JP2528815B2 - 多効果免疫性蛋白質 - Google Patents
多効果免疫性蛋白質Info
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- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
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- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
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-
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- C12N2770/32011—Picornaviridae
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-
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は免疫性蛋白質、組換DNA技術によるそれらの
製造、それらの治療薬としての用途および新規な中間体
に関する。
製造、それらの治療薬としての用途および新規な中間体
に関する。
微生物が一つの化合物、しばしば低分子量の化合物か
ら規則的に組みたてられて高分子量の物質を提供し得る
構成要素を有することは、多数の微生物の知られた特性
である。これらの高分子量の物質は、種々の形態をとり
得る。例えば、ウイルスの場合の蛋白質コート、ある種
のバクテリアの場合の繊毛である。そして低分子量物質
が炭水化物である場合は、高分子量物質はバクテリアの
細胞壁であり得る。この高分子量物質は、しばしば高度
に免疫性である。
ら規則的に組みたてられて高分子量の物質を提供し得る
構成要素を有することは、多数の微生物の知られた特性
である。これらの高分子量の物質は、種々の形態をとり
得る。例えば、ウイルスの場合の蛋白質コート、ある種
のバクテリアの場合の繊毛である。そして低分子量物質
が炭水化物である場合は、高分子量物質はバクテリアの
細胞壁であり得る。この高分子量物質は、しばしば高度
に免疫性である。
この組みたてプロセスの一例として、Ｂ型肝炎の表面
抗原は分子量29,000ダルトンのグリコプロテインからな
る。このグリコプロテインは、集合に際して130のサブ
ユニットを含有し、3.8×106ダルトンの分子量を有し、
デーン粒子として知られる粒子を形成する。同様な形状
はタバコモザイックウイルス（以下、TMVと略記する）
についても、比較的小さい蛋白質が単純ならせんに凝集
して多数の比較的小さい蛋白質を含むロッドを形成する
場合に起きる。ビールスの場合には、しばしばサブユニ
ット蛋白質は、ビールスの他の構成要素が存在すること
なしに、かつ完全にinvitro（イン ビトロ）条件下
に、最終的な重合体の形態に集まることができる。
抗原は分子量29,000ダルトンのグリコプロテインからな
る。このグリコプロテインは、集合に際して130のサブ
ユニットを含有し、3.8×106ダルトンの分子量を有し、
デーン粒子として知られる粒子を形成する。同様な形状
はタバコモザイックウイルス（以下、TMVと略記する）
についても、比較的小さい蛋白質が単純ならせんに凝集
して多数の比較的小さい蛋白質を含むロッドを形成する
場合に起きる。ビールスの場合には、しばしばサブユニ
ット蛋白質は、ビールスの他の構成要素が存在すること
なしに、かつ完全にinvitro（イン ビトロ）条件下
に、最終的な重合体の形態に集まることができる。
それ自体が抗原性である比較的大きい分子に結合した
場合、しばしば免疫原として、in vivo（イン ビボ）
系において抗体を発現させる能力において弱い作用しか
しない小さい分子が、比較的小さい分子に対する改良さ
れた抗体応答、並びに比較的大きいキャリアー分子に対
する正常な応答をおこすことも知られている。この大き
い方の分子に結合した小さい分子は、ハプテンと称さ
れ、そのサイズは小さいものから非常に大きなものまで
変り得る。このコンビネーションの一例において、保健
の分野で興味があることであるが、それ自体免疫性でな
い15のアミノ酸のシークエンスを含むＢ型肝炎の表面抗
原の小部分は抗原蛋白質、鍵穴に付着しているヘモシア
ニン、並びに自然のまゝの表面抗原および全肝炎ウイル
スと交差反応した、in vivo系における発現された接合
抗体に共有結合されていた。このキャリアー−ハプテン
系は、それに対してハプテンが指令する、疾患に対する
有効なワクチンの基礎となり得た。
場合、しばしば免疫原として、in vivo（イン ビボ）
系において抗体を発現させる能力において弱い作用しか
しない小さい分子が、比較的小さい分子に対する改良さ
れた抗体応答、並びに比較的大きいキャリアー分子に対
する正常な応答をおこすことも知られている。この大き
い方の分子に結合した小さい分子は、ハプテンと称さ
れ、そのサイズは小さいものから非常に大きなものまで
変り得る。このコンビネーションの一例において、保健
の分野で興味があることであるが、それ自体免疫性でな
い15のアミノ酸のシークエンスを含むＢ型肝炎の表面抗
原の小部分は抗原蛋白質、鍵穴に付着しているヘモシア
ニン、並びに自然のまゝの表面抗原および全肝炎ウイル
スと交差反応した、in vivo系における発現された接合
抗体に共有結合されていた。このキャリアー−ハプテン
系は、それに対してハプテンが指令する、疾患に対する
有効なワクチンの基礎となり得た。
米国特許第4,496,538に開示されたこの一般的なアイ
デアの改良において、キャリアーハプテンワクチンは、
公知の病原体、ヘモフィルス・インフルエンゼエｂ（Ha
emophilus influenzae b）、からの炭水化物であるハプ
テンおよびジフテリア・トキソイド（diphtheria toxoi
d）であるキャリアーを含むことができる。このキャリ
アーハプテンは免疫性であるばかりでなく、疾患から保
護するであろうことが示された。
デアの改良において、キャリアーハプテンワクチンは、
公知の病原体、ヘモフィルス・インフルエンゼエｂ（Ha
emophilus influenzae b）、からの炭水化物であるハプ
テンおよびジフテリア・トキソイド（diphtheria toxoi
d）であるキャリアーを含むことができる。このキャリ
アーハプテンは免疫性であるばかりでなく、疾患から保
護するであろうことが示された。
置換DNA技術は、生体に通常は無関係である蛋白質
を、微生物中にかなり多量に生成させるのに用いられ
た。このような技術は生体中に目的とする無関係な蛋白
質のための暗号を指令するDNAを含むベクターを挿入す
ることを含む。この方法において、固体が無関係な蛋白
質のみならず、天然に生成されるものとは異なる蛋白質
をも、アミノ酸のシークエンス、アディションまたはサ
ブトラクションを変更することにより生成することが可
能である。これらの無関係な蛋白質のために暗号を指令
する遺伝子は天然のソースから単離されてもよいし、合
成されてもよい。また、制限酵素を用いて、変更された
蛋白質のための遺伝子を得るよう変えてもよい。
を、微生物中にかなり多量に生成させるのに用いられ
た。このような技術は生体中に目的とする無関係な蛋白
質のための暗号を指令するDNAを含むベクターを挿入す
ることを含む。この方法において、固体が無関係な蛋白
質のみならず、天然に生成されるものとは異なる蛋白質
をも、アミノ酸のシークエンス、アディションまたはサ
ブトラクションを変更することにより生成することが可
能である。これらの無関係な蛋白質のために暗号を指令
する遺伝子は天然のソースから単離されてもよいし、合
成されてもよい。また、制限酵素を用いて、変更された
蛋白質のための遺伝子を得るよう変えてもよい。
ウイルスの蛋白質の生成に適用された、このような組
換DNA技術はワクチンとして使用し得る蛋白質の調製を
可能とする。これらワクチンは、ウイルスが細胞基質上
で培養され、また最終ワクチンが細胞基質、培養基およ
びウイルスからの核酸（これらは全て有害な影響を有し
うる）からの生成物を含有することがある標準方法によ
り製造された現在のウイルスのワクチンに伴われる汚染
物質を含有しないであろう。
換DNA技術はワクチンとして使用し得る蛋白質の調製を
可能とする。これらワクチンは、ウイルスが細胞基質上
で培養され、また最終ワクチンが細胞基質、培養基およ
びウイルスからの核酸（これらは全て有害な影響を有し
うる）からの生成物を含有することがある標準方法によ
り製造された現在のウイルスのワクチンに伴われる汚染
物質を含有しないであろう。
本発明においては、以下に記載するように、ある種の
新規な蛋白質物質が提供される。この蛋白質物質は、多
効果免疫ワクチンを提供するのに有用であり、かつ上記
のキャリアー−ハプテンのコンセプトを採用する組換DN
A技術により製造される。
新規な蛋白質物質が提供される。この蛋白質物質は、多
効果免疫ワクチンを提供するのに有用であり、かつ上記
のキャリアー−ハプテンのコンセプトを採用する組換DN
