KR102668726B1 - 기능성 뉴클레아제의 전달 시스템 - Google Patents
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Abstract
생체 내, 생체 외 또는 시험관 내에서의 세포에의 기능성 이펙터 단백질의 초하전 단백질-매개 전달을 위한 조성물, 방법, 전략, 키트 및 시스템이 제공된다. 양이온성 지질 및 양이온성 중합체를 사용한 기능성 이펙터 단백질의 전달을 위한 조성물, 방법, 전략, 키트 및 시스템도 제공된다. 기능성 이펙터 단백질에는 비제한적으로 전사 조절인자 (예컨대 억제인자 또는 활성화인자), 레콤비나제, 뉴클레아제 (예컨대 RNA-프로그램가능 뉴클레아제, 예컨대 Cas9 단백질; TALE 뉴클레아제 및 아연 핑거 뉴클레아제), 데아미나제, 및 기타 유전자 변형/편집 효소들이 포함된다. 기능성 이펙터 단백질에는 TALE 이펙터 단백질, 예컨대 TALE 전사 활성화인자 및 억제인자는 물론, TALE 뉴클레아제도 포함된다. 세포에의 기능성 이펙터 단백질의 전달을 위한 조성물, 방법, 전략 및 시스템은 비제한적으로 질환과 연관되어 있는 유전자의 표적화된 조작, 질환과 연관되어 있는 유전자의 발현 수준 조절, 및 세포 운명의 프로그래밍을 포함한 치료 및 연구 목적으로 유용하다.
Description
관련 출원
본 출원은 2014년 8월 18일자 U.S. 출원 U.S.S.N. 14/462,189호 및 2014년 8월 18일자 U.S. 출원 U.S.S.N. 14/462,163호에 대하여 35 U.S.C. § 365(c)하의 우선권을 주장하는 바이며, 또한 2013년 9월 6일자 U.S. 특허 가출원 U.S.S.N. 61/874,746호에 대하여 35 U.S.C. § 119(e)하의 우선권을 주장하는 바, 이들 각각은 본원에 참조로 포함된다.
포유동물 세포에의 거대분자 전달은 세포 조작을 위한 매력적인 접근법인데, 그것이 유전자 발현의 조절 및 게놈의 변형을 가능케 하게 되며, 이는 다시 연구를 위한 새로운 길을 열고 소형 분자에 의해서는 현재 "약물화불가능(undruggable)"인 것으로 보이는 분자의 치료 표적화를 가능케 하게 되기 때문이다. 특히, 질환과 연관되어 있는 유전자 또는 대립유전자를 표적으로 하는 재조합 뉴클레아제는 치료제로서 대단한 잠재력을 가지고 있다. 현재의 거대분자 전달 방법에는 핵산 분자의 바이러스 전달, 핵산 또는 단백질의 수용체-매개 전달, 그리고 단백질의 전달을 위한 TAT, Arg9 또는 페네트라틴과 같은 세포-침투 펩티드와의 단백질 융합의 사용이 포함된다. 이러한 전달 시스템 각각은 특정 적용분야에 잇점을 제공하나; 대부분의 경우, 효능, 세포독성 및 제조의 용이성과 관련한 문제들이 남아 있다. 상당한 세포독성 또는 다른 부정적인 부작용 없이 다양한 세포주에 거대분자 (예컨대 기능성 이펙터 단백질)를 효과적으로 전달할 수 있는 용이하게 제조되는 반응물은 상당한 관심사로 남아 있다.
대부분의 단백질은 자발적으로는 포유동물 세포에 진입하지 않으며, 그에 따라 당연히 연구 도구로서의 그의 사용 및 치료제로서의 그의 잠재력이 제한된다. 포유동물 세포에의 단백질의 전달을 위한 기술은 최근에는 세포내 표적에 대처하도록 개발되어 있다. 이러한 기술에는 지질-기재 반응물 (문헌 [Zelphati et al., J. Biol. Chem. 276, 35103-35110, 2001)], 나노입자 (문헌 [Hasadsri et al., J. Biol. Chem., 2009]), 원개형 리보뉴클레오단백질 입자 (문헌 [Lai et al., ACS Nano 3, 691-699, 2009]); 수용체 리간드에의 유전적 또는 화학적 융합 (문헌 [Gabel et al., J. Cell Biol. 103, 1817-1827, 1986]; [Rizk et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 11011-11015, 2009]); 및 세포-침투 펩티드에의 융합 (문헌 [Wadia et al., Curr. Protein Pept. Sci. 4, 97-104, 2003]; [Zhou et al., Cell Stem Cell 4, 381-384, 2009])의 사용이 포함된다. 아마도 가장 보편적인 단백질 전달 방법은 HIV-1 전사활성화인자인 전사 (Tat) 펩티드 및 폴리아르기닌 펩티드를 포함한 단백질 형질도입 도메인 (PTD)에 대한 유전적 융합일 것이다. 이러한 양이온성 PTD들은 외인성 단백질의 음으로 하전된 세포-표면 구조와의 결합 및 이후의 세포내이입을 촉진한다. Tat 및 폴리아르기닌 양자는 시험관 내 및 생체 내 모두에서 다양한 거대분자를 세포에 전달하는 데에 사용되어 왔다 (문헌 [Wadia et al., Curr. Protein Pept. Sci. 4, 97-104, 2003]; [Zhou et al., Cell Stem Cell 4, 381-384, 2009]; [Myou et al., J. Immunol. 169, 2670-2676, 2002]; [Bae et al., Clin. Exp. Immunol. 157, 128-138, 2009]; [Schwarze et al., Science 285, 1569-1572, 1999]). 이러한 진전에도 불구하고, 세포내 표적들은 외인성 단백질을 사용하여 영향을 주기가 어렵게 남아 있으며, 단백질이 기능성으로 세포에 전달되는 데에 있어서의 낮은 효율로 인하여, 약간의 성공조차도 각 형질도입 작용제의 독성인 농도를 필요로 할 수 있다 (문헌 [Zhou et al., Cell Stem Cell 4, 381-384, 2009]; [Wang et al., Nat. Biotechnol. 26, 901-908, 2008]). 따라서, 세포내 생체분자를 표적화하기 위하여 기능성인 이펙터 단백질을 세포에 진입시키는 더 우수한 전달 시스템에 대한 필요성이 남아 있다.
발명의 개요
본 개시는 초하전된 단백질(supercharged protein) (예컨대 양으로 하전된 초하전 단백질), 양이온성 중합체 또는 양이온성 지질을 사용하여 예를 들면 핵산에 결합하는 부위-특이적 단백질과 같은 기능성 이펙터 단백질을 세포에 전달하기 위한 신규 시스템, 조성물, 제제, 키트 및 관련 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 뉴클레아제는 TALE-뉴클레아제, RNA-프로그램가능 뉴클레아제 또는 조작된 RNA-프로그램가능 게놈-편집 효소 (예컨대 Cas9 및 그의 변이 또는 융합체), 또는 아연 핑거 뉴클레아제이다. 일부 실시양태에서, 전사 인자는 TALE 전사 활성화인자 또는 억제인자이다. 일부 실시양태에서, 이펙터 단백질은 레콤비나제이다. 본원에서 매우 상세하게 기술될 바와 같이, 기능성 이펙터 단백질 (예컨대 뉴클레아제, 전사 활성화인자/억제인자, 그의 변이 및 융합체를 포함한 Cas9 단백질 등)을 양으로 하전된 초하전 단백질과 융합 또는 회합시키는 것은 예를 들면 유전자 발현 또는 게놈 변형에 영향을 주기 위한 세포 내부로의 단백질의 전달을 가능케 한다. 기능성 이펙터 단백질을 음으로 하전된 초하전 단백질과 융합 또는 회합시키는 것은 단백질이 양이온성 지질 또는 양이온성 중합체와 회합하는 것을 가능케 함으로써 세포 내부로의 단백질의 강력한 전달을 제공한다는 것도 발견되었다. 또한, 자연상에서 음으로 하전되어 있는 기능성 이펙터 단백질 (예컨대 VP64 전사 활성화인자, 음이온성 3xFLAG 펩티드 태그 및 이들의 융합체) 또는 원래 음으로 하전되어 있는 핵산 (예컨대 가이드 RNA; "gRNA")과 결합하는 기능성 이펙터 단백질 (예컨대 Cas9 단백질, 및 그의 변이 및 융합체)은 (예컨대 초하전 단백질 부재시) 세포에의 전달을 위하여 양이온성 지질 또는 양이온성 중합체와 결합할 수 있다.
이펙터 단백질의 전달이 세포외 표적에 대해서는 효과적인 것으로 입증되어 있지만, 대부분 단백질의 포유동물 세포에 자발적으로 진입하는 능력의 부재로 인하여, 세포내 표적에 대처하기 위한 그의 사용에 대해서는 상대적으로 개발되어 있지 않다. 외인성 단백질이 세포내 표적에 접근하는 것을 가능케 하는 것은 가장 일반적으로는 화학적 형질감염, 전기천공 또는 바이러스 전달을 통한 그것을 코딩하고 있는 DNA의 전달에 의해 달성된다. 그러나, 세포에의 외인성 DNA의 도입은 게놈으로의 영구적 재조합, 내인성 유전자의 잠재적인 붕괴, 및 코딩되어 있는 작용제에 대한 장기간의 노출 가능성을 상승시킨다. 게놈 DNA의 1회 영구 변형을 수행하고자 하는 게놈 편집 적용분야를 포함한 일부 연구 또는 치료 적용분야의 경우, 비-복제가능 단백질 작용제의 기능성 전달은 향상된 안전성 및 더 광범위한 적용가능성을 제공할 수 있다. 또한, 지질 및 중합체와 같은 양이온성 화합물을 사용한 단백질의 전달이 남아 있는 기술적 과제를 가지고 있으며 많은 경우에서 세포 독성을 유도하는 반면, 놀랍게도 본원에서 제공되는 조성물 및 방법을 사용할 경우, 소정의 기능성 이펙터 단백질들 (예컨대 Cas9 단백질, 및 그의 변이 및 융합체, 레콤비나제, 전사 활성화인자/억제인자 등)이 독성이 없이도, 또는 최소한의 독성으로 세포에 전달될 수 있으며, 일부 경우에서는 상당한 효율의 향상 및 감소된 표적을 벗어난 효과로써 게놈 변형을 매개한다는 것이 발견되었다. 예를 들면, 실시예 7에 기술되어 있는 바와 같이, 양이온성 지질을 사용한 Cas9:gRNA 복합체의 전달은 매우 효율적이며 (단일 처리에서 배양되는 인간 세포의 80 %까지의 변형), 또한 플라스미드 형질감염에 비해 더 높은 게놈 변형 특이성을 유도함으로써 통상적으로 인간 세포에서 > 10-배 더 높은 표적 적중:표적을 벗어난(on-target:off-target) DNA 변형 비로 이어진다.
따라서, 일 측면에서는, 초하전된 단백질이 기능성 이펙터 단백질을 세포에 전달하는 데에 사용되는데, 예를 들면 뉴클레아제, 전사 활성화인자/억제인자, Cas9 단백질 (그의 융합체 및 변이 포함) 등이다. 일부 실시양태에서, 초하전 단백질은 상응하는 비변형 단백질에 비해 그의 전체적인 표면 전하에서 증가를 나타내도록 조작되어 있다. 다른 실시양태에서, 초하전 단백질은 상응하는 비변형 단백질에 비해 그의 전체적인 표면 전하에서 감소를 나타내도록 조작되어 있다. 다른 실시양태에서, 본 개시의 맥락에서 사용되는 초하전 단백질은 자연 발생 초하전 단백질이다. 초하전 단백질은 공유 또는 비-공유 상호작용을 통하여 전달될 단백질과 회합될 수 있다. 어떠한 특정 이론에도 얽매이고자 하는 것은 아니나, Cas9 단백질, 변이체, 또는 gRNA와 회합된 융합 단백질은 하전된 순수한 음성을 가져 양으로 하전된 초하전 단백질과의 회합이 촉진된다. 소정 실시양태에서, 초하전 단백질과 회합된 기능성 이펙터 단백질은 추가적으로 세포에의 전달에 적합한 조성물을 형성하기 위하여 양이온성 중합체 또는 양이온성 지질과 회합된다. 적합한 조작되거나 자연 발생인 초하전 단백질의 예는 2007년 12월 13일자 WO 2007/143574호로서 공개된 2007년 6월 1일자 국제 PCT 특허 출원 PCT/US07/70254호; 2009년 11월 5일자 WO 2009/134808호로서 공개된 2009년 4월 28일자 국제 PCT 출원 PCT/US09/041984호; 및 2010년 11월 11일자 WO 2010/129023호로서 공개된 2010년 4월 28일자 국제 PCT 출원 PCT/US10/001250호에 기술되어 있으며, 이들 각각의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다. 뉴클레아제를 세포로 전달하는 데에 사용하기 위한 초하전 단백질의 추가적인 예들은 본원에서 기술된다. 적합한 기능성 이펙터 단백질의 추가적인 예들, 예를 들면 뉴클레아제 및 RNA-프로그램가능 이펙터 단백질 예컨대 Cas9 단백질에 대해서는 발명의 명칭이 "Engineered Transcription Activator-Like Effector (TALE) Domains and Uses Thereof"인 2013년 8월 22일자 U.S. 특허 가출원 U.S.S.N. 61/868,846호, 발명의 명칭이 "Cas9 Variants and Uses Thereof"인 2013년 9월 6일자 U.S. 특허 가출원 U.S.S.N. 61/874,609호, 발명의 명칭이 "Switchable Cas9 Nucleases and Uses Thereof"인 2013년 9월 6일자 U.S. 특허 가출원 U.S.S.N. 61/874,682호, 발명의 명칭이 "Engineered Transcription Activator-Like Effector (TALE) Domains and Uses Thereof"인 2014년 6월 20일자 U.S. 정규 출원 U.S.S.N. 14/320,519호, 발명의 명칭이 "Cas9-FokI Fusion Proteins And Uses Thereof"인 2014년 6월 30일자 U.S. 정규 출원 U.S.S.N. 14/320,498호, 발명의 명칭이 "Cas9-Recombinase Fusion Proteins And Uses Thereof"인 2014년 6월 30일자 U.S. 정규 출원 U.S.S.N. 14/320,467호, 발명의 명칭이 "Switchable gRNAs Comprising Aptamers"인 2014년 7월 8일자 U.S. 정규 출원 U.S.S.N. 14/326,329호, 발명의 명칭이 "mRNA-Sensing Switchable gRNAs"인 2014년 7월 8일자 U.S. 정규 출원 U.S.S.N. 14/326,340호, 발명의 명칭이 "Extended DNA-Sensing gRNAs"인 2014년 7월 8일자 U.S. 정규 출원 U.S.S.N. 14/326,361호, 발명의 명칭이 "Fusions Of Cas9 Domains And Nucleic Acid-Editing Domains"인 2014년 7월 8일자 U.S. 정규 출원 U.S.S.N. 14/325,815호, 발명의 명칭이 "Methods For Nucleic Acid Editing"인 2014년 7월 8일자 U.S. 정규 출원 U.S.S.N. 14/326,109호, 발명의 명칭이 "Methods For Correcting PI3K Point Mutations"인 2014년 7월 8일자 U.S. 정규 출원 U.S.S.N. 14/326,140호, 발명의 명칭이 "Methods For Correcting Presenilin Point Mutations"인 2014년 7월 9일자 U.S. 정규 출원 U.S.S.N. 14/326,269호, 발명의 명칭이 "Methods For Correcting α-Antitrypsin Point Mutations"인 2014년 7월 8일자 U.S. 정규 출원 U.S.S.N. 14/326,290호, 발명의 명칭이 "Methods For Correcting Von Willebrand Factor Point Mutations"인 2014년 7월 8일자 U.S. 정규 출원 U.S.S.N. 14/326,318호, 발명의 명칭이 "Methods For Correcting Caspase-9 Point Mutations"인 2014년 7월 8일자 U.S. 정규 출원 U.S.S.N. 14/326,303호 및 발명의 명칭이 "Cas9 Proteins Including Ligand-Dependent Inteins"인 U.S. 가출원 U.S.S.N. 62/030,943호에 기술되어 있으며, 이들 각각의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
일부 실시양태에서, 조작되거나 자연 발생인 초하전 단백질은 양으로 하전된다. 예를 들면 양이온성 지질 및/또는 양이온성 중합체를 사용한 특정 이펙터 단백질의 전달과 연관되어 있는 다른 실시양태에서, 초하전 단백질은 음으로 하전된다. 소정 실시양태에서, 초양(superpositively) 또는 초음으로(supernegatively) 하전된 단백질은 이펙터 단백질과 비공유로 회합된다. 대안적으로, 초양 또는 초음으로 하전된 단백질은 이펙터 단백질에 공유로 결합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이펙터 단백질은 초하전 단백질에 융합된다. 소정 질시양태에서, 생성되는 융합 단백질은 초하전 단백질과 이펙터 단백질 사이에 링커, 예컨대 절단가능 링커를 포함한다.
본 개시의 일부 측면은 기능성 이펙터 단백질 (예컨대 뉴클레아제, 전사 활성화인자/억제인자, 레콤비나제, 그의 변이 및 융합체를 포함한 Cas9 단백질 등)과 회합되어 있는 초하전 단백질을 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 또한 양이온성 지질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 또한 양이온성 중합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 또한 완충제 또는 부형제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 초하전 단백질은 그의 상응하는 비변형 단백질에 비해 더 크며 세포에의 전달 및 침투에 충분한 양으로써 그를 위해 형성되는 전체 양전하를 가진다. 예를 들면 양이온성 지질 및/또는 양이온성 중합체를 사용한 특정 이펙터 단백질의 전달과 연관되어 있는 다른 실시양태에서, 초하전 단백질은 그의 상응하는 비변형 단백질에 비해 더 큰 전체 음전하를 가진다. 일부 실시양태에서, 기능성 이펙터 단백질은 부위-특이적 효소, 예컨대 뉴클레아제, Cas9 단백질, 레콤비나제 등이다. 일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 야생형 Cas9 단백질, Cas9 니카제이거나, 또는 뉴클레아제 불활성화 (dCas9) 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 dCas9를 포함하는 융합 단백질이다. 일부 실시양태에서, 상기 융합 단백질은 전사 활성화인자 (예컨대 VP64), 전사 억제인자 (예컨대 KRAB, SID), 뉴클레아제 도메인 (예컨대 FokI), 레콤비나제 도메인 (예컨대 Hin, Gin 또는 Tn3), 데아미나제 (예컨대 시티딘 데아미나제 또는 아데노신 데아미나제) 또는 후성 변형인자 도메인 (예컨대 TET1)을 포함한다. 뉴클레아제와 연관되어 있는 일부 실시양태에서, 뉴클레아제는 TALE 뉴클레아제, Cas9 뉴클레아제, Cas9 니카제 또는 아연 핑거 뉴클레아제이다. 일부 실시양태에서, 뉴클레아제는 핵산 서열에 특이적으로 결합하여 그것을 절단한다. 일부 실시양태에서, 표적으로 하는 핵산 서열은 치료 표적인 유전자, 예를 들면 질환의 치료에서 불활성화하는 것이 바람직한 유전자의 서열이다. 일부 실시양태에서, 표적으로 하는 핵산 서열은 PRDM16, PPARγ, VEGF-A, Oct-4, PI3K, 프레세닐린, α-안티트립신, 폰 빌레브란트 인자 또는 카스파제-9 유전자 서열이다.
일부 실시양태에서, 기능성 이펙터 단백질은 전사 인자이다. 일부 실시양태에서, 기능성 이펙터 단백질은 TALE 전사 활성화인자 또는 억제인자이다. 일부 실시양태에서, 전사 인자, 전사 활성화인자 또는 전사 억제인자는 유전자에 특이적으로 결합하여 그것을 활성화하거나 억제한다. 일부 실시양태에서, 상기 유전자는 치료 표적이다. 일부 실시양태에서, 기능성 이펙터 단백질은 TALE 이펙터이다. 일부 실시양태에서, 초하전 단백질은 기능성 이펙터 단백질에 공유로 결합됨으로써 융합 단백질을 형성한다. 일부 실시양태에서, 초하전 단백질은 링커를 통하여 기능성 이펙터 단백질과 회합된다. 일부 실시양태에서, 링커는 절단가능 링커이다. 일부 실시양태에서, 링커는 UV-절단가능 링커, 또는 리소좀 효소에 의해 절단되는 링커이다. 일부 실시양태에서, 초하전 단백질은 비공유로 기능성 이펙터 단백질과 회합됨으로써 복합체를 형성한다. 일부 실시양태에서, 초하전 단백질은 전체적 순수 양전하를 가진다. 다른 실시양태에서, 초하전 단백질은 전체적 순수 음전하를 가지며, 단백질(들)은 양이온성 지질과 회합된다. 다른 실시양태에서, 초하전 단백질은 전체적 순수 음전하를 가지며, 단백질(들)은 양이온성 중합체와 회합된다. 일부 실시양태에서는, 상기 전체적인 순수 양전하가 약 +5 내지 약 +40 사이이거나, 또는 상기 전체적인 순수 음전하가 약 -5 내지 약 -50 사이이다. 일부 실시양태에서, 초하전 단백질은 생리학적 pH에서 그의 상응하는 비변형 단백질에 비해 더 양으로 하전되거나, 또는 더 음으로 하전된다. 일부 실시양태에서, 상기 상응하는 비변형 단백질은 자연 발생 단백질이다. 일부 실시양태에서, 초하전 단백질은 생리학적 pH에서 그의 상응하는 비변형 단백질에 비해 적어도 +5 더 양으로 하전되거나, 또는 적어도 -5 더 음으로 하전된다. 일부 실시양태에서, 초하전 단백질은 형광 단백질이다. 일부 실시양태에서, 초하전 단백질은 녹색 형광 단백질 (GFP)이다. 일부 실시양태에서, 초하전 단백질은 초양 하전된 GFP이다. 일부 실시양태에서, 초하전 단백질은 하기 서열의 20개 이상 연속되는 아미노산 잔기를 포함하는 초양 하전된 GFP (+36 GFP)이다:
일부 실시양태에서, 초하전 단백질은 서열 1에 제시되어 있는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 초하전 단백질은 서열 1에 제시되어 있는 아미노산 서열로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 조성물은 제약 조성물이다. 일부 실시양태에서, 조성물은 제약상 허용되는 부형제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 대상체에 대한 투여용으로 제제화되며, 대상체의 하나 이상 세포에 대한 전달에 효과적인 양으로 초하전 단백질 및 기능성 이펙터 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 대상체에의 투여 후 측정가능한 치료 효과를 유도하기에 효과적인 양으로 초하전 단백질 및 기능성 이펙터 단백질을 포함한다.
본 개시의 일부 측면은 gRNA 및 양이온성 지질과 회합된 Cas9 단백질을 포함하는 조성물을 제공한다. 놀랍게도, Cas9 단백질이 gRNA와 회합되는 경우, 복합체가 양이온성 지질에 의해 캡슐화되어 효과적으로 세포에 전달될 수 있다는 것이 발견되었다. 이는 초하전 단백질을 사용하여, 또는 그것 없이 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 음으로 초하전된 단백질 (예컨대 초음 하전된 GFP) 및 양이온성 지질과 회합된 Cas9 단백질을 포함하는데, 이것 역시 세포에의 성공적인 전달을 제공한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 세포 군집에 전달되었을 때 낮은 독성을 나타내는데, 예를 들면 이 경우 세포 중 60 % 이상, 65 % 이상, 70 % 이상, 75 % 이상, 80 % 이상, 85 % 이상, 90 % 이상, 95 % 이상 또는 99 % 이상이 조성물의 투여 후 생존가능하다. 일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 야생형 Cas9 단백질, Cas9 니카제이거나, 또는 뉴클레아제 불활성화 (dCas9) 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 dCas9를 포함하는 융합 단백질이다. 일부 실시양태에서, 상기 융합 단백질은 전사 활성화인자 (예컨대 VP64), 전사 억제인자 (예컨대 KRAB, SID), 뉴클레아제 도메인 (예컨대 FokI), 레콤비나제 도메인 (예컨대 Hin, Gin 또는 Tn3), 데아미나제 (예컨대 시티딘 데아미나제 또는 아데노신 데아미나제) 또는 후성 변형인자 도메인 (예컨대 TET1)을 포함한다.
본 개시의 다른 측면은 gRNA 및 양이온성 중합체와 회합된 Cas9 단백질을 포함하는 조성물을 제공한다. 양이온성 지질에서와 마찬가지로, Cas9 단백질이 gRNA와 회합되는 경우, 복합체는 양이온성 중합체와 회합할 수 있으며, 효과적으로 세포에 전달될 수 있다. 이는 초하전 단백질을 사용하여, 또는 그것 없이 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 음으로 초하전된 단백질 (예컨대 초음 하전된 GFP) 및 양이온성 중합체와 회합된 Cas9 단백질을 포함하는데, 이것 역시 세포에의 성공적인 전달을 제공한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 세포 군집에 전달되었을 때 낮은 독성을 나타내는데, 예를 들면 이 경우 세포 중 60 % 이상, 65 % 이상, 70 % 이상, 75 % 이상, 80 % 이상, 85 % 이상, 90 % 이상, 95 % 이상 또는 99 % 이상이 조성물의 투여 후 생존가능하다. 일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 야생형 Cas9 단백질, Cas9 니카제이거나, 또는 뉴클레아제 불활성화 (dCas9) 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 dCas9를 포함하는 융합 단백질이다. 일부 실시양태에서, 상기 융합 단백질은 전사 활성화인자 (예컨대 VP64), 전사 억제인자 (예컨대 KRAB, SID), 뉴클레아제 도메인 (예컨대 FokI), 레콤비나제 도메인 (예컨대 Hin, Gin 또는 Tn3), 데아미나제 (예컨대 시티딘 데아미나제 또는 아데노신 데아미나제) 또는 후성 변형인자 도메인 (예컨대 LSD1, TET1)을 포함한다.
본 개시의 일부 측면은 대상체에 대한 본원에서 제공되는 조성물의 투여 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 본원에서 기술되는 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 대상체는 질환, 장애 또는 병태에 감수성이거나, 그에 걸려 있거나 또는 그의 1종 이상의 증상을 나타내고 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 투여의 결과로서 1종 이상의 징후 또는 증상이 개선되기에 충분한 양으로, 그리고 그에 적합한 조건하에서 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 투여 단계는 기능성 이펙터 단백질이 대상체의 세포에 침투하기에 충분한 조건하에서 수행된다. 일부 실시양태에서, 상기 질환, 장애 또는 이상은 mRNA, 단백질 또는 이들의 조합의 비정상적으로 상승된 농도와 연관된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 게놈 서열, 예를 들면 정상 또는 병원성 대립유전자; 질환에 대한 감수성, 또는 그의 발병 또는 진행과 연관되어 있는 유전자; 병원성 RNA 또는 단백질을 코딩하고 있는 유전자; 또는 질환 세포 또는 조직에서 비정상적으로 높은 농도로 발현되는 RNA 또는 단백질을 코딩하고 있는 유전자에 특이적으로 결합하여 절단하는 뉴클레아제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 투여 단계는 경구, 정맥내, 근육내, 동맥내, 피하, 심실내, 국소, 흡입 및 점막 전달로 이루어진 군에서 선택되는 투여 경로를 포함한다.
본 개시의 일부 측면은 세포에의 기능성 이펙터 단백질의 도입 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 기능성 이펙터 단백질이 세포에 진입하기에 적합한 조건하에서 세포를 본원에서 기술되는 바와 같이 초하전 단백질 및 기능성 이펙터 단백질을 포함하는 조성물과 접촉시킴으로써, 세포에 기능성 이펙터 단백질을 도입하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 Cas9 단백질이 세포에 진입하기에 적합한 조건하에서 세포를 Cas9 단백질, 및 양이온성 지질 및/또는 양이온성 중합체를 포함하는 조성물과 접촉시킴으로써, 세포에 Cas9 단백질을 도입하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 세포의 핵에 진입하는데, 예를 들면 Cas9 단백질은 단백질에 핵 국재화 신호 (NLS)를 포함하는 것에 의해 핵으로 유도된다. 일부 실시양태에서, 방법은 기능성 이펙터 단백질 (예컨대 Cas9 포함)이 세포에 침투하였음을 확인하는 것을 추가적으로 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포는 대상체 내에 존재하며, 접촉시키는 것은 생체 내에서 수행된다. 일부 실시양태에서, 대상체는 유전자의 비정상적인 발현 수준과 연관되어 있는 질환에 걸려 있거나, 그것을 발병할 위험성이 있는 것으로 진단되며, 이 경우 기능성 이펙터 단백질 (예컨대 Cas9 포함)은 유전자의 발현 수준을 조절한다. 일부 실시양태에서, 방법은 유전자 발현 수준의 변화를 검출하는 것, 또는 대상체에서의 치료 반응을 검출하는 것을 추가적으로 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포는 체세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 원하는 세포 운명으로의 세포의 프로그래밍을 유도하기에 충분한 양으로, 시간 동안, 그리고 조건하에서 조성물 또는 제약 조성물과 접촉된다. 일부 실시양태에서, 방법은 세포 대체 치료 접근법에서 프로그래밍된 세포를 사용하는 것을 추가적으로 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포는 질환과 연관되어 있는 게놈 대립유전자를 보유하는 세포이며, 기능성 이펙터 단백질은 상기 대립유전자를 특이적 표적으로 한다. 일부 실시양태에서, 세포는 생체 외에서 접촉되며, 기능성 이펙터 단백질에 의한 원치 않는 대립유전자의 성공적인 표적화 후 대상체에 재-투여된다.
본 개시의 일부 측면은 본원에서 기술되는 바와 같은 조성물, 예를 들면 기능성 이펙터 단백질과 회합된 초하전 단백질을 포함하는 조성물을 포함하는 키트를 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 키트는 Cas9 단백질 및 초하전 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 키트는 Cas9 단백질 및 양이온성 지질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 키트는 Cas9 단백질 및 양이온성 중합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키트는 추가적으로 키트에 포함되어 있는 구성요소들을 사용하기 위한 지침을 포함한다.
본 발명의 이러한 측면들, 및 기타 측면 및 실시양태들은 물론, 다양한 장점 및 효용들은 본 발명의 도면 및 상세한 설명과 관련하여 더 드러나게 될 것이다.
정의
본원 및 청구범위에 사용된 바와 같은, 단수 형태는 문맥상 달리 명백하게 표시하지 않는 한은 단수 및 복수의 언급 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "작용제"에 대한 언급은 단일 작용제 및 복수 개의 상기 작용제를 포함한다.
2개 이상 잔기 (예컨대 단백질 또는 단백질 도메인)의 맥락에서 본원에서 사용될 때의 "~와 회합된"이라는 용어는 잔기들이 직접적으로, 또는 연결 작용제로 기능하는 하나 이상의 추가적인 잔기를 통하여 서로 물리적으로 회합되거나 연결됨으로써, 충분히 안정해서 예컨대 생리학적 조건하에 구조가 사용되는 조건하에서 잔기들이 물리적으로 회합되어 유지되는 구조를 형성한다는 사실을 지칭한다. 초하전 단백질은 비-공유 상호작용 (예컨대 정전기적 상호작용)을 통하여 기능성 이펙터 단백질 (예컨대 뉴클레아제, 전사 활성화인자/억제인자, 레콤비나제, 그의 변이 및 융합체를 포함한 Cas9 단백질 등)과 결합될 수 있다. 소정 실시양태에서, 초하전 단백질은 정전기적 상호작용을 통하여 기능성 이펙터 단백질과 회합됨으로써, 복합체를 형성할 수 있다. 일부 실시양태에서는, 충분한 수의 더 약한 상호작용이 다양한 상이한 조건들하에서 잔기들이 물리적으로 회합되어 유지되기에 충분한 안정성을 제공할 수 있다. 소정 실시양태에서, 초하전 단백질은 공유 결합 (예컨대 아미드 결합)을 통하여 기능성 이펙터 단백질과 회합된다. 일부 실시양태에서, 기능성 이펙터 단백질은 펩티드 결합에 의해 직접, 또는 링커를 통하여 간접적으로 초하전 단백질과 회합된다.
"Cas9" 또는 "Cas9 뉴클레아제"라는 용어는 Cas9 단백질 또는 그의 단편 (예컨대 Cas9의 활성이거나 불활성인 DNA 절단 도메인, 또는 부분적으로 불활성인 DNA 절단 도메인 (예컨대 Cas9 "니카제"), 및/또는 Cas9의 gRNA 결합 도메인을 포함하는 단백질)을 포함하는 RNA-가이드 뉴클레아제를 지칭한다. 일부 실시양태에서, "Cas9"라는 용어는 Cas9 또는 그의 단편을 포함하는 융합 단백질을 지칭한다.
일부 실시양태에서, Cas9는 하기로부터의 Cas9를 지칭한다: 코리네박테리움 울세란스(Corynebacterium ulcerans) (NCBI 참조번호: NC_015683.1, NC_017317.1); 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheria) (NCBI 참조번호: NC_016782.1, NC_016786.1); 스피로플라스마 시르피디콜라(Spiroplasma syrphidicola) (NCBI 참조번호: NC_021284.1); 프레보텔라 인테르메디아(Prevotella intermedia) (NCBI 참조번호: NC_017861.1); 스피로플라스마 타이와네세(Spiroplasma taiwanense) (NCBI 참조번호: NC_021846.1); 스트렙토코쿠스 이니아에(Streptococcus iniae) (NCBI 참조번호: NC_021314.1); 벨리엘라 발티카(Belliella baltica) (NCBI 참조번호: NC_018010.1); 싸이크로플렉수스 토르퀴스I(Psychroflexus torquisI) (NCBI 참조번호: NC_018721.1); 스트렙토코쿠스 서모필루스(Streptococcus thermophilus) (NCBI 참조번호: YP_820832.1); 리스테리아 이노큐아(Listeria innocua) (NCBI 참조번호: NP_472073.1); 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni) (NCBI 참조번호: YP_002344900.1); 또는 네이쎄리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis) (NCBI 참조번호: YP_002342100.1).
"양이온성 지질"이라는 용어는 생리학적 pH에서 양이온성이거나 양인 전하를 가지는 지질을 지칭한다. 양이온성 지질은 비제한적으로 리포솜 또는 미포를 포함한 다양한 형태를 취할 수 있다. 본 개시의 소정 측면에 유용한 양이온성 지질에 대해서는 관련 기술분야에 알려져 있는데, 일반적으로 극성 및 비-극성 도메인 모두를 포함하며, 폴리음이온, 예컨대 핵산 분자 또는 음으로 초하전된 단백질에 결합하고, 통상적으로 세포에의 핵산의 전달을 촉진하는 것으로 알려져 있다. 유용한 양이온성 지질의 예에는 폴리에틸렌이민, 폴리아미도아민 (PAMAM) 성화 수지상체, 리포펙틴 (DOTMA와 DOPE의 조합), 리포펙타제, 리포펙타민(LIPOFECTAMINE)® (예컨대 리포펙타민® 2000, 리포펙타민® 3000, 리포펙타민® RNAiMAX, 리포펙타민® LTX), 세인트-레드(SAINT-RED) (시노볼룩스 세라퓨틱스(Synvolux Therapeutics) 사, 네덜란드 그로닝겐 소재), DOPE, 시토펙틴 (길레드 사이언시즈(Gilead Sciences) 사, 캘리포니아 포스터 시티 소재), 및 유펙틴 (JBL 사, 캘리포니아 산 루이스 오비스포 소재)가 포함된다. 대표적인 양이온성 리포솜은 N-[1-(2,3-디올레올옥시)-프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드 (DOTMA), N-[1-(2,3-디올레올옥시)-프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 메틸술페이트 (DOTAP), 3β-[N-(N',N'-디메틸아미노에탄)카르바모일]콜레스테롤 (DC-Chol), 2,3-디올레일옥시-N-[2(스페르민카르복스아미도)에틸]-N,N-디메틸-1-프로판아미늄 트리플루오로아세테이트 (DOSPA), 1,2-디미리스틸옥시프로필-3-디메틸-히드록시에틸 암모늄 브로마이드; 및 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드 (DDAB)으로부터 제조될 수 있다. 양이온성 지질은 관련 기술분야에서 세포에 핵산 분자를 전달하는 데에 사용되어 왔다 (예컨대 U.S. 특허 제5,855,910호; 5,851,548호; 5,830,430호; 5,780,053호; 5,767,099호; 8,569,256호; 8,691,750호; 8,748,667호; 8,758,810호; 8,759,104호; 8,771,728호; 문헌 [Lewis et al. 1996. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:3176]; [Hope et al. 1998. Molecular Membrane Biology 15:1] 참조). 또한, 다른 지질 조성물들 역시 관련 기술분야에 알려져 있는데, 예를 들면 U.S. 특허 제4,235,871호; U.S. 특허 제4,501,728호; 4,837,028호; 4,737,323호에 교시되어 있는 것들이 포함된다.
본원에서 사용될 때, "양이온성 중합체"라는 용어는 순수 양전하를 가지는 중합체를 지칭한다. 양이온성 중합체에 대해서는 관련 기술분야에 잘 알려져 있으며, 문헌 [Samal et al., Cationic polymers and their therapeutic potential. Chem Soc Rev. 2012 Nov 7;41(21):7147-94]; 공개된 U.S. 특허 출원 U.S. 2014/0141487 A1호, U.S. 2014/0141094 A1호, U.S. 2014/0044793 A1호, U.S. 2014/0018404 A1호, U.S. 2014/0005269 A호 및 U.S. 2013/0344117 A호; 그리고 U.S. 특허 제8,709,466호; 8,728,526호; 8,759,103호; 및 8,790,664호에 기술되어 있는 것들이 포함되는데, 각각의 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다. 대표적인 양이온성 중합체에는 비제한적으로 폴리알릴아민 (PAH); 폴리에틸렌이민 (PEI); 폴리(L-리신) (PLL); 폴리(L-아르기닌) (PLA); 폴리비닐아민 단일- 또는 공중합체; 폴리(비닐벤질-트리-C1-C4-알킬암모늄염); 지방족 또는 방향지방족 디할로겐화물 및 지방족 N,N,N',N'-테트라-C1-C4-알킬-알킬렌디아민의 중합체; 폴리(비닐피리딘) 또는 폴리(비닐피리디늄염); 폴리(N,N-디알릴-N,N-디-C1-C4-알킬-암모늄할로겐화물); 4차화된 디-C1-C4-알킬-아미노에틸 아크릴레이트 또는 메타크릴레이트의 단일- 또는 공중합체; 폴리쿠아드(POLYQUAD)™; 폴리아미노아미드 등이 포함된다.
"데아미나제"라는 용어는 탈아미노화 반응을 촉매하는 효소를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 시티딘 또는 데옥시시티딘의 각각 우라실 또는 데옥시우라실로의 가수분해성 탈아미노화를 촉매하는 시티딘 데아미나제이다.
본원에서 사용될 때, "유효량"이라는 용어는 원하는 생물학적 반응을 도출하기에 충분한 생물학적 활성 작용제의 양을 지칭한다. 예를 들어 일부 실시양태에서, 기능성 이펙터 단백질 (예컨대 뉴클레아제, 전사 활성화인자/억제인자, 레콤비나제, 그의 변이 및 융합체를 포함한 Cas9 단백질 등)의 유효량은 검출가능한 효과 (예컨대 표적 부위의 절단, 표적 부위의 변형, 유전자 발현의 조절 등)를 유도하기에 충분한 단백질의 양을 지칭할 수 있다. 그와 같은 효과는 적합한 검정, 예컨대 무-세포 검정으로, 또는 표적 세포, 조직 또는 대상 생물체 내에서 검출될 수 있다. 통상의 기술자라면 알고 있을 바와 같이, 작용제, 예컨대 기능성 이펙터 단백질의 유효량은 예를 들면 원하는 생물학적 반응, 표적으로 할 특정 대립유전자, 표적으로 하는 게놈, 표적 부위, 세포 또는 조직, 및 사용되는 초하전 단백질과 같은 다양한 인자들에 따라 달라질 수 있다.
"이펙터 단백질"이라는 용어는 세포에 도입되었을 때 세포의 생물학적 기능, 예를 들면 세포에서의 핵산 분자의 변형 (예컨대 절단, 탈아미노화, 재조합 등) 또는 세포에서의 유전자의 발현 또는 발현 수준의 조절 (예컨대 증가시키거나 감소시킴)을 조절하는 단백질을 지칭한다.
본원에서 사용될 때의 "조작된"이라는 용어는 인간에 의해 설계, 생성, 제조, 합성 및/또는 제작된 단백질 분자, 복합체, 물질 또는 실체를 지칭한다. 따라서, 조작된 생성물은 자연에서는 발생하지 않는 생성물이다. 일부 실시양태에서, 조작된 단백질 또는 조성물, 예컨대 뉴클레아제, Cas9 단백질 (그의 변이 및 융합체 포함)과 같은 기능성 이펙터 단백질과 회합된 조작된 초하전 단백질은 특정 요건을 충족하도록, 또는 특정의 원하는 특징을 가지도록, 예를 들면 구체적인 순수 전하를 가지도록, 해당 표적 서열에 특이적으로 결합하고/거나 그것을 절단하거나 변형시키도록, 구체적인 최소 또는 최대 절단 또는 효소 활성을 가지도록, 및/또는 구체적인 안정성을 가지도록 설계된 초하전 단백질이다.
본원에서 사용될 때, "후성 변형인자"라는 용어는 DNA, 예를 들면 염색체 DNA의 후성 변형을 초래하는 효소 활성을 가지는 단백질 또는 그의 촉매 도메인을 지칭한다. 후성 변형에는 DNA 메틸화 및 탈메틸화; 메틸화 및 탈메틸화 (예컨대 모노-, 디- 및 트리-메틸화), 히스톤 아세틸화 및 탈아세틸화는 물론, 히스톤 유비퀴틸화, 인산화 및 수모일화를 포함한 히스톤 변형이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
"기능성 단백질"이라는 용어는 그것이 특징으로 하고 있는 특성 및/또는 활성을 그것이 나타내는 형태로 존재하는 단백질을 지칭한다.
"융합 단백질"이라는 용어는 다수의 이종유래 단백질, 단백질 도메인 또는 펩티드를 포함하는 단백질, 예를 들면 펩티드 연결을 통하여 서로 회합됨으로써 단일 아미노산 서열을 형성하는 초하전 단백질과 기능성 이펙터 단백질을 지칭한다. 소정 실시양태에서, 융합 단백질은 하나의 유전자에 의해 코딩된다.
"유전자"라는 용어는 관련 기술분야에서 이해되고 있는 바와 같은 그의 의미를 가진다. 통상의 기술자라면, "유전자"라는 용어에 유전자 조절 서열 (예컨대 프로모터, 인핸서 등) 및/또는 인트론 서열이 포함될 수 있다는 것을 알고 있을 것이다. 단백질을 코딩하지 않는 대신 RNAi 작용제, 리보자임, tRNA 등과 같은 기능성 RNA 분자를 코딩하는 핵산에 대한 언급이 유전자의 정의에 포함된다는 것 또한 알고 있을 것이다. 명료성을 위하여, 본 출원에서 사용될 때, "유전자"라는 용어는 일반적으로는 단백질을 코딩하는 핵산의 부분을 지칭하며; 임의적으로는 문맥상 통상의 기술자에게 드러나게 될 바와 같이, 조절 서열을 포괄할 수 있다는 것에 유의해야 한다. 이와 같은 정의가 비-단백질-코딩 발현 단위에 대한 "유전자"라는 용어의 적용을 배제하고자 하는 것은 아니며, 그보다는 대부분의 경우에서 본 문서에서 사용될 때의 상기 용어가 단백질-코딩 핵산을 지칭한다는 것을 분명히 하고자 하는 것이다.
"단리된"이라는 용어는 (1) 처음에 생성되었을 때 (자연상인지 실험 환경에서인지에 관계없이) 그것이 회합되어 있던 성분들 중 일부 이상으로부터 분리되고/거나 (2) 인간에 의해 생성, 제조, 합성 및/또는 제작된 분자, 복합체, 물질 또는 실체를 지칭한다. 단리된 물질 및/또는 실체는 그것이 처음에 회합되어 있던 다른 성분들 중 적어도 약 10 %, 약 20 %, 약 30 %, 약 40 %, 약 50 %, 약 60 %, 약 70 %, 약 80 %, 약 90 % 또는 그 이상으로부터 분리될 수 있다. 일부 실시양태에서, 단리된 작용제는 약 80 % 초과, 약 85 %, 약 90 %, 약 91 %, 약 92 %, 약 93 %, 약 94 %, 약 95 %, 약 96 %, 약 97 %, 약 98 %, 약 99 % 또는 약 99 % 초과로 순수하다. 본원에서 사용될 때, 물질은 거기에 다른 성분이 실질적으로 없는 경우에 "순수"하다.
본원에서 사용될 때, "링커"라는 용어는 2개의 분자 또는 잔기, 예컨대 초하전 단백질과 뉴클레아제를 연결하는 화학 기 또는 분자를 지칭한다. 통상적으로, 링커는 2개의 기, 분자 또는 다른 잔기들 사이에 위치하거나, 그들에 의해 측접되며, 공유 결합을 통하여 각각의 것에 연결됨으로써 양자를 연결한다. 일부 실시양태에서, 링커는 아미노산 또는 다수의 아미노산들 (예컨대 펩티드 또는 단백질)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 유기 분자, 기, 중합체 또는 화학 잔기이다. 일부 실시양태에서, 링커는 절단가능 링커로써, 예를 들면 링커는 UV 광 또는 가수분해 효소, 예컨대 리소좀 프로테아제와 같은 절단 활성에의 노출시 절단될 수 있는 결합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 15개 이상, 20개 이상, 25개 이상, 30개 이상, 40개 이상, 50개 이상, 또는 그 이상의 아미노산을 가지는 임의의 아미노산 연장체이다. 일부 실시양태에서, 펩티드 링커는 예를 들면 서열 (GGS)n을 포함하는 트리-펩티드 Gly-Gly-Ser의 반복체를 포함하며, 여기서 n은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상의 반복체를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 링커는 서열 (GGS)6 (서열 2)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드 링커는 16개 잔기의 "XTEN" 링커 또는 그의 변이이다 (예컨대 문헌 [Schellenberger et al. A recombinant polypeptide extends the in vivo half-life of peptides and proteins in a tunable manner. Nat. Biotechnol. 27, 1186-1190 (2009)] 참조). 일부 실시양태에서, 상기 XTEN 링커는 서열 SGSETPGTSESATPES (서열 3), SGSETPGTSESA (서열 4) 또는 SGSETPGTSESATPEGGSGGS (서열 5)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드 링커는 VPFLLEPDNINGKTC (서열 6), GSAGSAAGSGEF (서열 7), SIVAQLSRPDPA (서열 8), MKIIEQLPSA (서열 9), VRHKLKRVGS (서열 10), GHGTGSTGSGSS (서열 11), MSRPDPA (서열 12); 또는 GGSM (서열 13)에서 선택되는 1종 이상이다.
본원에서 사용될 때, "뉴클레아제"라는 용어는 핵산 분자에서 뉴클레오티드 잔기들을 연결하는 포스포디에스테르 결합을 절단할 수 있는 작용제, 예를 들면 단백질 또는 소형 분자를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 뉴클레아제는 단백질, 예를 들면 핵산 분자에 결합하여 핵산 분자 내에서 뉴클레오티드 잔기들을 연결하는 포스포디에스테르 결합을 절단할 수 있는 효소이다. 뉴클레아제는 폴리뉴클레오티드 사슬 내의 포스포디에스테르 결합을 절단하는 엔도뉴클레아제, 또는 폴리뉴클레오티드 사슬 말단에서 포스포디에스테르 결합을 절단하는 엑소뉴클레아제일 수 있다. 일부 실시양태에서, 뉴클레아제는 본원에서 "인식 서열", "뉴클레아제 표적 부위" 또는 "표적 부위"로도 지칭되는 특정 뉴클레오티드 서열 내의 특정 포스포디에스테르 결합에 결합하고/거나 그것을 절단하는 부위-특이적 뉴클레아제이다. 일부 실시양태에서, 뉴클레아제는 단일 가닥의 표적 부위를 인식하는 반면, 다른 실시양태에서는 뉴클레아제가 이중-가닥의 표적 부위, 예를 들면 이중-가닥 DNA 표적 부위를 인식한다. 많은 자연 발생 뉴클레아제, 예를 들면 많은 자연 발생 DNA 제한 뉴클레아제의 표적 부위에 대해서는 통상의 기술자에게 잘 알려져 있다. 많은 경우에서, EcoRI, HindIII 또는 BamHI와 같은 DNA 뉴클레아제는 길이 4 내지 10개 염기쌍의 팔린드롬인(palindromic) 이중-가닥 DNA 표적 부위를 인식하여, 표적 부위 내의 특정 위치에서 2개의 DNA 가닥 각각을 절단한다. 일부 엔도뉴클레아제는 이중-가닥 핵산 표적 부위를 대칭으로 절단하는데, 다시 말하자면 양 가닥을 동일한 위치에서 절단함으로써, 말단이 본원에서 둔단(blunt end)으로도 지칭되는 염기-쌍을 이룬 뉴클레오티드들을 포함한다. 다른 엔도뉴클레아제는 이중-가닥 핵산 표적 부위를 비대칭으로 절단하는데, 다시 말하자면 각 가닥을 상이한 위치에서 절단함으로써, 말단이 쌍을 이루지 않은 뉴클레오티드들을 포함한다. 이중-가닥 DNA 분자의 말단에서 쌍을 이루지 않은 뉴클레오티드들은 "오버행(overhang)", 예를 들면 쌍을 이루지 않은 뉴클레오티드(들)가 각 DNA 가닥의 5' 말단을 형성하는지 또는 3' 말단을 형성하는지에 따라 "5'-오버행" 또는 "3'-오버행"으로도 지칭된다. 쌍을 이루지 않은 뉴클레오티드(들)로 종결되는 이중-가닥 DNA 분자 말단은 점착단(sticky end)으로도 지칭되는데, 그것이 상보성인 쌍을 이루지 않은 뉴클레오티드(들)를 포함하는 다른 이중-가닥 DNA 분자 말단에 "점착될" 수 있기 때문이다. 뉴클레아제 단백질은 통상적으로 단백질의 핵산 기질과의 상호작용을 매개하는 "결합 도메인", 및 핵산 백본 내 포스포디에스테르 결합의 절단을 촉매하는 "절단 도메인"을 포함한다. 일부 실시양태에서, 뉴클레아제 단백질은 단량체 형태로 핵산 분자에 결합하여 그것을 절단할 수 있는 반면, 다른 실시양태에서, 뉴클레아제 단백질은 표적 핵산 분자를 절단하기 위해서는 이량체화 또는 다량체화되어야 한다. 자연 발생 뉴클레아제의 결합 도메인 및 절단 도메인은 물론, 조합되어 특정 표적 부위에 결합하는 뉴클레아제를 생성시킬 수 있는 모듈형 결합 도메인 및 절단 도메인에 대해서는 통상의 기술자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, 전사 활성화인자 유사 요소는 원하는 표적 부위에 특이적으로 결합하는 결합 도메인으로 사용될 수 있으므로, 원하는 표적 부위를 절단하는 조작된 뉴클레아제를 생성시키기 위하여 절단 도메인, 예를 들면 FokI의 절단 도메인에 융합 또는 접합된다.
본원에서 호환가능하게 사용될 때의 "핵산"이라는 용어 및 "핵산 분자"라는 용어는 뉴클레오시드, 뉴클레오티드, 또는 뉴클레오티드의 중합체를 포함하는 화합물을 지칭한다. 통상적으로, 중합체성 핵산, 예를 들면 3개 이상의 뉴틀레오티드를 포함하는 핵산 분자는 인접 뉴클레오티드들이 포스포디에스테르 연결을 통하여 서로 연결되어 있는 선형 분자이다. 일부 실시양태에서는, "핵산"이 개별 핵산 잔기 (예컨대 뉴클레오티드 및/또는 뉴클레오시드)를 지칭한다. 일부 실시양태에서, "핵산"은 3개 이상의 개별 뉴클레오티드 잔기들을 포함하는 올리고뉴클레오티드 사슬을 지칭한다. 본원에서 사용될 때, "올리고뉴클레오티드" 및 "폴리뉴클레오티드"라는 용어는 뉴클레오티드의 중합체 (예컨대 3개 이상 뉴클레오티드들의 줄)를 지칭하는 데에 호환가능하게 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, "핵산"은 RNA는 물론, 단일 및/또는 이중-가닥 DNA를 포괄한다. 핵산은 예를 들면 게놈, 전사체, mRNA, tRNA, rRNA, siRNA, snRNA, 플라스미드, 코스미드, 염색체, 크로마티드의 맥락에서 자연 발생이거나, 또는 다른 자연 발생 핵산 분자일 수 있다. 반면, 핵산 분자는 비-자연 발생 분자, 예컨대 재조합 DNA 또는 RNA, 인공 염색체, 조작된 게놈, 또는 그의 단편, 또는 합성 DNA, RNA, DNA/RNA 혼성체이거나, 또는 비-자연 발생 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드를 포함할 수 있다. 또한, "핵산", "DNA", "RNA"라는 용어 및/또는 유사 용어에는 핵산 유사체, 즉 포스포디에스테르 백본이 아닌 다른 것을 가지는 유사체가 포함된다. 핵산은 자연 공급원으로부터 정제되거나, 재조합 발현 시스템을 사용하여 생성된 후 임의적으로 정제되거나, 화학적으로 합성되는 등일 수 있다. 경우에 따라, 예를 들면 화학적으로 합성되는 분자의 경우, 핵산은 화학적으로 변형된 염기 또는 당, 및 백본 변형을 가지는 유사체와 같은 뉴클레오시드 유사체를 포함할 수 있다. 핵산 서열은 다르게 표시되지 않는 한 5'에서 3' 방향으로 제시된다. 일부 실시양태에서, 핵산은 자연 뉴클레오시드 (예컨대 아데노신, 티미딘, 구아노신, 시티딘, 우리딘, 데옥시아데노신, 데옥시티미딘, 데옥시구아노신 및 데옥시시티딘); 뉴클레오시드 유사체 (예컨대 2-아미노아데노신, 2-티오티미딘, 이노신, 피롤로-피리미딘, 3-메틸 아데노신, 5-메틸시티딘, 2-아미노아데노신, C5-브로모우리딘, C5-플루오로우리딘, C5-요오도우리딘, C5-프로피닐-우리딘, C5-프로피닐-시티딘, C5-메틸시티딘, 2-아미노아데노신, 7-데아자아데노신, 7-데아자구아노신, 8-옥소아데노신, 8-옥소구아노신, O(6)-메틸구아닌 및 2-티오시티딘); 화학적으로 변형된 염기; 생물학적으로 변형된 염기 (예컨대 메틸화된 염기); 중격된(intercalated) 염기; 변형된 당 (예컨대 2'-플루오로리보스, 리보스, 2'-데옥시리보스, 아라비노스 및 헥소스); 변형된 포스페이트 기 (예컨대 포스포로티오에이트 및 5'-N-포스포르아미다이트 연결)이거나, 이들을 포함한다.
본원에서 사용될 때, "제약 조성물"이라는 용어는 예를 들면 질환 또는 장애의 치료 맥락에서 대상체에게 투여될 수 있는 조성물을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 활성 성분, 예컨대 기능성 이펙터 단백질 예컨대 뉴클레아제와 회합된 초하전 단백질, 또는 초하전 단백질과 기능성 이펙터 단백질을 예를 들면 융합 단백질의 형태로 코딩하고 있는 핵산, 그리고 제약상 허용되는 부형제를 포함한다.
본원에서 사용될 때의 "생리학적 pH"라는 용어는 정상적인 비-병리학적 세포 또는 대상체에서 발견되는 pH 값을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 생리학적 pH는 pH 5-8 사이이다. 일부 실시양태에서, 생리학적 pH는 pH 7-7.5, 예를 들면 pH 7.0, pH 7.1, pH 7.2, pH 7.3, pH 7.4 또는 pH 7.5이다. 일부 실시양태에서, 생리학적 pH는 pH 6.5-7.5이다. 일부 실시양태에서, 생리학적 pH는 pH 5, pH 5.5, pH 6, pH 6.5, pH 7, pH 7.5 또는 pH 8이다.
"예방" 또는 "예방하다"라는 용어는 대상체가 질환, 장애 또는 이상을 발병하게 될 가능성의 감소 (예방이 없는 가능성과 비교하였을 때), 및/또는 이미 확립된 장애의 추가적인 진행의 억제를 초래하는, 질환, 장애 또는 이상을 발병할 위험성이 있는 (예를 들면 대조 대상체 또는 대조 대상체 군과 비교하였을 때 상승된 위험성이 있거나, 또는 연령-일치 및/또는 성-일치 대상체의 평균 위험성과 비교하였을 때 상승된 위험성이 있는) 대상체의 예방적 치료를 지칭한다.
본원에서 사용될 때, "증식성 질환"이라는 용어는 세포 또는 세포 군집이 비정상적으로 상승된 증식 속도를 나타낸다는 점에서 세포 또는 조직 항상성이 교란되는 임의의 질환을 지칭한다. 증식성 질환에는 과증식성 질환, 예컨대 전신생물성 과다형성 상태 및 신생물성 질환이 포함된다. 신생물성 질환은 세포의 비정상적인 증식을 특징으로 하며, 양성 및 악성 신생물 모두가 포함된다. 악성 신생물은 암으로도 지칭된다.
"단백질"이라는 용어는 본원에서 "펩티드" 및 "폴리펩티드"라는 용어와 호환가능하게 사용되며, 펩티드 (아미드) 결합에 의해 서로 연결된 아미노산 잔기들의 중합체를 지칭한다. 상기 용어는 모든 크기, 구조 또는 기능의 단백질, 펩티드 또는 폴리펩티드를 지칭한다. 통상적으로, 단백질, 펩티드 또는 폴리펩티드는 3개 이상 아미노산의 길이가 되게 된다. 단백질, 펩티드 또는 폴리펩티드는 개별 단백질 또는 단백질들의 모음을 지칭할 수도 있다. 단백질, 펩티드 또는 폴리펩티드의 아미노산들 중 하나 이상은 예를 들면 탄수화물 기, 히드록실 기, 포스페이트 기, 파르네실 기, 이소파르네실 기, 지방산 기, 접합용 링커와 같은 화학적 존재의 첨가에 의해, 관능화 또는 기타 변형 등에 의해, 변형될 수 있다. 단백질, 펩티드 또는 폴리펩티드는 또한 단일 분자일 수 있거나, 또는 다중-분자 복합체일 수 있다. 단백질, 펩티드 또는 폴리펩티드는 단순하게 자연 발생 단백질 또는 펩티드의 단편일 수 있다. 단백질, 펩티드 또는 폴리펩티드는 자연 발생, 재조합 또는 합성, 또는 이들의 임의 조합일 수 있다. 단백질은 상이한 도메인들을 포함할 수 있는데, 예를 들어 TALE 이펙터 단백질은 핵산 결합 도메인 및 이펙터 도메인, 예컨대 핵산 절단 도메인 또는 전사 활성화인자 또는 억제인자 도메인을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 단백질은 단백질성인 부분, 예컨대 핵산 결합 도메인을 구성하는 아미노산 서열, 및 유기 화합물, 예컨대 핵산 절단 작용제로서 작용할 수 있는 화합물을 포함한다.
"RNA-프로그램가능 뉴클레아제" 및 "RNA-가이드 뉴클레아제"라는 용어는 본원에서 호환가능하게 사용되며, 절단용 표적이 아닌 1종 이상의 RNA 분자와 복합체를 형성하는 (예컨대 거기에 결합하거나 그와 회합되는) 뉴클레아제를 지칭한다. 일부 실시양태에서, RNA와의 복합체일 때, RNA-프로그램가능 뉴클레아제는 뉴클레아제:RNA 복합체로 지칭될 수 있다. RNA-프로그램가능 뉴클레아제에는 Cas9가 포함된다. 통상적으로, 결합되는 RNA(들)는 가이드 RNA (gRNA)로 지칭된다. gRNA는 2개 이상 RNA의 복합체 또는 단일 RNA 분자로서 존재할 수 있다. "gRNA"가 단일 분자 또는 2개 이상 분자의 복합체 중 어느 하나로서 존재하는 가이드 RNA를 지칭하는 데에 호환가능하게 사용되기는 하지만, 단일 RNA 분자로서 존재하는 gRNA는 단일-가이드 RNA (sgRNA)로 지칭될 수도 있다. 통상적으로, 단일 RNA 종으로 존재하는 gRNA는 하기 2개의 도메인을 포함한다: (1) 표적 핵산에 대한 상동성을 공유하는 (그리고 예컨대 표적에 대한 Cas9 복합체의 결합을 지시함) 도메인; 및 (2) Cas9 단백질에 결합하는 도메인. gRNA는 표적 부위에 상보성인 뉴클레오티드 서열을 포함하는데, 이는 상기 표적 부위에 대한 뉴클레아제/RNA 복합체의 결합을 매개하여 뉴클레아제:RNA 복합체의 서열 특이성을 제공한다.
본원에서 사용될 때, "레콤비나제"라는 용어는 레콤비나제 인식 서열들 사이의 DNA 단편의 삭제, 통합, 역위 또는 교환 (예컨대 전좌)으로 이어지는 레콤비나제 인식 서열들 사이의 DNA의 재조합을 매개하는 부위-특이적 효소를 지칭한다. 레콤비나제는 하기 2종의 구별되는 계열로 분류될 수 있다: 세린 레콤비나제 (예컨대 리솔바제 및 인버타제) 및 티로신 레콤비나제 (예컨대 인테그라제). 세린 레콤비나제의 예에는 비제한적으로 Hin, Gin, Tn3, β-six, CinH, ParA, γδ, Bxb1, φC31, TP901, TG1, φBT1, R4, φRV1, φFC1, MR11, A118, U153 및 gp29가 포함된다. 티로신 레콤비나제의 예에는 비제한적으로 Cre, FLP, R, 람다, HK101, HK022 및 pSAM2가 포함된다. 세린 및 티로신 레콤비나제 명칭은 레콤비나제가 DNA를 공격하는 데에 사용하며 가닥 교환시 DNA에 공유 결합되는 보존된 친핵성 아미노산 잔기에서 유래한다. 레콤비나제는 유전자 녹아웃/녹-인(knockout/knock-in)의 생성 및 유전자 치료법 적용분야를 포함한 수많은 적용분야를 가진다. 예컨대 각각의 전체 내용이 전체적으로 의거 참조로 포함되는 문헌 [Brown et al., "Serine recombinases as tools for genome engineering." Methods. 2011; 53(4):372-9]; [Hirano et al., "Site-specific recombinases as tools for heterologous gene integration." Appl. Microbiol. Biotechnol. 2011; 92(2):227-39]; [Chavez and Calos, "Therapeutic applications of the φC31 integrase system." Curr. Gene Ther. 2011;11(5):375-81]; [Turan and Bode, "Site-specific recombinases: from tag-and-target- to tag-and-exchange-based genomic modifications." FASEB J. 2011; 25(12):4088-107]; [Venken and Bellen, "Genome-wide manipulations of Drosophila melanogaster with transposons, Flp recombinase, and φC31 integrase." Methods Mol. Biol. 2012; 859:203-28]; [Murphy, "Phage recombinases and their applications." Adv. Virus Res. 2012; 83:367-414]; [Zhang et al., "Conditional gene manipulation: Cre-ating a new biological era." J. Zhejiang Univ. Sci. B. 2012; 13(7):511-24]; [Karpenshif and Bernstein, "From yeast to mammals: recent advances in genetic control of homologous recombination." DNA Repair (Amst). 2012; 1; 11(10):781-8]을 참조하라. 본원에서 제공되는 레콤비나제들이 본 발명의 실시양태에서 사용될 수 있는 레콤비나제의 배타적인 예임을 의미하는 것은 아니다. 본 발명의 방법 및 조성물은 새로운 직교 레콤비나제(orthogonal recombinase)에 대하여 데이터베이스를 탐색하는 것, 또는 정해진 DNA 특이성을 가지는 합성 레콤비나제를 설계하는 것에 의해 확장될 수 있다 (예컨대 각각의 전체 내용이 전체적으로 의거 참조로 포함되는 문헌 [Groth et al., "Phage integrases: biology and applications." J. Mol. Biol. 2004; 335, 667-678]; [Gordley et al., "Synthesis of programmable integrases." Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 2009; 106, 5053-5058] 참조). 본원에서 기술되는 방법 및 조성물에 유용한 레콤비나제의 다른 예에 대해서는 통상의 기술자에게 알려져 있으며, 발견되거나 생성되는 어떠한 새로운 레콤비나제도 본 발명의 여러 실시양태에서 사용될 수 있을 것으로 예상된다. 일부 실시양태에서, 레콤비나제 (또는 그의 촉매 도메인)는 Cas9 단백질 (예컨대 dCas9)에 융합된다.
