすることもできる（Nemoto,T.,
et al.,Eur.J.Immunol.,25,3001(1995) ）。

【００７４】さらに、上記ヒトＴｈ２タンパク質を発現
する発現ベクターを直接動物に筋注や皮下注等の手段で
投与することにより、その動物内で上記ヒトＴｈ２タン
パク質を継続的に産生させて、上記の形質転換細胞を移
植した場合と同様に本発明ポリクローナル抗体を製造す
ることができる（Raz,E.,el al.,Proc.Natl.Acad.Sci.
U.S.A.,91,9519(1994) ）。

【００７５】一方、本発明モノクローナル抗体は、本発
明ポリクローナル抗体の場合と同様の方法で、免疫した
動物の免疫細胞と動物の骨髄腫細胞とのハイブリドーマ
を作出し、これによりヒトＴｈ２タンパク質を認識する
抗体を産生するクローンを選択し、このクローンを培養
することにより製造することができる。

【００７６】また、免疫される動物も特に限定されるも
のではなく、マウス，ラット等を広く用いることができ
るが、モノクローナル抗体を製造する場合には、細胞融
合に用いる骨髄腫細胞との適合性を考慮して選択するこ
とが望ましい。免疫は一般的方法により、例えば上記免
疫抗原を免疫の対象とする動物に静脈内，皮内，皮下，
腹腔内注射等で投与することにより行うことができる。

【００７７】より具体的には、上記免疫抗原を所望によ
り通常のアジュバントと併用して、免疫の対象とする動
物に２〜１４日毎に上記手段により数回投与し、ポリク
ローナル抗体製造のための免疫血清又はモノクローナル
抗体製造のための免疫細胞、例えば免疫後の脾臓細胞を
得ることができる。

【００７８】モノクローナル抗体を製造する場合、この
免疫細胞と細胞融合する他方の親細胞としての骨髄腫細
胞としては、既に公知のもの、例えばＳＰ２／０−Ａｇ
１４，Ｐ３−ＮＳ１−１−Ａｇ４−１，ＭＰＣ11−４
５，６．ＴＧ１．７（以上、マウス由来）；２１０．Ｒ
ＣＹ．Ａｇ１．２．３（ラット由来）；ＳＫＯ−００
７，ＧＭ１５００６ＴＧ−Ａ１２（以上、ヒト由来）等
を用いることができる。

【００７９】上記免疫細胞とこの骨髄腫細胞との細胞融
合は、通常公知の方法、例えばケーラーとミルシュタイ
ンの方法（Kohler,G. and Milstein,C.,Nature,256,495
(1975)）等に準じて行うことができる。

【００８０】より具体的には、この細胞融合は、通常公
知の融合促進剤、例えばポリエチレングリコール（ＰＥ
Ｇ），センダイウイルス（ＨＶＪ）等の存在下におい
て、融合効率を向上させるためにジメチルスルホキシド
等の補助剤を必要に応じて添加した通常の培養培地中で
行い、ハイブリドーマを調製する。所望のハイブリドー
マの分離は、通常の選別用培地、例えばＨＡＴ（ヒポキ
サンチン，アミノプテリン及びチミジン）培地で培養す
ることにより行うことができる。すなわち、この選別用
培地において目的とするハイブリドーマ以外の細胞が死
滅するのに十分な時間をかけて培養することによりハイ
ブリドーマの分離を行うことができる。このようにして
得られるハイブリドーマは、通常の限界希釈法により目
的とするモノクローナル抗体の検索及び単一クローン化
に供することができる。

【００８１】目的とするモノクローナル抗体産生株の検
索は、例えばＥＬＩＳＡ法，プラーク法，スポット法，
凝集反応法，オクタロニー法，ＲＩＡ法等の一般的な検
索法に従い行うことができる。このようにして得られる
ヒトＴｈ２タンパク質を認識する所望のモノクローナル
抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培地で継代培
養することが可能であり、さらに液体窒素中で長時間保
存することもできる（本発明の技術的範囲には、このハ
イブリドーマも含まれる。）。

【００８２】このハイブリドーマからの所望のモノクロ
ーナル抗体の採取は、このハイブリドーマを常法に従っ
て培養して、その培養上清として得る方法や、ハイブリ
ドーマをこのハイブリドーマに適合性が認められる動物
に投与して増殖させ、その腹水として得る方法等を用い
ることができる。

【００８３】なお、インビトロで免疫細胞をヒトＴｈ２
タンパク質又はその一部の存在下で培養し、一定期間後
に上記細胞融合手段を用いて、この免疫細胞と骨髄腫細
胞とのハイブリドーマを調製し、抗体産生ハイブリドー
マをスクリーニングすることで所望するモノクローナル
抗体を得ることもできる（Reading,C.L.,J.Immunol.Met
h.,53,261(1982) ；Pardue,R.L.,et al.,J.Cell Biol.,
96,1149(1983））。

【００８４】さらに、免疫原として本発明ヒトＴｈ２
（Ｅ２６）タンパク質を用いることなしに、免疫原とし
て直接本発明Ｔｈ２（Ｅ２６）遺伝子又はその一部を用
いて所望するモノクローナル抗体を製造することも可能
である。すなわち、本発明Ｔｈ２（Ｅ２６）遺伝子で直
接動物を免疫して（この免疫の際には、この遺伝子を含
む遺伝子発現用組換えベクターを免疫原として用いるこ
とができる）、その遺伝子免疫動物の免疫細胞又は免疫
血清を用いることによって、ヒトＴｈ２（Ｅ２６）タン
パク質を特異的に認識するモノクローナル抗体を製造す
ることができる。