A技術により製造される。
本発明の一つの態様により、通常、免疫性の、比較的
高分子量の蛋白質物質に自己集合する低分子量のキャリ
アー蛋白質部分および病原性疾患に対する抗原のエピト
ープを表わす。上記低分子量キャリアー部分に結合され
るペプチド部分であるハプテン部分を含有する接合蛋白
質が提供される。キャリア−蛋白質へのハプテンの結合
の仕方は、キャリアー蛋白質の自己集合性が害されず、
かつ自己集合性蛋白質の集合に際して、ハプテンが免疫
系によるハプテンの認識が可能なごとく、組たてられた
粒子の表面に存在するようになされるのが適当である。
高分子量の蛋白質物質に自己集合する低分子量のキャリ
アー蛋白質部分および病原性疾患に対する抗原のエピト
ープを表わす。上記低分子量キャリアー部分に結合され
るペプチド部分であるハプテン部分を含有する接合蛋白
質が提供される。キャリア−蛋白質へのハプテンの結合
の仕方は、キャリアー蛋白質の自己集合性が害されず、
かつ自己集合性蛋白質の集合に際して、ハプテンが免疫
系によるハプテンの認識が可能なごとく、組たてられた
粒子の表面に存在するようになされるのが適当である。
自己集合性蛋白質とハプテンのコンビネーションは、
高分子量構造に集合され、かつin vivoで導入された場
合、自己集合性蛋白質およびハプテンに抗体を生成さ
せ、その結果、エピトープがそれに対して暗号を指令す
る疾患に対する保護、並びに自己集合性蛋白質に対する
免疫の応答を生ずる。
高分子量構造に集合され、かつin vivoで導入された場
合、自己集合性蛋白質およびハプテンに抗体を生成さ
せ、その結果、エピトープがそれに対して暗号を指令す
る疾患に対する保護、並びに自己集合性蛋白質に対する
免疫の応答を生ずる。
本発明の重要な、有利な、かつ新規な特徴は、集合さ
れた蛋白質が自己集合性蛋白質に結合した異なるハプテ
ンによって、蛋白質が集合する場合、生成した蛋白質の
粒子が多数の異なったエピトープを表面に有するように
調製され得ることである。これらのウイルスの粒子がin
vivoで用いられる場合、全てのハプテンに対する抗体
が発現され、それによって、ハプテンがそれに対して存
在する疾患に対して保護する。この方法において、多数
の疾患に対するただ一回の予防接種が、ただ一つの活性
蛋白質物質の調製と使用により提供される。
れた蛋白質が自己集合性蛋白質に結合した異なるハプテ
ンによって、蛋白質が集合する場合、生成した蛋白質の
粒子が多数の異なったエピトープを表面に有するように
調製され得ることである。これらのウイルスの粒子がin
vivoで用いられる場合、全てのハプテンに対する抗体
が発現され、それによって、ハプテンがそれに対して存
在する疾患に対して保護する。この方法において、多数
の疾患に対するただ一回の予防接種が、ただ一つの活性
蛋白質物質の調製と使用により提供される。
本発明の接合蛋白質は、合成遺伝子を組換DNA技術に
よりベクター中に挿入し、この組換ベクターを固体中に
導入し、固体を育成し、蛋白質−ハプテン接合物を単離
し、ついでこの接合物を集合させておくことによって有
利に調製される。
よりベクター中に挿入し、この組換ベクターを固体中に
導入し、固体を育成し、蛋白質−ハプテン接合物を単離
し、ついでこの接合物を集合させておくことによって有
利に調製される。
本発明は、どんな自己集合性蛋白質にも、またどんな
ハプテンにも適用できる基本的、かつ新規なコンセプト
を含む。本発明は、自己集合性蛋白質がタバコモザイッ
クウイルスのコートプロテインであり、ハプテンがポリ
オウイルス１型および３型を含む特別な場合について詳
しく、以下に記述される。しかしながら、この技術およ
び手順が次のような広範囲な他の自己集合性蛋白質に容
易に適用可能であることは明らかであろう。すなわち、
原核および真核植物からのキャプシド、コートおよびそ
の他の蛋白質、並びにＢ型肝炎表面抗原のような動物ウ
イルス、さらに多数の非ウイルス性蛋白質、例えば原核
生物のピリン、フラジェリンおよびリボソーム蛋白質、
並びに真核生物のテュビュリン、筋線維およびリボソー
ム蛋白質である。また、この技術および手順が、アデノ
ウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、ピコ
ルナウイルス、肝炎ウイルスおよび種々の腫瘍ウイルス
のようなウイルス性病原体からの広範囲の、その他のハ
プテンに容易に適用し得ることは明らかであろう。さら
に、肺炎球菌、連鎖球菌およびその他にも用いることが
できる。
ハプテンにも適用できる基本的、かつ新規なコンセプト
を含む。本発明は、自己集合性蛋白質がタバコモザイッ
クウイルスのコートプロテインであり、ハプテンがポリ
オウイルス１型および３型を含む特別な場合について詳
しく、以下に記述される。しかしながら、この技術およ
び手順が次のような広範囲な他の自己集合性蛋白質に容
易に適用可能であることは明らかであろう。すなわち、
原核および真核植物からのキャプシド、コートおよびそ
の他の蛋白質、並びにＢ型肝炎表面抗原のような動物ウ
イルス、さらに多数の非ウイルス性蛋白質、例えば原核
生物のピリン、フラジェリンおよびリボソーム蛋白質、
並びに真核生物のテュビュリン、筋線維およびリボソー
ム蛋白質である。また、この技術および手順が、アデノ
ウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、ピコ
ルナウイルス、肝炎ウイルスおよび種々の腫瘍ウイルス
のようなウイルス性病原体からの広範囲の、その他のハ
プテンに容易に適用し得ることは明らかであろう。さら
に、肺炎球菌、連鎖球菌およびその他にも用いることが
できる。
好ましい実施態様の説明 多数の疾患に対抗し哺乳動物に予防注射をして効果を
あげるために本発明を利用する場合に、上に関連した特
別な場合に対して望ましい結果を得られる好ましい方法
は次のようである。
あげるために本発明を利用する場合に、上に関連した特
別な場合に対して望ましい結果を得られる好ましい方法
は次のようである。
２ケの合成DNA断片、それらはそれぞれTMVコート蛋白
質のほぼ半分を指令するものであるが、は共に自動化さ
れたDNA合成機で生成される一本鎖DNAオリゴヌクレオチ
ドフラグメントを集めて組立てられる。合成TMVコート
蛋白質遺伝子のヌクレオチドシーケンスは第１図に示さ
れる。このDNAシーケンスは一般にTMVストレインのコー
ト蛋白質に対して報告された〔Proc.Nat.Sci.,USA,198
2,vol79,pp5818−5822〕真正のアミノ酸配列に対するコ
ードである。しかしながら合成されたシーケンス（配
列）は、大部分の指令する位置に対して選択的な原核生
物的コドンが選ばれているから、天然の遺伝子配列と異
る。“５′”と印され、一方の鎖（図における上側の
鎖）に199塩基を、他方の鎖（図における下側の鎖）に1
99塩基をもって成る第１図に示した配列部は、第２図に
示されるように13ケの一本鎖DNAオリゴヌクレオチドを
集めて組立てられ、Cla IとAcc I制限端を含む変性され
（modified）直線化されたpBR322プラスミドの中に挿入
される。E.coli中でこの組換プラスミドを増殖させ、Cl
a IとAcc I制限エンドヌクレアーゼで分割させることに
よって、“５′"TMVコート蛋白質遺伝子断片を限りなく
産生し得る。
質のほぼ半分を指令するものであるが、は共に自動化さ
れたDNA合成機で生成される一本鎖DNAオリゴヌクレオチ
ドフラグメントを集めて組立てられる。合成TMVコート
蛋白質遺伝子のヌクレオチドシーケンスは第１図に示さ
れる。このDNAシーケンスは一般にTMVストレインのコー
ト蛋白質に対して報告された〔Proc.Nat.Sci.,USA,198
2,vol79,pp5818−5822〕真正のアミノ酸配列に対するコ
ードである。しかしながら合成されたシーケンス（配
列）は、大部分の指令する位置に対して選択的な原核生
物的コドンが選ばれているから、天然の遺伝子配列と異
る。“５′”と印され、一方の鎖（図における上側の
鎖）に199塩基を、他方の鎖（図における下側の鎖）に1
99塩基をもって成る第１図に示した配列部は、第２図に
示されるように13ケの一本鎖DNAオリゴヌクレオチドを
集めて組立てられ、Cla IとAcc I制限端を含む変性され
（modified）直線化されたpBR322プラスミドの中に挿入
される。E.coli中でこの組換プラスミドを増殖させ、Cl
a IとAcc I制限エンドヌクレアーゼで分割させることに
よって、“５′"TMVコート蛋白質遺伝子断片を限りなく
産生し得る。
“３′”と印され、一方の鎖（図における上側の鎖）
に260塩基をもって成る第１図に示した部分は、第２図
に示されるように17ケの一本鎖DNAオリゴヌクレオチド
を集めて組立てられ、Acc IとApa I制限端を含む変性pB
R322線状プラスミドに挿入される。この場合pBR322のEc
o RIサイトはEco RIサイトにおいて合成DNAリンカーの
挿入によってApa Iサイトに換えられる。Acc IとApa I
によってこの変性プラスミドを分割すれば線状フラグメ
ントが生成し、これに合成Acc I−Apa Iフラグメントを
