JPH06503003A - ストレプトリシンｏ誘導体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ストレプトリジンＯ誘導体 本特許文書の開示の一部は、著作権保護の対象となる要素を含んでいる０本署作 権所有者は、特許商標庁のファイルまたは記録に表れるような特許文書または特 許開示の何人かによる転載に異議はないが、その他の場合は、すべての著作権の 権利を保持するものである。

関連出願 本出願は、クレイグＷ、アダムス（Ｃｒａｉｇ　Ｗ、Ａｄａｍｓ）によるｒスト レプトリジン０バリエンド（Ｓｔｒｅｐｔｏ　１ｙｓｉｎ　ＯＶａｒｉｅｎｔｓ ）Ｊと表題のついた米国出願番号第一（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｄｏｃｋｅｔ　Ｎｏ、 １２８Ｄ−１２２）およびクレイグＷ、アダムス（Ｃｒａｉｇ　Ｗ、ＡｄａｍＳ ）およびパティ・バング（Ｐａｔｔｙ　Ｐａｎｇ）による？ストレプトリジン０ 誘導体およびバリエンドの抗体（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｔｏ　５ｔｒｅｐｔｏ ｌｙｓｆｎ　ＯＤｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ　ａｎｄ　Ｖａｒｉｅｎｔｓ）Ｊと表題 のついた米国特許出願番号第　（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｄｏｃｋｅｔ　Ｎｏ。

１２８Ｄ−１２３）に関連する。この二つの出願は、今回同時に提出されていて 、ここでは参考のために記載した。

発明の分野 本発明は、ストレプトリジン〇一般に関し、さらに詳細には、組換えＤＮＡ技術 により産生されたストレプトリジンＯ誘導体に関す発明の背景 本明細書には、抗原物質であるストレプトリジンＯの誘導体融合生成物であるが 開示されている。ストレプトリジン０は、人間の場合、たとえば、リウマチ熱と 関連しているので、ストレプトリジンＯに対する免疫応答の証拠についての免疫 診断アッセイが、日常的に用いらてれている。ストレプトリジン０の開示した誘 導体変種は、組換えＤＮＡ技術により製造され、形質発現により可溶であり、野 生型ＳＬＯに結合し得る少なくともひとつの抗体により束縛され得るものであり 、溶血活性である０本発明以前は、ストレプトリジン０は、バクテリアストレブ トコッカスビョゲネス（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ）を経 て得ることができた。ストレプトリジン０の毒性と病原特性は、赤血球の溶菌に より典型的にモニターされる。

■、ｌ旦豊号」ユニ上玉 特定のたんばく質たとえばストレプトリジン０（以下ｒｓＬＯＪｌとする）の遺 伝子コードは、？コドン１と呼ばれる３つのヌクレオチドの逐次群別とそのよう なコドンの相互の関係の配列に依存する。

ｒヌクレオチドｊは、ヌクレオシドと１つまたはそれ以上のりん酸基からなって いる。ｒヌクレオシドｊは、ペントース糖に結合した窒素性塩基からなっている 。ｒへントース１糖は、５つの炭素原子を含んでいる。デオキシリボ核酸すなわ ちｒＤＮＡＪの分子中では、ペントース糖は、ｒデオキシリボース１であり、窒 素性塩基は、７ｆ＝ン（ｒＡＪ）、’；ｆ７ニン（ｒＧＪ）、チミン（ｒＴＪ） ＊たはシトシン（ｒｃＪ）である、リボ核酸すなわちｒＲＮＡＪの分子中では、 ペントース糖は、ｒリボース１であり、窒素性塩基は、ウラシル（ｒＵＪ）がチ ミンに取って替わること以外ＤＮＡについてと同じである。３つの種類のＲＮＡ である、メツセンジャーＲＮＡすなわちｒｍＲＮＡＪ　、　転移ＲＮＡｔなｔ） ちｒｔＲＮＡＪ　およＵリポソームすなわちｒｒＲＮＡＪは、ＲＮＡ中のコード 化した遺伝情報をたとえばポリペプチドまたはたんばく質に翻訳する。このよう に遺伝情報は、通常、次のように転移される：　ＤＮＡ−ＲＮＡ−たんばく質。

ＤＮＡ分子の窒素性塩基の配列は、その分子に含まれる遺伝情報を暗号化する。

ＤＮＡ分子の糖およびりん酸基は、構造的な役割を行い、ＤＡＮ　ｒ巨大分子１ と呼ばれる一連のＤＮＡ分子の主鎖を形成する。ＤＮＡは、ヌクレオチド鎖の２ つの相補鎖からなり、これらの鎖は、（比較的に）弱い水素結合により一緒に保 たれている。

それぞれのＤＮＡ分子の塩基は互いに結合している：Ａは、常にＴと、Ｃは、常 にＧと結合している。したがって、第１の鎖の配列５’−ＡＴＣＧ−３°は、他 方の鎖の相補配列５°−ＴＡＧＣ−３°にすぐに向き合っている。これは、ｒ相 補塩基対合１と呼ばれる。相補塩基対合のプロセスは、ｒハイブリッド形成１と 呼ばれ、安定なりＮＡ巨大分子の形成をもたらす。

それぞれのコドンは、１つのアミノ酸を指定する。ｒアミノ酸」は、たんぽ（質 の主要成分であり、ｒたんば（質１はすべての生きている細胞の必須成分である 。２０の天然のアミノ酸がある。４つのヌクレオチド塩基（Ａ％Ｃ％ＧおよびＴ ）と３つのヌクレオチドがコドン１つ当たりにあるので、６４の可能なコドン（ ４ｓ）がある、したがって、わずか２０個の天然のアミノ酸があるだけなので、 はとんどのアミノ酸は、２つ以上のコドンにより指定される。

これは、ｒ重複性１またはｒ縮退１゛と呼ばれる。たとえば、コドンＧＣＧ、Ｇ ＣＡ、ＧＣＴおよびＧＣＣはすべて、アミノ酸アラニンについてコード化する。

コドンＡＴＧ　（Ｍｅｔアミノ酸コドン）は、正常なｒ読み始め１コドンである 。アミノ酸に対してコード化しないコドンＴＡＡ、ＴＡＧおよびＴＧＡは、正常 なｒ停止１コドンである。ｍＲＮＡの゛情報は、得られる１本鎖ｍＲＮＡがＤＮ Ａの１本鎖の配列に相補的なヌクレオチド配列を持つように２重鎖Ｄ　Ｎ　Ａ巨 大分子の１本の鎖の読み始めコドンに基づいて確立される。停止コドンが、ＤＮ Ａ分子に沿いｍＲＮＡにより到達されると、翻訳は停止する。

ｍ、　ＲＮ　Ａから翻訳されたＤＮＡ巨大分子に沿う領域は、真核生物について はｒエクソン１と呼ばれ、原核生物についてはｒ翻訳された領域１と呼ばれる。

ｒ遺伝子１は、エクソン（真核生物）および翻訳された領域（原核生物）−を含 む、したがって、遺伝子はたんぽ（質および／またはポリペプチドについてコー ド化する。たとえば、は乳動物は、真核生物であり、バクテリアは、原核生物で ある。

たんぽ（質の天然の合成は、一連のいくつかの段階にわたり起こる。第１の段階 は、上記したようにＤＮＡ巨大分子に相補的なｍＲＮＡの形成である。その後、 ｔＲＮＡが形成される；ｔＲＮＡは、ｍ　ＲＮ　Ａ巨大分子上のそれぞれのコド ンについて相補的なコドン（ｒアンチコドン１）を与える。その後、ｒＲＮＡは 、ｍ　ＲＮ　Ａ：ｔＲＮＡから生じたコドン特異性アミノ酸（ｃｏｄｏｎ−ｓｐ ｅｃｉｆｉｃ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ）の集合を触媒してたんぽ（質および／ またはポリペプチドにすることになる。

Ｉｌ、徂ｍ≦口り忙皮皿 はとんどのたんばく質は、非常に少量、天然につくられる６組み換えＤＮＡ技術 の８現は、以前そのような少量でのみ得られたたんばく質の多量の産生を可能と した。

以下は、クローニングに用いられる典型的なバクテリアホストである大腸菌、ニ スケリチア　コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃ。

１ｉ）に適用されるであろうｒ典型的な１遺伝子操作についての説明である。

遺伝子を単離するためすなわちｒクローン化１するため、ＤＮＡライブラリーは 、ベクターを用いてＤＮＡ配列（ゲノムと呼ばれる）から構成される。ｒベクタ ー１は、バクテリア、イーストおよびは乳動物の細胞に天然に存在する２本鎖Ｄ ＮＡの小さな円形の分子である。ベクターは、通常、次に示す性質を有している ：　（ｉ）ベクターが、適当なホスト細胞（たとえばＥ、コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ） に保持されるであろうことを確実にする選択可能なｒマーカー１をコード化する ＤＮＡ配列；（ｉｉ）調節可能な転写プロモーター−−ｒ調節可能な１とは、た とえばベクターの環境の操作によりプロモーターがｒスイッチを入れられる１こ とができることを意味し；ｒプロモーター」は、スイッチが入れられるとベクタ ーに組み込まれた関心のもたれる遺伝子から多量のｍＲＮＡを生じるＤＮＡ配列 の領域である一一異なるプロモーター（たとえば、上ａＣ５ｍ、見且旦など）は 、ｍＲＮＡ産主の産生る速度を有する；（ｉ　ｉ　ｉ）翻訳調節配列、たとえば 、適当に位置したＡＴＧ読み始めコントン；および（ｉ　ｖ）ポリリンカー；ｒ ポリリンカー１は、ベクター内の正しい配向での関心のもたれる遺伝子の組み込 みを単純化する。ベクターは、関心のもたれる遺伝子が、読み始めコドンの隣に 組み込まれるようにベクターに位置したＡＴＧ読み始めコドンの両側に制限エン ドヌクレアーゼ部位を与えるように仕組まれ得る；このことは、プロモーター遺 伝子の活性化で遺伝子の即座の転写を考慮する。

ｒ制限エンドヌクレアーゼ」は、長さが４〜８のヌクレオチドの指定された配列 で２本鎖のＤＮＡを切断する酵素であり、多（の制限エンドヌクレアーゼは、切 断箇所で短い１本鎖のテイルをのこすスタガードカットをつ（る、この末端は、 他の粘着性の末端と相補的な塩基対を形成し得るのでｒ粘着末端（ｃｏｈｅｓｉ ｖｅ　ｅｎｄまたは５ｔｉｃｋｙ　ｅｎｄ）Ｊと呼ばれる。ゲノムは、ベクター を切断するために用いた制限エンドヌクレアーゼに相当する指定された制限エン ドヌクレアーゼにより切断され（ｃｕｔ−ｕｐ）、切断されたゲノムのそれぞれ の小片は、ベクターに組み込まれる。

特定の制限エンドヌクレアーゼによる細胞の全ゲノムを無作為的に切断すること は、ゲノムクローニングへのｒショットガン１アプローチと典型的に呼ばれる。

ショットガンアプローチは、非常にだ（さんのＤＮＡ断片を生じさせ得、そのす べてが、ベクターに組み込まれる。

個々の小片のゲノムおよびベクター（対応する粘着末端を有する）は、互いに「 融合され１すなわちｒアニールされ１て、ベクターとゲノムの一部を含んでなる 円形ハイブリッドＤＮＡ　ｒブラダミド１を形成する。

ブラズミドは、次に、ホスト細胞に導入される。２種類のホスト細胞ｒ真核ホス ト細胞１とｒ原核ホスト細胞１がある。真核ホスト細胞の例は、チャイニーズハ ムスター卵巣（ｒｃＨＯＪ）であり、原核ホスト細胞の例は、Ｅ、コリバクテリ アである。以下の説明の目的から、原核ホスト細胞に特に注目する。

ブラズミドが、ホスト細胞に導入されると、これらの細胞は、ブラズミドにより ｒ形質転換１されていると呼ばれる。細胞が成長し、分裂すると、ブラズミドは 、同様に複製して、ＤＮＡ断片を含むブラズミドのコピーを生じる。それぞれの 形質転換された細胞は、ｒゲノムＤＮＡクローン１と呼ばれ、異なるＤＮＡ断片 のすべてを含む形質転換された細胞の全集合は、ｒゲノムＤＮＡライブラリー１ と呼ばれる。

とのゲノムＤＮＡクローンが、対応するｍ　ＲＮ　Ａにコピーされ得るＤＮＡ配 列を含むかを決定するのには、ゲノムＤＮＡクローンを分離すなわちｒスクリー ニング１する必要がある。これを行うのには、いくつかの方法があり、たとえば 、放射性ＤＮＡプローブまたは免疫反応性の証拠の使用がある。認められるよう に、定義よりショットガンアプローチが、かなりの数のゲノムＤＮＡクローンの 形成をもたらし、これは、関心のもたれる可能性のある候補を見つけるようにス クリーニングされねばならないので、スクリーニングは、極端に労働集約的なプ ロセスとなろう。

ＩＩｌ、ムΣ２１土ユ之之旦 ストレプトリジン０（ｒｓＬＯＪ）は、およその分子量約６５゜ＯＯＯ〜約７０ ，０００ダルトンを有している。ＳＬｏは１．４つの異なる属（ストレプトコッ カス（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、バシラス（ｂａａ　ｉ　１１　ｕｓ）　 、クロストリジウム（ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）およびリステリア（ｌｉｓｔｅ ｒｉａ））に属するダラム陽性バクテリア種により生じる酸素感受性（「チオー ル活性化された１）、細胞破壊（ｒ細胞溶解性Ｊ）Ｉ！素（ｒ細胞毒１）の種類 に属する。

ＳＬＯは、膜コレステロールと相互作用し、広範囲のは乳動物細胞に細胞溶解性 −細胞毒性作用を示す、さらに、ＳＬＯは、非常に効果的な心臓毒性を有してい る。ＳＬＯと関連する毒性および病原性性質のひとつは、溶血活性であり、すな わち、ＳＬＯは、赤血球を溶解し、ヘモクロビンの放出をもたらす、ＳＬＯは、 比較的少ない投与量で実験動物に死をもたらし得る。ＳＬＯの動物への注入は、 その動物の即座の死を典型的にもたらす。

ＳＬＯは、指定されたバクテリア種により生じ得るので、これらの種が、は乳動 物ホストをｒ襲う」と、バクテリアにより放出されたＳＬＯが、異種たんばく質 としてホストにより扱われる。すると、ＳＬＯは、抗原である。「抗原１は、を 椎動物の血液流に入るとＢ型の小さなリンパ球のリンパ芽球への変換を刺激する 高分子化合物である。リンパ芽球は、抗原刺激因子に特異性の抗体を分泌する。