【００８５】また、上記で得られるポリクローナル抗体
及びモノクローナル抗体は、更に塩析，ゲル濾過法，ア
フィニティクロマトグラフィー等の通常の手段により精
製することができる。このようにして得られるポリクロ
ーナル抗体及びモノクローナル抗体は、本発明ヒトＴｈ
２（Ｅ２６）タンパク質に特異反応性を有する抗体であ
る。

【００８６】上記ポリクローナル抗体及びモノクローナ
ル抗体は、体内のＴｈ１／Ｔｈ２バランスをチェックす
る手段として用いることができる。すなわち、上記抗体
をＥＬＩＳＡ，ＲＩＡ，免疫組織化学的手法，フローサ
イトメトリーによる解析，ウエスタンブロット法等に用
いることによって、検体中のヒトＴｈ２量を特定するこ
とにより、体内のＴｈ１／Ｔｈ２バランスをチェックし
て、上記従来技術の欄に記載したごとく、Ｔｈ１／Ｔｈ
２インバランスが重大な要素となる疾患、例えばアトピ
ー性疾患やエイズ等の症状の推移等をより確実に把握す
ることができる。

【００８７】また、上記のようにして得られるポリクロ
ーナル抗体及びモノクローナル抗体は、例えばＴｈ２が
優位のＴｈ１／Ｔｈ２インバランスを是正する抗体とし
て用いることができる。

【００８８】なお、動物由来の抗体においては、そのま
ま人間に投与する場合に抗原性が認められ、そのままヒ
トに投与するのには適さない面がある。そのために、動
物由来のモノクローナル抗体の遺伝子の可変領域をクロ
ーニングして、この可変領域の遺伝子とヒト型の抗体の
遺伝子の定常領域の遺伝子と結合させて、この融合遺伝
子を発現させて融合抗体を製造することができる（Clac
kson,T.,et al.,Nature,352 ,624(1991)）。

【００８９】この技術を上記モノクローナル抗体につい
て適用することも可能である。すなわち、動物由来の上
記モノクローナル抗体の可変領域とヒト型の抗体の定常
領域とが融合した融合抗体を、例えばＴｈ２が優位のＴ
ｈ１／Ｔｈ２インバランスを是正する抗体として用いる
こともできる。

【００９０】

【実施例】以下、実施例等により本発明を具体的に記載
するが、この実施例により本発明の技術的範囲が限定し
て解釈されるべきものではない。

【００９１】〔実施例１〕 本発明Ｔｈ２（Ｅ２６）遺
伝子の製造等 （１）ヘルパーＴ細胞クローンの調製 健常人の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）１０⁶ 細胞／mlに、
ヒトＴｈ１細胞を主に誘導するために、ＰＨＡ（ＥＹラ
ボラトリーズ社製）１μg/ml，ｒＩＦＮ−γ（ジエンザ
イム社製）５０ng/ml 及びｒＩＬ−１２（Ｒ＆Ｄシステ
ムズ社製）５ng/ml を添加して５日間培養した。一方、
ヒトＴｈ２を主に誘導するために、ＰＢＭＣにダニ抽出
液（鳥居薬品製）２％（v/v)，ｒＩＬ−４（ジエンザイ
ム社製）２０ng/ml 及び抗ＩＦＮ−γ抗体（ジエンザイ
ム社製）を５μg ／mlを添加して５日間培養した。５日
後、各々の培養にｒＩＬ−２（塩野義製薬製）を４０Ｕ
/ml 添加して、さらに７〜１０日間培養した。

【００９２】次に、この培養集団の中から、ＣＤ４⁺ Ｔ
細胞を分離するために、抗ＣＤ４抗体を結合した磁気ビ
ーズ（ダイナル社製）を吸着させた後、磁石上でビーズ
と結合した細胞を回収した。次に、磁気ビーズ分離用試
薬（ダイナル社製）で、磁気ビーズからＣＤ４⁺ Ｔ細胞
を解離させ、ＣＤ４⁺ Ｔ細胞を得た。次いで、この純化
したＣＤ４⁺ Ｔ細胞集団をＰＨＡ０．５μg/ml及びｒＩ
Ｌ−２を４０Ｕ／ml添加した、１５％牛胎児血清添加Ｒ
ＰＭＩ１６４０で、細胞をウエル当り０．５細胞となる
ように９６穴マイクロプレートに播き、３〜４日毎に上
記と同様のＩＬ−２添加培地で培地交換を続け、増殖が
認められた細胞について表面マーカーを蛍光抗体法を用
いて調べ、ＣＤ４に対して陽性のクローンのみを選択し
て、対象となるＣＤ４⁺ Ｔ細胞クローンとした（Gianfr
anco, F.D.P.,et al.,J.Clin. Invest. ,88,346(1991)
）。

【００９３】次に、個々のＣＤ４⁺ Ｔ細胞クローンの細
胞のタイプを調べるために、上記ＣＤ４⁺ Ｔ細胞クロー
ン（６×１０⁵cells／３００μl ／ウエル）を、抗ＣＤ
３抗体（ＯＫＴ３：オーソファーマスーティカル社製）
をコートした４８ウエルプレートで２４時間培養し、そ
の培養上清中のＩＦＮ−γ及びＩＬ−４の濃度をそれぞ
れのモノクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡで測定し
た。その結果、ＩＬ−４を産生するがＩＦＮ−γを産生
しないものをヒトＴｈ２クローンとした。その結果を第
１表に示す。