接合して、E.Coliで増殖できる。
に260塩基をもって成る第１図に示した部分は、第２図
に示されるように17ケの一本鎖DNAオリゴヌクレオチド
を集めて組立てられ、Acc IとApa I制限端を含む変性pB
R322線状プラスミドに挿入される。この場合pBR322のEc
o RIサイトはEco RIサイトにおいて合成DNAリンカーの
挿入によってApa Iサイトに換えられる。Acc IとApa I
によってこの変性プラスミドを分割すれば線状フラグメ
ントが生成し、これに合成Acc I−Apa Iフラグメントを
接合して、E.Coliで増殖できる。
E.Coli中のこの組換プラスミドの増殖によって限りな
い量の“３′"TMVコート蛋白質遺伝子フラグメントが産
生する。
い量の“３′"TMVコート蛋白質遺伝子フラグメントが産
生する。
完全なTMVコート蛋白質遺伝子はTMV5′とTMV3′フラ
グメントに、さらに２つの合成二重螺旋DNAフラグメン
トと、lac UV5転写プロモーターを含む線状プラスミド
ベクターフラグメントから組立てられる。得られるプラ
スミドは第３図に示され、これは直線化されたE.Coli l
ac UV5転写プロモーターを含むpBR322プラスミドを示
し、Eco RIとBam HI制限端を含む。TMV5′とTMV3′フラ
グメントは互いに連結し、また合成二重螺旋DNAリンカ
ーによってpBR322のEco RIおよびBam HIとも連結され
る。この新規の第３図に示される組換プラスミドはpTMV
−６と命名され、バクテリア性のlac UV5プロモーター
のコントロールの下で完全なTMVコート蛋白質指令配列
を含むものである。lac UV5に対する転写開始サイトはE
co RI端から約37個目のヌクレオチドにあるから、TMV遺
伝子をEco RIとBam HIサイトの間に挿入すると遺伝子の
mRNA転写に効果的である。
グメントに、さらに２つの合成二重螺旋DNAフラグメン
トと、lac UV5転写プロモーターを含む線状プラスミド
ベクターフラグメントから組立てられる。得られるプラ
スミドは第３図に示され、これは直線化されたE.Coli l
ac UV5転写プロモーターを含むpBR322プラスミドを示
し、Eco RIとBam HI制限端を含む。TMV5′とTMV3′フラ
グメントは互いに連結し、また合成二重螺旋DNAリンカ
ーによってpBR322のEco RIおよびBam HIとも連結され
る。この新規の第３図に示される組換プラスミドはpTMV
−６と命名され、バクテリア性のlac UV5プロモーター
のコントロールの下で完全なTMVコート蛋白質指令配列
を含むものである。lac UV5に対する転写開始サイトはE
co RI端から約37個目のヌクレオチドにあるから、TMV遺
伝子をEco RIとBam HIサイトの間に挿入すると遺伝子の
mRNA転写に効果的である。
上述のように組立てられるプラスミドpTMV−６は任意
の好都合の生体、例えばE.ColiストレインHB101中で、
精製される前に増殖される。好ましくは精製されたプラ
スミドはE.ColiストレインJM103中にトランスフェクト
される、何故ならばこのストレインは誘発因子が加えら
れるまでは転写について不活性の状態のままにTMV遺伝
子をしておくlacレプレッサー（抑制体）蛋白質を過剰
生産するからである。
の好都合の生体、例えばE.ColiストレインHB101中で、
精製される前に増殖される。好ましくは精製されたプラ
スミドはE.ColiストレインJM103中にトランスフェクト
される、何故ならばこのストレインは誘発因子が加えら
れるまでは転写について不活性の状態のままにTMV遺伝
子をしておくlacレプレッサー（抑制体）蛋白質を過剰
生産するからである。
pTMV−６プラスミドを含むバクテリア中で合成される
組換TMVコート蛋白質は、そのバクテリアから分離さ
れ、酸性條件で蛋白質の自己集合性を利用した技術によ
って精製される。培養後、細胞は超音波処理し、酸性バ
ッファーにさらして透析する。これらの條件下で、バク
テリアの蛋白質の大部分は不溶性になり、したがって容
易に遠心分離で除かれる。酸性条件はTMVコート蛋白質
を高分子量ヘリックス（helix）製造への重合へ誘発す
るために充分であり、その分子量は溶液中にすでに存在
していたどの蛋白質よりも大きいので、クロマトグラフ
の技術を使って容易に精製できる。
組換TMVコート蛋白質は、そのバクテリアから分離さ
れ、酸性條件で蛋白質の自己集合性を利用した技術によ
って精製される。培養後、細胞は超音波処理し、酸性バ
ッファーにさらして透析する。これらの條件下で、バク
テリアの蛋白質の大部分は不溶性になり、したがって容
易に遠心分離で除かれる。酸性条件はTMVコート蛋白質
を高分子量ヘリックス（helix）製造への重合へ誘発す
るために充分であり、その分子量は溶液中にすでに存在
していたどの蛋白質よりも大きいので、クロマトグラフ
の技術を使って容易に精製できる。
pTMV−６プラスミドは翻訳終了指令（translation te
rmination codon）より前にApa I制限サイトと、その指
令（コドン）の後にBam HIサイトを含んでいる。これは
プラスミドからその終了コドン域を削り取ることを可能
にし、複合蛋白質を指令する変性プラスミドを与えるた
めに変性された領域と置換えることを可能にする。一つ
の具体例として、この領域は真正のTMVコート蛋白質端
末に10ケのアミノ酸を加えたものを指令するDNAフラグ
メントと置換えられる。この継ぎ足したアミノ酸の最初
の２ケはグリシンでスペーサー領域としてはたらき、残
りの８ケのアミノ酸はポリオウイルス３型のVP1蛋白質
からの特定の中性化エピトープ（epitope）から成る。
このエピトープはすでに開示されていて（Nature,1983,
Vol.304,pp459−462）ポリオ３型からの主な中性化エピ
トープをあらわし、このエピトープをTMVコート蛋白質
のＣ−端末に着け、そのハイブリッドコート蛋白質の重
合によって、免疫系へのこのエピトープの指示に対する
有効な媒体（vehicle）を生み出す。この変性新プラス
ミドは第４図に画かれpTMV−ポリオ３と命名された。
rmination codon）より前にApa I制限サイトと、その指
令（コドン）の後にBam HIサイトを含んでいる。これは
プラスミドからその終了コドン域を削り取ることを可能
にし、複合蛋白質を指令する変性プラスミドを与えるた
めに変性された領域と置換えることを可能にする。一つ
の具体例として、この領域は真正のTMVコート蛋白質端
末に10ケのアミノ酸を加えたものを指令するDNAフラグ
メントと置換えられる。この継ぎ足したアミノ酸の最初
の２ケはグリシンでスペーサー領域としてはたらき、残
りの８ケのアミノ酸はポリオウイルス３型のVP1蛋白質
からの特定の中性化エピトープ（epitope）から成る。
このエピトープはすでに開示されていて（Nature,1983,
Vol.304,pp459−462）ポリオ３型からの主な中性化エピ
トープをあらわし、このエピトープをTMVコート蛋白質
のＣ−端末に着け、そのハイブリッドコート蛋白質の重
合によって、免疫系へのこのエピトープの指示に対する
有効な媒体（vehicle）を生み出す。この変性新プラス
ミドは第４図に画かれpTMV−ポリオ３と命名された。
TMV−ポリオ３複合物を生体で発現させた後、TMV蛋白
質に対して行った上述と同様の方法で分離し、精製する
ことができる。
質に対して行った上述と同様の方法で分離し、精製する
ことができる。
他の具体例において、pTMV−６発現プラスミドは、Ap
a I−Bam HIフラグメントを除去し、TMVコート蛋白質Ｃ
−端末の最後の２ケのアミノ酸にスペーサーとして働く
２ケのグリシンとポリオ１型抗原性エピトープを提示す
る11ケの付加アミノ酸を加えたものを指令するDNAフラ
グメントと置き換えて変性することができる。第５図は
pTMV−ポリオ１と命名された新変性プラスミドの構造と
新エピトープの配列を示している。１型エピトープはポ
リオ１型のVP2蛋白質上に位置し（J.Virol.1984.Vol 5
2.pp719−721）中性化エピトープとして記述されてい
る。12ケのアミノ酸エピトープの配列は元来次のように
報じられた;Thr−Pro−Asp−Asn−Asn−Gln−Thr−Ser
−Pro−Ala−Arg−Agr.こゝで報告される配列は最後の
アミノ酸の位置が異る、こゝではArgがSerに変えられて
いるがこれはポリオ１型のマホネイストレイン（Mahone
y strain）のアミノ酸配列（Nature,1981,vol 291,pp 5
47−553）に完全に一致する。TMV−ポリオ１製品は、上
述のTMV−ポリオ３製品と同様の方法でE.coli抽出物か
ら分離することができる。
a I−Bam HIフラグメントを除去し、TMVコート蛋白質Ｃ
−端末の最後の２ケのアミノ酸にスペーサーとして働く
２ケのグリシンとポリオ１型抗原性エピトープを提示す
る11ケの付加アミノ酸を加えたものを指令するDNAフラ
グメントと置き換えて変性することができる。第５図は