抗体は、刺激抗原の反応特性すなわち反応部位に対して特異的に相補的な反応部 位を有するたんぽ（質である０通常、抗体は、抗原粒子または分子に、免疫学的 に活性部位すなわちｒエピトープ１を占めることによりホスト有機体に対して抗 原を無害とさせる性質を有している。抗ＳＬＯ抗体（ｒＡｓＯＪ）は、したがっ て、ホスト中へのＳＬＯの分泌に応答してホストにより生成される。現在の連鎖 球菌性感染またはその後遺症（病気または障害の後続作用）の各人の約８０−８ ５％は、上昇したレベルのＡＳＯを証明するであろう。

ＳＬＯを分泌する指定し７たバクテリア種による前のおよび／または現在の感染 の測定は、たとえば、ＳＬＯの溶血特性またはＡＳＯのＳＬＯへの結合に依存す る免疫診断アッセイ技術を用いることにより可能である。ＳＬＯについての溶血 免疫診断アッセイに焦点を当てると、患者のサンプルを、その患者とは異なる給 源から得られた既知量のＳＬＯに加え、この混合物を既知量の赤血球たとえばう さぎの赤血球に加える。ＳＬＯは、溶血特性を有するので、これは、これらの赤 血球を溶解することになる。しかしながら、ＡＳＯがＳＬＯに結合すると、ＳＬ Ｏの溶血特性は中和される。したがって、サンプルが、現在の連鎖球菌性感染ま たはその後遺症を賽する患者から得られるなら、サンプルに上昇したレベルのＡ ＳＯがあるであろう、したがって、混合物が、高いレベルの溶血活性をもたらす なら、このことは、あるとしても血清サンプル中にＡＳＯがほとんどないことを 示しくしたがって、ＳＬＯ分泌バクテリアからの感染があったとして゛もほとん どない）、その理由は、混合物中のＳＬＯの既知量は、混合物中の既知量の赤血 球を溶解し得るからである。混合物が、溶血活性につながらないなら、このこと は、サンプル中のＡＳＯの量が、混合物中のＳＬＯの既知量を不活性化するのに 十分であることを示す、研究者は、ＡＳＯのそのような量をｒタイター」と呼ぶ 、典型的には約３００国際単位／　ｍ　ｌより大きいＡＳＯタイターは、ＳＬＯ を分泌し得るバクテリア源による感染を示す。ＳＬＯを分泌するバクテリアによ る感染を測定する他の免疫診断アッセイには、比濁プロトコールおよび混濁度プ ロトコールがある。

上記に概説した免疫診断アッセイ法を用いるためには、混合物に加久る十分なＳ ＬＯへの到達が必要である。ＳＬＯの１つの給源は、バクテリアストレブトコッ 力スビョゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（ｒｓ、ピ ョゲネス」）を含む培養ブイヨンである。しかしながら、このようにしてＳＬＯ を得ることは、極めて困難であり費用がかかる：Ｓ、ピョゲネス培養ブイヨン１ リッターに対し、わずか約０．５ｍｇのＳＬＯが期待でできるだけである；Ｓ、 ビョゲネスを成長させる典型的な媒体は、高価である；Ｓ、ビョゲネスは、クラ ス２病原体である；このようにして得られるＳＬＯは、多（の他の抗原物質を含 んでいる。さらに、この手順で得られるＳＬＯは、液体の状態において不安定で ある傾向がある。したがって、そのようなＳＬＯ調剤（ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｓ）は、薬ビンに入れた乾燥凍結粉末としておおくは典型的に供給される。使用 前に、凍結乾燥粉末は、適当な溶剤で元に戻すことが必要である。残念なことに は、そのような元に戻されたＳＬＯは、その溶血活性を迅速に失い、したがって 、元に戻されてから短期間で使用されないなら廃棄されな（ではならない。この ことは１つの顕著な否定的な結果を有する二個々の血清サンプルを入手すると直 にテストすることは通常不可能である。よって、溶血活性に基づいてＡＳＯアッ セイを行う実験室は、凍結乾燥したＳＬＯの経済的な使用を可能とするように十 分な数が集まるまで個々のサンプルを保存するのが典型的である。このことは、 テスト結果を得るのに過度な後れをもたらし得る。

比濁プロトコールまたは混濁度プロトコールに依存するＡＳ○アッセイは、有意 的な量の精製ＳＬＯを必要とする。Ｓ、ビョゲネスから有意的な量の精製ＳＬＯ を得ることに関連する費用は、多くかかるので、上記の溶血性に基づ（アッセイ は、商業的に得られる第１のＡＳＯアッセイであった。

ＳＬＯ融合生成物を得るための組み換えＤＮＡ法は、そのような生成物を比較的 多量に得る利点を与える。そのような方法を用いることにより、Ｓ、ビョゲネス からＳＬＯを得る長たらしくコスト的に効果的でない点を避けることができょう 、ここに用いたように、用語ｒｓＬｏ誘導体１は、可溶性で溶血活性であり少な くとも１つの抗体により野生型ＳＬＯに結合され得るＳＬＯ融合生成物である。

ＳＬＯ誘導体は、ここでは、ｒｒｓＬＯＪと呼ばれる。これらのＳＬＯ誘導体は 、多量に供給され、実質的に純粋であり、溶血活性を保持する。

そのようなＳＬＯ誘導体は、たとえば、野生型のＳＬＯの溶血特性に依存するた とえば免疫診断アッセイで有益であろう。

発明の要約 本発明は、ＳＬＯ変形型を提供する６本明細書でｒ　ｍ　Ｓ　Ｌ　ＯＪと呼ぶこ れらの変形型は、次に示すような特徴を有していて、そのような特徴により広（ 定義される＝　（ｉ）野生型抜ストレプトリジン０抗体（ＡＳＯ）により認めら れる、すなわち、野生型ストレプトリジン０の少な（とも１つのエピトープ特性 を含む；（ｉｉ）実質的に非溶血活性である。本明細書で用いられているように 、用語ｒ認められる１は、ｍ５Ｌｏの少な（とも１つのエピトープ部位で結合し 得ることを意味し、言葉、ｒ実質的に非溶血活性１とは、野生型ＳＬＯ比活性４ Ｘ１０’溶血単位／ｍｇ野生型ＳＬＯに基づき約７５％よりも少ないパーセント 野生型ＳＬＯ比活性を意味する；ｒ野生型５ＬＯＪは、このような言葉に関連す る通常の定義と一致する、すなわち、能力のあるバクテリア給源により自然に分 泌されるＳＬＯである。定義から、ｒ野生型５ＬＯＪは、たとえば、組み換えＤ ＮＡの技術により得られるＳＬＯ融合生成物を含まない。

本発明の開示に従う特に有用なｒｓＬｏは、ここでは、１ｍｇ当たり約３．６ｘ ４０’溶血単位（ｒＨＵＪ）の比溶血活性を有するｒｓＬｏ、３と呼ばれる。

図面の簡単な説明 図１は、ｒｓＬｏ、３と呼ばれるＳＬＯ誘導体の最も好ましい具体例の核酸配列 の１本鎖である。

図２は、ｒｓＬｏ、３のアミノ酸配列である。

好ましい態様の詳細な説明 ここでの開示に用いられているように、ストレプトリジンＯ誘導体すなわちｒｒ ｓＬＯＪは、次に示すような特徴を有していてそれにより広く定義される：　（ ｉ）野生型ＳＬＯに少なくとも１つの抗体により固定され得る；（ｉｉ）発現に より可溶性である；（ｉ　ｉ　ｉ）溶血活性である０本明細書で用いられている ように、言葉ｒ野生型５ＬＯＪは、そのような言葉と関連する通常の定義に一致 し、すなわち、そのようなたんば（質を分泌し得るバクテリア給源により自然に 分泌されるＳＬＯである。好ましくは、ｒｓＬｏの溶血活性は、４Ｘ１０’溶血 単位／ｍｇの野生型ＳＬＯ比活性に基づいて野生型ＳＬＯの約７５％の溶血活性 を有する。より好ましくは、ｒｓＬｏの溶血活性は、野生型ＳＬＯ比活性の４× １ｏ“溶血単位／野生型ＳＬ０１ｍｇに基づいて野生型ＳＬＯの溶血活性の約５ ％〜５０％の間であり、最も好ましくは約９％である。これらの値は、相対的な ものである；したがって、パーセント野生型ＳＬＯ比活性が、野生型ＳＬＯ比活 性のＩ　Ｘ　１０’溶血単位／ｍｇに基づくなら、上記の値は、係数２．５だけ 下がる（すなわち、７５％は、３０％になり、９％は、３．６％になるといった 具合である）。

上記が、詳述されるのは、野生型ＳＬＯの「比活性１が、約１×１０６溶血単位 ／ｍｇもあると記載されているからであるが、約４×１０６溶血単位／ｍｇの比 活性も記載されている。アロフ、Ｊ。

Ｅ、（Ａｌｏｕｆ）、Ｊ、Ｅ、）ｒストレプトコツカルトキシン（Ｓｔｒｅｐｔ ｏｃｏｃｃａＬ　Ｔｏｘｉｎｓ）（ストレプトリジンＯ，ストレプトリジンＳ、 エリスロゲニックトキシン（Ｅ　ｒ　ｙ　ｔ　ｈｒｏｇｅｎｉｃ　Ｔｏｘｉｎ） ＪＰｈａｒｍａｃ、Ｔｈｅｒ、ＩＩ：６６１−７１７（１９８０）（参考のため にここに記載した）。

したがって、野生型ＳＬＯの報告されているｒ比活性１は、説明しがたいので、 前記のパーセントは、この事実に合う。

便宜上、ここで用いているように、用語ｒベクター１は、少なくとも１つの制限 部位と少な（とも１つのプロモーター遺伝子とを含む円形ＤＮＡ巨大分子を意味 する。用語ｒブラズミド１は、特に遺伝子を含む関心のもたれるゲノムの一部を 更に含んでなるベクターを意味する。用語ｒホスト１は、ブラズミドにより移入 （ｔｒａｎｓｆｅｃｔ）され得る細胞を意味する。

本分野で認められているように、はとんどのベクターは、所望の結果に関連して 選択される。たとえば、商業的な環境では、関心のもたれる遺伝子の高いレベル の形質発現は、そのような形質発現に伝導性（ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｅ）のある適 当なプロモーターを有するベクターが選択されるようにすることが典型的には好 ましいであろう；一方、研究環境では、ホストの調節要素の支配下にある翻訳信 号と転写信号とを有するベクターが適当であるようにそのような高いレベルの形 質発現が臨界的でな（でもよい。したがって、所望の結果に適当なベクターの選 択では、関心のもたれるベクターのプロモーター遺伝子に同時に焦点を当てるこ とがしばしば有用である。

非常に高いレベルのｍ　ＲＮ　Ａ産生を達成するプロモーター遺伝子には、たと えば、ｐＬ　ｓ　ｐｔａｃおよびｐア、がある、このリストは、余すところのな いリストを意図したものでもそのように解釈されるべきものでもない、むしろこ れらのプロモーターは、以下の説明のための代表例として用いられている。当業 者は、リストにあげたプロモーターと関連する同等な結果を与え得る所望のプロ モーターを有する適当なベクターを容易に選択できる。

たとえば、ｐｆ、は、Ｅ、コリＲＮＡポリメラーゼの割合の数倍の割合でＲＮＡ を合成し、Ｅ、コリＲＮＡポリメラーゼよりも転写を少ない頻度で終わらせるＴ ７ＲＮＡポリメラーゼと共に用いられる。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは、それ自体 のプロモーター配列で開始に関しかなり選択的であり；したがって、これは、Ｅ 、コリＤＮＡへの配列からの転写を開始しない、さらに、Ｔ７ＲＮＡポリメラー ゼは、Ｅ、コリＲＮＡポリメラーゼを抑制するりファンビシンのような抗生物質 に抵抗性である。したがって、たとえばＴ７ＲＮＡポリメラーゼを促進する細胞 へのりファンビシンの添加は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、すなわち 、ｐｒｙの支配下の遺伝子の独占的な形質発現をもたらす。

Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ／ｐ７．システムを用いる形質発現は、（典型的に）２ ブラズミドシステムに依存する：第１のブラズミドは形質発現される遺伝子およ びｐｒｙを含み、第２のブラズミドはＴ７ＲＮＡポリメラーゼについての遺伝子 を含む、第２のブラズミド、たとえば、ｐＧＰｌ−２（これは、Ｔ７ＲＮＡポリ メラーゼについての遺伝子を含むフタバー（Ｔａｂｏｒ）およびリチャードソン （Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ）　、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、８２　：１０７４−１０７８　（１９８５）参照）は、Ｅ 、コリに永久的に存在し得るかまたは、特殊化したファージたとえばＭ１３ベク ター（例として、ｍＧＰｌ−２、ターバーおよびリチャードソンを参照）または Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を含むλベクター（例として、ＣＨ２、スタブイ ア−（Ｓｔｕｄｉ上２．よ旦ユニ１１３−１３０　（１９８６）参照）によりＥ 、コリに導入され得る。

典型的には、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を含む篤２のブラズミドは、熱を誘 導し得るＥ、コリプロモーターの支配下にあり、すなわちたとえば３０℃から４ ２℃に温度を上げることにより、熱を誘導し得るＥ、コリプロモーターは、スイ ッチが入れられ、これは、次に第１のブラズミドのｐア、プロモーターのスイッ チを入れ、これにより、たとえば関心のもたれる遺伝子の形質発現がもたらされ る。このように、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ／ｐＴ？形質発現システムを用いるこ とにより　Ｅ、コリシステムは、熱を誘導し得るプロモーターたとえばＣＩａｍ ｔリプレッサーを有するラムダＰＬを含む。

ｐＴテを含むベクターの例は、たとえば、ｐＴＴシリーズ（ｐＴ７−５、ｐＴ７ −６およびｐＴ７−７、これらは、ｐＴ７−１の誘導体である；上記のターバー およびリチャードソンを参照）およびｐＥＴシリーズ（スタブイア−（Ｓｔｕｄ ｉｅｒ）ら、Ｍｅｔｈ。

