JPS61143327A - 多効果免疫性蛋白質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は免疫性蛋白質、組換ＤＮＡ技術によるそれらの
製造、それらの治療薬としての用途および新規な中間体
に関する。

〔従来の技術〕

微生物が一つの化合物、しばしば低分子量の化合物から
規則的に組みたてられて高分子量の物質を提供し得る構
成要素を有することは、多数の微生物の知られた特性で
ある。これらの高分子量の物質は、種々の形態をとり得
る０例えば、ウィルスの場合の蛋白質コート、ある種の
バクテリアの場合の繊毛である。そして低分子量物質が
炭水化物である場合は、高分子量物質はバクテリアの細
胞壁であり得る。この高分子量物質は、しばしば高度に
免疫性である。

この組みたてプロセスの一例として、Ｂ型肝炎の表面抗
原は分子量２９．Ｇｏｏダルトンのグリコプロティンか
らなる。このグリコプロティンは、集合に際して１３０
のサブユニットを含有し、３．８×ｔＯＳダルトンの分
子量を有し、ゾーン粒子として知られる粒子を形成する
。同様な状態はタバコモザイックウイルス（以下、ＴＭ
Ｖと略記する）についても、比較的小さい蛋白質が単純
ならせんに凝集して多数の比較的小さい蛋白質を含むロ
ッドを形成する場合に起きる。ビールスの場合には。

しばしばサブユニット蛋白質は、ビールスの他の構成要
素が存在することなしに、かつ完全に劫ｖｉｔｒｏ　　
（イン　ビトロ）条件下に、最終的な重合体の形態に集
まることができる。

それ自体が抗原性である比較的大きい分子に結合した場
合、しばしば免疫原として、Ｌ！　■怠（イン　ビボ）
系において抗体を発現させる能力において弱い作用しか
しない小さい分子が、比較的小さい分子に対する改良さ
れた抗体応答、並びに比較的大きいキャリアー分子に対
する正常な応答をおこすことも知られている。この大き
い方の分子に結合した小さい分子は、ハプテンと称され
、そのサイズは小さいものから非常に大きなものまで変
り得る。このコンビネーションの一例において、保健の
分野で興味があることであるが。

それ自体免疫性でない１５のアミノ酸のシーフェンスを
含むＢ型肝炎の表面抗原の小部分は抗原蛋白質、鍵穴に
付着しているヘモシアニン、並びに自然のまへの表面抗
原および全肝炎ウィルスと交差反応した、Ｌ！　■Ｖ系
における発現された接合抗体に共有結合されていた。こ
のキャリアー−ハプテン系は、それに対してハプテンが
指令する、疾患に対する有効なワクチンの基礎となり得
た。

米国特許第４．４ｉ９６，５３８に開示されたこの一般
的なアイデアの改良において、キャリアーハプテンワク
チンは、公知の病原体、ヘモフィルス・インフルエンゼ
ｘ　ｂ　　（Ｈａｅｓｏｐｈｉｌｕｓ　１ｎｆｌｕｅｎ
ｚａｅ　ｂ）、からの炭水化物であるハプテンおよびジ
フテリア・トキソイド（ｄｉｐｂｔｈｅｒｉａ　ｔｏｘ
ｏｉｄ）であるキャリアー毫含むことができる。このキ
ャリアーハプテンは免疫性であるばかりでなく、疾患か
ら保護するであろうことが示された。

置換ＤＮＡ技術は、生体に通常は無関係である蛋白質を
、微生物中にかなり多量に生成させるのに用いられた。

このような技術は生体中に目的とする無関係な蛋白質の
ための暗号を指令するＤＮＡを含むベクターを挿入する
ことを含む、この方法において１個体が無関係な蛋白質
のみならず。

天然に生成されるものとは異なる蛋白質をも、アミノ酸
のシーフェンス、アディションまたはサブトラクション
を変更することにより生成することが可能である。これ
らの無関係な蛋白質のために暗号を指令する遺伝子は天
然のソースから単離されてもよいし、合成されてもよい
、また、制限酵素を用いて、変更された蛋白質のための
遺伝子を得るよう変えてもよい。

ウィルスの蛋白質の生成に適用された、このような組換
ＤＮＡ技術はワクチンとして使用し得る蛋白質の調製を
可能とする。これらワクチンは、ウィルスが細胞基質上
で培養され、また最終ワクチンが細胞基質、培養基およ
びウィルスからの核酸（これらは全て有害な影響を有し
うる）からの生成物を含有することがある標準方法によ
り製造された現在のウィルスのワクチンに伴われる汚染
物質を含有しないであろう。

〔発明の開示〕

本発明においては、以下に記載するように、ある種の新
規な蛋白質物質が提供される。この蛋白質物質は、多効
果免疫ワクチンを提供するのに有用であり、かつ上記の
キャリアー−ハプテンのコンセプトを採用する組換ＤＮ
Ａ技術により製造される。

本発明の一つの態様により、通常、免疫性の、比較的高
分子量の蛋白質物質に自己集合する低分子量のキャリア
ー蛋白質部分および病原性疾患に対する抗原のエピトー
プを表わす、上記低分子量キャリア一部分に結合される
ペプチド部分であるハプテン部分を含有する接合蛋白質
が提供される。キャリアー蛋白質へのハプテンの結合の
仕方は、キャリアー蛋白質の自己集合性が害されず、か
つ自己集合性蛋白質の集合に際して、ハプテンが免疫系
によるハプテンの認識が可能なごとく。

組たてられた粒子の表面に存在するようになされるのが
適当である。

自己集合性蛋白質とへブテンのコンビネーシ重ンは、高
分子量構造に集合され、かつｉｎ　　ｖｉｖｏで導入さ
れた場合、自己集合性蛋白質およびハプテンに抗体を生
成させ、その結果、エピトープがそれに対して暗号を指
令する疾患に対する保護、並びに自己集合性蛋白質に対
する免疫の応答を生ずる。