pTMV−ポリオ１と命名された新変性プラスミドの構造と
新エピトープの配列を示している。１型エピトープはポ
リオ１型のVP2蛋白質上に位置し（J.Virol.1984.Vol 5
2.pp719−721）中性化エピトープとして記述されてい
る。12ケのアミノ酸エピトープの配列は元来次のように
報じられた;Thr−Pro−Asp−Asn−Asn−Gln−Thr−Ser
−Pro−Ala−Arg−Agr.こゝで報告される配列は最後の
アミノ酸の位置が異る、こゝではArgがSerに変えられて
いるがこれはポリオ１型のマホネイストレイン（Mahone
y strain）のアミノ酸配列（Nature,1981,vol 291,pp 5
47−553）に完全に一致する。TMV−ポリオ１製品は、上
述のTMV−ポリオ３製品と同様の方法でE.coli抽出物か
ら分離することができる。
すでに前に述べたように、本発明の重要な特徴はTMV
コート蛋白質様サブユニットの凝集分子を組立てる能力
であって、その中で凝集分子を作り上げている個々のサ
ブユニットが１個以上の形の抗原性エピトープを含むこ
とができることである。一例としてTMV−ポリオ１型とT
MV−ポリオ３型の混合物が形成され、それらサブユニッ
トが螺旋構造に重合され、この構造内で個々の螺旋分子
がTMV蛋白質残部の凝集によって両方のエピトープを含
有することになる。このような多種の特定のエピトープ
産物を備える能力は、多種の病原性因子に対して免疫を
与える多効果ワクチンの生産を可能にするものである。
コート蛋白質様サブユニットの凝集分子を組立てる能力
であって、その中で凝集分子を作り上げている個々のサ
ブユニットが１個以上の形の抗原性エピトープを含むこ
とができることである。一例としてTMV−ポリオ１型とT
MV−ポリオ３型の混合物が形成され、それらサブユニッ
トが螺旋構造に重合され、この構造内で個々の螺旋分子
がTMV蛋白質残部の凝集によって両方のエピトープを含
有することになる。このような多種の特定のエピトープ
産物を備える能力は、多種の病原性因子に対して免疫を
与える多効果ワクチンの生産を可能にするものである。
実施例１ この実施例はTMV5′断片の組立と生成を示す。
TMV5′断片は13のオリゴヌクレオチドの集合から、図
２で示すような２段のアニーリング及び連結法（anneal
ing and ligation strategy）で組立てられた。このオ
リゴヌクレオチドは次のアニーリング及び連結反応のた
めに、4,4,5個のオリゴヌクレオチドの３つの群に分け
られた。アニーリングの前に各DNAは５′端に加リン酸
化した。ただし群Ｉの34マーと群IIIの19マーは除外し
た。かくして群Ｉと群IIIの二重ストランド連結生成物
が、パリンドローム（Palindromic）的制限端の互に連
結して頭−頭ダイマーが生成するのを防止した。３つの
アニーリング−連結反応の各々の二重ストランド生成物
はポリアクリルアミドゲル電気泳動で精製した。精製ゲ
ル中の各生成物の位置は、オリゴヌクレオチドを加リン
酸反応中に放射性基質を用いることによって放射性にし
たので、容易に決定することができた。群I,II,III連結
の精製生成物は第２段の連結反応のために、互にアニー
ルさせる。二本鎖DNA分子（各鎖は199塩基を有する）は
ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって精製され、バ
クテリア中で増殖するためのCla IおよびAcc I制限端を
有するpBR322線状化プラスミドの中に連結された。組換
プラスミドはTMV5′断片の生成のためにE.Coli中で増殖
された。
２で示すような２段のアニーリング及び連結法（anneal
ing and ligation strategy）で組立てられた。このオ
リゴヌクレオチドは次のアニーリング及び連結反応のた
めに、4,4,5個のオリゴヌクレオチドの３つの群に分け
られた。アニーリングの前に各DNAは５′端に加リン酸
化した。ただし群Ｉの34マーと群IIIの19マーは除外し
た。かくして群Ｉと群IIIの二重ストランド連結生成物
が、パリンドローム（Palindromic）的制限端の互に連
結して頭−頭ダイマーが生成するのを防止した。３つの
アニーリング−連結反応の各々の二重ストランド生成物
はポリアクリルアミドゲル電気泳動で精製した。精製ゲ
ル中の各生成物の位置は、オリゴヌクレオチドを加リン
酸反応中に放射性基質を用いることによって放射性にし
たので、容易に決定することができた。群I,II,III連結
の精製生成物は第２段の連結反応のために、互にアニー
ルさせる。二本鎖DNA分子（各鎖は199塩基を有する）は
ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって精製され、バ
クテリア中で増殖するためのCla IおよびAcc I制限端を
有するpBR322線状化プラスミドの中に連結された。組換
プラスミドはTMV5′断片の生成のためにE.Coli中で増殖
された。
実施例２ この実施例はTMV3′断片の組立と生成を示す。
TMV指令配列（coding sequence）の３′断片が図２で
示されるような17のオリゴヌクレオチドの集合から組立
てられた。このオリゴヌクレオチドは4,4,4,5個のオリ
ゴヌクレオチドの４つの群に分けられた。すべてのオリ
ゴヌクレオチドは放射性ATPを用いて加リン酸化した。
ただし群Ｉの33マーと群IVの15マーは除外した。このこ
とは、実施例１と同様に、パリンドローム的制限端にも
とづく、群Ｉと群IVの連結生成物の２量化を防止するた
めであった。この４つの群はアニーリングと連結反応を
させた。次の連結生成物は変性ポリアクリルアミドゲル
電気泳動によって精製した。変性ゲルを用いたので、一
本鎖分子としてマイグレートする連結生成物が生じた。
変性ゲルのため高い程度の分解（resolution）が現れ、
又種々のヌクレオチド間の非特定の会合の結果として、
天然ゲル電気泳動の際、時々起る未確認のバンドは現れ
なかった。４つの連結反応の各々の２つの一本鎖生成物
を変性ゲルで精製し、第２段の連結反応のため一緒にア
ニールさせした。連結後、一方の鎖（図における上側の
鎖）が260塩基からなり、他方の鎖（図における下側の
鎖）が254塩基より成る生成物を変性ポリアクリルアミ
ドゲルで精製した。２つの鎖のアニーリングの後、生じ
た二本鎖DNAはAcc IおよびApa I制限端を含有する線状
化pBR322プラスミドの中に挿入した。組換プラスミドは
E.Coliの中でTMV3′断片の生成のため増殖された。
示されるような17のオリゴヌクレオチドの集合から組立
てられた。このオリゴヌクレオチドは4,4,4,5個のオリ
ゴヌクレオチドの４つの群に分けられた。すべてのオリ
ゴヌクレオチドは放射性ATPを用いて加リン酸化した。
ただし群Ｉの33マーと群IVの15マーは除外した。このこ
とは、実施例１と同様に、パリンドローム的制限端にも
とづく、群Ｉと群IVの連結生成物の２量化を防止するた
めであった。この４つの群はアニーリングと連結反応を
させた。次の連結生成物は変性ポリアクリルアミドゲル
電気泳動によって精製した。変性ゲルを用いたので、一
本鎖分子としてマイグレートする連結生成物が生じた。
変性ゲルのため高い程度の分解（resolution）が現れ、
又種々のヌクレオチド間の非特定の会合の結果として、
天然ゲル電気泳動の際、時々起る未確認のバンドは現れ
なかった。４つの連結反応の各々の２つの一本鎖生成物
を変性ゲルで精製し、第２段の連結反応のため一緒にア
ニールさせした。連結後、一方の鎖（図における上側の
鎖）が260塩基からなり、他方の鎖（図における下側の
鎖）が254塩基より成る生成物を変性ポリアクリルアミ
ドゲルで精製した。２つの鎖のアニーリングの後、生じ
た二本鎖DNAはAcc IおよびApa I制限端を含有する線状
化pBR322プラスミドの中に挿入した。組換プラスミドは
E.Coliの中でTMV3′断片の生成のため増殖された。
実施例３ この実施例は完全なTMV指令配列の生成とpTMV−６の
生成を示す。TMVコートプロテインエクスプレッション
プラスミドは５路連結反応によって生成され、その際TM
V5′とTMV3′の断片が、共通のAcc I制限端で互に連結
され、生じた450塩基対断片は２つの短い、二本鎖リン
カー断片の助力によって、pBR322ベクターに連結された
（図３）。１つのリンカー断片はpBR322プラスミドのEc
o RI端をTMV断片のCla I端に連結し、一方端のリンカー
はこのプラスミドのBam HIをTMV断片のApa I端に連結し
た。連結反応中の連結作用に加えて、リンカーDNAも、
残っているコドンと、翻訳の出発および停止信号を供給
してTMV指令配列を完成した。生じたプラスミドpTMV−
６は図３に示されている。
生成を示す。TMVコートプロテインエクスプレッション
プラスミドは５路連結反応によって生成され、その際TM
V5′とTMV3′の断片が、共通のAcc I制限端で互に連結
され、生じた450塩基対断片は２つの短い、二本鎖リン
カー断片の助力によって、pBR322ベクターに連結された