ｄｓ　Ｅｎｚ　ｍｏｌ　１８５：６Ｏ−８９（１９９０）参照）である。

もう１つのベクターシステムは、ｐＬプロモーター遺伝子を含む。ｐＬプロモー ターは、λバクテリオファージから誘導され、最も強力な調節されたＥ、コリプ ロモーターのひとつであるＩＩ　ｐＬからの転写は、十分に抑圧され得、したが ってＩ）Ｌを含んでなるブラズミドは、λリプレッサーｃＩにより安定化され得 る。このリプレッサーは、λゲノムの一部の一律化コピーを含んでなるＥ、コリ ホストにより典型的には供給される。そのようなＥ、コリホストは、ｒＥ、コリ リゾゲン１と呼ばれ、次のような性質を有する：（ｉ）これは、λ調節たんば（ 質ｃＩおよびＮ（終結抑止機能）を供給する；そして（ｉｉ）これは、通常、細 胞溶解（ｃｅｌｌｌ　ｙｓ　ｉ　ｓ）に通じる溶解成分を与えない。したがって 、たとえば関心のもたれるゲノムおよび１）Ｌを含んでなるブラズミドにより移 入されたＥ、コリリソゲンは、遺伝子の形質発現なしで高い密度に初期的に成長 され得、リプレッサーの不活性化の下でたんばく質を合成するように後に誘導さ れる。ＰＬ系ベクターの例は、たとえば、米国特許！４，９２５．７９９号（ｒ ｐＡｓＩＪ　）　、シャツＸマン（Ｓｈａｔｚｍａｎ）およびロゼンバーグ（Ｒ ｏｓｅｎｂｅｒｇ）による”Ｔｈｅ　ｐＡＳ　Ｖｅｃｔｏｒ　Ｓｙｓｔｅｍ　ａ ｎｄ　Ｉｔｓ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｔｏ　Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｉａ　Ｃｏ １１．”　Ｈｅ　ｔａｌｏ　７：３０５−３５５（１９８７）およびロゼンバー グらによる”Ｔｈｅ　Ｕｓｅ　ｏｆｐＫｃ３０　ａｎｄ　ｉｔｓ　Ｄｅｒｉｖａ ｔｉｖｅｓ　ｆｏｒＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｇｅ ｎｅＳ・”牲！工ニュ旦旦−呈旦旦しユ旦ユ　１旦ユニ１２３−１３９（１９８ ３）に記載されている。

ｐ□。プロモーターは、ｔｏ旦および上互旦プロモーターに基づくハイブリッド プロモーターである。デボアー（ｄｅ　Ｂｏｅｒ）らの”Ｔｈｅ　ｔａｃ　ｐｒ ｏｍｏｔｅｒ：Ａ　ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｈｙｂｒｉｄ　ｄｅｒｉｖｅｄ　ｆ ｒｏｍ　ｔｈｅ　エニュａｎｄ　上ａｃ　ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ、”Ｐｒｏｃ、Ｎ ａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８旦：２１−２５　（１９８３）；およびアマン（ Ａｍａｎｎ）らの”Ｖｅｃｔｏｒｓ　ｂｅａｒｉｎｇａ　ｈｙｂｒｉｄ　ユニ２ −上ａｃ　ｐｒｏｍｏｔｏｒ　ｕｓｅｆｕｌ　ｆｏｒ　ｒｅｇｕｌａｔｅｄ　ｅ ｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆｃｌｏｎｅｄ　ｇｅｎｅｓ　ｉｎ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃ ｉａ　ｃ。

土工、”　Ｇｅｎｅ　２５：１６７−１７８を参照＊ｐｔａｃは、１１９オペレ ーター領域を含むので、これは、ｌａｃリプレッサーを著量蓄積するＥ、コリ株 により抑制され得、イソプロピルβ−Ｄ−チオガラ口りトシド（ＩＰＴＧ）の添 加により完全に誘導される。

上記の引例は、参考のためにここに記載した。

適当なベクター／ホストシステムの選択は、精通した者の特定の要求の範囲に入 る。最も好ましいベクターは、ｐＬプロモーターに基づいている１表工は、適当 なベクターとホストおよびその給源の代表的な（限定する者ではない）リストを 示す。

表Ｉ ベクター　ホスビ　給　源 ｐＮＩＨ８Ａ　ＤＬ２１０ＰＨ，Ｄ１２１０　（２１ｐＮ１（１６Ａ　ＤＬ２１ ０ＰＨ，０１２１０（２）ｐ邪１８Ａ　ＤＬ２１０Ｐ１（、ＤＬ２１０　：２１ ｐｉ）ＲＯＫ−Ｉ　ＪＫ１０９　（３１ｐ■２　Ｎ４８１０−１　（３１ ｐ３３　ＡＲ１２０，ＡＲ５Ｂ　＋５＋ｐ　３３　ＡＲＬ２０．　Ａｌ１［１（ ５１ｅｂＬ−ラムダ　Ｎ９９ｃＩ−−Ｎ４８１０−１　（６１以下の例について 、ベクターｐΔ３３およびｐＢＴａｃ２ＤＮＡが、ｒｓＬｏ、３の形質発現とサ ブクローン化（初期的にはｐＵｃ１９から）とについて、ホスト株ＡＲ１２０お よびＪＭ１０５と共にそれぞれ用いられた。

例 好ましい実施態様を示す以下の例は、請求の範囲の開示を限定することを意図す るものでもなくまた限定するように解釈されるべきものでもない。

医１ 部分消化されたゲノムストし・ブトリシン０ＤＮＡの準備引例として示すケホエ Ｍ　（Ｋｅｈｏｅ、Ｍ）らによりＩｎｆｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎ、、１互：３２２８ −３２３２　（１９８７）（以下ｒケホエ１９８７Ｊ）により示された方法を用 いてストレブトコッカスビョゲネス（ＡＴＣＣ＃１０３８９）からゲノムＤＮＡ を単離した。約１ｍｇのＳ、ピョゲネスＤＮＡが、この手順を用いて得られた（ ９２５μｇ）。

Ｓ、ビョゲネス（Ｓ、ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＤＮＡ　（２，’５ｕｇ／μｍ）３７ ０μｍへ、３００μ１（７）ＩＯＸの高塩緩衝液（１０ＸＨｉｇｈ　５ａｌｔ　 Ｂｕｆｆｅｒ）（１，０ＭのＮａＣ１；１００ｍＭのトリスヒドロキシアミノメ タンクロリドＢＴＲｒｓ−ｃＩＪ　）、ｐＨ７，５；　１００ｍＭのＭｇＣ１＊ 　；および１０ｍＭ（７）ジスリオスレオトール（ｒＤＴＴＪ））、２３１０μ ｍの脱イオンＨｚＯおよび２０μｍのＢｇｌ　ＩＩ（ＢＲＬ、ガイザースバーグ （Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）　、ＭＤ、Ｃａｔ、＃５２１３ＳＡ）を加え、最 終容量を３０００μｍとした。この混合物を３７℃に保ち、夜通し温置した。

この温置した混合物に、３０００μｍの試薬Ａ（２５０μｍのフェノール、２５ ０μｍのクロロホルム、１０μｍのイソアミルアルコール、１μｍのβ−メルカ プトエタノール）を加えた。水性層と有機層とを分けるためにこの混合物を、遠 心分離に先立って、攪拌した。水性の上澄み液を、０．３ＭのＮａ０Ａｃと９５ ％エタノールとを用いて沈殿させた。この沈殿を、次に、２５０μｍのＴＥ（１ ０ｍＭのＴＲＩ　Ｓ−Ｃ１、ｐＨ７，５；　１ｍＭのＥＤＴＡ）に再び溶解させ 、２５μｍのＩＯＸのローディングダイ（０，，２ＭのＥＤＴＡ　；　５０％の グリセロール、０．２５％のキシレンシアツール、０．２５％のブロモフェノー ルブルー）をこれに加え、１％アガロースゲルで電気泳動を行った。次に、Ｂｇ ｌ　ＩＩ部分消化Ｓ、ビョゲネスゲノムＤＮＡフラグメントを大きさに従って評 価した。

認められるように、ＳＬＯは、およその分子量６５０００〜７゜０００ダルトン を有している。各アミノ酸は、およその分子量１１０ダルトンを有するので、（ 内輪の見積もりで）７００００ダルトンたんばく質は、およそ６３６のコドンま たは１９０９塩基対によりコード化される。したがって、上記のゲル電気泳動法 により測定される約２０００ないし２５００の塩基対（すなわち、２．０〜２． ５Ｋｂ）の塩基対の部分消化フラグメントが精製された。精製されたフラグメン トは５次に、１５０μｌのＴＥに再び懸濁させた。便宜上、これらは、ここでは 、Ｉｒ５ＬＯインサート（ｉｎｓｅｒｔ）Ｊと呼ぶ。

医旦 ブラズミドを含むストレプトリジン０の準備使用したベクターは、Ｂａｍ　ＨＩ 　（ＢＲＬ、Ｃａｔ、＃５２０ＩＳＡ）により切断したｐｕｃｌ９　（ＢＲＬ、 Ｃａｔ、＃５３６４ＳＡ）であった。

１μｍの切断したｐｕｃｌ　９ベクターに、１５μｍのＳＬＯインサート、３μ ｍの１０Ｘのリガチオン緩衝液（６６０ｍＭのＴＲｌ５−Ｃ１、ｐＨ７，５；　 ５０ｍＭの塩化マグネシウム；１０ｍＭのＤＴＴ　；　１０ｍＭのＡＴＰ）を加 えた。８μｍの脱イオンＨ，０を加えることにより最終容量を３０μｍとした。

この混合物に、２μｍのＴ４リガーゼ（ＵＳＢ、５μｇ／μｍ）を加えた；夜通 し室温でさらに温置した０便宜上、得られたものをｒｓＬｏブラズミド候補１と 呼ぶ。

医旦 ＳＬＯブラズミド候補のスクリーニングホスト細胞Ｅ、コリ株ＪＭ１０５を、次 のようにＳＬＯプラズミドにより形質転換させた。３００μｍの凍結ＪＭ１０５ 受容細胞を含むバイアルを解かし、１６，０μｍのＳＬＯブラズミド候補をそれ に加えた。この混合物を３０分間氷上で培養し、３７℃の水浴で２分間熱シヨツ クを与えた。その後、移入されたＪＭ１０５溶液を２ｍｌのＬＢ培地（Ｌｏｇの バクトートリブターゼ（Ｂａｃｔｏ−ｔｒｉｐｔａｓｅ）；５ｇのバクトイ−ス ト抽出物：　ＬｏｇのＮａＣ１；１リツターの脱イオン水；水酸化ナトリウムに よりｐＨ７゜５）に加えてから３７℃で３０分間攪拌（２０ＯＲＰＭ）Ｌ、た。

その後、ＬＢアンピリジンプレートに塗布を行い、３７℃で夜通し温置した；便 宜上これらは、ｒｓＬｏ形質転換体１と呼ぶ。

スクリーニングは、独特な手順を用いて行った。喪通し増殖させた後、ＰＢＳ／ １０ｍＭＤＴＴ中に０．８％アガロースに含むようにした２、５％の洗浄済うさ ぎ赤血球でコロニーを覆い、これをプレートを覆うように広げた。３７℃で４０ 分の培養の後、ＳＬＯを含むコロニーは、溶血の小さなゾーンにより囲まれた。

これらのコロニーがＳＬＯを含んでなることを確認するために、ＳＬＯの報告さ れたＤＮＡ　（ケホエ（Ｋｅｈｏｅ）　、１９８７参照）を含めたヌクレオチド ６７０−６９４から誘導された２５−ｍａｒオリゴヌクレオチドプローブを、プ ローブとして用いた。このプローブを、バイオサーチ（ＢｉｏＳｅａｒｃｈ）８ ６００ＤＮＡシンセシザーにより準備し、マニアチス（Ｍａｎ　ｉ　ａｔ　ｉ　 ｓ）らのＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｃ３ＰＬ　（１９８２）　、１ ２２−１２６ページ（以下ｒＭｏｌｅｃｕｌａｒ　ＣｌｏｎｉｎｇＪ）に記載の Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ手順により”Ｐでラベルした。

血液オーバーレイスクリーニング法は、ＳＬＯ形質転換体により形質発現された ＳＬＯを迅速にスクリーニングする有効で正確な方法であることがわかった。Ｓ ＬＯの性質は、赤血球を溶解するその能力であるので、いずれの給源からの赤血 球も用いられ、すなわち人、マウス、山羊、うさぎなどからの赤血球が用いられ 得る。うさぎの赤血球が、その入手のしやすさから好ましい。

溶血活性を証明し、２５−ｍａｒプローブとハイブリッド形成しているたんばく 質の発現をもたらしたＳＬＯクローンを、ｆｐＵｃ１９−ＳＬＯ−ＢＪと呼ぶよ うにした０便宜上、そのノンベクターＤＮＡ配列をここではｒｒｓＬｏ−候補ｊ と呼ぶ。

憇Ａ 発現の最適化と溶解度の測定 ｒｓＬｏ候補の発現を最適化するため、Ｂａ１−３１を用いてｒＳＬＯ−候補の 時限消化（ｔｉｍｅｄ−ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）を行った。さらに、上記したよう に、始めからの、すなわち、一度発現されたさらに化学的な修飾のない、発現し たたんばく質の溶解度は、重要である。これは、非溶解性ＳＬＯは定義により活 性でないからである。したがって、発現したたんばく質が可溶であったかどうが 、すなわち、遠心分離の後に、ベレットとは反対に上澄み液にあったかどうかを 測定する分析を行った。

ｐｕｃｌ９−ＳＬＯ−Ｂを次のようにしてＢｓｔＥ　ＩＩ　（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌ ａｎｄ　Ｂｉｏ　Ｌａｂｓ、Ｃａｔ、＃１６２゜１０Ｕ／μｍ）によりまず切断 した。４０μｍの４０Ｘの高温緩衝液、３３５μｍの脱イオンＨ，Ｏおよび５Ｌ ＬｌのＢｓｔＥ　ＩＩを、２０μｌのｐＵＣ１９−ＳＬＯ−Ｂ　（２，５ｇｇ／ μｌ）ｋ：加えた。この混合物を、２時間６０℃で温置し、次に、試薬Ａ４００ μｍで抽出してから、９８％エタノール８８８μｍに含むようにした３ＭのＮａ ０Ａｃ　（ｐＨ４，８）４４μｌで沈殿させた。次に、沈殿剤は、４０μｍのＨ ，Ｏに再溶解させた。その後、９０μｍのＨｚＯ１２０μｍのＩＯＸのＢａ１− ３１緩衝液（１２０ｍＭのＣａＣ１ｚ　；　１２０ｍＭのＭｇＣ１ｘ　、２．０ ＭのＮａＣ１；０．２ＭのＴＲｌ５−Ｃ１、ｐＨ８，Ｏ；　１０ｍＭのＥＤＴＡ ）および５０μｍの１　ｍ　ｇ　／　ｍ　１のウシ血清アルブミンを、再溶解し た沈殿剤と混合した。さらに１０μｍのＢａＬ−３１（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ 　Ｂｉｏ　Ｌａｂｓ、Ｃａｔ、＃２１３゜　１００　Ｕ／ｍ１）を加えて　全量 を２１０μｍとし、室温で培養したｓ　Ｂ　ａ　ｌ　−３１の効果を調節するた めに、２１０μｍの全量のうちの３０μｍアリコートを、Ｂａ１−３１添加後、 の３０分、４５分、６０分、８０分、１０５分、１３０分および１６０分で取り 除き、これらのアリコートのそれぞれを０．２ＭのＥＧＴＡの３．３μｍと混合 し、氷上で保存した。最後のアリコートの準備と保存の後、すべて７つのアリコ ートをプールし、試薬Ａ２３０μｍにより抽出してから、９５％エタノール５０ ６μｍに含むようにした３ＭのＮａ０Ａｃ２３μｍにより沈殿させた０次に沈殿 は、７５μｍのＨ，０に再び溶解させた。