핵산 변형 (예컨대 게놈 변형) 맥락에서의 "재조합하다" 또는 "재조합"이라는 용어는 2개 이상의 핵산 분자, 또는 단일 핵산 분자의 2개 이상의 영역이 레콤비나제 단백질의 작용에 의해 변형되는 과정을 지칭하는 데에 사용된다. 재조합은 특히 예컨대 하나 이상 핵산 분자들 내 또는 사이에서의 핵산 서열의 삽입, 역위, 삭제 또는 전좌를 초래할 수 있다.
본원에서 사용될 때, "대상체"라는 용어는 개별 생물체를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 대상체는 임의의 발생 단계에 있는 어느 한쪽 성의 인간이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 비-인간 포유동물이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 비-인간 영장류이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 설치류이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 실험실 동물, 예를 들면 마우스, 래트, 게르빌루스 쥐, 기니 피그, 어류, 개구리 또는 파리이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 농장 동물, 예를 들면 양, 염소, 돼지 또는 소이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 반려 동물, 예를 들면 고양이 또는 개이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 척추동물, 양서류, 파충류, 어류, 곤충, 파리 또는 선충이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 유전적으로 조작된 것, 예컨대 유전적으로 조작된 비-인간 대상체이다.
"초하전시키다"라는 용어는 단백질의 전체적인 순수 전하의 증가 또는 감소를 초래하는 임의의 단백질 변형을 지칭한다. 변형에는 아미노산 서열의 변경 또는 하전된 잔기 (예컨대 카르복실산 기, 포스페이트 기, 술페이트 기, 아미노 기)의 첨가가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 초하전시키는 것은 또한 작용제 단독에 비해 증가되거나 감소된 전하를 가지는 복합체를 형성시키기 위한, 자연 발생이거나 변형된 하전된 단백질과의 작용제의 결합을 지칭한다.
뉴클레아제 및 전사 활성화인자 또는 억제인자와 같이 핵산 분자에 결합하는 기능성 이펙터 단백질의 맥락에서 본원에서 사용될 때의 "표적 부위"라는 용어는 이펙터 단백질에 의해 결합되거나 거기에 작용하는, 예를 들면 뉴클레아제에 의해 절단되거나 전사 활성화인자 또는 억제인자에 의해 각각 전사 활성화되거나 억제되는 핵산 분자 내의 서열을 지칭한다. 표적 부위는 단일-가닥이거나 이중-가닥일 수 있다. RNA-가이드 (예컨대 RNA-프로그램가능) 뉴클레아제 (예컨대 Cas9)의 맥락에서, 표적 부위는 통상적으로 RNA-프로그램가능 뉴클레아제의 gRNA에 대하여 상보성인 뉴클레오티드 서열, 및 gRNA-상보성 서열에 인접한 3' 말단의 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)를 포함한다. RNA-가이드 뉴클레아제 Cas9 (또는 gRNA 결합 활성을 포함하여 가지는 변이 또는 융합체)의 경우, 표적 부위는 일부 실시양태에서 20개 염기쌍 더하기 3 염기쌍의 PAM (예컨대 NNN으로서, 여기서 N은 임의의 뉴클레오티드를 표시함)일 수 있다. 통상적으로, PAM의 첫 번째 뉴클레오티드는 임의의 뉴클레오티드일 수 있는 반면, 2개의 하류 뉴클레오티드는 구체적인 RNA-가이드 뉴클레아제에 따라 특정된다. Cas9와 같은 RNA-가이드 뉴클레아제의 대표적인 표적 부위에 대해서는 통상의 기술자에게 알려져 있으며, 비제한적으로 NNG, NGN, NAG 및 NGG가 포함되는데, 여기서 N은 임의의 뉴클레오티드를 표시한다. 또한, 여러 종들 (예컨대 에스. 파이오제네스(S. pyogenes)를 대신하는 에스. 서모필루스(S. thermophilus))로부터의 Cas9 뉴클레아제들이 서열 NGGNG를 포함하는 PAM을 인식한다. 추가적인 PAM 서열들에 대해서는 알려져 있으며, 비제한적으로 NNAGAAW 및 NAAR가 포함된다 (예컨대 그 전체 내용이 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Esvelt and Wang, Molecular Systems Biology, 9:641 (2013)] 참조). 예를 들면, Cas9와 같은 RNA-가이드 뉴클레아제의 표적 부위는 구조 [NZ]-[PAM]을 포함할 수 있는데, 여기서 각 N은 독립적으로 임의의 뉴클레오티드이며, Z는 양단포함 1 내지 50 사이의 정수이다. 일부 실시양태에서, Z는 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 6 이상, 7 이상, 8 이상, 9 이상, 10 이상, 11 이상, 12 이상, 13 이상, 14 이상, 15 이상, 16 이상, 17 이상, 18 이상, 19 이상, 20 이상, 25 이상, 30 이상, 35 이상, 40 이상, 45 이상, 또는 50 이상이다. 일부 실시양태에서, Z는 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50이다. 일부 실시양태에서, Z는 20이다. 일부 실시양태에서, "표적 부위"는 뉴클레아제에 의해 결합되기는 하지만 절단되지는 않는 핵산 분자 내의 서열을 지칭할 수도 있다. 예를 들어, 본원에서 기술되는 소정 실시양태는 불활성인 (또는 불활성화된) Cas9 DNA 절단 도메인을 포함하는 단백질을 제공한다. 그와 같은 단백질은 (예컨대 Cas9 RNA 결합 도메인도 포함하는 경우) gRNA에 의해 특정되는 표적 부위에 결합할 수는 있으나, DNA 절단 부위가 불활성화되어 있기 때문에, 그 단백질에 의해 표적 부위가 절단되지는 않는다. 그러나, 본원에서 기술되는 바와 같은 그와 같은 단백질은 통상적으로 핵산 분자의 변형을 매개하는 또 다른 단백질 (예컨대 뉴클레아제, 전사 활성화인자, 레콤비나제, 데아미나제 등) 또는 분자에 의해 접합, 융합 또는 결합된다. 일부 실시양태에서, 실제로 절단되는 서열은 핵산 분자의 절단을 매개하는 단백질 (예컨대 뉴클레아제) 또는 분자에 따라 달라지게 되며, 일부 경우에는 예를 들면 불활성화된 Cas9 단백질(들)이 결합되는 근접성 또는 거리와 관련되게 된다. 이량체화되는 뉴클레아제, 예를 들면 불활성 Cas9 (또는 Cas9 RNA 결합 도메인) 및 DNA 절단 도메인 (예컨대 FokI 절단 도메인 또는 활성인 Cas9 절단 도메인)을 포함하는 단백질의 이량체의 맥락에서, 표적 부위는 통상적으로 좌측-절반 부위 (일 단백질에 의해 결합됨), 우측-절반 부위 (두 번째 단백질에 의해 결합됨) 및 절단이 이루어지는 절반 부위들 사이의 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서는, 좌측-절반 부위 또는 우측-절반 부위 중 어느 하나 (스페이서 서열이 아님)가 절단된다. 이와 같은 구조 ([좌측-절반 부위]-[스페이서 서열]-[우측-절반 부위])는 본원에서 LSR 구조로 지칭된다. 일부 실시양태에서, 좌측-절반 부위 및/또는 우측-절반 부위는 RNA-가이드되는 표적 부위 (예컨대 Cas9 표적 부위)에 해당한다. 일부 실시양태에서는, 절반-부위들 중 어느 하나 또는 모두가 예컨대 Cas9가 표적으로 하는 통상적인 영역에 비해 더 짧거나 더 긴데, 예를 들면 20개 뉴클레오티드보다 더 짧거나 더 길다. 일부 실시양태에서, 좌측 및 우측 절반 부위는 상이한 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적 부위는 3개의 (3) RNA-가이드 뉴클레아제 표적 부위 서열, 예를 들면 첫 번째와 두 번째, 그리고 두 번째와 세 번째 Cas9 표적 부위 서열들이 스페이서 서열에 의해 분리되어 있는 Cas9 표적 부위 서열에 해당하는 3개의 서열을 포함하는 서열이다. 일부 실시양태에서, 스페이서 서열은 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 11개 이상, 12개 이상, 13개 이상, 14개 이상, 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 25개 이상, 30개 이상, 35개 이상, 40개 이상, 45개 이상, 50개 이상, 60개 이상, 70개 이상, 80개 이상, 90개 이상, 100개 이상, 125개 이상, 150개 이상, 175개 이상, 200개 이상, 또는 250개 이상 bp의 길이이다.
"전사 활성화인자" 및 "전사 억제인자"라는 용어는 표적 핵산 서열에 결합하여 각각 표적 핵산 서열과 연관되어 있는 유전자 생성물 발현 수준의 증가 또는 감소를 야기하는 단백질 (예컨대 전사 인자 또는 그의 단편)과 같은 작용제를 지칭한다. 예를 들어, 표적 핵산 서열이 유전자의 조절 영역 내에 위치되어 있는 경우, 전사 활성화인자는 유전자에 의해 코딩되는 유전자 생성물 발현 수준의 증가를 야기한다 (반대로, 전사 억제인자는 유전자에 의해 코딩되는 유전자 생성물 발현 수준의 감소를 야기함). 상기 유전자 생성물은 유전자로부터 전사되는 RNA (예컨대 mRNA), 또는 유전자로부터 전사된 mRNA로부터 번역되는 폴리펩티드일 수 있다. 통상적으로, mRNA 농도의 증가 또는 감소는 그로부터 번역되는 폴리펩티드 농도의 감소 증가로 이어진다. 발현 수준은 mRNA 또는 단백질을 측정하기 위한 표준 기술을 사용하여 측정될 수 있다.
본원에서 사용될 때의 "전사 활성화인자-유사 이펙터" (TALE)라는 용어는 고도로 가변적인 2개-아미노산 모티프 (반복 가변 2잔기, RVD)를 포함하는 고도로 보존된 33-34개의 아미노산 서열을 함유하는 DNA 결합 도메인을 포함하는 이펙터 단백질을 지칭한다. RVD 모티프는 핵산 서열에 대한 결합 특이성을 결정하는데, 원하는 DNA 서열에 특이적으로 결합하도록 통상의 기술자에게 잘 알려져 있는 방법에 따라 조작될 수 있다 (예컨대 각각의 전체 내용이 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Miller, Jeffrey; et.al. (February 2011). "A TALE nuclease architecture for efficient genome editing". Nature Biotechnology 29 (2): 143-8]; [Zhang, Feng; et.al. (February 2011). "Efficient construction of sequence-specific TAL effectors for modulating mammalian transcription". Nature Biotechnology 29 (2): 149-53]; [Geiβler, R.; Scholze, H.; Hahn, S.; Streubel, J.; Bonas, U.; Behrens, S.E.; Boch, J. (2011), Shiu, Shin-Han. ed. "Transcriptional Activators of Human Genes with Programmable DNA-Specificity". PLoS ONE 6 (5): e19509]; [Boch, Jens (February 2011). "TALEs of genome targeting". Nature Biotechnology 29 (2): 135-6]; [Boch, Jens; et.al. (December 2009). "Breaking the Code of DNA Binding Specificity of TAL-Type III Effectors". Science 326 (5959): 1509-12]; 및 [Moscou, Matthew J.; Adam J. Bogdanove (December 2009). "A Simple Cipher Governs DNA Recognition by TAL Effectors". Science 326 (5959): 1501] 참조). 아미노산 서열과 DNA 인식 사이의 단순한 관계는 적절한 RVD를 포함하는 반복 분절들의 조합을 선택하는 것에 의한 특정 DNA 결합 도메인의 조작을 가능케 하였다. TALE 이펙터 단백질에는 비제한적으로 TALE 뉴클레아제 (TALEN) 및 TALE 전사 활성화인자 및 억제인자가 포함된다.
본원에서 사용될 때의 "전사 활성화인자-유사 요소 뉴클레아제" (TALEN)라는 용어는 전사 활성화인자 유사 이펙터인 DNA 결합 도메인 내지 DNA 절단 도메인, 예를 들면 FokI 도메인을 포함하는 인공적인 뉴클레아제를 지칭한다. 조작된 TALE 구성체를 생성시키기 위한 수많은 모듈형 조립체 구성들이 보고되어 있다 (각각이 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Zhang, Feng; et.al. (February 2011). "Efficient construction of sequence-specific TAL effectors for modulating mammalian transcription". Nature Biotechnology 29 (2): 149-53]; [Geiβler, R.; Scholze, H.; Hahn, S.; Streubel, J.; Bonas, U.; Behrens, S.E.; Boch, J. (2011), Shiu, Shin-Han. ed. "Transcriptional Activators of Human Genes with Programmable DNA-Specificity". PLoS ONE 6 (5): e19509]; [Cermak, T.; Doyle, E.L.; Christian, M.; Wang, L.; Zhang, Y.; Schmidt, C.; Baller, J.A.; Somia, N.V. et al. (2011). "Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting". Nucleic Acids Research]; [Morbitzer, R.; Elsaesser, J.; Hausner, J.; Lahaye, T. (2011). "Assembly of custom TALE-type DNA binding domains by modular cloning". Nucleic Acids Research]; [Li, T.; Huang, S.; Zhao, X.; Wright, D.A.; Carpenter, S.; Spalding, M.H.; Weeks, D.P.; Yang, B. (2011). "Modularly assembled designer TAL effector nucleases for targeted gene knockout and gene replacement in eukaryotes". Nucleic Acids Research.]; [Weber, E.; Gruetzner, R.; Werner, S.; Engler, C; Marillonnet, S. (2011). Bendahmane, Mohammed, ed. "Assembly of Designer TAL Effectors by Golden Gate Cloning". PLoS ONE 6 (5): e19722]).
"전사 억제인자"라는 용어는 표적 핵산 서열에 결합하여 표적 핵산 서열과 연관되어 있는 유전자 생성물 발현 수준의 감소를 야기하는 전사 인자, 예컨대 단백질을 지칭한다. 예를 들어, 표적 핵산 서열이 유전자의 조절 영역 내에 위치되어 있는 경우, 전사 억제인자는 유전자에 의해 코딩되는 유전자 생성물 발현 수준의 감소를 야기한다. 상기 유전자 생성물은 유전자로부터 전사되는 RNA (예컨대 mRNA), 또는 유전자로부터 전사된 mRNA로부터 번역되는 폴리펩티드일 수 있다. 통상적으로, mRNA 농도의 감소는 그로부터 번역되는 폴리펩티드 농도의 감소로 이어진다. 발현 수준은 mRNA 또는 단백질을 측정하기 위한 표준 기술을 사용하여 측정될 수 있다.
본원에서 사용될 때, "아연 핑거 뉴클레아제"라는 용어는 아연 핑거 어레이(zinc finger array)를 포함하는 결합 도메인에 접합된 핵산 절단 도메인을 포함하는 뉴클레아제를 지칭한다. 일 실시양태에서, 상기 절단 도메인은 유형 II 제한 엔도뉴클레아제 FokI의 절단 도메인이다. 아연 핑거 뉴클레아제는 절단을 위하여 주어진 핵산 분자 내의 사실상 모든 원하는 서열을 표적으로 하도록 설계될 수 있으며, 복잡한 게놈의 맥락에서 고유 부위에 결합하는 아연 핑거 결합 도메인을 설계할 가능성은 살아 있는 세포에서의 단일 게놈 부위의 표적화된 절단을 가능케 함으로써, 예를 들면 치료상 가치가 있는 표적화된 게놈 변경을 달성한다. 원하는 게놈 좌위로 이중-가닥 파단을 표적화하는 것은 비-동종유래 DNA 복구 경로의 오류-빈발 특성을 이용하여 유전자의 코딩 서열에 프레임-쉬프트 돌연변이를 도입하는 데에 사용될 수 있다. 아연 핑거 뉴클레아제는 통상의 기술자에게 잘 알려져 있는 방법에 의해 해당 부위를 표적으로 하도록 생성될 수 있다. 예를 들면, 원하는 특이성을 가지는 아연 핑거 결합 도메인은 알려져 있는 특이성을 가지는 개별 아연 핑거 모티프들을 조합하는 것에 의해 설계될 수 있다. DNA에 결합된 아연 핑거 단백질 Zif268의 구조가 이 분야의 많은 연구에서 알려졌는데, 64개의 가능한 염기쌍 삼중체 각각에 대하여 아연 핑거를 수득한 다음, 임의의 원하는 서열 특이성을 가지는 단백질을 설계하기 위하여 이러한 모듈형 아연 핑거들을 혼합하고 맞추어보는 개념이 기술되어 있다 (전체 내용이 본원에 개재되는 문헌 [Pavletich NP, Pabo CO (May 1991). "Zinc finger-DNA recognition: crystal structure of a Zif268-DNA complex at 2.1 A". Science 252 (5007): 809-17]). 일부 실시양태에서는, 각각 3개 염기쌍의 DNA 서열을 인식하는 별도의 아연 핑거들이 조합됨으로써, 길이가 9개 염기쌍 내지 18개 염기쌍 범위인 표적 부위를 인식하는 3-, 4-, 5- 또는 6-핑거 어레이가 생성된다. 일부 실시양태에서는, 더 긴 어레이가 고려된다. 다른 실시양태에서는, 6-8개 뉴클레오티드를 인식하는 2-핑거 모듈이 조합됨으로써, 4-, 6- 또는 8-아연 핑거 어레이가 생성된다. 일부 실시양태에서는, 원하는 핵산 서열, 예를 들면 길이 3-30 bp의 원하는 뉴클레아제 표적 부위를 인식하는 아연 핑거 도메인을 개발하는 데에 세균 또는 파지 디스플레이가 사용된다. 일부 실시양태에서, 아연 핑거 뉴클레아제는 링커, 예를 들면 폴리펩티드 링커를 통하여 서로 융합되거나 다르게 접합된 아연 핑거 결합 도메인 및 절단 도메인을 포함한다. 링커의 길이는 아연 핑거 도메인에 의해 결합되는 핵산 서열로부터의 절단 거리를 결정한다. 더 짧은 링커가 사용되는 경우, 절단 도메인은 결합된 핵산 서열에 더 가까운 핵산을 절단하게 되는 반면, 더 긴 링커는 절단과 결합된 핵산 서열 사이의 더 긴 거리를 초래하게 된다. 일부 실시양태에서, 아연 핑거 뉴클레아제의 절단 도메인은 결합된 핵산을 절단하기 위해서는 이량체화되어야 한다. 그와 같은 일부 실시양태에서, 상기 이량체는 각각 상이한 아연 핑거 결합 도메인을 포함하는 2종 단량체의 이종이량체이다. 예를 들어 일부 실시양태에서, 상기 이량체는 FokI 절단 도메인에 접합된 아연 핑거 도메인 A를 포함하는 1종의 단량체, 및 FokI 절단 도메인에 접합된 아연 핑거 도메인 B를 포함하는 1종의 단량체를 포함할 수 있다. 이와 같은 비제한적인 예에서, 아연 핑거 도메인 A는 핵산 서열의 표적 부위 일측에 결합하며, 아연 핑거 도메인 B는 핵산 서열의 표적 부위 타측에 결합하고, 이량체화된 FokI 도메인이 아연 핑거 도메인 결합 부위들 사이에서 핵산을 절단한다.
본원에서 사용될 때, "아연 핑거"라는 용어는 접힘(fold), 및 상기 접힘을 안정화하는 하나 이상 아연 이온의 배위를 특징으로 하는 소형 핵산-결합 단백질 구조 모티프를 지칭한다. 아연 핑거는 매우 다양한 상이한 단백질 구조들을 포괄한다 (예컨대 전체 내용이 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Klug A, Rhodes D (1987). "Zinc fingers: a novel protein fold for nucleic acid recognition". Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 52: 473-82] 참조). 아연 핑거는 특정 뉴클레오티드 서열에 결합하도록 설계될 수 있으며, 사실상 모든 원하는 표적 서열에 결합하도록 일련의 아연 핑거들의 융합체를 포함하는 아연 핑거 어레이가 설계될 수 있다. 그와 같은 아연 핑거 어레이는 예를 들면 핵산 절단 도메인에 접합될 경우, 단백질, 예컨대 뉴클레아제의 결합 도메인을 형성할 수 있다. 상이한 유형의 아연 핑거 모티프들이 통상의 기술자에게 알려져 있는데, 비제한적으로 Cys2His2, Gag 너클(knuckle), 트레블 클레프(Treble clef), 아연 리본(Zinc ribbon), Zn2/Cys6 및 TAZ2 도메인-유사 모티프가 포함된다 (예컨대 문헌 [Krishna SS, Majumdar I, Grishin NV (January 2003). "Structural classification of zinc fingers: survey and summary". Nucleic Acids Res. 31 (2): 532-50] 참조). 통상적으로, 단일 아연 핑거 모티프는 핵산 분자의 3 또는 4개 뉴클레오티드에 결합한다. 따라서, 2개의 아연 핑거 모티프를 포함하는 아연 핑거 도메인은 6-8개 뉴클레오티드에 결합할 수 있으며, 3개의 아연 핑거 모티프를 포함하는 아연 핑거 도메인은 9-12개 뉴클레오티드에 결합할 수 있고, 4개의 아연 핑거 모티프를 포함하는 아연 핑거 도메인은 12-16개 뉴클레오티드에 결합할 수 있는 등이다. 어떠한 적합한 단백질 조작 기술도 아연 핑거의 DNA-결합 특이성을 변경하고/거나 3-30개 뉴클레오티드 길이의 사실상 모든 원하는 표적 서열에 결합하는 신규 아연 핑거 융합체를 설계하는 데에 사용될 수 있다 (예컨대 각각의 전체 내용이 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Pabo CO, Peisach E, Grant RA (2001). "Design and selection of novel cys2His2 Zinc finger proteins". Annual Review of Biochemistry 70: 313-340]; [Jamieson AC, Miller JC, Pabo CO (2003). "Drug discovery with engineered zinc-finger proteins". Nature Reviews Drug Discovery 2 (5): 361-368]; 및 [Liu Q, Segal DJ, Ghiara JB, Barbas CF (May 1997). "Design of polydactyl zinc-finger proteins for unique addressing within complex genomes". Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94 (11)] 참조). 조작된 아연 핑거 어레이와 핵산을 절단하는 단백질 도메인 사이의 융합은 "아연 핑거 뉴클레아제"를 생성시키는 데에 사용될 수 있다. 아연 핑거 뉴클레아제는 통상적으로 핵산 분자 내의 특정 표적 부위에 결합하는 아연 핑거 도메인, 및 결합 도메인에 의해 결합된 표적 부위 내에서 또는 그에 근접하여 핵산 분자를 절단하는 핵산 절단 도메인을 포함한다. 통상적인 조작된 아연 핑거 뉴클레아제는 3 내지 6개 사이의 개별 아연 핑거 모티프들, 및 길이가 9개 염기쌍 내지 18개 염기쌍 범위인 결합 표적 부위를 가지는 결합 도메인을 포함한다. 주어진 게놈 내에서 고유한 표적 부위에 결합하여 그것을 절단하고자 하는 상황에서는, 더 긴 표적 부위가 특히 매력적이다.
"치료", "치료하다" 및 "치료하는 것"이라는 용어는 본원에서 기술되는 바와 같은 질환 또는 장애, 또는 그의 1종 이상 증상의 역전, 경감, 발병 지연, 또는 진행 억제를 목표로 하는 임상적 개재를 지칭한다. 본원에서 사용될 때, "치료", "치료하다" 및 "치료하는 것"이라는 용어는 본원에서 기술되는 바와 같은 질환 또는 장애, 또는 그의 1종 이상 증상의 역전, 경감, 발병 지연, 또는 진행 억제를 목표로 하는 임상적 개재를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 치료는 1종 이상의 증상이 발병된 후 및/또는 질환이 진단된 후에 실시될 수 있다. 다른 실시양태에서, 치료는 예를 들면 증상의 발병을 예방 또는 지연하거나 질환의 발병 또는 진행을 억제하기 위하여 증상의 부재하에 실시될 수 있다. 예를 들면, 치료는 (예컨대 증상의 이력에 비추어, 및/또는 유전적 또는 기타 감수성 인자에 비추어) 증상의 발병 전에 감수성인 개체에게 실시될 수 있다. 치료는 예를 들면 그의 재발을 예방 또는 지연하기 위하여 증상이 해결된 후에도 계속될 수 있다.
도 1. 포유동물 세포에의 거대분자 전달의 개략도.
도 2. 지방세포 세포 운명을 프로그래밍하는 것: 백색 지방 조직 (WAT)으로부터 갈색 지방 조직 (BAT)으로의 전환.
도 3. PPARγ 또는 PRDM16을 표적으로 하도록 프로그래밍된 TALE 활성화인자를 전달하기 위하여 초하전 전달 플랫폼을 사용하는 것.
도 4. +36 GFP 융합체, 18.5mer TALE 도메인 및 VP64 활성화 도메인을 포함하는 융합 단백질의 개략도.
도 5. +36 GFP-TALE 활성화인자-융합 단백질의 발현 및 정제.
도 6. +36 GFP PPARγ 및 PRDM16 TALE 활성화인자 융합 단백질 전달시의 지방 세포 조절인자 유전자의 활성화에 대한 시험.
도 7. 상이한 농도에서의 +36 GFP TALE 활성화인자 융합 단백질의 전달 효능.
도 8. NIH 3T3 세포에서의 2종의 상이한 +36 GFP-PRDM16 TALE 융합 단백질의 전달 효능 비교.
도 9. PPARγ-TALE 활성화인자 융합체 전달 후의 PPARγ 유전자 발현, 및 다양한 대조에의 비교.
도 10. RDM16-TALE 활성화인자 융합체 전달 후의 PRDM16 유전자 발현, 및 다양한 대조에의 비교.
도 11. 혈청 존재하에서는 중간 정도의 TALE 활성이 관찰됨.
도 12. PPARγ의 바이러스 전달 후 이어지는 지방생성 칵테일을 사용한 7-일 처리의 검증.
도 13. WAT 및 BAT로 섬유모세포를 프로그래밍하는 것에 대한 검정의 개략도.
도 14. +36 GFP TALE 활성화인자 융합 단백질을 사용한 처리시 관찰되는 지방세포 형성.
도 15. 리피드톡스 레드를 사용한 7일 후 다양한 처리의 염색은 바이러스 전달은 물론 초하전 PPARγ TALE 활성화인자 융합 단백질 전달 후 지방세포의 형성을 나타냄.
도 16. 리피드톡스 레드를 사용한 7일 후 다양한 처리의 염색은 바이러스 전달은 물론 초하전 PPARγ TALE 활성화인자 융합 단백질 전달 후 지방세포의 형성을 나타냄.
도 17. 바이러스 전달은 물론 초하전 PPARγ TALE 활성화인자 융합 단백질 전달 후의 WAT 바이오마커 유전자의 발현.
도 18. 생체 내에서 갈색-지방 지방세포를 유도하기 위한 초하전 PRDM16 TALE 활성화인자 융합 단백질의 전달. PPARγ 및 PRDM16의 바이러스 전달 및 또한 초하전 TALE 활성화인자 단백질 융합체의 전달 후, 강력한 지방세포 형성이 관찰되었음.
도 19. PPARγ 및 PRDM16의 발현에 의한 갈색 지방 마커의 TALE/TALE, 바이러스/TALE 및 바이러스/바이러스-유도 발현의 비교.
도 20. RT-qPCR 평가는 리피드톡스 염색에 의해 관찰되었던 지방 세포 분화와 일치함.
도 21. +36 GFP와의 복합체로서의 기능성 TALE 활성화인자 융합 단백질의 전달은 전달 후 TALE 활성화인자 활성을 향상시킴.
도 22. +36 GFP와의 융합체 (+36 GFP PRDM16 TALE-3) 또는 복합체 (+36 GFP + PRDM16 TALE-3) 중 어느 하나로서의 TALE 활성화인자 융합체 전달 후의 PRDM16 유전자 발현. 복합체의 전달이 TALE 활성화인자 활성을 증가시키는 경향이 있음.
도 23. TALE 활성화인자 융합체 전달 (+36 GFP와의 융합체 또는 복합체 중 어느 하나로서의 것) 후 PRDM16 유전자 발현에 대한 +36 GFP에의 아우레인 펩티드 융합의 효과.
도 24. 리포펙타민 LTX와의 융합체 (+36 GFP PRDM16 TALE-3) 또는 복합체 (+36 GFP + PRDM16 TALE-3) 중 어느 하나로서의 TALE 활성화인자 융합체 전달 후의 PRDM16 유전자 발현.
도 25. 포유동물 세포에의 Cas9와의 초하전 융합 단백질 또는 복합체의 전달. (GGS)9-T-ALAL-PKKKRKV는 서열 251에 해당함.
도 26. 야생형 Cas9 단백질, 및 +36 GFP 및 아우레인-GGS9와의 Cas9 융합 단백질의 정제.
도 27a-b. 다가음이온성 거대분자와의 융합 또는 비-공유 복합체화, 및 양이온성 지질을 사용한 캡슐화에 의하여 포유동물 세포에 단백질을 전달하기 위한 전략을 나타냄. 도 27a는 레콤비나제, 전사-활성화인자-유사 이펙터 (TALE) 단백질 및 Cas9 엔도뉴클레아제가 핵산에 결합하며, 자연적으로 양이온성이고 (순수 이론적 전하를 흑색으로 나타내었음), 양이온성 지질에 의해 효율적으로 캡슐화되지 않는다는 것을 나타냄. 그러나, 이러한 단백질은 (-30)GFP와 같은 초음 하전된 단백질에의 융합, 또는 다가음이온성 핵산과의 복합체화 중 어느 하나에 의해 고도로 음이온성이 될 수 있음. 도 27b는 DNA 및 RNA를 형질감염시키는 데에 흔하게 사용되는 양이온성 지질이 생성되는 고도로 음이온성인 단백질 또는 단백질:핵산 복합체를 캡슐화함으로써 포유동물 세포에의 그의 전달을 매개한다는 것을 나타내는 개략도를 보여줌.
도 28a-f. 배양된 인간 세포에의 Cre 레콤비나제의 전달. 도 28a에서는, Cre 레콤비나제에 대한 고도로 양이온성인 (+36)GFP 또는 고도로 음이온성인 (-30)GFP 중 어느 하나의 융합을 나타냄. Cre-매개 재조합시 DsRed를 발현하는 HeLa 리포터 세포주를 사용하여 Cre 전달 효능을 평가하였는데; (GGS)9는 서열 252에 해당하며; His6은 서열 253에 해당함. 도 28b에서는, HeLa dsRed 세포를 10nM (-30)GFP-Cre 및 양이온성 지질 RNAiMAX를 사용하여 처리하였음. 10 % 소 태아 혈청 (FBS)을 함유하는 배지 중에서 48시간 동안 인큐베이션 후 세포를 가시화하였음. 도 28c는 10 % FBS 배지 또는 무-혈청 배지 중에서의 (+36)GFP-Cre의 전달, 및 완전 혈청 배지 중에서의 양이온성 지질 RNAiMAX가 있거나 없는 (-30)GFP-Cre의 전달을 나타냄. 도 28d는 10 % FBS를 함유하는 275 μL 배지 중에서 48시간 후 기능성 (-30)GFP-Cre 전달 효능에 대한 양이온성 지질 투여량의 효과를 나타냄. 도 28e는 (-30)dGFP-Cre의 기능성 전달 효능에 있어서의 몇 가지 시중에서 구입가능한 양이온성 지질 및 중합체들의 비교임. 도 28f는 Cre에 융합된 다수의 음이온성 펩티드 또는 단백질 서열들의 RNAiMAX-매개 전달을 나타냄. 오차 막대는 상이한 일자에 수행된 3회 생물학적 반복으로부터의 표준 편차를 반영함.
도 29a-b. 배양된 인간 세포에의 TALE 전사 활성화인자의 전달. 도 29a는 VP64 활성화 도메인의 C-말단에, 그리고 (-30)GFP 및 NLS의 N-말단에 융합된 18.5-반복 TALE 활성화인자의 설계를 나타내는데; (GGS)9는 서열 251에 해당하며; His6은 서열 252에 해당함. 융합체의 전체적인 순수 이론적 전하는 -43임. 도 29b는 NTF3 유전자 내의 부위를 표적으로 하는 TALE-VP64 활성화인자를 코딩하는 플라스미드의 통상적인 형질감염, 또는 상응하는 NTF3을 표적으로 하는 (-30)GFP-TALE-VP64 단백질의 RNAiMAX 양이온성 지질-매개 전달에 의한 NTF3 전사의 활성화를 입증하고 있음. 유전자 발현 수준은 qRT-PCR에 의해 측정하였으며, GAPDH 발현 수준에 대하여 표준화하였음. 오차 막대는 상이한 일자에 수행된 3회 생물학적 반복으로부터의 표준 편차를 반영함.
도 30a-e. 배양된 인간 세포에의 Cas9:sgRNA, Cas9 D10A 니카제 및 dCas9-VP64 전사 활성화인자의 전달. 도 30a는 U2OS EGFP 리포터 세포에 대한 EGFP를 표적으로 하는 sgRNA 또는 VEGF를 표적으로 하는 sgRNA와 복합체화된 Cas9 단백질 변이들의 양이온성 지질-매개 전달을 입증하고 있음. 결과를 Cas9 및 sgRNA 발현 플라스미드의 표준 형질감염의 것과 비교하였음. 도 30b는 비처리 (레인 1), EGFP를 표적으로 하는 sgRNA 단독을 사용한 처리 (레인 2), Cas9 단백질 단독 (레인 3), Cas9 단백질 + VEGF를 표적으로 하는 sgRNA + RNAiMAX (레인 4), Cas9 및 EGFP를 표적으로 하는 sgRNA를 발현하는 플라스미드의 형질감염 (레인 5) 또는 Cas9 단백질 + EGFP를 표적으로 하는 sgRNA + RNAiMAX (레인 6)에서의 EGFP의 변형을 측정하기 위한 T7 엔도뉴클레아제 I (T7EI) 검정의 결과를 나타냄. 농도측정법에 의해 계산된 삽입-결실 효율을 겔 이미지 아래에 나타내었음. 도 30c는 4종의 sgRNA 및 RNAiMAX와 복합체화된 Cas9의 단일 전달을 사용한 EGFP 및 3종의 내인성 유전자에서의 게놈 변형의 T7EI 검정 결과를 나타냄. 농도측정법에 의해 계산된 삽입-결실 효율을 겔 이미지 아래에 나타내었음. 도 30d는 플라스미드 형질감염 또는 RNAiMAX-매개 단백질:RNA 복합체 전달 중 어느 하나에 의한 Cas9 D10A 니카제 및 sgRNA 쌍의 전달을 나타냄. EGFP-붕괴 sgRNA GFP g1 + GFP g5 또는 GFP g3 + GFP g7은 유전자 붕괴를 초래할 것으로 예상된 반면, GFP g5 + GFP g7은 동일한 가닥을 표적으로 함으로써 비-기능성일 것으로 예상되었음. 도 30e는 플라스미드 형질감염 또는 RNAiMAX-매개 단백질 전달 중 어느 하나에 의한, 촉매에 의해 폐쇄된 NTF3을 표적으로 하는 (dCas9)-VP64 전사 활성화인자의 전달을 나타냄. VEGF g3 및 VEGF g5 sgRNA 양자의 전달은 NTF3 유전자 활성화에 대한 음성 대조로 사용되었음. 오차 막대는 상이한 일자에 수행된 6회 생물학적 반복으로부터의 표준 편차를 반영함.
도 31a-b. 플라스미드 형질감염 또는 양이온성 지질-매개 단백질:sgRNA 전달에 의한 배양된 인간 세포에서의 Cas9-매개 내인성 유전자 절단의 DNA 서열 특이성을 나타냄. 도 31a에서는, 내인성 CLTA, EMX 및 VEGF 유전자의 표적 적중 변형에 대하여 T7EI 검정을 수행하였음. 도 31b-d에서는, 플라스미드 형질감염 또는 양이온성 지질-매개 단백질:sgRNA 전달에 있어서의 Cas9:sgRNA로부터 생성되는 표적 적중:표적을 벗어난 DNA 변형 비를 나타냄. ~10 %의 표적 적중 절단을 초래하도록 각 처리를 위한 조건을 조정함으로써, 표적 적중 유전자 변형 효율이 유사한 조건하에서의 두 가지 전달 방법 사이의 DNA 절단 특이성 비교를 가능케 하였음. P 값은 표 2에 열거하였음. 각 표적 적중 및 표적을 벗어난 샘플을 1회 서열분석하였는데, 표적 적중 샘플 당 > 10,000개 서열을 분석하였으며, 표적을 벗어난 샘플 당 평균 > 111,000개의 서열을 분석하였음 (표 2).
도 32a-d. 마우스 내이의 유모세포에 대한 Cre 레콤비나제 및 Cas9:sgRNA 복합체의 생체 내 전달을 나타냄. 도 32a에서는, P0 floxP-tdTomato 마우스 (n=4)의 와우관 (달팽이관)에 50 % RNAiMAX 중 23 μM (-30)GFP-Cre 0.3 μL 또는 RNAiMAX 단독 (대조)을 주입하였음. 5일 후, 면역조직화학을 사용하여 Cre-매개 재조합을 표시하는 tdTomato 발현을 가시화하였음. 적색 = tdTomato; 녹색 = Myo7a; 백색 = Sox2; 청색 = DAPI. 황색 괄호는 외부 유모세포 (OHC) 층을 표시함. 도 32b는 (-30)GFP-Cre 전달 10일 후, 대조 와우에서의 부동섬모와 유사하게, tdTomato-양성 외부 유모세포의 무손상 에스핀(Esp)-발현 부동섬모가 나타났음을 (화살표) 보여줌. 적색 = tdTomato; 녹색 = Esp; 백색 = Sox2; 청색 = DAPI. 도 32c는 RNAiMAX 대신 리포펙타민 2000을 사용하는 것 이외에는 도 32a와 동일함 (n=4). 상부 및 하부 패널은 각각 저배율 및 고배율에서의 마우스 와우의 이미지로써, 전달의 효율은 물론 와우 구성 및 유모세포 상실에 대한 효과를 상세하게 기술하고 있음. 도 32d는 P2 Atoh1-GFP 마우스 (n=3)의 와우관 (달팽이관)에 50 % RNAiMAX 또는 리포펙타민 2000 중 0.3 μL의 33 μM Cas9, 33 μM sgRNA를 주입하였을 때의 결과를 나타냄. 10일 후에 가시화하였을 때, Cas9-매개 유전자 붕괴는 GFP 발현의 상실을 초래하였음. 상부 패널은 GFP 신호만을 나타내는 반면, 하부 패널은 추가적인 면역조직화학 마커를 포함함. 하부 패널의 황색 박스는 GFP 발현을 상실한 유모세포를 강조하고 있음. 적색 = tdTomato; 녹색 = Myo7a; 백색/엷은 청색 = Sox2; 청색 = DAPI. 백색으로 나타낸 모든 축척 막대는 10 ㎛임.
도 33a-c. Cre 레콤비나제의 양이온성 지질-매개 전달의 최적화. 도 33a는 Cre 재조합 효율을 측정하는 데에 사용된 두 번째 리포터 세포주인 BSR-TdTomato 세포에서의 (-30)GFP-Cre 전달의 최적화를 나타냄. 도 33b는 FACS에 의해 측정하였을 때의 HeLa dsRed 리포터 세포에서의 (-30)GFP-Cre 재조합 효율 및 독성에 대한 RNAiMAX 투약량의 효과를 입증하고 있음. 정상적인 형태구조를 유지하는 살아있는 세포를 확인하기 위하여, 전방-산란 및 측방-산란 게이팅(gating)에 의해 HeLa 세포를 분류하였음. 도 33c는 Cre 레콤비나제에 융합된 단백질의 순수 전하와 양이온성 지질-매개 기능성 Cre 전달 효율 사이의 관계를 도시함. 25 nM로 열거된 도메인에 융합된 Cre 레콤비나제를 1.5 μL의 RNAiMAX와 조합하고, HeLa dsRed 리포터 세포와 함께 인큐베이팅하였음. 2일 후, FACS에 의해 재조합 효율을 측정하였음. 오차 막대는 상이한 일자에 수행된 3회 생물학적 반복으로부터의 표준 편차를 반영함.
도 34a-d. 양이온성 지질-매개 전달 대 초양 하전된 양이온성 단백질 전달에 의한 단백질 흡수. 도 34a는 비결합 단백질을 제거하기 위해 PBS + 헤파린 (20 U/mL)을 사용하여 세포를 세척한 후 (-30)GFP-Cre 및 RNAiMAX, 또는 (+36)GFP-Cre 중 어느 하나를 사용하여 처리된 세포로부터의 GFP 형광을 정량함. 도 34b는 (+36)GFP와의 융합에서 비롯되는 Cre 레콤비나제 전달 효율에 대비한 (-30)GFP-Cre + 1.5 μL RNAiMAX의 기능성 Cre 레콤비나제 전달 효율을 나타냄. 도 34c는 처리 48시간 후에 총 세포 군집의 평균 mCherry 형광을 측정하고 PBS + 헤파린을 사용하여 세포를 세척하는 것에 의한, (-30)GFP-융합체 + 1.5 μM RNAiMAX 처리 대 (+36)GFP 융합체에 의해 흡수되는 mCherry의 비교를 제공함. 도 34d는 RNAiMAX 존재 또는 부재하에서의 (-30)GFP-Cre 또는 (+36)GFP-Cre의 총 세포 GFP 형광을 나타냄.
도 35. NTF3 유전자를 표적으로 하도록 설계된 TALE 활성화인자의 전달 최적화. NTF3 TALE 플라스미드 형질감염 또는 NTF3 TALE 단백질의 리포솜 전달 중 어느 하나를 사용하여 HEK293T 세포를 처리하였음. 양 처리를 위한 경험적으로 결정된 최적 인큐베이션 시간 후, 세포를 수확하고, qRT-PCR에 의해 NTF3의 mRNA 수준에 대하여 분석하였음. 도 29b에서의 2종 전달 기술의 비교를 위하여, 최적 단백질 (25-50 nM) 및 지질 투약량 (1.5 μL RNAiMAX)을 선택하였음. 오차 막대는 상이한 일자에 수행된 6회 생물학적 반복으로부터의 표준 편차를 반영함.
도 36a-d. Cas9:sgRNA의 전달 및 유동 세포측정법에 의해 분석하는 것에 의한, EGFP 리포터 유전자의 유전자 붕괴 빈도 측정. 도 36a는 Cas9 이중-가닥 파단에 의해 유도되는 NHEJ에 의한 U2OS 세포에서의 EGFP 붕괴의 개략도를 제공함. 도 36b는 플라스미드 형질감염 양성 대조 (오렌지색)와 함께 RNAiMAX를 사용하는 (-30)dGFP-Cas9와 복합체화된 EGFP를 표적으로 하는 sgRNA 또는 표적을 벗어난 sgRNA의 전달을 나타냄. 도 36c는 TO-PRO-3 생존/사멸 균주 (라이프 테크놀로지스 사, 캘리포니아 칼스배드 소재)로 샘플을 처리하고, 유동 세포측정법에 의해 생성 세포를 분석하는 것에 의해, EGFP 형광의 붕괴가 세포 독성의 결과가 아니라는 확인을 제공함. 도 36d는 세포를 투과화하지만 완전히 멤브레인 용해성은 아닌 세제 (0.5 % 트윈(Tween))의 첨가에 의한 TO-PRO-3 염색의 시험을 나타냄.
도 37a-d. Cas9:sgRNA 기능성 전달의 최적화. 도 37a에서, 2종의 시험된 구성체의 양이온성 지질-매개 전달 효율은 더 음이온성인 (-30)dGFP-NLS-Cas9가 자연 Cas9에 비해 낮은 단백질 및 sgRNA 농도에서 더 효율적인 전달을 촉진한다는 것을 나타냄. 도 37b는 단백질 및 sgRNA 농도의 함수로서의 (-30)dGFP-NLS-Cas9의 전달 최적화를 나타냄. 도 37c는 단백질 및 sgRNA 농도의 함수로서의 어떠한 융합 또는 태그도 없는 Cas9 단백질의 전달을 나타냄. 도 37d는 (-30)dGFP-NLS-Cas9 및 자연 Cas9의 RNAiMAX-매개 전달을 위한 최적의 sgRNA 대 단백질 비를 제공함. 오차 막대는 상이한 일자에 수행된 3회 생물학적 반복으로부터의 표준 편차를 반영함.
도 38a-c. sgRNA 및 Cas9 농도 양자의 함수로서의 기능성 Cas9 전달에 대한 NLS 및/또는 (-30)dGFP의 효과. 그래프에 나타낸 가변적인 단백질 농도와 함께, 하기 3종의 고정된 sgRNA 농도에서 EGFP 유전자 붕괴를 측정하였음: 10 nM (도 38a), 25 nM (도 38b) 및 50 nM (도 38c). 0.8 μL의 RNAiMAX를 사용하여 전달을 수행하고, 48시간 후 FACS에 의해 EGFP 형광 신호의 상실에 대하여 검정하였음.
도 39a-c. Cas9:sgRNA 전달 효율 및 세포 독성에 대한 RNAiMAX 및 리포펙타민 2000의 효과. 도 39a에서는, RNAiMAX 또는 리포펙타민 2000 중 어느 하나를 사용하여 16시간 동안 처리된 U2OS EGFP 리포터 세포에서의 상이한 Cas9 단백질 농도 및 100 nM EGFP sgRNA의 일정 투여량에서의 EGFP 유전자 붕괴를 나타냄. 16시간 후 배지를 제거하고, 단백질 전달 처리 48-72시간 후, 검정 종말점까지 새로운 배지를 세포에 첨가하였음. TO-PRO-3 생존/사멸 염색을 사용하여 FACS에 의해 살아있는 세포 군집을 측정하였음. 도 39b는 리포펙타민 2000 투여량의 함수로서의 U2OS 세포에 대한 Cas9:sgRNA 전달의 독성 프로파일을 나타냄. 도 39c는 RNAiMAX 투여량의 함수로서의 세포에 대한 독성 프로파일을 제공함. 오차 막대는 상이한 일자에 수행된 3회 생물학적 반복으로부터의 표준 편차를 반영함.
도 40. 가변 농도의 단백질 및 sgRNA에서의 NTF3 유전자를 표적으로 하는 dCas9-VP64 전달의 최적화. 48-웰 플레이트 포맷으로 (275 μL의 최종 부피), dCas9-VP64 활성화인자, 및 NTF3를 표적으로 하는 gRNA g2 또는 NTF3를 표적으로 하는 sgRNA 6종 전체의 혼합물 중 어느 하나를 사용하여 16시간 동안, 그리고 0.8 μL의 RNAiMAX를 사용하여 HEK293T 세포를 처리하였음. qRT-PCR에 의해 NTF3 mRNA 수준을 측정하고, GAPDH의 것에 대하여 표준화하였음. 오차 막대는 상이한 일자에 수행된 6회 생물학적 반복으로부터의 표준 편차를 반영함.
도 41a-c. 모의 처리, Cas9 플라스미드 및 sgRNA 선형 DNA PCR 생성물의 형질감염, 또는 양이온성 지질-매개 단백질:sgRNA 전달 중 어느 하나에 의해 처리된 몇 가지 인간 유전자의 고-처리량 서열분석에 의해 측정된 삽입-결실 빈도를 도시함. 모의 처리는 3종의 인간 유전자를 표적으로 하는 sgRNA들 중 1종 대신 EGFP를 표적으로 하는 sgRNA의 양이온성 지질-매개 단백질:sgRNA 전달을 포함하였음. 도 41a는 CLTA 유전자에 있어서의 표적 적중 및 표적을 벗어난 삽입-결실 빈도를 나타냄. 도 41b는 EMX 유전자에 있어서의 표적 적중 및 표적을 벗어난 삽입-결실 빈도를 제공함. 도 41c는 VEGF 유전자에 있어서의 표적 적중 및 표적을 벗어난 삽입-결실 빈도를 입증하고 있음. 각 표적 적중 및 표적을 벗어난 샘플을 1회 서열분석하였는데, 표적 적중 샘플 당 > 10,000개 서열을 분석하였으며, 표적을 벗어난 샘플 당 평균 > 111,000개의 서열을 분석하였음 (표 2).
도 42a-c. 마우스 배아 줄기 세포에의 Cas9 엔도뉴클레아제의 전달. 도 42a는 sgRNA 없이 Cas9 단백질 및 RNAiMAX로 처리된 부상 구체 (대조)가 강한 GFP 형광을 유지한 반면 (우측), Cas9:sgRNA 및 RNAiMAX를 사용하여 처리된 것들은 감소된 GFP 형광을 나타내었음을 (좌측) 보여줌. 축적자는 100 ㎛임. 도 42b는 세포 부착 후의 대조 전구 세포, 그리고 사실상 모든 대조 전구 세포가 GFP 양성이었음을 (우측 패널) 나타냄. Cas9:sgRNA 처리는 GFP 발현의 상당한 감소로 이어졌으며 (좌측 패널), 많은 전구 세포가 세포 부착 후 완전한 GFP 녹다운 (화살표)을 나타내었음. 축적자는 20 ㎛임. 도 42c는 영상화 후 수확된 줄기 세포에서의 T7EI 검정이 GFP 리포터의 절단을 확인해준다는 것을 나타냄. 양이온성 지질-매개 Cas9:sgRNA 전달, 및 Cas9 및 EGFP sgRNA 플라스미드의 형질감염에서 유사한 유전자 표적 변형 효율이 관찰되었음.
도 43a-b. 생체 내 내인성 좌위에서의 Cas9 뉴클레아제 및 sgRNA의 양이온성 지질-매개 단백질 전달에 의해 유도되는 게놈 변형. 도 43a는 마우스 유모세포에서 Cas9 및 EGFP sgRNA의 양이온성 지질-매개 전달 후 변형되는 EGFP 표적 적중 좌위의 게놈 DNA 서열의 대표적인 예를 나타냄. 나타낸 각 예에 있어서, 비변형되는 게놈 부위는 첫 번째 서열로써, 결실을 포함하는 가장 풍부한 8개 서열 및 삽입을 포함하는 3개 서열이 후속됨. 각 서열 앞의 숫자는 서열분석 계수를 나타냄. sgRNA 표적 부위는 굵으며 녹색으로 밑줄쳐져 있음. 삽입 및 결실은 적색으로 나타내었음. PAM 부위는 청색으로 나타내었음. 도 43b는 마우스 유모세포에서의 EMX 표적 적중 부위에 대한 도 42a에서와 동일한 분석을 나타냄. 도 43a에 나타낸 서열은 상부에서 하부로 서열 223-236에 해당하며; 도 43b에 나타낸 서열은 상부에서 하부로 서열 237-250에 해당함.
도 2. 지방세포 세포 운명을 프로그래밍하는 것: 백색 지방 조직 (WAT)으로부터 갈색 지방 조직 (BAT)으로의 전환.
도 3. PPARγ 또는 PRDM16을 표적으로 하도록 프로그래밍된 TALE 활성화인자를 전달하기 위하여 초하전 전달 플랫폼을 사용하는 것.
도 4. +36 GFP 융합체, 18.5mer TALE 도메인 및 VP64 활성화 도메인을 포함하는 융합 단백질의 개략도.
도 5. +36 GFP-TALE 활성화인자-융합 단백질의 발현 및 정제.
도 6. +36 GFP PPARγ 및 PRDM16 TALE 활성화인자 융합 단백질 전달시의 지방 세포 조절인자 유전자의 활성화에 대한 시험.
도 7. 상이한 농도에서의 +36 GFP TALE 활성화인자 융합 단백질의 전달 효능.
도 8. NIH 3T3 세포에서의 2종의 상이한 +36 GFP-PRDM16 TALE 융합 단백질의 전달 효능 비교.
도 9. PPARγ-TALE 활성화인자 융합체 전달 후의 PPARγ 유전자 발현, 및 다양한 대조에의 비교.
도 10. RDM16-TALE 활성화인자 융합체 전달 후의 PRDM16 유전자 발현, 및 다양한 대조에의 비교.
도 11. 혈청 존재하에서는 중간 정도의 TALE 활성이 관찰됨.
도 12. PPARγ의 바이러스 전달 후 이어지는 지방생성 칵테일을 사용한 7-일 처리의 검증.
도 13. WAT 및 BAT로 섬유모세포를 프로그래밍하는 것에 대한 검정의 개략도.
도 14. +36 GFP TALE 활성화인자 융합 단백질을 사용한 처리시 관찰되는 지방세포 형성.
도 15. 리피드톡스 레드를 사용한 7일 후 다양한 처리의 염색은 바이러스 전달은 물론 초하전 PPARγ TALE 활성화인자 융합 단백질 전달 후 지방세포의 형성을 나타냄.
도 16. 리피드톡스 레드를 사용한 7일 후 다양한 처리의 염색은 바이러스 전달은 물론 초하전 PPARγ TALE 활성화인자 융합 단백질 전달 후 지방세포의 형성을 나타냄.
도 17. 바이러스 전달은 물론 초하전 PPARγ TALE 활성화인자 융합 단백질 전달 후의 WAT 바이오마커 유전자의 발현.
도 18. 생체 내에서 갈색-지방 지방세포를 유도하기 위한 초하전 PRDM16 TALE 활성화인자 융합 단백질의 전달. PPARγ 및 PRDM16의 바이러스 전달 및 또한 초하전 TALE 활성화인자 단백질 융합체의 전달 후, 강력한 지방세포 형성이 관찰되었음.
도 19. PPARγ 및 PRDM16의 발현에 의한 갈색 지방 마커의 TALE/TALE, 바이러스/TALE 및 바이러스/바이러스-유도 발현의 비교.
도 20. RT-qPCR 평가는 리피드톡스 염색에 의해 관찰되었던 지방 세포 분화와 일치함.
도 21. +36 GFP와의 복합체로서의 기능성 TALE 활성화인자 융합 단백질의 전달은 전달 후 TALE 활성화인자 활성을 향상시킴.
도 22. +36 GFP와의 융합체 (+36 GFP PRDM16 TALE-3) 또는 복합체 (+36 GFP + PRDM16 TALE-3) 중 어느 하나로서의 TALE 활성화인자 융합체 전달 후의 PRDM16 유전자 발현. 복합체의 전달이 TALE 활성화인자 활성을 증가시키는 경향이 있음.
도 23. TALE 활성화인자 융합체 전달 (+36 GFP와의 융합체 또는 복합체 중 어느 하나로서의 것) 후 PRDM16 유전자 발현에 대한 +36 GFP에의 아우레인 펩티드 융합의 효과.
도 24. 리포펙타민 LTX와의 융합체 (+36 GFP PRDM16 TALE-3) 또는 복합체 (+36 GFP + PRDM16 TALE-3) 중 어느 하나로서의 TALE 활성화인자 융합체 전달 후의 PRDM16 유전자 발현.
도 25. 포유동물 세포에의 Cas9와의 초하전 융합 단백질 또는 복합체의 전달. (GGS)9-T-ALAL-PKKKRKV는 서열 251에 해당함.
도 26. 야생형 Cas9 단백질, 및 +36 GFP 및 아우레인-GGS9와의 Cas9 융합 단백질의 정제.
도 27a-b. 다가음이온성 거대분자와의 융합 또는 비-공유 복합체화, 및 양이온성 지질을 사용한 캡슐화에 의하여 포유동물 세포에 단백질을 전달하기 위한 전략을 나타냄. 도 27a는 레콤비나제, 전사-활성화인자-유사 이펙터 (TALE) 단백질 및 Cas9 엔도뉴클레아제가 핵산에 결합하며, 자연적으로 양이온성이고 (순수 이론적 전하를 흑색으로 나타내었음), 양이온성 지질에 의해 효율적으로 캡슐화되지 않는다는 것을 나타냄. 그러나, 이러한 단백질은 (-30)GFP와 같은 초음 하전된 단백질에의 융합, 또는 다가음이온성 핵산과의 복합체화 중 어느 하나에 의해 고도로 음이온성이 될 수 있음. 도 27b는 DNA 및 RNA를 형질감염시키는 데에 흔하게 사용되는 양이온성 지질이 생성되는 고도로 음이온성인 단백질 또는 단백질:핵산 복합체를 캡슐화함으로써 포유동물 세포에의 그의 전달을 매개한다는 것을 나타내는 개략도를 보여줌.
도 28a-f. 배양된 인간 세포에의 Cre 레콤비나제의 전달. 도 28a에서는, Cre 레콤비나제에 대한 고도로 양이온성인 (+36)GFP 또는 고도로 음이온성인 (-30)GFP 중 어느 하나의 융합을 나타냄. Cre-매개 재조합시 DsRed를 발현하는 HeLa 리포터 세포주를 사용하여 Cre 전달 효능을 평가하였는데; (GGS)9는 서열 252에 해당하며; His6은 서열 253에 해당함. 도 28b에서는, HeLa dsRed 세포를 10nM (-30)GFP-Cre 및 양이온성 지질 RNAiMAX를 사용하여 처리하였음. 10 % 소 태아 혈청 (FBS)을 함유하는 배지 중에서 48시간 동안 인큐베이션 후 세포를 가시화하였음. 도 28c는 10 % FBS 배지 또는 무-혈청 배지 중에서의 (+36)GFP-Cre의 전달, 및 완전 혈청 배지 중에서의 양이온성 지질 RNAiMAX가 있거나 없는 (-30)GFP-Cre의 전달을 나타냄. 도 28d는 10 % FBS를 함유하는 275 μL 배지 중에서 48시간 후 기능성 (-30)GFP-Cre 전달 효능에 대한 양이온성 지질 투여량의 효과를 나타냄. 도 28e는 (-30)dGFP-Cre의 기능성 전달 효능에 있어서의 몇 가지 시중에서 구입가능한 양이온성 지질 및 중합체들의 비교임. 도 28f는 Cre에 융합된 다수의 음이온성 펩티드 또는 단백질 서열들의 RNAiMAX-매개 전달을 나타냄. 오차 막대는 상이한 일자에 수행된 3회 생물학적 반복으로부터의 표준 편차를 반영함.
도 29a-b. 배양된 인간 세포에의 TALE 전사 활성화인자의 전달. 도 29a는 VP64 활성화 도메인의 C-말단에, 그리고 (-30)GFP 및 NLS의 N-말단에 융합된 18.5-반복 TALE 활성화인자의 설계를 나타내는데; (GGS)9는 서열 251에 해당하며; His6은 서열 252에 해당함. 융합체의 전체적인 순수 이론적 전하는 -43임. 도 29b는 NTF3 유전자 내의 부위를 표적으로 하는 TALE-VP64 활성화인자를 코딩하는 플라스미드의 통상적인 형질감염, 또는 상응하는 NTF3을 표적으로 하는 (-30)GFP-TALE-VP64 단백질의 RNAiMAX 양이온성 지질-매개 전달에 의한 NTF3 전사의 활성화를 입증하고 있음. 유전자 발현 수준은 qRT-PCR에 의해 측정하였으며, GAPDH 발현 수준에 대하여 표준화하였음. 오차 막대는 상이한 일자에 수행된 3회 생물학적 반복으로부터의 표준 편차를 반영함.
도 30a-e. 배양된 인간 세포에의 Cas9:sgRNA, Cas9 D10A 니카제 및 dCas9-VP64 전사 활성화인자의 전달. 도 30a는 U2OS EGFP 리포터 세포에 대한 EGFP를 표적으로 하는 sgRNA 또는 VEGF를 표적으로 하는 sgRNA와 복합체화된 Cas9 단백질 변이들의 양이온성 지질-매개 전달을 입증하고 있음. 결과를 Cas9 및 sgRNA 발현 플라스미드의 표준 형질감염의 것과 비교하였음. 도 30b는 비처리 (레인 1), EGFP를 표적으로 하는 sgRNA 단독을 사용한 처리 (레인 2), Cas9 단백질 단독 (레인 3), Cas9 단백질 + VEGF를 표적으로 하는 sgRNA + RNAiMAX (레인 4), Cas9 및 EGFP를 표적으로 하는 sgRNA를 발현하는 플라스미드의 형질감염 (레인 5) 또는 Cas9 단백질 + EGFP를 표적으로 하는 sgRNA + RNAiMAX (레인 6)에서의 EGFP의 변형을 측정하기 위한 T7 엔도뉴클레아제 I (T7EI) 검정의 결과를 나타냄. 농도측정법에 의해 계산된 삽입-결실 효율을 겔 이미지 아래에 나타내었음. 도 30c는 4종의 sgRNA 및 RNAiMAX와 복합체화된 Cas9의 단일 전달을 사용한 EGFP 및 3종의 내인성 유전자에서의 게놈 변형의 T7EI 검정 결과를 나타냄. 농도측정법에 의해 계산된 삽입-결실 효율을 겔 이미지 아래에 나타내었음. 도 30d는 플라스미드 형질감염 또는 RNAiMAX-매개 단백질:RNA 복합체 전달 중 어느 하나에 의한 Cas9 D10A 니카제 및 sgRNA 쌍의 전달을 나타냄. EGFP-붕괴 sgRNA GFP g1 + GFP g5 또는 GFP g3 + GFP g7은 유전자 붕괴를 초래할 것으로 예상된 반면, GFP g5 + GFP g7은 동일한 가닥을 표적으로 함으로써 비-기능성일 것으로 예상되었음. 도 30e는 플라스미드 형질감염 또는 RNAiMAX-매개 단백질 전달 중 어느 하나에 의한, 촉매에 의해 폐쇄된 NTF3을 표적으로 하는 (dCas9)-VP64 전사 활성화인자의 전달을 나타냄. VEGF g3 및 VEGF g5 sgRNA 양자의 전달은 NTF3 유전자 활성화에 대한 음성 대조로 사용되었음. 오차 막대는 상이한 일자에 수행된 6회 생물학적 반복으로부터의 표준 편차를 반영함.