【００９４】

【表１】

【００９５】（２）サブトラクトｃＤＮＡライブラリー
の調製 上記（１）において得たヒトＴｈ２クローン（２Ｐ２
６）及びヒトＴｈ１クローン（２Ｐ１５）よりそれぞれ
ｐｏｌｙ（Ａ）⁺ ＲＮＡをオリゴｄＴラテックス（日本
ロシュ製）を用いて常法により調製した。次いで、これ
らのｐｏｌｙ（Ａ）⁺ ＲＮＡを鋳型にして、オリゴ（ｄ
Ｔ）プライマー（ファルマシア製）及びＭＭＬＶ逆転写
酵素（ファルマシア製）を用いて、それぞれのｃＤＮＡ
を約３００ngを調製した。次に、それぞれのｃＤＮＡ
を、ＰＣＲ法による増幅工程に処するに適した鎖長にす
るために、制限酵素Ａｌｕ I（東洋紡績製）８４Ｕ及び
同Ｒｓａ I（東洋紡績製）４８Ｕで、３７℃で５時間消
化し、それぞれに異なるＰＣＲ用のリンカー（Balzer,
H.J.,and Baumlein,H.,Nucleic Acids Res.,22 ,2853(1
994) ）：

【００９６】ヒトＴｈ２用リンカー：５’−ＡＧＴ Ｔ
ＡＣ ＡＣＧ ＴＣＴ ＡＧＡ ＡＴＧ ＧＣＴ−３’
（配列番号１） ３’−ＡＴＡＧ ＴＣＡ ＡＴＧ ＴＧＣ ＡＧＡ Ｔ
ＣＴ ＴＡＣ ＣＧＡ−５’（配列番号２）

【００９７】ヒトＴｈ１用リンカー：５’−ＣＴＣ Ｔ
ＴＧ ＣＴＴ ＧＡＡ ＴＴＣ ＧＧＡ ＣＴＡ−３’
（配列番号３） ３’−ＡＣＡＣ ＧＡＧ ＡＡＣ ＧＡＡ ＣＴＴ Ａ
ＡＧ ＣＣＴ ＧＡＴ−５’（配列番号４）

【００９８】を結合した後に、アガロース電気泳動によ
り分子量が０．２Kbp から２Kbp のｃＤＮＡ断片のみを
分取した。次に、このようにして得られた２Ｐ２６由来
及び２Ｐ１５由来のｃＤＮＡ断片を、それぞれ特有のＰ
ＣＲ用プライマー：

【００９９】ヒトＴｈ２用プライマー：５’−ＡＧＴ
ＴＡＣ ＡＣＧ ＴＣＴ ＡＧＡ ＡＴＧ ＧＣＴ−
３’（配列番号１） ヒトＴｈ１用プライマー：５’−ＣＴＣ ＴＴＧ ＣＴ
Ｔ ＧＡＡ ＴＴＣ ＧＧＡ ＣＴＡ−３’（配列番号
３）

【０１００】を用いてＰＣＲにより増幅した（熱サイク
ル：９４℃１分；５０℃１分；７２℃２分；を３０
回）。このＰＣＲにより得られたＰＣＲ産物をサブトラ
クションの出発材料とした。

【０１０１】すなわち、ヒトＴｈ２（２Ｐ２６）由来の
上記ＰＣＲ産物（５μg ）に大過剰量のビオチン標識ヒ
トＴｈ１（２Ｐ１５）由来のＰＣＲ産物（１００μg ）
〔ＤＮＡ（100 μg ) に光反応性ビオチン（100 μg )
（ベクターラボラトリーズ社製）を加え、氷中で冷しな
がら、１６０Ｗサンランプ下約１５cmの所に静置し、１
５分間照射した。その後、未反応ビオチンをブタノール
抽出で除去し、この操作を再度繰り返した後、トリス・
ＥＤＴＡ緩衝液（ＴＥ）に溶解してビオチン標識を完了
した。〕を加え、１００℃で熱変性してそれぞれを１本
鎖とした後に両者をハイブリダイズさせた。次いで、フ
リーの２Ｐ１５由来のｃＤＮＡ及び２Ｐ２６由来のｃＤ
ＮＡとハイブリダイズした２Ｐ１５由来のｃＤＮＡを、
系にストレプトアビジン（ライフテクノロジーズ製）を
１００μg 添加して、これに吸着させて、フェノール・
クロロホルム抽出により除去した。この操作により、２
Ｐ２６由来のｃＤＮＡから２Ｐ１５由来のｃＤＮＡと共
通の塩基配列を持つｃＤＮＡが差し引かれ、２Ｐ２６に
対して特異的なｃＤＮＡを濃縮するサブトラクションが
完了した。

【０１０２】次いで、この濃縮した２Ｐ２６に対して特
異的なｃＤＮＡについて、上記のＰＣＲ増幅及びサブト
ラクションを再度繰り返し、２Ｐ２６に対して特異的な
ｃＤＮＡをさらに濃縮した後、再度上記と同様のＰＣＲ
増幅を行い、約３μg のｃＤＮＡを得た。このようにし
て得た２Ｐ２６に対して特異的なｃＤＮＡを、プラスミ
ドｐBluescript SK(-)（ストラタジーン社製）にクロー
ニングしてサブトラクトｃＤＮＡライブラリーを調製し
た。次いで、このサブトラクトｃＤＮＡライブラリーの
一部で大腸菌（Ｅ．coli JM109株）を形質転換した。

【０１０３】（３）本発明Ｔｈ２（Ｅ２６）遺伝子断片
の単離 上記（２）で得た２Ｐ２６由来のサブトラクトｃＤＮＡ
及び同様の方法により得られた２Ｐ１５由来のサブトラ
クトｃＤＮＡを、それぞれランダムプライミング法を用
いた市販の³²Ｐ標識用キット（宝酒造製）を用いて標識
し、これらを放射性プローブとした。一方、上記（２）
において調製した２Ｐ２６由来のｃＤＮＡライブラリー
の一部で形質転換した大腸菌をプレートに播き、生育し
てきたコロニーについて２組のレプリカフィルターを作
製した。この２組のレプリカフィルターに対して、上述
の２種の放射性プローブをハイブリダイズさせ、０．１
×ＳＳＣで洗浄後、オートラジオグラフィーでプローブ
中のｃＤＮＡと相同なｃＤＮＡを含む大腸菌コロニーを
同定した。