本発明の重要な、有利な、かつ新規な特徴は、集合され
た蛋白質が自己集合性蛋白質に結合した異なるハプテン
によって、蛋白質が集合する場合、生成した蛋白質の粒
子が多数の異なったエピトープを表面に有するように調
製され得ることである。これらのウィルスの粒子がｉｎ
　　ｖｉｖｏで用いられる場合、全てのハプテンに対す
る抗体が発現され、それによって、ハプテンがそれに対
して存在する疾患に対して保護する。この方法において
、多数の疾患に対するただ一回の予防接種が、ただ一つ
の活性蛋白質物質の調製と使用により提供される。

本発明の接合蛋白質は、合成遺伝子を組換ＤＮＡ技術に
よりベクター中に挿入し、この組換ベクターを個体中に
導入し、個体を育成し、蛋白質−ハプテン接合物を単離
し、ついでこの接合物を集合させておくことによって有
利に調製される。

本発明は、どんな自己集合性蛋白質にも、またどんなハ
プテンにも適用できる基本的、かつ新規なコンセプトを
含む０本発明は、自己集合性蛋白質がタバコモザイック
ウイルスのコートプロティンであり、ハプテンがポリオ
ウィルスｌ型および３型を含む特別な場合について詳し
く、以下に記述される。しかしながら、この技術および
手順が次のような広範囲な他の自己集合性蛋白質に容易
に適用可能であることは明らかであろう、すなわち、原
核および真核植物からのキャプシド、コートおよびその
他の蛋白質、並びにＢ型肝炎表面抗体のような動物ウィ
ルス、さらに多数の非ウィルス性蛋白質、例えば原核生
物のピリン、フラジェリンおよびリポソーム蛋白質、並
びに真核生物のテユビュリン、筋線維およびリポソーム
蛋白質である。また、この技術および手順が、アデノウ
ィルス、ヘルペスウィルス、ポックスウィルス、ピコル
ナウィルス、肝炎ウィルスおよび種々の腫瘍ウィルスの
ようなウィルス性病原体からの広範囲の、その他のハプ
テンに容易に適用し得ることは明らかであろう、さらに
、肺炎球菌、連鎖球菌およびその他にも用いることがで
きる。

好ましい実施態様の説明 多数の疾患に対抗し哺乳動物に予防注射をして効果をあ
げるために本発明を利用する場合に、上に関連した特別
な場合に対して望ましい結果を得られる好ましい方法は
次のようである。

２ケの合ｄｉ、ＤＮＡ断片、それらはそれぞれＴＭＶコ
ート蛋白質のほぼ半分を指令するものであるが、は共に
自動化されたＤＮＡ合成機で生成される単一ストランデ
アＤＮＡオリゴヌクレオチドフラグメントを集めて組立
てられる０合成ＴＭＶコート蛋白質遺伝子のヌクレオチ
ドシーケンスは第１図に示される。このＤＮＡシーケン
スは一般のＴＭＶストレインのコート蛋白質に対して報
告された（Ｐｒｏｃ、　Ｍａｔ、　Ｓｃｉ、、　Ｕ　Ｓ
　Ａ、　１９８２．　ｖｏ１７９、　ｐｐ５８１８−５
８２２）真正のアミノ酸配列に対するコードである。し
かしながら合成されたシーケンス（配列）は、大部分の
指令する位置に対して選択的な原核生物的コードンが選
ばれているから、天然の遺伝子配列と異る。“５′”と
６ｒｉされ、頂部ストランドに１８９の塩基対を、底部
ストランドに１９９の塩基対をもって成る第１図に示し
た配列部は、第２図に示されるように１３ケの単一スト
ランド化されたＤＮＡオリゴヌクレオチドを集めて組立
てられ、　Ｃ１ａ　ＩとＡｃｅ　Ｉ制限端を含む変性さ
れ（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）直線化されたｐ　Ｂ　Ｒ３２２
プラスミドの中に挿入される＠　Ｅ、　ｃａｌｉ中でこ
の組換プラスミドを増殖させ、Ｃ１ａ　ＩとＡｃｃ　Ｉ
制限エンドヌクレアーゼで分割させることによって、“
５′″ＴＭＶコート蛋白質遺伝子断片を限りなく産生じ
得る。

“τ”と印され、底部ストランドに２８０の塩基対をも
って成る第１図に示した部分は、第２図に示されるよう
に１７ケの単一ストランド化されたＤＮＡオリゴヌクレ
オチドを集めて組立てられ。

Ａｃｅ　ＩとＡｐａ　Ｉ制限端を含む変性ｐ　Ｂ　Ｒ３
２２線状プ９スミドに挿入される。この場合ｐ　Ｂ　Ｒ
，３２２のＥｃＯＲ１サイトはＥｃｏ　ＲＩサイトにお
いて合成りＮＡす゛シカーの挿入によってＡｐａ　Ｉサ
イトに変えられる。Ａｃｅ　ＩとＡｐａ　Ｉによってこ
の変性プラスミドを分割すれば線状フラグメントが生成
し、これに合成Ａｃｃｌ−ＡｐａＩフラグメントを接合
して。