도 31a-b. 플라스미드 형질감염 또는 양이온성 지질-매개 단백질:sgRNA 전달에 의한 배양된 인간 세포에서의 Cas9-매개 내인성 유전자 절단의 DNA 서열 특이성을 나타냄. 도 31a에서는, 내인성 CLTA, EMX 및 VEGF 유전자의 표적 적중 변형에 대하여 T7EI 검정을 수행하였음. 도 31b-d에서는, 플라스미드 형질감염 또는 양이온성 지질-매개 단백질:sgRNA 전달에 있어서의 Cas9:sgRNA로부터 생성되는 표적 적중:표적을 벗어난 DNA 변형 비를 나타냄. ~10 %의 표적 적중 절단을 초래하도록 각 처리를 위한 조건을 조정함으로써, 표적 적중 유전자 변형 효율이 유사한 조건하에서의 두 가지 전달 방법 사이의 DNA 절단 특이성 비교를 가능케 하였음. P 값은 표 2에 열거하였음. 각 표적 적중 및 표적을 벗어난 샘플을 1회 서열분석하였는데, 표적 적중 샘플 당 > 10,000개 서열을 분석하였으며, 표적을 벗어난 샘플 당 평균 > 111,000개의 서열을 분석하였음 (표 2).
도 32a-d. 마우스 내이의 유모세포에 대한 Cre 레콤비나제 및 Cas9:sgRNA 복합체의 생체 내 전달을 나타냄. 도 32a에서는, P0 floxP-tdTomato 마우스 (n=4)의 와우관 (달팽이관)에 50 % RNAiMAX 중 23 μM (-30)GFP-Cre 0.3 μL 또는 RNAiMAX 단독 (대조)을 주입하였음. 5일 후, 면역조직화학을 사용하여 Cre-매개 재조합을 표시하는 tdTomato 발현을 가시화하였음. 적색 = tdTomato; 녹색 = Myo7a; 백색 = Sox2; 청색 = DAPI. 황색 괄호는 외부 유모세포 (OHC) 층을 표시함. 도 32b는 (-30)GFP-Cre 전달 10일 후, 대조 와우에서의 부동섬모와 유사하게, tdTomato-양성 외부 유모세포의 무손상 에스핀(Esp)-발현 부동섬모가 나타났음을 (화살표) 보여줌. 적색 = tdTomato; 녹색 = Esp; 백색 = Sox2; 청색 = DAPI. 도 32c는 RNAiMAX 대신 리포펙타민 2000을 사용하는 것 이외에는 도 32a와 동일함 (n=4). 상부 및 하부 패널은 각각 저배율 및 고배율에서의 마우스 와우의 이미지로써, 전달의 효율은 물론 와우 구성 및 유모세포 상실에 대한 효과를 상세하게 기술하고 있음. 도 32d는 P2 Atoh1-GFP 마우스 (n=3)의 와우관 (달팽이관)에 50 % RNAiMAX 또는 리포펙타민 2000 중 0.3 μL의 33 μM Cas9, 33 μM sgRNA를 주입하였을 때의 결과를 나타냄. 10일 후에 가시화하였을 때, Cas9-매개 유전자 붕괴는 GFP 발현의 상실을 초래하였음. 상부 패널은 GFP 신호만을 나타내는 반면, 하부 패널은 추가적인 면역조직화학 마커를 포함함. 하부 패널의 황색 박스는 GFP 발현을 상실한 유모세포를 강조하고 있음. 적색 = tdTomato; 녹색 = Myo7a; 백색/엷은 청색 = Sox2; 청색 = DAPI. 백색으로 나타낸 모든 축척 막대는 10 ㎛임.
도 33a-c. Cre 레콤비나제의 양이온성 지질-매개 전달의 최적화. 도 33a는 Cre 재조합 효율을 측정하는 데에 사용된 두 번째 리포터 세포주인 BSR-TdTomato 세포에서의 (-30)GFP-Cre 전달의 최적화를 나타냄. 도 33b는 FACS에 의해 측정하였을 때의 HeLa dsRed 리포터 세포에서의 (-30)GFP-Cre 재조합 효율 및 독성에 대한 RNAiMAX 투약량의 효과를 입증하고 있음. 정상적인 형태구조를 유지하는 살아있는 세포를 확인하기 위하여, 전방-산란 및 측방-산란 게이팅(gating)에 의해 HeLa 세포를 분류하였음. 도 33c는 Cre 레콤비나제에 융합된 단백질의 순수 전하와 양이온성 지질-매개 기능성 Cre 전달 효율 사이의 관계를 도시함. 25 nM로 열거된 도메인에 융합된 Cre 레콤비나제를 1.5 μL의 RNAiMAX와 조합하고, HeLa dsRed 리포터 세포와 함께 인큐베이팅하였음. 2일 후, FACS에 의해 재조합 효율을 측정하였음. 오차 막대는 상이한 일자에 수행된 3회 생물학적 반복으로부터의 표준 편차를 반영함.
도 34a-d. 양이온성 지질-매개 전달 대 초양 하전된 양이온성 단백질 전달에 의한 단백질 흡수. 도 34a는 비결합 단백질을 제거하기 위해 PBS + 헤파린 (20 U/mL)을 사용하여 세포를 세척한 후 (-30)GFP-Cre 및 RNAiMAX, 또는 (+36)GFP-Cre 중 어느 하나를 사용하여 처리된 세포로부터의 GFP 형광을 정량함. 도 34b는 (+36)GFP와의 융합에서 비롯되는 Cre 레콤비나제 전달 효율에 대비한 (-30)GFP-Cre + 1.5 μL RNAiMAX의 기능성 Cre 레콤비나제 전달 효율을 나타냄. 도 34c는 처리 48시간 후에 총 세포 군집의 평균 mCherry 형광을 측정하고 PBS + 헤파린을 사용하여 세포를 세척하는 것에 의한, (-30)GFP-융합체 + 1.5 μM RNAiMAX 처리 대 (+36)GFP 융합체에 의해 흡수되는 mCherry의 비교를 제공함. 도 34d는 RNAiMAX 존재 또는 부재하에서의 (-30)GFP-Cre 또는 (+36)GFP-Cre의 총 세포 GFP 형광을 나타냄.
도 35. NTF3 유전자를 표적으로 하도록 설계된 TALE 활성화인자의 전달 최적화. NTF3 TALE 플라스미드 형질감염 또는 NTF3 TALE 단백질의 리포솜 전달 중 어느 하나를 사용하여 HEK293T 세포를 처리하였음. 양 처리를 위한 경험적으로 결정된 최적 인큐베이션 시간 후, 세포를 수확하고, qRT-PCR에 의해 NTF3의 mRNA 수준에 대하여 분석하였음. 도 29b에서의 2종 전달 기술의 비교를 위하여, 최적 단백질 (25-50 nM) 및 지질 투약량 (1.5 μL RNAiMAX)을 선택하였음. 오차 막대는 상이한 일자에 수행된 6회 생물학적 반복으로부터의 표준 편차를 반영함.
도 36a-d. Cas9:sgRNA의 전달 및 유동 세포측정법에 의해 분석하는 것에 의한, EGFP 리포터 유전자의 유전자 붕괴 빈도 측정. 도 36a는 Cas9 이중-가닥 파단에 의해 유도되는 NHEJ에 의한 U2OS 세포에서의 EGFP 붕괴의 개략도를 제공함. 도 36b는 플라스미드 형질감염 양성 대조 (오렌지색)와 함께 RNAiMAX를 사용하는 (-30)dGFP-Cas9와 복합체화된 EGFP를 표적으로 하는 sgRNA 또는 표적을 벗어난 sgRNA의 전달을 나타냄. 도 36c는 TO-PRO-3 생존/사멸 균주 (라이프 테크놀로지스 사, 캘리포니아 칼스배드 소재)로 샘플을 처리하고, 유동 세포측정법에 의해 생성 세포를 분석하는 것에 의해, EGFP 형광의 붕괴가 세포 독성의 결과가 아니라는 확인을 제공함. 도 36d는 세포를 투과화하지만 완전히 멤브레인 용해성은 아닌 세제 (0.5 % 트윈(Tween))의 첨가에 의한 TO-PRO-3 염색의 시험을 나타냄.
도 37a-d. Cas9:sgRNA 기능성 전달의 최적화. 도 37a에서, 2종의 시험된 구성체의 양이온성 지질-매개 전달 효율은 더 음이온성인 (-30)dGFP-NLS-Cas9가 자연 Cas9에 비해 낮은 단백질 및 sgRNA 농도에서 더 효율적인 전달을 촉진한다는 것을 나타냄. 도 37b는 단백질 및 sgRNA 농도의 함수로서의 (-30)dGFP-NLS-Cas9의 전달 최적화를 나타냄. 도 37c는 단백질 및 sgRNA 농도의 함수로서의 어떠한 융합 또는 태그도 없는 Cas9 단백질의 전달을 나타냄. 도 37d는 (-30)dGFP-NLS-Cas9 및 자연 Cas9의 RNAiMAX-매개 전달을 위한 최적의 sgRNA 대 단백질 비를 제공함. 오차 막대는 상이한 일자에 수행된 3회 생물학적 반복으로부터의 표준 편차를 반영함.
도 38a-c. sgRNA 및 Cas9 농도 양자의 함수로서의 기능성 Cas9 전달에 대한 NLS 및/또는 (-30)dGFP의 효과. 그래프에 나타낸 가변적인 단백질 농도와 함께, 하기 3종의 고정된 sgRNA 농도에서 EGFP 유전자 붕괴를 측정하였음: 10 nM (도 38a), 25 nM (도 38b) 및 50 nM (도 38c). 0.8 μL의 RNAiMAX를 사용하여 전달을 수행하고, 48시간 후 FACS에 의해 EGFP 형광 신호의 상실에 대하여 검정하였음.
도 39a-c. Cas9:sgRNA 전달 효율 및 세포 독성에 대한 RNAiMAX 및 리포펙타민 2000의 효과. 도 39a에서는, RNAiMAX 또는 리포펙타민 2000 중 어느 하나를 사용하여 16시간 동안 처리된 U2OS EGFP 리포터 세포에서의 상이한 Cas9 단백질 농도 및 100 nM EGFP sgRNA의 일정 투여량에서의 EGFP 유전자 붕괴를 나타냄. 16시간 후 배지를 제거하고, 단백질 전달 처리 48-72시간 후, 검정 종말점까지 새로운 배지를 세포에 첨가하였음. TO-PRO-3 생존/사멸 염색을 사용하여 FACS에 의해 살아있는 세포 군집을 측정하였음. 도 39b는 리포펙타민 2000 투여량의 함수로서의 U2OS 세포에 대한 Cas9:sgRNA 전달의 독성 프로파일을 나타냄. 도 39c는 RNAiMAX 투여량의 함수로서의 세포에 대한 독성 프로파일을 제공함. 오차 막대는 상이한 일자에 수행된 3회 생물학적 반복으로부터의 표준 편차를 반영함.
도 40. 가변 농도의 단백질 및 sgRNA에서의 NTF3 유전자를 표적으로 하는 dCas9-VP64 전달의 최적화. 48-웰 플레이트 포맷으로 (275 μL의 최종 부피), dCas9-VP64 활성화인자, 및 NTF3를 표적으로 하는 gRNA g2 또는 NTF3를 표적으로 하는 sgRNA 6종 전체의 혼합물 중 어느 하나를 사용하여 16시간 동안, 그리고 0.8 μL의 RNAiMAX를 사용하여 HEK293T 세포를 처리하였음. qRT-PCR에 의해 NTF3 mRNA 수준을 측정하고, GAPDH의 것에 대하여 표준화하였음. 오차 막대는 상이한 일자에 수행된 6회 생물학적 반복으로부터의 표준 편차를 반영함.
도 41a-c. 모의 처리, Cas9 플라스미드 및 sgRNA 선형 DNA PCR 생성물의 형질감염, 또는 양이온성 지질-매개 단백질:sgRNA 전달 중 어느 하나에 의해 처리된 몇 가지 인간 유전자의 고-처리량 서열분석에 의해 측정된 삽입-결실 빈도를 도시함. 모의 처리는 3종의 인간 유전자를 표적으로 하는 sgRNA들 중 1종 대신 EGFP를 표적으로 하는 sgRNA의 양이온성 지질-매개 단백질:sgRNA 전달을 포함하였음. 도 41a는 CLTA 유전자에 있어서의 표적 적중 및 표적을 벗어난 삽입-결실 빈도를 나타냄. 도 41b는 EMX 유전자에 있어서의 표적 적중 및 표적을 벗어난 삽입-결실 빈도를 제공함. 도 41c는 VEGF 유전자에 있어서의 표적 적중 및 표적을 벗어난 삽입-결실 빈도를 입증하고 있음. 각 표적 적중 및 표적을 벗어난 샘플을 1회 서열분석하였는데, 표적 적중 샘플 당 > 10,000개 서열을 분석하였으며, 표적을 벗어난 샘플 당 평균 > 111,000개의 서열을 분석하였음 (표 2).
도 42a-c. 마우스 배아 줄기 세포에의 Cas9 엔도뉴클레아제의 전달. 도 42a는 sgRNA 없이 Cas9 단백질 및 RNAiMAX로 처리된 부상 구체 (대조)가 강한 GFP 형광을 유지한 반면 (우측), Cas9:sgRNA 및 RNAiMAX를 사용하여 처리된 것들은 감소된 GFP 형광을 나타내었음을 (좌측) 보여줌. 축적자는 100 ㎛임. 도 42b는 세포 부착 후의 대조 전구 세포, 그리고 사실상 모든 대조 전구 세포가 GFP 양성이었음을 (우측 패널) 나타냄. Cas9:sgRNA 처리는 GFP 발현의 상당한 감소로 이어졌으며 (좌측 패널), 많은 전구 세포가 세포 부착 후 완전한 GFP 녹다운 (화살표)을 나타내었음. 축적자는 20 ㎛임. 도 42c는 영상화 후 수확된 줄기 세포에서의 T7EI 검정이 GFP 리포터의 절단을 확인해준다는 것을 나타냄. 양이온성 지질-매개 Cas9:sgRNA 전달, 및 Cas9 및 EGFP sgRNA 플라스미드의 형질감염에서 유사한 유전자 표적 변형 효율이 관찰되었음.
도 43a-b. 생체 내 내인성 좌위에서의 Cas9 뉴클레아제 및 sgRNA의 양이온성 지질-매개 단백질 전달에 의해 유도되는 게놈 변형. 도 43a는 마우스 유모세포에서 Cas9 및 EGFP sgRNA의 양이온성 지질-매개 전달 후 변형되는 EGFP 표적 적중 좌위의 게놈 DNA 서열의 대표적인 예를 나타냄. 나타낸 각 예에 있어서, 비변형되는 게놈 부위는 첫 번째 서열로써, 결실을 포함하는 가장 풍부한 8개 서열 및 삽입을 포함하는 3개 서열이 후속됨. 각 서열 앞의 숫자는 서열분석 계수를 나타냄. sgRNA 표적 부위는 굵으며 녹색으로 밑줄쳐져 있음. 삽입 및 결실은 적색으로 나타내었음. PAM 부위는 청색으로 나타내었음. 도 43b는 마우스 유모세포에서의 EMX 표적 적중 부위에 대한 도 42a에서와 동일한 분석을 나타냄. 도 43a에 나타낸 서열은 상부에서 하부로 서열 223-236에 해당하며; 도 43b에 나타낸 서열은 상부에서 하부로 서열 237-250에 해당함.
특정 발명 실시양태의 상세한 설명
본 발명은 기능성 이펙터 단백질을 1종 이상의 초하전 단백질, 양이온성 중합체 및/또는 양이온성 지질과 결합시키는 것에 의한, 세포에의 기능성 이펙터 단백질, 예컨대 뉴클레아제, 레콤비나제 및 Cas9 단백질 (그의 변이 및 융합체, 예컨대 Cas9 니카제, 및 데아미나제, 유전자 편집 효소, 전사 억제인자 및 활성화인자, 후성 변형인자에 대한 Cas9 융합체 등 포함)의 전달을 위한 복합체, 조성물, 제제, 키트, 시스템 및 관련 방법을 제공한다. 통상적으로, 기능성 이펙터 단백질은 예를 들면 세포 내에서의 생물학적 효과, 예컨대 게놈 표적 서열의 절단 또는 표적 유전자 발현의 조절을 야기하기 위하여 세포의 내부로 전달된다. 일부 실시양태에서, 상기 생물학적 효과는 세포가 발견되는 대상체에 치료상의 잇점을 부여한다. 기능성 이펙터 단백질의 전달을 위한 상기 복합체, 조성물, 제제, 시스템, 키트 및 관련 방법은 예를 들면 연구 또는 치료 목적으로 세포를 조작한다는 맥락에서 세포에 이펙터 단백질을 도입하는 데에 유용하다. 본원에서 제공되는 기능성 이펙터 단백질 전달용의 상기 복합체, 제제, 시스템, 키트, 및 관련 방법은 현행 기술과 비교하였을 때 향상된 효능 및 감소된 세포독성, 그리고 제조의 용이성을 나타낸다. 본원에서 제공되는 조성물, 제제, 시스템, 키트 및 관련 방법을 사용한 TALEN 또는 Cas9 단백질 (또는 그의 변이 또는 융합체)과 같은 부위-특이적 단백질의 전달은 더 침습성인 전달 방법, 예컨대 부위-특이적 단백질을 코딩하고 있는 벡터의 바이러스 전달의 사용을 회피하면서도, 시험관 내 또는 생체 내에서의 숙주 세포 게놈의 표적화된 조작/변형을 가능케 한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 기술은 세포에 기능성 이펙터 단백질을 전달하는 데에 초하전된 단백질을 사용한다. 소정 실시양태에서, 상기 초하전 단백질은 조작된 단백질이다. 소정 실시양태에서, 초하전 단백질은 자연 발생 초하전 단백질이다. 본 발명의 일부 측면은 초하전 단백질이 세포에 의해 세포내이입되며; 초하전 단백질과 회합될 수 있는 기능성 이펙터 단백질이 초하전 단백질과 함께 세포에 의해 효과적으로 흡수되고; 그와 같은 기능성 이펙터 단백질이 예를 들면 그것이 게놈 표적 부위를 절단하거나, 변형시키거나, 또는 표적 유전자의 전사를 조절할 수 있다는 점에서 세포 흡수 후 그의 생물학적 기능을 유지한다는 인식을 바탕으로 한다.
일부 실시양태에서, 기능성 이펙터 단백질 (예컨대 뉴클레아제, 전사 활성화인자/억제인자, 레콤비나제, 그의 변이 및 융합체를 포함한 Cas9 단백질 등)과 회합된 초하전 단백질을 포함하는 본원에서 제공되는 조성물은 치료제, 진단제 또는 연구 도구로서 유용하다. 일부 실시양태에서, 기능성 이펙터 단백질, 예컨대 뉴클레아제 또는 전사 인자는 예를 들면 그것이 질환 또는 장애와 연관되어 있는 유전자를 표적으로 한다는 점에서 치료적으로 활성일 수 있다. 일부 실시양태에서, 초하전 단백질 및 기능성 이펙터 단백질, 예컨대 뉴클레아제 또는 전사 인자를 포함하는 본원에서 제공되는 조성물은 세포에서 유전자의 발현을 조절하는 데에, 또는 세포에서 생물학적 경로 (예컨대 신호전달 경로; 대사 경로)를 조절하는 데에 사용된다. 일부 실시양태에서, 상기 세포는 세포에 기능성 이펙터 단백질을 도입하기 위하여 본원에서 기술되는 본 발명의 조성물과 접촉된다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 대상체 내의 세포에, 예를 들면 질환 또는 장애와 연관되어 있는 세포에 기능성 이펙터 단백질을 도입하기 위하여, 그를 필요로 하는 대상체에게 투여된다. 본 개시의 일부 측면에 따른 기능성 이펙터 단백질의 전달에 적합한 세포 및 세포 유형에는 인간 세포, 포유동물 세포, T-세포, 뉴런, 줄기 세포, 전구 세포, 혈액 세포, 섬유모세포, 상피 세포, 신생물 세포 및 종양 세포가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
초하전 단백질
본 발명에서 사용하기 위한 초하전 단백질은 단백질 표면상의 비-보존성 아미노산들을 더 극성이거나 하전된 아미노산 잔기로 교체하는 것에 의해 생성될 수 있다. 소정 실시양태에서, 단백질 표면상의 비-보존성 아미노산은 생리학적 pH (pH ~7.4)에서 양으로 하전되는 아미노산으로 돌연변이된다. 변형될 아미노산 잔기는 소수성이거나, 친수성이거나, 하전된 것이거나, 또는 이들의 조합일 수 있다. 초하전 단백질은 또한 단백질을 초하전시키기 위한 단백질에의 하전된 잔기의 결합에 의해 생성될 수 있다. 초하전 단백질은 종종 응집에 대하여 내성이며, 증가된 재접힘 능력을 가지고, 부적절한 접힘에 내성이며, 향상된 용해도를 가지고, 열 또는 세제의 존재와 같은 변성 조건을 포함한 광범위한 조건하에서 일반적으로 더 안정하다.
본 개시의 측면들에 따라 사용하기에 적합한 초하전 단백질에 대해서는 관련 기술분야에 알려져 있으며, 비제한적으로 2007년 12월 13일자 WO 2007/143574호로서 공개된 2007년 6월 1일자 국제 PCT 특허 출원 PCT/US07/70254호; 2009년 11월 5일자 WO 2009/134808호로서 공개된 2009년 4월 28일자 국제 PCT 출원 PCT/US09/041984호; 및 2010년 11월 11일자 WO 2010/129023호로서 공개된 2010년 4월 28일자 국제 PCT 출원 PCT/US10/001250호에 개시되어 있는 초하전 단백질들이 포함되는데, 이들 각각의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다. 일부 실시양태에서, 초하전 단백질은 조작된 초하전 단백질이다. 일부 실시양태에서, 초하전 단백질은 자연 발생 초하전 단백질, 예를 들면 본원에 참조로 포함되는 2010년 11월 11일자 WO 2010/129023호로서 공개된 2010년 4월 28일자 국제 PCT 출원 PCT/US10/001250호에 개시되어 있는 자연상의 초하전 단백질이다. 일부 실시양태에서, 조작된 것이거나 자연 발생인 초하전 단백질은 0.8을 초과하는, 예컨대 ≥0.85, ≥0.9, ≥0.95, ≥1, ≥1.1, ≥1.2, ≥1.3, ≥1.4, ≥1.5, ≥1.6, ≥1.7, ≥1.8, ≥1.9, ≥2, ≥2.5, ≥3, ≥4, ≥5, ≥6, ≥7, ≥8 또는 ≥10인 전하:분자량 비를 나타낸다.
사용되는 초하전 단백질은 임의의 식물, 동물 및/또는 미생물 종으로부터 유래할 수 있다. 소정 실시양태에서, 초하전 단백질은 포유동물 단백질이다. 소정 실시양태에서, 초하전 단백질은 인간 단백질이다. 소정 실시양태에서, 상기 단백질은 통상적으로 연구에 사용되는 생물체로부터 유래한다. 예를 들면, 변형될 단백질은 영장류 (예컨대 유인원, 원숭이), 설치류 (예컨대 토끼, 햄스터, 게르빌루스 쥐), 돼지, 개, 고양이, 어류 (예컨대 다니오 레리오(Danio rerio)), 선충 (예컨대 씨. 엘레간스(C. elegans)), 효모 (예컨대 사카로마이세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae)) 또는 세균 (예컨대 이. 콜리(E. coli))로부터 유래할 수 있다. 소정 실시양태에서, 단백질은 비-면역원성이다. 소정 실시양태에서, 단백질은 비-항원성이다. 소정 실시양태에서, 단백질은 본질적으로 생물학적 활성을 가지지 않거나, 또는 생물학적 활성을 가지지 않도록 변형되어 있다. 소정 실시양태에서, 단백질은 그의 표적화 능력을 기준으로 선택된다. 소정 실시양태에서, 단백질은 녹색 형광 단백질이다. 일부 실시양태에서, 초하전 단백질은 초하전된 글루타치온 S-트랜스퍼라제 (GST)이다. 일부 실시양태에서, 초하전 단백질은 초하전된 스트렙타비딘이다.
일부 실시양태에서는, 전체 순수 전하가 증가되도록, 또는 단백질 표면상 하전된 잔기의 총 수가 증가되도록 변형된 초하전 단백질이 사용된다. 소정 실시양태에서, 초하전 단백질의 이론적인 순수 전하는 비변형 단백질에 비해 +1 이상, +2 이상, +3 이상, +4 이상, +5 이상, +10 이상, +15 이상, +20 이상, +25 이상, +30 이상, +35 이상 또는 +40 이상 증가된다. 소정 실시양태에서, 초하전 단백질의 이론적인 순수 전하는 생리학적 pH (즉 ~7.4)에서 +1 이상, +2 이상, +3 이상, +4 이상, +5 이상, +10 이상, +15 이상, +20 이상, +25 이상, +30 이상, +35 이상 또는 +40 이상이다.
예를 들면 양이온성 지질 및/또는 양이온성 중합체의 사용과 연관되어 있는 다른 실시양태에서는, 전체 순수 전하가 감소되도록, 또는 단백질 표면상 하전된 잔기의 총 수가 감소되도록 변형된 초하전 단백질이 사용된다. 소정 실시양태에서, 초하전 단백질의 이론적인 순수 전하는 비변형 단백질에 비해 -1 이상, -2 이상, -3 이상, -4 이상, -5 이상, -10 이상, -15 이상, -20 이상, -25 이상, -30 이상, -35 이상, -40 이상, -45 이상 또는 -50 이상 감소된다 ("빼기" 또는 "음"은 '-'로 표시됨). 소정 실시양태에서, 초하전 단백질의 이론적인 순수 전하는 -1 이상, -2 이상, -3 이상, -4 이상, -5 이상, -10 이상, -15 이상, -20 이상, -25 이상, -30 이상, -35 이상, -40 이상, -45 이상 또는 -50 이상이다.
본 발명의 기술을 예시하기 위하여 일부 대표적인 초하전 단백질들이 본원에서 기술되기는 하지만, 본 개시가 그와 관련하여 제한되는 것은 아니다. 통상의 기술자라면, 본 개시를 바탕으로 세포에 기능성 이펙터 단백질을 전달하기 위한 추가적인 적합한 초하전 단백질들을 확인할 수 있을 것이다. 수많은 자연 발생 단백질들이 적합한 초하전 단백질이 생성되도록 변형될 수 있다. 그와 같은 단백질에서의 원하는 변형은 관련 기술분야에 알려져 있는 임의의 기술을 사용하여 수행될 수 있다. 단백질 서열에 그와 같은 변화를 도입하기 위한 재조합 DNA 기술이 관련 기술분야에 잘 알려져 있다. 소정 실시양태에서, 상기 변형은 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 위치-지정 돌연변이유발에 의해 이루어진다. 돌연변이를 도입하기 위한 다른 기술들은 문헌 [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., ed. by Sambrook, Fritsch, and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989)]; [the treatise, Methods in Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.)]; [Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, Inc., New York, 1999)]에 논의되어 있으며, 이들 각각은 본원에 참조로 포함된다.
초하전 단백질은 추가적으로 변형될 수도 있다. 초하전 단백질을 포함한 단백질들은 통상의 기술자에게 알려져 있는 기술을 사용하여 변형될 수 있다. 예를 들어, 초하전 단백질은 화학적 또는 생물학적으로 변형될 수 있다. 최초의 서열로부터 하나 이상의 아미노산이 첨가되거나, 결실되거나, 또는 변경될 수 있다. 예를 들면, 단백질의 정제를 돕기 위하여, 폴리-히스티딘 태그 또는 다른 태그가 초하전 단백질에 첨가될 수 있다. 단백질의 생물학적, 생화학적 및/또는 생물물리학적 특성을 변경하기 위하여, 초하전 단백질상에 다른 펩티드 또는 단백질이 첨가될 수도 있다. 예를 들면, 엔도솜분해 펩티드가 초하전 단백질의 최초 서열에 첨가될 수 있거나, 또는 표적화 펩티드가 초하전 단백질의 최초 서열에 첨가될 수 있다. 초하전 단백질의 다른 변형에는 번역-후 변형 (예컨대 글리코실화, 인산화, 아실화, 지질화, 파르네실화, 아세틸화, 단백질분해 등)이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 소정 실시양태에서, 초하전 단백질은 그의 면역원성이 감소되도록 변형된다. 소정 실시양태에서, 초하전 단백질은 세포에 기능성 이펙터 단백질 (예컨대 뉴클레아제, 전사 활성화인자/억제인자, 레콤비나제, 그의 변이 및 융합체를 포함한 Cas9 단백질 등)을 전달하는 그의 능력이 향상되도록 변형된다. 소정 실시양태에서, 초하전 단백질은 중합체에 접합된다. 예를 들면, 단백질은 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 중합체에 단백질을 접합시키는 것에 의해 PEG화될 수 있다. 단백질 서열의 변형 없이 초하전 단백질을 생성시키기 위하여, 다른 방법이 사용될 수 있다. 예를 들면, 초하전을 달성하는 표면 전하를 제공하기 위하여, (예컨대 화학적 또는 효소적 반응에 의해) 순수 전하를 변경하는 잔기들이 단백질에 결합될 수 있다. 소정 실시양태에서는, 본원에서 개시되는 본 발명 기술에 사용되는 단백질을 초하전시키기 위하여, 문헌 [Shaw et al., Protein Science 17:1446, 2008]에 기술되어 있는 단백질 변형 방법이 사용된다.
본원에서 개시되는 기술과 함께 사용하기에 적합한 몇 가지 상이한 초하전 단백질의 변이들의 설계 및 생성에 대한 것이 2007년 12월 13일자 WO 2007/143574호로서 공개된 2007년 6월 1일자 국제 PCT 특허 출원 PCT/US07/70254호; 2009년 11월 5일자 WO 2009/134808호로서 공개된 2009년 4월 28일자 국제 PCT 출원 PCT/US09/041984호; 및 2010년 11월 11일자 WO 2010/129023호로서 공개된 2010년 4월 28일자 국제 PCT 출원 PCT/US10/001250호에 기술되어 있는데, 이들 각각의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다. 거기에 기술되어 있는 개시 초하전 단백질들 중 일부는 더욱 안정하며, 그의 생물학적 기능, 예컨대 형광 단백질의 경우 그의 형광을 유지하는 것으로 나타났다. 예를 들면, 아에쿠오레아 빅토리아(Aequorea victoria) 유래의 녹색 형광 단백질 (GFP)이 진뱅크(GenBank) 등재 번호 P42212에 기술되어 있는데, 본원에 참조로 포함된다. 이와 같은 야생형 GFP의 아미노산 서열은 하기와 같다:
야생형 GFP는 -7의 이론적 순수 전하를 가진다. 예를 들면 전체 내용이 본원에 참조로 포함되는 2010년 11월 11일자 WO 2010/129023호로서 공개된 2010년 4월 28일자 국제 PCT 출원 PCT/US10/001250호에는 -29, -30, -25, +15, +25, +36, +48 및 +49의 이론적 순수 전하를 가지는 변이들이 보고되어 있다. +36 GFP를 95 ℃까지 가열한 후에도, 변이 단백질의 100 %가 가용성이며, 단백질이 그의 형광의 ≥70 %를 유지한다.
본 개시의 일부 측면은 +36 GFP가 표적 세포에 기능성 이펙터 단백질 (예컨대 뉴클레아제, 전사 활성화인자/억제인자, 레콤비나제, 그의 변이 및 융합체를 포함한 Cas9 단백질 등)을 효율적으로 전달하며, 그렇게 전달된 이펙터 단백질이 그의 생물학적 기능을 유지한다는 발견을 바탕으로 한다. 따라서, +15 이상, +25 이상, +30 이상, +35 이상 또는 +40 이상의 순수 전하를 가지는 GFP 또는 다른 단백질들은 세포에 기능성 이펙터 단백질을 도입하는 데에 특히 유용할 것으로 생각된다.
일부 실시양태에서, 특히 유용한 초하전 단백질은 +36 GFP의 것과 유사한 전하 분포 또는 표면 전하 밀도를 가능케 하는 단백질이다. 또한, 일부 실시양태에서, 특히 유용한 초하전 단백질은 초하전시키는 것에 의해 쉽게 교란되지 않음으로써 초하전된 단백질이 잘 접히도록 하는 안정한 접힌 구조를 나타내는 단백질이다. 일부 실시양태에서, 특히 유용한 초하전 단백질은 본원 또는 각각의 전체 내용이 본원에 참조로 포함되는 2007년 12월 13일자 WO 2007/143574호로서 공개된 2007년 6월 1일자 국제 PCT 특허 출원 PCT/US07/70254호; 2009년 11월 5일자 WO 2009/134808호로서 공개된 2009년 4월 28일자 국제 PCT 출원 PCT/US09/041984호; 및 2010년 11월 11일자 WO 2010/129023호로서 공개된 2010년 4월 28일자 국제 PCT 출원 PCT/US10/001250호에 기술되어 있는 초하전 단백질과 구조적 특징; 예를 들면 구형 구조 또는 β-배럴(barrel) 구조를 공유하는 단백질이다. 단백질 접힘, 단백질 접힘 구조 안정성 및 다르게 하전된 아미노산을 사용한 특정 아미노산의 치환에 의한 단백질 접힘의 교란, 전하 분포, 및 표면 전하 밀도는 본원에서 제공되는 방법 및 알고리즘, 및 통상의 기술자에게 알려져 있는 다른 것들에 의해 인실리코로(in silico) 모델화될 수 있다. 따라서, 문제의 초하전 단백질이 잘 접힐 것인지 여부는 일상적인 실험만으로도 통상의 기술자에게 드러나게 될 것이다. 따라서, 통상의 기술자라면, 주어진 아미노산 서열로부터 주어진 초하전 단백질이 본원에서 기술되는 기술에 따른 기능성 이펙터 단백질의 세포 전달에 유용할 것인지 여부를 확인할 수 있을 것이다.
일부 대표적인 적합한 GFP 변이에는 비제한적으로 하기가 포함된다:
+15 GFP:
+25 GFP:
+36 GFP:
+42 GFP:
+48 GFP:
+49 GFP:
(-)30 GFP:
통상의 기술자라면, 상기 서열이 N-말단 His6 태그를 포함하고 있으며, 그와 같은 태그가 없거나 다른 태그를 가지는 서열 역시 적합하다는 것을 알고 있을 것이다.
세포에의 전달 후의 기능성 이펙터 단백질 (예컨대 뉴클레아제, 전사 활성화인자/억제인자, 레콤비나제, 그의 변이 및 융합체를 포함한 Cas9 단백질 등)의 생물학적 기능을 촉진하기 위해서는, 세포 흡수 후 기능성 이펙터 단백질의 엔도솜 탈출을 강화하는 것이 바람직할 수 있다. 초하전 단백질 또는 기능성 이펙터 단백질은 엔도솜 분해 또는 엔도솜의 용해를 강화하는 것으로 알려져 있는 단백질, 펩티드 또는 다른 존재에 융합되거나 그와 회합될 수 있다. 소정 실시양태에서, 상기 펩티드는 엔도솜 분해를 강화하는 것으로 알려져 있는 헤마글루티닌 2 (HA2) 펩티드이다. 소정의 구체적인 실시양태에서는, HA2 펩티드가 초하전된 GFP (예컨대 +36 GFP)에 융합된다. 소정의 구체적인 실시양태에서, 융합된 단백질은 하기 서열의 것이다:
+36 GFP-HA2:
소정 실시양태에서, 엔도솜분해 펩티드는 멜리틴 펩티드 (GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ, 서열 23) (본원에 참조로 포함되는 문헌 [Meyer et al., JACS 130(11):3272-3273, 2008])이다. 소정 실시양태에서, 상기 멜리틴 펩티드는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 첨가에 의해 변형된다. 소정 실시양태에서, 멜리틴 펩티드는 하기 서열의 것이다: CIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ (서열 24). 소정의 구체적인 실시양태에서, 멜리틴 펩티드는 초하전된 GFP (예컨대 +36 GFP)에 융합된다.
소정 실시양태에서, 엔도솜분해 펩티드는 페네트라틴 펩티드 (RQIKIWFQNRRMKWKK-아미드, 서열 25), 소 PrP (1-30) 펩티드 (MVKSKIGSWILVLFVAMWSDVGLCKKRPKP-아미드, 서열 26), MPGΔNLS 펩티드 (K→S 치환으로 인하여 기능성인 핵 국재화 서열이 결핍되어 있음) (GALFLGWLGAAGSTMGAPKSKRKV, 서열 27), TP-10 펩티드 (AGYLLGKINLKALAALAKKIL-아미드, 서열 28), 및/또는 EB1 펩티드 (LIRLWSHLIHIWFQNRRLKWKKK-아미드, 서열 29) (본원에 참조로 포함되는 문헌 [Lundberg et al., 2007, FASEB J. 21:2664])이다. 소정 실시양태에서, 상기 페네트라틴, PrP (1-30), MPG, TP-10 및/또는 EB1 펩티드는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 첨가에 의해 변형된다. 소정의 구체적인 실시양태에서, 상기 PrP (1-30), MPG, TP-10 및/또는 EB1 펩티드는 초하전된 GFP (예컨대 +36 GFP)에 융합된다. 일부 실시양태에서는, 아우레인 펩티드가 초하전 단백질에 융합된다.
다른 펩티드 또는 단백질이 초하전 단백질, 또는 초하전 단백질과 기능성 이펙터 단백질 (예컨대 뉴클레아제, 전사 활성화인자/억제인자, 레콤비나제, 그의 변이 및 융합체를 포함한 Cas9 단백질 등)을 포함하는 융합 단백질에 융합될 수도 있다. 예를 들면, 기능성 이펙터 단백질을 특정 세포 유형에 선택적으로 전달하기 위하여, 표적화 펩티드가 초하전 단백질에 융합될 수 있다. 기능성 이펙터 단백질의 세포 흡수를 강화하는 펩티드 또는 단백질이 사용될 수도 있다. 소정 실시양태에서, 초하전 단백질에 융합되는 펩티드는 펩티드 호르몬이다. 소정 실시양태에서, 초하전 단백질에 융합되는 펩티드는 펩티드 리간드이다.
본원에서 상세하게 기술되는 대표적인 초하전 단백질들이 본 개시를 제한하는 것을 의미하지는 않는데, 통상의 기술자라면, 비제한적으로 다른 GFP-유형 형광 단백질을 포함한 다른 초하전 단백질들이 기능성 이펙터 단백질 (예컨대 뉴클레아제, 전사 활성화인자/억제인자, 레콤비나제, 그의 변이 및 융합체를 포함한 Cas9 단백질 등)의 세포 전달에 사용될 수 있다는 것을 알고 있을 것이다. 소정 실시양태에서, 초하전 단백질은 청색 형광 단백질의 초하전된 버전이다. 소정 실시양태에서, 초하전 단백질은 시안 형광 단백질의 초하전된 버전이다. 소정 실시양태에서, 초하전 단백질은 황색 형광 단백질의 초하전된 버전이다. 대표적인 적합한 형광 단백질에는 강화된 녹색 형광 단백질 (EGFP), AcGFP, 터보GFP, 에메랄드, 아자미 그린, Zs그린, EBFP, 사피레, T-사피레, ECFP, mCFP, 세룰린, CyPet, Am시안1, 미도리-이쉬 시안, mTFP1 (Teal), 강화된 황색 형광 단백질 (EYFP), 토파즈, 비너스, m시트린, YPet, PhiYFP, Zs옐로우1, m바나나, 쿠사비라 오렌지, m오렌지, d토마토, d토마토-탠덤, Ds레드, Ds레드2, Ds레드-익스프레스 (T1), Ds레드-모노머, m탄제린, m스트로베리, As레드2, mRFP1, J레드, m체리(mCherry), Hc레드1, m라즈베리, Hc레드1, Hc레드-탠덤, m플룸 및 AQ143이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
초하전되어, 예컨대 본원에서 개시되는 바와 같은 기능성 이펙터 단백질 (예컨대 뉴클레아제, 전사 활성화인자/억제인자, 레콤비나제, 그의 변이 및 융합체를 포함한 Cas9 단백질 등)의 전달에 사용될 수 있는 또 다른 단백질에는 히스톤 성분 또는 히스톤-유사 단백질, 고도-이동성-군(high-mobility-group) 단백질 (HMG), 효소 (예컨대 아밀라제, 펙티나제, 히드롤라제, 프로테아제, 글루코스 이소머라제, 리파제, 피타제, 알글루세라제, 이미글루세라제, 아갈시다제 베타, α-1-이두로니다제, 산 α-글루코시다제, 및 이두로네이트-2-술파타제, N-아세틸갈락토스아민-4-술파타제가 포함된다.
단백질이 아닌 다른 하전된 중합체가 기능성 이펙터 단백질을 전달하는 데에 사용될 수도 있다. 또한, 본원에서 매우 상세하게 기술되는 바와 같이, 양이온성 지질 및 지질-유사 물질은 물론, 양이온성 중합체가 기능성 이펙터 단백질을 전달하는 데에 사용될 수도 있다. 적합한 양이온성 지질, 지질-유사 물질 및 양이온성 중합체에 대해서는 본원에서 개시되며, 추가적인 적합한 지질 및 지질-유사 물질에 대해서는 통상의 기술자에게 알려져 있다 (예컨대 전체 내용이 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Akinc et al., Nature Biotechnology 26, 561-569 (2008)]에 기술되어 있는 것들 참조).
초하전 단백질을 사용한 기능성 이펙터 단백질의 전달
본 발명은 생체 내, 생체 외 또는 시험관 내에서의 세포에 대한 기능성 이펙터 단백질 (예컨대 뉴클레아제, 전사 활성화인자/억제인자, 레콤비나제, 그의 변이 및 융합체를 포함한 Cas9 단백질 등)의 전달을 위한 시스템 및 방법을 제공한다. 이와 같은 시스템 및 방법은 통상적으로 복합체 또는 융합 단백질을 형성시키기 위한 기능성 이펙터 단백질의 초하전 단백질과의 결합, 및 세포에의 상기 복합체 또는 융합 단백질의 전달을 포함한다. 일부 실시양태에서, 초하전 단백질에 의해 전달될 기능성 이펙터 단백질은 치료 활성을 가진다. 일부 실시양태에서, 세포에의 복합체 또는 융합 단백질의 전달은 기능성 이펙터 단백질과 회합된 초하전 단백질을 포함하는 복합체 또는 융합 단백질을 그를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 기능성 이펙터 단백질 (예컨대 뉴클레아제, 전사 활성화인자/억제인자, 레콤비나제, 그의 변이 및 융합체를 포함한 Cas9 단백질 등)은 그 자체로는 세포에 진입할 수 없을 수 있으나, 예를 들면 공유 결합 또는 비-공유 상호작용을 통하여 초하전 단백질과 회합되는 경우, 세포에 진입할 수 있다. 일부 실시양태에서는, 초하전 단백질에 공유 결합된 기능성 이펙터 단백질을 포함하는 조성물이 제공된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 예를 들면 직접 융합 또는 펩티드 링커를 통한 펩티드 결합을 통하여 초하전 단백질에 융합된 기능성 이펙터 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 비-공유 상호작용에 의해 초하전 단백질에 결합된 기능성 이펙터 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 초하전 단백질은 기능성 이펙터 단백질이 세포에 진입하는 것을 가능케 하는 데에 이용된다. 일부 실시양태에서, 초하전 단백질과 회합되어 세포에 전달된 기능성 이펙터 단백질은 세포에의 전달 후, 예를 들면 세포 프로테아제 (예컨대 엔도솜 프로테아제)에 의한 링커 펩티드의 절단에 의해, 또는 예를 들면 엔도솜 내의 특별한 세포 미세환경에서의 초하전 단백질로부터의 기능성 이펙터 단백질의 분해에 의해 초하전 단백질로부터 분리된다. 일부 실시양태에서, 본 개시에 의해 제공되는 시스템 또는 방법에 의해 세포에 전달되는 기능성 이펙터 단백질은 치료 활성을 가진다.
일부 실시양태에서, 기능성 이펙터 단백질 (예컨대 뉴클레아제, 전사 활성화인자/억제인자, 레콤비나제, 그의 변이 및 융합체를 포함한 Cas9 단백질 등)은 생체 내, 생체 외 또는 시험관 내에서 본원에서 제공되는 시스템, 조성물 또는 방법에 의해 세포에 전달된다. 일부 실시양태에서, 기능성 이펙터 단백질은 표적 세포 내에서 생물학적 기능을 수행할 수 있는 단백질, 예를 들면 표적 세포에서 그의 기질에 결합하여 효소 반응을 촉매할 수 있는 효소, 예컨대 표적 세포 내에서 핵산 분자에 결합하여 그것을 절단할 수 있는 뉴클레아제, 또는 표적 세포의 게놈과 상호작용하여 세포 내 표적 유전자의 전사를 활성화 또는 억제할 수 있는 전사 인자이다.
일부 실시양태에서, 기능성 이펙터 단백질과 초하전 단백질의 융합을 생성시키는 방법에는 인프레임으로 기능성 단백질 및 초하전 단백질은 물론, 임의적으로 펩티드 링커의 코딩 서열을 포함하는 발현 핵산 구성체의 생성; 배양물 중 원핵 또는 진핵 세포에서의 그와 같은 재조합 융합 단백질의 발현, 융합 단백질의 추출 및 정제가 포함된다. 일부 실시양태에서, 핵산 구성체는 발현 벡터, 예를 들면 세균 숙주에서의 증식 및 원핵 또는 진핵 세포 내에서의 발현에 적합한 벡터의 형태로 생성된다.
일부 실시양태에서, 융합 단백질 발현에 적합한 벡터는 양 코딩 서열이 서로 인프레임이 되는 것을 초래하는 클로닝 접근법에 의한, 진핵 및/또는 원핵 프로모터의 조절하에서의 초하전 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 클로닝 벡터에 대한 전달될 기능성 이펙터 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 클로닝에 의해 생성된다. 일부 실시양태에서, 상기 클로닝 벡터는 초하전 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 링커 및 초하전 단백질과 인프레임으로 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 삽입하는 데에 유용한 제한 부위 사이에 펩티드 링커를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 클로닝 벡터는 또한 원핵 또는 진핵 세포에서의 융합 단백질의 발현을 강화하거나 상기 세포로부터의 발현된 융합 단백질의 정제를 촉진하는 추가적인 서열, 예를 들면 융합 단백질을 코딩하는 전사체를 안정화하는 서열, 예컨대 폴리-A 신호, 스플라이싱가능 인트론, 인프레임 펩티드 또는 단백질 도메인 태그 (예컨대 Arg-태그, 칼모둘린-결합 펩티드 태그, 셀룰로스-결합 도메인 태그, DsbA 태그, c-myc-태그, 글루타치온 S-트랜스퍼라제 태그, FLAG-태그, HAT-태그, His-태그, 말토스-결합 단백질 태그, NusA 태그, S-태그, SBP-태그, Strep-태그 또는 티오레독신 태그)를 코딩하는 서열, 또는 발현 구성체를 보유하고 발현하는 세포의 확인 및/또는 그와 같은 세포에서 발현 수준을 정량하는 것을 가능케 하는 선택 마커 또는 리포터 카세트를 포함한다. 융합 단백질을 클로닝하고 발현시키기 위한 방법에 대해서는 통상의 기술자에게 잘 알려져 있는데, 예를 들면 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Volume 1-3, CSHL Press (1989)]; [Gellissen et al., Production of recombinant proteins, Wiley-VCH, 2005]을 참조하라.
일부 실시양태에서, 기능성 이펙터 단백질은 표적 세포에의 전달을 위하여 초하전된 GFP, 예를 들면 +36 GFP 또는 -30 GFP와 회합된다. 초하전 단백질에 의한 거대분자 전달에서의 엔도솜 붕괴의 잇점은 이미 입증되어 있으므로 (문헌 [Wadia et al., Nat. Med. 10, 310-315, 2004]), 일부 실시양태에서는, 본원에서 제공되는 바와 같이, 또는 관련 기술분야에 알려져 있는 바와 같이 강화된 엔도솜 탈출을 달성하기 위한 추가적인 단계가 수행된다. 효과적인 엔도솜 해제와 연계되는 경우, 고도로 효율적인 단백질 내재화는 외인성 단백질 작용제의 필수 투여량을 최소화함으로써, 연구 도구로서의 그의 잠재력을 강화하고, 치료제 개발로 이어질 가능성을 가진다.
일부 실시양태에서, 초하전 단백질과 회합된 기능성 이펙터 단백질을 포함하는 조성물은 단리 및/또는 정제 후에 표적 세포에 투여된다. 단백질 단리 방법 및 기술에 대해서는 통상의 기술자에게 잘 알려져 있는데, 예를 들면 친화성 크로마토그래피 또는 면역침전이 포함된다. 특정 기능성 이펙터 단백질, 초하전 단백질 및/또는 융합 단백질을 단리 및/또는 정제하는 데에 적합한 방법은 각 단백질의 특성에 따라 달라지게 된다. 예를 들어, His-태그화 융합 단백질은 Ni 또는 Co 이온 크로마토그래피를 통하여 용이하게 단리 및 정제될 수 있는 반면, 다른 펩티드 또는 도메인을 사용하여 태그화된 융합 단백질 또는 태그화되지 않은 융합 단백질은 다른 잘 확립되어 있는 방법에 의해 정제될 수 있다.
통상의 기술자라면, 본원에서 제공되는 시스템 또는 방법에 의한 생체 내, 생체 외 또는 시험관 내에서의 표적 세포에의 전달에 적합한 기능성 이펙터 단백질에 대해 잘 알고 있을 것인 바, 예를 들면 DNA-결합 단백질, 예컨대 전사 인자 및 뉴클레아제는 물론, Cas9 단백질 (그의 변이 및 융합체 포함)이 포함된다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법, 조성물 또는 시스템은 세포에 치료용 기능성 이펙터 단백질을 전달하는 데에 사용된다. 치료용 단백질의 예에는 질환 또는 장애와 연관되어 있는 게놈 대립유전자를 표적으로 하는 뉴클레아제 및 Cas9 단백질 (그의 변이 및 융합체 포함), 그리고 유익한 유전자를 활성화하거나 병원성인 유전자를 억제하는 전사 인자가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일부 실시양태에서는, Cas9가 세포에의 전달을 위하여 초하전 단백질에 융합된다. 일부 실시양태에서, 상기 초하전 단백질은 양으로 하전된다. 일부 실시양태에서, Cas9에 융합되는 초하전 단백질은 (+36)GFP이다. 일부 실시양태에서, Cas9와 (+36)GFP의 융합체는 서열 30의 아미노산 서열 (예컨대 핵 국재화 신호 (NLS)가 있거나 없으며, 6xHis 태그가 있거나 없음)을 포함하거나, 또는 서열 30의 아미노산 서열과 80 % 이상, 85 % 이상, 90 % 이상, 95 % 이상, 98 % 이상 또는 99 % 이상 동일한 아미노산 서열 (예컨대 핵 국재화 신호 (NLS)가 있거나 없으며, 6xHis 태그가 있거나 없음)을 포함한다. 일부 실시양태에서, Cas9에 융합되는 초하전 단백질은 (-30)GFP이다. 일부 실시양태에서, Cas9와 (-30)GFP의 융합체는 서열 31의 아미노산 서열 (예컨대 핵 국재화 신호 (NLS)가 있거나 없으며, 6xHis 태그가 있거나 없음)을 포함하거나, 또는 서열 31의 아미노산 서열과 80 % 이상, 85 % 이상, 90 % 이상, 95 % 이상, 98 % 이상 또는 99 % 이상 동일한 아미노산 서열 (예컨대 핵 국재화 신호 (NLS)가 있거나 없으며, 6xHis 태그가 있거나 없음)을 포함한다.
(+36)dGFP-NLS-Cas9-6xHis ( Y67S ):
(-30)dGFP-NLS-Cas9-6xHis ( Y67S ):
기능성 이펙터 단백질 및 양이온성 지질의 조성물
본 개시의 소정 측면은 예를 들면 "네이키드(naked)" 단백질 제제를 전달하는 것과 반대되는 이펙터 단백질 (예컨대 뉴클레아제, 전사 활성화인자/억제인자, 레콤비나제, 그의 변이 및 융합체를 포함한 Cas9 단백질 등)의 전달을 위한 양이온성 지질의 사용에 관한 것이다. 놀랍게도, 본원에서 기술되는 바와 같이, DNA 및 RNA와 같은 핵산의 전달을 위하여 조작된 기존의 리포솜 전달 반응물들이 시험관 내 및 생체 내 모두에서 소정 이펙터 단백질 (예컨대 그의 변이 및 융합체를 포함한 Cas9 단백질)을 효과적으로 전달한다는 것이 발견되었다. 핵산 전달은 리포솜 반응물의 개발로 인하여 지난 20년 동안 커다란 혜택을 받았다. 양이온성 리포솜 제제는 DNA 및 RNA 형질감염이 기초 연구에서 일상적인 기술이 되는 것, 및 심지어는 임상 시험에 사용되는 것을 가능케 하였다. 리포솜의 지질 이중층은 캡슐화된 핵산을 분해로부터 보호하며, 핵산의 네이키드 제제에 결합할 수 있는 항체에 의한 특이적 중화를 방지할 수 있다. 중요한 것은 엔도솜 성숙 동안의 엔도솜 멤브레인과의 리포솜의 융합이 양이온성 지질-전달 적재물의 고도로 효율적인 엔도솜 탈출을 가능케 할 수 있다는 것이다. 다른 비-양이온성이지만 가역적으로 이온화가능한 지질 나노입자 제제는 비-특이적인 정전기적 상호작용 및 이어지는 봉쇄(sequestration)를 피하면서도 효율적인 캡슐화 및 핵산 전달을 가능케 하였다. 그러나, 단백질들은 화학적으로 다양하고 그에 따라 고도로 음이온성인 핵산과는 다르기 때문에, 리포솜 제제가 효율적인 단백질 전달에 있어서 그만큼 성공적이지는 않았다. 예를 들어, 단백질이 시험관 내에서 비-특이적으로 캡슐화되어 재수화된 지질에 의해 전달될 수 있기는 하지만, 캡슐화의 효능이 단백질 농도에 따라 달라지며 일반적으로 비효율적이어서, 널리 보급된 적용을 나타내지는 않았다. 본 개시의 측면은 음이온성인 단백질 또는 단백질 복합체 (핵산과 회합되어 있는 단백질 포함)가 핵산 전달을 위하여 양이온성 리포솜 반응물에 의해 사용되는 동일한 정전기-유도 캡슐화의 장점을 취할 수 있을 수도 있다는 인식과 관련된다. 소수의 단백질들이 자연적으로 핵산의 포스페이트 백본에서 발견되는 음전하의 밀도를 보유하기는 하지만, 음이온성 운반체 예컨대 본원에서 기술되는 바와 같은 음으로 초하전된 단백질 또는 핵산에 대한 번역 융합 또는 그와의 비-공유 결합은 생성되는 이펙터 단백질 또는 단백질 복합체가 양이온성 리포솜 반응물에 의한 그와 같은 단백질 적재물의 효율적인 캡슐화를 유도하기에 충분하게 음이온성이 되게 한다.
일부 실시양태에서, 조작된 초음 하전된 GFP와의 회합 또는 융합은 핵산을 형질감염시키는 데에 일반적으로 사용되는 양이온성 지질에 의한 배양된 포유동물 세포로 가는 단백질의 효율적인 캡슐화 및 전달을 유도할 수 있다. 이와 같은 접근법은 낮은 나노몰 단백질 농도 및 혈청 부재하에서도 효과적이어서, 양이온성 펩티드 또는 단백질에의 융합을 사용하는 단백질 전달 방법에 비해 1,000-배까지 더 효율적인 기능성 단백질 전달로 이어진다. 실시예에 나타낸 바와 같이, 일부 실시양태에서, 전달 효능은 예를 들면 융합 태그의 이론적 순수 전하에 따라 달라지는데, 인기 있는 자연적으로 음이온성인 펩티드 태그, 예컨대 3xFLAG 및 VP64 역시 리포솜 단백질 전달을 가능케 할 수 있다.
실시예는 또한 다가음이온성 가이드 RNA (gRNA)와 결합된 Cas9 뉴클레아제 단백질이 이러한 일반적인 양이온성 리포솜 제제에 의해 포유동물 세포에 기능성인 형태로 효율적으로 전달될 수 있다는 것을 보여주고 있는데, 어떠한 특정 이론에도 얽매이고자 하는 것은 아니나, gRNA가 아니면 양이온성인 Cas9 단백질과 양이온성 지질 사이에서 다가음이온성 매개체로 작용하는 것으로 여겨지기 때문이다. Cas9:gRNA 복합체의 전달은 고도로 효율적일 뿐만 아니라 (단일 처리에 의한 80 %까지의 변형), 플라스미드 형질감염에 비해 현저하게 더 높은 게놈 변형 특이성으로 이어지기도 함으로써, 아마도 전달되는 Cas9:gRNA 활성의 일시적인 특성에 기인하는 통상적으로 >10-배 더 높은 표적 적중:표적을 벗어난 변형 비를 초래한다. 일부 실시양태에서, Cas9:gRNA 복합체의 전달은 적어도 2-배, 3-배, 4-배, 5-배, 6-배, 7-배, 8-배, 9-배, 10-배, 11-배, 12-배, 13-배, 14-배, 15-배, 20-배 또는 25-배 이상의 표적 적중:표적을 벗어난 변형 비를 초래한다. 실시예는 또한 예를 들면 기능성인 Cre 레콤비나제 및 기능성인 Cas9:gRNA 복합체를 마우스 내이의 유모세포에 전달하는 것에 의해, 이와 같은 단백질 전달 접근법이 생체 내에서 효과적일 수 있다는 것을 입증하고 있다.
따라서, 본 개시의 일부 측면은 Cas9 단백질 (예컨대 본원에서 기술되는 바와 같음; 예컨대 하기 Cas9 이펙터 단백질 참조), 및 세포의 내부에 Cas9 단백질을 전달할 수 있는 양이온성 지질을 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 예를 들면 복합체에 음이온성 전하를 제공함으로써 Cas9:gRNA 복합체가 양이온성 지질에 의해 캡슐화되는 것을 가능케 하는 gRNA와 회합된다. 일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 양이온성 지질에 의한 효과적인 캡슐화를 위하여 gRNA와 회합될 필요가 없으며, 대신 본원에서 기술되는 바와 같은 음으로 초하전된 단백질과 회합된다. Cas9 단백질이 음으로 초하전된 단백질과 회합되는 일부 실시양태에서는, Cas9 단백질이 gRNA와도 회합된다. 일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 야생형 Cas9 단백질, 야생형 Cas9 단백질의 단편, 또는 야생형 Cas9 단백질의 변이이다. 일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 dCas9 도메인 (예컨대 본원에서 기술되는 바와 같은 것)을 포함한다. 일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 dCas9 도메인 (예컨대 본원에서 기술되는 바와 같은 것)을 포함하는 융합 단백질이다. 일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 Cas9 니카제이다.
다른 실시양태에서는, 세포 내부에 (예컨대 세포의 핵에) 이펙터 단백질을 전달할 수 있는, 이펙터 단백질 (예컨대 Cas9 단백질이 아닌 다른 것) 및 양이온성 지질을 포함하는 조성물이 제공된다. 상기 이펙터 단백질은 자연적으로 음으로 하전된 것이거나, 순수한 전체 음전하를 가지도록 변형된 것이거나, 또는 본원에서 기술되는 바와 같은 음으로 초하전된 단백질과 회합된 것 중 어느 하나이다. 일부 실시양태에서, 이펙터 단백질은 본원에서 기술되는 임의의 이펙터 단백질이다. 일부 실시양태에서, 이펙터 단백질은 레콤비나제, 예컨대 본원에서 기술되는 임의의 레콤비나제이다. 일부 실시양태에서, 상기 레콤비나제는 Cre 레콤비나제이다. 일부 실시양태에서, 상기 Cre 레콤비나제는 서열 32의 아미노산 서열 (예컨대 6xHis 태그가 있거나 없음)을 포함한다. 일부 실시양태에서, Cre 레콤비나제는 서열 32의 아미노산 서열 (예컨대 6xHis 태그가 있거나 없음)과 80 % 이상, 85 % 이상, 90 % 이상, 95 % 이상, 98 % 이상 또는 99 % 이상 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, Cre 레콤비나제는 초하전 단백질 (예컨대 +36 GFP 또는 -30 GFP)에 융합된다. 일부 실시양태에서, 초하전 단백질에 융합된 Cre 레콤비나제는 서열 33 (예컨대 6xHis 태그가 있거나 없음) 또는 서열 34 (예컨대 6xHis 태그가 있거나 없음)의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 서열 33 또는 서열 34 (예컨대 6xHis 태그가 있거나 없음)의 아미노산 서열과 80 % 이상, 85 % 이상, 90 % 이상, 95 % 이상, 98 % 이상 또는 99 % 이상 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이펙터 단백질은 TALE 단백질 (예컨대 실시예에서 제공되는 것들을 포함하여 본원에서 기술되는 바와 같은 것)이다. 일부 실시양태에서, 상기 TALE 단백질은 하나 이상의 VP64 전사 활성화인자 도메인 (예컨대 서열 35)을 포함한다. 일부 실시양태에서, VP64 전사 활성화인자 도메인을 가지는 TALE 단백질은 서열 36-39 (예컨대 6xHis 태그가 있거나 없음)로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 추가적으로 포함한다. 일부 실시양태에서, VP64 전사 활성화인자 도메인을 가지는 TALE 단백질은 서열 36-39 (예컨대 6xHis 태그가 있거나 없음)로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열과 80 % 이상, 85 % 이상, 90 % 이상, 95 % 이상, 98 % 이상 또는 99 % 이상 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, TALE 이펙터 단백질은 (-30)GFP 도메인 (예컨대 서열 21 또는 서열 40), TALE 도메인의 N-말단 영역 (예컨대 서열 41), 가변 반복 도메인 (예컨대 문헌 [Maeder et al., "Robust, synergistic regulation of human gene expression using TALE activators." Nat. Methods. 2013; 10, 243-245]에 제공되어 있는 바와 같은 18.5mer 반복 도메인), C-말단 TALE 도메인 (예컨대 서열 42), VP64 활성화 도메인 (예컨대 서열 35), 그리고 임의적으로 임의 도메인들 사이의 하나 이상의 링커 (예컨대 GGS(9), 서열 252) 및 임의적으로 서열 태그 (예컨대 6xHis, 서열 253)를 포함한다.
DNA 및 RNA와 같은 적재물의 리포솜 전달이 표적으로 하는 세포에서 독성을 유도하는 것으로 알려져 있기는 하지만, 본원에서 기술되는 본 발명의 조성물은 시험관 내 및 생체 내 모두에서 놀랍게도 독성 없이, 또는 낮은 독성으로 그의 적재물을 전달한다는 것이 발견되었다. 예를 들어 일부 실시양태에서, Cas9 단백질 또는 본원에서 기술되는 다른 이펙터 단백질을 포함하는 조성물은 (예를 들면 시험관 내 또는 생체 내에서) 세포 군집에 투여되었을 때 낮은 독성을 나타낸다. 일부 실시양태에서는, Cas9 단백질 또는 다른 이펙터 단백질 및 양이온성 지질을 포함하는 본 발명 조성물의 투여 후, 군집 중 세포의 60 % 이상, 65 % 이상, 70 % 이상, 75 % 이상, 80 % 이상, 85 % 이상, 90 % 이상, 95 % 이상 또는 99 % 이상이 생존가능하다. 세포 군집에 투여되었을 때 조성물의 독성을 평가하는 방법에 대해서는 관련 기술분야에 잘 알려져 있으며, 실시예에서 기술되는 것들이 포함된다.