フィルイン反応（ｆｉｌｌ−ｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ）を、５μｍの２．５ｍＭ のｄＸＴＰ、１０μｌのＩＯＸの中温緩衝液（５００ｍＭのＮａＣＩＨｌｏｏｍ ＭのＴＲｌ５−Ｃ１、ｐＨ７，５；　１００ｍＭのＭ　ｇ　Ｃｌ　ｚ　；　１０ 　ｍＭのＤＴＴ）および１゜ＯｍＭのＤＴＴの１０μｍを再溶解沈殿剤の７５μ ｍへの添加により行い、これにクレノウボリメラーゼ（Ｋｌｅｎｏｗ　ｐ○Ｌｙ ｍｅｒａｓｅ）（５Ｕ／ｕｌ）６ｕｌを添加し、次に４時間室温で１置した。こ の混合物を試薬Ａ１００μｍで抽出し、１００％エタノール２２μｍに含むよう にした３ＭのＮａ０Ａｃ１１μｍで沈殿させ、次に、４０μｍのＨ１Ｏ中に沈殿 を懸濁させた。

フィルイン反応に続き、５ＬＬｌの５Ｘのリンカ一連結反応緩衝液（ｌｉｎｋｅ ｒ　ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒ）（２５０ｍＭのＴＲＩ　Ｓ−Ｃ１、ｐＨ ７，６；　５０ｍＭのＭ　ｇ　Ｃ１ｚ　；　５　ｍＭのＤＴＴ　；　５ｍＭのＡ ＴＰ；２．５％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ８０００（Ｊ、　Ｔ、　Ｂａｋｅｒ、Ｃａｔ、 ＃Ｕ２２２−０９）　）と１７μｍの再懸濁沈殿を混合した。これに、Ｔ４リガ ーゼ（５ｕｌμｍ）２μｍを加え、室温で６時間温置した０便宜上、得られた物 質をｒ　Ｃａ　／　６　Ｗ　Ｊと呼ぶ。

Ｅ、コリ株ＪＭ１０５を、上記のｃａ／ｅｗで形質転換し、次に、例１で上記し たように夜通し増殖させた。ブラズミドがＢａｍＨＩリンカ−を含んでなるかど うかを測定するため、４０μｍの１０Ｘの中温緩衝液および３２０μｍ脱イオン Ｈ：ｏを４０μｍのｃａ／ｅｗ　（０，５μｇ／μｍ）に加えた。この混合物へ 、５μｍのＥｃｏＲＩ　（ＢＲＬ、Ｃａｔ　＃５２０２　ＳＡ、１０ｕｌμｍ） を加えてから、３７℃で２時間製置した。ブラズミドが切断されることを確実に するために、ゲル電気泳動（１％アガロースゲル）を行った；これにより、さま ざまな大きさのスミア（ｓｍｅａｒ）ができ、切断がうまくいったことを示した 。切断したブラズミドに、５Ｍ（７）ＮａＣ１の８μｍを加えてから、さらに、 ５μｍのＢａｍ　ＨＩ　（ＩＯＵ／μｌ）を加えた。この混合物を３７℃で２時 間製置した。Ｂａ１−３１消化を行ったｒｓＬｏ−候補配列の大きさの測定は、 ゲル電気泳動（１％アガロースゲル）により行った。これは、ｒｓＬｏ−候補を 含む約１．２ないし約２．ＯＫｂで関心のもたれるバンドをもたらした。このよ うに溶血活性を証明した２、０−２．５Ｋｂの初期断片が、大きさを有意的に増 した。　゛ｒｓＬｏ−候補を含んでなるバンドをゲルから切断し、ＢａｍＨＩお よびＥＣｏＲＩにより先に切断したｐＵｃ１９ベクター中の連結にｒｓＬｏ−候 補が利用できるように置５μｌで精製した。そのような連結を達成するように、 ゲルで精製したｒＳＬＯ−候補１０μｍを、先に準備したベクター４μｌ、ＩＯ Ｘの連結緩衝液２μｍ、１０ｍＭのＡＴＰ２μｌおよび脱イオンＨ，０２μｌと 混合した。この混合物へ、Ｔ４リガーゼ２μｍを加えてから、６時間室温で培養 した。Ｅ、コリホスト細胞株ＪＭ１０５を、上記のようにこれらのブラズミドに より形質転換し、活性なコロニーを、上記の赤血球オーバーレイ法によりスクリ ーニングした。次に活性なコロニーを選択し、ＬＢ培地／１００μｇ／ｍｌアン ピシリンに接種し、上記の条件で夜通し増殖させた。

夜通し増殖させた後、細胞は、４℃で８０００ＲＰＭで５分間遠心分離させ、得 られたベレットを２ｍｌの試薬Ｂ（１５０ｍＭのＮａＣ１；２０ｍＭのＴＲｌ５ ％ｐＨ７，Ｏ：　１ｍＭのＥＤＴＡ）に懸濁させた。その後、懸濁細胞を、氷上 で２×１０秒間音波処理にかけた後、ベックマンＪＡ２０．１遠心機を用いて４ ℃で４０分間９５００ＲＰＭで遠心分離して発現したたんば（質を得た。

この段階で、ｒｓＬｏ−候補が可溶性のたんばく質の発現をもたらせば、そのた んばく質は、上澄み液にあることになる。したがって、抗体活性たんばく質の測 定のための標準ウェスタンプロットプロトコールを用いて上澄み液中のｒｓＬｏ −候補の存在の分析を行った。そのようなウェスタンプロット分析の結果は、馬 抗ＳＬＯ抗体（ｈｏｒｓｅ　ａｎｔｉ−ＳＬＯａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）により認 められる上澄み液中のＳＬＯ融合生成物があったことを示した。１つのそのよう な融合生成物を選択し、ｒｒｓＬｏ、３Ｊと名づけだ０便宜上、ｒｓＬｏ、３の 発現をもたらすＤＮＡ配列もｒＬＳｏ、３と呼ぶ、ｒｓＬｏ、３の高いレベルの 発現をその後試みた。

医二 ｒｓＬｏ、３の高いレベルの発現 ｐｕｃｌ　９ベクターを含んでなるブラズミドからのｒｓＬｏ、３の除去は、次 のようにして行った。４０μｌのＩＯＸのＳｍａ　Ｉ８、Ｏ；　１００ｍＭのＭ ｇＣ１ｘ　；　１０ｍＭのＤＴ’Ｔ）および３４５μｍの脱イオン）（、Ｏを、 ｒ　Ｓ　Ｌ　０　、３　（０、５ｕ　ｇ　／　１１１　）を含んでなるブラズミ ド１５μｍに加えた。この混合物に、５μｍのＳｍａ　Ｉ　（ＢＲＬ、Ｃａｔ　 ＃５２２８　ＳＡ、ＩＯＵ／μｍ）を加え、次に、２時間３７℃で培養した。ブ ラズミドが切断されることを確実にするように、ゲル電気泳動（１％アガロース ゲル）を行った：これは単一バンドをもたらし、切断がうまくいったことを示し た。この切断ブラズミドに、８μｍの５ＭのＮａＣ１を加え、さらに、５μｍの Ｂａｍ　ＨＩ　（ＩＯＵ／μｌ）を加えた。この混合物を、２時間３７℃で培養 した。ｒｓＬｏ、３配列が約２．７Ｋｂ　ｐＵｃ　１９ベクターから好首尾に切 断されることを確実にするため、ゲル電気泳動（１％アガロースゲル）を行った 。

これは、２つのバンドをもたらし、１つは約２．７Ｋｂ　（ベクター）テ、もう １つは、Ｆｉｌ、４Ｋｂ　（ｒｓＬｏ、３）　であった。

このバンドは、ｒｓＬｏ、３がＢａｍ　ＨＩおよびＳｍａ　Ｉにより先に切断し たｐΔ３３ベクターの連結に利用できるようにゲルから切断し、１５μｍの脱イ オンＨ２ｏで精製した。

上記の誘導したｒｓＬｏ、３ＤＮＡ２μｍに、上記のベクター２μｍ、ＩＯＸの 連結緩衝液１．５ｕ、ｌ、１０ｍＭのＡＴＰｌ、　５ｕ１および脱イオンＨ，Ｏ を加えた。この混合物に、Ｔ４リガーゼ（ＩＯＵ／μｍ）２μｍを加え、次に５ 時間室温で培養した。この培養は、ｒｓＬｏ、３およびｐΔ３３ベクターを含ん でなるブラズミドをもたらした。

Ｅ、コリ株ＡＲ１２０を、Ｅ、コリ株ＪＭ１０５について概説しである手順に従 い上記のブラズミドにより形質転換した。その後、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏ ｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏ　Ａｕ５ｃｈｅｌ、Ｆ、Ｍ、ｅ ｔ　ａｌ。

、Ｅｄｓ、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ　（ＮｅｗＹｏｒｋ）（１９８ ７）、５ｅｃｔｉｏｎ　１．６．に記載されたＤＮＡミニ準備（ｍｉｎｉ　ｐｒ ｅｐ）を行い、次に、ブラズミドがｒｓＬｏ、３を含んでなるかどうか測定する ためＢａｍ　ＨＩとＳａｌ　Ｉ　（ＢＲＬ、Ｃａｔ、＃５２１７　ＳＡ）により ブラズミドを切断した。ｒｓＬｏ、３を含んでなるブラズミドにより形質転換さ れたこれらのホスト細胞を、ナリジキシン酸プロトコールを介して誘導にかけた 。参考としてあげる、モットＪ、Ｅ、（Ｍ。

ｔｔ、　Ｊ、Ｅ、）らのｒλｐＬプロモーターを含むプラズミドベクターからの 遺伝子発現の最大限化：転写終了因子ｐを著量蓄積する方法（Ｍａｘｉｍｉｚｉ ｎｇ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｆｒｏｍ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｖｅｃｔｏ ｒｓ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ｔｈｅ　λｐＬ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ：　Ｓｔｒａ ｔｅｇｉｅｓ　ｆｏｒ　ｃｖｅｒｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉ ｏｎ　ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ　ｐ）Ｊ　ＰＮＡＳＵＳＡ　８２ ：８８−９２（１９８５）を参照０本分野のものに理解されるように、ＤＮＡを 損傷するナリジキシン酸は、Ｅ、コリに対するリカバリーたんぽ（質であるｒｅ ｃＡたんばく質を誘導する。誘導された利益対オーバー発現（ｄｅｒ　ｉ　ｖａ ｔ　ｉ　ｖｅｂｅｎｅｆｉｔ　ｖｉｓ−ａ−ｖｉｓ　ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉ ｏｎ）は、ｒｅｃＡが、プロテアーゼ活性を有することであり、これは、特に、 λｃＩ”リプレッサーの不活性化をもたらし、この不活性化は、ｐＬプロモータ ーによるオーバー発現につながる。

特に、形質転換されたＡＲ１２０を含んでなるコロニーは、寒天平板から引き上 げられ、Ａｓｓ。での培地の光学密度が、０．４になるまで、スーパーボス（Ｓ ｕｐｅｒｂｏｔｈ）（塩基−１２ｇのトリプトン、２４ｇのイースト抽出物、５ ｍｌのグリセロール、９００ｍ１の蒸留Ｈ２０；塩（塩基１リツター当たり）− １，７ｇ（’）ＫＨｚ　ＰＯ−，１５，８ｇ（７）Ｋｇ　ＨＰＯ４（無水物）、 １００ｍ１の蒸留Ｈ８０）および１１００ＬＬ／ｍｌのアンピシリン中に３７℃ で接種した。その後、ナリジキシン酸を、最終濃度６０μｇ／ｍｌで接種した混 合物へ加え、４時間３７℃で培養した。上澄み液のウェスタンプロット分析は、 ｒｓＬｏ、３の存在を証明した。

ｒｓＬｏ、３のアミノ酸配列およびＤＮＡを次に測定した（Ｌａｒｋ　Ｓｅｑｕ ｅｎｃｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｈ。

ｕｓｔｏｎ　ＴＸ）ｅ　ｒｓＬｏ、３の測定されたＤＮＡ配列の一本鎖の表示を 、図１に示し、ｒｓＬｏ、３の測定されたアミノ酸配列を図２に示した。

週五 ｒｓＬｏ、３の比活性 未精製のＳＬｏ、３の比活性とたんばく質濃度を、ナリジキシン酸誘導の直後に 測定した。

ｒｓＬｏ、３粗抽出物についてのたんばく質濃度を、ビオラッドたんぽ（質アッ セイ法（Ｂｉｏｒａｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｓ５ａｙ　ｍｅｔｈｏｄ）（クーマ シープルー〇−２５０）（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ　Ｂｌｕｅ　Ｇ−２５０）を用い て推定した。ナリジキシン酸誘導たんばく質混合物を４℃で５分間８０００ＰＰ Ｍで遠心分離し、ペレットを、５００μｍの音波処理緩衝液（ｓｏｎｉｆｉｃａ ｔｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒ）（４００ｍＭのＴＲｌ５．ｐＨ７，５；１ｍＭのＥＤ ＴＡ；１ｍＭのＤＴＴ　；　２００ｍＭのＮａＣ１）に懸濁させた。再懸濁させ たペレットを、次に、氷上で、２×１０秒間音波処理してから、４℃で４０分間 １２０００ＰＲＭで遠心分離した。その後、５μｍの再懸濁させたｒＳＬｏ、３ 混合物を、たんばく質濃度について分析した（ＡＩ。藝でのＯＤの読み）ら、た んぽ（質濃度は、４．６ｕｇ／μｍであることが測定された。

比活性は、上記の粗抽出物の一連の希釈と、洗浄済うさぎ赤血球（ｆＲＲＢｃＪ 　）のそれへの添加、さらに分光光度の読み（Ａ　ｓ　４１でのＯＤの読み）に より測定した。５ｍ１の新鮮なうさぎの血液を、１０ｍＭのＤＴＴを含むＰＢＳ ４５ｍｌで２回洗浄し、次に、４℃で５分間２００ＯＲＰＭで遠心分離した。そ の後、１．１２５ｍ１の洗浄済うさぎの赤血球（ｒＲＲＢＣＪ）を管の底から引 き出し、これに、４８．８７５のＰＢＳ／１０ｍＭのＤＴＴを加えた。

これにより、２．２５％ＲＲＢＣを含む溶液が得られた。溶血アッセイのため、 ＰＢＳ／１０ｍＭのＤＴＴに含むようにした５００μｍの１＝２の連続的に希釈 したｒｓＬｏ、３に、２．２５％ＲＲＢＣの５００μｍを加え、３０分間３７℃ で培養した。