Ｅ、　Ｇｏｌｉで増殖できる。

Ｅ、　Ｃｏ１１　中ｆ）この組換プラスミドの増殖によ
って限りない量の“３”ＴＭＶコート蛋白質遺伝子フラ
グメントが産生する。

完全なＴＭＶコート蛋白質遺伝子はＴ　Ｍ　Ｖ　５’と
Ｔ　Ｍ　Ｖ　３’フラグメントに、さらに２つの合成二
重螺旋ＤＮＡフラグメントと、　ｌａｃ　ＵＶ５転写プ
ロモーターを含む線状プラスミドベクターフラグメント
から組立てられる。得られるプラスミドは第３図に示さ
れ、これは直線化されたＩ！、　ｃａｌｉ　１ａｃＵＶ
５転写プロモーターを含むｐＢＲ３２２プラスミドを示
し、Ｅｃｏ　ＲＩとＢａｇ　ＨＩ制限端を含む、ＴＭＶ
５′とＴ　Ｍ　Ｖ　３’フラグメントは互いに連結し、
また合成二重螺旋ＤＮＡリンカ−によってｐＢＲ３２２
のＥｃｏ　ＲＩおよびＢａ層罰しも連結される。この新
規の第３図に示される組換プラスミドはｐＴＭＶ−６と
命名され、バクテリア性のｌａｃ　ＵＶ５プロモーター
のコントロールの下で完全なＴＭＶコート蛋白質指令配
列を含むものである。　ｌａｃ　ＵＶ５に対する転写開
始サイトはＥｃｏ　Ｒ１端から約３７ヌクレオチドにあ
るから、ＴＭＶ遺伝子をＥｃｏ　Ｒ１とＨａｍ　ＨＥサ
イトの間に挿入す■遺伝子のｍＲＮＡ転写に効果的であ
る。

上述のように組立てられるプラスミドｐＴＭＶ−６は任
意の好都合の有機体、例えばＥ、　ｃｏｌｉ　ストレイ
ンＨＢ　１０１中で、精製される前に増殖される。好ま
しくは精製されたプラスミドはＥ、　ｃｏｌｉストレイ
トン　Ｍ　１０３中にトランスフェクトされる、何故な
らばこのストレインは誘発因子が加えられるまでは転写
について不活性の状態のままにＴＭＶ遺伝子をしてお（
ｌａｃレプレッサー（抑制体）蛋白質を過剰生産するか
らでる。

ｐＴＭＶ−６プラスミドを含むバクテリア中で合成され
る組換ＴＭＶコート蛋白質は、そのバクテリアから分離
され、酸性條件で蛋白質の自己集合性を利用した技術に
よって精製される。培養後、細胞は超音波処理し、酸性
バッファーにさらして透析する。これらの條件下で、バ
クテリアの蛋白質の大部分は不は性になり、したがって
容易に遠心分離で除かれる。酸性条件はＴＭＶコート蛋
白質を高分子量へリックス（ｈａｌｉｘ）構造への重合
へ誘発するために充分であり、その分子量は溶液中にす
でに存在していたどの蛋白質よりも大きいので、クロー
ｙトゲラフの技術を使って容易に精製できる。・ ｐＴＭＶ−６プラスミドは翻訳終了指令（ｔｒａｎｓＩ
ａｔｉｏｎ　ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｃｏｄｏｎ）よ
り前にＡｐａ　Ｉ制限サイトと、その指令（コードン）
の後にＢａ−旧サイトを含んでいる。これはプラスミド
からその終了コードン城を削り取ることを可能にし、複
合蛋白質を指令する変性プラスミドを与えるために変性
された領域と置換えることを可能にする。一つの具体例
として、この領域は真正のＴＭＶコート蛋白買端末に１
０ケのアミノ酸を加えたものを指令するＤＮＡフラグメ
ントとＭ換えられる。この継ぎ足したアミノ酸の最初の
２ケはグリシンでスペーサー領域としてはたらき、残り
の８ケのアミノ酸はポリオウィルス３型のＶＰＩ蛋白質
からの特定の中性化エピトープ（ｅｐｉ　ｔａｐｅ）か
ら成る。このエピトープはすでに開示されていて（Ｎａ
ｔｕｒｅ。

１９８３、　Ｖｏｌ、　３０４．　ｐｐ　４５Ｂ−４８
２）ポリ第３型からの主な中性化エピトープをあられし
、このエビ）−プをＴＭＶコート蛋白質のＣ一端末に着
け、そのハイブリッドコート蛋白質の重合によって、免
疫系へのこのエピトープの提示に対する有効な媒体（マ
ｅｈｉｃｌｅ）を生み出す、この変性新プラスミドは第
４図に画かれｐＴＭＶ−ポリオ３と命名された。

ＴＭＶ−ポリ第３複合物は、有機体からしぼり出された
後、ＴＭＶ蛋白質に対して行った上述と同様の方法で分
離し、精製することができる。

他の具体例において、ｐＴＭＶ−６発現プラスミドは、
　Ａｐａ　Ｉ−Ｂａｇ　ＨＩフラグメントを除去し。

ＴＭＶコート蛋白蛋白質端末の最後の２ケのアミノ酸に
スペーサーとして働く２ケのグリシンとポリ第１型抗原
性エピトープを提示する１１ケの付加アミノ酸を加えた
ものを指令するＤＮＡフラグメントと置き換えて変性す
ることができる。第５図はｐＴＭＶ−ポリオ１と命名さ
れた新変性プラスミドの構造と新エピトープの配列を示
している。

ｌ型エピトープはポリ第１型のＶＰ２蛋白質上に位ｆａ
　シ（Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　１９８４．　Ｖｏｌ　５２
．　ｐｐ　７１９−７２１）中性化エピトープとして記
述されている。　１２ケのアミノ酸エピドーグの配列は
元来法のように報じられた；　Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ
−Ａｓｎ−＾５ｎ−Ｇ１ｎ−丁ｈｒ−９ｅｒ−Ｐｒｏ−
Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ、　　こ翫で報告される配列は
最後のアミノ酸の位置が異る、こ−ではＡｒｇがＳｅｒ
に変えられているがこれはポリオ１ｙＪのマホネイスト
レイン（Ｎａｈｏｎｅｙ　ｓｔｒａｉｍ）のアミノ酸配
列（Ｎａｔｕｒｅ。