Cre-6xHis (6xHis 태그 밑줄침):
(+36)GFP-Cre-6xHis (+36 GFP 이중-밑줄침; 6xHis 태그 밑줄침):
(-30)GFP-Cre-6xHis (-30 GFP 이중-밑줄침; 6xHis 태그 밑줄침):
(+36)GFP-PPARγ-TALE-2 (+36 GFP 이중-밑줄침; 6xHis 태그 밑줄침):
(+36)GFP-PRDM16_TALE-3 (+36 GFP 이중-밑줄침; 6xHis 태그 밑줄침):
(-30)GFP-PPARγ-TALE-2 (-30 GFP 이중-밑줄침; 6xHis 태그 밑줄침):
(-30)GFP-PRDM16_TALE-3 (-30 GFP 이중-밑줄침; 6xHis 태그 밑줄침):
(-30)GFP:
N-말단 TALE 도메인:
C-말단 TALE 도메인:
VP64 활성화 도메인:
기능성 이펙터 단백질 및 양이온성 중합체의 조성물
본 개시의 소정 측면은 예를 들면 "네이키드" 단백질 제제를 전달하는 것과 반대되는 이펙터 단백질 (예컨대 뉴클레아제, 전사 활성화인자/억제인자, 레콤비나제, 그의 변이 및 융합체를 포함한 Cas9 단백질 등)의 전달을 위한 양이온성 중합체의 사용에 관한 것이다. 양이온성 지질에서와 마찬가지로, 본 개시의 측면은 음이온성인 단백질 또는 단백질 복합체 (핵산과 회합되어 있는 단백질 포함)가 기능성 이펙터 단백질의 전달을 위하여 양이온성 중합체에 의한 정전기-유도 캡슐화 및/또는 그와의 결합의 장점을 취할 수 있다는 인식과 관련된다. 소수의 단백질들이 자연적으로 핵산의 포스페이트 백본에서 발견되는 음전하의 밀도를 보유하기는 하지만, 음이온성 운반체 예컨대 본원에서 기술되는 바와 같은 음으로 초하전된 단백질 또는 핵산에 대한 번역 융합 또는 그와의 비-공유 결합은 생성되는 이펙터 단백질 또는 단백질 복합체가 양이온성 중합체에 의한 그와 같은 단백질 적재물의 효율적인 캡슐화/결합을 유도하기에 충분하게 음이온성이 되게 한다.
일부 실시양태에서, 조작된 초음 하전된 GFP와의 결합 또는 융합은 양이온성 중합체에 의한 배양된 포유동물 세포로 가는 단백질의 효율적인 캡슐화/결합 및 전달을 유도할 수 있다. 일부 실시양태에서는, 다가음이온성 가이드 RNA (gRNA)와 회합된 Cas9 단백질이 양이온성 중합체를 사용하여 포유동물 세포에 기능성인 형태로 효율적으로 전달될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서는, Cas9 단백질 및 양이온성 중합체를 포함하는 조성물이 제공되는데, 여기서 Cas9 단백질은 gRNA와 회합되고, 상기 조성물은 세포의 내부에 Cas9 단백질을 전달할 수 있다. 일부 실시양태에서, 양이온성 중합체를 사용한 Cas9:gRNA 복합체의 전달은 Cas9 단백질의 플라스미드 형질감염과 비교하였을 때 적어도 2-배, 3-배, 4-배, 5-배, 6-배, 7-배, 8-배, 9-배, 10-배, 11-배, 12-배, 13-배, 14-배, 15-배, 20-배 또는 25-배 이상인 표적 적중:표적을 벗어난 변형 비를 초래한다.
따라서, 본 개시의 일부 측면은 Cas9 단백질 (예컨대 본원에서 기술되는 바와 같음; 예컨대 하기 Cas9 이펙터 단백질 참조), 및 세포의 내부에 Cas9 단백질을 전달할 수 있는 양이온성 중합체를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 예를 들면 복합체에 음이온성 전하를 제공함으로써 Cas9:gRNA 복합체가 양이온성 중합체에 의해 캡슐화되고/거나 그와 회합되는 것을 가능케 하는 gRNA와 회합된다. 일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 양이온성 지질에 의한 효과적인 캡슐화 및/또는 그와의 결합을 위하여 gRNA와 회합될 필요가 없으며, 대신 본원에서 기술되는 바와 같은 음으로 초하전된 단백질과 회합된다. Cas9 단백질이 음으로 초하전된 단백질과 회합되는 일부 실시양태에서는, Cas9 단백질이 gRNA와도 회합된다. 일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 야생형 Cas9 단백질, 야생형 Cas9 단백질의 단편, 또는 야생형 Cas9 단백질의 변이이다. 일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 dCas9 도메인 (예컨대 본원에서 기술되는 바와 같은 것)을 포함한다. 일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 dCas9 도메인 (예컨대 본원에서 기술되는 바와 같은 것)을 포함하는 융합 단백질이다. 일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 Cas9 니카제이다.
다른 실시양태에서는, 세포 내부에 (예컨대 세포의 핵에) 이펙터 단백질을 전달할 수 있는, 이펙터 단백질 (예컨대 Cas9 단백질이 아닌 다른 것) 및 양이온성 중합체를 포함하는 조성물이 제공된다. 상기 이펙터 단백질은 자연적으로 음으로 하전된 것이거나, 순수한 전체 음전하를 가지도록 변형된 것이거나, 또는 본원에서 기술되는 바와 같은 음으로 초하전된 단백질과 회합된 것 중 어느 하나이다. 일부 실시양태에서, 이펙터 단백질은 본원에서 기술되는 임의의 이펙터 단백질이다. 일부 실시양태에서, 이펙터 단백질은 레콤비나제, 예컨대 본원에서 기술되는 임의의 레콤비나제이다. 일부 실시양태에서, 상기 레콤비나제는 Cre 레콤비나제이다. 일부 실시양태에서, 상기 Cre 레콤비나제는 서열 32의 아미노산 서열 (예컨대 6xHis 태그가 있거나 없음)을 포함한다. 일부 실시양태에서, Cre 레콤비나제는 서열 32의 아미노산 서열 (예컨대 6xHis 태그가 있거나 없음)과 80 % 이상, 85 % 이상, 90 % 이상, 95 % 이상, 98 % 이상 또는 99 % 이상 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, Cre 레콤비나제는 초하전 단백질 (예컨대 +36 GFP 또는 -30 GFP)에 융합된다. 일부 실시양태에서, 초하전 단백질에 융합된 Cre 레콤비나제는 서열 33 (예컨대 6xHis 태그가 있거나 없음) 또는 서열 34 (예컨대 6xHis 태그가 있거나 없음)의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 서열 33 또는 서열 34 (예컨대 6xHis 태그가 있거나 없음)의 아미노산 서열과 80 % 이상, 85 % 이상, 90 % 이상, 95 % 이상, 98 % 이상 또는 99 % 이상 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이펙터 단백질은 TALE 단백질 (예컨대 실시예에서 제공되는 것들을 포함하여 본원에서 기술되는 바와 같은 것)이다. 일부 실시양태에서, 상기 TALE 단백질은 하나 이상의 VP64 전사 활성화인자 도메인 (예컨대 서열 35)을 포함한다. 일부 실시양태에서, VP64 전사 활성화인자 도메인을 가지는 TALE 단백질은 서열 36-39 (예컨대 6xHis 태그가 있거나 없음)로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 추가적으로 포함한다. 일부 실시양태에서, VP64 전사 활성화인자 도메인을 가지는 TALE 단백질은 서열 36-39 (예컨대 6xHis 태그가 있거나 없음)로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열과 80 % 이상, 85 % 이상, 90 % 이상, 95 % 이상, 98 % 이상 또는 99 % 이상 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, TALE 이펙터 단백질은 (-30)GFP 도메인 (예컨대 서열 21 또는 서열 40), TALE 도메인의 N-말단 영역 (예컨대 서열 41), 가변 반복 도메인 (예컨대 문헌 [Maeder et al., "Robust, synergistic regulation of human gene expression using TALE activators." Nat. Methods. 2013; 10, 243-245]에 제공되어 있는 바와 같은 18.5mer 반복 도메인), C-말단 TALE 도메인 (예컨대 서열 42), VP64 활성화 도메인 (예컨대 서열 35), 그리고 임의적으로 임의 도메인들 사이의 하나 이상의 링커 (예컨대 GGS(9), 서열 252) 및 임의적으로 서열 태그 (예컨대 6xHis, 서열 253)를 포함한다.
일부 실시양태에서, Cas9 단백질 또는 본원에서 기술되는 다른 이펙터 단백질 및 양이온성 중합체를 포함하는 조성물은 (예를 들면 시험관 내 또는 생체 내에서) 세포 군집에 투여되었을 때 낮은 독성을 나타낸다. 일부 실시양태에서는, Cas9 단백질 또는 다른 이펙터 단백질 및 양이온성 중합체를 포함하는 본 발명 조성물의 투여 후, 군집 중 세포의 60 % 이상, 65 % 이상, 70 % 이상, 75 % 이상, 80 % 이상, 85 % 이상, 90 % 이상, 95 % 이상 또는 99 % 이상이 생존가능하다. 세포 군집에 투여되었을 때 조성물의 독성을 평가하는 방법에 대해서는 관련 기술분야에 잘 알려져 있으며, 실시예에서 기술되는 것들이 포함된다.
Cas9 이펙터 단백질
일부 실시양태에서는, RNA-프로그램가능 단백질 (또는 그의 단편 또는 변이)을 포함하는 이펙터 단백질이 본원에서 제공되는 시스템 또는 방법에 의해 표적 세포에 전달된다. 일부 실시양태에서는, RNA-가이드 또는 RNA-프로그램가능 뉴클레아제가 본원에서 제공되는 시스템 또는 방법에 의해 표적 세포에 전달된다. 일부 실시양태에서, 상기 RNA-프로그램가능 단백질은 본원에서 제공되는 시스템 또는 방법에 의해 표적 세포에 전달되는 Cas9 뉴클레아제, Cas9 변이 또는 Cas9 단백질의 융합체이다.
일부 실시양태에서, 상기 RNA-프로그램가능 뉴클레아제는 (CRISPR-연관 시스템) Cas9 엔도뉴클레아제, 예를 들면 스트렙토코쿠스 파이오제네스(Streptococcus pyogenes) 유래의 Cas9 (Csn1)이다 (예를 들면 각각의 전체 내용이 본원에 참조로 포함되는 문헌 ["Complete genome sequence of an M1 strain of Streptococcus pyogenes." Ferretti J.J., McShan W.M., Ajdic D.J., Savic D.J., Savic G., Lyon K., Primeaux C, Sezate S., Suvorov A.N., Kenton S., Lai H.S., Lin S.P., Qian Y., Jia H.G., Najar F.Z., Ren Q., Zhu H., Song L. expand/collapse author list McLaughlin R.E., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98:4658-4663(2001)]; ["CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III." Deltcheva E., Chylinski K., Sharma C.M., Gonzales K., Chao Y., Pirzada Z.A., Eckert M.R., Vogel J., Charpentier E., Nature 471:602-607(2011)]; 및 ["A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity." Jinek M., Chylinski K., Fonfara I., Hauer M., Doudna J.A., Charpentier E. Science 337:816-821(2012)] 참조). RNA-프로그램가능 뉴클레아제 (예컨대 Cas9)는 표적 DNA 절단 부위를 결정하는 데에 RNA:DNA 혼성화를 사용하기 때문에, 원칙적으로 이러한 단백질은 가이드 RNA에 의해 특정되는 어떠한 서열도 절단할 수 있다. 부위-특이적 절단 (예컨대 게놈을 변형시키기 위한 것)을 위한 Cas9와 같은 RNA-프로그램가능 뉴클레아제의 사용 방법에 대해서는 관련 기술분야에 알려져 있다 (예를 들면 각각의 전체 내용이 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Cong, L. et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science 339, 819-823 (2013)]; [Mali, P. et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science 339, 823-826 (2013)]; [Hwang, W.Y. et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nature biotechnology 31, 227-229 (2013)]; [Jinek, M. et al. RNA-programmed genome editing in human cells. eLife 2, e00471 (2013)]; [Dicarlo, J.E. et al. Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems. Nucleic acids research (2013)]; [Jiang, W. et al. RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Nature biotechnology 31, 233-239 (2013)] 참조).
Cas9 뉴클레아제는 때로는 casn1 뉴클레아제 또는 CRISPR (군집화된 규칙적으로 이격된 짧은 팔린드롬 반복체)-연관 뉴클레아제로도 지칭될 수 있다. CRISPR은 이동성인 유전자 요소 (바이러스, 전위가능 요소 및 접합성 플라스미드)에 대한 보호를 제공하는 적응성 면역 시스템이다. CRISPR 군집은 스페이서, 선행 이동성 요소에 상보성인 서열, 및 표적 침습 핵산을 포함한다. CRISPR 군집은 CRISPR RNA (crRNA)로 전사 및 프로세싱된다. 유형 II CRISPR 시스템에서, 예비-crRNA의 올바른 프로세싱은 트랜스-코딩된 소형 RNA (tracrRNA), 내인성 리보뉴클레아제 3 (rnc) 및 Cas9 단백질을 필요로 한다. 상기 tracrRNA는 예비-crRNA의 리보뉴클레아제 3-보조 프로세싱을 위한 안내자로서 작용한다. 이후, Cas9/crRNA/tracrRNA가 스페이서에 상보성인 선형 또는 원형의 dsDNA 표적을 내부핵산분해로(endonucleolytically) 절단한다. crRNA에 상보성이 아닌 표적 가닥은 먼저 내부핵산분해로 절단된 다음, 3'-5' 외부핵산분해로(exonucleolytically) 트리밍된다. 자연상에서, DNA-결합 및 절단은 통상적으로 단백질 및 양 RNA를 필요로 한다. 그러나, 단일 가이드 RNA ("sgRNA" 또는 간단히 "gRNA")가 단일 RNA 종에 crRNA 및 tracrRNA 양자의 측면을 통합하도록 조작될 수 있다. 예를 들면 그의 전체 내용이 의거 참조로 포함되는 문헌 [Jinek M., Chylinski K., Fonfara I., Hauer M., Doudna J.A., Charpentier E. Science 337:816-821(2012)]을 참조하라. Cas9는 비-자기에 대비하여 자기를 구별하는 것을 돕기 위하여 CRISPR 반복 서열 내의 짧은 모티프 (PAM 또는 프로토스페이서 인접 모티프)를 인식한다. Cas9 뉴클레아제의 서열 및 구조에 대해서는 통상의 기술자에게 잘 알려져 있다 (예를 들면 각각의 전체 내용이 본원에 참조로 포함되는 문헌 ["Complete genome sequence of an M1 strain of Streptococcus pyogenes." Ferretti J.J., McShan W.M., Ajdic D.J., Savic D.J., Savic G., Lyon K., Primeaux C, Sezate S., Suvorov A.N., Kenton S., Lai H.S., Lin S.P., Qian Y., Jia H.G., Najar F.Z., Ren Q., Zhu H., Song L. expand/collapse author list McLaughlin R.E., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98:4658-4663(2001)]; ["CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III." Deltcheva E., Chylinski K., Sharma C.M., Gonzales K., Chao Y., Pirzada Z.A., Eckert M.R., Vogel J., Charpentier E., Nature 471:602-607(2011)]; 및 ["A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity." Jinek M., Chylinski K., Fonfara I., Hauer M., Doudna J.A., Charpentier E. Science 337:816-821(2012)] 참조).
비제한적으로 에스. 파이오제네스 및 에스. 서모필루스를 포함한 다양한 종들에서 Cas9 오르소로그(ortholog)들이 기술되어 있다. 추가적인 적합한 Cas9 뉴클레아제 및 서열들이 본 개시를 바탕으로 통상의 기술자에게 드러나게 될 것인 바, 그와 같은 Cas9 뉴클레아제 및 서열에는 그의 전체 내용이 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Chylinski, Rhun, and Charpentier, "The tracrRNA and Cas9 families of type II CRISPR-Cas immunity systems" (2013) RNA Biology 10:5, 726-737]에 개시되어 있는 생물체 및 좌위 유래의 Cas9 서열들이 포함된다. 일부 실시양태에서, Cas9 단백질 또는 그의 단편을 포함하는 단백질은 "Cas9 변이"로 지칭된다. Cas9 변이는 Cas9 또는 그의 단편에 대하여 상동성을 공유한다. 예를 들어, Cas9 변이는 야생형 Cas9와 약 70 % 이상 동일하거나, 약 80 % 이상 동일하거나, 약 90 % 이상 동일하거나, 약 95 % 이상 동일하거나, 약 98 % 이상 동일하거나, 약 99 % 이상 동일하거나, 약 99.5 % 이상 동일하거나, 또는 약 99.9 % 이상 동일하다. 일부 실시양태에서, Cas9 변이는 단편이 상응하는 야생형 Cas9의 단편과 약 70 % 이상 동일하거나, 약 80 % 이상 동일하거나, 약 90 % 이상 동일하거나, 약 95 % 이상 동일하거나, 약 98 % 이상 동일하거나, 약 99 % 이상 동일하거나, 약 99.5 % 이상 동일하거나, 또는 약 99.9 % 이상 동일하도록 Cas9의 단편 (예컨대 gRNA 결합 도메인 또는 DNA-절단 도메인, N-말단 도메인 또는 C-말단 도메인 등)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 야생형 Cas9는 스트렙토코쿠스 파이오제네스 (NCBI 참조 서열: NC_017053.1, 서열 43 (뉴클레오티드); 서열 44 (아미노산)) 유래의 Cas9에 상응한다. 일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 불활성인 (예컨대 불활성화된) DNA 절단 도메인을 가진다. 뉴클레아제-불활성화된 Cas9 단백질은 "dCas9" 단백질 (뉴클레아제 "폐쇄(dead)" Cas9)로 호환가능하게 지칭될 수 있다. 일부 실시양태에서, dCas9는 하기에 서열 45로 제시되어 있는 아미노산에 상응하거나, 또는 그의 일부 또는 전체를 포함한다. 일부 실시양태에서는, dCas9의 변이 (예컨대 서열 45의 변이)가 제공된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서는, 뉴클레아제 불활성화 Cas9 (dCas9)를 초래하는, D10A 및 H840A가 아닌 다른 돌연변이를 가지는 변이가 제공된다. 그와 같은 돌연변이에는 예를 들자면 D10 및 H840에서의 다른 아미노산 치환, 또는 Cas9의 뉴클레아제 도메인 내에서의 다른 치환 (예컨대 HNH 뉴클레아제 하위도메인 및/또는 RuvC1 하위도메인에서의 치환)이 포함된다. 일부 실시양태에서는, 서열 45와 약 70 % 이상 동일하거나, 약 80 % 이상 동일하거나, 약 90 % 이상 동일하거나, 약 95 % 이상 동일하거나, 약 98 % 이상 동일하거나, 약 99 % 이상 동일하거나, 약 99.5 % 이상 동일하거나, 또는 약 99.9 % 이상 동일한 dCas9의 변이 또는 상동체 (예컨대 서열 45의 변이)가 제공된다. 일부 실시양태에서는, 약 5개 아미노산, 약 10개 아미노산, 약 15개 아미노산, 약 20개 아미노산, 약 25개 아미노산, 약 30개 아미노산, 약 40개 아미노산, 약 50개 아미노산, 약 75개 아미노산, 약 100개 아미노산, 또는 그 이상 만큼 서열 45에 비해 더 짧거나 더 긴 아미노산 서열을 가지는 dCas9의 변이 (예컨대 서열 45의 변이)가 제공된다. 일부 실시양태에서는, Cas9의 단일 뉴클레아제 도메인을 불활성화하는 돌연변이를 포함하는 Cas9 "니카제"가 제공된다. 그와 같은 니카제는 이중 가닥 파단과 반대로 표적 핵산에서 단일 가닥 파단을 유도한다.
Cas9
(단일 밑줄: HNH 도메인; 이중 밑줄: RuvC 도메인)
dCas9 (D10A 및 H840A):
(단일 밑줄: HNH 도메인; 이중 밑줄: RuvC 도메인)
Cas9 니카제 (D10A):
일부 실시양태에서는, 본원에서 기술되는 조성물 및 방법들 중 어느 것에서 사용하기 위하여, Cas9 단백질을 포함하는 융합 단백질이 제공된다. 일부 실시양태에서, 상기 융합 단백질은 dCas9 단백질 (예컨대 본원에서 기술되는 바와 같은 것)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질은 dCas9와 하나 이상의 도메인 (예컨대 효소 도메인) 사이에 링커 (예컨대 본원에서 기술되는 바와 같은 것)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질은 dCas9와 전사 활성화인자 도메인, 전사 억제인자 도메인, 레콤비나제 도메인, 유전자 편집 도메인 (예컨대 데아미나제 도메인) 또는 후성 변형인자 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공되는 대표적인 융합 단백질의 일반적인 구성은 하기의 구조를 포함하는데:
[NH2]-[효소 도메인]-[dCas9]-[COOH] 또는
[NH2]-[dCas9]-[효소 도메인]-[COOH];
여기서 NH2는 융합 단백질의 N-말단이며, COOH는 융합 단백질의 C-말단이고, 효소 도메인은 뉴클레아제 도메인 (예컨대 FokI), 레콤비나제 촉매 도메인 (예컨대 Hin, Gin 또는 Tn3 레콤비나제 도메인), 핵산-편집 도메인 (예컨대 데아미나제 도메인), 전사 활성화인자 도메인 (예컨대 VP64, p65), 전사 억제인자 도메인 (예컨대 KRAB, SID) 또는 후성 변형인자 (예컨대 LSD1 히스톤 데메틸라제, TET1 히드록실라제)를 포함한다.
추가적인 특징은 예를 들면 소정 도메인들 사이의 하나 이상의 링커 서열로 제공될 수 있다. 제공될 수 있는 다른 대표적인 특징은 국재화 서열, 예컨대 핵 국재화 서열 (NLS; 예컨대 MAPKKKRKVGIHRGVP (서열 47)); 세포질 국재화 서열; 외수송 서열, 예컨대 핵 외수송 서열; 또는 다른 국재화 서열은 물론, 융합 단백질의 가용화, 정제 또는 검출에 유용한 서열 태그이다. 적합한 국재화 신호 서열 및 단백질 태그의 서열들이 본원에서 제공되는 바, 관련 기술분야에 알려져 있는 것으로써, 바이오틴 카르복실라제 운반체 단백질 (BCCP) 태그, myc-태그, 칼모둘린-태그, FLAG-태그 (예컨대 3xFLAG 태그: MDYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK (서열 48)), 헤마글루티닌 (HA) 태그, 히스티딘 태그 또는 His-태그로도 지칭되는 폴리히스티딘 태그, 말토스 결합 단백질 (MBP)-태그, nus-태그, 글루타치온-S-트랜스퍼라제 (GST) 태그, 녹색 형광 단백질 (GFP) 태그, 티오레독신-태그, S-태그, 소프태그(Softag) (예컨대 소프태그 1, 소프태그 3), strep-태그, 바이오틴 리가제 태그, FlAsH 태그, V5 태그 및 SBP-태그가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 통상의 기술자라면, 추가적인 적합한 서열들을 알고 있을 것이다.
일부 실시양태에서, 상기 효소 도메인은 뉴클레아제 또는 그의 촉매 도메인을 포함한다. 예를 들면, 일부 실시양태에서, 뉴클레아제 도메인을 가지는 대표적인 리간드-의존성 dCas9 융합 단백질의 일반적인 구성은 하기의 구조를 포함하는데:
[NH2]-[NLS]-[dCas9]-[뉴클레아제]-[COOH]
[NH2]-[NLS]-[뉴클레아제]-[dCas9]-[COOH]
[NH2]-[dCas9]-[뉴클레아제]-[COOH] 또는
[NH2]-[뉴클레아제]-[dCas9]-[COOH];
여기서 NLS는 핵 국재화 신호이며, NH2는 융합 단백질의 N-말단이고, COOH는 융합 단백질의 C-말단이다. 일부 실시양태에서는, dCas9와 뉴클레아제 도메인 사이에 링커가 삽입된다. 일부 실시양태에서는, NLS와 뉴클레아제 및/또는 dCas9 도메인 사이에 링커가 삽입된다. 일부 실시양태에서, NLS는 뉴클레아제 및/또는 dCas9 도메인의 C-말단에 위치된다. 일부 실시양태에서, NLS는 뉴클레아제와 dCas9 도메인 사이에 위치된다. 서열 태그와 같은 추가적인 특징들이 존재할 수도 있다. 일부 측면에서, 뉴클레아제 도메인은 표적 핵산 (예컨대 DNA)을 절단하기 위해서는 이량체화 (예컨대 2개 뉴클레아제 단량체의 합침)를 필요로 하는 뉴클레아제이다. 일부 실시양태에서, 뉴클레아제 도메인은 FokI DNA 절단 도메인의 단량체이다. FokI DNA 절단 도메인에 대해서는 알려져 있는데, 일부 측면에서는 FokI (NCBI 등재 번호 J04623)의 아미노산 388-583에 상응한다. 일부 실시양태에서, FokI DNA 절단 도메인은 FokI의 아미노산 300-583, 320-583, 340-583 또는 360-583에 상응한다. 각각의 전체 내용이 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Wah et al., "Structure of FokI has implications for DNA cleavage" Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998; 1;95(18):10564-9]; [Li et al., "TAL nucleases (TALNs): hybrid proteins composed of TAL effectors and FokI DNA-cleavage domain" Nucleic Acids Res. 2011; 39(l):359-72]; [Kim et al., "Hybrid restriction enzymes: zinc finger fusions to FokI cleavage domain" Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1996; 93:1156-1160]도 참조하라. 일부 실시양태에서, FokI DNA 절단 도메인은 서열 49로 제시되어 있는 아미노산 서열에 상응하거나, 그의 일부 또는 전부를 포함한다. 일부 실시양태에서, FokI DNA 절단 도메인은 본원에서 기술되는 바와 같은 FokI의 변이 (예컨대 서열 49의 변이)이다. 다른 대표적인 dCas9-뉴클레아제 융합 단백질의 조성물 및 방법에 대해서는 그의 전체 내용이 본원에 참조로 포함되는 2014년 6월 30일자 발명의 명칭 "Cas9-FokI fusion Proteins and Uses Thereof"의 U.S. 특허 출원 U.S.S.N 14/320,498호에서 찾아볼 수 있다.
FokI 뉴클레아제 도메인:
fCas9 (예컨대 dCas9-NLS-GGS3링커-FokI):
fCas9 (예컨대 NLS-dCas9-GGS3링커-FokI):
fCas9 (예컨대 FokI-GGS3링커-dCas9-NLS):
fCas9 (예컨대 NLS-FokI-GGS3링커-dCas9):
fCas9:
일부 실시양태에서, 상기 효소 도메인은 레콤비나제 또는 그의 촉매 도메인을 포함한다. 예를 들면, 일부 실시양태에서, 레콤비나제 도메인을 가지는 대표적인 리간드-의존성 dCas9 융합 단백질의 일반적인 구성은 하기의 구조를 포함하는데:
[NH2]-[NLS]-[dCas9]-[레콤비나제]-[COOH]
[NH2]-[NLS]-[레콤비나제]-[dCas9]-[COOH]
[NH2]-[dCas9]-[레콤비나제] -[COOH] 또는
[NH2]-[레콤비나제]-[dCas9]-[COOH];
여기서 NLS는 핵 국재화 신호이며, NH2는 융합 단백질의 N-말단이고, COOH는 융합 단백질의 C-말단이다. 일부 실시양태에서는, dCas9와 레콤비나제 도메인 사이에 링커가 삽입된다. 일부 실시양태에서는, NLS와 레콤비나제 및/또는 dCas9 도메인 사이에 링커가 삽입된다. 일부 실시양태에서, NLS는 레콤비나제 도메인 및/또는 dCas9 도메인의 C-말단에 위치된다. 일부 실시양태에서, NLS는 레콤비나제 도메인과 dCas9 도메인 사이에 위치된다. 서열 태그와 같은 추가적인 특징들이 존재할 수도 있다. "레콤비나제의 촉매 도메인"은 도메인이 (단독, 또는 융합 단백질의 일부를 형성할 수 있거나 형성하지 않을 수 있는 다른 레콤비나제 촉매 도메인을 포함한 추가적인 인자와 함께 중 어느 하나로) 표적 핵산과 접촉되었을 때 재조합을 유도하기에 충분하도록 하는 레콤비나제의 (예컨대 그로부터 유래하는) 아미노산 서열을 포함하는 도메인을 융합 단백질이 포함하고 있다는 것을 의미한다. 일부 실시양태에서, 레콤비나제의 촉매 도메인은 레콤비나제의 DNA 결합 도메인을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 레콤비나제의 촉매 도메인은 레콤비나제의 일부 또는 전부를 포함하는데, 예를 들면 상기 촉매 도메인은 레콤비나제 도메인 및 DNA 결합 도메인, 또는 그의 일부를 포함할 수 있거나, 또는 촉매 도메인은 레콤비나제 도메인, 및 DNA 결합 활성을 폐기하기 위하여 돌연변이되거나 감축된 DNA 결합 도메인을 포함할 수 있다. 레콤비나제 및 레콤비나제의 촉매 도메인에 대해서는 통상의 기술자에게 알려져 있는데, 예를 들면 본원에서 기술되는 것들이 포함된다. 일부 실시양태에서, 촉매 도메인은 임의의 레콤비나제로부터 유래한다. 일부 실시양태에서, 레콤비나제 촉매 도메인은 Tn3 리솔바제, Hin 레콤비나제 또는 Gin 레콤비나제의 촉매 도메인이다. 일부 실시양태에서, 촉매 도메인은 하기에서 제공되는 바와 같은 서열 55의 일부 또는 전부를 포함하는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 Tn3 리솔바제 (예컨대 스타크(Stark) Tn3 레콤비나제)를 포함한다. 일부 실시양태에서, Tn3 촉매 도메인은 서열 55의 변이에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, Tn3 촉매 도메인은 서열 56에 상당하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (또는 그의 변이)에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 촉매 도메인은 하기에서 제공되는 바와 같은 서열 57의 일부 또는 전부를 포함하는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 Hin 레콤비나제를 포함한다. 일부 실시양태에서, Hin 촉매 도메인은 서열 57의 변이에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, Hin 촉매 도메인은 서열 58에 상당하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (또는 그의 변이)에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 촉매 도메인은 하기에서 제공되는 바와 같은 서열 59의 일부 또는 전부를 포함하는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 Gin 레콤비나제 (예컨대 Gin 베타 레콤비나제)를 포함한다. 일부 실시양태에서, Gin 촉매 도메인은 서열 59의 변이에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, Gin 촉매 도메인은 서열 60에 상당하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (또는 그의 변이)에 의해 코딩된다. dCas9-레콤비나제 융합 단백질의 다른 대표적인 조성물 및 사용 방법은 그의 전체 내용이 본원에 참조로 포함되는 2014년 6월 30일자 발명의 명칭 "Cas9 Variants and Uses Thereof"의 U.S. 특허 출원 U.S.S.N 14/320,467호에서 찾아볼 수 있다.
스타크 Tn3 레콤비나제 (뉴클레오티드: 서열 55; 아미노산: 서열 56):
Hin 레콤비나제 (뉴클레오티드: 서열 57; 아미노산: 서열 58):
Gin 베타 레콤비나제 (뉴클레오티드: 서열 59; 아미노산: 서열 60):
일부 실시양태에서, 상기 효소 도메인은 데아미나제 또는 그의 촉매 도메인을 포함한다. 예를 들면, 일부 실시양태에서, 데아미나제 효소 또는 도메인을 가지는 대표적인 dCas9 융합 단백질의 일반적인 구성은 하기의 구조를 포함하는데:
[NH2]-[NLS]-[Cas9]-[데아미나제]-[COOH]
[NH2]-[NLS]-[데아미나제]-[Cas9]-[COOH]
[NH2]-[Cas9]-[데아미나제] -[COOH] 또는
[NH2]-[데아미나제]-[Cas9]-[COOH];
여기서 NLS는 핵 국재화 신호이며, NH2는 융합 단백질의 N-말단이고, COOH는 융합 단백질의 C-말단이다. 일부 실시양태에서는, dCas9와 데아미나제 도메인 사이에 링커가 삽입된다. 일부 실시양태에서는, NLS와 데아미나제 및/또는 dCas9 도메인 사이에 링커가 삽입된다. 일부 실시양태에서, NLS는 데아미나제 및/또는 dCas9 도메인의 C-말단에 위치된다. 일부 실시양태에서, NLS는 데아미나제 도메인과 dCas9 도메인 사이에 위치된다. 서열 태그와 같은 추가적인 특징들이 존재할 수도 있다. 핵산-편집 효소 및 도메인의 한 가지 대표적인 적합한 유형은 예를 들면 활성화-유도 시티딘 데아미나제 (AID) 및 아포지질단백질 B 편집 복합체 3 (APOBEC3) 효소를 포함한 시토신 데아미나제 효소의 아포지질단백질 B mRNA-편집 복합체 (APOBEC) 계열의 시토신 데아미나제이다. 본 발명에 사용하기에 적합한 핵산-편집 효소 및 그의 도메인의 또 다른 대표적인 적합한 유형에는 아데노신 데아미나제가 포함된다. 예를 들면, ADAT 계열 아데노신 데아미나제가 dCas9 도메인에 융합될 수 있다. 본개시의 측면에 따라 dCas9 도메인에 융합될 수 있는 일부 대표적인 적합한 핵산 편집 효소 및 도메인, 예컨대 데아미나제 및 데아미나제 도메인에 대해서는 하기에서 제공된다. 일부 실시양태에서 각 서열의 활성인 도메인, 예를 들면 국재화 신호 (핵 외수송 신호 없는 핵 국재화 신호, 세포질 국재화 신호)가 없는 도메인이 사용될 수 있다는 것은 알고 있을 것이다. dCas9-뉴클레아제 융합 단백질의 다른 대표적인 조성물 및 사용 방법은 그의 전체 내용이 본원에 참조로 포함되는 2014년 7월 8일자 발명의 명칭 "Fusions of Cas9 Domains and Nucleic Acid-Editing Domains"의 U.S. 특허 출원 U.S.S.N 14/325,815호에서 찾아볼 수 있다.
인간 AID:
(밑줄: 핵 국재화 신호; 이중 밑줄: 핵 외수송 신호)
마우스 AID:
(밑줄: 핵 국재화 신호; 이중 밑줄: 핵 외수송 신호)
개 AID:
(밑줄: 핵 국재화 신호; 이중 밑줄: 핵 외수송 신호)
소 AID
(밑줄: 핵 국재화 신호; 이중 밑줄: 핵 외수송 신호)
마우스 APOBEC-3:
(밑줄: 핵산 편집 도메인)
래트 APOBEC-3:
(밑줄: 핵산 편집 도메인)
레서스 마카크 APOBEC-3G:
(굵은 이탤릭체: 핵산 편집 도메인; 밑줄: 세포질 국재화 신호)
침팬지 APOBEC-3G:
(밑줄: 핵산 편집 도메인; 이중 밑줄: 세포질 국재화 신호)
사바나 원숭이 APOBEC-3G:
(밑줄: 핵산 편집 도메인; 이중 밑줄: 세포질 국재화 신호)
인간 APOBEC-3G:
(밑줄: 핵산 편집 도메인; 이중 밑줄: 세포질 국재화 신호)
인간 APOBEC-3F:
(밑줄: 핵산 편집 도메인)
인간 APOBEC-3B:
(밑줄: 핵산 편집 도메인)
인간 APOBEC-3C:
(밑줄: 핵산 편집 도메인)
인간 APOBEC-3A:
(밑줄: 핵산 편집 도메인)
인간 APOBEC-3H:
(밑줄: 핵산 편집 도메인)
인간 APOBEC-3D:
(밑줄: 핵산 편집 도메인)
인간 APOBEC-1:
마우스 APOBEC-1:
래트 APOBEC-1:
인간 ADAT-2:
마우스 ADAT-2:
마우스 ADAT-1:
(밑줄: 핵산 편집 도메인)
인간 ADAT-1:
(밑줄: 핵산 편집 도메인)
일부 실시양태에서, 상기 효소 도메인은 1종 이상의 전사 활성화인자를 포함한다. 예를 들면, 일부 실시양태에서, 전사 활성화인자 도메인을 가지는 대표적인 dCas9 융합 단백질의 일반적인 구성은 하기의 구조를 포함하는데:
[NH2]-[NLS]-[Cas9]-[(전사 활성화인자)n]-[COOH]
[NH2]-[NLS]-[(전사 활성화인자)n]-[Cas9]-[COOH]
[NH2]-[Cas9]-[(전사 활성화인자)n] -[COOH] 또는
[NH2]-[(전사 활성화인자)n]-[Cas9]-[COOH];
여기서 NLS는 핵 국재화 신호이며, NH2는 융합 단백질의 N-말단이고, COOH는 융합 단백질의 C-말단이다. 일부 실시양태에서, 상기 융합 단백질은 하나 이상의 전사 활성화인자 반복체를 포함하는데, 예를 들면 여기서 n = 1-10이다 (예컨대 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10임). 일부 실시양태에서, n = 1-20이다. 일부 실시양태에서는, dCas9와 전사 활성화인자 도메인 사이에 링커가 삽입된다. 일부 실시양태에서는, NLS와 전사 활성화인자 및/또는 dCas9 도메인 사이에 링커가 삽입된다. 일부 실시양태에서, NLS는 전사 활성화인자 및/또는 dCas9 도메인의 C-말단에 위치된다. 일부 실시양태에서, NLS는 전사 활성화인자 도메인과 dCas9 도메인 사이에 위치된다. 서열 태그와 같은 추가적인 특징들이 존재할 수도 있다. 일부 실시양태에서, 전사 활성화인자는 VP64 (서열 84 또는 서열 35), VP16 (서열 85) 및 p65 (서열 86)로 이루어진 군에서 선택된다. 일부 실시양태에서는, dCas9-VP64 융합 단백질이 서열 87의 아미노산 서열 (예컨대 6xHis 태그가 있거나 없음)을 포함하거나, 또는 서열 87의 아미노산 서열 (예컨대 6xHis 태그가 있거나 없음)과 80 % 이상, 85 % 이상, 90 % 이상, 95 % 이상, 98 % 이상 또는 99 % 이상 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
VP64:
VP16:
p65:
dCas9-VP64-6xHis:
일부 실시양태에서, 상기 효소 도메인은 1종 이상의 전사 억제인자를 포함한다. 예를 들면, 일부 실시양태에서, 전사 억제인자 도메인을 가지는 대표적인 dCas9 융합 단백질의 일반적인 구성은 하기의 구조를 포함하는데:
[NH2]-[NLS]-[Cas9]-[(전사 억제인자)n]-[COOH]
[NH2]-[NLS]-[(전사 억제인자)n]-[Cas9]-[COOH]
[NH2]-[Cas9]-[(전사 억제인자)n] -[COOH] 또는
[NH2]-[(전사 억제인자)n]-[Cas9]-[COOH];
여기서 NLS는 핵 국재화 신호이며, NH2는 융합 단백질의 N-말단이고, COOH는 융합 단백질의 C-말단이다. 일부 실시양태에서, 상기 융합 단백질은 하나 이상의 전사 억제인자 반복체를 포함하는데, 예를 들면 n = 1-10이다 (예컨대 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10임). 일부 실시양태에서, n = 1-20이다. 일부 실시양태에서는, dCas9와 전사 억제인자 도메인 사이에 링커가 삽입된다. 일부 실시양태에서는, NLS와 전사 억제인자 및/또는 dCas9 도메인 사이에 링커가 삽입된다. 일부 실시양태에서, NLS는 전사 억제인자 및/또는 dCas9 도메인의 C-말단에 위치된다. 일부 실시양태에서, NLS는 전사 억제인자 도메인과 dCas9 도메인 사이에 위치된다. 서열 태그와 같은 추가적인 특징들이 존재할 수도 있다. 일부 실시양태에서, 전사 억제인자는 Kox1의 KRAB (크뤼펠 연관 박스(Kruppel associated box)) 도메인, SID (mSin3 상호작용 도메인), HP1α의 CS (크로모 섀도우(Chromo Shadow)) 도메인 또는 Hes1의 WRPW 도메인으로 이루어진 군에서 선택된다. 이들 및 다른 억제인자 도메인에 대해서는 관련 기술분야에 알려져 있는데, 일부 실시양태에서는 그의 전체 내용이 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Urrutia, KRAB-containing zinc-finger repressor proteins. Genome Biol. 2003;4(10):231]; [Gilbert et al. CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes. Cell. 2013; 154, 442-451]; [Konermann et al., Optical control of mammalian endogenous transcription and epigenetic states. Nature. 2013; 500, 472-476]; 및 U.S. 2014/0186958 A1호로서 공개된 U.S. 특허 출원 U.S.S.N. 14/105,017호에 기술되어 있는 것들이 해당된다. 일부 실시양태에서, 전사 억제인자 도메인은 하나 이상의 KRAB 도메인 반복체 (예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 반복체)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 KRAB 도메인은 서열 88-91로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 전사 억제인자 도메인은 하나 이상의 SID 단백질 반복체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 SID 단백질은 서열 80으로 제시되어 있는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 억제인자 도메인은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 SID 단백질 (예컨대 서열 92) 반복체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 억제인자 도메인은 4개의 SID 반복체 (예컨대 SID4x; 서열 93)를 포함한다.
KRAB (인간; 진뱅크: AAD20972.1)
KRAB 단백질 도메인, 부분적 (인간; 진뱅크: CAB52478.1):
KRAB A 도메인, 부분적 (인간; 진뱅크: AAB03530.1):
KRAB (마우스; C2H2 유형 도메인 포함 단백질; 진뱅크: CAM27971.1):
SID 억제인자 도메인:
SID4x 억제인자 도메인:
일부 실시양태에서, 상기 효소 도메인은 후성 변형인자 또는 그의 촉매 도메인을 포함한다. 예를 들면, 일부 실시양태에서, 후성 변형인자 또는 도메인을 가지는 대표적인 dCas9 융합 단백질의 일반적인 구성은 하기의 구조를 포함하는데:
[NH2]-[NLS]-[Cas9]-[후성 변형인자]-[COOH]
[NH2]-[NLS]-[후성 변형인자]-[Cas9]-[COOH]
[NH2]-[Cas9]-[후성 변형인자] -[COOH] 또는
[NH2]-[후성 변형인자]-[Cas9]-[COOH];
여기서 NLS는 핵 국재화 신호이며, NH2는 융합 단백질의 N-말단이고, COOH는 융합 단백질의 C-말단이다. 일부 실시양태에서는, dCas9와 후성 변형인자 도메인 사이에 링커가 삽입된다. 일부 실시양태에서는, NLS와 후성 변형인자 및/또는 dCas9 도메인 사이에 링커가 삽입된다. 일부 실시양태에서, NLS는 후성 변형인자 및/또는 dCas9 도메인의 C-말단에 위치된다. 일부 실시양태에서, NLS는 후성 변형인자 도메인과 dCas9 도메인 사이에 위치된다. 서열 태그와 같은 추가적인 특징들이 존재할 수도 있다. 후성 변형인자에 대해서는 관련 기술분야에 잘 알려져 있는데, 통상적으로 DNA 메틸화 (및 탈메틸화) 또는 히스톤 변형 (예컨대 히스톤 메틸화/탈메틸화, 아세틸화/탈아세틸화, 유비퀴틸화, 인산화, 수모일화 등)을 촉매한다. 하나 이상 후성 변형인자의 존재는 예를 들면 유전자를 "켜짐" 상태로부터 "꺼짐" 상태로 전환함으로써, 하나 이상 유전자의 전사 활성에 영향을 줄 수 있으며, 그 반대도 마찬가지이다. 후성 변형인자에는 히스톤 데메틸라제, 히스톤 메틸트랜스퍼라제, 히드록실라제, 히스톤 데아세틸라제 및 히스톤 아세틸트랜스퍼라제가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 대표적인 후성 변형 단백질에 대해서는 각각의 전체 내용이 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Konermann et al., Optical control of mammalian endogenous transcription and epigenetic states. Nature. 2013; 500, 472-476]; [Mendenhall et al., Locus-specific editing of histone modifications at endogenous enhancers. Nat. Biotechnol. 2013; 31, 1133-1136]; 및 [Maeder et al., Targeted DNA demethylation and activation of endogenous genes using programmable TALE-TET1 fusion proteins. Nat. Biotechnol. 2013; 31, 1137-1142]에서 찾아볼 수 있다. 일부 실시양태에서, 후성 변형인자 도메인은 LSD1 (리신 (K)-특이적 데메틸라제 1A) 히스톤 데메틸라제로써, 일부 실시양태에서는 서열 94 또는 서열 95로 제시되어 있는 아미노산 서열 전체 또는 그의 일부를 포함한다. 일부 실시양태에서, 후성 변형인자 도메인은 TET1 히드록실라제 촉매 도메인으로써, 일부 실시양태에서는 서열 96으로 제시되어 있는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 후성 변형인자는 히스톤 데아세틸라제 (HDAC) 이펙터 도메인이다. 일부 실시양태에서, 상기 HDAC 이펙터 도메인은 문헌 [Konermann et al., Optical control of mammalian endogenous transcription and epigenetic states. Nature. 2013; 500, 472-476]의 부록 표 2에 제공되어 있는 HDAC 이펙터 단백질들 중 어느 것에 상응하는 아미노산 서열인 서열 97-108의 전부 또는 일부를 포함한다. 일부 실시양태에서, 후성 변형인자는 히스톤 메틸트랜스퍼라제 (HMT) 이펙터 도메인이다. 일부 실시양태에서, 상기 HMT 이펙터 도메인은 문헌 [Konermann et al., Optical control of mammalian endogenous transcription and epigenetic states. Nature. 2013; 500, 472-476]의 부록 표 3에 제공되어 있는 HDAC 이펙터 단백질들 중 어느 것에 상응하는 아미노산 서열인 서열 109-118의 전부 또는 일부를 포함한다.
LSD1, 동형 a (인간):
LSD1, 동형 b (인간):
TET1 촉매 도메인:
HDAC 이펙터 도메인:
HDAC8 (엑스. 라에비스):
RPD3 (에스. 세레비시아에):
MesoLo4 (엠. 로티):
HDAC11 (인간):
HDT1 (에이. 탈리아나):
SIRT3 (인간):
HST2 (에스. 세레비시아에):
CobB (이. 콜리 (K12)):
HST2 (씨. 알비칸스):
SIRT5 (인간):
Sir2A (피. 팔시파룸):
SIRT6 (인간):
HMT 이펙터 도메인:
NUE (씨. 트라코마티스):
vSET (피. 부르사리아 클로렐라 바이러스):
SUV39H1 (인간):
DIM5 (엔. 크라싸):
KYP (에이. 탈리아나):
SUVR4 (에이. 탈리아나):
Set4 (씨. 엘레간스):
Set1 (씨. 엘레간스):
SETD8 (인간):
TgSET8 (티. 곤디이):
통상의 기술자라면, 예를 들면 본원에서 기술되는 대표적인 Cas9 뉴클레아제, 그의 변이 및 융합체를 포함한 대표적인 Cas9 단백질들 중 어느 것이 본원에서 개시되는 기술을 사용하여 세포에 전달될 수 있다는 것, 그리고 그와 관련하여 본 개시가 제한되지는 않는다는 것이 이해될 것이다.
뉴클레아제 이펙터 단백질
TALE 뉴클레아제 또는 TALEN은 DNA 절단 도메인, 예를 들면 FokI 도메인과 회합된 전사 활성화인자-유사 이펙터 DNA 결합 도메인을 포함하는 인공 뉴클레아제이다. 조작된 TALE 구성체를 생성시키기 위한 수많은 모듈형 조립체 구성들이 보고되어 있다 (각각의 전체 내용이 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Zhang, Feng; et.al. (February 2011). "Efficient construction of sequence-specific TAL effectors for modulating mammalian transcription". Nature Biotechnology 29 (2): 149-53]; [Geiβler, R.; Scholze, H.; Hahn, S.; Streubel, J.; Bonas, U.; Behrens, S.E.; Boch, J. (2011), Shiu, Shin-Han. ed. "Transcriptional Activators of Human Genes with Programmable DNA-Specificity". PLoS ONE 6 (5): e19509]; [Cermak, T.; Doyle, E.L.; Christian, M.; Wang, L.; Zhang, Y.; Schmidt, C.; Baller, J.A.; Somia, N.V. et al. (2011). "Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting". Nucleic Acids Research]; [Morbitzer, R.; Elsaesser, J.; Hausner, J.; Lahaye, T. (2011). "Assembly of custom TALE-type DNA binding domains by modular cloning". Nucleic Acids Research]; [Li, T.; Huang, S.; Zhao, X.; Wright, D.A.; Carpenter, S.; Spalding, M.H.; Weeks, D.P.; Yang, B. (2011). "Modularly assembled designer TAL effector nucleases for targeted gene knockout and gene replacement in eukaryotes". Nucleic Acids Research.]; [Weber, E.; Gruetzner, R.; Werner, S.; Engler, C; Marillonnet, S. (2011). Bendahmane, Mohammed, ed. "Assembly of Designer TAL Effectors by Golden Gate Cloning". PLoS ONE 6 (5): e19722]). 통상의 기술자라면, TALE 뉴클레아제가 고도의 특이성으로 사실상 모든 게놈 서열을 표적으로 하도록 조작될 수 있다는 것, 및 그와 같이 조작된 뉴클레아제가 본 발명 기술의 실시양태에서 예를 들면 TALEN이 세포 게놈 내 그의 표적 서열에 결합하여 그것을 절단하기에 적합한 상황하에 본원에서 개시되는 방법 또는 전략을 통하여 각 TALEN을 전달하는 것에 의해 세포의 게놈을 조작하는 데에 사용될 수 있다는 것이 이해될 것이다. 일부 실시양태에서, 전달되는 TALEN은 질환 또는 장애와 연관되어 있는 유전자 또는 대립유전자를 표적으로 한다. 일부 실시양태에서, 대상체에의 TALEN의 전달은 대상체에게 치료적 잇점을 제공한다.
아연 핑거 뉴클레아제는 DNA 절단 도메인 및 아연 핑거 DNA 결합 도메인을 포함하는 종류의 인공 뉴클레아제이다. 일부 실시양태에서, 상기 DNA 절단 도메인은 제한 엔도뉴클레아제, 예를 들면 FokI의 비-특이적인 DNA 절단 도메인이다. 일부 실시양태에서, 상기 DNA 절단 도메인은 동일 유형의 두 번째 DNA 절단 도메인과 이량체화되었을 때 이중-가닥 DNA만을 절단하는 도메인이다. 일부 실시양태에서, DNA 절단 도메인은 링커, 예를 들면 펩티드 링커를 통하여 아연 핑거 도메인의 C-말단에 융합된다. 일부 실시양태에서, 아연 핑거 도메인은 약 3 내지 약 6개 사이의 아연 핑거를 포함하며, 약 9-20개 뉴클레오티드 길이의 표적 서열을 특이적으로 인식하여 거기에 결합한다. 일부 실시양태에서는, 본 발명에 의해 제공되는 시스템 또는 방법에 의해 다수의 아연 핑거 뉴클레아제 분자가 표적 세포에 전달됨으로써, 일 아연 핑거 뉴클레아제 분자의 아연 핑거 도메인이 두 번째 아연 핑거 뉴클레아제 분자의 표적 서열의 근처의 표적 서열에 결합한다. 일부 실시양태에서, 서로 근처에서 표적 서열에 결합하는 아연 핑거 뉴클레아제 분자의 아연 핑거 도메인들은 서로 다르다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공되는 시스템 또는 방법에 의해 세포에 전달되는 아연 핑거 뉴클레아제 분자는 또 다른 아연 핑거 뉴클레아제 분자의 표적 서열 근처에서 표적 핵산 서열에 결합함으로써, 분자의 DNA 절단 도메인들이 이량체화되어, 2개 표적 서열 사이의 부위에서 DNA 분자를 절단한다.
일부 실시양태에서는, 본원에서 개시되는 전략 또는 방법을 통하여 세포에 전달되는 뉴클레아제에 의해, 예를 들면 TALEN 또는 아연-핑거 뉴클레아제, 또는 이와 같은 뉴클레아제들 다수 또는 조합에 의해 표적 세포의 게놈이 편집된다. 일부 실시양태에서는, 뉴클레아제에 의해 표적 세포의 게놈 내 특정 부위에 단일- 또는 이중-가닥 파단이 도입됨으로써, 표적 게놈 서열의 붕괴를 초래한다. 일부 실시양태에서, 상기 표적 게놈 서열은 유전자 코딩 영역 내의 핵산 서열이다. 일부 실시양태에서, 뉴클레아제에 의해 도입되는 가닥 파단은 코딩하고 있는 유전자 생성물의 발현을 손상시키는 표적 유전자 내의 돌연변이로 이어진다. 일부 실시양태에서는, 뉴클레아제와 함께 핵산이 세포로 공동-전달된다. 일부 실시양태에서, 상기 핵산은 뉴클레아제 표적 부위에 인접한 서열과 동일하거나 상동성인 서열을 포함한다. 그와 같은 일부 실시양태에서, 뉴클레아제에 의해 수행되는 가닥 파단은 파괴 부위에서 공동-전달되는 핵산의 전부 또는 일부를 세포 DNA에 도입함으로써 공동-전달 핵산 또는 그 일부의 표적화된 삽입을 초래하는 세포 DNA 복구 기구에 의해 복구된다. 일부 실시양태에서, 상기 삽입은 병원성 대립유전자의 붕괴 또는 복구를 초래한다. 일부 실시양태에서, 상기 삽입은 적합한 검정, 예를 들면 DNA 서열분석 검정, 사우던 블럿 검정, 또는 공동-전달 핵산에 의해 코딩되는 리포터 유전자, 예를 들면 형광 단백질 또는 항생제에 대한 내성의 검정에 의해 검출된다. 일부 실시양태에서는, 초하전 단백질에의 결합에 의해 핵산이 공동-전달된다. 일부 실시양태에서, 상기 초하전 단백질은 기능성 이펙터 단백질, 예컨대 뉴클레아제와도 회합된다. 일부 실시양태에서, 표적 세포에의 뉴클레아제의 전달은 유전자 기능의 임상적 또는 치료적으로 유익한 붕괴를 초래한다.
일부 실시양태에서는, 대상체로부터의 세포가 수득된 후, 생체 외에서 본원에서 제공되는 시스템 또는 방법에 의해 뉴클레아제 또는 다른 이펙터 단백질이 세포에 전달된다. 일부 실시양태에서, 처리되는 세포는 원하는 뉴클레아제-매개 게놈 편집 사례가 수행된 세포 중에서 선택된다. 일부 실시양태에서, 원하는 게놈 돌연변이 또는 변경을 보유하는 처리 세포는 그것이 수득되었던 대상체로 복귀된다.
특정 서열을 표적으로 하는 뉴클레아제, 예컨대 TALE 또는 아연 핑거 뉴클레아제의 조작, 생성 및 단리 방법, 그리고 특정 표적 서열에서 세포 게놈을 편집하는 것에 대해서는 관련 기술분야에 잘 알려져 있다 (예를 들면 문헌 [Mani et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 335:447-457, 2005]; [Perez et al., Nature Biotechnology 26:808-16, 2008]; [Kim et al., Genome Research, 19:1279-88, 2009]; [Urnov et al., Nature 435:646-51, 2005]; [Carroll et al., Gene Therapy 15:1463-68, 2005]; [Lombardo et al., Nature Biotechnology 25:1298-306, 2007]; [Kandavelou et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 388:56-61, 2009]; 및 [Hockemeyer et al., Nature Biotechnology 27(9):851-59, 2009]은 물론, 각 부문에서 각 뉴클레아제에 대하여 인용된 참고문헌 참조). 통상의 기술자라면, 본원에서 제공되는 지침을 바탕으로 본 개시의 맥락에서 사용하기에 적합한 방법들을 확인할 수 있을 것이다.
TALE 이펙터 단백질
일부 실시양태에서는, TALE 도메인을 포함하는 이펙터 단백질이 본원에서 제공되는 시스템 또는 방법에 의해 표적 세포에 전달된다. 일부 실시양태에서는, TALE 이펙터, 예를 들면 TALE DNA 결합 도메인 및 이종유래 전사 활성화인자 또는 억제인자 도메인을 포함하는 조작된 TALE 전사 인자가 본 발명의 측면에 의해 제공되는 시스템 또는 방법에 의해 세포에 전달된다. 일부 실시양태에서, TALE 이펙터, 예컨대 전사 인자는 세포 내에서 전사 인자 표적 유전자의 전사를 활성화시키거나 억제하기에 충분한 양으로 세포에 전달된다. 일부 실시양태에서, 전사 인자는 표적 세포 표현형의 변화, 예를 들면 세포 기능의 변화 또는 발생 가능성의 변화를 수행하기에 충분한 양으로, 그리고 시간 기간 동안 전달된다. 대표적인 TALE 전사 인자에 대해서는 본원에서 기술되는 바, 통상의 기술자라면, 본원에서 제공되는 지침 및 관련 기술분야에서의 해당 TALE 전사 인자에 대한 지식을 바탕으로 추가적인 적합한 TALE 전사 인자들을 확인할 수 있을 것이다.
일부 실시양태에서, 표적 세포 예를 들면 체세포는 본원에서 제공되는 초하전 단백질과 회합된 TALE 전사 인자, 또는 그와 같은 인자들의 조합과 접촉된다. 일부 실시양태에서, 상기 표적 세포는 초대 체세포(primary somatic cell)이며, 시험관 내 또는 생체 외에서 초하전 단백질과 회합된 TALE 전사 인자와 접촉된다. 일부 실시양태에서, TALE 전사 인자는 예를 들면 본원에서 기술되는 바와 같은 양으로 하전된 초하전 단백질과 회합된다. 일부 실시양태에서, TALE 전사 인자는 예를 들면 본원에서 기술되는 바와 같은 음으로 하전된 초하전 단백질과 회합된다. 일부 실시양태에서, TALE 전사 인자는 예를 들면 본원에서 기술되는 바와 같은 양이온성 지질 및/또는 양이온성 중합체와 회합된다. 일부 실시양태에서, TALE 전사 인자는 예를 들면 본원에서 기술되는 바와 같은 음으로 하전된 초하전 단백질 및 양이온성 지질 및/또는 양이온성 중합체와 회합된다.
일부 실시양태에서, 표적 세포는 본원에서 제공되는 바와 같은 초하전 단백질 (및 임의적으로 양이온성 지질 및/또는 양이온성 중합체)과 회합된 TALE 전사 인자와 접촉 또는 반복적으로 접촉된 후, 세포 표현형 또는 유전자 발현의 원하는 변화가 검출된다. 일부 실시양태에서, 표적 세포는 원하는 세포 표현형의 형성이 검출될 때까지 본원에서 제공되는 바와 같은 초하전 단백질 (및 임의적으로 양이온성 지질 및/또는 양이온성 중합체)과 회합된 TALE 전사 인자와 반복적으로 접촉된다. 세포 표현형 및 유전자 발현을 검출하는 방법에 대해서는 통상의 기술자에게 잘 알려져 있는데, 예를 들면 형태구조 분석, 그리고 면역조직화학, 형광 활성화 세포 분류 (FACS) 또는 형광 현미경법과 같은 잘-확립되어 있는 방법들에 의한 마커 유전자 발현의 검출이 포함된다. 일부 실시양태에서, 표적 세포는 3시간 이상, 6시간 이상, 12시간 이상, 1일 이상, 2일 이상, 3일 이상, 4일 이상, 5일 이상, 6일 이상, 7일 이상, 10-12일 이상, 12-15일 이상, 15-20일 이상, 20-25일 이상, 25-30일 이상, 30-40일 이상, 40-50일 이상, 50-60일 이상, 60-70일 이상 또는 70-100일 이상의 기간 동안 본원에서 제공되는 바와 같은 초하전 단백질과 회합된 TALE 전사 인자와 접촉된다.
일부 실시양태에서, 표적 세포는 상이한 세포 단계로 세포를 프로그래밍하는 데에 효과적인 양으로, 그리고 시간 기간 동안, 본원에서 제공되는 바와 같은 초하전 단백질 (및 임의적으로 양이온성 지질 및/또는 양이온성 중합체)과 회합된 TALE 전사 인자와 접촉된다. 통상의 기술자라면 알고 있을 바와 같이, 세포를 프로그래밍 또는 재-프로그래밍하는 데에 필요한 양은 다양한 인자들, 예를 들면 세포 유형 및 처리 일정에 따라 달라지게 된다. 일반적으로, 본원에서 제공되는 시스템 또는 방법에 의한 표적 체세포에의 TALE 전사 인자의 전달은 유의성 있는 독성이 관찰될 수 있는 농도 미만인 농도의 것이 되게 된다. 임계 농도는 예를 들면 구체적인 TALE 전사 인자, 그것이 회합되는 초하전 단백질, 결합의 유형, 및 처리되는 세포의 유형에 따라 달라지게 된다.
특정 세포 유형에의 전달을 위한 초하전 단백질 (및 임의적으로 양이온성 지질 및/또는 양이온성 중합체)과 회합된 기능성 이펙터 단백질의 유용한 농도는 일상적인 실험으로 통상의 기술자에 의해 확립될 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적 세포는 시험관 내 또는 세포 외에서 약 1 pM 내지 약 1 μM의 농도로 초하전 단백질 (및 임의적으로 양이온성 지질 및/또는 양이온성 중합체)과 회합된 기능성 이펙터 단백질과 접촉된다. 일부 실시양태에서, 표적 세포는 시험관 내 또는 세포 외에서 약 1 pM, 약 2.5 pM, 약 5 pM, 약 7.5 pM, 약 10 pM, 약 20 pM, 약 25 pM, 약 30 pM, 약 40 pM, 약 50 pM, 약 60 pM, 약 70 pM, 약 75 pM, 약 80 pM, 약 90 pM, 약 100 pM, 약 200 pM, 약 250 pM, 약 300 pM, 약 400 pM, 약 500 pM, 약 600 pM, 약 700 pM, 약 750 pM, 약 800 pM, 약 900 pM, 약 1 nM, 약 2 nM, 약 3 nM, 약 4 nM, 약 5 nM, 약 6 nM, 약 7 nM, 약 8 nM, 약 9 nM, 약 10 nM, 약 20 nM, 약 25 nM, 약 30 nM, 약 40 nM, 약 50 nM, 약 60 nm, 약 70 nM, 약 75 nM, 약 80 nM, 약 90 nM, 약 100 nM, 약 200 nM, 약 250 nM, 약 300 nM, 약 400 nM, 약 500 nM, 약 600 nM, 약 700 nM, 약 750 nM, 약 800 nM, 약 900 nM 또는 약 1 μM의 농도로 초하전 단백질과 회합된 기능성 이펙터 단백질과 접촉된다. 기능성 이펙터 단백질에 대한 표적 세포의 노출, 및 필요에 따라서는 기능성 이펙터 단백질 부재하에서의 투여 후 인큐베이션의 유용한 시간은 물론, 원하는 생물학적 효과 (예컨대 유전자 전사의 변화, 전달된 뉴클레아제에 의한 표적 부위의 절단 등) 또는 원하는 세포 표현형을 달성하는 데에 유용한 투여/인큐베이션 주기의 수 역시 일상적인 실험으로 통상의 기술자에 의해 확립될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공되는 시스템 또는 방법에 의한 기능성 이펙터 단백질의 전달을 위한 표적 세포는 대상체로부터 생검에 의해 수득되는 초대 세포이다. 일부 실시양태에서, 상기 대상체는 질환에 걸린 것으로 진단되어 있다. 일부 실시양태에서, 상기 질환은 특정 세포 유형, 예를 들면 신경 세포의 감소된 기능을 특징으로 하는 퇴행성 질환이다. 일부 실시양태에서, 본원에서 개시되는 전략 또는 방법에 따라 기능성 이펙터 단백질을 사용하여 처리되는 세포 또는 그와 같은 세포의 자손은 세포-대체 치료 접근법에 사용된다. 일부 실시양태에서, 처리되는 세포는 자가 세포 대체 치료 접근법에서 체세포가 수득되었던 대상체에게 투여된다.