これらの連続的な希釈は、分光光度法により分析した（　Ａ　ｍ　４＋でのＯＤ の読み）。この分析は、希釈されたｒｓＬｏ、３粗抽出物の０．２μｍがＲＲＢ Ｃの５０％溶血を起こしたことを示した：０゜２μｍの希釈抽出物は、抽出物自 体の２μｍに匹敵する。したがって、ｒｓＬｏ、３粗抽已物は、２マイクロリツ ター当たり１溶血率位（ｒＨＵＪ　）すなわち５００ＨＵ／ｍｌを証明した。

認められるように、粗抽出物のたんぽ（質濃度は、４．６ｍｇ／ｍ１であると測 定された。したがって、ｐΔ３３−ＡＲ１２０発現システムから誘導されたｒｓ Ｌｏ、３の比活性は、１０８．７ＨＵ／ｍｇであった。これらは、粗（すなわち 精製されてない）抽出物に対する値であるので、これらの値は、抽出物の全たん ぽ（質濃度に基づいて予測される。精製された抽出物については、比活性値は増 加する。

医ユ ｒｓＬｏ、３の回収 以下の手順は、約２００ｇの形質転換済ホスト細胞（すなわち、６ｇの全たんば く質）に対するのもである。

形質変換済ホスト細胞は、２００ｍ１ｓの試薬Ｃ（４０ｍＭのＴＲｌ５．ｐＨ７ ，５：　１ｍＭのＥＤＴＡ：０．１％２−メルカプトエタノール）に再懸濁させ てから、１００ｍＭのＰＭＳＦを添加した。その後、細胞は、音波処理により崩 壊させ、次に、１００ｍＭのＰＭＳＦ４ｍｌを加えた。この混合物を３０分間４ ℃で１５００ＯＲＰＭで遠心分離させた。

得られる上澄み液を除去し、とっておいた；試薬Ｃ２００ｍ１をベレットに加え 、さらに１００ｍＭのＰＭＳＦ４ｍｌを加えた。再懸濁させたベレットを次に音 波処理してから、上記のように遠心分離した。得られた上澄み液を除き、さきの 上澄み液と一緒にし、そのｐＨをＮａＯＨにより７．０に調節した。

最終的な量の上澄み液に、ボリミンＰ　（Ｐｏｌｙｍｉｎ　Ｐ　）（Ａｌｄｒｉ ｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）にゆっくりと加えて（室温で攪拌を行いながら）最 終的な濃度を０．７５％にした。この混合物を、次に、３０分間室温で１１００ ＯＯＲＰで遠心分離してから、上澄み液の回収をした。上澄み液の８０％飽和ま で、固体硫酸ナトリウムを攪拌しながらゆっ（りと加えた。

その後、この混合物を、４℃で２時間攪拌してから、１５０００ＲＰＭで４℃で ３０分間遠心分離にかけた０次にベレットを回収し、４００ｍ１の飽和硫酸アン モニウム中に再び懸濁させた（ｐＨ７，０）、この混合物を、１１００ＯＯＲＰ で４℃で３０分間遠心分離してから、ベレットを回収し、試薬Ｄ（２０ｍＭのＴ Ｒｌ５゜ｐＨ７；１ｍＭのＥＤＴＡ；０．１％の２−メルカプトエタノール）２ ００ｍｌ中に再び懸濁させた。

再懸濁させたベレットを次に４℃で４回の交換をして試薬りの２リツターにたい して透析した。サンプルの容積が増加する透析バッグに十分な余地を残した。透 析に続き、サンプルのｐＨを調べ、ＮａＯＨにより７．０に調節した。

次にサンプルは、試薬り中で平衡とさせたファーマシアファーストフロー８−セ ファローズカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＦａｓｔＦｌｏｗ　Ｓ−５ｅｐｈａｒ ｏｓｅ　ｃｏｌｕｍｎ）に充填した。４００ｍ１ベツドボリユームが、サンプル からｍ５Ｌ０．３／６を除去するのに十分であるとわかった。Ｅ、コリたんばく 質を含んでなる流れを集めて捨て、カラムは、約１リツターの試薬りにより洗浄 した。

ｒｓＬｏ、３を、緩衝液Ｂ中の２Ｘ１リッター０．０−０．４ＭＮ、ａＣ１勾配 で溶離した。断片は、ＳＤＳアクリルアミドゲル（９％）により分析し、多い量 のｒｓＬｏ、３を有する断片を一緒にした。約２５０ｍ１の一緒にしたｒｓＬｏ 、３が回収された。

上記の手順を用い、初期の全たんば（質の約６０％（約０．３６ｇ）が、ｒｓＬ ｏ、３であり、必要になるまで４℃で保存した。

医旦 ｒｓＬｏ、３の精製 ｒｓＬｏ、３の精製は１次のプロトコールを用いて少な（とも８０％の純度とし た。

例９に記載したプロトコールに従い誘導した凍結細胞ペースト約６００ｇを解凍 （３７℃）し、３リツターの冷溶解緩憂液（４０ｍＭのＴＲＩ　Ｓ−Ｃ１、ｐＨ ７，０；　１ｍｍのＥＤＴＡ、０．１％の２−メルカプトエタノール、２ＭのＮ ａＣ１；４℃）に再懸濁させてから、ヒートシステム超音波連続流ソニフィケー ター（ＨｅａｔＳｙｓｔｅｍｓ　Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ　Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕ ｓ　Ｆｌｏｗ　ｓｏｎｉｆｉｃａｔｏｒ）（Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ、Ｎ、Ｙ、 、Ｎｏ、Ｗ−３８５）により４−１０℃で６０分間音波処理した。その後、この 物質をペックマンＪＡＩＯ遠心機により９５００ＲＰＭで４０分間２０−２６℃ で遠心分離した。約３リツターの上澄み液が回収された。

上澄み液へ、１２．５％で、ポリミンＰ沈殿剤（Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｍｉｌｗａｕ ｋｅｅ、Ｗｉｓ、）の原液を加え、最終濃度を０．２−０．３％の間にした０次 にこの溶液を１時間室温で攪拌してから沈殿を捨てた。液体部分のｐＨを、Ｎａ ＯＨにより７．０に調節した。この液体を、室温で夜通し静置した。

その後、溶液を上記のようにして遠心分離にかけ、透明な上澄み液を回収した。

この上澄み液を、室温で２ｍ１７分で１リツターのフェニル−セファローゼＨＩ Ｃカラム（Ｐｈａｒｍａｃ　ｉ　ａ。

Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ、Ｊ、）に充填した。その後、カラムは、溶離緩衝液 （２０ｍＭのＴＲＩ　Ｓ−Ｃ１、ｐＨ７，Ｏ；　１ｍＭのＥＤＴＡ；０．１％の ＢＭＥ）により７ｍ１／分で洗浄した。各留分は、Ｐｈａｒｍａｃ　ｉ　ａ　Ｐ ｈａＳｔ−Ｐａｇｅ”システムを用いて５ＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によりモニタ ーした。たんばく質濃度は、バイオランドたんばく質アッセイキット（ＢｉｏＲ ａｄＰｒｏｔｅｉｎ　Ａｓ５ａｙ　Ｋｉｔ）により測定した。たんばく質を含む 留分を一緒にした。

一緒にした留分を、１リツターのブルーアフィニティーカラム（Ｂｌｕｅ　Ａｆ ｆｉｎｉｔｙ　Ｃｏｌｕｍｎ）（ＢｉｏＲａｄ。

Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ）に室温で２ｍ１／ｍｍで充填し、 次に、２つのカラム容量に対し、室温で２ｍ１７分で上記の溶離緩衝液を用いて 洗浄した。

結合したたんばく質の溶離は、Ｏ，Ｏ−０，８ＭのＮａＣ１密度勾配（ｐＨ７， ０）を用いて達成した。留分は、Ｐｈａｓｔ−ＰＡＧＥシステムを用いてモニタ ーし、たんばく質濃度は、ビオラッドたんぽ（貿アッセイキットにより測定した 。単一のピークが、ＮａＣ１密度勾配で０．３−０．４Ｍで得られた。

溶離したｒｓＬｏ、３の純度は、６つの異なる量の溶離したｒＳＬｏ、３　（１ ６，８，４，２，１，０，５μｇのｒｓＬｏ、３）のゲル電気泳動（１２％の５ ＤＳ−ポリアクリルアミド）から得た主バンド均質性（ｍａｊｏｒ　ｂａｎｄ　 ｈｏｍｏｇｅｎｅｉｔｙ）の分析に基づいてベックマンＤＵ７５００分光光度計 を用いて評価した。主バンド均質性に基づ＜ｒｓＬｏ、３の測定した純度は、表 ２に示す。

表呈 ｒｓＬｏ、３　パーセント　ｒｓＬｏ、３０．５　９９．０％ １．０　９９．０％ ２．０　９４．４％ ４．０　８２．４％ ８．０　８１．４％ １６．０　８０．１％ 溶血活性の測定については、精製ｒｓＬ０．３の濃度を測定した。精製ｒｓＬ０ ．３の０．７ｍｇ／ｍｌの濃度の１：２５．６００タイターが、２．５％ＲＲＢ Ｃの５０％溶解より多くを得るのに必要とされた。したがって、精製ｒｓＬｏ、 ３の比溶血活性は、約３．６Ｘ１０’　ＨＵ／ｍｇ　（２５，６００＋０．７） であった。

認められるように、野生型ＳＬＯの「比活性１に基づ＜ｒｓＬ。

（精製ｒｓＬ０．３）の特定変種のパーセント溶血活性と比活性は次のようであ る。

表呈 ＰＳＬＯｒｓＬｏ、３ 比活性（溶血活性　ａ）ＩＸＩＯ’ （溶血単位／ｍｇ））　ｂ）４ｘｌＯ’　３．６ｘｌＯ’野生型ＳＬＯの　ａ） １００　３．６ バーセント溶血活性　ｂ）Ｚｏｏ　９ 医旦 ｒｓＬｏ、３の生体内毒性作用 ｒｓＬｏ、３の生体内毒性作用を評価するため、Ｂａ１ｂ／ｃマウスにｒｓＬｏ 、３の未希釈静脈注射と希釈静脈注射を行った。未希釈対照懸濁緩衝液と希釈対 照懸濁緩衝液を、同数のマウスに投与した。静脈注射を増進させるため、マウス は、注射に先立ち２０−３０分間ヒートランプ下で加温した。それぞれの条件に 対し約２０匹のマウスを用いた。

未希釈のｒｓＬｏ、３について、それぞれのマウスは、はぼ１７ｍｇ／ｋｇの投 与量とし、希釈ｒｓＬ０．３については、それぞれのマウスは、はぼ１０００μ ｇ／ｋｇの投与量を与えた。対照溶液緩衝液は、対照マウスに作用しなかった。

注射後、数分いくらか興奮状態となることを別として、希釈ｒＳＬ０．３または 未希釈ｒｓＬ０．３を投与したマウスのいずれも静脈投与による悪い影響を示さ なかった。ｒｓＬｏ、３が、溶血活性であり、上記のようなｒｓＬｏ、３の注射 を受けたマウスは、死ななかった。

汎旦 ｒｓＬｏ、３のサブクローニング ｒｓＬ０．３を得て、確認して、配列決定してから、もう１つの発現／ベクター システムを用いて、そのサブクローニングと発現を開始させた。ベクターｐＢＴ ａｃ　２　ＤＮＡ　（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｃａｔ、Ｎｏ 、１０８１３８１゜１０ＬＬｇ）は、３０μｍのｐＢＴａｃ２　ＤＮＡ　（Ｉμ ｇ／ｕｌ）、３０μｌのＩＯＸの中温緩衝液（Ｍｅｄｉｕｍ　５ａｌｔ　Ｂｕｆ ｆｅｒ）および２４０μｍの脱イオンＨＩＯを混合することによりＨｉｎｄ　Ｉ ＩＩ　（ＢＲＬ、Ｃａｔ、Ｎｏ、５２０７５Ａ。

１０Ｕ／ｍｌ）により切断してから、５μｍのＨｉｎｄ　ＩＩＩ（ＢＲＬ、　Ｃ ａｔ、＃５２０７　ＳＡ、　ＬＯＵ／μｌ）を加えた。この混合物を３７℃で２ 時間培養した。その後、この混合物を、ベクターがうま（切断されたかどうか測 定するため、アガロース電気泳動（１％アガロースゲル）により分析した；単一 バンドが、切断のうまくいったことを示した。

３０５μｍの混合物に対して３００μｍの試薬Ａを加えた。この混合物を次に、 ベックマンマイクロ遠心機により１２００ＯＲＰＭで５分間遠心分離してから、 上層の液体層を回収した。この液体層に、３３μｍの３ＭのＮａ０Ａｃ　（ｐＨ ４，８）と６６０ｕｌのエタノールを加えてから、−２０℃で夜通し沈殿させた 。次に、ベックマンマイクロ遠心機により１２０００ＰＰＭで１０分間遠心分離 させた。ベレットを回収してから空気により乾燥させた。乾燥したベレットを次 に１５０μｍの脱イオンＨ，Ｏに懸濁させた。

Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ切断ベクターの１つの末端を平滑にする（ｂｌｕｎｔ）（フィ ルイン）（ｆｉｌｌ−ｉｎ）、懸濁させたベレットを含んでなる１５０μｍ溶液 を、１０μｍの２０ＸのｄＮＴＰ（２，５ｍＭ）　、２０μ１（７）ＩＯＸのＭ ＳＢおよび２０μｍ（７）１００ｍＭのＤＴＴと混合した。次に、４μｍのクレ ナウボリメラーゼ（Ｋｌｅｎｏｗ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌ ａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂ、　Ｃａｔ、Ｎｏ、２１０．　５Ｕ／ｍｌ）を加えてから 、７時間室温で温置した。その後、３００μｌの試薬Ａを温！した混合物に加え てから、１２００ＯＲＰＭで５分間遠心分離した。上層の液層を回収して上記の ように沈殿させた。乾燥させたベレットを、３０μｍの脱イオンＨ２０に懸濁さ せた。便宜上、フィルインしたＨｉｎｄ　ＩＩＩ切断ベクターをｒｖｅｃ。

ｒｂＪと呼ぶ。

その後、ｖｅｃ、ｒｂをＢａｍ　ＨＩ　（ＢＲＬ、Ｃａｔ　Ｎｏ。

５２０１　ＳＡ、　ＩＯＵ／ＬＬｌ）により切断した。３０ＩＬｌのｖｅｃ、ｒ ｂに、３０μｍのＩＯＸの高温緩衝液および２４０ｕ１の脱イオンＨ，Ｏを加え た。この混合物に、５μｍのＢａｍ　ＨＩを加え、３７℃で２時間培養した。培 養した混合物に、試薬Ａ３００μｍを加えてから、上記のように遠心分離した。