１９８１、　ｖａｔ　２９１．　ｐｐ　５４７−５５３
）に完全に一致する。ＴＭＶ−ポリオｌ製品は、上述の
ＴＭＶ−ポリ第３製品と同様の方法でＥ、　ｃｏｌｉ抽
出物から分離することができる。

すでに前に述べたように、本発明の重要な特徴はＴＭＶ
コート蛋白質様サブユニットの凝集分子を組立てる能力
であって、その中で凝集分子を作り上げている個々のサ
ブユニットが１個以上の型の抗原性エピトープを含むこ
とができることである。−例としてＴＭＶ−ポリオｌ型
とＴＭＶ−ポリ第３型の混合物が形成され、それらサブ
ユニットが螺旋構造に重合され、この構造内で個々の螺
旋分子がＴＭＶ蛋白質残部の凝集によって両方のエピト
ープを含有することになる。このような多種の特定のエ
ピトープ産物を備える能力は、多種の病原性因子に対し
て免疫を与える多効果ワクチンの生産を可能にするもの
である。

実施例１ この実施例はＴ　Ｍ　Ｖ　５’断片の組立と生成を示す
。

Ｔ　Ｍ　Ｖ　５’断片は１３のオリゴヌクレオチドの集
合から５図２で示すような２段のなまじと連結法（ａｎ
ｎｅａｌｉｎｇ　ａｎｄ　ｔｔｇａｔｔｏｎ　ｓｔｒａ
ｔｅｇｙ）　’ｃ組立てられた。このオリゴヌクレオチ
ドは次のなまじと連結反応のために、４，４．５個のオ
リゴヌクレオチドの３つの群に分けられた。なまじの前
に各ＤＮＡは５′端に加リン酸化した。ただし群Ｉの３
４マーと群■の１９マーは除外した。かくして群Ｉと群
■の二重ストランド連結生成物が、パリンドローム（Ｐ
ａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ）的制限端の互に連結して頭−頭
ダイマーが生成するのを防止した。３つのなまし一連結
反応の各々の二重ストランド生成物はポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動で精製した。精製ゲル中の各生成物の位
置は、オリゴヌクレオチドを加リン酸反応中に放射性基
質を用いることによって放射性にしたので、容易に決定
することができた０群工、■、■連結の精製生成物は第
２段の連結反応のために、互になましされる。二重スト
ランドＤＮＡ分子（各ストランドには１８８のベース対
）はポリアクリルアミドゲル電気泳動によって精製され
、バクテリア中で増殖するためのＣ１ａ　ＩおよびＡｃ
ｅ　Ｉ制限端を有するｐ　Ｂ　１３２２線状化プラスミ
ドの中に連結された０組換プラスミドはＴ　Ｍ　Ｖ　５
’断片の生成のためにＥ、　Ｃｏ１１中で増殖された。

実施例２ この実施例はＴ　Ｍ　Ｖ　３’断片の組立と生成を示す
。

ＴＭＶ指令配列（ｃｏｄｉｎｇ　５ｅｑｕｅｎｃｅ）の
３′断片が図２で示されるような１７のオリゴヌクレオ
チドの集合から組立てられた。このオリゴヌクレオチド
は４　、４　、４　、５＠のオリゴヌクレオチドの４っ
の群に分けられた。すべてのオリゴヌクレオチドは放射
性ＡＴＰを用いて加リン酸化した。ただし群工の３３マ
ーと群■の１５マーは除外した。このことは、実施例１
と同様に、パリンドローム的制限端にもとづく、群Ｉと
群■の連結生成物の２量化を防止するためであった。こ
の４つの群はなまじと連結反応をさせた０次の連結生成
物は変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって精製
した。

変性ゲルを用いたので、単一ストランド分子としてマイ
グレートする連結生成物が生じた。変性ゲルのため高い
程度の分解（〒ｅａｏｌｕｔｉｏｎ）が現れ、又種々の
ヌクレオチド間の非特定の会合の結果として、天然ゲル
電気泳動の際、時□々起る未確認のバンドは現れなかっ
た。４つの連結反応の各々の２つの単一スドライド生成
物を変性ゲルで精製し、第２段の連結反応のため一緒に
なましした。連結層、２８０ベース対のトップストラン
ドと２５４ベース対のボトムストランドより成る生成物
を変性ポリアクリルアミドゲルで精製した。２つのスト
ランドのなまじの后、生じた二重ストランドＤＮＡはＡ
ｃｃ　ＩおよびＡｐａ　Ｉ　％眼幅を含有する線状化ｐ
　Ｂ　Ｒ３２２プラスミドの中に挿入した０組換プラス
ミドはＥ、　Ｇｏｌｉの中でＴ　Ｍ　Ｖ　３’断片の生
成のため増殖された。

実施例３ この実施例は完全なＴＭＶ指令配列の生成とｐＴＭＶ−
６の生成を示す、ＴＭＶコートプロティンエクスプレッ
ションプラスミドは５路連結反応によって生成され、そ
の際Ｔ　Ｍ　Ｖ　５’とＴＭＶ３’の断片が、共通のＡ
ｃｅ　Ｉ制限端で互に連結され、生じた４５０ベ一ス対
断片は２つの短い、二重ストランドリンカ−断片の助力
によって、ＰＢＲ３２２ベクターに連結された（図３）
、１つのリンカ−断片はＰＢＲ３２２プラスミドのＥｃ
ｏ　ＲＩ端をＴＭＶ断片のＧｌａ　Ｉ端に連結し、一方
他のリンカ−はこのプラスミドのＢａ履Ｈ１をＴＭＶ・
断片のＡｐａ　Ｉ端に連結した。連結反応中の連結作用
に加えて、リンカ−ＤＮＡも、残っているニートンと、
翻訳の出発および停止信号を供給してＴＭＶ指令配列を
完成した。生じたプラスミドｐＴＭＶ−６は図３に示さ
れている。