（図３）。１つのリンカー断片はpBR322プラスミドのEc
o RI端をTMV断片のCla I端に連結し、一方端のリンカー
はこのプラスミドのBam HIをTMV断片のApa I端に連結し
た。連結反応中の連結作用に加えて、リンカーDNAも、
残っているコドンと、翻訳の出発および停止信号を供給
してTMV指令配列を完成した。生じたプラスミドpTMV−
６は図３に示されている。
実施例４ この実施例はTMVコートプロテインのエクスプレッシ
ョンを示す。
ョンを示す。
E.Coliストレインにクローニングした後、実施例３に
記載の如く、生成したpTMV−６を精製し、標準方法を用
いてE.ColiストレインJM103の中に移植した。TMV遺伝子
のバクテリア中のエクスプレッションが1mMのイソプロ
ピルＢ−Ｄ−チオガラクトピラノシド〔IPTG〕で誘発さ
れた。培養液0.5mlを採取し、バクテリアを遠心分離
し、100℃でSDS処理によって分解（lyse）する。この全
細胞抽出物をSDSポリアクリルアミド上で電気泳動す
る。その後各プロテインはニトロセルローズ紙にブロッ
トし、TMV状物質の存否を反TMV抗体を用いて決定した
（図６参照）。図６はこの実験の結果を示すが、その際
プラスミドpBR322のみを含有するバクテリアはTMVコー
トプロテイン位置にマイグレートするポジティブ信号を
示さない。しかしながら、合成コートプロテイン遺伝子
を含有するバクテリアは、実際のウイールスから得られ
た真正のTMVコートプロテインマーカーと全く同じ位置
にマイグレートするポジティブバンドを示す。
記載の如く、生成したpTMV−６を精製し、標準方法を用
いてE.ColiストレインJM103の中に移植した。TMV遺伝子
のバクテリア中のエクスプレッションが1mMのイソプロ
ピルＢ−Ｄ−チオガラクトピラノシド〔IPTG〕で誘発さ
れた。培養液0.5mlを採取し、バクテリアを遠心分離
し、100℃でSDS処理によって分解（lyse）する。この全
細胞抽出物をSDSポリアクリルアミド上で電気泳動す
る。その後各プロテインはニトロセルローズ紙にブロッ
トし、TMV状物質の存否を反TMV抗体を用いて決定した
（図６参照）。図６はこの実験の結果を示すが、その際
プラスミドpBR322のみを含有するバクテリアはTMVコー
トプロテイン位置にマイグレートするポジティブ信号を
示さない。しかしながら、合成コートプロテイン遺伝子
を含有するバクテリアは、実際のウイールスから得られ
た真正のTMVコートプロテインマーカーと全く同じ位置
にマイグレートするポジティブバンドを示す。
実施例５ この実施例は細胞培養液からのTMVプロテインの回収
を示す。
を示す。
実施例３の記載に従って生成したpTMV−６をかくまう
バクテリア（E.ColiストレインJM103）をIPTGの存在下
で培養しlac VV5プロモーターでエクスプレッションを
誘発した。細胞を遠心分離によって収獲した。バクテリ
アをソニケーション緩衝液に再懸濁し、ソニケーション
によって分解（lyse）し、次に細胞砕片を定速遠心分離
によって除いた。上澄液を0.1Mナトリウムアセテートよ
りなるpH5.0の緩衝溶液に対して一昼夜、室温で透析し
た。だから、このサンプルをセファローズ6Bカラムにか
け、生じたピークをポリアクリルアミドゲル電気泳動
（図８参照）で分析した。TMVウイールスからの真正の
コートプロテインマーカーとしての、正確な位置にマイ
グレートする単一生成物を含むボイドフラクションを示
す。比較実験としてTMVエクスプレッションプラスミド
を欠くバクテリアを同じ方法で処理したが、ボイドフラ
クションの中に検知生成物が認められなかった。
バクテリア（E.ColiストレインJM103）をIPTGの存在下
で培養しlac VV5プロモーターでエクスプレッションを
誘発した。細胞を遠心分離によって収獲した。バクテリ
アをソニケーション緩衝液に再懸濁し、ソニケーション
によって分解（lyse）し、次に細胞砕片を定速遠心分離
によって除いた。上澄液を0.1Mナトリウムアセテートよ
りなるpH5.0の緩衝溶液に対して一昼夜、室温で透析し
た。だから、このサンプルをセファローズ6Bカラムにか
け、生じたピークをポリアクリルアミドゲル電気泳動
（図８参照）で分析した。TMVウイールスからの真正の
コートプロテインマーカーとしての、正確な位置にマイ
グレートする単一生成物を含むボイドフラクションを示
す。比較実験としてTMVエクスプレッションプラスミド
を欠くバクテリアを同じ方法で処理したが、ボイドフラ
クションの中に検知生成物が認められなかった。
実施例６ この実施例はpTMV−Polio3の生成を示す。
Ｃ−末端に抗原性エピトープを有する変性TMVコート
プロテインをコードする遺伝子の生成は、pTMV−６プラ
スミド（図３）をApa IとBam HIで分裂し、そのコート
プロテインのＣ−末端のためにコードする小断片を除く
ことによって遂行された。この断片は、コートプロテイ
ンＣ−端末プラス２つのグリシン残基、及びPolio type
3に対するVIPプロテインからの支配的抗原性エピトープ
を表わす８つのアミノ酸に対してコードする他の合成DN
A断片で置換された。生じたプラスミドは図４に示され
る。
プロテインをコードする遺伝子の生成は、pTMV−６プラ
スミド（図３）をApa IとBam HIで分裂し、そのコート
プロテインのＣ−末端のためにコードする小断片を除く
ことによって遂行された。この断片は、コートプロテイ
ンＣ−端末プラス２つのグリシン残基、及びPolio type
3に対するVIPプロテインからの支配的抗原性エピトープ
を表わす８つのアミノ酸に対してコードする他の合成DN
A断片で置換された。生じたプラスミドは図４に示され
る。
実施例７ この実施例はTMV−Polio 3複合プロテインのエクスプ
レッションを示す。
レッションを示す。
実施例３の記載に従って生成されたpTMV−６もしくは
実施例６の記載に従って生成されたpTMV−polio 3プラ
スミドを含有するE.Coliの培養液がIPTGでエクスプレス
するよう誘発された。各培養液0.5mlを遠心分離によっ
て収獲し、バクテリアペレットをSDSで100℃で分解（ly
se）した。全細胞抽出液をSDSポリアクリルアミドゲル
上で電気泳動させ、その後プロテインをニトロセルロー
スにブロットさせ、抗TMVおよび抗polio type3抗体と反
応させた。図７はこの実験を示す。抗TMV抗体は、真正
のTMVコートプロテインマーカーと共マイグレートす
る。pTMV−６を含むバクテリアからの生成物、と反応し
た。抗TMV抗体は又pTMV−polio 3含有バクテリアからの
TMV様生成物と反応したが、このものはTMVマーカーに関
して低い移動度を示す。これは、Ｃ−末端に追加の10ア
ミノ酸を含有するTMV−polio 3生成物としての期待され
た結果であり、異ったマイグレートすることを期待すべ
きである。
実施例６の記載に従って生成されたpTMV−polio 3プラ
スミドを含有するE.Coliの培養液がIPTGでエクスプレス
するよう誘発された。各培養液0.5mlを遠心分離によっ
て収獲し、バクテリアペレットをSDSで100℃で分解（ly
se）した。全細胞抽出液をSDSポリアクリルアミドゲル
上で電気泳動させ、その後プロテインをニトロセルロー
スにブロットさせ、抗TMVおよび抗polio type3抗体と反
応させた。図７はこの実験を示す。抗TMV抗体は、真正
のTMVコートプロテインマーカーと共マイグレートす
る。pTMV−６を含むバクテリアからの生成物、と反応し
た。抗TMV抗体は又pTMV−polio 3含有バクテリアからの
TMV様生成物と反応したが、このものはTMVマーカーに関
して低い移動度を示す。これは、Ｃ−末端に追加の10ア
ミノ酸を含有するTMV−polio 3生成物としての期待され
た結果であり、異ったマイグレートすることを期待すべ
きである。
抗polio type3抗体とのブロット反応によって、TMV−
polio 3生成物からのポジティブ信号が生じたが、未変
性TMVの場合は生じなかった。
polio 3生成物からのポジティブ信号が生じたが、未変
性TMVの場合は生じなかった。
実施例８ この実施例は、細胞培養液からのTMV−polio 3複合プ
ロテインの回収を示す。
ロテインの回収を示す。
TMV−polio 3の精製実験は実施例３でTMVについて述
べたと同じ方法で行った。バクテリアをIPTGの存在下で
培養し、収獲し、ソニケーションで分解した。細胞砕片
を遠心分離によって除いた後、上澄液をpH5.0緩衝液に
対して透析し、TMV−polio 3生成物の凝集を刺激した。
セファローズ6Bクロマトグラフによって、SDSポリアク
リルアミドゲル中の真正TMVコートプロテインマーカー
よりも若干遅くマイグレートする単一生成物を含有する
小さいボイドピークが生じた。精製工程中TMV−polio 3
がTMVコートプロテインと同じ様に行動する事実は、Ｃ
−末端の伸長の存在が、コートプロテイン生成物の酸性
pHで誘発された凝集に干渉しないことを示すものであ
る。更にtype3エピトープは実際に重合を促進している
かもしれない。TMV−polio 3の精製からのボイドピーク
