CN107405411A - 使用腺病毒载体的体内基因改造 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了重组核酸表达盒和辅助病毒依赖性腺病毒，其中所述的表达盒使用了在辅助病毒依赖性腺病毒生产型细胞中用于控制核酸酶表达的miRNA基系统，由此在CD34+细胞中的体内基因编辑方面允许进行生产和应用。

Description

使用腺病毒载体的体内基因改造
交叉引用
本申请要求2014年5月1日提交的美国临时专利申请系列号61/987,340的优先权，该申请的内容以引用方式全部并入本文。
政府权利的陈述
本发明是在政府的资助下在由National Institutes of Health授予的GrantNo.R01HLA078836和R21CA193077下完成的。在本发明中，政府具有某些权利。
背景技术
造血干细胞(HSC)是基因治疗的重要靶物。目前的方案涉及由供体/患者收集HSC，体外培养，使用逆转录病毒载体转导，以及再移植至骨髓-病态的患者中。这种方法除了技术的复杂性，其缺点包括必须在多种细胞因子存在下进行培养，其中所述的细胞因子可以影响HSC的多能性和它们的植入潜力。此外，在患有非恶性紊乱的患者中对清髓性方案的需要创造了其他的风险。
HSC基因治疗中的主要任务是使用人工的位点特异性核酸内切酶(EN)对HSC基因进行位点特异性修饰，其中所述的核酸内切酶以预选的基因组位点作为DNA断裂的目标。使用EN敲除基因，校正移码突变，或者将野生型cDNA敲入内源位点或异源位点。但是，对于动员的HSC的体内改造而言，在基因组中产生位点特异性DNA断裂的目前的EN基因传递平台都是不够的。
发明概述
在第一个方面中，本发明提供了重组核酸的表达盒，其包含至少一个第一核酸模块，其包含：
(i)编码核酸酶的第一编码区，其中所述的核酸酶能够在所关注的CD34+细胞基因组靶物中产生DNA断裂；以及
(ii)编码一个或多个miRNA靶位点的第二编码区，其中所述的miRNA靶位点位于第一编码区的3’非翻译区，以及位于第一编码区的翻译终止密码子的下游的至少60个核苷酸，其中与一个或多个编码的miRNA靶位点结合的miRNA在病毒生产细胞中高度表达，但是在细胞中不表达或以较低的水平表达，
其中第一核酸模块与在CD34+细胞中具有活性的启动子可操作地连接。
在一个实施方案中，所述的盒进一步包含编码CD46的第二核酸模块，其中所述的CD46与腺病毒纤维多肽结合。在另一个实施方案中，表达盒进一步在重组核酸载体的各个末端包含反向末端重复序列(ITR)，其中所述的ITR衍生自结合CD46腺病毒血清型。在其他的实施方案中，表达盒进一步包含得自结合CD46腺病毒血清型的包装信号。
在一个实施方案中，一个或多个miRNA靶位点包含一种、两种或所有三种miRNA的反向互补序列，其中所述的miRNA选自：(a)CACUGGUAGA(SEQ ID NO:1)(has-miR183-5p核心),(b)UGUGCUUGAUCUAA(SEQ ID NO:2)(has-miR218-5p核心)；和(c)CACUAGCACA(SEQ IDNO:3)(miR96-5p核心)。在另一个实施方案中，一个或miRNA靶位点包含miRNA的反向互补序列，其中所述的miRNA选自SEQ ID NO:1-90。在另一个实施方案中，第二编码区编码至少4个miRNA靶位点。在另一个实施方案中，1-10个核苷酸之间的间隔序列存在于各个编码的miRNA靶位点之间。在另一个实施方案中，所述的核酸酶选自锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应器核酸酶(TALEN)、聚合酶和CRISPR-Cas9核酸酶，包括但不限于包含选自SEQ IDNO 91-93中的多肽的核酸序列的核酸酶。在另一个实施方案中，所述的核酸酶能够在CD34+细胞基因组靶物中形成DNA断裂，其中所述的CD34+细胞基因组靶物选自编码趋化因子受体5型(CCR5),β-球蛋白,补体受体2(CR2)(人类疱疹病毒(EBV)受体),Niemann-Pick病,C1型受体((NPC1)埃博拉病毒受体),血管紧张素转化酶2受体((ACE2)SARS受体)的基因，以及编码如果误叠能够导致溶酶体贮积症的蛋白质的基因。在一个实施方案中，启动子选自EF1α启动子、磷酸甘油酸激酶(PGK)1启动子和泛素基因启动子。