実施例４ この実施例はＴＭＶコートプロティンのエクスプレッシ
ョンを示す。

Ｅ、　Ｃｏ１１　ストレインにクロニングした後、実施
例３に記載の如く、生成したｐＴＭＶ−６を精製し、標
準方法を用いてＥ、　Ｃｏ１１ストレインＪＭ１０３の
中に移植した。ＴＭＶ遺伝子のバクテリア中のエクスプ
レッションが１層昶のインプロピルＢ−Ｄ−チオガラク
トピラノシド（Ｉ　ＰＴＧ）で誘発された。培養液０．
５１を採取し、バクテリアを遠心分離し、　１００℃で
ＳＯ５処理によって分解（ｌｙｓｅ）する、この全細胞
抽出物をＳＯＳポリアクリルアミド上で電気泳動する。

その后各プロティンはニトロセルローズ紙にプロットし
、ＴＭＶ状物質の存否を反ＴＭＶ抗体を用いて決定した
（図６参照）０図６はこの実験の結果を示すが、その際
プラスミドｐ　Ｂ　Ｒ３２２のみを含有するバクテリア
はＴＭＶコートプロティン位置にマイグレートするポジ
ティブ信号を示さない、しかしながら、合成コートプロ
ティン遺伝子を含有するバクテリアは、実際のウイール
スから得られた真正のＴＭＶコートプロティンマーカー
と全く同じ位置にマイグレートす・るポジティブバンド
を示す。

実施例５ この実施例は細胞培養液からσＴＭＶプロティンの回収
を示す。

実施例３の記載に従って生成したｐＴＭＶ−８をかくま
うバクテリア（Ｅ、　ＧｏｌｉストレイトンＭ１０３）
をＩ　ＰＴＧの存在下で培養しラキュブ５（Ｉａｃｕマ
５）プロモーターでエクスプレッションを誘発した。細
胞を遠心分離によって収獲した。バクテリアをソニケー
ション緩衝液に再懸濁し、ソニケーションによって分解
（Ｉｙｓｅ）Ｌ、、次に細胞砕片を低速遠心分離によっ
て除いた。上澄液を０．１Ｍナトリウムアセテートより
なるｐＨ５，０の緩衝溶液に対して一昼夜、室温で透析
した。だから、このサンプルをセファローズ６Ｂカラム
にかけ、生じたピークをポリアクリルアミドゲル電気泳
動（図８参照）で分析した。ＴＭＶウイールスからの真
正のコートプロティンマーカーとしての、正確な位置に
マイグレートする単一生成物を含むボイドフラクション
を示す、比較実験としてＴＭＶエクスプレッションプラ
スミドを欠くバクテリアを同じ方法で処理したが、ポイ
ドフラクシ璽ンの中に検知生成物が認められなかった。

実施例に の実施例はｐ　Ｔ　Ｍ　Ｖ　−Ｐｏ１ｉｏ　３の生成を
示す。

Ｃ−末端に抗原性エピトープを有する変性ＴＭＶコート
プロティンのためにコードする遺伝子の生成は、ｐＴＭ
Ｖ−８プテスミド（図３）を轟ｐａ■とＢａＩＩＨＩで
分裂し、そのコートプロティンのＣ−末端のためにコー
ドする小断片を除くことによって遂行された０、この断
片は、コートプロティンＣ−末端プラス２つのグリシン
残基、及びＰｏ１ｉｏ　ｔｙｐｅ３に対するＶＰＩプロ
ティンからの支配的抗原性エピトープを表わす８つのア
ミノ−酸に対してコードする他の合成りＮＡ断片でＨ換
された。生じたプラスミドは図４に示される。

実施例７ この実施例はＴＭＶ−Ｐｏｌｉｏ　３複合プロティン　
゛のエクスプレッションを示す。

実施例３の記載に従って生成されたｐ　ＴＭＶ　−６も
しくは実施例６の記載に従って生成されたｐＴ　Ｍ　Ｖ
　−ｐｏｌｉｏ　３プラスミドを含有するＩＥ、　Ｃｏ
１１の培養液がＩＰＴＧでエクスプレスするよう誘発さ
れた。各培養液０．５−を遠心分離によって収獲し、バ
クテリアペレットをＳＤＳで１００℃で分解（ｌｙｓｅ
）シた。全細胞抽出液をＳＤＳポリアクリルアミドゲル
上↑上気電気泳動、その后プロティンをニトロセルロー
スにプロットさせ、　反ＴＭＶおよび反ｐｏｌｉｏ　ｔ
ｙｐｅ３抗体と挑戦させた０図７はこの実験を示す０反
ＴＭＶ抗体は、真正のＴＭＶコートプロティンマーカー
と共マイグレートする、ｐＴＭＶ−６を含むバクテリア
からの生成物、と反応した０反ＴＭＶ抗体は又ｐ　ＴＭ
Ｖ　−ｐｏｌｉｏ　３含有バクテリアからのＴＭＶ様生
酸生成物応したが、このものはＴＭＶマーカーに関して
低い移動度を示す、これは、Ｃ−末端に追加の１゜アミ
ノ酸を含有するＴＭＶ−ｐｏｌｉｏ　３生成物としての
期待された結果であり、異ったマイグレートすることを
期待すべきである。

反−ｐｏｌｉｏ　ｔ！ｐｅ３抗体とのプロットの反応に
よって、　ＴＭＶ　−ｐｏｌｉｏ　３生成物からのポジ
ティブ信号が生じたが、未変性ＴＭＶの場合は生じなか
った。