はTMV精製からのボイドピークよりも先に再現され、こ
れらの条件下では、エピトープは高分子量に凝集してい
ることを示唆している。
べたと同じ方法で行った。バクテリアをIPTGの存在下で
培養し、収獲し、ソニケーションで分解した。細胞砕片
を遠心分離によって除いた後、上澄液をpH5.0緩衝液に
対して透析し、TMV−polio 3生成物の凝集を刺激した。
セファローズ6Bクロマトグラフによって、SDSポリアク
リルアミドゲル中の真正TMVコートプロテインマーカー
よりも若干遅くマイグレートする単一生成物を含有する
小さいボイドピークが生じた。精製工程中TMV−polio 3
がTMVコートプロテインと同じ様に行動する事実は、Ｃ
−末端の伸長の存在が、コートプロテイン生成物の酸性
pHで誘発された凝集に干渉しないことを示すものであ
る。更にtype3エピトープは実際に重合を促進している
かもしれない。TMV−polio 3の精製からのボイドピーク
はTMV精製からのボイドピークよりも先に再現され、こ
れらの条件下では、エピトープは高分子量に凝集してい
ることを示唆している。
実施例９ この実施例はTMV蛋白質とTMV−ポリオ３との複合体
（コンジュゲート）の電子顕微鏡による分析例である。
（コンジュゲート）の電子顕微鏡による分析例である。
上記実施例５および８記載の方法で得られたTMVおよ
びTMV−ポリオ３のそれぞれのpH5.0試料について、この
pHにおいて見られる凝集が真性（authentic）TMVタイプ
の重合反応に相当したことを示すために、電子顕微鏡に
よる分析が行なわれた。E.coliが生産したコート蛋白質
およびTMV−ポリオ３の両試料は、上記実施例５および
８記載のセファローズ6BのクロマトグラフィーによりpH
5.0のE.coli抽出物から精製された。これらの試料につ
いて、その背景をよごす（ネガティブスティニング）技
術を施したのち、電子顕微鏡で観察した。第10図に見ら
れるように、両試料は酸性条件下の真性TMVコート蛋白
質の典型的な短い棒（rods）および円盤（disk）タイプ
の製造の存在を示した。更に、TMV−ポリオ３の試料は
長い棒の存在を示しており、非修飾のTMV生成物よりも
より効果的に凝集していることを示唆している。
びTMV−ポリオ３のそれぞれのpH5.0試料について、この
pHにおいて見られる凝集が真性（authentic）TMVタイプ
の重合反応に相当したことを示すために、電子顕微鏡に
よる分析が行なわれた。E.coliが生産したコート蛋白質
およびTMV−ポリオ３の両試料は、上記実施例５および
８記載のセファローズ6BのクロマトグラフィーによりpH
5.0のE.coli抽出物から精製された。これらの試料につ
いて、その背景をよごす（ネガティブスティニング）技
術を施したのち、電子顕微鏡で観察した。第10図に見ら
れるように、両試料は酸性条件下の真性TMVコート蛋白
質の典型的な短い棒（rods）および円盤（disk）タイプ
の製造の存在を示した。更に、TMV−ポリオ３の試料は
長い棒の存在を示しており、非修飾のTMV生成物よりも
より効果的に凝集していることを示唆している。
実施例10 この実施例はTMV蛋白質の凝集の可逆性を示すもので
ある。
ある。
真性TMVコート蛋白質が示す重合反応の重要な特徴
は、その可逆性である。実施例８記載のようにしてpH5.
0セファローズ6Bカラムからのボイドフラクション（voi
d fraction）から分離されたTMV−ポリオ３の試料は0.1
モルのトリス（Tris）pH8.0に対して４℃において透析
され、さらにもう一度セファローズ6B上でクロマトグラ
フィーにかけられた。生成物の移動性は減少しており、
TMV−ポリオ３はインクルージョンフラクション（inclu
sion fraction）中にのみ見出された。更に、0.1M酢酸
ソーダに対する透析による第２のpH5.0への逆転換の結
果、更にもう一つの移動性の転換が生じ、そこではゲル
過（gelfiltration）クロマトグラフィーの結果、そ
の物質は再びボイドフラクション中に見出された。
は、その可逆性である。実施例８記載のようにしてpH5.
0セファローズ6Bカラムからのボイドフラクション（voi
d fraction）から分離されたTMV−ポリオ３の試料は0.1
モルのトリス（Tris）pH8.0に対して４℃において透析
され、さらにもう一度セファローズ6B上でクロマトグラ
フィーにかけられた。生成物の移動性は減少しており、
TMV−ポリオ３はインクルージョンフラクション（inclu
sion fraction）中にのみ見出された。更に、0.1M酢酸
ソーダに対する透析による第２のpH5.0への逆転換の結
果、更にもう一つの移動性の転換が生じ、そこではゲル
過（gelfiltration）クロマトグラフィーの結果、そ
の物質は再びボイドフラクション中に見出された。
実施例11 この実施例は免疫実験の結果を示すものである。
最初の免疫実験では、実施例５および８記載の方法で
それぞれ製造されたTMVコート蛋白質およびTMV−ポリオ
３複合蛋白質が皮内（ID）および腹腔内（IP）ルートに
よってラットに注射された。各ラットはIDにTMV100μｇ
とIPにTMV100μｇか、もしくはIDに100μｇのTMV−ポリ
オ３とIPに100μｇのTMV−ポリオ３を注射された。すべ
ての注射液は完全なフロインド（Freund）の補助剤入り
であり、各ラットは全部で４回の注射を受けた。第１と
第２の注射の間隔は３週間であり、残りの２回は２週間
間隔で行った。結果を第１表に示す。
それぞれ製造されたTMVコート蛋白質およびTMV−ポリオ
３複合蛋白質が皮内（ID）および腹腔内（IP）ルートに
よってラットに注射された。各ラットはIDにTMV100μｇ
とIPにTMV100μｇか、もしくはIDに100μｇのTMV−ポリ
オ３とIPに100μｇのTMV−ポリオ３を注射された。すべ
ての注射液は完全なフロインド（Freund）の補助剤入り
であり、各ラットは全部で４回の注射を受けた。第１と
第２の注射の間隔は３週間であり、残りの２回は２週間
間隔で行った。結果を第１表に示す。
上記結果に見られる如く、TMV−ポリオ３製品の注射を
受けたラットは抗ポリオの中和性（antipolio neutrali
zing）抗体を生産した。滴定値は対数の相乗平均として
表示してある。ウイルス粒子の中和は各試験ラット個体
からの抗血清の一連の希釈液で処理したウイルスを組織
培養細胞上に平板培養することによって確かめられた。
細胞変性効果の欠如は、すべてのウイルス粒子の完全な
中和を示した。
受けたラットは抗ポリオの中和性（antipolio neutrali
zing）抗体を生産した。滴定値は対数の相乗平均として
表示してある。ウイルス粒子の中和は各試験ラット個体
からの抗血清の一連の希釈液で処理したウイルスを組織
培養細胞上に平板培養することによって確かめられた。
細胞変性効果の欠如は、すべてのウイルス粒子の完全な
中和を示した。
第２の免疫実験はTMV−ポリオ３製品の３つの異なる
形体、すなわちpH5.0凝集TMV−ポリオ３（実施例８）、
pH8.0解凝集TMV−ポリオ３（実施例10）およびRNA結集T
MV−ポリオ３への免疫応答を比較するために実施され
た。最後の形体すなわちRNA結集物質は真性TMVゲノムの
RNA（genomic RNA）によってin vitroで培養されたTMV
−ポリオ３の調製を示した。そのような反応の結果、TM
V−ポリオ３およびTMV RNAよりなるpH安定性ウイルス様
粒子が生成した。そのような生成物は電子顕微鏡による
観察が示すように、真性TMVウイルスにきわめて似たも
のであった。RNA結集TMV−ポリオ３は結集前のRNAの減
成に起因する棒の長さの不均質を示した。
形体、すなわちpH5.0凝集TMV−ポリオ３（実施例８）、
pH8.0解凝集TMV−ポリオ３（実施例10）およびRNA結集T
MV−ポリオ３への免疫応答を比較するために実施され
た。最後の形体すなわちRNA結集物質は真性TMVゲノムの
RNA（genomic RNA）によってin vitroで培養されたTMV
−ポリオ３の調製を示した。そのような反応の結果、TM
V−ポリオ３およびTMV RNAよりなるpH安定性ウイルス様
粒子が生成した。そのような生成物は電子顕微鏡による
観察が示すように、真性TMVウイルスにきわめて似たも
のであった。RNA結集TMV−ポリオ３は結集前のRNAの減
成に起因する棒の長さの不均質を示した。
このTMV−ポリオ３のRNA結集調製は免疫研究の際のコ
ントロールとして役立った。その理由は、もしpH5.0凝
集TMV−ポリオ３に対する免疫応答がpH8.0解凝集物質に
対してよりもRNA結集製品への応答により近似していれ
ば、免疫応答の誘発中、pH5.0製品は大部分が高分子量
の状態にとどまっていることを示している。一方、もし
pH5.0TMV−ポリオ３の応答がpH8.0のものの応答により
近似していれば、pH5.0物質は注射後まもなく解凝集し
てしまうこと、および観察された免疫応答は主として低
分子量生成物に対して向けられたと推論出来るだろう。
ントロールとして役立った。その理由は、もしpH5.0凝