【０１０４】この方法で、約３４００のコロニーをスク
リーニングした結果、「２Ｐ１５由来のサブトラクトｃ
ＤＮＡプローブでは陽性シグナルを与えず、２Ｐ２６由
来のサブトラクトｃＤＮＡプローブに対してのみ陽性シ
グナルを与える」コロニーを２０１個認めた。この２０
１個のｃＤＮＡクローンについて、コロニーハイブリダ
イゼーション法により、相互の異同を検討した結果、相
互にハイブリダイズしない独立した６０個のクローンを
得た。次に、この６０個のクローンについて、全ＲＮＡ
を用いたノーザンブロッティングにより、２Ｐ２６と２
Ｐ１５との間でのｍＲＮＡの発現の差を検討した。その
結果、２Ｐ１５には殆ど発現しておらず、２Ｐ２６にの
み発現が顕著であるクローンを１３種得た。

【０１０５】次に、この１３種のクローンのｃＤＮＡに
ついて、さらにヒトＴｈ２に対する特異性を確認するた
めに、複数のヒトＴｈ２クローン細胞及びヒトＴｈ１ク
ローン細胞との間でのｍＲＮＡの発現の差を、上記ノー
ザンブロッティング法により検討した。その結果、ヒト
Ｔｈ２クローン細胞にのみ共通に発現が認められるいく
つかのｃＤＮＡクローンを得た。そのうちの１つのクロ
ーン（Ｅ２６）の上記ノーザンブロッティング解析の結
果を第１図に示す。

【０１０６】この第１図において、Ｅ２６ｍＲＮＡが上
記２つのヒトＴｈ２クローン（２Ｐ２６及びＫＮＤ４）
において発現していることが明らかになった（レーン３
及びレーン４に対応する）。なお、Ｅ２６ｍＲＮＡはヒ
トＴｈ１クローン（１ＰＯ４及び２Ｐ１５：それぞれレ
ーン１及びレーンに対応する）には発現していなかっ
た。

【０１０７】ｃＤＮＡクローンＥ２６のＤＮＡの塩基配
列の解析を、蛍光ターミネーターを用いたジデオキシタ
ーミネーション法により（パーキンエルマーシータス社
のキットを用いた）行った。その結果、クローンＥ２６
は、新規の塩基配列を有するＤＮＡを有していた。そこ
で、次にクローンＥ２６が有する上記遺伝子と相同の塩
基配列を含む遺伝子〔本発明Ｔｈ２（Ｅ２６）遺伝子〕
の全長についてのクローニングを行った。

【０１０８】（４）本発明Ｔｈ２（Ｅ２６）遺伝子のク
ローニング 所望のｃＤＮＡの全長をクローニングするために、Ｅ２
６ｍＲＮＡの発現が高い細胞からλファージｃＤＮＡラ
イブラリーを調製した。すなわち、上記ＫＮＤ４細胞よ
り全ＲＮＡを抽出し、オリゴ（ｄＴ）ラテックス（日本
ロシュ製）を用いて、ｐｏｌｙ（Ａ）⁺ ＲＮＡを常法に
より精製した。次に、市販のｃＤＮＡクローニングキッ
ト（ライフテクノロジー社製）を用いて、２本鎖ｃＤＮ
Ａを合成し、λＺＡＰII（ストラタジーン社製）のＥｃ
ｏＲＩサイトにクローニングした。これに引続き、市販
のキット（ストラタジーン社製）を用いて、インビトロ
で上記λファージにおけるパッケージングを完了した。
このパッケージング産物を大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ Ｍ
ＲＦ' （ストラタジーン社製）に感染させ、約１×１０
⁵ 個の組換えλファージを得た。次に、上記（３）によ
り得た新規のｃＤＮＡ断片をランダムプライミング法を
用いた市販の³²Ｐ標識用キット（宝酒造製）を用いて標
識し、これを放射性プローブとして、プラークハイブリ
ダイゼーション法によりλファージライブラリーのスク
リーニングを行った。

【０１０９】その結果、２５の陽性クローンを見出し、
これらの陽性ｃＤＮＡクローンのうち、最も長いインサ
ートＤＮＡを持つクローン３個を選択した。選択したλ
ＺＡＰII３クローンのそれぞれより、ExAssistヘルパー
ファージ（ストラタジーン社製）を用いて、ＥｃｏＲＩ
サイトにインサートＤＮＡを含むファージミドｐBluesc
riptを切り出した。次ぎに、インサートＤＮＡを含むフ
ァージミドｐBluescriptＤＮＡ大腸菌ＳＯＬＲ（ストラ
タジーン社製）を形質転換した。上記（３）と同様の蛍
光ターミネーターを用いたジデオキシターミネーション
法による塩基配列解析の結果、上記３つの陽性クローン
のｃＤＮＡの互いに重複する部分の塩基配列は完全に一
致しており、同一の遺伝子に由来するクローンであるこ
とが確認された。これらの３つの陽性クローンのうち、
最も長いｃＤＮＡを有するクローンＥ２６−１をＥ２６
と称し、以下に用いた。

【０１１０】（５）本発明Ｔｈ２（Ｅ２６）遺伝子の構
造 クローンＥ２６に取り込まれたｃＤＮＡは８６２bpの鎖
長であり、ノーザンブロッティングで測定されたｍＲＮ
Ａの長さ（約１kbp ）に近いものであった。そして、そ
の３’端に、ｐｏｌｙ（Ａ）⁺ 付加シグナル及びｐｏｌ
ｙ（Ａ）⁺ の一部と思われる９個のＡ（アデニン）を有
していた。