実施例８ この実施例は、細胞培養液からのＴＭＶ−Ｐｏｌｉ。

３複合プロティンの回収を示す。

ＴＭＶ−ｐｏｌｉｏ　３（７）精製実験は実施例３でＴ
ＭＶについて述べたと同じ方法で行った。バクテリアを
ＩＰＴＧの存在下で培養し、収獲し、ソニケーションで
分解した。細胞砕片を遠心分離によって除いた後、上澄
液をｐＨ５，０！ｌ衝液に対して透析し、ＴＭＶ−ｐｏ
ｌｉｏ　３生成物の凝集を刺激した。セファローズ６Ｂ
クロマトグラフによって。

ＳＤＳポリアクリルアミドゲル中の真正ＴＭＶコートプ
ロティンマーカーよりも若干遅くマイグレートする単一
生成物を含有する小さいボイドピークが生じた。精製工
程中ＴＭＶ−ｐｏｌｉｏ　３がＴＭＶコートプロティン
と同じ様に行動する事実は、Ｃ−末端の伸長の存在が、
コートプロティン生成物の酸性■で誘発された凝集に干
渉しないことを示すものである。更にｔｙｐｅ３エピト
ープは実際に重合を促進しているかもしれない、ＴＭＶ
−ｐｏｌｉｏ　３の精製からのボイドビークはＴＭＶ精
製からのボイドピークよりも先に再現され、これらの条
件下では、エピトープは高分子量に凝集していることを
示唆している。

実施例９ この実施例はＴＭＶ蛋白質とＴＭＶ−ポリ第３との複合
体（フンシュゲート）の電子顕微鏡による分析例である
。

上記実施例５および８記載の方法で得られたＴＭＹおよ
びＴＭＶ−ポリ第３のそれぞれのｐＨ５，０試料につい
て、このｐＨにおいて見られる凝集が真性（ａｕｔｈｅ
ｎｔｉｃ）　ＴＭＶタイプの重合反応に相当したことを
示すために、電子顕微鏡による分析が行なわれた＠　Ｅ
、　ｃｏｌｉが生産したコート蛋白質およびＴＭＶ−ポ
リ第３の両試料は、上記実施例５および８記載のセファ
ローズ６ＢのクロマトグラフィーによりｐＨ５，０のＥ
、　ｃａｌｆ抽出物から精製された。これらの試料につ
いて、その背景をよごす（ネガティブステイニング）技
術を施したのち、電子顕微鏡で観察した。第１Ｏ図に見
られるように１両試料は酸性条件下の真性ＴＭＶコート
蛋白質の典型的な短い棒（ｒｏｄｓ）および円盤（ｄｉ
ｓｋ）タイプの構造の存在を示した。更に、ＴＭＶ−ポ
リ第３の試料は長い棒の存在を示しており、非修飾のＴ
ＭＶ生虞物よりもより効果的に凝集していることを示唆
している。

実施例１０ この実施例はＴＭＶ蛋白質の凝集の可逆性を示すもので
ある。

真性ＴＭＶコート蛋白買が示す重合反応の重要な特徴は
、その可逆性である。実施例８記載のようにしてｐｉ（
５，０のセファローズ６Ｂカラムからのポイドフラクシ
璽ン（マｏｒｄ　ｆｒａｃｔｉｏｎ）から分離されたＴ
ＭＶ−ポリ第３の試料は０．１モルのトリス（Ｔｒｉｓ
）ｐＨ８，０に対して４℃において透析され、更にもう
一度セファローズ６Ｂ上でクロマトグラフィーにかけら
れた。生成物の移動性は減少しており、ＴＭＶ−ポリ第
３はインクルージョンフラクシ璽ン（ｉｎｃｌｕａｉｏ
ｎ　ｆｒａｃｔ＋ｏｎ）中にのみ見出された。更に、　
０．１　Ｍ酢酸ソーダに対する透析による第２のｐＨ５
，０への逆転換の結果、更にもう一つの移動性の転換が
生じ、そこではゲル濾過（ｇｅ　Ｉｆｉｌｔｒａｔｉｏ
ｎ）クロマトグラフィーの結果、その物質は再びボイド
フラクション中に見出された。

実施例１１ この実施例は免疫実験の結果を示すものである。

最初の免疫実験では、実施例５および８記載の方法でそ
れぞれ製造されたＴＭＶコート蛋白質およびＴＭＶ−ポ
リ第３複合蛋白質が皮肉（ＩＤ）および腹腔内（ＩＰ）
ルートによってラットに注射された。各ラットはＩＤに
Ｔ　Ｍ　Ｖ　１００　終ｇとＩ　ＰニＴＭＶ　１１００
ＩＬ　ｂｓ、もり、＜１ｉＩＤニ１１００ＪＬ　ノＴＭ
Ｖ−ポ！ｊ　：第３　トＩ　Ｐニ１００＃Ｌｇ　（１）
ＴＭＶ−ポリ第３を注射された。すべての注射液は完全
なフロイント（Ｆｒｅｕｎｄ）の補助剤入りであり、各
ラットは全部で４回の注射を受けた。第１と第２の注射
の間隔は３週間であり、残りの２回は２週間間隔で行っ
た。結果を第１表に示す。

第１表 上記結果に見られる如く、ＴＭＶ−ポリ第３製品の注射
を受けたラットは抗ポリオの中和性（ａｎｔｉｐｏｌｉ
ｏ　ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ）抗体を生産した０滴定
値は対数の相乗平均として表示しである。ウィルス粒子
の中和は各試験ラット個体からの抗血清の一連の稀釈液
で処理したウィルスを組織培養細胞上に平板培養するこ
とによって確かめられた。細胞変性効果の欠如は、すべ
てのウィルス粒子の完全な中和を示した。