集TMV−ポリオ３に対する免疫応答がpH8.0解凝集物質に
対してよりもRNA結集製品への応答により近似していれ
ば、免疫応答の誘発中、pH5.0製品は大部分が高分子量
の状態にとどまっていることを示している。一方、もし
pH5.0TMV−ポリオ３の応答がpH8.0のものの応答により
近似していれば、pH5.0物質は注射後まもなく解凝集し
てしまうこと、および観察された免疫応答は主として低
分子量生成物に対して向けられたと推論出来るだろう。
第２の免疫実験結果を第２表に示す。
第２表の結果が示す如く、pH5.0凝集TMV−ポリオ３へ
の応答はRNA結集物への応答に最も近似していた。pH5.0
生成物はやゝ高いレベルの免疫性を誘発するように思わ
れ、この事はpH5.0凝集TMV−ポリオ３は注射後すぐには
解凝集しなかった事を示した。予期したように、pH8.0
解凝集生成物への免疫応答は、免疫応答の効果的誘発の
ために高分子量を維持することの重要性を、より低度に
確認していた。RNA結集TMV−ポリオ３は、E.M.およびク
ロマトグラフィ的研究により判断されるように、生理的
pHにおいては安定であるべきと知られていた。
の応答はRNA結集物への応答に最も近似していた。pH5.0
生成物はやゝ高いレベルの免疫性を誘発するように思わ
れ、この事はpH5.0凝集TMV−ポリオ３は注射後すぐには
解凝集しなかった事を示した。予期したように、pH8.0
解凝集生成物への免疫応答は、免疫応答の効果的誘発の
ために高分子量を維持することの重要性を、より低度に
確認していた。RNA結集TMV−ポリオ３は、E.M.およびク
ロマトグラフィ的研究により判断されるように、生理的
pHにおいては安定であるべきと知られていた。
実施例12 この実施例は解凝集実験の結果を示すものである。
実施例11において提示した免疫性のテストにおいて、
TMV−ポリオ３生成物はラット中に注射後すみやかには
解凝集しなかった事の証拠を提示するために、pH5.0で
凝集したTMV−ポリオ３試料をpH7.0および37℃において
りん酸塩で緩衝された塩類溶液中に透析し、次いで同じ
条件下でセファローズ6B上にクロマトグラフした。その
結果、生成物はまだボイドピーク中に移動しており、解
凝集は生起しなかった事を示していた。pH5.0におけるT
MV−ポリオ３の類似試料を０℃においてpH8.0緩衝液中
へ透析し、次いでクロマトグラフした。この物質はもっ
ぱらインクルージョンフラクション中に見出され、従っ
て解凝集が生起した事を示した。上記の実験により、TM
V−ポリオ３の解凝集はアルカリ性pHにおいて冷時には
生起するが、生理的条件下ではおそらく生起しないこと
がわかる。
TMV−ポリオ３生成物はラット中に注射後すみやかには
解凝集しなかった事の証拠を提示するために、pH5.0で
凝集したTMV−ポリオ３試料をpH7.0および37℃において
りん酸塩で緩衝された塩類溶液中に透析し、次いで同じ
条件下でセファローズ6B上にクロマトグラフした。その
結果、生成物はまだボイドピーク中に移動しており、解
凝集は生起しなかった事を示していた。pH5.0におけるT
MV−ポリオ３の類似試料を０℃においてpH8.0緩衝液中
へ透析し、次いでクロマトグラフした。この物質はもっ
ぱらインクルージョンフラクション中に見出され、従っ
て解凝集が生起した事を示した。上記の実験により、TM
V−ポリオ３の解凝集はアルカリ性pHにおいて冷時には
生起するが、生理的条件下ではおそらく生起しないこと
がわかる。
実施例13 この実施例はプラスミドpTMV−ポリオ１の形成および
細胞培養時のその表現を示すものである。
細胞培養時のその表現を示すものである。
TMVコート蛋白質のＣ−末端の遺伝情報を指定すpTMV
−６のApa I−Bam HIフラグメントを取除き、コート蛋
白質Ｃ−末端と２つのグリシンの遺伝情報を指定する制
限フラグメントおよびポリオ１型のVP2蛋白質からの12
アミノ酸エピトープとでおきかえた。得られたプラスミ
ドpTMV−ポリオ１を第５図に示した。この修飾プラスミ
ドを含有するE.Coli人工変種JM103をIPTGで誘発する
と、TMV様の生成物が生成し、それはpH5.0で凝集し、SD
Sポリアクリルアミドゲル上でTMVコート蛋白質の標識よ
りもわずかに遅い移動性で移動した。この生成物をTMV
−ポリオ１と称することにする。
−６のApa I−Bam HIフラグメントを取除き、コート蛋
白質Ｃ−末端と２つのグリシンの遺伝情報を指定する制
限フラグメントおよびポリオ１型のVP2蛋白質からの12
アミノ酸エピトープとでおきかえた。得られたプラスミ
ドpTMV−ポリオ１を第５図に示した。この修飾プラスミ
ドを含有するE.Coli人工変種JM103をIPTGで誘発する
と、TMV様の生成物が生成し、それはpH5.0で凝集し、SD
Sポリアクリルアミドゲル上でTMVコート蛋白質の標識よ
りもわずかに遅い移動性で移動した。この生成物をTMV
−ポリオ１と称することにする。
実施例14 この実施例はTMV−ポリオ１およびTMV−ポリオ３の共
重合体を示すものである。
重合体を示すものである。
実施例７および13の手法に従ってそれぞれ調製し、pH
5.0において精製したTMV−ポリオ１およびTMV−ポリオ
３をpH8.0において混合し、pH5.5において共重合させ
た。尚、pHの変換はすべて透析により行った。共重合反
応は電子顕微鏡により監視され、その際抗ポリオタイプ
３抗体が加えられ、試料の抗体結合をしらべた。電子顕
微鏡により観察されたすべての棒は注目に値する抗体結
合の存在を証明しており、形成されたすべての棒がTMV
−ポリオ１とTMV−ポリオ３型のサブ単位から構成され
ており、TMV−ポリオ１のサブ単位のみで構成された棒
はないことを示唆していた。対照としてTMV−ポリオ３
の棒またはTMV−ポリオ１の棒をそれぞれ抗ポリオタイ
プ３抗体で処理して試験を行った。TMV−ポリオ３の棒
の方はかなり抗体で覆われていたが、一方、TMV−ポリ
オ１の棒の方は反応しなかった（第11図参照）。
5.0において精製したTMV−ポリオ１およびTMV−ポリオ
３をpH8.0において混合し、pH5.5において共重合させ
た。尚、pHの変換はすべて透析により行った。共重合反
応は電子顕微鏡により監視され、その際抗ポリオタイプ
３抗体が加えられ、試料の抗体結合をしらべた。電子顕
微鏡により観察されたすべての棒は注目に値する抗体結
合の存在を証明しており、形成されたすべての棒がTMV
−ポリオ１とTMV−ポリオ３型のサブ単位から構成され
ており、TMV−ポリオ１のサブ単位のみで構成された棒
はないことを示唆していた。対照としてTMV−ポリオ３
の棒またはTMV−ポリオ１の棒をそれぞれ抗ポリオタイ
プ３抗体で処理して試験を行った。TMV−ポリオ３の棒
の方はかなり抗体で覆われていたが、一方、TMV−ポリ
オ１の棒の方は反応しなかった（第11図参照）。
上記開示を要約すれば、本発明は自己凝集性蛋白質と
ハプテンとからなるユニークな蛋白質複合生成物を提供
するものであり、該生成物は凝集によりワクチンの製造
に適した多価の免疫原性物質を形成する。本発明の範囲
内におけるいろいろな部分的変更が可能である。
ハプテンとからなるユニークな蛋白質複合生成物を提供
するものであり、該生成物は凝集によりワクチンの製造
に適した多価の免疫原性物質を形成する。本発明の範囲
内におけるいろいろな部分的変更が可能である。
第１図はTMVコート蛋白質遺伝子に対するヌクレオチド
シーケンスを示す。 第２図はTMV5′およびTMV3′のヌクレオチドシーケンス
の生成過程を図式的に示したものである。 第３図は主な制限サイトをもったプラスミドpTMV−６を
示し、合成組換TMV遺伝子の構成が示されている。 第４図はプラスミドpTMV−ポリオ３を示し、ポリオ３エ
ピトープに対するアミノ酸シーケンスを詳しく画いてあ
る。 第５図はプラスミドpTMV−ポリオ１を示し、ポリオ１エ
ピトープに対するアミノ酸シーケンスを詳しく画いてあ
る。 第６図は、実施例４で得られたウエスタン・ブロツトの
結果における各ブロツトの位置を示した図であり、１は
ポジテイブコントロールとしてのTMVウイルスを、２はp
BR322プラスミドを有するE.coliを、３はpTMV−６プラ
スミドを有し、その誘発のあつたE.coliを、４はpTMV−
６プラスミドを有し、その誘発がなかつたE.coliをそれ
ぞれ試料としたものである。 第7A図及び第7B図は、実施例７で得られたウエスタン・
ブロツトの結果における各ブロツトの位置を示した図で
あり、１はポジテイブコントロールとしてのTMVウイル
スを、２はポジテイブコントロールとしてのポリオタイ
プIIIウイルスを、３はTMV−ポリオIIIプラスミドを有
し、その誘発のなかつたE.coliを、４はTMV−ポリオIII
プラスミドを有し、その誘発のあつたE.coliを、５はpT
MV−６プラスミドを有し、その誘発のなかつたE.coli
を、６はpTMV−６プラスミドを有し、その誘発のあつた
E.coliをそれぞれ試料としたものであり、また第7A図は
抗体として抗TMV抗体を用い、第7B図は抗体として抗ポ