上層の液体層を回収して上記のように沈殿させた０次に乾燥させたベレットを２ ０μｍの脱Ｈ，Ｏに懸濁させた。この懸濁させたベレットは、Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ 切断、フィルインした、Ｂａｍ　ＨＩ切断したｐＢＴａｃ２　ＤＮＡを含んでな っていた。

ｒｓＬｏ、３を、上記のように記載したブラズミドから除去した。ｒｓＬｏ、３ 　（１μｇ／１μｍ）を含んでなるブラズミド４０μｍへ、ＩＯＸのＳｍａＩ　 Ｂａｆｆｅｒおよび３２０μｌの脱イオンＨｚＯを加えた。この混合物に、５μ ｍのＳｍａ　Ｉ　（ＩＯＵ／μｍ）を加えてから、２時間３７℃で温置した。ブ ラズミドが切断されることを確実にするため、ゲル電気泳動（１％アガロースゲ ル）を行ったところ、単一バンドが得られ、好首尾の切断を示した。切断された ブラズミドに、８μｍの５ＭのＮ　ａ　Ｃ］、を加え、５μｍのＢａｍ　ＨＩ（ ＩＯＵ／μｍ）をさらに加えた。この混合物を、２時間３７℃で温置した。約６ ．３ＫｂｐΔ３３ベクターからｒｓＬｏ、３配列がうま（切断されるのを確実に するように、ゲル電気泳動（１％アガロースゲル）を行った。これは２つのバン ドをもたらし、１つは約６．３Ｋｂ　（ベクター）であり、もう１つは約１．４ ｋＢ　（ｒｓＬｏ、３）である、１．４Ｋｂバンドを、ゲルから切断され、２０ μｍの脱イオンＨ，Ｏで精製して、ｍ　Ｓ　Ｌ　０　。

３／６が準備したｐＢＴａｃ２ベクターの連結で利用できるようにした。

３μｍのベクターへ、２μｍのｍ５Ｌ０．３／６．１．５μｌの１０Ｘの連結緩 衝液（Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒ）（０，６６Ｍ＋７）ＴＲＩＳ−Ｃ１（ ｐＨ７，５）　、５０ｍＭ（７）ＭｇＣ１，，５０ｍＭのＤＴＴ、１０ｍＭのＡ ＴＰ）　、１．５μｌの１０ｍＭのＡＴＰおよび７μｍの脱イオンＨ，Ｏを加え た。その後、１．５μｍのＴ４リガーゼをそれに加えてから、室温で夜通し装置 した０便宜上、この混合物をｒサブクローンｒ１と呼ぶ。

Ｅ、コリ株ＪＭ１０５を、次のようにしてサブクローンにより移入した。凍結Ｊ Ｍ１０５受容細胞３００μｍを含むバイアルを解凍し、８．０μｍのサブクロー ン、をそれに加えた。この混合物を氷上で３０℃で培養してから、２分間３７℃ の水浴でヒートショックを行った。その後、形質転換したＪＭ１０５溶液を２ｍ ｌのＬＢ培地（１０ｇのバクトートリブタン（Ｂａｃｔｏ−ｔｒｉｐｔａｎｅ） ；５ｇのバクトイ−スト抽出物（Ｂａｃｔｏ　ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ）； ＬｏｇのＮａＣ１：１１の脱イオン水；水酸化ナトリウムによりｐＨ７，５）に 加えてから、３７℃で３０分間振盪（２０ＯＲＰＭ）した、その後、ＬＢアンピ シリンプレート（ＬＢＡｍｐｉｃｉ　１１　ｉｎ）上での平板培養（ｐ　１　ａ ｔ　ｉ　ｎｇ）を行い、次に、３７℃で夜通し増殖させた。スクリーニングは、 上記の血液オーバーレイ法を用いて行い、溶血を明示するコロニーを選択した。

ｒｓＬｏ、３サブクローンを含む選択したスクリーン済のコロニーを１２ｍ１の 久−バーブロスアンビシリンブイヨンに接種した。

培養液が、ＯＤ　ｓ。０の読み０．７の時、培養液へ最終濃度１ｍＭで、イソプ ロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ｉｓｏｐｒｐｙｉ−β−Ｄ−ｔｈｉ ｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）（ｒＩ　ＰＴＧＪ　）を加えることに より誘導を行った。得られる溶液１２ｍ１を１０分間４℃で８００ＯＲＰＭで遠 心分離し、得られるペレットを、１．２ｍ１Ｃ７）ＰＢＳ／１０ｍＭ（７）ＤＴ Ｔ！：懸濁サセた。懸濁させたベレットは、１．５分間音波処理し、音波処理の 抽出物のたんぽ（質濃度を、上記のバイオラッドたんばく質アッセイプロトコー ルを用いて測定した。たんぽ（質濃度は、９．３ｍｇ／ｍ１であると測定された 。このデータを用い、上記の２．５％洗浄済うさぎ赤血球プロトコールの５０％ ライゼに基づくタイターにより音波処理した抽出物の比溶血活性を測定した。ｒ ｓＬｏ、３を含んでなる培養物のタイターに基づ（溶血活性は、２．６９Ｘ１０ ”であると測定された。

上記の例は、ＳＬＯゲノムライブラリーの世代に向けられている、本分野のもの が認識するように、ゲノムＤＮＡライブラリーよりも複雑でないもう１つの種類 のライブラリーは、ｒ相補的ＤＮＡＪすなわちｒｃＤＮＡＪライブラリーである ＊　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａは、ｍＤＮＡから直接に誘導され、したがって、定義より、 ｃＤＮＡライブラリーは、翻訳の領域からなる。ｍ５Ｌｏ　ＤＮＡに相補的なｍ ＲＮＡに基づ＜ｃＤＮＡライブラリーを誘導する方法は、ｍ５Ｌｏについてのｃ ＤＮＡ系ライブラリーが本開示の一部であることが、熟達者の範囲と考えられる 。

たんばく質の折りたたみ ヌクレオチドの直線状の配置は、特定のコドンを定めるので、アミノ酸の配置す なわち配列は、その特定の機能を含めてたんばく質を定める。しかしながら、特 定のアミノ酸配列が、たんばく質の同定に関して重要であるのに対し、たんばく 質が示す特別な三次元の形も同様に重要である０本賞的に、形の上での特異性は 、たんばく質の性質を共同定義（ｃｏ−ｄｆｉｎｓ）する：なぜなら、たんぽ（ 質の形は、たんばく質にその特定のたんぽ（質の形を認識し得るだけの他の分子 と特異的に相互作用させるからである。

たいていのたんばく質は、その正しい形に自然と折れる。たんばく質をある糧の 変性溶剤により処理することにより、たんばく質は、柔軟な鎖へと「広がるＪこ とができる。変性剤を除くと、柔軟な鎖の一部は、その初めの構造へと再び折れ る。これは、たんばく質の折りたたみを支配する最も重要な因子のひとつが、そ のたんばく質のアミノ酸の極性（親水性すなわちｒ水を嫌う１）および非極性（ 疎水性すなわちｒ水を好む１）の側鎖の分布であるからである。変性溶剤は、ア ミノ酸ｇｆＩ頒の極性を妨害する０次のアミノ酸が極性側鎖を有する：Ａｓｎ； 　Ｇｉｎ；　Ｓｅｒ；　Ｔｈｒ；およびＴｙｒ、次のアミノ酸が非極性の側鎖を 有する：Ｇ１ｙ；　Ａｌａ；　Ｖａｌ；　Ｌｅｕ；　Ｉｓｏ；　Ｐｒｏ；　Ｐｈ ｅ；　Ｍｅｔ；　Ｔｒｐ；およびＣｙｓ、塩基性側鎖および酸性側鎖を有するア ミノ酸は、非常に極性である１次のアミノ酸は、塩基性側鎖を有する：Ｌｙｓ； 　Ａｒｇ；およびＨｉｓ　ｅ次のアミノ酸は、酸性側鎖を有する：Ａｓｐおよび Ｇｌｕ。

たんばく質が天然に存在する環境は、定義により、非変性環境であり、それは典 型的には、水性である。したがって、たんぽ（質の疎水性側鎖は、たんばく質分 子の内部で一緒に押し込められろ傾向があり、このことは、疎水性の側鎖が水性 の環境と接触するのを避けるのを可能とする。他方、極性の側鎖は、たんばく質 分子の外側近くで極性の側鎖自体配置する傾向があり、その位置で極性の側鎖は 水および他の極性の分子と相互作用し得る。

直線状ＤＮＡ配列が転写され対応するポリペプチドの正確なアミノ酸配列に翻訳 される分子的な機構はよくわかっているが、ポリペプチド鎖がどのように同時に かつ自主的にその三次元構造に折りたたまれるかは、よくはわかっていない、し かしながら、合成りＮＡすなわち組換え技術により合成されたＤＮＡの実際の可 能性は、たんばく賀設計の領域で実現されるであろう、しかしながら、これを実 現させるためには、たんばく質の折りたたみの機構がより簡潔に明らかとされね ばならない。配列からたんぽ（質構造を予測する一般的な問題は、とらえがたく （構造を配列に関連づけさせる規則が出現していないことが主な理由である）、 配列のある部分が、構造に重要であり、他の部分が、これらの部分に！換または 修飾が可能であることから構造の点で比較的に重要でないことが明白である。

したがって、たんばく質の配列の一部が、折り込まれたたんば（質の構造の安定 に有意的に寄与しているものと思われる。

たんばく質配列からたんばく質構造を予測することは、とらえにくいが、定義か ら、たんばく質は、測定することのできる独特な三次元構造を有している。たと えば、次の方法論が、たんばく質構造の測定に用いることができる：結晶学、光 学活性、核磁気共鳴分光学。

ａ）結晶学 たんばく質は結晶を形成し得る。たんば（質は、たんばく質の溶解度に影響する 多数の変数のうちの１つ以上を変えることにより達成され得る飽和または過飽和 の状態で通常結晶する。したがって、溶液のイオン濃度を変えるか、または有機 ポリマーたとえばポリエチレングリコールの利用により、たんばく質は晶出し得 る。たんぽ（質結晶を成長させる技術は、Ｎａｒａｎｇ、Ｓ、Ａ、Ｐｒ。

ｔｅｎ　Ｅｎ　１ｎｅｅｒｉｎ　：　Ａ　ｒｏａｃｈｅｓ　ｔ。

ｔｈｅ　Ｍａｎｉ　ｕユａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｆ立上旦エユ１（ Ｂｕｔｔｅｒｎｗｏｒｔｈ、Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ、Ｓｏｎｅｈａｍ　ＭＡ、、　 １９９０）、Ｃｈｐｔ、６（以下ｒＮａｒａｎｇＪとする）に記載されている。

上記の本は、参考としてここに示した。たんばく質を晶出したら、Ｘ−線、中性 子および電子回折法が用いられてたんばく質の構造が測定できる（好ましくはＸ −線回折法が用いられる）、結晶のたんばく質構造は、結晶形に対し分子の最小 限立体配座フリーエネルギーにあるかまたはその近（にあると思われる。

ｂ）光学活性 アミノ酸の不斉中心に起因し、また、その不斉配座に起因してポリペプチド／た んばく質の光学活性は、ポリペプチド／たんば（質の構造の測定に用いることが できる。この不斉は、たんば（質を右旋偏光および左旋偏光と異なるように相互 反応させる＝２つのビームがたんばく質を異なる速度で結果的に進行すると、偏 光は回転される。旋光分散（ｒＯＲＤＪ）は、波長へのこの回転の依存である。

たんぽ（質分子が光を吸収しない波長域で、回転は、波長と共に漸進的に変化す るが、吸収域では、回転は、１つの方向でまず鋭く増加し、吸収極大でゼロに下 がり、次に反対方向で鋭（リスト（ｒｉｓｔｅ）する。左旋偏光および右旋偏光 の不均等な吸収もあり、これは、円偏光２色性（ｒＣＤＪ）と呼ばれる。たんぽ （質のＣＤおよびＯＥＳスペクトルは、その構造的な立体配座に非常に鋭敏であ る。折りたたまれたたんば（質は、通常、近ＵＶ領域（２５０−３００ｎｍ）で 有意的に光学活性を有する。

Ｃ）核磁気共鳴分光学 たとえば、　＋Ｈ５”Ｃｓ　”Ｎｓ　”ｐおよび２Ｈを用いる核磁気共鳴分光学 は、溶液中のたんぽ（質の構造を研究するのに大いに役に立つことが証明されて いる。　＋Ｈに関心を払うと、分子中のそれぞれの水素原子は、核磁気スピンを 有している、すなわち、原子の核は、小さな磁石のようにふるまう、外部の磁界 の不在下で、プロトンの磁気モーメントはランダムに配向している。核磁気共鳴 の実験では、強い外部の磁界が、特定の方向に沿ってサンプルに加えられ、磁気 モーメントと特定の方向の軸線に沿う正味巨視的磁化（ｎｅｔ　ｍａｃｒｏｓｃ ｏｐｉｃ　ｍａｇｎｅｔｉｚａｔｉｏｎ）とが整合する：適当な強さの短いラジ オ周波数パルスが加わり、磁化ベクターがこの軸線から離れるようにノックする 。磁化が回復すると、過渡的なラジオ周波数信号が、時間の関数として記録され る。この信号のフーリエ変換は、周波数スペクトルを生じる０分子のそれぞれの プロトンは、そのプロトンの局部電子環境により定められるある特徴的な共鳴周 波数で起こるこのスペクトルでピークを生じさせる。特定のプロトンの共鳴周波 数は、そのｒ化学的シフトＪと呼ばれ、ある基準周波数からのオフセットとして 測定される。

ＮＭＲからのストラフチャード情報（ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ　ｉｎｆｏｒｍａｔ ｉｏｎ）は、核オーバーハウザー効果（ｎｕｌｃｅａｒ　０ｖｅｒｈａｕｓｅｒ 　ｅｆｆｅｃｔ）（ｒＮＯＥＪ　、これは１対のプロトンが、空間で互いに近い かどうかを定める）と３つ以下の化学結合により分離されるプロトンの結合定数 とから誘導される。ＮＯＥおよび結合定数は、−次元データを与える：二次元デ ータは、特に核オーバーハウザーエンハンスメント分光法（ＮＯＥＳＹ）と二次 元相関分光法（ＣＯＳＹ）とにより与えられ、そしてそのようなデータから、三 次元たんばく質構造が決定され得る。

たんぽ（質分子の三次元構造の決定について述べた上記の情報の点で、ＤＮＡ巨 大分子およびアミノ酸の後記の請求の範囲は、三次元構造をそれにより表される たんばく質分子と関連させて固有に含む。