일부 실시양태에서는, 일 분화 상태로부터 또 다른 것으로 세포를 전환할 수 있는 기능성 이펙터 단백질 예컨대 TALE 전사 인자가 본원에서 제공되는 시스템 또는 방법에 의해 시험관 내 또는 생체 내에서 표적 세포에 전달된다. 전환분화(transdifferentiation)를 수행하는 전사 인자에 대해서는 관련 기술분야에 알려져 있다 (예컨대 문헌 [Zhou et al., Nature 455:627-33, 2008] 참조). 일부 실시양태에서는, PPARγ 또는 PRDM16의 발현을 조절하는 TALE 전사 인자가 본 발명에 의해 제공되는 바와 같은 시스템 또는 방법에 의해 섬유모세포 세포에 전달된다. 이러한 전사 인자의 발현이 갈색 지방 또는 백색 지방 세포 상태로의 섬유모세포 프로그래밍의 중추적인 단계라는 것은 관련 기술분야에 알려져 있다. 일부 실시양태에서는, 갈색 지방 세포를 필요로 하는 대상체로부터 수득된 섬유모세포로부터 프로그래밍된 갈색 지방 세포가 생성된 후, 상기 대상체에게 투여됨으로써, 예를 들면 대상체가 연루되는 세포-대체 치료 접근법에 사용된다.
복합체의 형성
본 발명은 전달될 1종 이상의 기능성 이펙터 단백질과 회합된 초하전 단백질을 포함하는 복합체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 초하전 단백질은 비-공유 상호작용을 통하여 전달될 1종 이상의 기능성 이펙터 단백질과 회합된다. 일부 실시양태에서, 초하전 단백질은 정전기적 상호작용을 통하여 1종 이상의 기능성 이펙터 단백질과 회합된다. 일부 실시양태에서, 초하전 단백질은 전체적 순수 양전하를 가지며, 전달될 기능성 이펙터 단백질은 전체적 순수 음전하를 가진다. 일부 실시양태에서, 복합체는 추가적으로 양이온성 지질 및/또는 양이온성 중합체를 포함한다. 예를 들면, 일부 실시양태에서, 복합체의 초하전 단백질은 초음으로 하전됨으로써, 양이온성 지질 및/또는 중합체와의 결합을 가능케 한다.
소정 실시양태에서, 초하전 단백질은 공유 결합을 통하여 전달될 1종 이상의 기능성 이펙터 단백질과 회합된다. 예를 들면, 초하전 단백질은 전달될 기능성 이펙터 단백질에 융합될 수 있다. 공유 결합은 직접적인 것이거나, 간접적인 것 (예컨대 링커를 통함)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 공유 결합은 1종 이상의 링커를 통하여 매개된다. 일부 실시양태에서, 상기 링커는 절단가능 링커이다. 일부 실시양태에서, 상기 절단가능 링커는 아미드, 에스테르 또는 디술피드 결합을 포함한다. 예를 들면, 링커는 세포 효소에 의해 절단가능한 아미노산 서열일 수 있다. 소정 실시양태에서, 상기 효소는 프로테아제이다. 다른 실시양태에서, 효소는 에스테라제이다. 일부 실시양태에서, 효소는 다른 세포 유형에서에 비해 소정 세포 유형에서 더 고도로 발현되는 것이다. 예를 들면, 효소는 비-종양 세포에서에 비해 종양 세포에서 더 고도로 발현되는 것일 수 있다. 대표적인 링커 및 그러한 링커를 절단하는 효소들을 하기에 제시한다.
<표>
1 X는 초하전 단백질 또는 전달될 기능성 이펙터 단백질을 나타냄
* 관찰된 절단 부위를 지칭함
한 가지만 구체적인 예를 제시하자면, +36 GFP는 ALAL (서열 254)와 같은 절단가능 링커에 의해 전달될 기능성 이펙터 단백질과 회합됨으로써, +36 GFP-(GGS)4-ALAL-(GGS)4-[기능성 이펙터 단백질 X] (서열 255)을 생성시킬 수 있다.
소정 실시양태에서, 전달될 기능성 이펙터 단백질은 초하전 단백질과 접촉됨으로써, 복합체를 형성한다. 일부 실시양태에서, 복합체의 형성은 pH 7 또는 그 부근에서 수행된다. 일부 실시양태에서, 복합체의 형성은 약 pH 5, 약 pH 6, 약 pH 7, 약 pH 8 또는 약 pH 9에서 수행된다. 복합체의 형성은 통상적으로 초하전 단백질 및/또는 기능성 이펙터 단백질의 기능에 부정적인 영향을 주지 않는 pH에서 수행된다. 일부 실시양태에서, 복합체의 형성은 실온에서 수행된다. 일부 실시양태에서, 복합체의 형성은 37 ℃ 또는 그 부근에서 수행된다. 일부 실시양태에서, 복합체의 형성은 4 ℃ 미만, 약 4 ℃, 약 10 ℃, 약 15 ℃, 약 20 ℃, 약 25 ℃, 약 30 ℃, 약 35 ℃, 약 37 ℃, 약 40 ℃ 또는 40 ℃ 초과에서 수행된다. 복합체의 형성은 통상적으로 초하전 단백질 및/또는 기능성 이펙터 단백질의 기능에 부정적인 영향을 주지 않는 온도에서 수행된다. 일부 실시양태에서, 복합체의 형성은 무-혈청 배지에서 수행된다. 일부 실시양태에서, 복합체의 형성은 CO2의 존재하에 (예컨대 약 1 %, 약 2 %, 약 3 %, 약 4 %, 약 5 %, 약 6 % 또는 그 이상) 수행된다.
일부 실시양태에서, 복합체의 형성은 약 100 nM의 기능성 이펙터 단백질 농도를 사용하여 수행된다. 일부 실시양태에서, 복합체의 형성은 약 25 nM, 약 50 nM, 약 75 nM, 약 90 nM, 약 100 nM, 약 110 nM, 약 125 nM, 약 150 nM, 약 175 nM 또는 약 200 nM의 기능성 이펙터 단백질 농도를 사용하여 수행된다. 일부 실시양태에서, 복합체의 형성은 약 40 nM의 초하전 단백질 농도를 사용하여 수행된다. 일부 실시양태에서, 복합체의 형성은 약 10 nM, 약 20 nM, 약 30 nM, 약 40 nM, 약 50 nM, 약 60 nM, 약 70 nM, 약 80 nM, 약 90 nM 또는 약 100 nM의 초하전 단백질 농도를 사용하여 수행된다.
일부 실시양태에서, 복합체의 형성은 기능성 이펙터 단백질 과량 조건하에서 수행된다. 일부 실시양태에서, 복합체의 형성은 약 20:1, 약 10:1, 약 9:1, 약 8:1, 약 7:1, 약 6:1, 약 5:1, 약 4:1, 약 3:1, 약 2:1 또는 약 1:1의 기능성 이펙터 단백질:초하전 단백질 비로 수행된다. 일부 실시양태에서, 복합체의 형성은 약 3:1의 기능성 이펙터 단백질:초하전 단백질 비로 수행된다. 일부 실시양태에서, 복합체의 형성은 약 20:1, 약 10:1, 약 9:1, 약 8:1, 약 7:1, 약 6:1, 약 5:1, 약 4:1, 약 3:1, 약 2:1 또는 약 1:1의 초하전 단백질:기능성 이펙터 단백질 비로 수행된다.
일부 실시양태에서, 복합체의 형성은 초하전 단백질을 기능성 이펙터 단백질과 혼합하는 것, 및 혼합물을 (예컨대 역전에 의해) 교반하는 것에 의해 수행된다. 일부 실시양태에서, 복합체의 형성은 초하전 단백질을 기능성 이펙터 단백질과 혼합하는 것, 및 혼합물을 계속 방치시키는 것에 의해 수행된다. 일부 실시양태에서, 복합체의 형성은 제약상 허용되는 담체 또는 부형제의 존재하에 수행된다. 일부 실시양태에서, 복합체는 추가적으로 제약상 허용되는 담체 또는 부형제와 조합된다. 대표적인 부형제 또는 담체에는 물, 용매, 지질, 단백질, 펩티드, 엔도솜 작용제 (예컨대 클로로퀸, 피렌 부티르산), 소형 분자, 탄수화물, 완충제, 천연 중합체, 합성 중합체 (예컨대 PLGA, 폴리우레탄, 폴리에스테르, 폴리카프로락톤, 폴리포스파젠), 제약 작용제 등이 포함된다.
일부 실시양태에서, 초하전 단백질 및 기능성 이펙터 단백질을 포함하는 복합체는 겔 전기영동 분석에서 초하전 단백질 단독 또는 기능성 이펙터 단백 단독 중 어느 하나에 비해 더 느리게 이동할 수 있다.
적용
본 발명은 세포에 전달될 기능성 이펙터 단백질 (예컨대 뉴클레아제, 전사 활성화인자/억제인자, 레콤비나제, 그의 변이 및 융합체를 포함한 Cas9 단백질 등)과 회합된 자연 발생이거나 조작된 초하전 단백질을 포함하는 조성물은 물론, 그와 같은 조성물의 사용 방법 및 그와 같은 조성물의 용도를 제공한다. 소정 실시양태에서는, Cas9 단백질 (예컨대 Cas9 단백질이 gRNA와 회합되는 경우) 및 양이온성 지질을 포함하는 조성물이 제공된다. 소정 실시양태에서는, Cas9 단백질 (예컨대 Cas9 단백질이 gRNA와 회합되는 경우) 및 양이온성 단백질을 포함하는 조성물이 제공된다. 본 발명의 조성물은 예를 들면 세포에의 작용제의 전달로부터 잇점을 제공받을 수 있는, 임의 질환의 치료 또는 예방에 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물은 연구 목적으로 세포를 형질감염시키거나 처리하는 데에 사용될 수도 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명에 따른 조성물은 연구 목적으로, 예를 들면 연구 맥락에서 세포에 기능성 이펙터 단백질을 효율적으로 전달하는 데에 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 따른 조성물은 치료 목적으로 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 따른 조성물은 비제한적으로 하기 중 1종 이상을 포함한 다양한 질환, 장애 및/또는 이상들 중 어느 것의 치료에 사용될 수 있다: 자가면역 장애 (예컨대 당뇨병, 루푸스, 다발성 경화증, 건선, 류마티스 관절염); 염증성 장애 (예컨대 관절염, 골반 염증 질환); 감염성 질환 (예컨대 바이러스 감염 (예컨대 HIV, HCV, RSV), 세균 감염, 진균 감염, 패혈증); 신경학적 장애 (예컨대 알츠하이머병, 헌팅턴병; 자폐증; 뒤시엔느 근 위축증); 심혈관 장애 (예컨대 죽상동맥경화증, 고콜레스테롤혈증, 혈전증, 응고 장애, 혈관형성 장애 예컨대 황반 변성); 증식성 장애 (예컨대 암, 양성 신생물); 호흡 장애 (예컨대 만성 폐쇄성 폐 질환); 소화 장애 (예컨대 염증성 창자병, 궤양); 근골격 장애 (예컨대 섬유근육통, 관절염); 내분비, 대사 및 영양 장애 (예컨대 당뇨병, 골다공증); 비뇨기 장애 (예컨대 신장 질환); 심리 장애 (예컨대 우울증, 정신분열증); 피부 장애 (예컨대 상처, 습진); 혈액 및 림프 장애 (예컨대 빈혈, 혈우병) 등.
본 발명의 조성물은 임상 환경에서 사용될 수도 있다. 예를 들면, 초하전 단백질은 치료 적용분야에 사용될 수 있는 기능성 이펙터 단백질과 결합될 수 있다. 그와 같은 기능성 이펙터 단백질은 예를 들면 뉴클레아제 또는 전사 활성화인자일 수 있다. Cas9 단백질 및 양이온성 지질을 포함하는 다른 조성물 역시 치료 적용분야에 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 초하전 단백질 또는 초하전 단백질과 회합되는 기능성 이펙터 단백질은 검출가능한 표지를 포함한다. 이러한 분자는 검출, 영상화, 질환 단계지정, 진단 또는 환자 선택에 사용될 수 있다. 적합한 표지에는 형광, 화학발광, 효소 표지, 비색, 인광, 밀도-기반 표지, 예컨대 전자 밀도를 기반으로 하는 표지, 및 일반적인 조영제, 및/또는 방사성 표지가 포함된다.
제약 조성물
본 발명은 전달될 1종 이상의 기능성 이펙터 단백질과 회합된 초하전 단백질을 포함하는 조성물을 제공하는데, 일부 실시양태에서는 양이온성 지질에 의해 캡슐화된다. Cas9 단백질 및 양이온성 지질을 포함하는 다른 조성물도 제공된다. 따라서, 본 발명은 기능성 이펙터 단백질과 회합된 1종 이상의 초하전 단백질, 및/또는 양이온성 지질 및/또는 양이온성 중합체와 회합된 1종 이상의 기능성 이펙터 단백질, 및 1종 이상의 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 제약 조성물은 임의적으로 1종 이상의 추가적인 치료 활성 물질을 포함할 수도 있다. 일부 실시양태에 따르면, 전달될 기능성 이펙터 단백질과 회합된 1종 이상의 초하전 단백질을 포함하는 제약 조성물의 그를 필요로 하는 대상체에의 투여 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 인간에게 투여된다. 본 개시의 목적상, "활성 성분"이라는 구는 일반적으로 기능성 이펙터 단백질과 회합된 Cas9 단백질 및/또는 초하전 단백질, 또는 본원에서 기술되는 바와 같은 전달될 기능성 이펙터 단백질을 지칭한다.
본원에서 제공되는 제약 조성물에 대한 기술이 원칙적으로 인간에의 투여에 적합한 제약 조성물에 관한 것이기는 하지만, 통상의 기술자라면, 그와 같은 조성물이 모든 종류의 동물들에 대한 투여에 일반적으로 적합하다는 것이 이해될 것이다. 조성물이 다양한 동물들에의 투여에 적합하게 되도록 하기 위한 인간에의 투여에 적합한 제약 조성물의 변형에 대해서는 잘 알려져 있어서, 일반 기술의 수의 약학자라면, 있다고 하더라도 단순히 일반적인 실험으로 그와 같은 변형을 설계 및/또는 수행할 수 있다. 제약 조성물의 투여가 고려되는 대상체에는 인간 및/또는 다른 영장류; 상업적으로 관련되어 있는 포유동물 예컨대 소, 돼지, 말, 양, 고양이, 개, 마우스 및/또는 래트를 포함한 포유동물; 및/또는 상업적으로 관련되어 있는 조류 예컨대 닭, 오리, 거위 및/또는 칠면조를 포함한 조류가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원에서 기술되는 제약 조성물의 제제는 약학 관련 기술분야에 알려져 있거나 이후 개발될 어떠한 방법에 의해서도 제조될 수 있다. 일반적으로, 그와 같은 제조 방법은 활성 성분을 부형제 및/또는 1종 이상의 다른 보조 성분과 연합시킨 다음, 필요하고/거나 바람직할 경우, 생성물을 원하는 단일- 또는 다중-투여분 단위로 성형 및/또는 포장하는 단계를 포함한다.
본 발명에 따른 제약 조성물은 단일 단위 투여분으로서, 및/또는 다수의 단일 단위 투여분으로서 대량으로 제조, 포장 및/또는 판매될 수 있다. 본원에서 사용될 때, "단위 투여분"은 예정된 양의 활성 성분을 포함하는 개별적인 양의 제약 조성물이다. 활성 성분의 양은 일반적으로 대상체에게 투여되게 되는 활성 성분의 투약량 및/또는 예를 들면 그와 같은 투약량의 2분의 1 또는 3분의 1과 같은 해당 투약량의 간편 분획과 동일하다.
본 발명에 따른 제약 조성물 중 활성 성분, 제약상 허용되는 부형제 및/또는 임의의 추가적인 성분의 상대적인 양은 치료되는 대상체의 정체, 크기 및/또는 상태에 따라, 그리고 또한 조성물이 투여되어야 하는 경로에 따라 달라지게 된다. 예를 들자면, 조성물은 0.1 % 내지 100 % (w/w) 사이의 활성 성분을 포함할 수 있다.
제약 제제는 추가적으로 제약상 허용되는 부형제를 포함할 수 있는데, 본원에서 사용될 때 여기에는 원하는 구체적인 투약 형태에 적합한 대로의 임의의 모든 용매, 분산 매체, 희석제, 또는 기타 액체 비히클, 분산 또는 현탁 조제, 표면 활성제, 등장화제, 증점 또는 에멀션화제, 보존제, 고체 바인더, 윤활제 등이 포함된다. 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Remington's The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, A.R. Gennaro (Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006)]에, 제약 조성물을 제제화하는 데에 사용되는 다양한 부형제들 및 그의 제조를 위한 공지의 기술들이 개시되어 있다. 임의의 통상적인 부형제 매체가 예컨대 임의의 바람직하지 않은 생물학적 효과를 산출하거나, 또는 유해한 방식으로 제약 조성물 중 임의의 다른 성분(들)과 달리 상호작용하는 것에 의해 물질 또는 그의 유도체와 비상용성인 예외가 아닌 한, 그의 사용은 본 발명의 영역에 속하는 것으로 간주된다.
일부 실시양태에서, 제약상 허용되는 부형제는 95 % 이상, 96 % 이상, 97 % 이상, 98 % 이상, 99 % 이상 또는 100 % 순수하다. 일부 실시양태에서, 부형제는 인간에서의 용도 및 수의 용도로 승인되어 있다. 일부 실시양태에서, 부형제는 미국 식품 의약국(United States Food and Drug Administration)에 의해 승인되어 있다. 일부 실시양태에서, 부형제는 제약 등급이다. 일부 실시양태에서, 부형제는 미국 약전 (USP), 유럽 약전 (EP), 영국 약전 및/또는 국제 약전의 표준을 충족한다.
제약 조성물의 제조에 사용되는 제약상 허용되는 부형제에는 불활성 희석제, 분산 및/또는 과립화제, 표면 활성제 및/또는 에멀션화제, 붕해제, 결합제, 보존제, 완충제, 윤활제 및/또는 오일이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 그와 같은 부형제는 임의적으로 제약 제제에 포함될 수 있다. 제조자의 판단에 따라, 코코아 버터 및 좌약 왁스, 착색제, 코팅제, 감미제, 향미제 및/또는 향수 작용제와 같은 부형제들이 조성물 중에 존재할 수 있다.
대표적인 희석제에는 칼슘 카르보네이트, 나트륨 카르보네이트, 칼슘 포스페이트, 디칼슘 포스페이트, 칼슘 술페이트, 칼슘 수소 포스페이트, 나트륨 포스페이트 락토스, 수크로스, 셀룰로스, 미세결정질 셀룰로스, 카올린, 만니톨, 소르비톨, 이노시톨, 나트륨 클로라이드, 건조 전분, 옥수수전분, 분말화된 당 등, 및/또는 이들의 조합이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
대표적인 과립화 및/또는 분산제에는 감자 전분, 옥수수 전분, 타피오카 전분, 나트륨 전분 글리콜레이트, 점토, 알긴산, 구아 검, 감귤 펄프, 아가, 벤토나이트, 셀룰로스 및 목재 생성물, 천연 해면, 양이온-교환 수지, 칼슘 카르보네이트, 실리케이트, 나트륨 카르보네이트, 가교-결합 폴리(비닐-피롤리돈) (크로스포비돈), 나트륨 카르복시메틸 전분 (나트륨 전분 글리콜레이트), 카르복시메틸 셀룰로스, 가교-결합 나트륨 카르복시메틸 셀룰로스 (크로스카르멜로스), 메틸셀룰로스, 예비호화 전분 (전분 1500), 미세결정질 전분, 수불용성 전분, 칼슘 카르복시메틸 셀룰로스, 마그네슘 알루미늄 실리케이트 (비검), 나트륨 라우릴 술페이트, 4차 암모늄 화합물 등, 및/또는 이들의 조합이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
대표적인 표면 활성제 및/또는 에멀션화제에는 천연 에멀션화제 (예컨대 아카시아, 아가, 알긴산, 나트륨 알기네이트, 트라가칸트, 콘드룩스, 콜레스테롤, 크산탄, 펙틴, 젤라틴, 난황, 카세인, 양모 지방, 콜레스테롤, 왁스 및 레시틴), 콜로이드성 점토 (예컨대 벤토나이트 [알루미늄 실리케이트] 및 비검(Veegum)® [마그네슘 알루미늄 실리케이트]), 장쇄 아미노산 유도체, 고분자량 알콜 (예컨대 스테아릴 알콜, 세틸 알콜, 올레일 알콜, 트리아세틴 모노스테아레이트, 에틸렌 글리콜 디스테아레이트, 글리세릴 모노스테아레이트, 및 프로필렌 글리콜 모노스테아레이트, 폴리비닐 알콜), 카르보머 (예컨대 카르복시 폴리메틸렌, 폴리아크릴산, 아크릴산 중합체, 및 카르복시비닐 중합체), 카라기난, 셀룰로스계 유도체 (예컨대 카르복시메틸셀룰로스 나트륨, 분말화된 셀룰로스, 히드록시메틸 셀룰로스, 히드록시프로필 셀룰로스, 히드록시프로필 메틸셀룰로스, 메틸셀룰로스), 소르비탄 지방산 에스테르 (예컨대 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트 (트윈(Tween)®20), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 (트윈®60), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트 [트윈®80], 소르비탄 모노팔미테이트 [스판(Span)®40], 소르비탄 모노스테아레이트 [스판®60], 소르비탄 트리스테아레이트 [스판®65], 글리세릴 모노올레에이트, 소르비탄 모노올레이트 [스판®80]), 폴리옥시에틸렌 에스테르 (예컨대 폴리옥시에틸렌 모노스테아레이트 [Myrj®45], 폴리옥시에틸렌 수소화 피마자유, 폴리에톡실화 피마자유, 폴리옥시메틸렌 스테아레이트 및 솔루톨(Solutol)®), 수크로스 지방산 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 지방산 에스테르 (예컨대 크레모포어(Cremophor)®), 폴리옥시에틸렌 에테르 (예컨대 폴리옥시에틸렌 라우릴 에테르 (Brij®30)), 폴리(비닐-피롤리돈), 디에틸렌 글리콜 모노라우레이트, 트리에탄올아민 올레에이트, 나트륨 올레에이트, 칼륨 올레에이트, 에틸 올레에이트, 올레산, 에틸 라우레이트, 나트륨 라우릴 술페이트, 플루로닉(Pluronic)®F 68, 폴록사머(Poloxamer)®188, 세트리모늄 브로마이드, 세틸피리디늄 클로라이드, 벤즈알코늄 클로라이드, 도큐세이트 나트륨 등, 및/또는 이들의 조합이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
대표적인 결합제에는 전분 (예컨대 옥수수전분 및 전분 페이스트); 젤라틴; 당 (예컨대 수크로스, 글루코스, 덱스트로스, 덱스트린, 당밀, 락토스, 락티톨, 만니톨); 천연 및 합성 검 (예컨대 아카시아, 나트륨 알기네이트, 뿔가사리 추출물, 판와 검, 가티 검, 이사폴 껍질의 점질액, 카르복시메틸셀룰로스, 메틸셀룰로스, 에틸셀룰로스, 히드록시에틸셀룰로스, 히드록시프로필 셀룰로스, 히드록시프로필 메틸셀룰로스, 미세결정질 셀룰로스, 셀룰로스 아세테이트, 폴리(비닐-피롤리돈), 마그네슘 알루미늄 실리케이트 (비검®) 및 낙엽송 아라보갈락탄); 알기네이트; 폴리에틸렌 옥시드; 폴리에틸렌 글리콜; 무기 칼슘염; 실리크산; 폴리메타크릴레이트; 왁스; 물; 알콜 등; 및 이들의 조합이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
대표적인 보존제에는 항산화제, 킬레이팅제, 항미생물 보존제, 항진균 보존제, 알콜 보존제, 산성 보존제 및/또는 기타 보존제가 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 대표적인 항산화제에는 알파 토코페롤, 아스코르브산, 아코르빌 팔미테이트, 부틸화 히드록시아니솔, 부틸화 히드록시톨루엔, 모노티오글리세롤, 칼륨 메타비술파이트, 프로피온산, 프로필 갈레이트, 나트륨 아스코르베이트, 나트륨 비술파이트, 나트륨 메타비술파이트 및/또는 나트륨 술파이트가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 대표적인 킬레이팅제에는 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA), 시트르산 1수화물, 디나트륨 에데테이트, 디칼륨 에데테이트, 에데트산, 푸마르산, 말산, 인산, 나트륨 에데테이트, 타르타르산 및/또는 트리나트륨 에데테이트가 포함된다. 대표적인 항미생물 보존제에는 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드, 벤질 알콜, 브로노폴, 세트리미드, 세틸피리디늄 클로라이드, 클로르헥시딘, 클로로부탄올, 클로로크레졸, 클로로크실레놀, 크레졸, 에틸 알콜, 글리세린, 헥세티딘, 이미드우레아, 페놀, 페녹시에탄올, 페닐에틸 알콜, 페닐수은 니트레이트, 프로필렌 글리콜 및/또는 티메로살이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 대표적인 항진균 보존제에는 부틸 파라벤, 메틸 파라벤, 에틸 파라벤, 프로필 파라벤, 벤조산, 히드록시벤조산, 칼륨 벤조에이트, 칼륨 소르베이트, 나트륨 벤조에이트, 나트륨 프로피오네이트 및/또는 소르브산이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 대표적인 알콜 보존제에는 에탄올, 폴리에틸렌 글리콜, 페놀, 페놀계 화합물, 비스페놀, 클로로부탄올, 히드록시벤조에이트 및/또는 페닐에틸 알콜이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 대표적인 산성 보존제에는 비타민 A, 비타민 C, 비타민 E, 베타-카로텐, 시트르산, 아세트산, 데히드로아세트산, 아스코르브산, 소르브산 및/또는 피트산이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 기타 보존제에는 토코페롤, 토코페롤 아세테이트, 데테록심 메실레이트, 세트리미드, 부틸화 히드록시아니솔 (BHA), 부틸화 히드록시톨루엔 (BHT), 에틸렌디아민, 나트륨 라우릴 술페이트 (SLS), 나트륨 라우릴 에테르 술페이트 (SLES), 나트륨 비술파이트, 나트륨 메타비술파이트, 칼륨 술파이트, 칼륨 메타비술파이트, 글리단트 플러스(Glydant Plus)®, 페노닙(Phenonip)®, 메틸파라벤, 게르말(Germall)®115, 게르마벤(Germaben)®II, 네올론(Neolone)™, 카톤(Kathon)™ 및/또는 에욱실(Euxyl)™이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
대표적인 완충제에는 시트레이트 완충 용액, 아세테이트 완충 용액, 포스페이트 완충 용액, 암모늄 클로라이드, 칼슘 카르보네이트, 칼슘 클로라이드, 칼슘 시트레이트, 칼슘 글루비오네이트, 칼슘 글루셉테이트, 칼슘 글루코네이트, D-글루콘산, 칼슘 글리세로포스페이트, 칼슘 락테이트, 프로판산, 칼슘 레불리네이트, 펜탄산, 2염기성 칼슘 포스페이트, 인산, 3염기성 칼슘 포스페이트, 칼슘 히드록시드 포스페이트, 칼륨 아세테이트, 칼륨 클로라이드, 칼륨 글루코네이트, 칼륨 혼합물, 2염기성 칼륨 포스페이트, 1염기성 칼륨 포스페이트, 칼륨 포스페이트 혼합물, 나트륨 아세테이트, 나트륨 비카르보네이트, 나트륨 클로라이드, 나트륨 시트레이트, 나트륨 락테이트, 2염기성 나트륨 포스페이트, 1염기성 나트륨 포스페이트, 나트륨 포스페이트 혼합물, 트로메타민, 마그네슘 히드록시드, 알루미늄 히드록시드, 알긴산, 무-발열원수, 등장 식염수, 링거 용액, 에틸 알콜 등, 및/또는 이들의 조합이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
대표적인 윤활제에는 마그네슘 스테아레이트, 칼슘 스테아레이트, 스테아르산, 실리카, 활석, 맥아, 글리세릴 베하네이트, 수소화 식물성 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 벤조에이트, 나트륨 아세테이트, 나트륨 클로라이드, 류신, 마그네슘 라우릴 술페이트, 나트륨 라우릴 술페이트 등, 및 이들의 조합이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
대표적인 오일에는 아몬드, 살구인, 아보카도, 바바수, 베르가못, 블랙 커렌트 종자, 서양지치, 케이드, 카밀레, 카놀라, 캐러웨이, 카르나우바, 피마자, 계피, 코코아 버터, 코코넛, 대구 간, 커피, 옥수수, 면실, 에뮤, 유칼립투스, 금달맞이꽃, 어류, 아마씨, 제라니올, 박, 포도씨, 헤이즐넛, 히솝, 이소프로필 미리스테이트, 호호바, 쿠쿠이 너트, 라밴딘, 라벤더, 레몬, 리씨, 마카데미아 너트, 아욱, 망고씨, 메도우폼 종자, 밍크, 육두구, 올리브, 오렌지, 오렌지 러피, 팜, 팜인, 복숭아인, 땅콩, 양귀비 종자, 호박씨, 평지씨, 쌀겨, 로즈마리, 홍화, 백단, 사스쿠아나, 세이버리, 보리수나무, 참깨, 시어 버터, 실리콘, 대두, 해바라기, 차나무, 엉겅퀴, 츠바키, 베티베르, 호두 및 밀배아 오일이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 대표적인 오일에는 부틸 스테아레이트, 카프릴 트리글리세리드, 카프르 트리글리세리드, 시클로메티콘, 디에틸 세바케이트, 디메티콘 360, 이소프로필 미리스테이트, 무기 오일, 옥틸도데칸올, 올레일 알콜, 실리콘 오일 및/또는 이들의 조합이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
경구 및 비경구 투여용 액체 투약 형태에는 제약상 허용되는 에멀션, 미세에멀션, 용액, 현탁액, 시럽 및/또는 엑릭시르가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 활성 성분 이외에도, 액체 투약 형태는 예를 들면 물 또는 기타 용매, 가용화제 및 에멀션화제 예컨대 에틸 알콜, 이소프로필 알콜, 에틸 카르보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알콜, 벤질 베조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸렌 글리콜, 디메틸포름아미드, 오일 (특히 면실, 땅콩류, 옥수수, 새싹, 올리브, 피마자 및 참깨 오일), 글리세롤, 테트라히드로푸르푸릴 알콜, 폴리에틸렌 글리콜 및 소르비탄의 지방산 에스테르, 및 이들의 혼합물과 같이 관련 기술분야에서 흔히 사용되는 불활성 희석제를 포함할 수 있다. 불활성 희석제 이외에, 경구 조성물은 습윤제, 에멀션화 및 현탁제, 감미제, 향미제 및/또는 향수 작용제와 같은 아주반트들을 포함할 수 있다. 비경구 투여용 소정 실시양태에서, 조성물은 크레모포어®, 알콜, 오일, 변형 오일, 글리콜, 폴리소르베이트, 시클로덱스트린, 중합체 및/또는 이들의 조합과 같은 가용화제와 혼합된다.
주사가능 제제, 예를 들면 멸균 주사가능 수성 또는 유성 현탁액은 공지의 기술에 따라 적합한 분산제, 습윤제 및/또는 현탁제를 사용하여 제제화될 수 있다. 멸균 주사가능 제제는 예를 들면 1,3-부탄디올 중 용액과 같은 비독성의 비경구용으로 허용되는 희석제 및/또는 용매 중의 멸균 주사가능 용액, 현탁액 및/또는 에멀션일 수 있다. 사용될 수 있는 허용가능 비히클 및 용매로는 물, 링거 용액, U.S.P. 및 등장성 나트륨 클로라이드 용액이 있다. 멸균된 고정 오일은 용매 또는 현탁 매체로서 편리하게 사용된다. 이와 같은 목적으로는, 합성 모노- 또는 디글리세리드를 포함한 임의의 무자극성인 고정 오일이 사용될 수 있다. 올레산과 같은 지방산이 주사가능제의 제조에 사용될 수 있다.
주사가능 제제는 예를 들면 세균-잔류 필터를 통한 여과, 및/또는 사용 전에 멸균수 또는 다른 멸균 주사가능 매체에 용해 또는 분산될 수 있는 멸균 고체 조성물 형태의 멸균제를 도입하는 것에 의해 멸균될 수 있다.
활성 성분의 효과를 연장하기 위해서는, 종종 피하 또는 근육내 주사로부터의 활성 성분의 흡수를 느리게 하는 것이 바람직하다. 이는 저조한 수용성을 가지는 결정질 또는 비정질 물질의 액체 현탁액의 사용에 의해 수행될 수 있다. 이후 약물의 흡수 속도는 그의 용해 속도에 따라 달라지며, 그것은 다시 결정 크기 및 결정질 형태에 따라 달라질 수 있다. 대안적으로, 비경구로 투여되는 약물 형태의 지연된 흡수는 약물을 오일 비히클에 용해 또는 현탁시키는 것에 의해 수행된다. 폴리락티드-폴리글리콜리드와 같은 생물분해가능 중합체 중 약물의 미세캡슐화 매트릭스를 형성시키는 것에 의하면, 주사가능 데포(depot) 형태가 제조된다. 약물 대 중합체의 비 및 사용되는 구체적인 중합체의 특성에 따라, 약물 방출의 속도는 조절될 수 있다. 다른 생물분해가능 중합체의 예에는 폴리(오르소에스테르) 및 폴리(무수물)이 포함된다. 데포 주사가능 제제는 신체 조직과 상용성인 리포솜 또는 미세에멀션 중에 약물을 포획하는 것에 의해 제조된다.
직장 또는 질 투여용 조성물은 통상적으로 조성물을 주변 온도에서는 고체이나 체온에서는 액체이며 그에 따라 직장 또는 질 공강에서 용융되어 활성 성분을 방출하는 적합한 비-자극성 부형제, 예컨대 코코아 버터, 폴리에틸렌 글리콜 또는 좌약 왁스와 혼합하는 것에 의해 제조될 수 있는 좌약이다.
경구 투여용 고체 투약 형태에는 캡슐, 정제, 환약, 분말 및 과립이 포함된다. 그와 같은 고체 투약 형태에서, 활성 성분은 1종 이상의 불활성이며 제약상 허용되는 부형제, 예컨대 나트륨 시트레이트 또는 디칼슘 포스페이트 및/또는 충전재 또는 연장제 (예컨대 전분, 락토스, 수크로스, 글루코스, 만니톨 및 실리크산), 바인더 (예컨대 카르복시메틸셀룰로스, 알기네이트, 젤라틴, 폴리비닐피롤리딘온, 수크로스 및 아카시아), 습윤제 (예컨대 글리세롤), 붕해제 (예컨대 아가, 칼슘 카르보네이트, 감자 또는 타피오카 전분, 알긴산, 소정 실리케이트 및 나트륨 카르보네이트), 용해 지연제 (예컨대 파라핀), 흡수 촉진제 (예컨대 사차 암모늄 화합물), 습윤제 (예컨대 세틸 알콜 및 글리세롤 모노스테아레이트), 흡수제 (예컨대 카올린 및 벤토나이트 점토) 및 윤활제 (예컨대 활석, 칼슘 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 고체 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 라우릴 술페이트), 및 이들의 혼합물과 혼합된다. 캡슐, 정제 및 환약의 경우, 투약 형태는 완충제를 포함할 수도 있다.
유사한 유형의 고체 조성물이 락토스 또는 유당은 물론 고분자량 폴리에틸렌 글리콜 등과 같은 부형제를 사용하는 연질 및 경질-충전 젤라틴 캡슐에서 충전재로 사용될 수 있다. 정제, 당의정, 캡슐, 환약 및 과립의 고체 투약 형태는 장 코팅 및 제약 제제 관련 기술분야에 잘 알려져 있는 기타 코팅과 같은 코팅 및 셸을 사용하여 제조될 수 있다. 그것은 임의적으로 불투명화제를 포함할 수 있으며, 임의적으로 지연되는 방식으로 장관로의 소정 부분에서만, 또는 거기에서 주로 그것이 활성 성분(들)을 방출하는 조성의 것일 수 있다. 사용될 수 있는 매립 조성물의 예에는 중합체 물질 및 왁스가 포함된다. 유사한 유형의 고체 조성물이 락토스 또는 유당은 물론 고분자량 폴리에틸렌 글리콜 등과 같은 부형제를 사용하는 연질 및 경질-충전 젤라틴 캡슐에서 충전재로 사용될 수 있다.
조성물의 국소 및/또는 경피 투여를 위한 투약 형태에는 연고, 페이스트, 크림, 로션, 젤, 분말, 용액, 스프레이, 흡입제 및/또는 패치가 포함될 수 있다. 일반적으로, 활성 성분은 멸균 조건하에서 필요할 수 있는 대로의 제약상 허용되는 부형제 및/또는 임의의 필요한 보존제 및/또는 완충제와 혼합될 수 있다. 또한, 본 발명은 종종 신체에 대한 화합물의 조절되는 전달을 제공한다는 부가적인 장점을 가지는 경피 패치의 사용을 고려한다. 그와 같은 투약 형태는 예를 들면 적정한 매체에 화합물을 용해 및/또는 분산시키는 것에 의해 제조될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 속도는 속도 조절 멤브레인을 제공하는 것, 및/또는 화합물을 중합체 매트릭스 및/또는 젤 중에 분산시키는 것 중 어느 하나에 의해 조절될 수도 있다.
본원에서 기술되는 피내 제약 조성물을 전달하는 데에 사용하기 위한 적합한 장치에는 단침 장치가 포함된다. 피내 조성물은 피부에 대한 바늘의 효과적인 침투 길이를 제한하는 장치, 및 그의 기능상 등가물에 의해 투여될 수 있다. 액체 분사 주사기를 통하여, 및/또는 각질층을 뚫고 진피에 도달하는 분사를 야기하는 바늘을 통하여 진피에 액체 조성물을 전달하는 분사 주사 장치가 적합하다. 피부 외부 층을 통하여 진피로 분말 형태인 백신을 가속하는 데에 압축 가스를 사용하는 탄도(ballistic) 분말/입자 전달 장치가 적합하다. 대안적으로 또는 추가적으로, 전통적인 망토식 피내 투여 방법에서는 통상적인 주사기가 사용될 수도 있다.
국소 투여에 적합한 제제에는 액체 및/또는 반액체 제제 예컨대 도찰제, 로션, 수중유 및/또는 유중수 에멀션 예컨대 크림, 연고 및/또는 페이스트, 및/또는 용액 및/또는 현탁액이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 활성 성분의 농도가 용매 중 활성 성분의 용해도 한계만큼 높을 수 있기는 하지만, 국소-투여가능 제제는 예를 들면 약 1 % 내지 약 10 % (w/w)의 활성 성분을 포함할 수 있다. 국소 투여용 제제는 또한 본원에서 기술되는 1종 이상의 추가적인 성분을 포함할 수 있다.
제약 조성물은 협강을 통한 폐 투여에 적합한 제제로 제조, 포장 및/또는 판매될 수도 있다. 그와 같은 제제는 활성 성분을 포함하며, 약 0.5 nm 내지 약 7 nm 또는 약 1 nm 내지 약 6 nm 범위의 직경을 가지는 건조 입자를 포함할 수 있다. 그와 같은 조성물은 편리하게는 건조 분말 저장소를 포함하며 분말을 분산시키기 위하여 거기로 추진제 스트림이 가이드될 수 있는 장치를 사용하고/거나 자가-추진 용매/분말 분배 용기 예컨대 밀봉된 용기 내에 저-비점 추진제에 용해 및/또는 현탁된 활성 성분을 포함하는 장치를 사용한 투여를 위한 건조 분말의 형태이다. 그와 같은 분말은 중량 기준 입자의 98 % 이상이 0.5 nm를 초과하는 직경을 가지며, 수 기준 입자의 95 % 이상이 7 nm 미만의 직경을 가지는 입자를 포함한다. 대안적으로는, 중량 기준 입자의 95 % 이상이 1 nm를 초과하는 직경을 가지며, 수 기준 입자의 90 % 이상이 6 nm 미만의 직경을 가진다. 건조 분말 조성물은 고체 미세 분말 희석제 예컨대 당을 포함할 수 있으며, 단위 투여분 형태로 편리하게 제공될 수 있다.
저비점 추진제에는 일반적으로 주변 압력에서 65 ℉ 미만의 비점을 가지는 액체 추진제가 포함된다. 일반적으로, 추진제는 조성물의 50 % 내지 99.9 % (w/w)를 구성할 수 있으며, 활성 성분은 조성물의 0.1 % 내지 20 % (w/w)를 구성할 수 있다. 추진제는 또한 추가적인 성분 예컨대 액체 비-이온계 및/또는 고체 음이온계 계면활성제 및/또는 고체 희석제 (활성 성분을 포함하는 입자와 동일한 수준의 입자 크기를 가질 수 있음)를 포함할 수 있다.
폐 전달용으로 제제화되는 제약 조성물은 용액 및/또는 현탁액의 액적 형태로 활성 성분을 제공할 수 있다. 그와 같은 제제는 활성 성분을 포함하며 임의적으로 멸균된 수성 및/또는 희석 알콜 용액 및/또는 현탁액으로 제조, 포장 및/또는 판매될 수 있으며, 임의의 분무 및/또는 원자화 장치를 사용하여 편리하게 투여될 수 있다. 그와 같은 제제는 또한 비제한적으로 향미제 예컨대 사카린 나트륨, 휘발성 오일, 완충제, 표면 활성제 및/또는 보존제 예컨대 메틸히드록시벤조에이트를 포함한 1종 이상의 추가적인 성분들을 포함할 수 있다. 이와 같은 투여 경로에 의해 제공되는 액적은 약 0.1 nm 내지 약 200 nm 범위의 평균 직경을 가질 수 있다.
폐 전달에 유용한 것으로 본원에서 기술되는 제제는 제약 조성물의 비내 전달에 유용하다. 비내 투여에 적합한 또 다른 제제는 활성 성분을 포함하며 약 0.2 ㎛ 내지 500 ㎛의 평균 입자를 가지는 조질 분말이다. 그와 같은 제제는 코담배가 섭취되는 방식으로, 즉 코 근처에서 유지되는 분말의 용기로부터의 비내 통과를 통한 빠른 흡입에 의해 투여된다.
비내 투여에 적합한 제제는 예를 들면 대략 0.1 % (w/w)만큼 소량 내지 100 % (w/w)만큼 다량의 활성 성분을 포함할 수 있으며, 본원에서 기술되는 1종 이상의 추가적인 성분들을 포함할 수 있다. 제약 조성물은 협측 투여에 적합한 제제로 제조, 포장 및/또는 판매될 수 있다. 그와 같은 제제는 예를 들면 통상적인 방법을 사용하여 제조되는 정제 및/또는 로젠지의 형태일 수 있으며, 예를 들면 0.1 % 내지 20 % (w/w)의 활성 성분을 포함할 수 있고, 나머지는 경구로 용해가능하고/거나 분해가능한 조성물, 및 임의적으로 본원에서 기술되는 1종 이상의 추가적인 성분들을 포함한다. 대안적으로, 협측 투여에 적합한 제제는 활성 성분을 포함하는 분말, 및/또는 에어로졸화 및/또는 분무화된 용액 및/또는 현탁액을 포함할 수 있다. 그와 같은 분말화, 에어로졸화 및/또는 에어로졸화된 제제는 분산될 경우, 약 0.1 nm 내지 약 200 nm 범위의 평균 입자 및/또는 액적 크기를 가질 수 있으며, 추가적으로 본원에서 기술되는 임의의 추가적인 성분 1종 이상을 포함할 수 있다.
제약 조성물은 안구 투여에 적합한 제제로 제조, 포장 및/또는 판매될 수 있다. 그와 같은 제제는 예를 들면 수성 또는 유성 액체 부형제 중 활성 성분의 예컨대 0.1/1.0 % (w/w) 용액 및/또는 현탁액을 포함한 점안액의 형태일 수 있다. 그와 같은 액적은 추가적으로 완충제, 염, 및/또는 본원에서 기술되는 1종 이상의 다른 임의의 추가적인 성분들을 포함할 수 있다. 유용한 다른 안구-투여가능 제제에는 미세결정질 형태 및/또는 리포솜 제제로써 활성 성분을 포함하는 것들이 포함된다. 점이액 및/또는 점안액은 본 발명의 영역에 속하는 것으로 고려된다.
제약 작용제의 제제화 및/또는 제조에 있어서의 일반적인 고려사항들은 예를 들면 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy 21st ed., Lippincott Williams & Wilkins, 2005] (본원에 참조로 포함됨)에서 찾아볼 수 있다.
투여
본 발명은 기능성 이펙터 단백질과 회합된 초하전 단백질의 조성물을 그를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서는, 다른 기능성 이펙터 단백질 (예컨대 Cas9 단백질) 및 양이온성 지질 및/또는 양이온성 중합체를 포함하는 조성물의 투여 방법이 제공된다. 그와 같은 조성물은 질환, 장애 및/또는 이상을 예방, 치료, 진단 또는 영상화하는 데에 효과적인 임의의 양 및 임의의 투여 경로를 사용하여 대상체에게 투여될 수 있다. 필요한 정확한 양은 대상체의 종, 연령 및 일반적인 상태, 질환의 중증도, 구체적인 조성물, 그의 투여 양식, 그의 활성 양식 등에 따라 대상체마다 달라질 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 통상적으로 투여의 용이성 및 투약량의 균일성을 위하여 투약 단위 형태로 제제화된다. 그러나, 본 발명 조성물의 총 하루 용법이 적절한 의료적 판단의 영역 내에서 주치의에 의해 결정되게 된다는 것은 이해될 것이다. 임의의 특정 환자에 대한 구체적으로 치료상 효과적이거나, 예방상 효과적이거나, 또는 영상화에 적절한 투여량 수준은 치료되는 장애 및 장애의 중증도; 사용되는 구체적인 화합물의 활성; 사용되는 구체적인 조성물; 환자의 연령, 체중, 일반적인 건강, 성 및 식단; 사용되는 구체적인 화합물의 투여 시간, 투여 경로 및 배설률; 치료 기간; 사용되는 구체적인 화합물과 조합으로써 또는 동시에 사용되는 약물; 및 의료 관련 기술분야에 잘 알려져 있는 유사 인자들을 포함한 다양한 인자들에 따라 달라지게 된다.
전달될 기능성 이펙터 단백질과 회합된 초하전 단백질의 조성물은 물론, 예컨대 Cas9 단백질 및 양이온성 지질을 포함하는 조성물은 어떠한 경로에 의해서도 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 그와 같은 조성물은 경구, 정맥내, 근육내, 동맥-내, 척수내, 수막강내, 피하, 심실내, 경피, 피간, 직장, 질내, 복강내, 국소 (예컨대 분말, 연고, 크림, 젤, 로션 및/또는 액적에 의함), 점막, 비내, 협측, 장, 유리체, 종양내, 설하; 기관내 점적, 기관지 점적 및/또는 흡입을 포함한 다양한 경로들 중 1종 이상에 의해; 경구 스프레이, 비내 스프레이 및/또는 에어로졸로서, 및/또는 간문맥 카테터를 통하여 투여된다. 일부 실시양태에서, 초하전 단백질 또는 복합체, 및/또는 그의 제약, 예방, 진단 또는 영상화 조성물은 전신성인 정맥내 주사에 의해 투여된다. 특정 실시양태에서, 초하전 단백질 또는 복합체, 및/또는 그의 제약, 예방, 진단 또는 영상화 조성물은 정맥내 및/또는 경구로 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, 그와 같은 조성물은 기능성 이펙터 단백질이 혈액-뇌 장벽, 혈관 장벽 또는 기타 상피 장벽을 건너는 것을 가능케 하는 방식으로 투여될 수 있다.
소정 실시양태에서, 본 발명에 따른 조성물은 원하는 치료, 진단, 예방 또는 영상화 효과를 수득하기 위하여, 하루에 1회 이상 대상체 체중 기준 일 당 약 0.0001 mg/kg 내지 약 100 mg/kg, 약 0.01 mg/kg 내지 약 50 mg/kg, 약 0.1 mg/kg 내지 약 40 mg/kg, 약 0.5 mg/kg 내지 약 30 mg/kg, 약 0.01 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 0.1 mg/kg 내지 약 10 mg/kg 또는 약 1 mg/kg 내지 약 25 mg/kg인 양의 기능성 이펙터 단백질을 전달하기에 충분한 투약량 수준으로 투여될 수 있다. 상기 원하는 투약량은 하루에 3회, 하루에 2회, 하루에 1회, 2일마다, 3일마다, 매주, 2주마다, 3주마다 또는 4주마다 전달될 수 있다. 소정 실시양태에서, 원하는 투약량은 다중 투여 (예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14회 또는 그 이상의 투여)를 사용하여 전달될 수 있다.
기능성 이펙터 단백질과 결합된 초하전 단백질을 포함하는 조성물은 1종 이상의 다른 치료제, 예방제, 진단제 또는 영상화제와의 조합으로써 투여될 수 있다. "~와의 조합으로써"가 작용제가 동시에 투여되고/거나 함께 전달용으로 제제화되어야 함을 의미하고자 하는 것은 아니지만, 이러한 전달 방법도 본 발명의 영역 내에 속한다. 조성물은 1종 이상의 다른 원하는 치료제 또는 의료적 절차와 동시에, 그 전에, 또는 그에 이어서 투여될 수 있다. 일반적으로, 각 작용제는 그 작용제에 대하여 정해지는 투여량 및/또는 시간 일정으로 투여되게 된다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 그의 생체이용률을 향상시키거나 그의 대사를 감소시키고/거나 변형시키거나, 그의 배설을 억제하고/거나, 신체 내에서의 그의 분포를 변형시킬 수 있는 작용제와의 조합으로써의 제약, 예방, 진단 또는 영상화 조성물의 전달을 포괄한다.
키트
본 발명은 본 발명의 방법을 편리하고/거나 효과적으로 수행하기 위한 다양한 키트들을 제공한다. 통상적으로, 키트는 사용자가 다수의 대상자(들) 치료를 수행하고/거나 다수의 실험을 수행하는 것을 가능케 하기에 충분한 양 및/또는 수의 구성요소들을 포함하게 된다. 일부 실시양태에서, 키트는 (i) 본원에서 기술되는 바와 같은 초하전 단백질; (ii) 전달될 기능성 이펙터 단백질; (iii) 양이온성 지질 및/또는 양이온성 중합체; 및 (iv) 초하전 단백질과 회합된 기능성 단백질을 포함하는 조성물을 제제화하기 위한 지침 중 1종 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 키트는 Cas9 단백질 및 양이온성 지질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 키트는 초하전 단백질 및/또는 전달될 기능성 단백질을 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 키트는 융합 단백질을 생성시키기 위한 기능성 이펙터 단백질의 인-프레임 클로닝을 가능케 하는, 초하전 단백질 및 클로닝 부위를 코딩하는 클로닝 벡터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키트는 기능성 이펙터 단백질과 회합된 초하전 단백질을 포함하는 본원에서 제공되는 제약 조성물; 대상체에 대한 제약 조성물의 투여를 위한 주사기, 바늘 또는 적용장치; 및 대상체에 대한 제약 조성물의 투여를 위한 지침을 포함한다.
하기의 실시예를 숙고하면, 본 발명의 이들 및 기타 측면들에 대해 추가적으로 알게 될 것인 바, 이는 소정의 구체적인 본 발명 실시양태들을 예시하고자 하는 것으로써, 청구범위에 의해 한정되는 바와 같은 그의 영역을 제한하고자 하는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1: 초하전 GFP에 융합된 TALE 활성화인자의 전달
갈색 또는 백색 지방세포 세포 운명으로 섬유모세포 세포 운명을 재프로그래밍하기 위한 주 표적은 PRDM16 및 PPARγ의 발현에 의해 좌우되는 백색 지방 조직 (WAT)으로부터 갈색 지방 조직 (BAT)으로의 전환에 있다. 섬유모세포 내 PPARγ 및 PRDM16 게놈 서열을 표적으로 하는 +36 GFP에 융합된 강력한 TALE 전사 활성화인자를 조작하였다. 헤파린 컬럼 및/또는 SEC를 사용하여 융합 단백질을 정제하였는데, 겔상 130 kD에서 단일 밴드로 나타났다. TALE 활성화인자 전달 후의 발현 및 세포 표현형에 대한 효과의 조절을 PPARγ cDNA의 바이러스 전달에 이어지는 지방생성 칵테일을 사용한 7-일 처리 후의 조절과 비교하였다. +36 GFP TALEPRDM16 융합체를 사용한 처리시 지방세포가 형성됨이 관찰되엇다. 초하전 PRDM16 TALE 활성화인자의 전달 후, 백색 지방 조직 마커 유전자의 발현이 검출되었다.
PPARγ용 TALE 활성화인자의 1회 초하전 단백질-매개 전달이 백색-지방 유전자의 발현을 유도하며, 백색-지방 세포로 섬유모세포를 분화시킨다는 것이 발견되었다. PPARγ 및 PRDM16 TALE 활성화인자 양자의 초하전 단백질-매개 전달은 PRDM16, cox8b, elovl3 및 cidea와 같은 갈색-지방 마커의 발현 증가는 물론, 발열 유전자 발현 마커인 PGC1a 및 UCP1의 소폭 증가를 동반하여, 지방 세포의 분화를 유도하였다.
아우레인(aurein) 펩티드를 +36 GFP-TALE-활성화인자 융합 단백질의 N-말단에 융합시켰다. 처리된 세포의 핵에서 형광을 검출하는 것에 의해, 헤파린 컬럼에 의해 정제된 아우레인 +36 GFP TALE의 전달을 관찰하였다.
도 1은 포유동물 세포에의 거대분자 전달의 개략도를 나타낸다. 도 2는 백색 지방 조직 (WAT)으로부터 갈색 지방 조직 (BAT)으로의 전환의 개관을 나타낸다. 도 3은 PPARγ 또는 PRDM16을 표적으로 하도록 프로그래밍된 TALE 활성화인자를 전달하기 위한 초하전 전달 플랫폼의 개략도를 나타낸다. 도 4는 +36 GFP 융합체, 18.5mer TALE 도메인 및 VP64 활성화 도메인을 포함하는 융합 단백질의 개략도를 나타낸다. 도 5는 +36 GFP-TALE 활성화인자-융합 단백질의 발현 및 정제를 나타낸다. 도 6은 +36 GFP PPARγ 및 PRDM16 TALE 활성화인자 융합 단백질 전달시의 지방 세포 조절인자 유전자의 활성화에 대한 시험 검정을 나타낸다.
도 7은 상이한 농도에서의 +36 GFP TALE 활성화인자 융합 단백질의 전달 효능을 나타낸다. 도 8은 NIH 3T3 세포에서의 2종의 상이한 +36 GFP-PRDM16 TALE 융합 단백질의 전달 효능 비교를 나타낸다. 도 9는 PPARγ-TALE 활성화인자 융합체 전달 후의 PPARγ 유전자 발현, 및 다양한 대조에의 비교를 나타낸다. 도 10은 RDM16-TALE 활성화인자 융합체 전달 후의 PRDM16 유전자 발현, 및 다양한 대조에의 비교를 나타낸다. 도 11은 혈청 존재하에서 관찰되는 중간 정도의 TALE 활성을 나타낸다.
도 12는 PPARγ의 바이러스 전달 후 이어지는 지방생성 칵테일을 사용한 7-일 처리의 실증을 나타낸다. 도 13은 WAT 및 BAT로 섬유모세포를 프로그래밍하는 것에 대한 검정의 개략도를 나타낸다. 도 14는 +36 GFP TALE 활성화인자 융합 단백질을 사용한 처리시 관찰되는 지방세포 형성을 나타낸다. 도 15는 바이러스 전달은 물론 초하전 PPARγ TALE 활성화인자 융합 단백질 전달 후의 지방세포의 형성을 입증하는, 리피드톡스(LipidTOX) 레드를 사용한 다양한 7일 후 처리의 염색을 나타낸다. 도 16은 바이러스 전달은 물론 초하전 PPARγ TALE 활성화인자 융합 단백질 전달 후의 지방세포의 형성을 입증하는, 리피드톡스 레드를 사용한 다양한 7일 후 처리 후의 세포의 염색을 나타낸다. 도 17은 바이러스 전달은 물론 초하전 PPARγ TALE 활성화인자 융합 단백질 전달 후의 WAT 바이오마커 유전자의 발현을 나타낸다.
실시예 2: 초하전된 GFP에 융합된 TALE 활성화인자의 생체 내 전달
NIH 3T3 세포를 70-90 % 전면생장률(confluence)시까지 성장시키고, 혈청이 없는 DMEM 중에서 1 μM 또는 0.5-5 μM 사이의 +36 GFP PPARγ TALE 및/또는 +36 GFP PRDM16 TALE 융합 단백질을 사용하여 처리하였다. 무-혈청 배지를 선택하였는데, 혈청이 단백질-기반 전달의 효과성을 감소시킬 수 있기 때문이었다. 세포를 각 융합 단백질 용액과 함께 4시간 동안 인큐베이팅한 후, 배지를 제거하고, 혈청을 함유하는 완전 DMEM을 다시 세포에 첨가하였다. 공지의 프로토콜에 따라 (예컨대 그의 전체 내용이 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Seale et al. 2008 Nature 454, 961-967] 참조) WAT 및 BAT 유전자의 발현에 대한 양성 대조로 사용하기 위하여 PPARγ 또는 PRDM16을 코딩하는 바이러스 구성체로 대조 세포들을 감염시켰다. 일단 모든 세포가 100 % 전면생장률에 도달하고 나서, 이소부틸메틸크산틴, 인슐린, 로시글리타존, 덱사메토손, T3 및 인도메타신을 함유하는 지방생성 칵테일을 세포에 첨가하고, 48시간 후 인슐린, T3 및 로시글리타존만을 함유하는 칵테일의 형태로 교체하였다. 이와 같은 두 번째 칵테일 교체 48시간 후, 또 다른 투약량의 T3, 인슐린 및 로시글리타존을 세포에 첨가하였다. 실험 개시로부터 1주일 현재인 다음날, TRIzol을 사용하여 세포를 수확하고, 총 RNA를 추출한 후, qRT-PCR을 수행함으로써, PPARγ, PRDM16, 및 기타 갈색 지방 마커 유전자 예컨대 UCP1, PGC1a, Elov13 및 Cidea의 유전자 발현 수준을 측정하였다.
도 18은 생체 내에서 갈색-지방 지방세포를 유도하기 위한 초하전 PRDM16 TALE 활성화인자 융합 단백질의 전달을 나타낸다. PPARγ 및 PRDM16의 바이러스 전달 및 또한 초하전 TALE 활성화인자 단백질 융합체의 전달 후, 강력한 지방세포 형성이 관찰되었다. 도 19는 세포에 대한 PPARγ 및 PRDM16의 초하전 (TALE) 및 바이러스 전달의 비교를 나타낸다. 도면은 PPARγ 및 PRDM16의 발현에 의한 갈색 지방 마커의 TALE/TALE, 바이러스/TALE 및 바이러스/바이러스-유도 발현을 나타낸다. 도 20은 리피드톡스 염색에 의해서도 관찰되었던 지방 세포 분화와 일치하는 RT-qPCR 평가를 타나낸다.
실시예 3: 초하전된 GFP와 복합체화된 TALE 활성화인자의 전달
전달 효능을 향상시키기 위하여, 기능성 단백질이 초하전 단백질과 비-공유로 회합된 단백질 복합체를 생성시킨 후, 세포에 투여하였다. 도 21은 +36 GFP와의 복합체로서의 기능성 TALE 활성화인자 융합 단백질의 전달이 전달 후 TALE 활성화인자 활성을 향상시킨다는 것을 나타낸다. 도 22는 +36 GFP와의 융합체 (+36 GFP PRDM16 TALE-3) 또는 복합체 (+36 GFP + PRDM16 TALE-3) 중 어느 하나로서의 TALE 활성화인자 융합체 전달 후의 PRDM16 유전자 발현을 나타낸다. 복합체의 전달이 TALE 활성화인자 활성을 증가시키는 경향이 있다는 것이 관찰되었다.
실시예 4: 전달 효능에 대한 아우레인 융합의 효과
도 23은 TALE 활성화인자 융합체 전달 (+36 GFP와의 융합체 또는 복합체 중 어느 하나로서의 것) 후 PRDM16 유전자 발현에 대한 +36 GFP에의 N-말단 아우레인 펩티드 융합의 효과를 나타낸다. 아우레인 펩티드를 GGS(9) (서열 252) 링커를 통하여 GFP-TALE 구성체의 N-말단에 융합시킴으로써, 아우레인 펩티드-GGS(9) 링커-(+)36 GFP 단백질-GGS(9) 링커-PRDM16 TALE-3 융합 단백질을 생성시켰다. 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여, 상기 단백질을 정제하였다.
실시예 5: 초하전된 GFP 또는 양이온성 지질과 복합체화된 TALE 활성화인자의 전달
도 24는 +36 GFP와의 융합체 (+36 GFP PRDM16 TALE-3), +36 GFP와의 복합체 (+36 GFP + PRDM16 TALE-3), 또는 리포펙타민 LTX와의 복합체 중 어느 하나로서의 TALE PRDM16 활성화인자 단백질 전달 후의 PRDM16 유전자 발현을 나타낸 것으로써, 유전자 발현의 증가가 관찰되었다.
실시예 6: 초하전된 GFP에 융합된 Cas9의 전달
포유동물 세포에의 Cas9의 초하전 전달은 선행 전달 방법들의 결점이 없는 세포에서의 강력한 RNA-프로그램가능 뉴클레아제 기술의 적용을 가능케 하게 된다. 이와 관련하여, ALAL 링커를 사용하여, +36 GFP와의 Cas9 융합체를 생성시켰다. 도 25는 Cas9와의 초하전 융합 단백질의 개략도를 나타낸다. 도 26은 야생형 Cas9 단백질, 및 +36 GFP 및 아우레인-GGS9와의 Cas9 융합 단백질의 정제를 나타낸다. 융합 단백질은 상기한 TALE 활성화인자 융합 단백질과 동일한 방식으로 투여된다. 일단 세포에 전달되고 나면, Cas9는 세포 게놈 중 그의 표적 부위에 결합하여 그것을 절단한다. 표적 세포에서의 뉴클레아제 활성은 적합한 검정, 예컨대 사우던 블럿 또는 서열분석 검정을 통하여 검출된다.