ｗ４２の免疫実験はＴＭＶ−ポリ第３製品の３つの異る
形体、すなわちｐＨ５，０凝Ｑ　Ｔ　Ｍ　Ｖ−ポリ第３
（実施例８）　、　ｐＨ８，０解凝集ＴＭＶ−ポリ第３
（実施例１０）およびＲＮＡ結集結集７−Ｖリ第３への
免疫応答を比較するために実施された。最後の形体すな
わちＲＮＡ結集物質は真性ＴＭＶゲノムのＲＮ　Ａ　（
ｇｅｎｏｍｉｃ　ＲＮＡ）によって＋ｎ　ｖｉｔｒｏテ
培養されたＴＭＶ−ポリ第３の調製を示した。そのよう
な反応の結果、ＴＭＶ−ポリ第３およびＴＭＶ　　ＲＮ
ＡよりなるｐＨ安定性ウィルス様粒子が生成した。その
ような生成物は電子顕微鏡による観察が示すように、真
性ＴＭＶウィルスにきわめて似たものであった。ＲＮＡ
結集結集７−Ｖリ第３は結集前のＲＮＡの減成に起因す
る棒の長さの不均質を示した。

このＴＭＶ−ポリ第３のＲＮＡ結集調製は免疫研究の際
のコントロールとして役立った。その理由は、もしｐＨ
５，０凝集ＴＭＶ−ポリ第３に対する免疫応答がｐＨ８
，０解凝集物質に対してよりもＲＮＡ結集製品への応答
により近似していれば、免疫応答の誘発中、　ｐＨ５，
０製品は大部分が高分子量の状態゛にとどまっているこ
とを示している。一方。

−モＬ　ｐＨ５，ＯＴ　Ｍ　Ｖ−ポリ第３の応答がｐＨ
８，０ノものの応答により近似していれば、ｐＨ５，０
物質は注射後まもなく解凝集してしまうこと、および観
察された免疫応答は主として低分子量生成物に対して向
けられたと推論出来るだろう。

第２の免疫実験結果を第２表に示す。

第２表 第２表の結果が示す如＜、ＰＨ５，０凝集ＴＭＶ−ポリ
第３への応答はＲＮＡ結集物への応答に最も近似してい
た。ｐＨ５，０生成物はやへ高いレベルの免疫性を誘発
するように思われ、この事はｐＨ５，０凝集ＴＭＶ−ポ
リ第３は注射後すぐには解凝集しなかった事を示した。

予期したように、ｐＨ８，０解凝集生成物への免疫応答
は、免疫応答の効果的誘発のために高分子量を維持する
ことの重要性を、より低度に確認していた。ＲＮＡ結集
結集７−Ｖリ第３は、Ｅ、Ｍ、およびクロマトグラフィ
的研究により判断されるように、生理的ｐＨにおいては
安定であるべきと知られていた。

実施例１２ この実施例は解凝集実験の結果を示すものである。

実施例１１において提示した免疫性のテストにおいて、
ＴＭＶ−ポリ第３生成物はラット中に注射後すみやかに
は解凝集しなかった事の証拠を提示するために、　ｐＨ
５，０で凝集したＴＭＶ−ポリ第３試料をｐＨ７，０お
よび３７℃においてりん酸塩で緩衝された塩類溶液中に
透析し、次いで同じ条件下でセファローズ６Ｂ上にクロ
マトグラフした。その結果、生成物はまだボイドビーク
中に移動しており、解凝集は生起しなかった事を示して
いた。　ｐＨ５，０におけるＴＭＶ−ポリ第３の類似試
料を０℃においてｐＨ８，Ｏ４ｉ衝液中へ透析し、次い
でクロマトグラフした。この物質はもっばらインクルー
ジヨンフラクション中に見出され、従って解凝集が生起
した事を示した。上記の実験により、ＴＭＶ−ポリ第３
の解凝集はアルカリ性ｐＨに於いて冷時には生起するが
、生理的条件下ではおそらく生起しないことがわかる。

実施例１３ この実施例はプラスミドＰＴＭＶ−ポリ第１の形成およ
び細胞培養時のその表現を示すものである。

ＴＭＶコート蛋白質のＣ−末端の遺伝情報を指定するｐ
ＴＭＶ−６のＡｐａ　Ｉ−Ｂａｇ　ＨＩ７ラグメントを
取除き、コート蛋白質Ｃ−末端と２つのグリシンの遺伝
情報を指定する制限フラグメントおよびポリオｌ型のＶ
Ｐ２蛋白質からの１２アミノ酸エピトープとでおきかえ
た。得られたプラスミドｐＴＭＶ−ポリオｌを第５図に
示した。コノｔ！ｌＥ１！Ｉプラスミドを含有するＥ、
　Ｃｏ１１人工変種ＪＭ１０３をＩ　ＰＴＧで誘発する
と、ＴＭＶ様の生成物が生成し、それはｐ）ｌ　５．０
で凝集し、ＳＯＳポリアクリルアミドゲル上でＴＭＶコ
ート蛋白質の標識よりもわずかに遅い移動性で移動した
。この生成物をＴＭＶ−ポリオｌと称することにする。

実施例１４ この実施例はＴＭＶ−ポリオｌおよびＴＭＶ−ポリオ３
の共重合体を示すものである。

実施例７および１３の手法に従ってそれぞれ調製し、ｐ
Ｈ５，０において精製したＴＭＶ−ポリオｌおよびＴＭ
Ｖ−ポリオ３をｐＨ８，０において混合し、ｐＨ５，５
において共重合させた。尚、ｐＨの変換はすべて透析に
より行った。共重合反応は電子顕微鏡により監視され、
その際アンチータイプ３抗体が加えられ、試料の抗体結
合をしらべた。電子！１１ｍ鏡により観察されたすべて
の棒は注目に値する抗体結合の存在を証明しており、形
成されたすべての棒がＴＭＶ−ポリオ１．！：ＴＭＶ−
余す第３型とのサブ単位から構成されており、ＴＭＶ−
ポリオｌのサブ単位のみで構成された棒はないことを示
唆していた。対照としてＴＭＶ−ポリオ３の棒またはＴ
ＭＶ−ポリオｌの棒をそれぞれアンチ−タイプ３抗体で
処理して試験を行った。ＴＭＶ−ポリオ３の棒の方はか
なり抗体で覆われていたが、一方、ＴＭＶ−ポリオｌの
棒の方は反応しなかった（第１１図参照）。