【０１１１】また、最も長いオープンリーディングフレ
ームは、５’端より７９番目のＡＴＧより始まり、６７
６番目のＴＧＡで終わり、１９９アミノ酸残基よりなる
タンパク質をコードしていると予測された。その開始コ
ドン付近の塩基配列（ＧＣＡＣＣ ＡＴＧＣ）は、Ｋｏ
ｚａｋのコンセンサス配列（ＣＣＡ（Ｇ）ＣＣＡＴＧ
Ｇ：Kozak,M.,Nucleic Acids Res.,15,8125(1987) ））
とほぼ相同であった。

【０１１２】以上の点より、クローンＥ２６は、ｍＲＮ
Ａの３’端から始まり、コーディング領域全長を経て
５’側の非翻訳領域の一部に達するほぼ全長を含んでい
ると判断された。

【０１１３】このクローンＥ２６の有するｃＤＮＡ配列
を有する遺伝子を本発明Ｔｈ２（Ｅ２６）遺伝子とし、
その配列を配列番号５に示す。また、この塩基配列がコ
ードすると推定されるアミノ酸配列を配列番号６に示
す。

【０１１４】なお、このアミノ酸配列を一文字法で表す
と以下のようになる。『MPNYKLTYFNMRGRAEIIRYIFAYLDIQ
YEDHRIEQADWPEIKSTLPFGKIPILEVDGLTLHQSLAIARYLTKNTDLA
GNTEMEQCHVDAIVDTLDDFMSCFPWAEKKQDVKEQMFNELLTYNAPHLM
QDLDTYLGGREWLIGNSVTWADFYWEICSTTLLVFKPDLLDNHPRLVTLR
KKVQAIPAVANWIKRRPQTKL 』 〔上記アミノ酸配列において、Ａ：アラニン，Ｖ：バリ
ン，Ｌ：ロイシン，Ｉ：イソロイシン，Ｐ：プロリン，
Ｆ：フェニルアラニン，Ｗ：トリプトファン，Ｍ：メチ
オニン，Ｇ：グリシン，Ｓ：セリン，Ｔ：トレオニン，
Ｃ：システイン，Ｑ：グルタミン，Ｎ：アスパラギン，
Ｙ：チロシン，Ｋ：リシン，Ｒ：アルギニン，Ｈ：ヒス
チジン，Ｄ：アスパラギン酸，Ｅ：グルタミン酸，をそ
れぞれ示す。〕

【０１１５】また、本発明Ｔｈ２（Ｅ２６）遺伝子を大
腸菌（Ｅ.coli K12-JM109 株）に組み込んだこの形質転
換体は、Ｅ２６ ｃＤＮＡとして、工業技術院生命工学
研究所に寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１５６１７で寄託され
ている。

【０１１６】（６）インビトロにおける本発明Ｔｈ２
（Ｅ２６）遺伝子の転写及び翻訳 市販のキット（ストラタジーン社製）を用いて、本発明
Ｔｈ２（Ｅ２６）遺伝子を鋳型として、Ｔ７ＲＮＡポリ
メラーゼを用いてＲＮＡを合成した。続いて³⁵Ｓメチオ
ニンの存在下に、市販のウサギ網状赤血球抽出物（プロ
メガ バイオテク社製）を用いてインビトロ翻訳を行っ
た。次いで、その翻訳産物をレムリ（Laemmli ）の方法
に従い、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動で分析し
た。その結果、予測された分子量である２３Kdと近似し
た分子量を有する単一のタンパク質が作られていること
を確認した（第２図）。

【０１１７】（７）ｍＲＮＡ発現の組織特異性 本発明Ｔｈ２（Ｅ２６）遺伝子由来のｍＲＮＡ発現の組
織特異性を調べるために、種々の組織に由来する細胞株
の全ＲＮＡについてのノーザンブロッティング解析を行
った。その結果、用いたいずれの細胞株でも本発明Ｔｈ
２（Ｅ２６）遺伝子由来のｍＲＮＡの発現が確認できな
かった（第３図）。従って、本発明Ｔｈ２（Ｅ２６）遺
伝子の発現は、Ｔｈ２細胞を含む特定の細胞に限定され
ることが明らかになった。

【０１１８】〔実施例２〕大腸菌リコンビナント本発明
Ｔｈ２（Ｅ２６）タンパク質の製造（１）本発明Ｔｈ２
（Ｅ２６）遺伝子発現ベクターの製造 本発明Ｔｈ２（Ｅ２６）遺伝子の全長（配列番号５）を
含むプラスミドＤＮＡ（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ
（−）、上記Ｅ２６ ｃＤＮＡから単離）からこの遺伝
子のコード領域を含むインサートＤＮＡを制限酵素Ｐｓ
ｔＩおよびＥｃｏＲＩを用いて切り出し、アガロース電
気泳動で精製した。このようにして得たＥ２６遺伝子断
片（配列番号５の４２番目から８６２番目に相当する配
列の３’末端に、ｃＤＮＡクローニングに使用したＥｃ
ｏＲＩアダプターが連結した状態）をｐｃＤＬ−ＳＲα
のＰｓｔＩ，ＥｃｏＲＩサイトに挿入し、所望する哺乳
動物細胞用の発現プラスミドｐｃＤＬ−ＳＲα／Ｅ２６
を得た。