ここに記載の例は、好ましい特定のベクター、プラスミドおよびホスト細胞に限 定されて解釈されろものではない、ここで説明のｒＳＬＯは、ｒＳＬｏ、３と呼 称した好ましいｒｓＬｏまたは好ましいベクター、プラスミドおよびホスト細胞 だけに限定されると解釈されるものではない。同様に、好ましいｒｓＬｏ、３は 、ＤＮＡおよびそのアミノ酸配列が本出願人の題しているＤＮＡおよびアミノ酸 配列だけでであるということを実際上意味することでも暗示するものでもない、 これらは、適用できる特許法のもとに十分な保護を受ける資格がある。

指定により物質をクレームする目的で、ｐΔ３３−ｒｓＬｏ、３を含んでなるプ ラスミドで形質転換したＡＲ１２０およびｐＢＴａｃＤＮＡ−ｒｓＬｏ、３を含 んでなるプラスミドで形質転換した３Ｍ１０５を１９９１年８月２３日に、ザ・ アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　 ＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）　（ＡＴＣＣ）、１２３０１ 　Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ 、２０８５２に特許手続き上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約 （ｔｈｅ　Ｂｕｄａｐｅｓｔ　Ｔｒｅａｔｙ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｉｎｔｅｒｎａ ｔｉｏｎａｌ　Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｄｅｐｏｓｉｔ　ｏｆ 　Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｐｕｒｐｏｓｅ　ｏｆＰａ ｔｅｎｔ　Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）の条項により寄託した。これらは、１９９１年 ８月２７日にｔｈｅ　ＡＴＣＣにより試験され両方とも生存できると測定された 。ｔｈｅ　ＡＴＣＣは、これらの物質にそれぞれ寄託番号ＡＴＣＣ６８６７５お よびＡＴＣＣ６８６７７を付与した。

ここになした開示に基づき、当業者は、図１に示したＤＮＡ配列の断片が、野生 型ＳＬＯの特徴的な少なくとも１つのエピトープ部位（ｅｐｉｔｏｐｉｃ　５ｉ ｔｅ）を保持し続け、溶血特性を維持する該図１に示したＤＮＡ配列の断片を容 易に得ることができる。

さらに、気づかれるように、ヌクレオチドの保存置換（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖ ｅ　５ｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）は、当業者に理解され認められるように、アミ ノ酸配列の付随する変化なしに行われ得る。たとえば、ｒコンピュタ−ライズド パツク翻訳（ｃｏｍｐｕｔｅｒｉｚｅｄ　ｂａｃｋ　ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ） Ｊが用いられ得、これにより、アミノ酸配列がコンビエータ−により分析され、 コンピューターが、そのようなアミノ酸を暗号化するに必要なコドンに用いるた めの最適ヌクレオチドを決定する。さらに、ＤＮＡ合成技術は、図１のＤＮＡ配 列の長さを有するオリゴヌクレオチドが得られるように進行するので、技術のそ のような進行と共に適当にその配列を合成できる。

ＳＬＯ誘導体のスクリーニングが、上記の血液オーバーレイ法を用いて容易に達 成できるので、多数のＳＬＯ誘導体候補を迅速に評価できる。したがって、当業 者は、この方法を用いてＳＬＯ誘導体類似体候補を誘導し、溶血活性の表示のた めのこれらの候補を迅速にスクリーニングして、類似体の核酸およびアミノ酸配 列を決定することが容易にできる。

したがって、ここに記載の例が、特定のＳＬ・０特異体であるｒＬＳｏ、３に向 けられていて、技術のこの進歩をものにすれば、当業者は、本分野で公知の技術 を用いてこの進歩を当業者自身に適用できるので、本出願人の発明は、上記に定 めた特徴を有するＳＬＯ誘導体を含むと理解され、例に開示した特定の誘導体に 限定されるものではない。

本発明は、ある好ましい実施態様について記載したが、本発明の教示の範囲に入 る他の実施態様も可能である。特定のＳＬＯ誘導体の産生を詳述したが、それ自 体代表例と解釈されるべきである。したがって、開示も後記の請求の範囲もここ に記載の好ましい実施態様の説明により限定されることを意図するものでも解釈 されるものでもない。

３７Ｃ，Ｆ、Ｒ，１１，８２１（ｃ）配列一覧表（１）一般情報 （ｉ）出願人：アダムス、フレイブＭ、（Ａｄａｍｓ。

ＣｒａｉｇＭ、）およびワンプ、エバＹ、（Ｗａｎｇ、ＥｖａＹ、） （ｉｉ）発明の名称：ストレプトリシン０誘導体（ｉｉｉ）配列：　２ （ｉｖ）通信住所： （Ａ）受信人；　ベックマン・インストラメンツ社（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｉｎｓｔ ｒｕｍｅｎｔｓ、Ｉｎｃ、）（Ｂ）通り：　２５００ハーバ−大通り（２５００ Ｈａｒｂｏｒ　Ｂｌｖｄ、） （Ｃ）市：フラートン（Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ）（Ｄ）州：カリホルニア（Ｃａｌ ｉｆｏｒｎｉａ）（Ｅ）国：アメリカ合衆国（ＵＳＡ） （Ｆ）郵便番号（ＺＩＰ）：９２６３４（Ｖ）コンピューター読み取り可能フオ ーム：（Ａ）媒体タイプ：ディスケット、３．５インチ、１．４４Ｍｂ （Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ （Ｃ）作動システム：ＭＳ、ＤＯＳ （Ｄ）ソフトウェアー：ＷｏｒｄＰｅｒｆｅｃｔ５．１ （ｖｉ）現在の出願データ（ＣＵＲＲＥＮＴ　ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮ　ＤＡＴ Ａ： （Ａ）出願番号：　（ここに記載） ＣＢ）出願日＝　（ここに記載） （Ｃ）分類： （ｖｉｉ）先行出願データ：　（適用不可）（Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日二 （ｖｉｉｉ）弁理士／代理人情報 （Ａ）名前：バーグーン、リチャードＰ、（Ｂｕｒｇｏｏｎ、Ｒｉｃｈａｒｄ　 Ｐ、） （Ｂ）登録番号：３４．７８７ （Ｃ）参照／名簿番号：　１２８Ｄ−１０２３（ｉｘ）電気通信情報 （Ａ）電話：　（７１４）　７７３−７６１０（Ｂ）テレファックス：　（７１ ４）　７７３−７９（２）ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、の情報＝１（ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：１５２４塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖特性（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ）：　二重（Ｄ）トポロジー二直線状 （ｉ　ｉ）分子タイプ：ゲノムＤＮＡ （ｖｉ）初期の給源： （Ａ）生物体：ストレブトコツカスビョゲネス（ｖｉｉ）即時（ＩＭＭＥＤＩＡ ＴＥ）給源：（Ａ）ライブラリー：ゲノム （Ｂ）クローン：５ＳＬ０．３ （ｘｉ）配列記事：ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、：１ａｃｅ　’ｒｒｒ雇αスαテコ嵩 α込λスズの７に１Ｎπλぼα講に１８６４ＴＸＣＴＣＴ　ＧＡＴ　ＡＴＣＴＴ Ａ　ＱＡＡ　ＡＡＴ　ＡＧＣＴＣＡ　’ＩＴ丁ＡＣλ　ＧＣＴＧＴＣＧＴＴ　ｆ ｆ１ＧＧＡ　９１２ＧＣτＴＡＴ　ＣＣτＪＬＴＴＴＣλＴＸＣＡＣＣＡＧＧＣ ＴＴ　Ｔ！’ＣＣＴ丁λＡＡλＡＴ　ＪｕＴ　ＭＡ　ＡＴＴ　１０５６ＧＣＧ　 ＧＧＴ　ＧＴＣＪＩＪＬＴ　ＡＡＣＡＧＡ　ＡＣＴ　ＧＡＡ　ＴＡＣＧＴｒ’　 ＧＡＡ　ＡＣＡ　ＡＣＡ　ＴＣＴ　λＣＣＧＡＧ　P１０４ ＴＡｃＲＣＴ　ＡＧＴ　ＧＪｈ　ＡＡＡ　ＡＴＴ　ＪＬＡＩ：　Ｃ！’Ｇ　ＴＣ Ｔ　ＣＡＴ　ＣＡＡ　ＧＧＣＧＣＧ　ＴＪＬＴ　ＧＴＴ　ＧbＴ　１１５２ （ＪＡ　ＴＡＴ　ＧＡＡ　ＡＴＣＣＴＴＴＧＧ　ＧｋＴ　ＣＡＡ　ＡＴＣｋｋＴ 　Ｔ’にτＧＡτＣ＆　入ＡＡ　ＧＧＡ　ＡＡＡ　１２００（ＪＬＡ　Ｇ”１ｍ 　ＡＴＴ　ＡＣＡ　ＭＡ　ＣＧＡ　ＣＧＴ　ＴＧＧ　ＧＡＴ　Ｍｅ　ＡＡＣＴＧ Ｇ　’！Ｍ　ＡＧＴ　ＭＧ　ＡＣＡ　１Q４１１ ＴＣＸＣＣＡ　ＴＴｒ　ＡＧＣＡＣＡ　ＧＴｒ　ｋＪ’ｃ　ＣＣＡ　Ｃ：ＡＧα ＡＧＣτλＡ丁ＴＯＬ　Ｃ（ａλＡＩＴ　ＡＴｈ　１２９６ＭＡ　ＧＴＧ　ＡＴ ＣＧＡＩ：　ＧＡＡ　Ｍ入ＣλτＧＴＧ　入ＡＡＣｒＧ　τＣτＭＡαＡＡ　Ａ ＴＣＡＡτＧＴＣ１３９２ＴＡＧ　Ｇｏｄ：　ＴＧＧ　ＴＴＣＡＡＧ　ＡＧＧ　 Ｔｒｌ：　ＧＴＣＡＡＧ　ＣＮ：　ＣｒＴ　Ｇｋｒ　ＧＣＴ　ＧＣｒ　Ｔ）Ｔ　 ＣＴＣP４１１８ ＴｒＧ　ＡＧＡ　ＴＣＣＣＣＧ　ＧＧＴ　ＡＧＧ　ＣＣｒ　ＡＧＴ　Ｔ）ｋＡ　 ＣＴＡ　ＧＴＣＧＡＣ１５２４（３）ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、の情報：２（ｉ）配 列特性： （Ａ）長さ＝４８０アミノ酸 （Ｂ）タイプ：アミノ酸 （Ｃ）トポロジー：直線状 （ｉｉ）分子タイプ：たんばく賞 （ｉｘ）特徴： （Ａ）名前／キー：シグナル配列 （Ｂ）位置：ＳＬＯのアミノ酸９８からアミノ酸５７１まで （Ｃ）同定方法二組換えベクターから可溶性で溶血活性なＳＬＯの生成に基づい て実験的に定める。

（Ｄ）他の情報：リセス赤血球 （ｘｉ）配列記事：ＳＥＱ　ＴＤ　Ｎｏ、：２Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ 　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ｌｅｕ　Ｊｕａ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ 　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　ＧｌｕＡＳｎ　ＬＹ！Ｊ　ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｖａｌ 　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　ｐｒｏ　Ｇｉｎ　Ｌｙｓ　工”ｘ ｅ　Ｈ奄■ １１ｅ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｍｅｔ：　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ 　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ａｓ■ ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　 工１ａ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ｇ１ｎＴｒｐ　Ｈｉｓ　Ａ ｓｐ　Ａｓｎ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　ｐ ｒｏ　Ｊｕａ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ｇ１ｎＴｙｒ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｍｅ 亡Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｇ１ｎ工ｌｅ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　 Ａｌａ　Ｌｅｕ１６０　１Ｇ５　１７０ Ａｊ！ｎ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　ＩＪｙｓ工１ｅ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ 　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　ＧｌｙＬｙｓ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　ＬｙｓＳｅｒ　工ｌ＝　Ｓ ｅｒ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｍｅヒ　エｌｅ　Ａ ｌａ　Ａｌａ　Ｔｙｒ　Ｌｙｓ　Ｇ１ｎ工１ｅ　Ｐｈｅ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ｖａ ｌ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ａｌ ａ　Ａｓｐ　Ｖａ１Ｐｈｅ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ 　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　５ｅｒ Ａｓｎ　Ｇｌｕ　Ａｈａ　ＰｒＯＰｒｏ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｖａｎ　Ｓｅｒ　Ａ ｓｎ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｔｙｒ　ＧＩＹ　Ａｒｇ　ＴｈｒＶａｌ　ｐｈｅ　Ｖａ ｌ　ＬＹ！９　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　ＬｙｓＳｅｒ　Ａ９ ｎ　Ａ−５ｉｐ　ｖａＩＧｌｕ　ＡＩdＬ Ａｌａ　ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　 ｊＬＩＩｐ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　ＧｌｙＬｙ■ ２７５　２ＥＩＯ２８５ Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ工ｌａ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｓａｒ　Ｐ ｈｅ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｖａ、ｌ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　ＧｌｙＬｙｓ　Ａｒｇ　Ａ ｓｎ　Ｖａｌ工１ｅ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｓｅ ｒ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｐｒ。