リオタイプIII抗体を用いた場合である。 第８図はTMVコート蛋白質を含むクロマトグラフカラム
から流出した分画のSDS−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動の結果を示した図である。 第９図はTMV−ポリオ３複合蛋白質を含むクロマトグラ
フカラムから流出した分画のSDS−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動の結果を示した図である。 第10A図は、電子顕微鏡で観察した際の凝集TMVコートタ
ンパク質の形態を描いた図であり、第10B図は電子顕微
鏡で観察した際の凝集TMV−ポリオIIIの形態を描いた図
である。 第11A1図及び第11A2図は、電子顕微鏡で観察した際の凝
集ポリオIIIを抗タイプIII抗体で処理した後の状態を描
いた図であり、第11B1図及び第11B2図は、電子顕微鏡で
観察した際のTMV−ポリオIIIとTMV−ポリオＩとの凝結
物を抗タイプIII抗体で処理した後の状態を描いた図で
あり、第11C1図及び第11C2図は、電子顕微鏡で観察した
際の凝集TMV−ポリオＩを抗タイプIII抗体で処理した後
の状態を描いた図である。
シーケンスを示す。 第２図はTMV5′およびTMV3′のヌクレオチドシーケンス
の生成過程を図式的に示したものである。 第３図は主な制限サイトをもったプラスミドpTMV−６を
示し、合成組換TMV遺伝子の構成が示されている。 第４図はプラスミドpTMV−ポリオ３を示し、ポリオ３エ
ピトープに対するアミノ酸シーケンスを詳しく画いてあ
る。 第５図はプラスミドpTMV−ポリオ１を示し、ポリオ１エ
ピトープに対するアミノ酸シーケンスを詳しく画いてあ
る。 第６図は、実施例４で得られたウエスタン・ブロツトの
結果における各ブロツトの位置を示した図であり、１は
ポジテイブコントロールとしてのTMVウイルスを、２はp
BR322プラスミドを有するE.coliを、３はpTMV−６プラ
スミドを有し、その誘発のあつたE.coliを、４はpTMV−
６プラスミドを有し、その誘発がなかつたE.coliをそれ
ぞれ試料としたものである。 第7A図及び第7B図は、実施例７で得られたウエスタン・
ブロツトの結果における各ブロツトの位置を示した図で
あり、１はポジテイブコントロールとしてのTMVウイル
スを、２はポジテイブコントロールとしてのポリオタイ
プIIIウイルスを、３はTMV−ポリオIIIプラスミドを有
し、その誘発のなかつたE.coliを、４はTMV−ポリオIII
プラスミドを有し、その誘発のあつたE.coliを、５はpT
MV−６プラスミドを有し、その誘発のなかつたE.coli
を、６はpTMV−６プラスミドを有し、その誘発のあつた
E.coliをそれぞれ試料としたものであり、また第7A図は
抗体として抗TMV抗体を用い、第7B図は抗体として抗ポ
リオタイプIII抗体を用いた場合である。 第８図はTMVコート蛋白質を含むクロマトグラフカラム
から流出した分画のSDS−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動の結果を示した図である。 第９図はTMV−ポリオ３複合蛋白質を含むクロマトグラ
フカラムから流出した分画のSDS−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動の結果を示した図である。 第10A図は、電子顕微鏡で観察した際の凝集TMVコートタ
ンパク質の形態を描いた図であり、第10B図は電子顕微
鏡で観察した際の凝集TMV−ポリオIIIの形態を描いた図
である。 第11A1図及び第11A2図は、電子顕微鏡で観察した際の凝
集ポリオIIIを抗タイプIII抗体で処理した後の状態を描
いた図であり、第11B1図及び第11B2図は、電子顕微鏡で
観察した際のTMV−ポリオIIIとTMV−ポリオＩとの凝結
物を抗タイプIII抗体で処理した後の状態を描いた図で
あり、第11C1図及び第11C2図は、電子顕微鏡で観察した
際の凝集TMV−ポリオＩを抗タイプIII抗体で処理した後
の状態を描いた図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:92） Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:92） (72)発明者 ジヨエル アール．ヘインツ カナダ国 エル３ワイ ６テイー３ オ ンタリオ州 ニユーマーケツト ブリス トール ロード 458
Claims (7)
- 【請求項１】低分子量キャリアー蛋白質部分と、該キャ
リアー蛋白質部分に結合するハプテン部分とを有する接
合蛋白質であって、前記キャリアー蛋白質部分は自己凝
集により免疫原性を有する比較的高分子量の蛋白質物質
を形成し得るものであり、前記ハプテン部分は病原性疾
患の抗原エピトープを含むペプチドからなることを特徴
とする接合蛋白質。 - 【請求項２】低分子量キャリアー蛋白質部分と、該キャ
リアー蛋白質部分に結合するハプテン部分とを有する接
合蛋白質であって、前記キャリアー蛋白質部分は自己凝
集により免疫原性を有する比較的高分子量の蛋白質物質
を形成し得るものであり、前記ハプテン部分は病原性疾
患の抗原エピトープを含むペプチドからなる接合蛋白質
の複数を、前記キャリア−蛋白質を介して凝集させた粒
子であって、前記ハプテン部分が、身体免疫系による認
識が可能なように該粒子の表面に位置することを特徴と
する接合蛋白質凝集粒子。 - 【請求項３】複数のハプテン部分が同一の抗原エピトー
プを有する特許請求の範囲第２項に記載の接合蛋白質凝
集粒子。 - 【請求項４】複数のハプテン部分間に少なくとも２種の
異なる抗原エピトープが存在する特許請求の範囲第２項
に記載の接合蛋白質凝集粒子。 - 【請求項５】（ａ）低分子量キャリアー蛋白質部分と、
該キャリアー蛋白質部分に結合するハプテン部分とを有
する接合蛋白質であって、前記キャリアー蛋白質部分は
自己凝集により免疫原性を有する比較的高分子量の蛋白
質物質を形成し得るものであり、前記ハプテン部分は病
原性疾患の抗原エピトープを含むペプチドからなる接合
蛋白質をコードする合成遺伝子を有するプラスミドベク
ターを調製する過程と、 （ｂ）該プラスミドベクターを、前記合成遺伝子の発現
が可能な生体に導入する過程と、 （ｃ）該プラスミドベクターを有する生体を増殖させ、
前記合成遺伝子を発現させて前記接合蛋白質を生産する
過程と、 （ｄ）該生産された接合蛋白質を、その複数が該接合蛋
白質のキャリアー蛋白質部分を介して凝集した粒子であ
って、前記ハプテン部分が、身体免疫系による認識が可
能なように該粒子の表面に位置する接合蛋白質凝集粒子
として分離する過程と、 を有することを特徴とする接合蛋白質の形成方法。 - 【請求項６】接合蛋白質凝集粒子の分離過程が、生産さ
れた接合蛋白質を有する生体の溶解を、該接合蛋白質が
凝集し、かつ得られた接合蛋白質の凝集物の溶解生成物
からの分離が可能となる条件下で行う特許請求の範囲第
５項に記載の接合蛋白質の形成方法。 - 【請求項７】前記プラスミドベクターが、pTMV−ポリオ
ＩまたはpTMV−ポリオIIIである特許請求の範囲第５項
または第６項に記載の接合蛋白質の形成方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB8421282 | 1984-08-22 | ||
| GB848421282A GB8421282D0 (en) | 1984-08-22 | 1984-08-22 | Multispecific antigenic proteins |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61143327A JPS61143327A (ja) | 1986-07-01 |
| JP2528815B2 true JP2528815B2 (ja) | 1996-08-28 |
Family
ID=10565652
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60183149A Expired - Lifetime JP2528815B2 (ja) | 1984-08-22 | 1985-08-22 | 多効果免疫性蛋白質 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5972659A (ja) |
| EP (1) | EP0174759B1 (ja) |
| JP (1) | JP2528815B2 (ja) |
| AT (1) | ATE62254T1 (ja) |
| CA (1) | CA1340776C (ja) |
| DE (1) | DE3582380D1 (ja) |
| GB (1) | GB8421282D0 (ja) |
Families Citing this family (25)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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