【０１１９】一方、大腸菌用の発現プラスミドを以下の
ようにして作製した。まず、ｃＤＮＡクローンＥ２６を
鋳型にして、ＢａｍＨＩサイト及びエンテロキナーゼ認
識切断部位をコードする塩基配列を含むセンスプライマ
ー〔５’−ＣＣＧ ＡＧＡ ＧＧＡ ＴＣＣ ＧＡＴ
ＧＡＣ ＧＡＴ ＧＡＣ ＡＡＡ ＡＴＧ ＣＣＡ Ａ
ＡＣ ＴＡＣ ＡＡＡ ＣＴＣ ＡＣＴ Ｔ−３’（配
列番号７）〕及びＨｉｎｄＩＩＩサイトを含むアンチセ
ンスプライマー〔５’−ＣＧＧＡＡＣ ＡＡＧ ＣＴＴ
ＧＡＡ ＧＧＣ ＡＡＣ ＡＴＧ ＧＡＴ ＣＡＧＣ
ＴＡ−３’（配列番号８）〕を用いて本発明Ｔｈ２（Ｅ
２６）遺伝子のコード領域全長をＰＣＲで増幅した。こ
のＰＣＲは、耐熱性ポリメラーゼ（ストラタジーン社
製）を用いて、９６℃・３０秒，６０℃・１分，７６℃
・３分を１サイクルとしする熱サイクルを１０サイクル
行った。このＰＣＲによって得られたＰＣＲ産物を、フ
ェノール／クロロホルム抽出及びエタノール沈殿により
精製した後、制限酵素（ＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩ）
で消化し、この消化物をアガロース電気泳動で精製し
た。得られた精製ＤＮＡをｐＱＥ３０（ＱＩＡＧＥＮ社
製）のＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩサイトに挿入し、所
望する大腸菌用の発現プラスミドｐＱＥ／Ｅ２６を得
た。

【０１２０】（２）リコンビナント本発明ヒトＴｈ２
（Ｅ２６）タンパク質の製造 リコンビナント本発明ヒトＴｈ２（Ｅ２６）タンパク質
を得るために、まず上述の大腸菌用の発現プラスミドｐ
ＱＥ／Ｅ２６で大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。次に
形質転換体をＴＢ培地２０ml中で３７℃で一晩振盪培養
を行った。次に得られた形質転換体をＴＢ培地で５０倍
に希釈して１l とし、さらに３７℃での培養を継続し
た。６００nmでの吸光度が１．０になった時点で、終濃
度０．５mlになるようにＩＰＴＧ（シグマ社製）を添加
し、さらに６時間振盪培養を行った。得られた培養物に
遠心処理を施して集菌してＰＢＳで洗浄後、菌を溶解液
（50mM Tris/HCl, 1M NaCl, 10％ グリセリン, 1 mM
フェニルメチルスルフォニルフルオライド, 1 ％トリト
ンX-100, pH7.5）３０mlに再浮遊させ、氷中で冷しなが
ら超音波破砕した。

【０１２１】この超音波破砕産物に遠心処理を施し、そ
の遠心上清にＮｉ−ＮＴＡagarose（ＱＩＡＧＥＮ社
製）４mlを加え、４℃で一晩攪拌した。翌日、反応後の
Ｎｉ−ＮＴＡagarose をカラムに充填し、上述の溶解液
でよく洗浄後、０〜６００mMのイミダゾール濃度勾配洗
浄液６０mlで溶出し、２mlずつ分画した。各フラクショ
ンをＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動で解析し、夾雑
蛋白質の混入が少ないフラクションをプールした。その
結果、純度９５％以上のリコンビナント本発明ヒト（Ｅ
２６）タンパク質を得た（第４図）。

【０１２２】〔実施例３〕本発明ヒト（Ｅ２６）タンパ
ク質に対するモノクローナル抗体の製造 （１）動物への免疫 上記実施例２により得た、リコンビナント本発明ヒト
（Ｅ２６）タンパク質のＰＢＳ溶液（１mg/ml)を等量の
フロイント完全アジュバントと混和し、その０．１mlを
７週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（雌）の背部皮下に免疫し
た。２週間後、フロイント不完全アジュバントを使用し
て同様の免疫を行い、それ以降は２週間に１回，計２〜
４回、上記ＰＢＳ溶液（０．５mg/ml)０．１mlを腹腔に
注入して免疫した。

【０１２３】（２）ハイブリドーマの調製 最終免疫の３日後のマウスの脾臓細胞１０⁸ 個をマウス
ミエローマ細胞株ＳＰ２／０−Ａｇ１４（２ｘ１０
⁷ 個）と混和し、５０％ポリエチレングリコール（平均
分子量１５００）ＰＢＳ溶液（シグマ社製）を用いて細
胞融合を行った。

【０１２４】処理後の細胞を９６ウエルプレートにウエ
ルあたり１ｘ１０⁵ 個の割合で播き、翌日からＨＡＴ試
薬（シグマ社製）を添加し、１０日間選択培養を行った
ところ、ほぼ全ウエルにハイブリドーマの増殖が認めら
れた。各ハイブリドーマの培養上清中のＥ２６特異的モ
ノクローナル抗体の存在の有無は、上述した本発明ヒト
（Ｅ２６）タンパク質を抗原としたＥＬＩＳＡ法でスク
リーニングした。

【０１２５】すなわち、クローン細胞Ｅ２６を固相化し
た９６ウエルプレートにハイブリドーマの培養上清５０
μl を加え、よく混和後、室温で１時間反応させた（１
次反応）。次に０．１％ツィーン２０を含むＰＢＳ（洗
浄液）で５回洗浄後、パーオキシダーゼ標識ヤギ抗マウ
スイムノグロブリン抗体（Bio source International社
製）を室温で１時間反応させた（２次反応）。再び系を
洗浄液で５回洗浄後、ＡＢＴＳ試薬（シグマ社製）で発
色させた（基質反応）。この反応において発色が認めら
れたサンプルを陽性とした。