실시예 7: 시험관 내 및 생체 내에서의 게놈 편집 단백질의 효율적인 전달
게놈-편집 작용제를 포함한 단백질 치료제들의 잠재력을 완전히 실현하기 위해서는 핵 또는 세포질로의 단백질의 효율적인 세포내 전달이 필요하다. 현행 단백질 전달 방법은 종종 혈청 단백질에 대한 낮은 내성, 저조한 엔도솜 탈출, 및 제한된 생체 내 효능을 겪고 있다. 본 실시예에서 입증되는 바와 같이, 원래 핵산 형질감염을 위해 개발되었던 일반적인 양이온성 지질 반응물들이 음으로 초하전된 단백질에 융합되거나, 천연 음이온성 도메인을 포함하고 있거나, 또는 자연적으로 음이온성 핵산에 결합하는 단백질을 강력하게 전달할 수 있다. 이와 같은 접근법은 10 % 혈청을 함유하는 배지에서의 낮은 나노몰 농도에서의 배양된 인간 세포에의 Cre 레콤비나제, TALE- 및 Cas9-기반 전사 활성화인자, 및 Cas9:sgRNA 뉴클레아제 복합체의 기능성인 전달을 매개한다. 지질-기반 전달은 양이온성 단백질 전달 전략에 비해 > 1,000-배 더 강력할 수 있다. 아마도 전달되는 Cas9:sgRNA 복합체의 일시적 특성으로 인하여, Cas9:sgRNA 복합체의 전달은 표준 DNA 형질감염에 비해 실질적으로 더 높은 특이성으로 80 %만큼 높은 게놈 변형 효율로 이어졌다. 이와 같은 접근법은 또한 생체 내에서의 마우스 내이에의 Cre 레콤비나제 및 Cas9:sgRNA 복합체의 효율적인 전달을 매개함으로써, 표적으로 하는 털-세포 군집에서 90 %까지의 Cre-매개 레콤비나제 및 20 %의 Cas9-매개 게놈 변형을 달성하였다.
재료 및 방법
Cas9, Cre 및 TALE 융합체 및 sgRNA 발현 플라스미드의 구성
본 문서에서 사용되는 모든 구성체의 서열들은 하기에 목록화되어 있거나, 또는 명세서의 다른 곳에서 제공된다. 모든 단백질 구성체는 pET29a 발현 플라스미드로 클로닝된 해당 단백질용으로 이전에 보고된 플라스미드로부터 생성되었다.
에스. 파이오제네스
Cas9 및 기타 단백질의 발현 및 정제
N-말단 10xHis-태그/말토스 결합 단백질에 융합된 에스. 파이오제네스 Cas9를 코딩하는 pMJ80647을 사용하여, 이. 콜리 BL21 STAR (DE3) 적격 세포 (라이프 테크놀로지스(Life Technologies) 사)를 형질전환시켰다. 생성되는 발현 균주를 37 ℃에서 밤새 100 ㎍/mL의 암피실린을 함유하는 루리아-베르타니(Luria-Bertani) (LB) 브로스에 접종하였다. 세포를 동일한 성장 배지에 1:100으로 희석하고, 37 ℃에서 OD600 = ~0.6까지 성장시켰다. 배양물을 20 ℃에서 30분 동안 인큐베이팅하고, Cas9 발현을 유도하기 위하여 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노시드 (IPTG)를 0.5 mM로 첨가하였다. 대략 16시간 후, 8,000 g에서의 원심분리에 의해 세포를 수집하고, 용해 완충제 (50 mM 트리스(히드록시메틸)-아미노메탄 (트리스)-HCl, pH 8.0, 1 M NaCl, 20 % 글리세롤, 10 mM 트리스(2-카르복시에틸)포스파인 (TCEP))에 재현탁시켰다. 초음파처리 (1초 펄스-켜기, 1초 펄스-끄기로 6 W 출력에서 총 15분 동안)에 의해 세포를 용해시키고, 20,000 g에서의 30분 동안의 원심분리에 의해 가용성 용해질을 수득하였다.
상기 세포 용해질을 4 ℃에서 30분 동안 His-Pur 니켈-니트릴로아세트산 (니켈-NTA) 수지 (서모 사이언티픽(Thermo Scientific) 사)와 함께 인큐베이팅함으로써, His-태그화된 Cas9를 포획하였다. 상기 수지를 20-mL 컬럼으로 옮기고, 20 컬럼 부피의 용해 완충제를 사용하여 세척하였다. 50 mM 트리스-HCl (pH 8), 0.1 M NaCl, 20 % 글리세롤, 10 mM TCEP 및 300 mM 이미다졸에서 Cas9를 용리하고, 아미콘(Amicon) 초원심분리 필터 (밀리포어(Millipore) 사, 100-kDa 분자량 컷-오프)에 의해 ~50 mg/mL로 농축하였다. 4 ℃에서의 20시간 동안의 TEV 프로테아제 처리에 의해 6xHis 태그 및 말토스-결합 단백질을 제거하고, 두 번째 Ni-친화성 정제 단계에 의해 포획하였다. Cas9를 함유하는 용리액을 50 mM 트리스-HCl (pH 8), 0.1 M NaCl, 20 % 글리세롤 및 10 mM TCEP을 함유하는 정제 완충제 중에서 하이트랩(HiTrap) SP HP 컬럼 (GE 헬스케어(Healthcare) 사)에 주사하였다. 0.1 M 내지 1 M의 선형 NaCl 구배를 가지는 정제 완충제를 사용하여, 5 컬럼 부피에 걸쳐 Cas9를 용리하였다. Cas9를 함유하는 용리된 분획을 비신코닌산 검정 (BCA) (피어스 바이오테크놀로지(Pierce Biotechnology) 사)에 의해 정제하였을 때 200 μM의 농도까지 농축하고, 액체 질소 중에서 급속-냉동시킨 후, -80 ℃에서 분취량으로 저장하였다. 모든 다른 단백질들을 이와 같은 방법으로, 그러나 TEV 절단 단계 없이 정제하고, 동일한 정제 프로토콜을 사용하여 하이-트랩 Q HP 음이온 교환 컬럼 (GE 헬스케어 사)을 사용한 음이온 교환에 의해, (-30)GFP를 포함하는 단백질을 정제하였다.
sgRNA의 시험관 내 전사
T7 프로모터 결합 부위에 이어지는 20-bp sgRNA 표적 서열을 포함하는 선형 DNA 단편을 시험관 내에서 T7 고수율 RNA 합성 키트 (NEB 사)를 사용하여 제조자의 지침에 따라 전사하였다. 에탄올을 사용하여 시험관 내 전사된 RNA를 침전시키고, 크리테리온(Criterion) 10 % 폴리아크릴아미드 TBE-우레아 겔 (바이오-래드(Bio-Rad) 사)에서의 겔 전기영동에 의해 정제하였다. 절제된 겔 단편을 420 μL의 300 mM NaCl 중에서 진동 표면상 4 ℃로 밤새 추출하였다. 에탄올을 사용하여 겔-정제된 sgRNA를 침전시키고, 물에 재용해시킨 후, UV 흡광도에 의해 sgRNA 농도를 최종적으로 정량하고, -80 ℃에서 급속-냉동시켰다.
플라스미드 형질감염
리포펙타민 2000 (라이프 테크놀로지스 사)을 사용하여 제조자의 프로토콜에 따라 플라스미드 DNA를 형질감염시켰다. TALE 활성화인자 플라스미드의 경우 300 ng의 DNA를 형질감염시켰으며, 활성화인자 상승작용 실험의 경우, 각각 60 ng의 5개 플라스미드를 합쳐 형질감염시켰다. Cas9 뉴클레아제 전달 실험의 경우, sgRNA를 발현하는 선형 DNA PCR 생성물을 CLTA, EMX, VEGF 및 GFP (니카제 연구를 위한 sgRNA GFP g1, GFP g3, GFP g5 및 GFP g7)의 게놈 부위를 표적으로 하는 형질감염 실험에 사용하였다. 주형으로서의 U6 프로모터, 및 U6 프로모터 상류 서열을 보유하는 순방향 프라이머, 및 U6 하류 서열에 이어지는 sgRNA 서열 (각 표적에 고유한 20-bp 서열 더하기 불변 sgRNA 백본 구성 서열)을 포함하는 역방향 프라이머를 포함하는 플라스미드를 사용하여, 선형 DNA PCR 생성물을 생성시켰다. 선형 DNA 주형으로부터 발현되는 sgRNA는 T7 전사에 해당 염기들을 필요로 하였던 시험관 내 전사 sgRNA와 일치하는 2개 이상의 5' 구아노신을 포함하였다. 프라이머 서열 및 PCR 조건은 하기에 열거하였다. dCas9 활성화인자 실험의 경우, 700 ng의 Cas9 또는 dCas9-VP64 플라스미드 DNA를 250 ng의 적절한 sgRNA 발현 플라스미드와 공동-형질감염시켰다. 활성화인자 상승작용 실험의 경우, 각각으로부터의 DNA 50 ng의 6개 sgRNA를 합쳐, 700 ng의 dCas9-VP64 플라스미드와 공동-형질감염시켰다.
세포 배양물 내에서의 양이온성 지질과 복합체화된 전사 인자 단백질의 전달
시험관 내 및 생체 내 모두에서의 게놈-편집 단백질의 전달에 대한 더 깊이 있는 설명은 하기에서 찾아볼 수 있다. 간단하게 말하자면, 다음날 ~70 %의 전면생장률에 도달하는 데에 필요한 세포 밀도에서, 10 % FBS ("완전 혈청 배지") 및 항생제를 포함하는 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Media) 더하기 글루타맥스(GlutaMAX) (라이프 테크놀로지스 사, 캘리포니아 칼스배드 소재) 중에서 48-웰 포맷 (250 μL 부피)에 배양된 세포를 플레이팅하였다. 전달 1시간 전에, 완전 혈청 배지를 동일하나 항생제를 함유하지 않는 배지로 교체하였다. 인큐베이션 시간을 포함한 표준 플라스미드 형질감염에 대한 제조자의 프로토콜에 따라, 25 μL 옵티멈(OPTIMEM) 배지 (라이프 테크놀로지스 사, 캘리포니아 칼스배드 소재)에서 1 nM 내지 1 μM의 단백질 (275 μL의 최종 부피)을 0.5-1.5 μL의 시중에서 구입가능한 양이온성 지질과 조합하는 것에 의해, Cre 및 TALE 단백질의 전달을 수행하였다. 시험관 내에서의 Cas9 전달의 경우, 전사된 sgRNA를 Cas9 단백질과 함께 5분 동안 인큐베이팅한 후, 양이온성 지질 반응물과 복합체화하였다. 25 μL의 옵티멈 배지 중 지질 복합체를 세포에 첨가하고, 다르게 언급되지 않는 한 배지를 12-16시간 후 새로운 배지로 교체하였다. 전달 48시간 후에 재조합에 대하여, 전달 4 또는 16시간 후 중 어느 하나에 유전자 활성화에 대하여, 그리고 전달 72시간 후에 유전자 변형에 대하여 세포를 검정하였다.
게놈 변형을 검출하기 위한 T7 엔도뉴클레아제 I 검정
U2OS-EGFP 세포 또는 HEK293T 세포를 Cas9 발현 및 sgRNA 발현 플라스미드 또는 상기한 바와 같은 선형 DNA PCR 생성물을 사용하여 형질감염시키거나, 또는 Cas9 단백질만으로, 시험관 내 전사된 sgRNA만으로, 또는 RNAiMAX만으로 처리하였다. 형질감염 2일 후, 디엔어드밴스(DNAdvance) 키트 (에이젠코트(Agencourt) 사)를 사용하여 제조자의 지침에 따라 세포로부터 게놈 DNA를 단리하였다. 200 ng의 게놈 DNA를 PCR 반응의 주형으로 사용하여 하기에서 열거되는 조사 프라이머(survey primer) 쌍이 측접되어 있는 표적 게놈 좌위를 증폭하였다. 키아퀵(QIAquick) PCR 정제 키트 (키아젠(Qiagen) 사)를 사용하여 PCR 생성물을 젱제한 후, 퀀트(Quant)-iT™ 피코그린(PicoGreen)® dsDNA 키트 (라이프 테크놀로지스 사)를 사용하여 정량하였다. 250 ng의 정제된 PCR DNA를 19 μL의 총 부피로 2 μL의 엔이버퍼(NEBuffer) 2 (NEB 사)와 조합하고, 95 ℃로 5분; 2 ℃/s로 95 내지 85 ℃; 0.2 ℃/s로 85 내지 20 ℃의 열순환에 의해 변성시킨 다음 재-어닐링하였다. 재-어닐링된 DNA를 37 ℃에서 15분 동안 1 μl의 T7 엔도뉴클레아제 I (10 U/μl, NEB 사)와 함께 인큐베이팅하였다. 10 μL의 50 % 글리세롤을 T7 엔도뉴클레아제 반응에 첨가하고, 12 μL를 200 V에서 30분 동안 전기영동되는 5 % TBE 18-웰 크리테리온 PAGE 겔 (바이오-래드 사)에서 분석한 다음, 1x SYBR 골드 (라이프 테크놀로지스 사)를 사용하여 30분 동안 염색하였다. 알파이매저(AlphaImager) HP (알파 이노테크(Alpha Innotech) 사)에서 Cas9-유도 절단 밴드 및 비절단 밴드를 가시화하고, 이미지제이(ImageJ) 소프트웨어를 사용하여 정량하였다54. 절단 밴드의 피크 강도를 모든 밴드 (비절단 + 절단 밴드)의 총 강도로 나눔으로써 절단된 분율을 측정하고, 이전에 기술된 바와 같은 유전자 변형 수준을 추정하는 데에 그것을 사용하였다46. 각 샘플에 대하여, 형질감염 및 이후의 변형 측정은 상이한 일자에 3반복으로 수행하였다.
줄기 세포 배양 및 전달
15 % FBS (기브코(Gibco) 사), 100 mM MEM 비필수 아미노산 (기브코 사), 0.55 mM 2-메르캅토에탄올 및 백혈병 억제 인자 (1,000 유닛/ml; 케미콘(Chemicon) 사)를 포함하는 DMEM 중에서, 영구 GFP 유전자 삽입을 포함하는 마우스 배아 줄기 세포 (ES) 주인 Tau-GFP를 배양하였다. 5일 후, GFP 형광을 나타내는 부상 구체들이 형성되었다. Cas9:sgRNA 복합체 및 RNAiMAX를 부상 구체를 함유하는 배양물에 16시간 동안 첨가하였다. Cas9:sgRNA 처리 후, 세포를 상기 배지 중에서 3일 동안 배양하였다. 부상 구체를 5분 동안 트립신으로 처리한 다음, 70 ㎛ 필터로 통과시켜 단일 세포를 수집하였다. 1xN2, 1xB27, 페니실린-스트렙토마이신 (100 ㎍/mL) 및 10% FBS가 보충된 DMEM/F12 (1:1) 중 라미닌-코팅된 슬라이드상에서 표지 전 2일 동안 세포를 배양하였다. 항-GFP 항체 (#ab13970, 앱캠(Abcam) 사)를 사용하여 면역조직화학을 수행함으로써, GFP 발현을 평가하였다. GFP-음성 세포의 수를 정량하기 위하여, 3개의 대표적인 가시 지역에서 20X 배율로 GFP-양성 및 GFP-음성 세포의 총 수를 계수하고, 평균 효율을 계산하였다. 각 조건에서 3회의 개별 실험을 수행하였다.
마우스 내이에의 단백질 미세주입
P0 floxP-tdTomato 마우스를 (-30)GFP-Cre 주입에 사용하고, P2 Atoh1-GFP 마우스를 Cas9:sgRNA 주입에 사용하였다. 동물들은 매사추세츠 안구 및 귀 병원 ALCUC 위원회(Massachusetts Eye & Ear Infirmary ALCUC committee)에 의해 승인된 프로토콜하에 사용하였다. 얼음상에서 그의 온도를 낮추는 것에 의해, 마우스를 마취시켰다. 귀 뒤쪽을 절개하는 것에 의해 와우개창술(cochleostomy)를 수행하여, 귀 기포를 노출시켰다. 미세조작장치에 의해 유지되는 유리 마이크로피펫을 사용하여 복합체를 와우관으로 전달하였는데, 이는 내이 유모세포에의 접근을 가능케 하였다. (-30)GFP-Cre 전달의 경우, 3 μL의 45 μM 단백질을 3 μL의 RNAiMAX 또는 리포펙타민 2000 중 어느 하나와 혼합한 후, 주입 전에 30분 동안 실온에서 인큐베이팅하였다. 처리 군 당 4마리의 마우스에 주입하였다. Cas9:sgRNA 복합체 전달의 경우, 1 μL의 200 μM Cas9 단백질을 2 μL의 100 μM sgRNA와 혼합하고, 실온에서 5분 동안 인큐베이팅한 후, 3 μL의 RNAiMAX 또는 리포펙타민 2000 중 어느 하나와 혼합하고, 주입 전에 추가 30분 동안 인큐베이팅하였다. 처리 군 당 3마리의 마우스에 주입하였다. 모든 주입에 있어서의 총 전달 부피는 와우 당 0.3 μL이었으며, 방출은 32 nL/초의 속도로 미세조작장치에 의해 조절하였다.
면역조직화학 및 정량
주입 5-10일 후, 마우스를 희생시키고, 표준 프로토콜에 의해 와우를 수확하였다55. 면역조직화학에는, 이전에 기술된 프로토콜에 따라 털-세포 마커 (Myo7a 및 Esp)에 대한 항체 및 지지 세포 (Sox2)를 사용하였다55. (-30)GFP-Cre 후 tdTomato 양성 세포 또는 Cas9:sgRNA 전달 후 GFP 음성 세포의 수를 정량하기 위하여, 와우 기저 회전 주입 부위 부근의 200 ㎛에 걸친 영역에서 외부 유모세포의 총 수를 계수하였다. (-30)GFP-Cre-유도 재조합 또는 Cas9:sgRNA-유도 게놈 변형의 효율은 tdTomato를 발현하거나 GFP 발현을 상실하는 외부 모발 세포의 백분율로 계산하였다.
게놈 변형의 고-처리량 DNA 서열분석
초기에 U2OS-EGFP 리포터 세포에 대한 Cas9 단백질 전달에 대하여 기술된 바와 같이, HEK293T 세포를 Cas9와 sgRNA 발현 플라스미드 또는 선형 DNA PCR 생성물로 형질감염시키거나, 또는 50 nM Cas9 단백질, 250 nM 정제 sgRNA 및 양이온성 지질로 처리하였다. 플라스미드-기반 형질감염 실험의 경우, 700 ng의 Cas9 발현 플라스미드 더하기 EMX1, CLTA2 또는 VEGF 좌위 중 어느 하나를 표적으로 하기 위한 sgRNA를 발현하는 250 ng의 sgRNA 플라스미드 또는 50 ng의 선형 DNA PCR 생성물을 리포펙타민 2000 (라이프 테크놀로지스 사)과 함께 형질감염시키고, 2일 후 세포를 단리하였다. 생체 내 단백질 전달 실험의 경우, 마취된 마우스로부터 이전에 기술된 바와 같이55 ~30 mg의 마우스 조직을 단리한 후, 에이젠코트 디엔에이어드밴스(DNAAdvance) 게놈 DNA 단리 키트 (베크만 쿨터(Beckman Coulter) 사)를 사용하여 게놈 DNA를 추출하였다. 세포 배양 실험을 위하여, 상기한 바와 같이 게놈 DNA를 단리하였다. 150 ng의 게놈 DNA를 주형으로 사용하여, PCR에 의해 하기에서 열거되는 HTS 프라이머 쌍이 측접되어 있는 표적 적중 및 표적을 벗어난 게놈 부위를 증폭하였다. 겔 전기영동에 의해 조 PCR 생성물의 상대적인 양을 정량하고, 상이한 sgRNA 쌍 또는 Cas9 뉴클레아제 유형으로 처리된 샘플을 별도로 등몰 농도로 합친 후, 키아퀵 PCR 정제 키트 (키아젠 사)로 정제하였다. 5 % TBE 18-웰 크리테리온 PAGE 겔 (바이오래드 사)을 사용하여 200 V에서 30분 동안 대략 150 ng의 합쳐진 DNA를 전기영동함으로써 ~125 bp 내지 ~300 bp 길이의 DNA들을 단리한 후, 키아퀵 PCR 정제 키트 (키아젠 사)에 의해 정제하였다. 서열분석 어댑터를 포함하는 프라이머를 사용한 PCR에 의해 정제된 DNA를 증폭하여 정제한 후, 이전에 기술된 바와 같이 MiSeq 고-처리량 DNA 서열분석기 (일루미나(Illumina) 사)에서 서열분석하였다47.
데이터 분석
일루미나 서열분석 리드(read)들을 필터링하여, 하기에 개괄한 바와 같이 유닉스 바쉬(Unix Bash)로 기재된 스크립트(script)들을 사용하여 분석하였다. 서열분석 실험을 위한 샘플 크기는 최대한의 효과 검출 능력을 보장하기 위하여 (실제 실험 고려상황 내에서) 최대화하였다. 본페로니법(Bonferroni method)을 사용한 다중 비교 보정을 사용하여, 이전에 기술된 바와 같이56 Cas9-변형 게놈 부위들 (표2)의 통계 분석을 수행하였다.
하기는 각 게놈 표적 부위에 있어서의 상류 및 하류 측접 서열들의 목록이다.
sgRNA의 T7 전사를 위한 기질로 사용하기 위한 PCR 생성물을 생성시키는 데에 사용되는 프라이머
모든 경우에서 T7_gRNA-Rev를 사용하였다. 사용된 DNA 주형은 상기에서 언급된 바와 같은 EGFP sgRNA 플라스미드였다. dCas9-VP64 활성화인자 실험을 위한 NTF3 및 VEGF sgRNA에 대해서는 이전에 보고된 바 있다 (문헌 [Maeder et al., CRISPR RNA-guided activation of endogenous human genes. Nat. Methods. 2013; 10, 977-979]).
형질감염을 위한 선형 DNA PCR 생성물을 생성시키기 위한 프라이머
하기에 열거된 PCR_sgRNA-fwd1, PCR_sgRNA-rev2 및 적절한 PCR_sgRNA 프라이머들을 사용한, 주형으로서 U6 프로모터를 포함하는 플라스미드상에서의 (72 ℃, 3분)으로의 PCR 연장.
T7 엔도뉴클레아제 I DNA 절단 검정을 수행하기 위한 프라이머
인간 게놈의 표적 적중 및 표적을 벗어난 부위에 대한 고-처리량 서열분석을 위한 프라이머
결과
초음 하전된 단백질에 융합된 Cre 레콤비나제의 고도로 효율적인 전달
핵산의 고도로 음이온성인 정전기적 특성을 게놈-편집 단백질에 부여하는 것이 양이온성 지질을 사용한 포유동물 세포에의 그의 효율적인 전달을 가능케 할 수 있을 것으로 예상되었다 (도 27a). 자연적으로 고도로 음으로 하전되어 있지 않은 해당 단백질의 경우, 천연이거나 조작된 초음 하전된 단백질17과의 융합이 다가음이온성인 특성을 부여하게될 것으로 생각되었다. 핵산-결합 단백질의 경우에는, 자연 DNA 또는 RNA 기질과의 단순한 복합체화가 양이온성 지질-기반 전달을 지지하기에 충분한 음이온성 특징을 제공할 수 있을 것으로 예상되었다 (도 27a).
먼저, 조작된 초음 하전 GFP 변이35인 (-30)GFP가 융합 단백질 적재물의 캡슐화 및 전달을 매개할 수 있을 것인지 여부를 시험하였다 (도 27b). (-30)GFP를 Cre 레콤비나제에 융합시키고, 몇 가지 시중에서 구입가능한 양이온성 지질들을 Cre-매개 재조합시 DsRed만을 발현하는 HeLa 세포에 기능성으로 융합체를 전달하는 그의 능력에 대하여 시험하였다 (도 28a). 10 % 소 태아 혈청 (FBS)를 함유하는 배지 중에서의 1.5 μL의 리포펙타민 RNAiMAX (이하 "RNAiMAX"로 지칭됨, 캘리포니아 칼스배드 소재 라이프 테크놀로지스 사)와 복합체화된 10 nM (-30)GFP-Cre의 전달은 처리된 세포들 중에서의 강한 DsRed 형광 신호로 이어졌다. 형광-활성화 세포 분류 (FACS)로써, 처리 48시간 후 세포 중 52 %가 Cre 레콤비나제에 부합하는 DsRed를 발현하였음이 밝혀졌다 (도 28b).
최적화는 10 % FBS를 함유하는 매체 250 μL 중에서의 1.5 μL RNAiMAX와 복합체화된 25 nM (-30)GFP-Cre를 사용한 65 %의 재조합 효율을 초래하였다 (도 28c). 지질-매개 음이온성 Cre 전달의 강력성은 양이온성 단백질-매개 전달의 것에 비해 주목할만하다. 양이온성 지질을 포함하는 겨우 1 nM의 (-30)GFP-Cre가 15-20 %의 재조합 세포를 초래하는 데에 필요하였던 반면, 이와 같은 정도의 재조합을 달성하는 데에 1 μM의 (+36)GFP-Cre가 요구됨으로써, 전달 강력성에 있어서 1,000-배 차이를 나타내었다 (도 28c). 거의 동일한 결과가 두 번째 Cre 리포터 세포주 (BSR TdTomato)에서 관찰되었다 (도 33a). 양이온성 지질의 양을 증가시키는 것은 독성을 증가시켰는데 (도 33b), 샘플 250 μL 당 1.5 μL의 RNAiMAX가 최소한의 세포 독성을 유도하면서도 재조합 효율을 최대화하는 것으로 밝혀졌다. 이러한 조건하에서, 양이온성 지질은 중성이거나 양이온성인 Cre 레콤비나제 융합체의 전달 강력성은 증가시키지 않음으로써 (도 28c 및 도 33c), 양이온성 지질-매개 전달에 참여하기 위해서는 (-30)GFP-Cre의 강한 음전하가 요구된다는 것을 나타내었다. 양이온성 지질의 양을 증가시키는 것이 최대 재조합에 요구되는 단백질의 농도를 증가시킨다는 것도 관찰되었는데, 전달가능한 단백질이 특정 화학량론의 양이온성 지질과 복합체화된다는 모델에 부합하였다 (도 28d). 이러한 관찰은 집합적으로 양이온성 지질이 혈청의 존재하에서도 포유동물 세포에의 다가음이온성 단백질의 강력한 전달을 매개할 수 있다는 것을 나타낸다.
양이온성 단백질-매개 전달 대비 양이온성 지질-매개 (-30)GFP-Cre 전달의 더 높은 강력성이 세포에 의한 더 많은 총 단백질 흡수 또는 세포에 진입하는 기능성인 비-엔도솜 단백질 분자의 더 높은 분율에서 비롯되는지 여부를 확인하기 위하여, 유동 세포측정법을 사용하여 각각의 최적 Cre 전달 조건하에서 (+36)GFP-Cre 또는 리포솜 (-30)GFP-Cre 중 어느 하나로 처리된 세포의 GFP 형광을 측정하였다. 세포 형광 및 재조합 효율의 비교로써, (-30)GFP-Cre의 지질-매개 기능성 전달이 세포내이입되는 단백질의 양과 관련하여 (+36)GFP-Cre의 전달에 비해 9,800-배 더 강력하다는 것이 밝혀졌다 (도 34). 조합하면, 이러한 결과는 음이온성 단백질의 지질-매개 전달의 비정상적으로 높은 강력성이 각 세포에서의 비정상적으로 높은 단백질 흡수에서 비롯되는 것은 아니며, 그보다는 세포질로의 엔도솜 탈출 및 리소좀 단백질 분해의 회피를 포함할 가능성이 있는 세포내이입-후 과정에서 비롯되는 것임을 암시한다.
다가음이온성 단백질을 전달하는 능력이 RNAiMAX 중 특허 성분에 따라 달라지는지 여부, 또는 다른 양이온성 지질이 유사하게 강력한 전달을 매개할 수 있는지 여부를 시험하기 위하여, 핵산을 전달하도록 설계되어 있는 몇 가지 다른 형질감염 반응물들을 시험하였다 (도 28e). RNAiMAX가 (-30)GFP-Cre를 위한 가장 효과적인 기능성 전달 작용제로 유지되기는 하지만, 다른 양이온성 지질 제제들도 강력한 전달을 초래하였다. 리포펙타민 2000 및 리포펙타민 LTX (라이프 테크놀로지스 사, 캘리포니아 칼스배드), 양이온성 지질 제제를 기반으로 하는 2종의 플라스미드 형질감염 반응물들21, 및 세인트-레드(SAINT-Red) (시노볼룩스 세라퓨틱스(Synvolux Therapeutics) 사, 네덜란드 그로닝겐 소재), 합성 피리디늄-함유 양이온성 지질을 함유하는 siRNA 전달 제제 모두가 일련의 농도에 걸쳐 강한 기능성 (-30)GFP-Cre 전달을 초래하였다 (도 28 e). 반면, 양이온성 지질인 DOTAP (로체 디아그노스틱스(Roche Diagnostics) 사, 인디애나 인디애나폴리스 소재) 또는 펩티드-기반 핵산 전달 작용제 EZ-PLEX (어센션 바이오(Ascension Bio) 사, 플로리다 탬파 소재)를 사용한 강한 전달은 관찰되지 않닸다 (도 28e). 이러한 관찰은 집합적으로 몇 가지 (모두는 아님) 양이온성 지질들이 음으로 하전된 단백질을 인간 세포로 캡슐화하여 전달할 수 있다는 것을 나타낸다.
(-30)GFP가 아닌 다른 다가음이온성 단백질을 전달하는 데에 양이온성 지질을 사용하는 것이 가능할 수도 있을 것으로 예상되었다. 생물의학 연구에서 일반적으로 사용되는 조작된 다가음이온성 단백질 도메인에는 전사 활성화를 위하여 조작된 아연 핑거 어레이, TALE 반복체 어레이 또는 dCas9와의 융합에 광범위하게 사용되는 VP64 활성화 도메인 (-22의 순수 이론적 전하), 및 단백질 정제 및 가시화에 사용되는 에피토프 태그인 3x FLAG (-7의 순수 이론적 전하)이 포함된다 (도 28f). VP64 및 3x FLAG 모두가 (-30)GFP만큼 효과적이지는 않다 할지라도 양이온성 지질을 사용한 Cre 레콤비나제의 기능성 전달을 강화하는 것으로 관찰되었는데, 그의 더 낮은 전체 음전하에 기인한 것일 가능성이 있다 (도 33c). 이러한 관찰은 (-30)GFP를 능가하는 비정상적으로 음으로 하전된 단백질이라면 포유동물 세포에 대한 효율적인 양이온성 지질-기반 전달을 매개할 수 있다는 것을 입증하고 있다.
TALE 활성화인자 단백질의 기능성 전달
배양된 인간 세포에 대한 TALE-VP64 전사 활성화인자 (사용되는 TALE 변이에 따라 대략 +4의 이론적 순수 전하)의 지질-매개 전달을 시험하였다. 전달되는 TALEN 단백질에 의한 중간 정도로 효과적인 내인성 유전자 절단이 Arg9 36와 같은 양이온성 펩티드를 사용하는 혈청 부재하에서의 포유동물 세포에서 입증되어 있기는 하지만, TALE-기반 전사 인자 단백질의 전달에 대해서는 아직 보고된 바 없으며, 혈청 중에서의 TALE 단백질의 효과적인 전달도 우리의 지식으로는 이전에 기술된 바가 없다. 신경변성 질환과 연관되어 있는 신경 성장 인자인 뉴로트로핀-3 (NTF3)의 유전자를 표적으로 하였다37. 이전에 기술된 NTF3을 표적으로 하는 TALE-VP6438는 (-30)GFP에 융합되었었으며 (도 29a), Cre 전달에 최적화된 조건하에서 25 nM (-30)GFP-NTF3 TALE1-VP64 및 RNAiMAX를 사용하여 HEK293T 세포를 처리하였었다. 처리 4시간 후의 NTF3의 유전자 발현 수준은 비처리 세포, RNAiMAX만으로 처리된 세포, 또는 VEGF를 표적으로 하는 TALE 전사 활성화인자를 사용하여 처리된 세포에 비해 25 nM (-30)GFP-NTF3 TALE-VP64 및 RNAiMAX를 사용하여 처리된 세포에서 3.5-배 더 높았다 (도 29b). 유사한 수준의 NTF3 발현이 동일한 NTF3을 표적으로 하는 TALE-VP64를 코딩하는 플라스미드의 형질감염 48시간 후 관찰되었다 (도 29b).
동일 유전자상의 상이한 부위들을 표적으로 하는 다수 TALE 활성화인자의 상승작용성 발현이 유전자 활성화를 증대시키는 것으로 밝혀져 있으므로38, RNAiMAX를 사용하여 (-30)GFP에 융합된 5종의 구별되는 NTF3을 표적으로 하는 TALE 활성화인자들을 동시에 전달하였다. 단백질-지질 복합체는 각각 5 nM의 단백질 총 25 nM로 5종의 (-30)GFP-NTF3-TALE-VP64 단백질을 첨가하는 것에 의해, 상기와 같이 제조하였다. 4-시간 인큐베이션 후 NTF3 발현의 6.5-배 증가가 관찰된 반면 (도 29b 및 도 35), 5종 NTF3 TALE 활성화인자 전체의 플라스미드 공동-형질감염 후 이어지는 48-시간 인큐베이션은 NTF3 발현 수준의 10-배 증가를 초래하였다 (도 29b). 이러한 발견은 TALE 활성화인자 단백질이 인간 세포에서 유전자 발현을 일시적으로 활성화하기 위해 양이온성 지질을 사용하여 전달될 수 있다는 것을 입증하고 있다. 프로그램가능 전사 활성화인자 단백질의 전달은 프로그램가능 전사 인자의 DNA-기반 전달의 일반적인 우려사항인 만성 유전자 발현을 회피하면서 표적 유전자의 1회 활성화를 가능케 할 수 있다. 이와 같은 능력은 일시적으로 발현되었을 때 세포 상태 또는 세포 운명에 있어서의 1회 영구 변화를 수행하는 단백질에 특히 가치있는 것으로 입증될 수 있다39.
인간 세포에의 Cas9:sgRNA 단백질:RNA 복합체의 고도로 효율적인 전달
완전-혈청 배지에서의 다가음이온성 Cre 및 TALE 활성화인자 단백질 변이의 강력한 지질-매개 전달을 감안할 때, (-30)GFP와의 융합체 또는 자연 다가음이온성 Cas9:가이드 RNA 복합체 중 어느 하나로서의 CRISPR-Cas9:sgRNA 복합체 역시 이와 같은 접근법을 사용하여 인간 세포에 전달될 수 있을 것으로 예상되었다. 잘 확립되어 있는 Cas9-유도 유전자 붕괴 검정40을 사용하여, 인간 U2OS 세포 중 게놈 EGFP 리포터 유전자 내의 특정 부위들을 표적화하였다 (도 36a). 표적 적중 Cas9 절단은 EGFP에서의 비-상동성 말단 연결 (NHEJ) 및 세포 형광의 상실을 유도한다. (-30)GFP의 형광으로부터의 방해를 회피하기 위하여, (-30)GFP에 Y67S 돌연변이를 도입함으로써 그의 형광을 제거하고, 이와 같은 비-형광 변이를 (-30)dGFP로 명명하였다.
10 % FBS를 함유하는 배지에서의 25 nM의 (-30)dGFP-NLS-Cas9, 및 RNAiMAX를 포함하는 50 nM의 EGFP를 표적으로 하는 sgRNA를 사용한 U2OS 리포터 세포의 처리는 세포 중 48 %에서의 EGFP 발현의 상실을 나타내었다 (도 30a). Cas9 또는 sgRNA를 발현하는 플라스미드의 공동형질감염은 세포 중 37 %에서의 유사한 EGFP 상실을 초래하였다 (도 30a). EGFP sgRNA 단독, Cas9 단독을 코딩하는 플라스미드의 형질감염, 또는 VEGF 좌위를 표적으로 하도록 설계된 Cas9와 sgRNA를 코딩하는 플라스미드의 공동형질감염시에는 유의성 있는 EGFP 붕괴가 관찰되지 않았다 (도 30a, 도 36b). EGFP의 강력한 붕괴가 세포 독성의 결과는 아니라는 것이 확인되었다 (도 36c-d). 10 % FBS 혈청 존재하에서의 (+36)dGFP-NLS-Cas9 및 sgRNA를 사용한 세포의 처리가 효율적인 유전자 붕괴로 이어지지 않는다는 것도 관찰됨으로써 (도 30a), Cas9 및 sgRNA의 양이온성-펩티드 기반 전달 방법은 아마도 gRNA:Cas9 복합체 형성 또는 초음 하전된 단백질에 의한 뉴클레아제 기능의 방해로 인하여41 효과적이지 않다는 것을 암시하였다. 합치면, 이러한 결과는 (-30)dGFP-NLS-Cas9:sgRNA 복합체의 양이온성 지질-매개 전달이 인간 세포에서 효율적인 sgRNA-의존성 표적 유전자 붕괴를 초래할 수 있다는 것을 입증하고 있다.
다가음이온성 sgRNA는 효율적인 지질-매개 Cas9 전달에 필요 충분하다
자연 Cas9 단백질 (+22의 순수 이론적 전하)과 sgRNA (~103의 음이온성 포스페이트 기)의 복합체는 전체적으로 고도로 음이온성일 것이기 때문에, 다음에는 다가음이온성 단백질에의 융합이 없는 자연 Cas9:sgRNA 복합체가 양이온성 지질을 사용하여 인간 세포에 전달될 수 있는지 여부를 시험하였다. 100 nM의 Cas9, 100 nM의 EGFP sgRNA 및 0.8 μL의 RNAiMAX를 사용한 U2OS EGFP 리포터 세포의 처리는 EGFP 리포터 유전자의 65 % 붕괴를 초래하였다 (도 30a). Cas9 단백질 및 sgRNA를 사용하였으나 RNAiMAX가 없는 세포 처리는 GFP 형광의 상실을 초래하지 않았다 (도 30a). 이러한 관찰은 sgRNA 단독이 초음 하전된 융합 단백질의 부재하에서도 Cas9의 양이온성 지질-기반 전달을 매개하는 데에 필요한 고도로 음이온성인 특징을 제공할 수 있다는 것을 암시한다.
(-30)dGFP-NLS-Cas9:sgRNA 대 Cas9:sgRNA의 양이온성 지질-매개 전달에서 비롯되는 유전자 붕괴 효율의 비교로써, 낮은 투여량에서 (-30)dGFP-NLS-Cas9가 자연 Cas9에 비해 더 효율적인 유전자 붕괴를 초래한다는 것이 밝혀졌는데 (도 37a), 더 높은 농도는 물론 어느 한쪽 단백질의 각 최적 단백질:sgRNA 투여량에서는 자연 Cas9가 그것을 능가하였다 (도 37b-37c). 이러한 결과 또한 sgRNA가 복합체화된 Cas9 단백질의 양이온성 지질-기반 전달을 지지하기에 충분한 음전하를 공급할 수 있다는 것을 입증하고 있다.
Cas9에 비해 (-30)dGFP-NLS-Cas9의 최적 전달에 전체적으로 더 적은 단백질이 요구되기는 하였지만, 자연 Cas9-매개 유전자 붕괴에서에 비해 최대 (-30)dGFP-NLS-Cas9-매개 EGFP 유전자 붕괴에 더 높은 sgRNA:단백질 비가 요구된다는 것도 발견되었다 (도 37d). 융합된 (-30)dGFP가 Cas9:sgRNA 복합체화를 정전기적으로 방해할 수 있기 때문에, (-30)dGFP-NLS-Cas9와 복합체화시키는 데에 더 많은 당량의 sgRNA가 필요한 것으로 예상되었다. (-30)dGFP-NLS-Cas9 매개 EGFP 유전자 붕괴를 위한 이상적인 단백질 투여량은 야생형 Cas9의 것에 비해 10-배 더 낮은데, 이 결과 역시 (-30)dGFP-Cas9가 그의 더 높은 전체 음전하로 인하여 Cas9:sgRNA에 비해 양이온성 리포솜에 의해 더 잘 캡슐화된다는 것을 암시하기는 하지만, 이와 같은 전하 크기는 Cas9:sgRNA 상호작용을 방해함으로써, 단백질 당 더 많은 sgRNA를 필요로 하게 하며, 잠재적으로 총 전달 Cas9 활성을 감소시킬 수 있다. 더하여, NLS-Cas9 및 Cas9-NLS 단백질을 생성시켜 시험하였는데, (-30)dGFP-NLS-Cas9 중 NLS의 존재가 매우 낮은 농도에서의 전달 효능의 차이를 적어도 부분적으로 설명할 수 있기는 하지만, 25 nM 이상의 농도에서는 Cas9, NLS-Cas9 및 Cas9-NLS 모두가 (-30)dGFP-NLS-Cas9에 비해 더 높은 EGFP 붕괴 효율을 초래한다는 것이 관찰되었다 (도 38a-c).
RNAiMAX가 아닌 다른 양이온성 지질 제제를 사용하는 Cas9:sgRNA 전달도 시험하였다. 리포펙타민 2000을 사용한 전달이 RNAiMAX를 사용한 것에 비해 현저하게 더 효율적이어서, 80 %까지의 Cas9-매개 유전자 붕괴를 초래하고 (도 39a), 1 nM의 단백질에서도 높은 효율 (60 % 유전자 붕괴)을 유지하였다 (도 39a). 그러나, 세포 배양 조건하에서의 RNAiMAX에 비해 약간 더 높은 리포펙타민 2000의 독성으로 인하여 (도 33b-c), 이후의 모든 세포 배양 연구에는 RNAiMAX를 사용하였다.
EGFP 붕괴가 Cas9 결합42에서만이 아니라 게놈 변형에서 비롯된다는 것을 입증하기 위하여, T7 엔도뉴클레아제 I (T7EI) 검정43을 사용하여, 표적 EGFP 좌위에서의 Cas9-매개 게놈 삽입/결실 돌연변이 (삽입-결실(indel))의 빈도를 검출 및 정량하였다 (도 30b). T7EI 검정 결과는 Cas9 및 EGFP sgRNA 플라스미드 양자, 또는 Cas9 단백질과 정제된 EGFP sgRNA를 사용하여 처리된 세포들만이 표적 부위에 삽입-결실을 포함한다는 것을 보여주었다. 합치면, 이러한 발견은 활성인 Cas9:sgRNA 복합체가 sgRNA에 의해 제공되는 음전하에 의존성인 방식으로 양이온성 지질을 사용하여 인간 세포에 강력하게 전달될 수 있다는 것을 입증하고 있다.
U2OS EGFP 리포터 세포를 또한 EGFP, CLTA, EMX 및 VEGF를 표적으로 하는 4종 gRNA의 혼합물과 복합체화된 Cas9의 단일 지질-매개 전달 처리를 사용하여 처리하였다. 이와 같은 처리는 T7EI 절단 검정에 의해 측정하였을 때 각각 58 %, 28 %, 16 % 및 40 %의 절단 효율로써, 4종 표적 모두의 효율적인 붕괴를 초래하였다. 50 nM의 Cas9 및 25 nM의 각 sgRNA (sgRNA 총 100 nM) 단일 전달로부터의 이러한 높은 유전자 붕괴 효율은 지질-매개 Cas9:sgRNA 전달이 효율적인 다중화된 게놈 편집을 지지할 수 있다는 것을 입증하고 있다 (도 30c).
Cas9 니카제 및 dCas9 활성화인자의 기능성 전달
다음에, 양이온성 지질-기반 단백질 전달이 Cas9 니카제44 및 Cas9-기반 전사 활성화인자와 같은 다른 Cas9-유래 게놈 조작 도구들을 전달하도록 확장될 수 있는지 여부를 시험하였다45. 니카제와 적절하게 쌍을 이룬 EGFP를 표적으로 하는 sgRNA 플라스미드의 공동형질감염, 또는 RNAiMAX를 사용한 EGFP sgRNA의 쌍과 복합체화된 정제 단백질 중 어느 하나에 의해, Cas9 D10A 니카제의 전달로부터 생성되는 U2OS EGFP 리포터 세포에서의 유전자 붕괴 효율을 측정하였다 (도 30d). 이중 Cas9 니카제의 플라스미드 및 양이온성 지질-매개 단백질:RNA 전달 모두가 대향 가닥을 표적으로 하는 sgRNA 쌍 (sgRNA 쌍 g1+g5 및 g3+g7)의 존재하에서만 유사한 효율로 EGFP 붕괴를 초래하였을 뿐 (도 30d), 동일 가닥을 표적으로 하는 sgRNA 쌍 (sgRNA 쌍 g5+g7)에서는 그렇지 않음으로써 (도 30d), Cas9 니카제 절단 요건에 대한 이전의 보고46와 일치하였다.
VP64 활성화 도메인에 융합된 dCas9의 플라스미드 형질감염 또는 직접적인 단백질:sgRNA 복합체 전달 중 어느 하나에 기인하는 HEK293T 세포에서의 NTF3 전사 활성화 효율도 비교하였다45. 플라스미드 형질감염 또는 RNAiMAX-매개 단백질 전달 중 어느 하나에 의한 dCas9-VP64 활성화인자의 전달은 NTF3 전사의 강한 (≥ ~10-배) 활성화를 초래하였다 (도 30e 및 도 40). 각 전달 방법에 대한 최적 검정 시간에서, 플라스미드 형질감염으로부터 생성되는 전사 활성화 수준이 단백질 전달로부터 생성되는 활성화에 비해 더 강력하였는데 (도 30e), 잠재적으로 일시적인 단일 투여량의 정제된 단백질 및 RNA에 대비되는 플라스미드로부터의 Cas9 활성화인자 단백질 및 sgRNA 양자의 지속적인 발현에 기인한다. 상기 결과가 그와 같은 인자들이 전달되는 Cas9 뉴클레아제 및 니카제 단백질에 의한 비가역적인 게놈 변형의 강력성을 제한하지는 않는다는 것을 나타내고 있기는 하지만 (도 40A 및 40D), 전달되는 단백질의 낮은 투여량 및 일시적인 특성이 전사 활성화와 같은 동적 과정의 강력성은 더 강하게 제한할 수도 있다. 그럼에도 불구하고, 이러한 결과들은 합쳐서 Cas9 니카제 및 Cas9 전사 활성화인자 양자가 양이온성 지질-매개 단백질:RNA 복합체 전달에 의해 효과적으로 전달될 수도 있다는 것을 나타낸다.
Cas9:sgRNA 전달은 DNA 형질감염에 비해 더 큰 특이성으로 게놈을 변형시킨다
기능성 Cas9:sgRNA 복합체의 무-DNA 전달은 바이러스 또는 다른 유전자 전달 방법과 연관되어 있는 위험성을 회피하며, 표적 좌위가 변형된 후의 게놈-편집 작용제의 불필요한 발현을 회피하는 것에 의해 게놈 변형의 특이성을 향상시킬 가능성을 가진다. 기술되는 접근법이 인간 세포에서 내인성 유전자를 붕괴시킬 수 있는지 여부를 시험하기 위하여, EMX1, CLTA2 및 VEGF 유전자 내 게놈 좌위를 표적화하였는데, 그의 잠재적인 생물의학적 관련성 및 Cas9 표적을 벗어난 절단 활성에 대한 이전의 연구들40,46,47에서의 그의 사용을 고려하였다. HEK293T 세포에의 Cas9:sgRNA 복합체의 양이온성 지질-매개 전달은 앞서 U2OS 세포에 대하여 최적화되었던 동일한 Cas9:sgRNA 전달 조건을 사용한 T7EI 검정에 의해 밝혀졌던 바와 마찬가지로 플라스미드 형질감염 방법의 것과 유사하거나 그에 비해 더 큰 효율로 3종 전체 인간 유전자의 강력한 절단을 초래하였다 (도 31a).
Cas9의 플라스미드 대 단백질:RNA 전달 방법의 내인성 유전자 변형 특이성을 비교하기 위하여, 표적 적중 좌위는 물론, Cas9 및 sgRNA 발현 플라스미드의 형질감염, 또는 유사한 표적 적중 변형 효율을 초래하였던 조건하에서의 RNAiMAX-매개 Cas9:sgRNA 복합체 전달 중 어느 하나에 의해 처리된 HEK293 세포로부터 단리된 게놈 DNA로부터의 몇 가지 공지 표적을 벗어난 부위들 (도 44)을 증폭하였다. 고-처리량 DNA 서열분석에 의해 3개의 표적 적중 및 11개의 표적을 벗어난 부위들에서의 삽입-결실 빈도를 검정하였다 (도 45). 3종 전체 표적 유전자에서, 플라스미드 또는 단백질:sgRNA 전달 중 어느 하나로부터 생성되는 표적 적중 DNA 변형의 빈도는 대략 10 %로써 (도 41a-c), 매우 유사한 표적 적중 게놈 변형 효율을 초래하는 처리 조건하에서의 2종 기술 사이의 표적을 벗어난 변형의 비교를 가능케 하였다. 중요한 것은 전체 11개의 표적을 벗어난 부위에 대한 표적을 벗어난 게놈 변형의 빈도가 플라스미드 전달에서에 비해 단백질:sgRNA 전달에서 더 낮았으며, 결과적으로 시험된 모든 부위에 있어서의 표적 적중 대 표적을 벗어난 변형의 비가 플라스미드 전달에서에 비해 단백질:sgRNA 전달에서 19-배까지 더 높았다는 것이다 (도 31b-d).
DNA 변형 특이성은 높은 표적을 벗어난 변형 수준을 가지는 좌위들 (예컨대 플라스미드 전달은 4- 내지 20-배 사이의 평균 표적 적중:표적을 벗어난 변형 비를 산출하였으나 단백질:RNA 전달은 9- 내지 400-배 사이의 평균 표적 적중:표적을 벗어난 변형 비를 산출한 4종의 VEGF 표적을 벗어난 부위들)은 물론, 더 낮은 표적을 벗어난 변형 수준을 가지는 좌위들 (예컨대 플라스미드 전달은 64-배만큼 낮은 평균 표적 적중:표적을 벗어난 변형 비를 산출하였으나 단백질:RNA 전달은 500- 내지 2,000-배의 평균 표적 적중:표적을 벗어난 변형 비를 산출한 3종의 EMX 표적을 벗어난 좌위들)에서도 플라스미드 전달에서에 비해 단백질:sgRNA 전달에서 더 높았다. 합치면, 이러한 결과는 양이온성 지질을 사용한 Cas9:sgRNA 복합체의 전달이 Cas9 및 sgRNA를 발현하는 DNA의 전달에 비해 높은 효율 및 실질적으로 더 큰 특이성으로 표적 유전자 변형을 수행할 수 있다는 것을 나타낸다.
마우스 배아 줄기 세포에의 Cas9:sgRNA의 전달
효율적이며 영구적이고 고도로 특이적인 유전자 편집을 수행하기 위한 Cas9:sgRNA의 강력하며 일시적인 양이온성 지질-매개 전달은 줄기 세포에서 특히 유용할 수 있다. 이와 같은 가능성을 시험하기 위하여, Tau-EGFP를 발현하는 마우스 배아 줄기 세포48를 Cas9 및 EGFP를 표적으로 하는 sgRNA로 처리하였다. 표준 줄기-세포 배양 조건하에서, EGFP-양성 부상 구체를 형성시켰다. RNAiMAX와 복합체화된 Cas9:sgRNA, 또는 대조로서 sgRNA가 없는 Cas9와 RNAiMAX를 사용하여 상기 부상 구체를 처리하였다. 처리 3일 후, 대조 샘플에 비해 Cas9:sgRNA-처리 구체에서의 GFP 형광의 감소가 관찰되었다 (도 42a). 처리된 구체들을 분리하고, 세포를 젤라틴-코팅된 접시에 부착시킨 후, 전구 세포로 분화시켰다. 항-GFP 항체를 사용한 면역조직화학은 어떠한 눈에 띄는 EGFP도 결핍되어 있는 많은 핵으로써, Cas9:sgRNA 처리된 샘플 중 세포에서의 EGFP 발현의 녹다운을 확인해주었다. 반면, 대조 구체로부터 유래하는 모든 세포는 EGFP 양성이었다 (도 42b). Cas9:sgRNA-처리 세포로부터 수확된 게놈 DNA를 T7EI 검정에 적용하였는데, Tau-EGFP 좌위에서의 분명한 삽입-결실의 증거로 이어졌다 (도 42c). 이와 같은 검정으로부터, 양이온성 지질-매개 Cas9:sgRNA 전달 및 Cas9 및 sgRNA DNA의 형질감염 모두에서 42 %의 삽입-결실 빈도가 계산되었다. Cas9:sgRNA가 결핍되어 있거나 Cas9 및 비관련 gRNA를 함유하는 대조 샘플에서는 표적 변형이 검출되지 않았다. 이러한 발견은 양이온성 지질-매개 Cas9:sgRNA 전달이 마우스 배아 줄기 세포에서 고도로 효율적인 유전자 붕괴를 수행할 수 있다는 것을 입증하고 있다.
Cre 레콤비나제 및 Cas9:sgRNA의 생체 내 양이온성 지질-매개 전달
생체 내에서의 기능성 게놈-편집 단백질의 고-효율 전달은 유전자 질환을 바로잡기 위한 비-바이러스 치료용 게놈 편집을 포함한 광범위한 적용분야를 가능케 한다. 살아있는 포유동물에서 상기한 단백질 전달 방법을 평가하기 위하여, 그의 제한된 공간, 잘 특성화되어 있는 내이 세포 유형, 및 미래의 청각 회복 연구를 가능케 할 수 있는 유전적 청각장애 마우스 모델의 존재를 고려하여, 마우스 내이에의 전달을 선택하였다. 마우스 내이에 대한 두 가지 유형 단백질의 생체 내 전달을 시도하였다. 먼저, 내이 세포 유형의 표적화 및 기능성 단백질 전달의 효율을 평가하기 위하여, (-30)GFP-Cre 단백질의 전달을 시험하였다. 두 번째로, 양이온성 지질-매개 단백질:gRNA 복합체 전달이 생체 내에서 CRISPR-기반 유전자 편집을 지지할 수 있는지 여부를 확인하기 위하여, 내이에의 Cas9:sgRNA 복합체의 전달을 평가하였다.
(+36)GFP-Cre가 마우스 망막에 전달될 수 있다는 것이 이전에 밝혀진 바 있기는 하지만16, 단백질이 중간 정도 수준의 재조합 전환율만을 초래함으로써, 불충분한 생체 내 전달을 암시하였었다. 본 발명의 최초 내이 전달 시험을 위하여, (-30)GFP-Cre를 RNAiMAX와 복합체화한 후, 게놈상으로 통합된 플록싱된(floxed)-STOP tdTomato 리포터를 가지는 생후 0일차 (P0) 리포터 마우스의 와우에 상기 복합체를 주입하였다. 이전에 기술된 시험관 내 Cre 리포터 세포주에서와 마찬가지로, 내이 세포에의 Cre의 기능성 전달, 그 후에 이어지는 엔도솜 탈출, 핵 국재화, 및 Cre-매개 재조합은 tdTomato의 발현을 초래한다. 주입 후, tdTomato와의 공동-국재화를 위한 내이 세포 마커를 사용한 면역표지를 위하여 와우를 수확하였다. 대조로는 RNAiMAX 단독 주입을 사용하였다. (-30)GFP-Cre 및 RNAiMAX 주입 5일 후, 소리를 감지하는 청각 감지 세포인 와우 외부 유모세포는 유모세포 마커인 미오신 VIIa (Myo7a)와 공동-국재화된 강한 tdTomato 신호를 나타냄으로써, 유모세포에의 기능성 Cre 전달을 입증하였다 (도 32a-b). 대조 와우에서는 tdTomato 발현이 검출되지 않았다 (도 32a). tdTomato 신호는 와우의 기저 회전의 주입 부위 영역에 집중되어 있었다. 와우의 기저에서는, 평균 33±3 %의 외부 유모세포가 tdTomato 양성이었다 (P < 0.001; 평균±SEM, n=4).
표적 세포에 대한 양이온성 지질-매개 (-30)GFP-Cre 단백질 전달의 효과를 추가적으로 확인하기 위하여, 주입 10일 후, 청력에 필수적인 정교한 구조인 유모세포 부동섬모를 조사하였다. tdTomato 양성 외부 유모세포는 에스핀 발현에 의해 영상화하였을 때 대조 부동섬모와 유사한 통상적인 부동섬모 구조를 가졌다 (도 32b). 대조 와우에서는 tdTomato 발현이 검출되지 않았다. 이러한 관찰은 (-30)GFP-Cre 단백질의 양이온성 지질-매개 전달이 와우 외부 유모세포에서 유모세포 구성에 눈에 띄는 영향을 주지 않으면서 재조합을 수행한다는 것을 나타낸다.
생체 내에서의 표적 부피, 단백질 투여량 및 sgRNA 투여량은 세포 배양물 실험에서와 상이하기 때문에, 상이한 전달 조건하에서 상기 실험들을 반복하였다. 시험관 내에서의 그의 더 높은 강력성을 고려하여 리포펙타민 2000을 사용한 전달을 시험하였는데 (도 39a), 극적으로 더 높은 재조합 효율이 관찰된 바; 90 %를 초과하는 (-30)GFP-Cre + 리포펙타민 2000으로 처리된 와우의 외부 유모세포가 tdTomato 양성이었다 (도 32c). 대조 샘플과의 비교에서, 약간의 외부 유모세포 상실이 관찰됨으로써 (도 32c) 리포펙타민 2000의 더 높은 세포 독성에 대한 이전의 관찰에 부합하기는 하였지만, 전체적인 와우 구성은 보존되었다.
생체 내에서의 Cas9:sgRNA 전달의 효과성을 시험하기 위하여, EGFP를 표적으로 하는 Cas9 및 sgRNA를 RNAiMAX와 조합하고, 생성되는 복합체를 전사 인자에 대한 유모세포-특이적 인핸서인 Atoh1의 조절하에서49 모든 유모세포가 GFP를 발현하는 생후 2일차 (P2) 트랜스제닉 Atoh1-GFP 마우스 와우에 주입하였다. 이와 같은 모델을 사용하면, EGFP의 Cas9:sgRNA-매개 붕괴가 외부 유모세포에서의 EGFP 형광의 상실을 초래한다. 양이온성 지질을 동반한 Cas9:sgRNA의 주입 10일 후, 주입 부위 부근 외부 유모세포 중 13 %에서 GFP의 부재가 관찰되었다. 반면, 어떠한 sgRNA도 없이 Cas9 단백질 및 RNAiMAX를 사용하여 주입된 대조 와우는 EGFP 신호의 상실을 나타내지 않았다 (도 32d). Cas9:sgRNA RNAiMAX 복합체를 사용하여 주입된 와우의 외부 유모세포는 최소 유모세포 독성과 부합하는 정형화된 Myo7a의 발현 및 건강한 핵으로써, 달리 영향을 받지 않은 것으로 보였다 (도 32d). 와우 조직 샘플로부터 단리된 게놈 DNA의 고-처리량 DNA 서열분석은 처리된 샘플에서 GFP 표적 유전자 붕괴와 부합하는 삽입-결실을 나타내었으나, sgRNA가 결핍되어 있는 대조 샘플에서는 그렇지 않았다 (도 43a). 추가적으로, EMX 유전자를 표적으로 하는 sgRNA를 사용한 Cas9:sgRNA의 내이 생체 내 전달을 반복하였는데, 유사하게, 처리된 동물의 EMX 유전자에서는 삽입-결실이 관찰되었으나, 대조 동물에서는 관찰되지 않았다 (도 43b).
리포펙타민 2000과 복합체화된 (-30)GFP-Cre가 RNAiMAX와 복합체화된 (-30)GFP-Cre에 비해 더 효율적인 표적 유모세포 군집의 변형을 초래하였기 때문에 (도 32a 및 32c), Atoh1-GFP 와우에 대한 Cas9:sgRNA 전달에서의 그의 사용을 상기와 같이 시험하였다. 10일 후, 주입 부위 부근의 외부 유모세포 중 20 %에서 GFP 발현의 상실이 관찰된 반면, Cas9 및 리포펙타민 2000을 사용하였으나 sgRNA 없이 주입된 대조 와우에서는 모든 외부 유모세포가 강한 GFP 발현을 유지하였다 (도 32d). (-30)GFP-Cre의 리포펙타민 2000 전달 후 관찰된 중간 정도의 유모세포 상실과 달리 (도 32c), Cas9:sgRNA가 표적으로 한 외부 유모세포는 분명한 독성 또는 구조적 변경을 나타내지 않았다 (도 32d).
(-30)GFP-Cre에서와 마찬가지로, 마우스 내이에의 Cas9:sgRNA의 무-바이러스 양이온성 지질-매개 전달은 외부 유모세포 군집의 특정 게놈 좌위를 성공적으로 변형시킴으로써, 표적 유전자 발현의 상실을 초래하였다. 모든 유형의 유전적 청각장애 중 거의 절반이 유모세포 상실 또는 기능장애에서 비롯되는데50, 본원에서 제시되는 결과는 이러한 세포를 유전적으로 변형시켜 청각 회복을 수행하기 위한 Cas9:sgRNA 복합체의 전달을 기반으로 하는 잠재적인 전략을 암시하고 있다.
(-30)GFP-Cre의 단백질 전달 효능 측정
양이온성 단백질 전달의 것에 비해 더 높은 리포솜-매개 (-30)GFP-Cre 전달의 강력성이 세포에 의한 더 많은 총 단백질 흡수, 또는 세포에 의해 흡수되는 기능성 비-엔도솜 단백질 분자의 더 높은 분율에서 비롯되는지 여부를 확인하기 위하여, 유동 세포측정법을 사용하여 각 해당 최적 Cre 전달 조건하에서 (+36)GFP-Cre 또는 리포솜 (-30)GFP-Cre 중 어느 하나로 처리된 세포의 GFP 형광을 측정하였다. 세포 형광은 엔도솜 국재화인지 또는 비-엔도솜 국재화인지에 관계없이 총 세포내이입 (-30)GFP-Cre 또는 (+36)GFP-Cre를 기록한다1. 지질-매개 단백질 전달은 지질-매개 기능성 Cre 전달의 높은 효율에도 불구하고, 총 단백질 흡수에 있어서의 놀랍도록 작은 증가를 초래하였다 (도 34a). (+36)GFP-Cre 처리는 투여량-의존성인 방식으로 세자릿수 크기까지 세포 GFP 형광을 증가시킴으로써 (도 34a) 이전의 보고1,2와 부합한 반면, 리포솜 (-30)GFP-Cre 처리는 세포 GFP 형광의 5-배 이하 증가를 유도하였다 (도 34a). 세포 형광 및 재조합 효율의 비교로써, (-30)GFP-Cre의 지질-매개 기능성 전달이 (+36)GFP-Cre의 전달에 비해 세포내이입되는 단백질 양 당으로 9,800-배 더 강력하다는 것이 밝혀졌다 (도 34b).
양이온성 지질과의 음이온성 (-30)GFP의 복합체화가 GFP 형광을 방해함으로써 세포에 진입하는 적재물의 진정한 양을 감추는지 여부를 시험하기 위하여, (-30)GFP 또는 (+36)GFP 중 어느 하나에 형광성이나 고도로 음이온성은 아닌 mCherry를 융합시키고, 양 단백질 융합체를 HeLa 세포에 전달하였다. PBS + 헤파린 (20 U/mL)을 사용하여 세포 표면에 부착되어 있으나 세포에 진입하지는 않았을 수 있는 단백질을 세척 제거한 후, FACS에 의해 처리 4시간 및 24시간 후의 mCherry 형광에 대하여 세포를 분석하였다. (-30)GFP-융합 mCherry의 지질-매개 전달이 세포 mCherry 형광에 있어서의 약간의 증가만을 초래하는 반면, (+36)GFP-mCherry의 전달시 mCherry 형광은 대체적으로 ≥ 100-배 더 높다는 것이 관찰됨으로써 (도 34c), (-30)GFP에 대한 융합이 실질적인 양의 단백질 적재물이 세포에 진입하도록 하지는 않는다는 것을 암시하였다. 또한, 양이온성인 지질과 음이온성인 (-30)GFP가 분명하게 상호작용한다는 사실에도 불구하고, (-30)GFP-Cre에 대한 지질의 첨가가 GFP 형광 신호를 측정가능하게 변경하지는 않았다 (도 34d). 합치면, 이러한 결과는 음이온성 단백질의 지질-매개 전달의 비정상적으로 높은 강력성은 각 세포에서의 비정상적으로 높은 단백질 흡수로부터 비롯되는 것이 아니라, 그보다는 아마도 단백질 분해의 회피 및 세포질로의 엔도솜 탈출을 포함하는 세포내이입-후 과정에서 비롯된다는 것을 암시한다.