上記開示を要約すれば、木発゛明は自己凝集性蛋白質と
ハプテンとからなるユニークな蛋白質複合生成物を提供
するものであり、該生成物は凝集によりワクチンの製造
に適した多価の免疫原性物質を形成する０本発明の範囲
内におけるいろいろな部分的変更が可能である。

【図面の簡単な説明】

第１図はＴＭＶコート蛋白質遺伝子に対するヌクレオチ
ドシーケンスを示す。 第２図はＴ　Ｍ　Ｖ　５’およびＴ　Ｍ　Ｖ　３’のヌ
クレオチドシーケンスの生成過程を図式的に示したもの
である。 第３図は主な制限サイトをもったプラスミドｐＴＭＶ−
６を示し、合成組換ＴＭＶ遺伝子の構成が示されている
。 第４図はプラスミドｐＴＭＶ−ポリ第３を示し、ポリ第
３エピトープに対するアミノ酸シーケンスを詳しく画い
である。 第５図はプラスミドｐＴＭＶ−ポリ第１を示し、ポリオ
ｌエピトープに対するアミノ酸シーケンスを詳しく画い
である。 第６図はプラスミドｐＴＭＶ−６を含（７Ｅ、ｃｏｌｉ
から回収されたＴＭＶコート蛋白質のウェスターンプロ
ット（Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔ）である。 第７図はｐ　Ｔ　Ｍ　Ｖ　：ｌ−）蛋白質とｐ”ｒｒｖ
ｔｖ−ｅとｐＴＭＶ−ポリオ３を含ｔｒＥ、　ｃｏｌｉ
　カラｃ７）　Ｔ　ＭＶ−ポリ第３複合蛋白質のウェス
ターンプロットである。 第８図はＴＭＶニート蛋白質を含むクロマトグラフカラ
ムから流出した分画の５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動である。 第９図はＴＭＶ−ポリ第３複合蛋白質を含むクロマトグ
ラフカラムから流出した分画の５ＤＳ−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動である。 第１Ｏ図は凝集ＴＭＶニート蛋白質と凝集ＴＭＶ−ポリ
第３複合蛋白質のエレクトロンマイクログラフをそれぞ
れ示す。 第１１図は、凝集ＴＭＶ−ポリポリ　　ＴＭＶ−ポリオ
３とＴＭＶ−ポリオ１との凝結物および凝集ＴＭＶ−ポ
リオｌの、アンチ−タイプ３抗体で処理した後のエレク
トロンマイクログラフを示す・

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、常態では、免疫性の、比較的高分子量の蛋白質物質
   に自己集合する低分子量キャリアー蛋白質部分、および
   病原性疾患に対する抗原のエピトープを含有し、キャリ
   アー蛋白質の自己集合を損なわない方法で上記低分子量
   キャリアー蛋白質に結合するペプチド部分であるところ
   のハプテン部分を特徴とする接合蛋白質。 ２、上記低分子量蛋白質が身体免疫系によるハプテンの
   認識が可能なように、粒子の表面上にハプテン部分を供
   給するために集合される複数の接合蛋白質である特許請
   求の範囲第１項に記載された接合蛋白質。 ３、上記ハプテン部分が同一の抗原エピトープを含有す
   る特許請求の範囲第２項に記載された接合蛋白質。 ４、上記ハプテン部分が少なくとも２種の異なった抗原
   エピトープを含有する特許請求の範囲第２項に記載され
   た接合蛋白質。 ５、￥ｉｎ￥　￥ｖｉｖｏ￥投与用のワクチンとして製
   剤された特許請求の範囲第２項、第３項または第４項に
   記載された接合蛋白質。 ６、ｐＴＭＶ−６、ｐＴＭＶ−ポリオ I またはｐＴＭ
   Ｖ−ポリオIIIなる名称を有するプラスミド。 ７、合成遺伝子を有するプラスミドベクターを調製し、
   そのベクターを有機体の複製において合成遺伝子を発現
   する能力のある有機体の中に転移させ、合成遺伝子の生
   成と発現を同時に行いながらその有機体を生育させ、合
   成遺伝子を分離することによって蛋白性物質を形成する
   方法であって、その合成遺伝子は、免疫性高分子蛋白性
   物質に正常に自己凝集する低分子量キャリヤー蛋白質部
   分と、その低分子量キャリヤー蛋白質にその自己凝集性
   を損うことのないような方法で結合された、病原性疾患
   に対して抗原としてはたらくエピトープを含むペプチド
   フラクションであるハプテン部分からなる複合蛋白質を
   指令するヌクレオチド配列であり、その複合蛋白質が、
   その低分子量キャリヤー部分がハプテン部分がウィルス
   粒子の表面にあるようにした高分子ウィルス粒子に凝集
   された形で分離されることを特徴とする方法。 ８、分離段階が、有機体のリゼート（ｌｙｓａｔｅ）の
   條件を自己凝集性蛋白質がリゼートから精製できる高分
   子量生成物に凝集するような條件に調整されて行われる
   特許請求の範囲第７項記載の方法。 ９、プラスミドベクターがｐＴＭＶ−ポリオ I 又はｐ
   ＴＭＶ−ポリオIIIである特許請求の範囲第７項又は第
   ８項記載の方法。