【０１２６】（４）モノクローナル抗体の製造 上記スクリーニング法で陽性であったハイブリドーマ培
養上清については、以下のようにしてＣＯＳ７細胞に発
現させた本発明ヒトＴｈ２（Ｅ２６）タンパク質との反
応性を調べ、特異性を確認した。すなわち、まず上述し
た哺乳動物細胞用の発現プラスミドｐｃＤＬ−ＳＲα／
Ｅ２６をリポフェクチン試薬（ライフテクノロジー社
製）を用いてＣＯＳ７細胞に遺伝子導入した。２日後に
細胞をスライドグラス上に塗抹し、３％パラフォルムア
ルデヒド／ＰＢＳで室温、１０分間固定した。この固定
細胞上にハイブリドーマ培養上清を滴下し、室温で３０
分間反応させた（１次反応）。

【０１２７】系をＰＢＳで洗浄後、フルオレセインイソ
チオシアネート標識ヤギ抗マウスイムノグロブリン抗体
（Bio source International社製）を滴下し室温で３０
分間反応させた（２次反応）。再びＰＢＳで洗浄後、５
０％グリセリン／ＰＢＳで封じ、蛍光顕微鏡で蛍光の有
無を観察した。対照のＣＯＳ７細胞とは反応せず、ｐｃ
ＤＬ−ＳＲα／Ｅ２６を遺伝子導入したＣＯＳ７細胞と
のみ反応するハイブリドーマ培養上清が、本発明ヒトＴ
ｈ２（Ｅ２６）タンパク質に特異的なモノクローナル抗
体を含むと判定した。

【０１２８】このようにして特異性が確認されたハイブ
リドーマ細胞について、９６ウエルプレートにウエルあ
たり０．３細胞を播くクローニング操作を２〜３回繰り
返し、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを確立し
た。

【０１２９】これらのハイブリドーマのうち１つは、Ｍ
ｏｕｓｅ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ＡＥ３Ｃとして、工業
技術院生命工学研究所に寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１６２
１５で寄託されている。

【０１３０】このモノクローナル抗体（Ｍｏｕｓｅ Ｈ
ｙｂｒｉｄｏｍａ ＡＥ３Ｃ）を用いて、ウエスタンブ
ロッティング法でＴｈ１、およびＴｈ２クローン細胞に
おける本発明ヒトＴｈ２（Ｅ２６）タンパク質の発現を
解析した結果を第５図に示す。第５図において、本発明
ヒトＴｈ２（Ｅ２６）タンパク質は、Ｔｈ１に比べてＴ
ｈ２細胞に優勢に発現していることが確認された。

【０１３１】

【発明の効果】本発明により、上記のＴｈ１／Ｔｈ２サ
ブセットの分布における極性化における知見に基づい
た、免疫関連疾患の病勢や病型の特定手段の重要な要素
となるヒトＴｈ２特異的遺伝子及びヒトＴｈ２特異的タ
ンパク質が提供される。また、本発明により、このヒト
Ｔｈ２特異的遺伝子を含む遺伝子発現用組換えベクタ
ー、及びこの遺伝子発現用組換えベクターで形質転換さ
れた形質転換体が提供される。さらに、本発明により上
記ヒトＴｈ２特異的タンパク質を抗原とするポリクロー
ナル抗体及びモノクローナル抗体とこれを産生するハイ
ブリドーマが提供される。

【配列表】

【０１３２】配列番号：１ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 AGTTACACGT CTAGAATGGC T 21

【０１３３】配列番号：２ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 AGCCATTCTA GACGTGTAA CTGATA 25

【０１３４】配列番号：３ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CTCTTGCTTG AATTCGGACT A 21

【０１３５】配列番号：４ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TAGTCCGAAT TCAAGCAAG AGCACA 25

【０１３６】配列番号：５ 配列の長さ：８６２ 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：不明 配列の種類：ｃＤＮＡ 起源 ヒトＴｈ２（Ｅ２６）遺伝子 配列 ATAAACCCAA GGCACAGTCA CATACCCAGG GATACAAGAC ACTGCAGACT CCCGAGAGAC 60 ATAACACAGA ATTGCACCAT GCCAAACTAC AAACTCACTT ATTTTAATAT GAGGGGGAGA 120 GCAGAAATTA TTCGTTACAT ATTTGCTTAT TTGGACATAC AGTATGAAGA CCACAGAATA 180 GAACAAGCTG ACTGGCCTGA AATCAAATCA ACTCTCCCAT TTGGAAAAAT CCCCATTTTG 240 GAAGTTGATG GACTTACTCT TCACCAGAGC CTAGCAATAG CAAGATATTT GACCAAAAAC 300 ACAGATTTGG CTGGAAACAC AGAAATGGAA CAATGTCATG TTGATGCTAT TGTGGACACT 360 CTGGATGATT TCATGTCATG TTTTCCTTGG GCAGAGAAAA AGCAAGATGT GAAAGAGCAG 420 ATGTTCAATG AGCTGCTCAC GTATAATGCG CCTCATCTTA TGCAAGACTT GGACACATAT 480 TTAGGGGGGA GAGAATGGCT TATTGGTAAC TCTGTAACTT GGGCAGACTT CTACTGGGAG 540 ATTTGCAGTA CCACACTTTT GGTCTTTAAG CCTGACCTGT TAGACAACCA TCCAAGGCTG 600 GTGACTTTAC GGAAGAAAGT CCAAGCCATT CCTGCCGTCG CTAACTGGAT AAAACGAAGG 660 CCCCAAACCA AACTCTAGCT GATCCATGTT GCCTTCAAGT TTGTTTTTCT CGGGGGCATC 720 TCTCTCATCA GATAAGACAG CTACATCAGC CTGCCAGATA ATCCACATGC TCCCTCCCCA 780 GCTCCACTAA GATTTTCACT TTAGCCATAT TCTGATTTTT AAAAAGGAAA ATAAAAACAA 840 ATCTTTCTTC AGTAAAAAAA AA 862