在另一个实施方案中，第二核酸模块编码腺病毒纤维多肽，该腺病毒纤维多肽包含与CD46结合的一个或多个人类腺病毒钮结构域或其等价物。在另一个实施方案中，钮结构域选自Ad11钮结构域,Ad16钮结构域,Ad21钮结构域,Ad35钮结构域,Ad50钮结构域和它们的功能等价物。在另一个实施方案中，钮结构域选自SEQ ID NO:94-101。在另一个实施方案中，第二核酸模块编码腺病毒纤维多肽，其包含一个或多个人类腺病毒柄结构域(shaftdomain)或其功能等价物。在一个实施方案中，一个或多个人类腺病毒柄饥饿哦股有选自一个或多个Ad5柄结构域、一个或多个Ad11柄结构域、一个或多个Ad16柄结构域、一个或多个Ad21柄结构域、一个或多个Ad35柄结构域、Ad50柄结构域、它们的组合或功能等价物。在另一个实施方案中，一个或多个人类腺病毒柄结构域选自SEQ ID NO:118-130和152-156。
在另一个实施方案中，第二核酸模块编码腺病毒纤维多肽，其包含人类腺病毒尾结构域或其等价物。在一个实施方案中，人类腺病毒尾结构域选自Ad11尾结构域,Ad16尾结构域,Ad21尾结构域,Ad35尾结构域,Ad50尾结构域及其功能等价物。在另一个实施方案中，人类腺病毒尾结构域选自SEQ ID NO:131-132。在另一个实施方案中，ITR得自Ad11,Ad16,Ad21,Ad35或Ad50，包括但不限于选自SEQ ID NO:133-137中的多核苷酸。在另一个实施方案中，包装信号包含Ad11,Ad16,Ad21,Ad35或Ad50包装信号，包括但不限于选自SEQ ID NO:138-141中的多核苷酸。在另一个实施方案中，包装信号的侧翼为核酸切除信号。在另一个实施方案中，所述的盒不编码其他的腺病毒蛋白质。
在另一个实施方案中，表达盒进一步包含与在CD34+细胞中具有活性的第二启动子可操作地连接的转基因。在一个实施方案中，所述的盒进一步包含位于转基因侧翼的至少第一再结合位点和第二再结合位点，其中所述的第一再结合位点和第二再结合位点靶向CD34+细胞基因组DNA中的位点，该位点为用于转基因的所需插入位点的侧翼。在多个非限定性实施方案中，转基因可以选自-CCR5,β-球蛋白,补体受体2(CR2)(Epstein BarrVirus(EBV)受体),Niemann-Pick病,C1型受体(NPC1)Ebola受体),血管紧张素转化酶2受体(ACE2)SARS受体)，以及编码蛋白质(如果该蛋白质误叠，则可以导致溶酶体贮积症疾病)的基因。
在另一个方面中，本发明提供了重组核酸载体，其包含本发明的任何实施方案的或者实施方案的组合的重组核酸表达盒。在一个实施方案中，表达盒和/或重组核酸载体的长度为至少28kb。
在另一个方面中，本发明提供了重组宿主细胞，其包含本发明的任何实施方案的或者实施方案的组合的表达盒或重组核酸载体。在一个实施方案中，宿主细胞生产miRNA，其中由所述的盒编码的miRNA靶位点与所述的miRNA结合。在另一个实施方案中，宿主细胞进一步包含辅助腺病毒和/或辅助腺病毒载体。在多个实施方案中，宿主细胞选自人胚肾(HEK)293细胞、HEK 293-Cre细胞、PerC6细胞和HCT116细胞。
在另一个方面中，本发明提供了重组辅助病毒依赖性腺病毒，其包含本发明的任何实施方案的或实施方案的组合的表达盒或重组核酸载体，并且本发明提供了用于制备重组辅助病毒依赖性腺病毒的方法。
在另一个方面中，本发明提供了用于造血细胞基因治疗的方法，其包括使用本发明的任何实施方案的或实施方案的组合的重组辅助病毒依赖性Ad病毒体内转导移动至需要造血细胞基因治疗的受试对象的外周血中的造血细胞，其中所述的核酸酶靶向待破坏的造血细胞基因组基因，其中造血细胞基因组基因的破坏为受试对象提供治疗益处。
在另一个方面中，本发明提供了用于造血细胞基因治疗的方法，其包括使用本发明的任何实施方案的或实施方案的组合的重组辅助病毒依赖性Ad病毒体内转导移动至需要造血细胞基因治疗的受试对象的外周血中的造血细胞，其中所述的重组核酸表达盒包含在CD34+细胞中具有活性的启动子可操作地连接的转基因，其中所述的转基因的侧翼为至少第一再结合位点和第二再结合位点，其中所述的第一再结合位点和第二再结合位点靶向造血细胞基因组DNA中的位点，其中所述的基因组DNA为用于转基因的所需插入位点的侧翼，并且其中转基因插入至所需的插入位点为受试对象提供了治疗益处。
在本发明的治疗方法的一个实施方案中，通过向受试对象给予动员剂的组合使造血细胞移动至外周血中，其中所述的动员剂的组合选自粒细胞集落刺激因子(GCSF),Plerixafor(AMD3100；CXCR抑制剂),POL5551(CXCR4(C-X-C趋化因子受体4型)拮抗剂),BIO5192(VLA-4的小分子抑制剂)和它们的组合。在另一个实施方案中，受试对象为人类。在另一个实施方案中，所述的对象患有或者处于发展成选自以下的紊乱的风险之下：β-珠蛋白生成障碍性贫血,人免疫缺陷性病毒感染和/或获得性免疫缺陷性综合征,Ebola病毒感染,Epstein-Barr病毒感染和突发性急性呼吸综合征病毒(SARS)感染。在另一个实施方案中，重组辅助病毒依赖性Ad病毒通过静脉内注射给予。