표적을 벗어난 절단 검정의 감수성 한계
게놈 표적을 벗어난 절단을 검출하기 위한 고-처리량 서열분석 방법의 감수성은 각 게놈 표적 부위의 PCR 증폭에 투입되는 게놈 DNA (gDNA)의 양에 의해 제한된다. 인간 gDNA의 1 ng 샘플은 겨우 대략 330개의 개별 게놈을 나타내며, 그에 따라 각 게놈 부위의 겨우 대략 330개 개별 사본이 존재한다. 총 150 ng의 투입 gDNA에서 각 게놈 표적에 대한 PCR 증폭을 수행하였는데, 각각 50,000개 이하의 개별 gDNA 사본으로부터 유래하는 앰플리콘들을 제공하였다. 이에 따라, 고-처리량 서열분석 검정은 50,000 중 1 (0.002 %) 미만의 빈도로 발생하는 희소성인 게놈 변형 사례는 검출할 수 없다. 이와 같은 한계는 표 2에 언급되어 있다.
합치면, 이러한 발견은 게놈-편집 단백질의 양이온성 지질-매개 전달이 유전적 질환의 치료를 위한 강력한 도구 및 생체 내 전략으로 사용될 수 있다는 것을 암시하고 있다.
결론
시험관 내 및 특히 생체 내에서의 효율적인 세포내 단백질 전달은 생물의학 연구 및 단백질 치료학에 있어서의 지속적인 과제였다. 20년 이상 동안 양이온성 펩티드 및 단백질을 사용한 전달이 광범위하게 연구되어 오기는 하였지만, 혈청 단백질에 대한 감수성, 항체에 의한 중화, 세포외 및 세포내 프로테아제에 의한 분해, 및 저조한 내재화-후 엔도솜 탈출이 그와 같은 접근법을 사용한 단백질 전달 적용분야의 영역을 제한하여 왔다.
본 실시예에서는, 양이온성 리포솜과의 음이온성 단백질 복합체화를 사용하는 일반적인 단백질 전달 전략이 논증되고 있다. 이와 같은 방법은 배양된 세포주, 줄기 세포 집락, 및 마우스 내이 내의 치료적으로 관련되어 있는 생체 내 부위에 대한 Cre 티로신 레콤비나제, TALE 전사 활성화인자, 및 Cas9 뉴클레아제, 니카제 및 전사 활성화인자를 포함한 (도 27a) 다양한 단백질 종류들을 전달하는 데에 사용되었다. 기술되는 접근법은 고도로 효율적이어서, 확립되어 있는 세포 배양물에서의 핵산 형질감염 방법과 동등한 변형률을 산출함으로써, 살아있는 마우스의 내이 유모세포 군집 내에서 각각 90 % 및 20 %까지의 Cre 레콤비나제 및 Cas9-매개 게놈 변형률을 가능케 한다 (도 32c-d). 이러한 결과는 또한 그들을 핵산과 복합체화하는 것에 의해, 세포 운명에서 치료적으로 관련되어 있는 변화를 유도하는 전사 인자를 포함한 다른 핵산-결합 단백질들을 효율적으로 전달하는 데에 양이온성 지질을 사용하는 것이 가능할 수 있다는 것을 암시한다.
양이온성 지질-기반 음이온성 단백질 전달은 강력한 양이온성 단백질 전달 융합 상대물인 (+36)GFP를 세포내이입되는 단백질의 양 당으로 9,800-배까지만큼 능가함으로써, 자릿수 크기만큼 더 낮은 단백질 투여량으로 처리되는 세포의 더 효율적인 변형을 유도한다 (도 28c, 34). Cas9 뉴클레아제 전달의 경우, 본 접근법은 또한 통상적인 플라스미드 형질감염에 비해 > 10-배 더 특이적인 게놈 변형을 초래하는데 (도 31b-d), 이전의 기록에 부합하여51, DNA 전달 방법에 비해 일시적인 각 게놈이 노출되는 Cas9 활성의 범위에 기인한 것일 가능성이 있다.
기술되는 접근법은 실행하기가 간단해서, 정제된 전달가능 단백질 및 대중적인 시중의 핵산 형질감염 반응물들의 사용만을 필요로 한다 (도 27b). 주어진 단백질을 이와 같은 접근법에 적합하게 되도록 하는 것은 (-30)GFP와 같은 고도로 음이온성인 상대물에 대한 간단한 번역 융합을 필요로 하는데 (도 27a), VP64 활성화 도메인 및 3xFLAG 친화성 태그를 포함한 일반적인 번역 융합 태그를 사용하여서도 효과적이다 (도 28f 및 도 33c). Cas9 단백질에서와 같은 어떤 경우에는, 동계 핵산 (본 사례에서는 sgRNA)과의 예비-복합체화이면 충분한데 (도 30a), 어쩌면 부분적으로 노출되는 결합 핵산이 양이온성 지질과의 복합체화를 매개하기에 충분한 음이온 전하를 제공하기 때문이다.
다른 군들은 DNA 또는 mRNA 형태인 Cas9 발현 구성체의 생체 내 전달에 대해 기록하고 있다52,53. 본 실시예는 단백질 전달이 생체 내 게놈 편집을 위한 경쟁력 있는 접근법이라는 것을 입증하고 있다.
<표 1>
표 1. EMX, VEGF 및 CLTA 내 부위들을 표적으로 하는 Cas9:sgRNA의 표적 적중 및 공지의 표적을 벗어난 기질들. 소문자로 굵게 나타낸 표적 적중 서열로부터의 돌연변이와 함께, EMX, VEGF 및 CLTA의 게놈상 표적 적중 및 표적을 벗어난 부위들의 목록을 나타냄. PAM은 밑줄로 나타내었음.
<표 2>
표 2. EMX, CLTA 및 VEGF 표적 적중 부위 및 11개의 공지 표적을 벗어난 부위에 있어서의 삽입-결실 빈도, P 값 및 표적 적중:표적을 벗어난 절단 특이성 비. CLTA 부위: 합계: 서열 계수의 총 수; 처음 10,000개 서열만이 표적 적중 부위 서열에 대하여 분석됨. 변형: 삽입-결실의 수를 총 서열 수로 나눈 백분율. 1개 미만의 삽입-결실이 존재한다고 가정한 다음, 총 서열 계수로 나눔으로써 상위 한계 변형 백분율에 도달하거나, 또는 이론적 검출 한계를 취하여 (1/49,500; 상기 결과 참조), 어느 값이 더 큰가에 의해, 관찰된 삽입-결실이 없는 부위에 대하여 잠재적인 변형의 상위 한계를 계산하였음. P-값: 모의 처리, Cas9 플라스미드 형질감염 및 리포솜 Cas9 단백질:sgRNA 전달에 대하여 각 CLTA-표적화 처리 샘플 (DNA 형질감염 또는 단백질:sgRNA 전달 중 어느 하나) 대 EGFP를 표적으로 하여 Cas9 단백질 및 sgRNA로 처리된 대조 샘플 (모의 처리) 사이의 2-측 피셔 정밀 검정(two-sided Fisher's exact test)을 사용하여 P-값을 계산하였음. on:off 특이성은 각 부위에 있어서의 표적 적중 대 표적을 벗어난 게놈 변형 빈도의 비임. EMX 부위는 EMX 표적 부위에 적용된 CLTA 분석의 실험 및 분석 방법을 나타냄. VEGF 부위는 VEGF 표적 부위에 적용될 때의 CLTA 분석의 실험 및 분석 방법을 나타냄. 주 문서의 도 31 및 또한 도 41에서 삽입-결실의 총 수를 측정하고 표적 적중:표적을 벗어난 비를 계산하기 위하여, 플라스미드 형질감염 및 단백질:sgRNA 전달 삽입-결실 수 양자로부터 모의 처리 대조에서의 삽입-결실 수를 차감하였음.
[참고문헌]
등가 및 범위
통상의 기술자라면, 일상적인 실험만을 사용하여서도 본원에서 기술된 구체적인 실시양태에 대한 많은 등가물들에 대해 이해하게 되거나, 그것을 확인할 수 있을 것이다. 본 발명의 영역을 상기 상세한 설명으로 제한하고자 하는 것은 아니며, 그보다는 그것은 첨부된 청구범위에 제시되어 있는 바와 같다.
통상의 기술자라면, 일상적인 실험만을 사용하여서도 본원에서 기술된 본 발명에 따른 구체적인 실시양태에 대한 많은 등가물들에 대해 이해하게 되거나, 그것을 확인할 수 있을 것이다. 본 발명의 영역을 상기 상세한 설명으로 제한하고자 하는 것은 아니며, 그보다는 그것은 첨부된 청구범위에 제시되어 있는 바와 같다.
청구범위에서, "a", "an" 및 "the"와 같은 관사는 문맥상 분명하게 반대로 또는 다르게 표시되지 않는 한, 하나 또는 하나 초과를 의미할 수 있다. 하나 이상 군 구성원들 사이에 "또는"이 포함되는 청구범위 또는 상세한 설명은 문맥상 분명하게 반대로 또는 다르게 표시되지 않는 한, 하나, 하나 초과 또는 모든 군 구성원이 주어진 생성물 또는 방법에 존재하거나, 사용되거나 또는 달리 관련되는 경우에 충족된 것으로 간주된다. 본 발명은 정확하게 하나의 군 구성원이 주어진 생성물 또는 방법에 존재하거나, 사용되거나 또는 달리 관련되는 실시양태를 포함한다. 본 발명은 하나 초과 또는 모든 군 구성원이 주어진 생성물 또는 방법에 존재하거나, 사용되거나 또는 달리 관련되는 실시양태를 포함한다. 또한, 열거되는 청구항들 중 하나 이상에 속하는 하나 이상의 한정, 요소, 조항, 기술 용어 등이 또 다른 청구항에 도입되는 모든 변이, 조합 및 변경을 본 발명이 포괄한다는 것이 이해되어야 한다. 예를 들어, 또 다른 청구항에 종속하는 임의의 청구항은 동일한 기본 청구항에 종속하는 임의의 다른 청구항에서 발견되는 하나 이상의 한정을 포함하도록 변형될 수 있다. 또한, 청구항이 조성물을 인용하는 경우, 다르게 표시되지 않는 한, 또는 모순 또는 불일치가 야기되는 것이 통상의 기술자에게 분명하게 되지 않는 한, 본원에서 개시되는 목적들 중 어느 것을 위한 조성물의 사용 방법이 포함되며, 본원에서 개시되는 제조 방법들 중 어느 것에 따른 조성물의 제조 방법 또는 관련 기술분야에 알려져 있는 다른 방법이 포함된다는 것이 이해되어야 한다.
예컨대 마커쉬 그룹(Markush group) 포맷에서 요소들이 목록으로 제시되는 경우, 요소들의 각 하위군 역시 개시되는 것이며, 어떠한 요소(들)도 군으로부터 제거될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 일반적으로, 본 발명 또는 본 발명의 측면이 특정 요소, 특징 등을 포함하는 것으로 지칭되는 경우, 본 발명 또는 본 발명 측면의 소정 실시양태는 그와 같은 요소, 특징 등으로 이루어지거나, 본질적으로 그로 이루어진 것임이 이해되어야 한다. 단순성을 목적으로, 그러한 실시양태들은 여기 본원에(in haec verba) 구체적으로 제시되어 있지 않다. "포함하는 것"이라는 용어는 개방적인 것을 의미하며, 추가적인 요소 또는 단계의 포함을 허용한다는 것 역시 유의해야 한다.
범위가 제시되는 경우, 종말점들은 포함된다. 또한, 문맥상 그리고 통상적인 기술자의 지식상 다르게 표시되거나 다르지 않는 한, 범위로 표현되는 값은 본 발명의 다른 실시양태에서는 문맥상 분명하게 다르게 기술되지 않는 한, 범위 하위 한계의 10분의 1 단위까지 언급된 범위 이내인 임의의 구체적인 값 또는 하위범위를 취할 수 있다는 것이 이해되어야 한다.
또한, 선행 기술에 속하는 본 발명의 어떠한 구체적인 실시양태도 청구항들 중 임의의 하나 이상으로부터 명시적으로 배제될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 그와 같은 실시양태는 통상의 기술자에게 공지된 것으로 간주되기 때문에, 본원에서 명시적으로 배제가 제시되지 않는다 할지라도, 그것이 배제될 수 있다. 본 발명 조성물의 임의의 구체적인 실시양태 (예컨대 임의의 초하전 단백질; 임의의 핵산; 임의의 제조 방법; 임의의 사용 방법 등)는 선행 기술의 존재와 관련되는지 여부와 관계없이 임의의 이유로 임의의 하나 이상 청구항으로부터 배제될 수 있다.
인용되는 모든 공급원, 예를 들면 참고문헌, 공개, 데이터베이스, 데이터베이스 구성원, 및 본원에서 언급되는 기술은 인용시 명시적으로 언급되지 않는다 할지라도, 본 출원에 참조로 포함된다. 인용 출처와 본 출원의 언급이 충돌하는 경우, 본 출원의 언급이 우선하게 된다.
SEQUENCE LISTING
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Asp Gly Lys Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Arg Thr
115 120 125
Leu Val Asn Arg Ile Lys Leu Lys Gly Arg Asp Phe Lys Glu Lys Gly
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Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Arg Tyr Asn Phe Asn Ser His Lys Val
145 150 155 160
Tyr Ile Thr Ala Asp Lys Arg Lys Asn Gly Ile Lys Ala Lys Phe Lys
165 170 175
Ile Arg His Asn Val Lys Asp Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp His Tyr
180 185 190
Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Arg Gly Pro Val Leu Leu Pro Arg Asn
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His Tyr Leu Ser Thr Arg Ser Lys Leu Ser Lys Asp Pro Lys Glu Lys
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Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Lys
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His Gly Arg Asp Glu Arg Tyr Lys
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100 105 110
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115 120 125
Leu Val Asn Arg Ile Lys Leu Lys Gly Arg Asp Phe Lys Glu Lys Gly
130 135 140
Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Arg Tyr Asn Phe Asn Ser His Lys Val
145 150 155 160
Tyr Ile Thr Ala Asp Lys Arg Lys Asn Gly Ile Lys Ala Lys Phe Lys
165 170 175
Ile Arg His Asn Val Lys Asp Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp His Tyr
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Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Lys
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His Gly Arg Lys Glu Arg Tyr Lys
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His Gly Arg Lys Glu Arg Tyr Lys
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Leu Val Asn Arg Ile Lys Leu Lys Gly Arg Asp Phe Lys Glu Lys Gly
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Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Arg Tyr Asn Phe Asn Ser His Lys Val
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Arg Asp His Met Val Leu Lys Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Lys
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His Gly Arg Lys Glu Arg Tyr Lys
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<223> Synthetic Polypeptide
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Met Gly His His His His His His Gly Gly Ala Ser Lys Gly Glu Glu
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Asn Gly His Glu Phe Ser Val Arg Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr
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His Gly Arg Asp Glu Arg Tyr Lys Gly Ser Ala Gly Ser Ala Ala Gly
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Gly Ile Gly Ala Val Leu Lys Val Leu Thr Thr Gly Leu Pro Ala Leu
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Met Val Lys Ser Lys Ile Gly Ser Trp Ile Leu Val Leu Phe Val Ala
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Met Trp Ser Asp Val Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro
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Gly Ala Leu Phe Leu Gly Trp Leu Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly
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Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Lys Ile Asn Leu Lys Ala Leu Ala Ala Leu
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Ala Lys Lys Ile Leu
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Met Gly Ala Ser Lys Gly Glu Arg Leu Phe Arg Gly Lys Val Pro Ile
1 5 10 15
Leu Val Glu Leu Lys Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Arg
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Gly Lys Gly Lys Gly Asp Ala Thr Arg Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe
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50 55 60
Thr Leu Thr Ser Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Lys His Met
65 70 75 80
Lys Arg His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Lys Gly Tyr Val Gln
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Glu Arg Thr Ile Ser Phe Lys Lys Asp Gly Lys Tyr Lys Thr Arg Ala
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Glu Val Lys Phe Glu Gly Arg Thr Leu Val Asn Arg Ile Lys Leu Lys
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Gly Arg Asp Phe Lys Glu Lys Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Arg
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Tyr Asn Phe Asn Ser His Lys Val Tyr Ile Thr Ala Asp Lys Arg Lys
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Gly Pro Val Leu Leu Pro Arg Asn His Tyr Leu Ser Thr Arg Ser Lys
195 200 205
Leu Ser Lys Asp Pro Lys Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu
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Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Lys His Gly Arg Asp Glu Arg Tyr Lys
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Thr Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
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Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Thr Ala Leu Ala Leu
260 265 270
Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Met Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu
275 280 285
Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr
290 295 300
Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His
305 310 315 320
Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu
325 330 335
Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr
340 345 350
Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu
355 360 365
Met Ala Lys Val Asp Asp Ser Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe
370 375 380
Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn
385 390 395 400
Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His
405 410 415
Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu
420 425 430
Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu
435 440 445
Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe
450 455 460
Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile
465 470 475 480
Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser
485 490 495
Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys
500 505 510
Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr
515 520 525
Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln
530 535 540
Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln
545 550 555 560
Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser
565 570 575
Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr
580 585 590
Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His
595 600 605
Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu
610 615 620
Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly
625 630 635 640
Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys
645 650 655
Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu
660 665 670
Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser
675 680 685
Ile Pro His Gln Ile His Leu Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg
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Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu
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Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg
725 730 735
Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile
740 745 750
Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln
755 760 765
Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu
770 775 780
Lys Val Leu Pro Lys His Ser Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr
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Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro
805 810 815
Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe
820 825 830
Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe
835 840 845
Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp
850 855 860
Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile
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Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu
885 890 895
Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu
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Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys
915 920 925
Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys
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Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp
945 950 955 960
Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile
965 970 975
His Asp Asp Ser Leu Thr Phe Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val
980 985 990
Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly
995 1000 1005
Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val
1010 1015 1020
Asp Glu Leu Val Lys Val Met Gly Arg His Lys Pro Glu Asn Ile
1025 1030 1035
Val Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln Thr Thr Gln Lys Gly Gln
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Lys Asn Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile Glu Glu Gly Ile Lys
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Glu Leu Gly Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro Val Glu Asn Thr
1070 1075 1080
Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu Gln Asn Gly
1085 1090 1095
Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg Leu Ser
1100 1105 1110
Asp Tyr Asp Val Asp His Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys Asp
1115 1120 1125
Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg
1130 1135 1140
Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met
1145 1150 1155
Lys Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln
1160 1165 1170
Arg Lys Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser
1175 1180 1185
Glu Leu Asp Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr
1190 1195 1200
Arg Gln Ile Thr Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met
1205 1210 1215
Asn Thr Lys Tyr Asp Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys
1220 1225 1230
Val Ile Thr Leu Lys Ser Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp
1235 1240 1245
Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala
1250 1255 1260
His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys
1265 1270 1275
Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe Val Tyr Gly Asp Tyr Lys
1280 1285 1290
Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala Lys Ser Glu Gln Glu Ile
1295 1300 1305
Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe Tyr Ser Asn Ile Met Asn
1310 1315 1320
Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala Asn Gly Glu Ile Arg Lys
1325 1330 1335
Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu Thr Gly Glu Ile Val Trp
1340 1345 1350
Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val Arg Lys Val Leu Ser Met
1355 1360 1365
Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr Glu Val Gln Thr Gly Gly
1370 1375 1380
Phe Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys Arg Asn Ser Asp Lys Leu
1385 1390 1395
Ile Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro Lys Lys Tyr Gly Gly Phe
1400 1405 1410
Asp Ser Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val Leu Val Val Ala Lys Val
1415 1420 1425
Glu Lys Gly Lys Ser Lys Lys Leu Lys Ser Val Lys Glu Leu Leu
1430 1435 1440
Gly Ile Thr Ile Met Glu Arg Ser Ser Phe Glu Lys Asn Pro Ile
1445 1450 1455
Asp Phe Leu Glu Ala Lys Gly Tyr Lys Glu Val Lys Lys Asp Leu
1460 1465 1470
Ile Ile Lys Leu Pro Lys Tyr Ser Leu Phe Glu Leu Glu Asn Gly
1475 1480 1485
Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser Ala Gly Glu Leu Gln Lys Gly Asn
1490 1495 1500
Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr Val Asn Phe Leu Tyr Leu Ala
1505 1510 1515
Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser Pro Glu Asp Asn Glu Gln
1520 1525 1530
Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln His Lys His Tyr Leu Asp Glu Ile
1535 1540 1545
Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys Arg Val Ile Leu Ala Asp
1550 1555 1560
Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala Tyr Asn Lys His Arg Asp
1565 1570 1575
Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn Ile Ile His Leu Phe Thr
1580 1585 1590
Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala Phe Lys Tyr Phe Asp Thr
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Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Ser Thr Lys Glu Val Leu Asp
1610 1615 1620
Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr Gly Leu Tyr Glu Thr Arg
1625 1630 1635
Ile Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp His His His His His His
1640 1645 1650
<210> 31
<211> 1653
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polypeptide
<400> 31
Met Gly Ala Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Asp Gly Val Val Pro Ile
1 5 10 15
Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Glu Phe Ser Val Arg
20 25 30
Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Glu Gly Glu Leu Thr Leu Lys Phe
35 40 45
Ile Cys Thr Thr Gly Glu Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr
50 55 60
Thr Leu Thr Ser Gly Val Gln Cys Phe Ser Asp Tyr Pro Asp His Met
65 70 75 80
Asp Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln
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Glu Arg Thr Ile Ser Phe Lys Asp Asp Gly Thr Tyr Lys Thr Arg Ala
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Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Asp His Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys
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Thr Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
245 250 255
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Thr Ala Leu Ala Leu
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Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His
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Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu
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Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr
340 345 350
Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu
355 360 365
Met Ala Lys Val Asp Asp Ser Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe
370 375 380
Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn
385 390 395 400
Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His
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Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu
420 425 430
Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu
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Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe
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Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile
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Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser
485 490 495
Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys
500 505 510
Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr
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Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln
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Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln
545 550 555 560
Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser
565 570 575
Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr
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Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His
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Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys
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850 855 860
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Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu
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Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Thr Ala Ser Asn Leu
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<220>
<223> Synthetic Polypeptide
<400> 36
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545 550 555 560
Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu
565 570 575
Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu Thr
580 585 590
Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala
595 600 605
Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly
610 615 620
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625 630 635 640
Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala
645 650 655
His Gly Leu Thr Pro Ala Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly
660 665 670
Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys
675 680 685
Gln Asp His Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn
690 695 700
Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val
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Leu Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala
725 730 735
Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu
740 745 750
Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val Ala
755 760 765
Ile Ala Asn Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg
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Glu Ser Ile Val Ala Gln Leu Ser Arg Pro Asp Pro Ala Leu Ala
1025 1030 1035
Ala Leu Thr Asn Asp His Leu Val Ala Leu Ala Cys Leu Gly Gly
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Arg Pro Ala Leu Asp Ala Val Lys Lys Gly Leu Pro His Ala Pro
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Ala Leu Ile Lys Arg Thr Asn Arg Arg Ile Pro Glu Arg Thr Ser
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His Arg Val Ala Asp His Ala Gln Val Val Arg Val Leu Gly Phe
1085 1090 1095
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<223> Synthetic Polypeptide
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Ala Ala Leu Gly Thr Val Ala Val Lys Tyr Gln Asp Met Ile Ala Ala
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100 105 110
Arg Gly Pro Pro Leu Gln Leu Asp Thr Gly Gln Leu Leu Lys Ile Ala
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Lys Arg Gly Gly Val Thr Ala Val Glu Ala Val His Ala Trp Arg Asn
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Ala Leu Thr Gly Ala Pro Leu Asn Leu
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polypeptide
<400> 42
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Ala Leu Thr Asn Asp His Leu Val Ala Leu Ala Cys Leu Gly Gly Arg
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Pro Ala Leu Asp Ala Val Lys Lys Gly Leu Pro His Ala Pro Ala Leu
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Ile Lys Arg Thr Asn Arg Arg Ile Pro Glu Arg Thr Ser His Arg Val
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Ser Gly Gly
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<212> DNA
<213> Streptococcus pyogenes
<400> 43
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atcactgatg attataaggt tccgtctaaa aagttcaagg ttctgggaaa tacagaccgc 120
cacagtatca aaaaaaatct tataggggct cttttatttg gcagtggaga gacagcggaa 180
gcgactcgtc tcaaacggac agctcgtaga aggtatacac gtcggaagaa tcgtatttgt 240
tatctacagg agattttttc aaatgagatg gcgaaagtag atgatagttt ctttcatcga 300
cttgaagagt cttttttggt ggaagaagac aagaagcatg aacgtcatcc tatttttgga 360
aatatagtag atgaagttgc ttatcatgag aaatatccaa ctatctatca tctgcgaaaa 420
aaattggcag attctactga taaagcggat ttgcgcttaa tctatttggc cttagcgcat 480
atgattaagt ttcgtggtca ttttttgatt gagggagatt taaatcctga taatagtgat 540
gtggacaaac tatttatcca gttggtacaa atctacaatc aattatttga agaaaaccct 600
attaacgcaa gtagagtaga tgctaaagcg attctttctg cacgattgag taaatcaaga 660
cgattagaaa atctcattgc tcagctcccc ggtgagaaga gaaatggctt gtttgggaat 720
ctcattgctt tgtcattggg attgacccct aattttaaat caaattttga tttggcagaa 780
gatgctaaat tacagctttc aaaagatact tacgatgatg atttagataa tttattggcg 840
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caacaacttc cagaaaagta taaagaaatc ttttttgatc aatcaaaaaa cggatatgca 1080
ggttatattg atgggggagc tagccaagaa gaattttata aatttatcaa accaatttta 1140
gaaaaaatgg atggtactga ggaattattg gtgaaactaa atcgtgaaga tttgctgcgc 1200
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tataacgaat tgacaaaggt caaatatgtt actgagggaa tgcgaaaacc agcatttctt 1620
tcaggtgaac agaagaaagc cattgttgat ttactcttca aaacaaatcg aaaagtaacc 1680
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tcaggagttg aagatagatt taatgcttca ttaggcgcct accatgattt gctaaaaatt 1800
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gattttttga aatcagatgg ttttgccaat cgcaatttta tgcagctgat ccatgatgat 2100
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<213> Streptococcus pyogenes
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Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu
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His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr
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His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly
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<223> Synthetic Polynucleotide
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atagatcgca aacgatacac ttctaccaag gaggtgctag acgcgacact gattcaccaa 4800
tccatcacgg gattatatga aactcggata gatttgtcac agcttggggg tgac 4854
<210> 54
<211> 4869
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 54
atggactaca aagaccatga cggtgattat aaagatcatg acatcgatta caaggatgac 60
gatgacaaga tggcccccaa gaagaagagg aaggtgggca ttcaccgcgg ggtacctgga 120
ggttctggat cccaactagt caaaagtgaa ctggaggaga agaaatctga acttcgtcat 180
aaattgaaat atgtgcctca tgaatatatt gaattaattg aaattgccag aaattccact 240
caggatagaa ttcttgaaat gaaggtaatg gaatttttta tgaaagttta tggatataga 300
ggtaaacatt tgggtggatc aaggaaaccg gacggagcaa tttatactgt cggatctcct 360
attgattacg gtgtgatcgt ggatactaaa gcttatagcg gaggttataa tctgccaatt 420
ggccaagcag atgaaatgca acgatatgtc gaagaaaatc aaacacgaaa caaacatatc 480
aaccctaatg aatggtggaa agtctatcca tcttctgtaa cggaatttaa gtttttattt 540
gtgagtggtc actttaaagg aaactacaaa gctcagctta cacgattaaa tcatatcact 600
aattgtaatg gagctgttct tagtgtagaa gagcttttaa ttggtggaga aatgattaaa 660
gccggcacat taaccttaga ggaagtcaga cggaaattta ataacggcga gataaacttt 720
agcggcagcg agactcccgg gacctcagag tccgccacac ccgaaagtga taaaaagtat 780
tctattggtt tagctatcgg cactaattcc gttggatggg ctgtcataac cgatgaatac 840
aaagtacctt caaagaaatt taaggtgttg gggaacacag accgtcattc gattaaaaag 900
aatcttatcg gtgccctcct attcgatagt ggcgaaacgg cagaggcgac tcgcctgaaa 960
cgaaccgctc ggagaaggta tacacgtcgc aagaaccgaa tatgttactt acaagaaatt 1020
tttagcaatg agatggccaa agttgacgat tctttctttc accgtttgga agagtccttc 1080
cttgtcgaag aggacaagaa acatgaacgg caccccatct ttggaaacat agtagatgag 1140
gtggcatatc atgaaaagta cccaacgatt tatcacctca gaaaaaagct agttgactca 1200
actgataaag cggacctgag gttaatctac ttggctcttg cccatatgat aaagttccgt 1260
gggcactttc tcattgaggg tgatctaaat ccggacaact cggatgtcga caaactgttc 1320
atccagttag tacaaaccta taatcagttg tttgaagaga accctataaa tgcaagtggc 1380
gtggatgcga aggctattct tagcgcccgc ctctctaaat cccgacggct agaaaacctg 1440
atcgcacaat tacccggaga gaagaaaaat gggttgttcg gtaaccttat agcgctctca 1500
ctaggcctga caccaaattt taagtcgaac ttcgacttag ctgaagatgc caaattgcag 1560
cttagtaagg acacgtacga tgacgatctc gacaatctac tggcacaaat tggagatcag 1620
tatgcggact tatttttggc tgccaaaaac cttagcgatg caatcctcct atctgacata 1680
ctgagagtta atactgagat taccaaggcg ccgttatccg cttcaatgat caaaaggtac 1740
gatgaacatc accaagactt gacacttctc aaggccctag tccgtcagca actgcctgag 1800
aaatataagg aaatattctt tgatcagtcg aaaaacgggt acgcaggtta tattgacggc 1860
ggagcgagtc aagaggaatt ctacaagttt atcaaaccca tattagagaa gatggatggg 1920
acggaagagt tgcttgtaaa actcaatcgc gaagatctac tgcgaaagca gcggactttc 1980
gacaacggta gcattccaca tcaaatccac ttaggcgaat tgcatgctat acttagaagg 2040
caggaggatt tttatccgtt cctcaaagac aatcgtgaaa agattgagaa aatcctaacc 2100
tttcgcatac cttactatgt gggacccctg gcccgaggga actctcggtt cgcatggatg 2160
acaagaaagt ccgaagaaac gattactcca tggaattttg aggaagttgt cgataaaggt 2220
gcgtcagctc aatcgttcat cgagaggatg accaactttg acaagaattt accgaacgaa 2280
aaagtattgc ctaagcacag tttactttac gagtatttca cagtgtacaa tgaactcacg 2340
aaagttaagt atgtcactga gggcatgcgt aaacccgcct ttctaagcgg agaacagaag 2400
aaagcaatag tagatctgtt attcaagacc aaccgcaaag tgacagttaa gcaattgaaa 2460
gaggactact ttaagaaaat tgaatgcttc gattctgtcg agatctccgg ggtagaagat 2520
cgatttaatg cgtcacttgg tacgtatcat gacctcctaa agataattaa agataaggac 2580
ttcctggata acgaagagaa tgaagatatc ttagaagata tagtgttgac tcttaccctc 2640
tttgaagatc gggaaatgat tgaggaaaga ctaaaaacat acgctcacct gttcgacgat 2700
aaggttatga aacagttaaa gaggcgtcgc tatacgggct ggggacgatt gtcgcggaaa 2760
cttatcaacg ggataagaga caagcaaagt ggtaaaacta ttctcgattt tctaaagagc 2820
gacggcttcg ccaataggaa ctttatgcag ctgatccatg atgactcttt aaccttcaaa 2880
gaggatatac aaaaggcaca ggtttccgga caaggggact cattgcacga acatattgcg 2940
aatcttgctg gttcgccagc catcaaaaag ggcatactcc agacagtcaa agtagtggat 3000
gagctagtta aggtcatggg acgtcacaaa ccggaaaaca ttgtaatcga gatggcacgc 3060
gaaaatcaaa cgactcagaa ggggcaaaaa aacagtcgag agcggatgaa gagaatagaa 3120
gagggtatta aagaactggg cagccagatc ttaaaggagc atcctgtgga aaatacccaa 3180
ttgcagaacg agaaacttta cctctattac ctacaaaatg gaagggacat gtatgttgat 3240
caggaactgg acataaaccg tttatctgat tacgacgtcg atgccattgt accccaatcc 3300
tttttgaagg acgattcaat cgacaataaa gtgcttacac gctcggataa gaaccgaggg 3360
aaaagtgaca atgttccaag cgaggaagtc gtaaagaaaa tgaagaacta ttggcggcag 3420
ctcctaaatg cgaaactgat aacgcaaaga aagttcgata acttaactaa agctgagagg 3480
ggtggcttgt ctgaacttga caaggccgga tttattaaac gtcagctcgt ggaaacccgc 3540
caaatcacaa agcatgttgc acagatacta gattcccgaa tgaatacgaa atacgacgag 3600
aacgataagc tgattcggga agtcaaagta atcactttaa agtcaaaatt ggtgtcggac 3660
ttcagaaagg attttcaatt ctataaagtt agggagataa ataactacca ccatgcgcac 3720
gacgcttatc ttaatgccgt cgtagggacc gcactcatta agaaataccc gaagctagaa 3780
agtgagtttg tgtatggtga ttacaaagtt tatgacgtcc gtaagatgat cgcgaaaagc 3840
gaacaggaga taggcaaggc tacagccaaa tacttctttt attctaacat tatgaatttc 3900
tttaagacgg aaatcactct ggcaaacgga gagatacgca aacgaccttt aattgaaacc 3960
aatggggaga caggtgaaat cgtatgggat aagggccggg acttcgcgac ggtgagaaaa 4020
gttttgtcca tgccccaagt caacatagta aagaaaactg aggtgcagac cggagggttt 4080
tcaaaggaat cgattcttcc aaaaaggaat agtgataagc tcatcgctcg taaaaaggac 4140
tgggacccga aaaagtacgg tggcttcgat agccctacag ttgcctattc tgtcctagta 4200
gtggcaaaag ttgagaaggg aaaatccaag aaactgaagt cagtcaaaga attattgggg 4260
ataacgatta tggagcgctc gtcttttgaa aagaacccca tcgacttcct tgaggcgaaa 4320
ggttacaagg aagtaaaaaa ggatctcata attaaactac caaagtatag tctgtttgag 4380
ttagaaaatg gccgaaaacg gatgttggct agcgccggag agcttcaaaa ggggaacgaa 4440
ctcgcactac cgtctaaata cgtgaatttc ctgtatttag cgtcccatta cgagaagttg 4500
aaaggttcac ctgaagataa cgaacagaag caactttttg ttgagcagca caaacattat 4560
ctcgacgaaa tcatagagca aatttcggaa ttcagtaaga gagtcatcct agctgatgcc 4620
aatctggaca aagtattaag cgcatacaac aagcacaggg ataaacccat acgtgagcag 4680
gcggaaaata ttatccattt gtttactctt accaacctcg gcgctccagc cgcattcaag 4740
tattttgaca caacgataga tcgcaaacga tacacttcta ccaaggaggt gctagacgcg 4800
acactgattc accaatccat cacgggatta tatgaaactc ggatagattt gtcacagctt 4860
gggggtgac 4869
<210> 55
<211> 432
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 55
atggccctgt ttggctacgc acgcgtgtct accagtcaac agtcactcga tttgcaagtg 60
agggctctta aagatgccgg agtgaaggca aacagaattt ttactgataa ggccagcgga 120
agcagcacag acagagaggg gctggatctc ctgagaatga aggtaaagga gggtgatgtg 180
atcttggtca aaaaattgga tcgactgggg agagacacag ctgatatgct tcagcttatt 240
aaagagtttg acgctcaggg tgttgccgtg aggtttatcg atgacggcat ctcaaccgac 300
tcctacattg gtcttatgtt tgtgacaatt ttgtccgctg tggctcaggc tgagcggaga 360
aggattctcg aaaggacgaa tgagggacgg caagcagcta agttgaaagg tatcaaattt 420
ggcagacgaa gg 432
<210> 56
<211> 144
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polypeptide
<400> 56
Met Ala Leu Phe Gly Tyr Ala Arg Val Ser Thr Ser Gln Gln Ser Leu
1 5 10 15
Asp Leu Gln Val Arg Ala Leu Lys Asp Ala Gly Val Lys Ala Asn Arg
20 25 30
Ile Phe Thr Asp Lys Ala Ser Gly Ser Ser Thr Asp Arg Glu Gly Leu
35 40 45
Asp Leu Leu Arg Met Lys Val Lys Glu Gly Asp Val Ile Leu Val Lys
50 55 60
Lys Leu Asp Arg Leu Gly Arg Asp Thr Ala Asp Met Leu Gln Leu Ile
65 70 75 80
Lys Glu Phe Asp Ala Gln Gly Val Ala Val Arg Phe Ile Asp Asp Gly
85 90 95
Ile Ser Thr Asp Ser Tyr Ile Gly Leu Met Phe Val Thr Ile Leu Ser
100 105 110
Ala Val Ala Gln Ala Glu Arg Arg Arg Ile Leu Glu Arg Thr Asn Glu
115 120 125
Gly Arg Gln Ala Ala Lys Leu Lys Gly Ile Lys Phe Gly Arg Arg Arg
130 135 140
<210> 57
<211> 414
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 57
atggcaacca ttggctacat aagggtgtct accatcgacc aaaatatcga cctgcagcgc 60
aacgctctga catccgccaa ctgcgatcgg atcttcgagg ataggatcag tggcaagatc 120
gccaaccggc ccggtctgaa gcgggctctg aagtacgtga ataagggcga tactctggtt 180
gtgtggaagt tggatcgctt gggtagatca gtgaagaatc tcgtagccct gataagcgag 240
ctgcacgaga ggggtgcaca tttccattct ctgaccgatt ccatcgatac gtctagcgcc 300
atgggccgat tcttctttta cgtcatgtcc gccctcgctg aaatggagcg cgaacttatt 360
gttgaacgga ctttggctgg actggcagcg gctagagcac agggccgact tgga 414
<210> 58
<211> 138
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polypeptide
<400> 58
Met Ala Thr Ile Gly Tyr Ile Arg Val Ser Thr Ile Asp Gln Asn Ile
1 5 10 15
Asp Leu Gln Arg Asn Ala Leu Thr Ser Ala Asn Cys Asp Arg Ile Phe
20 25 30
Glu Asp Arg Ile Ser Gly Lys Ile Ala Asn Arg Pro Gly Leu Lys Arg
35 40 45
Ala Leu Lys Tyr Val Asn Lys Gly Asp Thr Leu Val Val Trp Lys Leu
50 55 60
Asp Arg Leu Gly Arg Ser Val Lys Asn Leu Val Ala Leu Ile Ser Glu
65 70 75 80
Leu His Glu Arg Gly Ala His Phe His Ser Leu Thr Asp Ser Ile Asp
85 90 95
Thr Ser Ser Ala Met Gly Arg Phe Phe Phe Tyr Val Met Ser Ala Leu
100 105 110
Ala Glu Met Glu Arg Glu Leu Ile Val Glu Arg Thr Leu Ala Gly Leu
115 120 125
Ala Ala Ala Arg Ala Gln Gly Arg Leu Gly
130 135
<210> 59
<211> 432
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 59
atgctcattg gctatgtaag ggtcagcacc aatgaccaaa acacagactt gcaacgcaat 60
gctttggttt gcgccggatg tgaacagata tttgaagata aactgagcgg cactcggaca 120
gacagacctg ggcttaagag agcactgaaa agactgcaga agggggacac cctggtcgtc 180
tggaaactgg atcgcctcgg acgcagcatg aaacatctga ttagcctggt tggtgagctt 240
agggagagag gaatcaactt cagaagcctg accgactcca tcgacaccag tagccccatg 300
ggacgattct tcttctatgt gatgggagca cttgctgaga tggaaagaga gcttattatc 360
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ccgaagagcg gc 432
<210> 60
<211> 144
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polypeptide
<400> 60
Met Leu Ile Gly Tyr Val Arg Val Ser Thr Asn Asp Gln Asn Thr Asp
1 5 10 15
Leu Gln Arg Asn Ala Leu Val Cys Ala Gly Cys Glu Gln Ile Phe Glu
20 25 30
Asp Lys Leu Ser Gly Thr Arg Thr Asp Arg Pro Gly Leu Lys Arg Ala
35 40 45
Leu Lys Arg Leu Gln Lys Gly Asp Thr Leu Val Val Trp Lys Leu Asp
50 55 60
Arg Leu Gly Arg Ser Met Lys His Leu Ile Ser Leu Val Gly Glu Leu
65 70 75 80
Arg Glu Arg Gly Ile Asn Phe Arg Ser Leu Thr Asp Ser Ile Asp Thr
85 90 95
Ser Ser Pro Met Gly Arg Phe Phe Phe Tyr Val Met Gly Ala Leu Ala
100 105 110
Glu Met Glu Arg Glu Leu Ile Ile Glu Arg Thr Met Ala Gly Ile Ala
115 120 125
Ala Ala Arg Asn Lys Gly Arg Arg Phe Gly Arg Pro Pro Lys Ser Gly
130 135 140
<210> 61
<211> 198
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 61
Met Asp Ser Leu Leu Met Asn Arg Arg Lys Phe Leu Tyr Gln Phe Lys
1 5 10 15
Asn Val Arg Trp Ala Lys Gly Arg Arg Glu Thr Tyr Leu Cys Tyr Val
20 25 30
Val Lys Arg Arg Asp Ser Ala Thr Ser Phe Ser Leu Asp Phe Gly Tyr
35 40 45
Leu Arg Asn Lys Asn Gly Cys His Val Glu Leu Leu Phe Leu Arg Tyr
50 55 60
Ile Ser Asp Trp Asp Leu Asp Pro Gly Arg Cys Tyr Arg Val Thr Trp
65 70 75 80
Phe Thr Ser Trp Ser Pro Cys Tyr Asp Cys Ala Arg His Val Ala Asp
85 90 95
Phe Leu Arg Gly Asn Pro Asn Leu Ser Leu Arg Ile Phe Thr Ala Arg
100 105 110
Leu Tyr Phe Cys Glu Asp Arg Lys Ala Glu Pro Glu Gly Leu Arg Arg
115 120 125
Leu His Arg Ala Gly Val Gln Ile Ala Ile Met Thr Phe Lys Asp Tyr
130 135 140
Phe Tyr Cys Trp Asn Thr Phe Val Glu Asn His Glu Arg Thr Phe Lys
145 150 155 160
Ala Trp Glu Gly Leu His Glu Asn Ser Val Arg Leu Ser Arg Gln Leu
165 170 175
Arg Arg Ile Leu Leu Pro Leu Tyr Glu Val Asp Asp Leu Arg Asp Ala
180 185 190
Phe Arg Thr Leu Gly Leu
195
<210> 62
<211> 198
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 62
Met Asp Ser Leu Leu Met Lys Gln Lys Lys Phe Leu Tyr His Phe Lys
1 5 10 15
Asn Val Arg Trp Ala Lys Gly Arg His Glu Thr Tyr Leu Cys Tyr Val
20 25 30
Val Lys Arg Arg Asp Ser Ala Thr Ser Cys Ser Leu Asp Phe Gly His
35 40 45
Leu Arg Asn Lys Ser Gly Cys His Val Glu Leu Leu Phe Leu Arg Tyr
50 55 60
Ile Ser Asp Trp Asp Leu Asp Pro Gly Arg Cys Tyr Arg Val Thr Trp
65 70 75 80
Phe Thr Ser Trp Ser Pro Cys Tyr Asp Cys Ala Arg His Val Ala Glu
85 90 95
Phe Leu Arg Trp Asn Pro Asn Leu Ser Leu Arg Ile Phe Thr Ala Arg
100 105 110
Leu Tyr Phe Cys Glu Asp Arg Lys Ala Glu Pro Glu Gly Leu Arg Arg
115 120 125
Leu His Arg Ala Gly Val Gln Ile Gly Ile Met Thr Phe Lys Asp Tyr
130 135 140
Phe Tyr Cys Trp Asn Thr Phe Val Glu Asn Arg Glu Arg Thr Phe Lys
145 150 155 160
Ala Trp Glu Gly Leu His Glu Asn Ser Val Arg Leu Thr Arg Gln Leu
165 170 175
Arg Arg Ile Leu Leu Pro Leu Tyr Glu Val Asp Asp Leu Arg Asp Ala
180 185 190
Phe Arg Met Leu Gly Phe
195
<210> 63
<211> 198
<212> PRT
<213> Canis lupus
<400> 63
Met Asp Ser Leu Leu Met Lys Gln Arg Lys Phe Leu Tyr His Phe Lys
1 5 10 15
Asn Val Arg Trp Ala Lys Gly Arg His Glu Thr Tyr Leu Cys Tyr Val
20 25 30
Val Lys Arg Arg Asp Ser Ala Thr Ser Phe Ser Leu Asp Phe Gly His
35 40 45
Leu Arg Asn Lys Ser Gly Cys His Val Glu Leu Leu Phe Leu Arg Tyr
50 55 60
Ile Ser Asp Trp Asp Leu Asp Pro Gly Arg Cys Tyr Arg Val Thr Trp
65 70 75 80
Phe Thr Ser Trp Ser Pro Cys Tyr Asp Cys Ala Arg His Val Ala Asp
85 90 95
Phe Leu Arg Gly Tyr Pro Asn Leu Ser Leu Arg Ile Phe Ala Ala Arg
100 105 110
Leu Tyr Phe Cys Glu Asp Arg Lys Ala Glu Pro Glu Gly Leu Arg Arg
115 120 125
Leu His Arg Ala Gly Val Gln Ile Ala Ile Met Thr Phe Lys Asp Tyr
130 135 140
Phe Tyr Cys Trp Asn Thr Phe Val Glu Asn Arg Glu Lys Thr Phe Lys
145 150 155 160
Ala Trp Glu Gly Leu His Glu Asn Ser Val Arg Leu Ser Arg Gln Leu
165 170 175
Arg Arg Ile Leu Leu Pro Leu Tyr Glu Val Asp Asp Leu Arg Asp Ala
180 185 190
Phe Arg Thr Leu Gly Leu
195
<210> 64
<211> 199
<212> PRT
<213> Bos taurus
<400> 64
Met Asp Ser Leu Leu Lys Lys Gln Arg Gln Phe Leu Tyr Gln Phe Lys
1 5 10 15
Asn Val Arg Trp Ala Lys Gly Arg His Glu Thr Tyr Leu Cys Tyr Val
20 25 30
Val Lys Arg Arg Asp Ser Pro Thr Ser Phe Ser Leu Asp Phe Gly His
35 40 45
Leu Arg Asn Lys Ala Gly Cys His Val Glu Leu Leu Phe Leu Arg Tyr
50 55 60
Ile Ser Asp Trp Asp Leu Asp Pro Gly Arg Cys Tyr Arg Val Thr Trp
65 70 75 80
Phe Thr Ser Trp Ser Pro Cys Tyr Asp Cys Ala Arg His Val Ala Asp
85 90 95
Phe Leu Arg Gly Tyr Pro Asn Leu Ser Leu Arg Ile Phe Thr Ala Arg
100 105 110
Leu Tyr Phe Cys Asp Lys Glu Arg Lys Ala Glu Pro Glu Gly Leu Arg
115 120 125
Arg Leu His Arg Ala Gly Val Gln Ile Ala Ile Met Thr Phe Lys Asp
130 135 140
Tyr Phe Tyr Cys Trp Asn Thr Phe Val Glu Asn His Glu Arg Thr Phe
145 150 155 160
Lys Ala Trp Glu Gly Leu His Glu Asn Ser Val Arg Leu Ser Arg Gln
165 170 175
Leu Arg Arg Ile Leu Leu Pro Leu Tyr Glu Val Asp Asp Leu Arg Asp
180 185 190
Ala Phe Arg Thr Leu Gly Leu
195
<210> 65
<211> 429
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 65
Met Gly Pro Phe Cys Leu Gly Cys Ser His Arg Lys Cys Tyr Ser Pro
1 5 10 15
Ile Arg Asn Leu Ile Ser Gln Glu Thr Phe Lys Phe His Phe Lys Asn
20 25 30
Leu Gly Tyr Ala Lys Gly Arg Lys Asp Thr Phe Leu Cys Tyr Glu Val
35 40 45
Thr Arg Lys Asp Cys Asp Ser Pro Val Ser Leu His His Gly Val Phe
50 55 60
Lys Asn Lys Asp Asn Ile His Ala Glu Ile Cys Phe Leu Tyr Trp Phe
65 70 75 80
His Asp Lys Val Leu Lys Val Leu Ser Pro Arg Glu Glu Phe Lys Ile
85 90 95
Thr Trp Tyr Met Ser Trp Ser Pro Cys Phe Glu Cys Ala Glu Gln Ile
100 105 110
Val Arg Phe Leu Ala Thr His His Asn Leu Ser Leu Asp Ile Phe Ser
115 120 125
Ser Arg Leu Tyr Asn Val Gln Asp Pro Glu Thr Gln Gln Asn Leu Cys
130 135 140
Arg Leu Val Gln Glu Gly Ala Gln Val Ala Ala Met Asp Leu Tyr Glu
145 150 155 160
Phe Lys Lys Cys Trp Lys Lys Phe Val Asp Asn Gly Gly Arg Arg Phe
165 170 175
Arg Pro Trp Lys Arg Leu Leu Thr Asn Phe Arg Tyr Gln Asp Ser Lys
180 185 190
Leu Gln Glu Ile Leu Arg Pro Cys Tyr Ile Pro Val Pro Ser Ser Ser
195 200 205
Ser Ser Thr Leu Ser Asn Ile Cys Leu Thr Lys Gly Leu Pro Glu Thr
210 215 220
Arg Phe Cys Val Glu Gly Arg Arg Met Asp Pro Leu Ser Glu Glu Glu
225 230 235 240
Phe Tyr Ser Gln Phe Tyr Asn Gln Arg Val Lys His Leu Cys Tyr Tyr
245 250 255
His Arg Met Lys Pro Tyr Leu Cys Tyr Gln Leu Glu Gln Phe Asn Gly
260 265 270
Gln Ala Pro Leu Lys Gly Cys Leu Leu Ser Glu Lys Gly Lys Gln His
275 280 285
Ala Glu Ile Leu Phe Leu Asp Lys Ile Arg Ser Met Glu Leu Ser Gln
290 295 300
Val Thr Ile Thr Cys Tyr Leu Thr Trp Ser Pro Cys Pro Asn Cys Ala
305 310 315 320
Trp Gln Leu Ala Ala Phe Lys Arg Asp Arg Pro Asp Leu Ile Leu His
325 330 335
Ile Tyr Thr Ser Arg Leu Tyr Phe His Trp Lys Arg Pro Phe Gln Lys
340 345 350
Gly Leu Cys Ser Leu Trp Gln Ser Gly Ile Leu Val Asp Val Met Asp
355 360 365
Leu Pro Gln Phe Thr Asp Cys Trp Thr Asn Phe Val Asn Pro Lys Arg
370 375 380
Pro Phe Trp Pro Trp Lys Gly Leu Glu Ile Ile Ser Arg Arg Thr Gln
385 390 395 400
Arg Arg Leu Arg Arg Ile Lys Glu Ser Trp Gly Leu Gln Asp Leu Val
405 410 415
Asn Asp Phe Gly Asn Leu Gln Leu Gly Pro Pro Met Ser
420 425
<210> 66
<211> 429
<212> PRT
<213> Rattus norvegicus
<400> 66
Met Gly Pro Phe Cys Leu Gly Cys Ser His Arg Lys Cys Tyr Ser Pro
1 5 10 15
Ile Arg Asn Leu Ile Ser Gln Glu Thr Phe Lys Phe His Phe Lys Asn
20 25 30
Leu Arg Tyr Ala Ile Asp Arg Lys Asp Thr Phe Leu Cys Tyr Glu Val
35 40 45
Thr Arg Lys Asp Cys Asp Ser Pro Val Ser Leu His His Gly Val Phe
50 55 60
Lys Asn Lys Asp Asn Ile His Ala Glu Ile Cys Phe Leu Tyr Trp Phe
65 70 75 80
His Asp Lys Val Leu Lys Val Leu Ser Pro Arg Glu Glu Phe Lys Ile
85 90 95
Thr Trp Tyr Met Ser Trp Ser Pro Cys Phe Glu Cys Ala Glu Gln Val
100 105 110
Leu Arg Phe Leu Ala Thr His His Asn Leu Ser Leu Asp Ile Phe Ser
115 120 125
Ser Arg Leu Tyr Asn Ile Arg Asp Pro Glu Asn Gln Gln Asn Leu Cys
130 135 140
Arg Leu Val Gln Glu Gly Ala Gln Val Ala Ala Met Asp Leu Tyr Glu
145 150 155 160
Phe Lys Lys Cys Trp Lys Lys Phe Val Asp Asn Gly Gly Arg Arg Phe
165 170 175
Arg Pro Trp Lys Lys Leu Leu Thr Asn Phe Arg Tyr Gln Asp Ser Lys
180 185 190
Leu Gln Glu Ile Leu Arg Pro Cys Tyr Ile Pro Val Pro Ser Ser Ser
195 200 205
Ser Ser Thr Leu Ser Asn Ile Cys Leu Thr Lys Gly Leu Pro Glu Thr
210 215 220
Arg Phe Cys Val Glu Arg Arg Arg Val His Leu Leu Ser Glu Glu Glu
225 230 235 240
Phe Tyr Ser Gln Phe Tyr Asn Gln Arg Val Lys His Leu Cys Tyr Tyr
245 250 255
His Gly Val Lys Pro Tyr Leu Cys Tyr Gln Leu Glu Gln Phe Asn Gly
260 265 270
Gln Ala Pro Leu Lys Gly Cys Leu Leu Ser Glu Lys Gly Lys Gln His
275 280 285
Ala Glu Ile Leu Phe Leu Asp Lys Ile Arg Ser Met Glu Leu Ser Gln
290 295 300
Val Ile Ile Thr Cys Tyr Leu Thr Trp Ser Pro Cys Pro Asn Cys Ala
305 310 315 320
Trp Gln Leu Ala Ala Phe Lys Arg Asp Arg Pro Asp Leu Ile Leu His
325 330 335
Ile Tyr Thr Ser Arg Leu Tyr Phe His Trp Lys Arg Pro Phe Gln Lys
340 345 350
Gly Leu Cys Ser Leu Trp Gln Ser Gly Ile Leu Val Asp Val Met Asp
355 360 365
Leu Pro Gln Phe Thr Asp Cys Trp Thr Asn Phe Val Asn Pro Lys Arg
370 375 380
Pro Phe Trp Pro Trp Lys Gly Leu Glu Ile Ile Ser Arg Arg Thr Gln
385 390 395 400
Arg Arg Leu His Arg Ile Lys Glu Ser Trp Gly Leu Gln Asp Leu Val
405 410 415
Asn Asp Phe Gly Asn Leu Gln Leu Gly Pro Pro Met Ser
420 425
<210> 67
<211> 370
<212> PRT
<213> Macaca mulatta
<400> 67
Met Val Glu Pro Met Asp Pro Arg Thr Phe Val Ser Asn Phe Asn Asn
1 5 10 15
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Lys Thr Lys Asp Pro Ser Gly Pro Pro Leu Asp Ala Lys Ile Phe Gln
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Gly Lys Val Tyr Ser Lys Ala Lys Tyr His Pro Glu Met Arg Phe Leu
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65 70 75 80
Val Thr Trp Tyr Val Ser Trp Ser Pro Cys Thr Arg Cys Ala Asn Ser
85 90 95
Val Ala Thr Phe Leu Ala Lys Asp Pro Lys Val Thr Leu Thr Ile Phe
100 105 110
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Arg Ile Leu Cys Gln Lys Arg Gly Gly Pro His Ala Thr Met Lys Ile
130 135 140
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Arg Gly Lys Pro Phe Lys Pro Arg Asn Asn Leu Pro Lys His Tyr Thr
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260 265 270
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275 280 285
Lys Phe Ile Ser Asn Asn Glu His Val Ser Leu Cys Ile Phe Ala Ala
290 295 300
Arg Ile Tyr Asp Asp Gln Gly Arg Tyr Gln Glu Gly Leu Arg Ala Leu
305 310 315 320
His Arg Asp Gly Ala Lys Ile Ala Met Met Asn Tyr Ser Glu Phe Glu
325 330 335
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340 345 350
Trp Asp Gly Leu Asp Glu His Ser Gln Ala Leu Ser Gly Arg Leu Arg
355 360 365
Ala Ile
370
<210> 68
<211> 384
<212> PRT
<213> Pan troglodytes
<400> 68
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1 5 10 15
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20 25 30
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
Leu Arg His Ser Met Asp Pro Pro Thr Phe Thr Ser Asn Phe Asn Asn
195 200 205
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210 215 220
Glu Arg Leu His Asn Asp Thr Trp Val Leu Leu Asn Gln Arg Arg Gly
225 230 235 240
Phe Leu Cys Asn Gln Ala Pro His Lys His Gly Phe Leu Glu Gly Arg
245 250 255
His Ala Glu Leu Cys Phe Leu Asp Val Ile Pro Phe Trp Lys Leu Asp
260 265 270
Leu His Gln Asp Tyr Arg Val Thr Cys Phe Thr Ser Trp Ser Pro Cys
275 280 285
Phe Ser Cys Ala Gln Glu Met Ala Lys Phe Ile Ser Asn Asn Lys His
290 295 300
Val Ser Leu Cys Ile Phe Ala Ala Arg Ile Tyr Asp Asp Gln Gly Arg
305 310 315 320
Cys Gln Glu Gly Leu Arg Thr Leu Ala Lys Ala Gly Ala Lys Ile Ser
325 330 335
Ile Met Thr Tyr Ser Glu Phe Lys His Cys Trp Asp Thr Phe Val Asp
340 345 350
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355 360 365
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<210> 69
<211> 377
<212> PRT
<213> Chlorocebus sabaeus
<400> 69
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 70
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195 200 205
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225 230 235 240
Phe Leu Cys Asn Gln Ala Pro His Lys His Gly Phe Leu Glu Gly Arg
245 250 255
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275 280 285
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290 295 300
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305 310 315 320
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325 330 335
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 71
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180 185 190
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Val Lys His His Ser Pro Val Ser Trp Lys Arg Gly Val Phe Arg Asn
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Arg Leu Tyr Tyr Phe Trp Asp Thr Asp Tyr Gln Glu Gly Leu Arg Ser
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Leu Ser Gln Glu Gly Ala Ser Val Glu Ile Met Gly Tyr Lys Asp Phe
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Lys Tyr Cys Trp Glu Asn Phe Val Tyr Asn Asp Asp Glu Pro Phe Lys
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370
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 72
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195 200 205
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210 215 220
Asn Gly Thr Trp Val Leu Met Asp Gln His Met Gly Phe Leu Cys Asn
225 230 235 240
Glu Ala Lys Asn Leu Leu Cys Gly Phe Tyr Gly Arg His Ala Glu Leu
245 250 255
Arg Phe Leu Asp Leu Val Pro Ser Leu Gln Leu Asp Pro Ala Gln Ile
260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
Leu Arg Ile Phe Ala Ala Arg Ile Tyr Asp Tyr Asp Pro Leu Tyr Lys
305 310 315 320
Glu Ala Leu Gln Met Leu Arg Asp Ala Gly Ala Gln Val Ser Ile Met
325 330 335
Thr Tyr Asp Glu Phe Glu Tyr Cys Trp Asp Thr Phe Val Tyr Arg Gln
340 345 350
Gly Cys Pro Phe Gln Pro Trp Asp Gly Leu Glu Glu His Ser Gln Ala
355 360 365
Leu Ser Gly Arg Leu Arg Ala Ile Leu Gln Asn Gln Gly Asn
370 375 380
<210> 73
<211> 190
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 73
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Asn Phe Arg Leu Leu Lys Arg Arg Leu Arg Glu Ser Leu Gln
180 185 190
<210> 74
<211> 199
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 74
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65 70 75 80
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195
<210> 75
<211> 200
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 75
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1 5 10 15
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180 185 190
Asp Ile Leu Cys Asp Ala Glu Val
195 200
<210> 76
<211> 386
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 76
Met Asn Pro Gln Ile Arg Asn Pro Met Glu Arg Met Tyr Arg Asp Thr
1 5 10 15
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195 200 205
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Gly Arg Asn Glu Ser Trp Leu Cys Phe Thr Met Glu Val Thr Lys His
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His Ser Ala Val Phe Arg Lys Arg Gly Val Phe Arg Asn Gln Val Asp
245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
Ser Trp Ser Pro Cys Pro Glu Cys Ala Gly Glu Val Ala Glu Phe Leu
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Ala Arg His Ser Asn Val Asn Leu Thr Ile Phe Thr Ala Arg Leu Cys
305 310 315 320
Tyr Phe Trp Asp Thr Asp Tyr Gln Glu Gly Leu Cys Ser Leu Ser Gln
325 330 335
Glu Gly Ala Ser Val Lys Ile Met Gly Tyr Lys Asp Phe Val Ser Cys
340 345 350
Trp Lys Asn Phe Val Tyr Ser Asp Asp Glu Pro Phe Lys Pro Trp Lys
355 360 365
Gly Leu Gln Thr Asn Phe Arg Leu Leu Lys Arg Arg Leu Arg Glu Ile
370 375 380
Leu Gln
385
<210> 77
<211> 236
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 77
Met Thr Ser Glu Lys Gly Pro Ser Thr Gly Asp Pro Thr Leu Arg Arg
1 5 10 15
Arg Ile Glu Pro Trp Glu Phe Asp Val Phe Tyr Asp Pro Arg Glu Leu
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Arg Lys Glu Ala Cys Leu Leu Tyr Glu Ile Lys Trp Gly Met Ser Arg
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Lys Ile Trp Arg Ser Ser Gly Lys Asn Thr Thr Asn His Val Glu Val
50 55 60
Asn Phe Ile Lys Lys Phe Thr Ser Glu Arg Asp Phe His Pro Ser Met
65 70 75 80
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Ser Gln Ala Ile Arg Glu Phe Leu Ser Arg His Pro Gly Val Thr Leu
100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
His Leu Gln Asn Cys His Tyr Gln Thr Ile Pro Pro His Ile Leu Leu
210 215 220
Ala Thr Gly Leu Ile His Pro Ser Val Ala Trp Arg
225 230 235
<210> 78
<211> 229
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 78
Met Ser Ser Glu Thr Gly Pro Val Ala Val Asp Pro Thr Leu Arg Arg
1 5 10 15
Arg Ile Glu Pro His Glu Phe Glu Val Phe Phe Asp Pro Arg Glu Leu
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65 70 75 80
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Gln Gly Leu Arg Asp Leu Ile Ser Ser Gly Val Thr Ile Gln Ile Met
130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
Leu Tyr Val Leu Glu Leu Tyr Cys Ile Ile Leu Gly Leu Pro Pro Cys
180 185 190
Leu Lys Ile Leu Arg Arg Lys Gln Pro Gln Leu Thr Phe Phe Thr Ile
195 200 205
Thr Leu Gln Thr Cys His Tyr Gln Arg Ile Pro Pro His Leu Leu Trp
210 215 220
Ala Thr Gly Leu Lys
225
<210> 79
<211> 229
<212> PRT
<213> Rattus norvegicus
<400> 79
Met Ser Ser Glu Thr Gly Pro Val Ala Val Asp Pro Thr Leu Arg Arg
1 5 10 15
Arg Ile Glu Pro His Glu Phe Glu Val Phe Phe Asp Pro Arg Glu Leu
20 25 30
Arg Lys Glu Thr Cys Leu Leu Tyr Glu Ile Asn Trp Gly Gly Arg His
35 40 45
Ser Ile Trp Arg His Thr Ser Gln Asn Thr Asn Lys His Val Glu Val
50 55 60
Asn Phe Ile Glu Lys Phe Thr Thr Glu Arg Tyr Phe Cys Pro Asn Thr