【０１３７】配列番号：６ 配列の長さ：２２３ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：不明 配列の種類：蛋白質 起源 ヒトＴｈ２（Ｅ２６） 配列 Met Pro Asn Tyr Lys Leu Thr Tyr Phe Asn Met Arg Gly Arg Ala Glu 16 Ile Ile Arg Tyr Ile Phe Ala Tyr Leu Asp Ile Gln Tyr Glu Asp His 32 Arg Ile Glu Gln Ala Asp Trp Pro Glu Ile Lys Ser Thr Leu Pro Phe 48 Gly Lys Ile Pro Ile Leu Glu Val Asp Gly Leu Thr Leu His Gln Ser 64 Leu Ala Ile Ala Arg Tyr Leu Thr Lys Asn Thr Asp Leu Ala Gly Asn 80 Thr Glu Met Glu Gln Cys His Val Asp Ala Ile Val Asp Thr Leu Asp 96 Asp Phe Met Ser Cys Phe Pro Trp Ala Glu Lys Lys Gln Asp Val Lys 112 Glu Gln Met Phe Asn Glu Leu Leu Thr Tyr Asn Ala Pro His Leu Met 128 Gln Asp Leu Asp Thr Tyr Leu Gly Gly Arg Glu Trp Leu Ile Gly Asn 144 Ser Val Thr Trp Ala Asp Phe Tyr Trp Glu Ile Cys Ser Thr Thr Leu 160 Leu Val Phe Lys Pro Asp Leu Leu Asp Asn His Pro Arg Leu Val Thr 176 Leu Arg Lys Lys Val Gln Ala Ile Pro Ala Val Ala Asn Trp Ile Lys 192 Arg Arg Pro Gln Thr Lys Leu 199

【０１３８】配列番号：７ 配列の長さ：４９ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CCGAGAGGAT CCGATGACGA TGACAAAATG CCAAACTACA AACTCACTT 49

【０１３９】配列番号：８ 配列の長さ：３３ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CGGAACAAGC TTGAAGGCAA CATGGATCAG CTA 33

【図面の簡単な説明】

【図１】Ｅ２６クローンのノーザンブロッティング解析
の結果を示す電気泳動写真像等を示した図面である。

【図２】インビトロにおける本発明Ｔｈ２（Ｅ２６）遺
伝子の翻訳産物の電気泳動写真像等を示した図面であ
る。

【図３】本発明Ｔｈ２（Ｅ２６）遺伝子由来のｍＲＮＡ
発現の組織特異性を示すノーザンブロッティング解析の
結果を示す電気泳動写真像等を示した図面である。

【図４】リコンビナント本発明ヒトＴｈ２（Ｅ２６）タ
ンパク質を、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動で解析
した結果を示した図面である。

【図５】モノクローナル抗体を用いて、ウエスタンブロ
ッティング法でＴｈ１、およびＴｈ２クローン細胞にお
ける本発明ヒトＴｈ２（Ｅ２６）タンパク質の発現を解
析した結果を示す図面である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｋ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 33/577 Ｂ 33/577 Ｃ１２Ｎ 1/21 // Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 7823−4Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 高野 昇一 埼玉県川越市的場1361番地１ 株式会社ビ ー・エム・エル総合研究所内

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】配列番号６で表されるアミノ酸配列のヒト
   Ｔｈ２特異的タンパク質。
2. 【請求項２】配列番号６で表されるアミノ酸配列の一部
   のアミノ酸が欠失，置換若しくは付加されたアミノ酸配
   列からなり、かつ請求項１記載のヒトＴｈ２特異的タン
   パク質と実質的に同一の生物学的活性を有するヒトＴｈ
   ２特異的タンパク質。
3. 【請求項３】配列番号６で表されるアミノ酸配列をコー
   ドする塩基配列を含むヒトＴｈ２特異的遺伝子。
4. 【請求項４】配列番号５で表される塩基配列のヒトＴｈ
   ２特異的遺伝子。
5. 【請求項５】配列番号５で表される塩基配列の一部の塩
   基が欠失，置換若しくは付加された塩基配列からなり、
   かつストリンジェントな条件下で配列番号５で表される
   塩基配列のＤＮＡとハイブリダイズし、さらに配列番号
   ６で表されるアミノ酸配列を有するヒトＴｈ２特異的タ
   ンパク質と実質的に同一の生物学的活性を有するヒトＴ
   ｈ２特異的タンパク質をコードするヒトＴｈ２特異的遺
   伝子。
6. 【請求項６】請求項３乃至請求項５のいずれかの請求項
   記載のヒトＴｈ２特異的遺伝子を含有する遺伝子発現用
   組換えベクター。
7. 【請求項７】請求項６記載の遺伝子発現用組換えベクタ
   ーで形質転換され、かつこの遺伝子発現用組換えベクタ
   ーに含まれているヒトＴｈ２特異的遺伝子が発現してい
   る形質転換体。
8. 【請求項８】請求項１又は請求項２記載のヒトＴｈ２特
   異的タンパク質のいずれかの部分を抗原決定基とし、か
   つヒトＴｈ１特異的タンパク質との間においては免疫反
   応性を示さないモノクローナル抗体。
9. 【請求項９】請求項８記載のモノクローナル抗体を産生
   するハイブリドーマ。