Ａｈａ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ａ５ｎ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　 Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　ＧｌｕＴｙｒ　Ｔｈｒ　Ｓ ｅｒ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ工１ｅ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｈｌｓ　Ｇｌｎ　Ｇｌ ｙ　Ａｌａ　Ｔｙｒ　Ｖａｌｌ、ＡｌａＧｌｎ　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ工１ｅ　Ｌｅｕ 　Ｔｒｐ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ工１ｅ　Ａｓｎ　Ｔｙｒ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　 Ｇｌｙ　ＬｙｓＧｌｕ　Ｖａｌ工１ｅ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｔｒ ｐ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｔｒｐ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　ＴｈｒＳｅｒ 　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ工１ｅ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　 Ａｌａ　Ａｓｎ　ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ａｓｎ工１ｅＡｒｇ　工ｌｅ　Ｍｅヒ　Ａｌ ａ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｃｙｓ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｔｒｐ　Ｇｌ ｕ　Ｔｒｐ　Ｔｒｐ　ＡｒｇＬｙｓ　Ｖａｌ工１ｅ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　 Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ工１ｅ　Ａｓｎ　Ｖ ａｎＡｓｎ工ＩｅＳｅｒ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　 Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ工１ｅ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　ＬｙｓＡＴＣＧＡＴ　ＣＣＧ 　ＴＣＡ　ＧＡＡ　ＧＡＣ入入Ａ入ＡＡ　入ＡＧ　入ＧＣＧ入ＡＧλＡＧ入ＴＣ λＣλＣ丁Ｇ入入　４ＢにＭ　ＡＴＣＭＴ　ＧＡＣＡＡＧ　ＡＴＴ　ＴＡＴ　Ｔ ＣＡ　ＣＴＡ　ＡＡＴ　ＴＡＴ　ＡＡＴ　ＧＡＧ　ＣＴＴ　Ｇ入入ＧＴＡ　９６ ＣＴＴ　ＧＣＴ　ＡＡＡ　ＡＡＴ　にＧＣＴ　ＧＡＡ　ＡＣＣＡＴＴ　ＧＡＡ　 ＡＡＴ−１ＧＴｒα：Ｔ　ＡＡＡ　Ｇｋｋ　ＧＧＣ１４４Ｃ’ｌ’７　ＡＡＧ　 ＡＡＡ　ＧＣＴ　ＧＡＴ　入ＡＡＴＴ丁　入ＴＴ　ＧＴＣ入ＴｒＧ入Ａ　ＡＧＡ 　ＡＡＧ　入ＡＡ　ＭＡ　ＡＡＴ　１X２ Ａ＋ｒＣＭＣＡＣＴ　ＡＣＡ　ＣＣＡ　ＧＴＣＧＡ丁ＡＴＴ　ＴＣＣＡＴＣＡＴ Ｔ　ＧＡＣＴＣＴ　ＧＴＣＡＣＴ　ＣＡＴ　２４０ＡＧＧ　ＡｃＣＴＡＴ　ＣＣ Ａ　’ＧＣＡ　ＧＣＣＣＴＴ　ＣＡＧ　ＣＴＧ　ＧＣＴ　入入丁　ＡＡＡ　ＧＧ Ｔ　ＴＴＴ　ＡＣＣＧＡＡ　２W８ ＡＡＣＡＡＡ　ＣＣＡ　ＧＡＣＧＣＧ　ＧＴＡ　ＧＴＣＡＣＣｋｋＧ　ＣＧＡ　 ｋｋｃ　ＣＣＡ　ＣＡＡ　ＡＡＡ　ＡＴＣＣＡＴ　３３６ＡＴＴ　ＧＡＴ　Ｔｒ Ａ　Ｃ（Ｊ　ＧＧＴ　ＡＴＧ　ＧにＡ　ＧＡＣＡＡＡ　ＧＣＡ　ＡＣＧ　ＧＴｒ 　ＧＡＧ　ＧＴＣＡＡＴＧＡＣ３＋＋S ＣＣ＋ｒ　ＡＣＣＴＡ丁ＧＣＣＡＡＴ　ＣＴＴＴＣ入入Ｃ入ＧＣＴ　ＡＴＴ　Ｇ ＡＴ　入ＡＴ　ＣＴＴ　ＧＴＴ　λＡＣＣ入入　４３２２　ＣＡＴ　（ＪＴ　Ａ ＡＴ　丁ＡＴ　ＴＣＴ　ＧＧＴ　ＣＧＴ　ＡＡＴ　ＡＣＧ　ＣＴＴ　ＣＣＴ　Ｇ ＣＣ入ＧＡ　ＡＣＡ　ＧＡＡ　４８O 丁ＡＴ　ＡＣＴ　ＧＡＡ　ＴＣＣＡＴＣＧＴＡ　ＴＡＴ　ＴＣＴ　ＡＡＧ　ＴＣ Ａ　ＣＡＧ　ＡＴｒ　ＧＡＡ　ＧＣＡ　ＧＣＴ　ＣＴＡ　５Q８ ＡＡＴ　ＧＴＴ　ＡＡＴ　ＡＣＣＡＡＡ　ＡＴＣＴＴＡ　ＧＡＴ　にＧＣＴ　Ａ ＣＴ　ＴＴＡ　ＧＧＣＡＴｒ’　ＯＡＴ　ＴｒＣＡＡＧ　５V６ ＴＣＧ　ＡＴＴ　ＴＣＡ　ＡＡＡ　ＧＧＴ　ＧＡＡ　ＡＡＧ　ＡＡＧ　ＧＴＧ　 ＡＴＧ　ＡＴＴ　ＧＣＡ　ＧＣＡ　ＴＡＣＡＡＧ　ＣＡＡ　U２４ ＡＴｒ　ＴＩＴ　ＴＡＣＡＣＣＧＴｘ　ＴＣＡ　ＧＣＡ　ＡＡＣＣＴｒ　ＣＯＴ 　ＡＡＴ　ＡＡＴ　ＣＣＴ　ＧＣＧ　ＧＡＴ　ＧＴＧ　６７Q ｆ！Ｔ　ＧＡＴ　ＡＡＡ　ＴＣＡ　ＧＴＧ　ＡＣＣＴＴＴ　ＡＡＡ　ＧＡＧ　Ｔ ＴＧ　ＣＭ　ＣＧＡ　ＡＡＡ　ＧＧＴ　ＧＴＣＡＧＣ７２０ＡＡＴ　ＧＡＡ　Ｇ ＣＴ　ＣＣＧ　ＣＣＡ　ＣＴＣＴＩＴ　ＧＴＧＡＧ’ｒ　ＡＡＣＧＴＡ　ＧＣＣ ＴｋＴ　ＣＧＴ　ＣＧＡ　ＡＣＴ　７６■ ＧＴＴ　ＴＴＴ　ＧＴＣＡＡＡ　ＣＴＡ　ＧｋＡ　ＡＣＡ　ＡＧＴ　ＴＣ’Ｔ　 ＡＡＡ　ＡＧＴ　ＡＡＴ　ＧＡＴ　（ＴＴ　ＧＡ入ＧＣＧ　W１６ ＧＣＣＴＴＴ　ＡＧＴ　ＧＣＡ　ＧＣＴ　ＣＴＡ　ＡＭ　ＧＧ入ＡＣＡ　ＣＡＴ ＧＴＴ　入入入ＡＣＴ　入入τＧＧＡ　λ入λ　８６４ＴＡＣＴＣＴ　ＧＡＴ　 ＡＴＣＴＴＡ　ＧＡＡ　ＡＡＴＡＣＣＴＣＡ　ｆｆｒ　入ＣＡ　ＧＣＴ　ＧＴＣ ＧＴＩ”ＩＴＡ　ＣＧＡ　９１２ＧＧ入　ＧＡＴ　ＧＣＴ　ＧＣＡ　ＣＡＧ　Ｃ ＡＣＡＡＴ　ＡＡＧ　ＧＴＡ　ＧＴＣＡＣＡ　ＡＡ４　ＧＡＣＴＴＴ　Ｇ入ＴＧ ＴＴ　９６０ＡＴＴ　ＡＧＡ　ＡＡＣＧＴＴ　ＡＴＣＡＡＡ　ＧＡＣＡＡＴ　Ｇ ＣＴ　ＡＣＣＴＴｑ　ＡＧＴ　λＧλＡ入入入八ＣＣへ入　１００ＢＧＣＴ　Ｔ ＡＴ　ＣＣ’Ｔ　ＡＴＴ　ＴＣＡ　ＴＡＣＡＣＣＡＧＴ　ＧＴＴＴＴＣＣＴＴ　 ＡＡＡ　ＡＡＴ　ＡＡＴ　ＪＪｔ入ＡＴＴ　１ｃP５６ ＧＣＧ　にＧＣＴ　ＧＴＣＡＡＴ　ＡＡＣＡＧＡ　ＡＣＴ　Ｇ入Ａ’ＴＡＣＧＴ Ｔ　ＣＡＡ　ＡＣＡ　ＡＣＡ　ＴＣＴＡＣＣＧＪＵ　′、１O４ Ｔ入ＣＡＣＴＡＧＴ　ＧＧＡ　ＭＡ　ＡＴＴ　ＡＡＣＣＴＧ　ＴＣＴ　ＣＡＴ　 ＣＡＡ　ＧＧＣＧＣＧ　ＴＡＴ　ＧＴＴ　ＧＣＴ　１１５２ＣＡＡ　ＴＡＴ　Ｃ ＡＡ　ＡＴＣＣＴＴ　ＴＧＧ　ＧＡＴ　ＧＡＡ入ＴＣＡＡτＴＡＴ　ＧＡＴ　Ｇ 入Ｃ入ｋｈＧＧｋ）ＪＡ　１２００Ｆｉｇ、　１ ＧＡＡ　ＧＴＧ　ＡＴＴ　ＡＣＡ　ＡＡＡ　ＣＧＡ　ＣＧτＴＧＧＧ入丁ＡＡＣ ＡＡＣＴＧＧ　ＴＡＡＡＣＴ　ＭＧ　ＡＣＡ　１２４８τＣＡ　ＣＣＡ　ＴＴＴ 　ＡＧＣＡＣＡ　ＣＴＴ　ＡＴＣＣＣＡ　Ｃτ入ＧＧＡ　ＧＣＴ　ＡＡＴ　ＴＣ Ａ　ＣＧＡ　ＡＡＴ　ＡＴＡ　１２^ロ ＣＧＴ　入丁ＣｋＴＧ　ＧＣＴ　ＡＧＡ　ＧＡＧ　ＴＧＣＡＣＣＧＧＣＴｒＡ　 ＧＣＴ　ＴＧＣＧＡＪ３ＴＧＧ　ＴＧＧ　ＣＧＡ　１３４４ＡＡＡ　ＧＴＧ　Ａ ＴＣＧＡＣＧＡＡ　ＡＧＡ　ＧＡＴ　ＣＴＧ　ＡＡＡ　ＣＴＣＴＣＴ　ＡＡＡ　 ＧＡＡ　ＡＴＣＡＡＴ　ＧＴＣ１３９２人ＡＣＡＴＣＴＣＡ　ＧＧＡ　ＴＣＡ　 ＡＣＣＣＴＧ　ＡＧＣＣＣＡ　ＴＡＴ　Ｇｌｌ；Ｔ　ＴＣ；　ＡＴＴ　ＡＣＴ　 ＴＡＴ　ＡＡＧ　１S４０ ＴＡＧ　ＧＡＣＴＧＧ　ＴＴＧ　ＡＡＧ　ＡＧＧ　ＴｒＣＧＴＣＡＡＧ　ＣＡ、 ＣＣＴＴ　ＧＡＴ　ＧＣ丁ＧＣＴＴ入Ｔ　ＣＴＣ１４１１８Ｔ！’Ｇ　ＡＧＡ　 ＴＣＣＣＣＧ　ＧＧ’！’　ＡＧＧ　ＣＣＴ　ＡＧＴ　ＴＭ　ＣＴＡ　ＧＴＣＧ ＡＣ１５２４Ｍｅｅ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ｌｙ ｓ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｈｉｓ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ−２− Ｉ　Ｓ　１０ Ｇｌｕ工１ｅ　Ａｓｎ　ｘｓｐ　ＬＹＳ　：Ｌｅ　Ｔ’、”ｆ：　ｓｅｒ　Ｌｅ ｕ　ｋｓｎ　Ｔｙｒ　Ａｓｎ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｖ≠P １５２０　フ５　３０ Ｌｅｕ　−人１＆　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｘ：ｅ　ＧＬｕ 　Ａｓｎ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　ＧＬ■ Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　工１ｅ　Ｖａｌ　 工１ｅ　ＧＬｕ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌ、ｙｓ　Ａｓ■ ５ｏ　５５　６０ 工１ｅ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　工１ｅ　Ｓｅｒ　 工１ｅ　工ｌｅ　Ａｓｐ　５ｅｒＶａｌ　Ｔｈｒ　Ａｓｐｋｒｇ　Ｔｈｒ　Ｔｙ ｒ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ｌｙ ｓ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　ＧｌｕＡｓｒｔ、　Ｌｙｓ　９ｒｏ　Ａｓｐ　Ａ ｌａ　Ｖａｎ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ入ｒｇ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　Ｌｙ ｓ工ｌｅ　Ｈ”−T ９５’００　１０５　１１０ Ｔｒｐ　Ｈｉｓ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ｔｙｒ　Ｓｅｘ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　 Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ｇ１ｎＴｙｒ　Ｔｈｒ　Ｇ Ｌｕ　Ｓａｒ　Ｍｅｃ　ＶａＬ　Ｔｙ−、Ｓｅｘ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ工” ｂｅ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ａｌａ　ＬａｕＡｓｎ　Ｖａ工Ａｓｒｌ　Ｓｅｒ　ＬＹ Ｓ　Ｘ１ｅ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｇｌｙτｆｉｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙエエａ　Ａｓｐ 　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ’ｈ１５１００　１８５　１９０ ｓｅｔ　＝ｌｅ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　 Ｍｅｅ　工１ｅ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｔｙｒ　Ｌｙｓ　Ｇ１ｎＰｈ＠Ａｓｐ　Ｌｙ ｓ　Ｓａｒ　Ｖａ工Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ 　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　５ａｒＦ”Ｊ、、２ Ｖａｌ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｌａｕ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　 Ｌｙｓ　Ｅａｒ　Ａｓｎ　Ａｓｐ　ＶａＬ　Ｇｌｕ　ＡｌａＡｌａ　Ｐｈｅ　Ｓ ａｒ　Ａｌａλｌａ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｌｙ ｓ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　ＬｙｓＴｖ１：　Ｓｐｌ　入ｓｐ　工１ａ　Ｌａ ｕ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｖａ ｌ　Ｌｅｕ　ＧＬ■ ２９０　、　２９５　３００ Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ａｌｌ　Ａｌａ、　Ｑｌｕ　Ｈｌｓ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ、Ｖａｌ 　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓλｓｐ　Ｐｈａ　Ａｓｐ　Ｖａ１工１ｅ　Ａｒｇ　Ａ ｓｎ　Ｖａｌ　工１ｅ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　入１ａ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｓ ａｒ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｐｒ。

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Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. １．溶血活性を明示するストレプトリシンＯの可溶性誘導体をコード化するＤＮ Ａ配列から本質的になる精製及び単離されたＤＮＡ配列。
2. ２．前記ＤＮＡ配列が図１に示した配列である可溶性誘導体ストレプトリシンＯ をコード化するＤＮＡ配列。
3. ３．ホスト細胞がストレプトリシンＯを発現するように請求の範囲第１項または 第２項に記載のＤＮＡ配列で形質転換されたまたはトランスフェクトされた原核 または真核ホスト細胞。
4. ４．請求の範囲第１項または第２項に記載のＤＮＡ配列およびＤＮＡベクターを 含んでなるＤＮＡプラスミド。
5. ５．請求の範囲第４項に記数のＤＮＡプラスミドにより形質転換されたまたはト ランスフェクトされた原核または真核ホスト細胞。
6. ６．ストレプトリシンＯの誘導体のそのアミノ酸配列を有する可溶性ポリペプチ ドをコード化するＤＮＡ配列から本質的になる精製及び単離されたＤＮＡ配列。
7. ７．アミノ酸配列が図２に示した配列であるストレプトリシンＯの可溶性変異体 をコード化するアミノ酸配列。
8. ８．ＡＴＴＣ寄託番号ＡＴＣＣ６８６７５を有する物質により形質発現されるこ とのできる物質と実質的に同じ性質を有するストレプトリシンＯの誘導体。
9. ９．ＡＴＣＣ寄託番号ＡＴＣＣ６８６７７を有する物質により形質発現されるこ とのできる物質と実質的に同じ性質を有するストレプトリシンＯの誘導体。