65 70 75 80
Arg Cys Ser Ile Thr Trp Phe Leu Ser Trp Ser Pro Cys Gly Glu Cys
85 90 95
Ser Arg Ala Ile Thr Glu Phe Leu Ser Arg Tyr Pro His Val Thr Leu
100 105 110
Phe Ile Tyr Ile Ala Arg Leu Tyr His His Ala Asp Pro Arg Asn Arg
115 120 125
Gln Gly Leu Arg Asp Leu Ile Ser Ser Gly Val Thr Ile Gln Ile Met
130 135 140
Thr Glu Gln Glu Ser Gly Tyr Cys Trp Arg Asn Phe Val Asn Tyr Ser
145 150 155 160
Pro Ser Asn Glu Ala His Trp Pro Arg Tyr Pro His Leu Trp Val Arg
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Leu Tyr Val Leu Glu Leu Tyr Cys Ile Ile Leu Gly Leu Pro Pro Cys
180 185 190
Leu Asn Ile Leu Arg Arg Lys Gln Pro Gln Leu Thr Phe Phe Thr Ile
195 200 205
Ala Leu Gln Ser Cys His Tyr Gln Arg Leu Pro Pro His Ile Leu Trp
210 215 220
Ala Thr Gly Leu Lys
225
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 80
Met Glu Ala Lys Ala Ala Pro Lys Pro Ala Ala Ser Gly Ala Cys Ser
1 5 10 15
Val Ser Ala Glu Glu Thr Glu Lys Trp Met Glu Glu Ala Met His Met
20 25 30
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35 40 45
Val Tyr Asn Asn Glu Val Val Gly Lys Gly Arg Asn Glu Val Asn Gln
50 55 60
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65 70 75 80
Leu Asp Trp Cys Arg Gln Ser Gly Lys Ser Pro Ser Glu Val Phe Glu
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100 105 110
Ala Leu Arg Leu Met Lys Ile Pro Leu Val Val Tyr Gly Cys Gln Asn
115 120 125
Glu Arg Phe Gly Gly Cys Gly Ser Val Leu Asn Ile Ala Ser Ala Asp
130 135 140
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<213> Mus musculus
<400> 81
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1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Leu Asp Trp Cys His Gln His Gly Gln Ser Pro Ser Thr Val Phe Glu
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
Leu Pro Asn Thr Gly Arg Pro Phe Gln Cys Ile Pro Gly Tyr Arg Ala
145 150 155 160
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165 170 175
Asn Ala Pro Lys Ser Lys Val Arg Lys Lys Asp Cys Gln Lys Ser
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<212> PRT
<213> Mus musculus
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1 5 10 15
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130 135 140
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195 200 205
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Val Ser Ser Ser Asp Leu Thr Lys Glu Glu Pro Asp Ala Ala Asn Gly
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Ile Ala Ser Gly Ser Phe Arg Val Val Asp Val Tyr Arg Thr Gly Ala
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<213> Homo sapiens
<400> 83
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Ala Thr Val Thr Arg Ile Ala Pro Gly Ser Ala Lys Val Ile Asp Val
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Tyr Arg Thr Gly Ala Lys Cys Val Pro Gly Glu Ala Gly Asp Ser Gly
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<220>
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Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser Asp
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Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser Asp Ala Leu Asp
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<211> 85
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polypeptide
<400> 85
Ala Pro Pro Thr Asp Val Ser Leu Gly Asp Glu Leu His Leu Asp Gly
1 5 10 15
Glu Asp Val Ala Met Ala His Ala Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu
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Asp Met Leu Gly Asp Gly Asp Ser Pro Gly Pro Gly Phe Thr Pro His
35 40 45
Asp Ser Ala Pro Tyr Gly Ala Leu Asp Met Ala Asp Phe Glu Phe Glu
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polypeptide
<400> 86
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Leu Ala Gln Pro Pro Ala Pro Ala Pro Val Leu Thr Pro Gly Pro Pro
35 40 45
Gln Ser Leu Ser Ala Pro Val Pro Lys Ser Thr Gln Ala Gly Glu Gly
50 55 60
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polypeptide
<400> 87
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Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe
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Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu
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195 200 205
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Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe
245 250 255
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Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp
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Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys
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340 345 350
Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser
355 360 365
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Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg
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Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe
420 425 430
Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile
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450 455 460
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1340 1345 1350
Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp
1355 1360 1365
Gly Ser Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Ser Ser Asp Tyr Lys Asp
1370 1375 1380
His Asp Gly Asp Tyr Lys Asp His Asp Ile Asp Tyr Lys Asp Asp
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Asp Asp Lys Ala Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Arg Ala Asp Ala
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Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser Asp Ala Leu Asp
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Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe
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Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu
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<210> 88
<211> 94
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 88
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<210> 89
<211> 74
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 89
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1 5 10 15
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 90
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Asn Lys Lys Thr His
65
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polypeptide
<400> 93
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1 5 10 15
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20 25 30
Gly Ser Gly Met Asn Ile Gln Met Leu Leu Glu Ala Ala Asp Tyr Leu
35 40 45
Glu Arg Arg Glu Arg Glu Ala Glu His Gly Tyr Ala Ser Met Leu Pro
50 55 60
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Glu Arg Arg Glu Arg Glu Ala Glu His Gly Tyr Ala Ser Met Leu Pro
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Ser Arg
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1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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<213> Homo sapiens
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Leu Thr Ala Ala Glu Gln Leu Ile Glu Gly Lys Thr Arg Ile Ala Val
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
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65 70 75 80
Glu Glu Asp Leu Leu Val Val His Thr Arg Arg Tyr Leu Asn Glu Leu
85 90 95
Lys Trp Ser Phe Ala Val Ala Thr Ile Thr Glu Ile Pro Pro Val Ile
100 105 110
Phe Leu Pro Asn Phe Leu Val Gln Arg Lys Val Leu Arg Pro Leu Arg
115 120 125
Thr Gln Thr Gly Gly Thr Ile Met Ala Gly Lys Leu Ala Val Glu Arg
130 135 140
Gly Trp Ala Ile Asn Val Gly Gly Gly Phe His His Cys Ser Ser Asp
145 150 155 160
Arg Gly Gly Gly Phe Cys Ala Tyr Ala Asp Ile Thr Leu Ala Ile Lys
165 170 175
Phe Leu Phe Glu Arg Val Glu Gly Ile Ser Arg Ala Thr Ile Ile Asp
180 185 190
Leu Asp Ala His Gln Gly Asn Gly His Glu Arg Asp Phe Met Asp Asp
195 200 205
Lys Arg Val Tyr Ile Met Asp Val Tyr Asn Arg His Ile Tyr Pro Gly
210 215 220
Asp Arg Phe Ala Lys Gln Ala Ile Arg Arg Lys Val Glu Leu Glu Trp
225 230 235 240
Gly Thr Glu Asp Asp Glu Tyr Leu Asp Lys Val Glu Arg Asn Ile Lys
245 250 255
Lys Ser Leu Gln Glu His Leu Pro Asp Val Val Val Tyr Asn Ala Gly
260 265 270
Thr Asp Ile Leu Glu Gly Asp Arg Leu Gly Gly Leu Ser Ile Ser Pro
275 280 285
Ala Gly Ile Val Lys Arg Asp Glu Leu Val Phe Arg Met Val Arg Gly
290 295 300
Arg Arg Val Pro Ile Leu Met Val Thr Ser Gly Gly Tyr Gln Lys Arg
305 310 315 320
Thr Ala Arg Ile Ile Ala Asp Ser Ile Leu Asn Leu Phe Gly Leu Gly
325 330 335
Leu Ile Gly Pro Glu Ser Pro Ser Val Ser Ala Gln Asn Ser Asp Thr
340 345 350
Pro Leu Leu Pro Pro Ala Val Pro Glu Phe
355 360
<210> 101
<211> 226
<212> PRT
<213> A. thaliana
<400> 101
Ala Ser Ser Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Glu Ala Ser Met Glu Phe
1 5 10 15
Trp Gly Ile Glu Val Lys Ser Gly Lys Pro Val Thr Val Thr Pro Glu
20 25 30
Glu Gly Ile Leu Ile His Val Ser Gln Ala Ser Leu Gly Glu Cys Lys
35 40 45
Asn Lys Lys Gly Glu Phe Val Pro Leu His Val Lys Val Gly Asn Gln
50 55 60
Asn Leu Val Leu Gly Thr Leu Ser Thr Glu Asn Ile Pro Gln Leu Phe
65 70 75 80
Cys Asp Leu Val Phe Asp Lys Glu Phe Glu Leu Ser His Thr Trp Gly
85 90 95
Lys Gly Ser Val Tyr Phe Val Gly Tyr Lys Thr Pro Asn Ile Glu Pro
100 105 110
Gln Gly Tyr Ser Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Val Pro Ala
115 120 125
Gly Asn Ala Ala Lys Ala Val Ala Lys Pro Lys Ala Lys Pro Ala Glu
130 135 140
Val Lys Pro Ala Val Asp Asp Glu Glu Asp Glu Ser Asp Ser Asp Gly
145 150 155 160
Met Asp Glu Asp Asp Ser Asp Gly Glu Asp Ser Glu Glu Glu Glu Pro
165 170 175
Thr Pro Lys Lys Pro Ala Ser Ser Lys Lys Arg Ala Asn Glu Thr Thr
180 185 190
Pro Lys Ala Pro Val Ser Ala Lys Lys Ala Lys Val Ala Val Thr Pro
195 200 205
Gln Lys Thr Asp Glu Lys Lys Lys Gly Gly Lys Ala Ala Asn Gln Ser
210 215 220
Glu Phe
225
<210> 102
<211> 272
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 102
Ala Ser Ser Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Glu Ala Ser Met Val Gly
1 5 10 15
Ala Gly Ile Ser Thr Pro Ser Gly Ile Pro Asp Phe Arg Ser Pro Gly
20 25 30
Ser Gly Leu Tyr Ser Asn Leu Gln Gln Tyr Asp Leu Pro Tyr Pro Glu
35 40 45
Ala Ile Phe Glu Leu Pro Phe Phe Phe His Asn Pro Lys Pro Phe Phe
50 55 60
Thr Leu Ala Lys Glu Leu Tyr Pro Gly Asn Tyr Lys Pro Asn Val Thr
65 70 75 80
His Tyr Phe Leu Arg Leu Leu His Asp Lys Gly Leu Leu Leu Arg Leu
85 90 95
Tyr Thr Gln Asn Ile Asp Gly Leu Glu Arg Val Ser Gly Ile Pro Ala
100 105 110
Ser Lys Leu Val Glu Ala His Gly Thr Phe Ala Ser Ala Thr Cys Thr
115 120 125
Val Cys Gln Arg Pro Phe Pro Gly Glu Asp Ile Arg Ala Asp Val Met
130 135 140
Ala Asp Arg Val Pro Arg Cys Pro Val Cys Thr Gly Val Val Lys Pro
145 150 155 160
Asp Ile Val Phe Phe Gly Glu Pro Leu Pro Gln Arg Phe Leu Leu His
165 170 175
Val Val Asp Phe Pro Met Ala Asp Leu Leu Leu Ile Leu Gly Thr Ser
180 185 190
Leu Glu Val Glu Pro Phe Ala Ser Leu Thr Glu Ala Val Arg Ser Ser
195 200 205
Val Pro Arg Leu Leu Ile Asn Arg Asp Leu Val Gly Pro Leu Ala Trp
210 215 220
His Pro Arg Ser Arg Asp Val Ala Gln Leu Gly Asp Val Val His Gly
225 230 235 240
Val Glu Ser Leu Val Glu Leu Leu Gly Trp Thr Glu Glu Met Arg Asp
245 250 255
Leu Val Gln Arg Glu Thr Gly Lys Leu Asp Gly Pro Asp Lys Glu Phe
260 265 270
<210> 103
<211> 306
<212> PRT
<213> S. cerevisiae
<400> 103
Ala Ser Ser Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Glu Ala Ser Thr Glu Met
1 5 10 15
Ser Val Arg Lys Ile Ala Ala His Met Lys Ser Asn Pro Asn Ala Lys
20 25 30
Val Ile Phe Met Val Gly Ala Gly Ile Ser Thr Ser Cys Gly Ile Pro
35 40 45
Asp Phe Arg Ser Pro Gly Thr Gly Leu Tyr His Asn Leu Ala Arg Leu
50 55 60
Lys Leu Pro Tyr Pro Glu Ala Val Phe Asp Val Asp Phe Phe Gln Ser
65 70 75 80
Asp Pro Leu Pro Phe Tyr Thr Leu Ala Lys Glu Leu Tyr Pro Gly Asn
85 90 95
Phe Arg Pro Ser Lys Phe His Tyr Leu Leu Lys Leu Phe Gln Asp Lys
100 105 110
Asp Val Leu Lys Arg Val Tyr Thr Gln Asn Ile Asp Thr Leu Glu Arg
115 120 125
Gln Ala Gly Val Lys Asp Asp Leu Ile Ile Glu Ala His Gly Ser Phe
130 135 140
Ala His Cys His Cys Ile Gly Cys Gly Lys Val Tyr Pro Pro Gln Val
145 150 155 160
Phe Lys Ser Lys Leu Ala Glu His Pro Ile Lys Asp Phe Val Lys Cys
165 170 175
Asp Val Cys Gly Glu Leu Val Lys Pro Ala Ile Val Phe Phe Gly Glu
180 185 190
Asp Leu Pro Asp Ser Phe Ser Glu Thr Trp Leu Asn Asp Ser Glu Trp
195 200 205
Leu Arg Glu Lys Ile Thr Thr Ser Gly Lys His Pro Gln Gln Pro Leu
210 215 220
Val Ile Val Val Gly Thr Ser Leu Ala Val Tyr Pro Phe Ala Ser Leu
225 230 235 240
Pro Glu Glu Ile Pro Arg Lys Val Lys Arg Val Leu Cys Asn Leu Glu
245 250 255
Thr Val Gly Asp Phe Lys Ala Asn Lys Arg Pro Thr Asp Leu Ile Val
260 265 270
His Gln Tyr Ser Asp Glu Phe Ala Glu Gln Leu Val Glu Glu Leu Gly
275 280 285
Trp Gln Glu Asp Phe Glu Lys Ile Leu Thr Ala Gln Gly Gly Met Gly
290 295 300
Glu Phe
305
<210> 104
<211> 257
<212> PRT
<213> E. coli
<400> 104
Ala Ser Ser Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Glu Ala Ser Met Glu Lys
1 5 10 15
Pro Arg Val Leu Val Leu Thr Gly Ala Gly Ile Ser Ala Glu Ser Gly
20 25 30
Ile Arg Thr Phe Arg Ala Ala Asp Gly Leu Trp Glu Glu His Arg Val
35 40 45
Glu Asp Val Ala Thr Pro Glu Gly Phe Asp Arg Asp Pro Glu Leu Val
50 55 60
Gln Ala Phe Tyr Asn Ala Arg Arg Arg Gln Leu Gln Gln Pro Glu Ile
65 70 75 80
Gln Pro Asn Ala Ala His Leu Ala Leu Ala Lys Leu Gln Asp Ala Leu
85 90 95
Gly Asp Arg Phe Leu Leu Val Thr Gln Asn Ile Asp Asn Leu His Glu
100 105 110
Arg Ala Gly Asn Thr Asn Val Ile His Met His Gly Glu Leu Leu Lys
115 120 125
Val Arg Cys Ser Gln Ser Gly Gln Val Leu Asp Trp Thr Gly Asp Val
130 135 140
Thr Pro Glu Asp Lys Cys His Cys Cys Gln Phe Pro Ala Pro Leu Arg
145 150 155 160
Pro His Val Val Trp Phe Gly Glu Met Pro Leu Gly Met Asp Glu Ile
165 170 175
Tyr Met Ala Leu Ser Met Ala Asp Ile Phe Ile Ala Ile Gly Thr Ser
180 185 190
Gly His Val Tyr Pro Ala Ala Gly Phe Val His Glu Ala Lys Leu His
195 200 205
Gly Ala His Thr Val Glu Leu Asn Leu Glu Pro Ser Gln Val Gly Asn
210 215 220
Glu Phe Ala Glu Lys Tyr Tyr Gly Pro Ala Ser Gln Val Val Pro Glu
225 230 235 240
Phe Val Glu Lys Leu Leu Lys Gly Leu Lys Ala Gly Ser Ile Ala Glu
245 250 255
Phe
<210> 105
<211> 346
<212> PRT
<213> C. albicans
<400> 105
Ala Ser Ser Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Glu Ala Ser Met Pro Ser
1 5 10 15
Leu Asp Asp Ile Leu Lys Pro Val Ala Glu Ala Val Lys Asn Gly Lys
20 25 30
Lys Val Thr Phe Phe Asn Gly Ala Gly Ile Ser Thr Gly Ala Gly Ile
35 40 45
Pro Asp Phe Arg Ser Pro Asp Thr Gly Leu Tyr Ala Asn Leu Ala Lys
50 55 60
Leu Asn Leu Pro Phe Ala Glu Ala Val Phe Asp Ile Asp Phe Phe Lys
65 70 75 80
Glu Asp Pro Lys Pro Phe Tyr Thr Leu Ala Glu Glu Leu Tyr Pro Gly
85 90 95
Asn Phe Ala Pro Thr Lys Phe His His Phe Ile Lys Leu Leu Gln Asp
100 105 110
Gln Gly Ser Leu Lys Arg Val Tyr Thr Gln Asn Ile Asp Thr Leu Glu
115 120 125
Arg Leu Ala Gly Val Glu Asp Lys Tyr Ile Val Glu Ala His Gly Ser
130 135 140
Phe Ala Ser Asn His Cys Val Asp Cys His Lys Glu Met Thr Thr Glu
145 150 155 160
Thr Leu Lys Thr Tyr Met Lys Asp Lys Lys Ile Pro Ser Cys Gln His
165 170 175
Cys Glu Gly Tyr Val Lys Pro Asp Ile Val Phe Phe Gly Glu Gly Leu
180 185 190
Pro Val Lys Phe Phe Asp Leu Trp Glu Asp Asp Cys Glu Asp Val Glu
195 200 205
Val Ala Ile Val Ala Gly Thr Ser Leu Thr Val Phe Pro Phe Ala Ser
210 215 220
Leu Pro Gly Glu Val Asn Lys Lys Cys Leu Arg Val Leu Val Asn Lys
225 230 235 240
Glu Lys Val Gly Thr Phe Lys His Glu Pro Arg Lys Ser Asp Ile Ile
245 250 255
Ala Leu His Asp Cys Asp Ile Val Ala Glu Arg Leu Cys Thr Leu Leu
260 265 270
Gly Leu Asp Asp Lys Leu Asn Glu Val Tyr Glu Lys Glu Lys Ile Lys
275 280 285
Tyr Ser Lys Ala Glu Thr Lys Glu Ile Lys Met His Glu Ile Glu Asp
290 295 300
Lys Leu Lys Glu Glu Ala His Leu Lys Glu Asp Lys His Thr Thr Lys
305 310 315 320
Val Asp Lys Lys Glu Lys Gln Asn Asp Ala Asn Asp Lys Glu Leu Glu
325 330 335
Gln Leu Ile Asp Lys Ala Lys Ala Glu Phe
340 345
<210> 106
<211> 289
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 106
Ala Ser Ser Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Glu Ala Ser Ser Ser Ser
1 5 10 15
Met Ala Asp Phe Arg Lys Phe Phe Ala Lys Ala Lys His Ile Val Ile
20 25 30
Ile Ser Gly Ala Gly Val Ser Ala Glu Ser Gly Val Pro Thr Phe Arg
35 40 45
Gly Ala Gly Gly Tyr Trp Arg Lys Trp Gln Ala Gln Asp Leu Ala Thr
50 55 60
Pro Leu Ala Phe Ala His Asn Pro Ser Arg Val Trp Glu Phe Tyr His
65 70 75 80
Tyr Arg Arg Glu Val Met Gly Ser Lys Glu Pro Asn Ala Gly His Arg
85 90 95
Ala Ile Ala Glu Cys Glu Thr Arg Leu Gly Lys Gln Gly Arg Arg Val
100 105 110
Val Val Ile Thr Gln Asn Ile Asp Glu Leu His Arg Lys Ala Gly Thr
115 120 125
Lys Asn Leu Leu Glu Ile His Gly Ser Leu Phe Lys Thr Arg Cys Thr
130 135 140
Ser Cys Gly Val Val Ala Glu Asn Tyr Lys Ser Pro Ile Cys Pro Ala
145 150 155 160
Leu Ser Gly Lys Gly Ala Pro Glu Pro Gly Thr Gln Asp Ala Ser Ile
165 170 175
Pro Val Glu Lys Leu Pro Arg Cys Glu Glu Ala Gly Cys Gly Gly Leu
180 185 190
Leu Arg Pro His Val Val Trp Phe Gly Glu Asn Leu Asp Pro Ala Ile
195 200 205
Leu Glu Glu Val Asp Arg Glu Leu Ala His Cys Asp Leu Cys Leu Val
210 215 220
Val Gly Thr Ser Ser Val Val Tyr Pro Ala Ala Met Phe Ala Pro Gln
225 230 235 240
Val Ala Ala Arg Gly Val Pro Val Ala Glu Phe Asn Thr Glu Thr Thr
245 250 255
Pro Ala Thr Asn Arg Phe Arg Phe His Phe Gln Gly Pro Cys Gly Thr
260 265 270
Thr Leu Pro Glu Ala Leu Ala Cys His Glu Asn Glu Thr Val Ser Glu
275 280 285
Phe
<210> 107
<211> 288
<212> PRT
<213> P. falciparum
<400> 107
Ala Ser Ser Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Glu Ala Ser Met Gly Asn
1 5 10 15
Leu Met Ile Ser Phe Leu Lys Lys Asp Thr Gln Ser Ile Thr Leu Glu
20 25 30
Glu Leu Ala Lys Ile Ile Lys Lys Cys Lys His Val Val Ala Leu Thr
35 40 45
Gly Ser Gly Thr Ser Ala Glu Ser Asn Ile Pro Ser Phe Arg Gly Ser
50 55 60
Ser Asn Ser Ile Trp Ser Lys Tyr Asp Pro Arg Ile Tyr Gly Thr Ile
65 70 75 80
Trp Gly Phe Trp Lys Tyr Pro Glu Lys Ile Trp Glu Val Ile Arg Asp
85 90 95
Ile Ser Ser Asp Tyr Glu Ile Glu Ile Asn Asn Gly His Val Ala Leu
100 105 110
Ser Thr Leu Glu Ser Leu Gly Tyr Leu Lys Ser Val Val Thr Gln Asn
115 120 125
Val Asp Gly Leu His Glu Ala Ser Gly Asn Thr Lys Val Ile Ser Leu
130 135 140
His Gly Asn Val Phe Glu Ala Val Cys Cys Thr Cys Asn Lys Ile Val
145 150 155 160
Lys Leu Asn Lys Ile Met Leu Gln Lys Thr Ser His Phe Met His Gln
165 170 175
Leu Pro Pro Glu Cys Pro Cys Gly Gly Ile Phe Lys Pro Asn Ile Ile
180 185 190
Leu Phe Gly Glu Val Val Ser Ser Asp Leu Leu Lys Glu Ala Glu Glu
195 200 205
Glu Ile Ala Lys Cys Asp Leu Leu Leu Val Ile Gly Thr Ser Ser Thr
210 215 220
Val Ser Thr Ala Thr Asn Leu Cys His Phe Ala Cys Lys Lys Lys Lys
225 230 235 240
Lys Ile Val Glu Ile Asn Ile Ser Lys Thr Tyr Ile Thr Asn Lys Met
245 250 255
Ser Asp Tyr His Val Cys Ala Lys Phe Ser Glu Leu Thr Lys Val Ala
260 265 270
Asn Ile Leu Lys Gly Ser Ser Glu Lys Asn Lys Lys Ile Met Glu Phe
275 280 285
<210> 108
<211> 304
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 108
Ala Ser Ser Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Glu Ala Ser Met Ser Val
1 5 10 15
Asn Tyr Ala Ala Gly Leu Ser Pro Tyr Ala Asp Lys Gly Lys Cys Gly
20 25 30
Leu Pro Glu Ile Phe Asp Pro Pro Glu Glu Leu Glu Arg Lys Val Trp
35 40 45
Glu Leu Ala Arg Leu Val Trp Gln Ser Ser Ser Val Val Phe His Thr
50 55 60
Gly Ala Gly Ile Ser Thr Ala Ser Gly Ile Pro Asp Phe Arg Gly Pro
65 70 75 80
His Gly Val Trp Thr Met Glu Glu Arg Gly Leu Ala Pro Lys Phe Asp
85 90 95
Thr Thr Phe Glu Ser Ala Arg Pro Thr Gln Thr His Met Ala Leu Val
100 105 110
Gln Leu Glu Arg Val Gly Leu Leu Arg Phe Leu Val Ser Gln Asn Val
115 120 125
Asp Gly Leu His Val Arg Ser Gly Phe Pro Arg Asp Lys Leu Ala Glu
130 135 140
Leu His Gly Asn Met Phe Val Glu Glu Cys Ala Lys Cys Lys Thr Gln
145 150 155 160
Tyr Val Arg Asp Thr Val Val Gly Thr Met Gly Leu Lys Ala Thr Gly
165 170 175
Arg Leu Cys Thr Val Ala Lys Ala Arg Gly Leu Arg Ala Cys Arg Gly
180 185 190
Glu Leu Arg Asp Thr Ile Leu Asp Trp Glu Asp Ser Leu Pro Asp Arg
195 200 205
Asp Leu Ala Leu Ala Asp Glu Ala Ser Arg Asn Ala Asp Leu Ser Ile
210 215 220
Thr Leu Gly Thr Ser Leu Gln Ile Arg Pro Ser Gly Asn Leu Pro Leu
225 230 235 240
Ala Thr Lys Arg Arg Gly Gly Arg Leu Val Ile Val Asn Leu Gln Pro
245 250 255
Thr Lys His Asp Arg His Ala Asp Leu Arg Ile His Gly Tyr Val Asp
260 265 270
Glu Val Met Thr Arg Leu Met Lys His Leu Gly Leu Glu Ile Pro Ala
275 280 285
Trp Asp Gly Pro Arg Val Leu Glu Arg Ala Leu Pro Pro Leu Glu Phe
290 295 300
<210> 109
<211> 234
<212> PRT
<213> C. trachomatis
<400> 109
Ala Ser Ser Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Glu Ala Ser Met Thr Thr
1 5 10 15
Asn Ser Thr Gln Asp Thr Leu Tyr Leu Ser Leu His Gly Gly Ile Asp
20 25 30
Ser Ala Ile Pro Tyr Pro Val Arg Arg Val Glu Gln Leu Leu Gln Phe
35 40 45
Ser Phe Leu Pro Glu Leu Gln Phe Gln Asn Ala Ala Val Lys Gln Arg
50 55 60
Ile Gln Arg Leu Cys Tyr Arg Glu Glu Lys Arg Leu Ala Val Ser Ser
65 70 75 80
Leu Ala Lys Trp Leu Gly Gln Leu His Lys Gln Arg Leu Arg Ala Pro
85 90 95
Lys Asn Pro Pro Val Ala Ile Cys Trp Ile Asn Ser Tyr Val Gly Tyr
100 105 110
Gly Val Phe Ala Arg Glu Ser Ile Pro Ala Trp Ser Tyr Ile Gly Glu
115 120 125
Tyr Thr Gly Ile Leu Arg Arg Arg Gln Ala Leu Trp Leu Asp Glu Asn
130 135 140
Asp Tyr Cys Phe Arg Tyr Pro Val Pro Arg Tyr Ser Phe Arg Tyr Phe
145 150 155 160
Thr Ile Asp Ser Gly Met Gln Gly Asn Val Thr Arg Phe Ile Asn His
165 170 175
Ser Asp Asn Pro Asn Leu Glu Ala Ile Gly Ala Phe Glu Asn Gly Ile
180 185 190
Phe His Ile Ile Ile Arg Ala Ile Lys Asp Ile Leu Pro Gly Glu Glu
195 200 205
Leu Cys Tyr His Tyr Gly Pro Leu Tyr Trp Lys His Arg Lys Lys Arg
210 215 220
Glu Glu Phe Val Pro Gln Glu Glu Glu Phe
225 230
<210> 110
<211> 134
<212> PRT
<213> P. bursaria chlorella virus
<400> 110
Ala Ser Ser Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Glu Ala Ser Met Phe Asn
1 5 10 15
Asp Arg Val Ile Val Lys Lys Ser Pro Leu Gly Gly Tyr Gly Val Phe
20 25 30
Ala Arg Lys Ser Phe Glu Lys Gly Glu Leu Val Glu Glu Cys Leu Cys
35 40 45
Ile Val Arg His Asn Asp Asp Trp Gly Thr Ala Leu Glu Asp Tyr Leu
50 55 60
Phe Ser Arg Lys Asn Met Ser Ala Met Ala Leu Gly Phe Gly Ala Ile
65 70 75 80
Phe Asn His Ser Lys Asp Pro Asn Ala Arg His Glu Leu Thr Ala Gly
85 90 95
Leu Lys Arg Met Arg Ile Phe Thr Ile Lys Pro Ile Ala Ile Gly Glu
100 105 110
Glu Ile Thr Ile Ser Tyr Gly Asp Asp Tyr Trp Leu Ser Arg Pro Arg
115 120 125
Leu Thr Gln Asn Glu Phe
130
<210> 111
<211> 349
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 111
Ala Ser Ser Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Glu Ala Ser Asn Leu Lys
1 5 10 15
Cys Val Arg Ile Leu Lys Gln Phe His Lys Asp Leu Glu Arg Glu Leu
20 25 30
Leu Arg Arg His His Arg Ser Lys Thr Pro Arg His Leu Asp Pro Ser
35 40 45
Leu Ala Asn Tyr Leu Val Gln Lys Ala Lys Gln Arg Arg Ala Leu Arg
50 55 60
Arg Trp Glu Gln Glu Leu Asn Ala Lys Arg Ser His Leu Gly Arg Ile
65 70 75 80
Thr Val Glu Asn Glu Val Asp Leu Asp Gly Pro Pro Arg Ala Phe Val
85 90 95
Tyr Ile Asn Glu Tyr Arg Val Gly Glu Gly Ile Thr Leu Asn Gln Val
100 105 110
Ala Val Gly Cys Glu Cys Gln Asp Cys Leu Trp Ala Pro Thr Gly Gly
115 120 125
Cys Cys Pro Gly Ala Ser Leu His Lys Phe Ala Tyr Asn Asp Gln Gly
130 135 140
Gln Val Arg Leu Arg Ala Gly Leu Pro Ile Tyr Glu Cys Asn Ser Arg
145 150 155 160
Cys Arg Cys Gly Tyr Asp Cys Pro Asn Arg Val Val Gln Lys Gly Ile
165 170 175
Arg Tyr Asp Leu Cys Ile Phe Arg Thr Asp Asp Gly Arg Gly Trp Gly
180 185 190
Val Arg Thr Leu Glu Lys Ile Arg Lys Asn Ser Phe Val Met Glu Tyr
195 200 205
Val Gly Glu Ile Ile Thr Ser Glu Glu Ala Glu Arg Arg Gly Gln Ile
210 215 220
Tyr Asp Arg Gln Gly Ala Thr Tyr Leu Phe Asp Leu Asp Tyr Val Glu
225 230 235 240
Asp Val Tyr Thr Val Asp Ala Ala Tyr Tyr Gly Asn Ile Ser His Phe
245 250 255
Val Asn His Ser Cys Asp Pro Asn Leu Gln Val Tyr Asn Val Phe Ile
260 265 270
Asp Asn Leu Asp Glu Arg Leu Pro Arg Ile Ala Phe Phe Ala Thr Arg
275 280 285
Thr Ile Arg Ala Gly Glu Glu Leu Thr Phe Asp Tyr Asn Met Gln Val
290 295 300
Asp Pro Val Asp Met Glu Ser Thr Arg Met Asp Ser Asn Phe Gly Leu
305 310 315 320
Ala Gly Leu Pro Gly Ser Pro Lys Lys Arg Val Arg Ile Glu Cys Lys
325 330 335
Cys Gly Thr Glu Ser Cys Arg Lys Tyr Leu Phe Glu Phe
340 345
<210> 112
<211> 346
<212> PRT
<213> N. crassa
<400> 112
Ala Ser Ser Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Glu Ala Ser Met Glu Lys
1 5 10 15
Ala Phe Arg Pro His Phe Phe Asn His Gly Lys Pro Asp Ala Asn Pro
20 25 30
Lys Glu Lys Lys Asn Cys His Trp Cys Gln Ile Arg Ser Phe Ala Thr
35 40 45
His Ala Gln Leu Pro Ile Ser Ile Val Asn Arg Glu Asp Asp Ala Phe
50 55 60
Leu Asn Pro Asn Phe Arg Phe Ile Asp His Ser Ile Ile Gly Lys Asn
65 70 75 80
Val Pro Val Ala Asp Gln Ser Phe Arg Val Gly Cys Ser Cys Ala Ser
85 90 95
Asp Glu Glu Cys Met Tyr Ser Thr Cys Gln Cys Leu Asp Glu Met Ala
100 105 110
Pro Asp Ser Asp Glu Glu Ala Asp Pro Tyr Thr Arg Lys Lys Arg Phe
115 120 125
Ala Tyr Tyr Ser Gln Gly Ala Lys Lys Gly Leu Leu Arg Asp Arg Val
130 135 140
Leu Gln Ser Gln Glu Pro Ile Tyr Glu Cys His Gln Gly Cys Ala Cys
145 150 155 160
Ser Lys Asp Cys Pro Asn Arg Val Val Glu Arg Gly Arg Thr Val Pro
165 170 175
Leu Gln Ile Phe Arg Thr Lys Asp Arg Gly Trp Gly Val Lys Cys Pro
180 185 190
Val Asn Ile Lys Arg Gly Gln Phe Val Asp Arg Tyr Leu Gly Glu Ile
195 200 205
Ile Thr Ser Glu Glu Ala Asp Arg Arg Arg Ala Glu Ser Thr Ile Ala
210 215 220
Arg Arg Lys Asp Val Tyr Leu Phe Ala Leu Asp Lys Phe Ser Asp Pro
225 230 235 240
Asp Ser Leu Asp Pro Leu Leu Ala Gly Gln Pro Leu Glu Val Asp Gly
245 250 255
Glu Tyr Met Ser Gly Pro Thr Arg Phe Ile Asn His Ser Cys Asp Pro
260 265 270
Asn Met Ala Ile Phe Ala Arg Val Gly Asp His Ala Asp Lys His Ile
275 280 285
His Asp Leu Ala Leu Phe Ala Ile Lys Asp Ile Pro Lys Gly Thr Glu
290 295 300
Leu Thr Phe Asp Tyr Val Asn Gly Leu Thr Gly Leu Glu Ser Asp Ala
305 310 315 320
His Asp Pro Ser Lys Ile Ser Glu Met Thr Lys Cys Leu Cys Gly Thr
325 330 335
Ala Lys Cys Arg Gly Tyr Leu Trp Glu Phe
340 345
<210> 113
<211> 282
<212> PRT
<213> A. thaliana
<400> 113
Ala Ser Ser Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Glu Ala Ser Asp Ile Ser
1 5 10 15
Gly Gly Leu Glu Phe Lys Gly Ile Pro Ala Thr Asn Arg Val Asp Asp
20 25 30
Ser Pro Val Ser Pro Thr Ser Gly Phe Thr Tyr Ile Lys Ser Leu Ile
35 40 45
Ile Glu Pro Asn Val Ile Ile Pro Lys Ser Ser Thr Gly Cys Asn Cys
50 55 60
Arg Gly Ser Cys Thr Asp Ser Lys Lys Cys Ala Cys Ala Lys Leu Asn
65 70 75 80
Gly Gly Asn Phe Pro Tyr Val Asp Leu Asn Asp Gly Arg Leu Ile Glu
85 90 95
Ser Arg Asp Val Val Phe Glu Cys Gly Pro His Cys Gly Cys Gly Pro
100 105 110
Lys Cys Val Asn Arg Thr Ser Gln Lys Arg Leu Arg Phe Asn Leu Glu
115 120 125
Val Phe Arg Ser Ala Lys Lys Gly Trp Ala Val Arg Ser Trp Glu Tyr
130 135 140
Ile Pro Ala Gly Ser Pro Val Cys Glu Tyr Ile Gly Val Val Arg Arg
145 150 155 160
Thr Ala Asp Val Asp Thr Ile Ser Asp Asn Glu Tyr Ile Phe Glu Ile
165 170 175
Asp Cys Gln Gln Thr Met Gln Gly Leu Gly Gly Arg Gln Arg Arg Leu
180 185 190
Arg Asp Val Ala Val Pro Met Asn Asn Gly Val Ser Gln Ser Ser Glu
195 200 205
Asp Glu Asn Ala Pro Glu Phe Cys Ile Asp Ala Gly Ser Thr Gly Asn
210 215 220
Phe Ala Arg Phe Ile Asn His Ser Cys Glu Pro Asn Leu Phe Val Gln
225 230 235 240
Cys Val Leu Ser Ser His Gln Asp Ile Arg Leu Ala Arg Val Val Leu
245 250 255
Phe Ala Ala Asp Asn Ile Ser Pro Met Gln Glu Leu Thr Tyr Asp Tyr
260 265 270
Gly Tyr Ala Leu Asp Ser Val His Glu Phe
275 280
<210> 114
<211> 328
<212> PRT
<213> A. thaliana
<400> 114
Ala Ser Ser Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Glu Ala Ser Gln Ser Ala
1 5 10 15
Tyr Leu His Val Ser Leu Ala Arg Ile Ser Asp Glu Asp Cys Cys Ala
20 25 30
Asn Cys Lys Gly Asn Cys Leu Ser Ala Asp Phe Pro Cys Thr Cys Ala
35 40 45
Arg Glu Thr Ser Gly Glu Tyr Ala Tyr Thr Lys Glu Gly Leu Leu Lys
50 55 60
Glu Lys Phe Leu Asp Thr Cys Leu Lys Met Lys Lys Glu Pro Asp Ser
65 70 75 80
Phe Pro Lys Val Tyr Cys Lys Asp Cys Pro Leu Glu Arg Asp His Asp
85 90 95
Lys Gly Thr Tyr Gly Lys Cys Asp Gly His Leu Ile Arg Lys Phe Ile
100 105 110
Lys Glu Cys Trp Arg Lys Cys Gly Cys Asp Met Gln Cys Gly Asn Arg
115 120 125
Val Val Gln Arg Gly Ile Arg Cys Gln Leu Gln Val Tyr Phe Thr Gln
130 135 140
Glu Gly Lys Gly Trp Gly Leu Arg Thr Leu Gln Asp Leu Pro Lys Gly
145 150 155 160
Thr Phe Ile Cys Glu Tyr Ile Gly Glu Ile Leu Thr Asn Thr Glu Leu
165 170 175
Tyr Asp Arg Asn Val Arg Ser Ser Ser Glu Arg His Thr Tyr Pro Val
180 185 190
Thr Leu Asp Ala Asp Trp Gly Ser Glu Lys Asp Leu Lys Asp Glu Glu
195 200 205
Ala Leu Cys Leu Asp Ala Thr Ile Cys Gly Asn Val Ala Arg Phe Ile
210 215 220
Asn His Arg Cys Glu Asp Ala Asn Met Ile Asp Ile Pro Ile Glu Ile
225 230 235 240
Glu Thr Pro Asp Arg His Tyr Tyr His Ile Ala Phe Phe Thr Leu Arg
245 250 255
Asp Val Lys Ala Met Asp Glu Leu Thr Trp Asp Tyr Met Ile Asp Phe
260 265 270
Asn Asp Lys Ser His Pro Val Lys Ala Phe Arg Cys Cys Cys Gly Ser
275 280 285
Glu Ser Cys Arg Asp Arg Lys Ile Lys Gly Ser Gln Gly Lys Ser Ile
290 295 300
Glu Arg Arg Lys Ile Val Ser Ala Lys Lys Gln Gln Gly Ser Lys Glu
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Val Ser Lys Lys Arg Lys Glu Phe
325
<210> 115
<211> 303
<212> PRT
<213> C. elegans
<400> 115
Ala Ser Ser Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Glu Ala Ser Met Gln Leu
1 5 10 15
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20 25 30
Ser Asp His Ser Met Thr Pro Thr Glu Leu Cys Tyr Phe Asp Asp Phe
35 40 45
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50 55 60
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100 105 110
Leu Pro Pro Asn Lys Leu Phe Glu Phe Arg Asp His Ile Val Arg Phe
115 120 125
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130 135 140
Arg Tyr Ser Gln Glu Gly His Gln Gly Ala Lys Leu Val Ser Thr Gly
145 150 155 160
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165 170 175
Leu Leu Ser Ser Glu Asp Glu Asp Ser Ile Leu Ala Gln Glu Gly Ser
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210 215 220
Phe Val Ser His Gly Ser Thr Ala His Ile Arg Val Leu Arg Asp Met
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Val Pro Gly Asp Glu Ile Thr Cys Phe Tyr Gly Ser Glu Phe Phe Gly
245 250 255
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260 265 270
Gly Ala Phe Ser Tyr Leu Arg Gly Asn Glu Asn Ala Glu Pro Ile Ile
275 280 285
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290 295 300
<210> 116
<211> 257
<212> PRT
<213> C. elegans
<400> 116
Ala Ser Ser Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Glu Ala Ser Met Lys Val
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Ala Ala Lys Lys Leu Ala Thr Ser Arg Met Arg Lys Asp Arg Ala Ala
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Ala Ala Ser Pro Ser Ser Asp Ile Glu Asn Ser Glu Asn Pro Ser Ser
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Leu Ala Ser His Ser Ser Ser Ser Gly Arg Met Thr Pro Ser Lys Asn
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115 120 125
Arg Gly Ile Arg Thr Lys Val Asn Phe Glu Lys Gly Asp Phe Val Val
130 135 140
Glu Tyr Arg Gly Val Met Met Glu Tyr Ser Glu Ala Lys Val Ile Glu
145 150 155 160
Glu Gln Tyr Ser Asn Asp Glu Glu Ile Gly Ser Tyr Met Tyr Phe Phe
165 170 175
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195 200 205
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Arg Arg Gln Ile Ala Gln Gly Glu Glu Leu Leu Tyr Asp Tyr Gly Asp
225 230 235 240
Arg Ser Ala Glu Thr Ile Ala Lys Asn Pro Trp Leu Val Asn Thr Glu
245 250 255
Phe
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<211> 224
<212> PRT
<213> Homo sapiens
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1 5 10 15
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Gly Lys Gln Ala Pro Arg Lys Lys Ala Gln Gly Lys Thr Gln Gln Asn
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Arg Lys Leu Thr Asp Phe Tyr Pro Val Arg Arg Ser Ser Arg Lys Ser
50 55 60
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65 70 75 80
Glu Ser Gly Lys Glu Glu Gly Met Lys Ile Asp Leu Ile Asp Gly Lys
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Gly Arg Gly Val Ile Ala Thr Lys Gln Phe Ser Arg Gly Asp Phe Val
100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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165 170 175
Thr Lys Leu His Asp Ile Asp Gly Val Pro His Leu Ile Leu Ile Ala
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Ser Arg Asp Ile Ala Ala Gly Glu Glu Leu Leu Tyr Asp Tyr Gly Asp
195 200 205
Arg Ser Lys Ala Ser Ile Glu Ala Phe Pro Trp Leu Lys His Glu Phe
210 215 220
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<211> 319
<212> PRT
<213> T. gondii
<400> 118
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35 40 45
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50 55 60
Asp Arg Glu Gly Ala Ala Asp Lys Ala Lys Gln Arg Glu Glu Arg Arg
65 70 75 80
Gln Lys Glu Leu Glu Glu Arg Phe Glu Glu Met Lys Val Glu Phe Glu
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Gln Gly Ile Leu Lys Trp Pro Leu Ser Val Met Ser Ile Arg Gln Arg
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165 170 175
His Leu Thr Lys Val Pro Gly Lys Gly Arg Ala Val Phe Ala Ala Asp
180 185 190
Thr Ile Leu Lys Asp Asp Phe Val Val Glu Tyr Lys Gly Glu Leu Cys
195 200 205
Ser Glu Arg Glu Ala Arg Glu Arg Glu Gln Arg Tyr Asn Arg Ser Lys
210 215 220
Val Pro Met Gly Ser Phe Met Phe Tyr Phe Lys Asn Gly Ser Arg Met
225 230 235 240
Met Ala Ile Asp Ala Thr Asp Glu Lys Gln Asp Phe Gly Pro Ala Arg
245 250 255
Leu Ile Asn His Ser Arg Arg Asn Pro Asn Met Thr Pro Arg Ala Ile
260 265 270
Thr Leu Gly Asp Phe Asn Ser Glu Pro Arg Leu Ile Phe Val Ala Arg
275 280 285
Arg Asn Ile Glu Lys Gly Glu Glu Leu Leu Val Asp Tyr Gly Glu Arg
290 295 300
Asp Pro Asp Val Ile Lys Glu His Pro Trp Leu Asn Ser Glu Phe
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Synthetic Polynucleotide
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<212> DNA
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<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
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<223> Synthetic Polynucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Synthetic Polynucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 124
cagcctctga acagctcccg 20
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Synthetic Polynucleotide
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tgacttggcc tttgtaggaa 20
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<213> Artificial Sequence
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<223> Synthetic Polynucleotide
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<223> Synthetic Polynucleotide
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<212> DNA
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<223> Synthetic Polynucleotide
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catcaatgat tgggcatttc 20
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<212> DNA
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<223> Synthetic Polynucleotide
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actccagtcc caaatatgta 20
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
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actagggggc gctcggccac 20
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
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<211> 20
<212> DNA
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<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
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<212> DNA
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<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
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tcgtgtcatc ttgtttgtgc 20
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<212> DNA
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<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
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<223> Synthetic Polynucleotide
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
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<223> Synthetic Polynucleotide
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<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 144
cttgcaggga ccttctgatt 20
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<212> DNA
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<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
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<223> Synthetic Polynucleotide
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gatagcagta tgaccttggg 20
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
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agcgtgtccg gcgagggcga 20
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<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 149
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
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<223> Synthetic Polynucleotide
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<210> 153
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
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<210> 154
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 154
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<210> 155
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 155
taatacgact cactataggc aaggaggacg gcaacatccg aaaggacgaa acacc 55
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 156
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<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 157
taatacgact cactataggg gtggggggag tttgctccga aaggacgaaa cacc 54
<210> 158
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 158
taatacgact cactataggc agatgtagtg tttccacaga aaggacgaaa cacc 54
<210> 159
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 160
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 161
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cttgctattt ctagctctaa aac 83
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<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
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<210> 163
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 163
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 164
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<210> 165
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 165
gaaaggacga aacaccggca aggaggacgg caacatccgt tttagagcta gaaatagcaa 60
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<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
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<223> Synthetic Polynucleotide
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<211> 59
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 168
gaaaggacga aacaccgggg tggggggagt ttgctccgtt ttagagctag aaatagcaa 59
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 169
tacggcaagc tgaccctgaa 20
<210> 170
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 170
gtccatgccg agagtgatcc 20
<210> 171
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 171
gccaggggct gttatcttgg 20
<210> 172
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 172
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<210> 173
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 173
ctgtgtcctc ttcctgccct 20
<210> 174
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 174
ctctccgagg agaaggccaa 20
<210> 175
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 175
ccacacagct tcccgttctc 20
<210> 176
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 176
gagagccgtt ccctctttgc 20
<210> 177
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 177
cactctttcc ctacacgacg ctcttccgat ctcctcccca ttggcctgct tc 52
<210> 178
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 178
cactctttcc ctacacgacg ctcttccgat cttcgtcctg ctctcactta gac 53
<210> 179
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 179
cactctttcc ctacacgacg ctcttccgat ctttttgtgg cttggcccca gt 52
<210> 180
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 180
cactctttcc ctacacgacg ctcttccgat cttgcagtct catgacttgg cct 53
<210> 181
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 181
cactctttcc ctacacgacg ctcttccgat ctttctgagg gctgctacct gt 52
<210> 182
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 182
cactctttcc ctacacgacg ctcttccgat ctacatgaag caactccagt ccca 54
<210> 183
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 183
cactctttcc ctacacgacg ctcttccgat ctagcagacc cactgagtca actg 54
<210> 184
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 184
cactctttcc ctacacgacg ctcttccgat ctcccgccac agtcgtgtca t 51
<210> 185
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 185
cactctttcc ctacacgacg ctcttccgat ctcgccccgg tacaaggtga 50
<210> 186
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 186
cactctttcc ctacacgacg ctcttccgat ctgtaccgta cattgtagga tgttt 55
<210> 187
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 187
cactctttcc ctacacgacg ctcttccgat ctcctcatct ccctcaagca ggc 53
<210> 188
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 188
cactctttcc ctacacgacg ctcttccgat ctattctgct cttgaggtta tttgt 55
<210> 189
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 189
cactctttcc ctacacgacg ctcttccgat ctcacctctg cctcaagagc agaaaa 56
<210> 190
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 190
cactctttcc ctacacgacg ctcttccgat cttgtgtgtg tgtgtgtgta ggact 55
<210> 191
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 191
ggagttcaga cgtgtgctct tccgatcttc atctgtgccc ctccctcc 48
<210> 192
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 192
ggagttcaga cgtgtgctct tccgatctcg agaaggaggt gcaggag 47
<210> 193
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 193
ggagttcaga cgtgtgctct tccgatctcg ggagctgttc agaggctg 48
<210> 194
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 194
ggagttcaga cgtgtgctct tccgatctct cacctgggcg agaaaggt 48
<210> 195
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 195
ggagttcaga cgtgtgctct tccgatctaa aactcaaaga aatgcccaat ca 52
<210> 196
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 196
ggagttcaga cgtgtgctct tccgatctag acgctgctcg ctccattc 48
<210> 197
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 197
ggagttcaga cgtgtgctct tccgatctac aggcatgaat cactgcacct 50
<210> 198
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 198
ggagttcaga cgtgtgctct tccgatctgc ggcaacttca gacaaccga 49
<210> 199
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 199
ggagttcaga cgtgtgctct tccgatctga cccaggggca ccagtt 46
<210> 200
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 200
ggagttcaga cgtgtgctct tccgatctct gccttcattg cttaaaagtg gat 53
<210> 201
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 201
ggagttcaga cgtgtgctct tccgatctac agttgaagga aggaaacatg c 51
<210> 202
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 202
ggagttcaga cgtgtgctct tccgatctgc tgcatttgcc catttcca 48
<210> 203
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 203
ggagttcaga cgtgtgctct tccgatctgt tgggggagga ggagcttat 49
<210> 204
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 204
ggagttcaga cgtgtgctct tccgatctct aagagctata agggcaaatg act 53
<210> 205
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (33)..(36)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 205
cactctttcc ctacacgacg ctcttccgat ctnnnnacgt aaacggccac aagttc 56
<210> 206
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 206
ggagttcaga cgtgtgctct tccgatctgt cgtccttgaa gaagatggtg 50
<210> 207
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 207
cactctttcc ctacacgacg ctcttccgat ctccaggtga aggtgtggtt ccag 54
<210> 208
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 208
ggagttcaga cgtgtgctct tccgatctcc cctagtcatt ggaggtgac 49
<210> 209
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 209
gagtccgagc agaagaagaa ggg 23
<210> 210
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 210
gaggccgagc agaagaaaga cgg 23
<210> 211
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 211
gagtcctagc aggagaagaa gag 23
<210> 212
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 212
gagtctaagc agaagaagaa gag 23
<210> 213
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 213
gagttagagc agaagaagaa agg 23
<210> 214
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 214
gggtgggggg agtttgctcc tgg 23
<210> 215
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 215
ggatggaggg agtttgctcc tgg 23
<210> 216
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 216
gggagggtgg agtttgctcc tgg 23
<210> 217
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 217
cgggggaggg agtttgctcc tgg 23
<210> 218
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 218
ggggagggga agtttgctcc tgg 23
<210> 219
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 219
gcagatgtag tgtttccaca ggg 23
<210> 220
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 220
acaaatgtag tatttccaca ggg 23
<210> 221
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 221
ccagatgtag tattcccaca ggg 23
<210> 222
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 222
ctagatgaag tgcttccaca tgg 23
<210> 223
<211> 133
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 223
gggcgatgcc acctacggca agctgaccct gaagttcatc tgcaccaccg gcaagctgcc 60
cgtgccctgg cccaccctcg tgaccaccct gacctacggc gtgcagtgct tcagccgcta 120
ccccgaccac atg 133
<210> 224
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 224
gggcgatcgg cgtgcagtgc ttcagccgct accccgacca catg 44
<210> 225
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 225
gggcgatgcc acctacggca agctgaccct gaagttcatc tgcaccaccg cgaccacatg 60
<210> 226
<211> 131
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 226
gggcgatgcc acctacggca agctgaccct gaagttcatc tgcacccggc aagctgcccg 60
tgccctggcc caccctcgtg accaccctga cctacggcgt gcagtgcttc agccgctacc 120
ccgaccacat g 131
<210> 227
<211> 100
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 227
gggcgatgcc acctacggca agctgcccgt gccctggccc accctcgtga ccaccctgac 60
ctacggcgtg cagtgcttca gccgctaccc cgaccacatg 100
<210> 228
<211> 131
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 228
gggcgatgcc acctacggca agctgaccct gaagttcatc tgcaccacgc aagctgcccg 60
tgccctggcc caccctcgtg accaccctga cctacggcgt gcagtgcttc agccgctacc 120
ccgaccacat g 131
<210> 229
<211> 131
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 229
gggcgatgcc acctacggca agctgaccct gaagttcatc tgcaccaccg gcaagctgcg 60
tgccctggcc caccctcgtg accaccctga cctacggcgt gcagtgcttc agccgctacc 120
ccgaccacat g 131
<210> 230
<211> 131
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 230
gggcgatgcc acctacggca agctgaccct gaagttcatc tgcaccaccg gcaagctgcc 60
cgccctggcc caccctcgtg accaccctga cctacggcgt gcagtgcttc agccgctacc 120
ccgaccacat g 131
<210> 231
<211> 125
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 231
gggcgatgcc acctacggca agctgaccct gaagttcatc tggcaagctg cccgtgccct 60
ggcccaccct cgtgaccacc ctgacctacg gcgtgcagtg cttcagccgc taccccgacc 120
acatg 125
<210> 232
<211> 82
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 232
gggcgatgcc acctacggca agctgaccct gaagttcatc tgcaccaccg cgcagtgctt 60
cagccgctac cccgaccaca tg 82
<210> 233
<211> 131
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 233
gggcgatgcc acctacggca agctgaccct gaagttcatc tgcaccaccc aagctgcccg 60
tgccctggcc caccctcgtg accaccctga cctacggcgt gcagtgcttc agccgctacc 120
ccgaccacat g 131
<210> 234
<211> 135
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 234
gggcgatgcc acctacggca agctgaccct gaagttcatc tgcaccaccg atgcaagctg 60
cccgtgccct ggcccaccct cgtgaccacc ctgacctacg gcgtgcagtg cttcagccgc 120
taccccgacc acatg 135
<210> 235
<211> 166
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 235
gggcgatgcc acctacggca agctgaccct gaagttcatc tgcaccaccg gcaagctgac 60
cctgaagttc atctgcacca ccggcaagct gcccgtgccc tggcccaccc tcgtgaccac 120
cctgacctac ggcgtgcagt gcttcagccg ctaccccgac cacatg 166
<210> 236
<211> 130
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 236
gggcgatgcc acctacggca agctgaccct gaagaaatga agaaatgaag aaatgcccgt 60
gccctggccc accctcgtga ccaccctgac ctacggcgtg cagtgcttca gccgctaccc 120
cgaccacatg 130
<210> 237
<211> 80
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 237
ggcagaagct ggaagaggaa gggccggagt ctgagcagaa gaagaagggt tcccaccata 60
tcaaccggtg gcgcatcgcc 80
<210> 238
<211> 77
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 238
ggcagaagct ggaagaggaa gggccggagt ctgagcagaa gaagggttcc caccatatca 60
accggtggcg catcgcc 77
<210> 239
<211> 78
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 239
ggcagaagct ggaagaggaa gggccggagt ctgagcagaa agaagggttc ccaccatatc 60
aaccggtggc gcatcgcc 78
<210> 240
<211> 73
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 240
ggcagaagct ggaagaggaa gggccggagt ctgagagaag ggttcccacc atatcaaccg 60
gtggcgcatc gcc 73
<210> 241
<211> 76
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 241
ggcagaagct ggaagaggaa gggccggagt ctgagcagag aagggttccc accatatcaa 60
ccggtggcgc atcgcc 76
<210> 242
<211> 71
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 242
ggcagaagct ggaagaggaa gggccggagt ctgagaaggg ttcccaccat atcaaccggt 60
ggcgcatcgc c 71
<210> 243
<211> 71
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 243
ggcagaagct ggaagaggaa gggccggagt ctgagcagaa gaaccaccat atcaaccggt 60
ggcgcatcgc c 71
<210> 244
<211> 70
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 244
ggcagaagct ggaagaggaa gggccggagt ctagaagggt tcccaccata tcaaccggtg 60
gcgcatcgcc 70
<210> 245
<211> 78
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 245
ggcagaagct ggaagaggaa gggccggagt ctgagcagaa gaagaagggt tcaccatatc 60
aaccggtggc gcatcgcc 78
<210> 246
<211> 74
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 246
ggcagaagct ggaagaggaa gggccggagt ctgagcagaa gggttcccac catatcaacc 60
ggtggcgcat cgcc 74
<210> 247
<211> 71
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 247
ggcagaagct ggaagaggaa gggccggagt ctgagcaggg ttcccaccat atcaaccggt 60
ggcgcatcgc c 71
<210> 248
<211> 77
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 248
ggcagaagct ggaagaggaa gggccggagt ctgagcagaa gaccatatcc caccatatca 60
accggtggcg catcgcc 77
<210> 249
<211> 87
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 249
ggcagaagct ggaagaggaa gggccggagt ctgagcagaa gaccatatcc aaccatatcc 60
caccatatca accggtggcg catcgcc 87
<210> 250
<211> 93
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<400> 250
ggcagaagct ggaagaggaa gggccggagt ctgagcagaa gaagaagaag ggttcccacc 60
atatcccacc atatcaaccg gtggcgcatc gcc 93
<210> 251
<211> 39
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polypeptide
<400> 251
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Thr Ala Leu Ala Leu
20 25 30
Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val
35
<210> 252
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polypeptide
<400> 252
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
20 25
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Ala Leu Ala Leu
1
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Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ala Leu Ala Leu
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Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
20 25
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<400> 259
Xaa Ala Leu Ala Leu Ala Xaa
1 5
Claims (23)
- 세포에 전달되는 RNA-프로그램가능 단백질로서, 가이드 RNA와 회합되어 음으로 하전된 복합체를 생성하는 것인, RNA-프로그램가능 단백질, 및
양이온성 중합체
를 포함하는 조성물. - 제1항에 있어서, RNA-프로그램가능 단백질이 양으로 하전되거나, 음으로 하전되거나, 또는 중성 전하를 갖는 것인 조성물.
- 제1항에 있어서, RNA-프로그램가능 단백질이 제2 단백질에 융합된 것인 조성물.
- 제3항에 있어서, 제2 단백질이 데아미나제를 포함하는 것인 조성물.
- 제4항에 있어서, 데아미나제가 시티딘 데아미나제를 포함하는 것인 조성물.
- 제5항에 있어서, 시티딘 데아미나제가 APOBEC1, AID, 및 ACF1/ASE 데아미나제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
- 제4항에 있어서, 데아미나제가 아데노신 데아미나제를 포함하는 것인 조성물.
- 제7항에 있어서, 아데노신 데아미나제가 ADAT 계열 데아미나제를 포함하는 것인 조성물.
- 제1항에 있어서, 복합체가 -5 내지 -50 사이인 순수 전하를 갖는 것인 조성물.
- 제1항에 있어서, 복합체가 -0.03 미만의 분자량에 대한 전하의 비를 갖는 것인 조성물.
- 제1항에 있어서, 가이드 RNA가 치료제인 유전자에 결합하는 서열을 포함하는 것인 조성물.
- 제1항에 있어서, 세포 군집에 투여되었을 때 낮은 독성을 나타내는 조성물.
- 제1항에 있어서, RNA-프로그램가능 단백질이 Cas9 단백질인 조성물.
- 제1항에 있어서, 자가면역 장애, 당뇨병, 루푸스, 다발성 경화증, 건선, 류마티스 관절염, 염증성 장애, 관절염, 골반 염증 질환, 감염성 질환, 바이러스 감염, HIV 감염, HCV 감염, RSV 감염, 세균 감염, 진균 감염, 패혈증, 신경학적 장애, 알츠하이머병, 헌팅턴병, 자폐증, 뒤시엔느 근 위축증, 심혈관 장애, 죽상동맥경화증, 고콜레스테롤혈증, 혈전증, 응고 장애, 혈관형성 장애, 황반 변성, 증식성 장애, 암, 양성 신생물, 호흡 장애, 만성 폐쇄성 폐 질환, 소화 장애, 염증성 창자병, 궤양, 근골격 장애, 섬유근육통, 내분비 장애, 대사 장애, 영양 장애, 골다공증, 비뇨기 장애, 신장 질환, 심리 장애, 우울증, 정신분열증, 피부 장애, 습진, 혈액 장애, 림프 장애, 빈혈, 및 혈우병으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환 또는 장애를 치료하는 데 유용한 제약 조성물인 조성물.
- 제1항에 있어서, 양이온성 중합체가 폴리알릴아민 (PAH), 폴리에틸렌이민 (PEI), 폴리(L-리신) (PLL), 폴리(L-아르기닌) (PLA), 폴리비닐아민, 폴리(비닐벤질-트리-C1-C4-알킬암모늄염), 지방족 또는 방향지방족 디할로겐화물 및 지방족 N,N,N',N'-테트라-C1-C4-알킬-알킬렌디아민의 중합체, 폴리(비닐피리딘) 또는 폴리(비닐피리디늄염), 폴리(N,N-디알릴-N,N-디-C1-C4-알킬-암모늄할로겐화물), 4차화된 디-C1-C4-알킬-아미노에틸 아크릴레이트, 메타크릴레이트, 또는 폴리아미노아미드를 포함하는 것인 조성물.
- 단리된 세포를 제1항의 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는, 단리된 세포에 RNA-프로그램가능 단백질을 전달하는 방법.
- 제16항에 있어서, 접촉이 시험관 내인 것인 방법.
- 제16항에 있어서, 접촉이 생체 외인 것인 방법.
- 제1항의 조성물을 포함하는 키트.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 의약의 제조에 사용하기 위한 방법.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
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