在另一个方面中，本发明提供了包含2个或多个拷贝的miRNA靶位点的重组核酸，其中所述的miRNA靶位点包含选自SEQ ID NO:1-90中的核酸序列的反向互补序列。在一个实施方案中，重组核酸包含至少4个拷贝的miRNA靶位点。在另一个实施方案中，miRNA靶位点总计包含用于至少2个不同的miRNA的靶位点。在另一个实施方案中，1-10个核苷酸的间隔序列存在于各个编码的miRNA靶位点之间。在另一个实施方案中，重组核酸进一步包含位于2个或多个拷贝的miRNA靶位点上游的所关注的蛋白质的编码区，其中所述的2个或多个拷贝的miRNA靶位点位于编码区的3’非翻译区域内，并且在编码区的翻译终止密码子下游的至少60个核苷酸。在另一个实施方案中，本发明提供了核酸表达载体，其包含与启动子序列可操作地连接的本发明该方面的重组核酸。
附图简述
图1.在293-Cre与CD34+细胞中miRNA表达图谱。a)CD34+细胞(Y-轴)和293-Cre细胞(X-轴)的MicroRNA log2强度的散点图。满足我们的选择标准(在293-Cre细胞中高表达水平，而在CD34+细胞中缺如/低表达)的miRNA被标记。如实施例中所述，使用Ad载体感染293-Cre和CD34+细胞(由4名不同的供体汇集)。在感染后的24小时，分离总RNA，并与包含>2,000miRNA探针的阵列芯片杂交。b)使用用于阵列研究的相同的RNA样品(由顶至低：SEQID NO:2,14,73,157,158,159)，通过对所选miRNA的实时PCR分析，对阵列结果的确认。Ct值表示为由四组试验的平均值和标准偏差。由于基于miRNA阵列和qRT-PCR测试，由于hsa-miR-130a-3p在所有293和CD34+细胞样品中以高水平表达，所以选择hsa-miR-130a-3p作为阳性对照。Ct值与RNA浓度呈负相关。n.d.-未检测。
图2.miRNA调节的转基因表达的分析。a)用于检验miRNA调节的表达的Ad5/35载体的图示。在内容中进行描述。GFP基因的3'末端与球蛋白基因的3'非翻译区(UTR)连接。miRNA靶位点插入至3'UTR中。由EF1a启动子转录的GFP mRNA因此包含miRNA靶位点。相反，mCherryTM的表达不受所选的miRNA的调剂。b)293-Cre细胞中转基因的表达。使用缺乏miRNA靶位点(无miR)的Ad5/35和包含miRNA靶位点的载体在所示的MOI下感染细胞。显示GFP荧光强度除以在感染后48h通过流式细胞仪测量的mCherryTM荧光强度。N＝3。使用具有具有不等方差的未配对t检验来计算P值(GraphPad Prism 5软件)。用于“无miR”与“miR218-183”的p值为0.12；0.0012；0.02；而分别用于MOI 2,5,10和20pfu/细胞的p值为0.0016。注意2个启动子(PGK和EF1a)受到差异性调节，并且需要不同的转录因子。对于不具有miR靶位点的载体而言，随着MOI升高，即，转基因拷贝数的升高，GFP水平增加至比mCherryTM水高很多的程度。c)感染后48h，转导的CD34+细胞的流式细胞仪。显示GFP/mCherryTM MFI比值。N＝3。使用第一代载体进行293和CD34+细胞中的转导研究。效价以空斑形成单位(Pfu)给出。1个pfu相当于20个病毒颗粒(vp)。
图3.使用HD-Ad5/35.ZFNmiR的转导研究。a)载体基因组结构。通过自自切割病毒2A肽连接2个ZFN亚单元。ZFN编码序列位于miR-183/218靶位点和3’UTR的上游。2个ZFN亚单位由EF1a启动子转录。在CD34+细胞中，mRNA未被降解，并且将表达多肽，该多肽随后在2A肽处被切割成2个ZFN亚单元。b和d)在使用HD-Ad5/35.ZFNmiR载体(HD-ZFN)在所示的MOI下转导后，ZFN蛋白质在MO7e细胞(b)或CD34+细胞(d)中的表达。后来，在48h时收获细胞，并且使用针对Fok1结构域的抗体通过Western印迹来分析细胞裂解物。肌动蛋白B用作加载对照。c和a)T7E1核酸酶测试。由转导的MO7e细胞(c)或CD34+细胞(e)得到的基因组DNA经历基于T7E1核酸酶的PCR测试，其中所述的测试检测突变[11]。通过PAGE电泳分离PCR产物。通过箭头标记相当于被破坏的ccr5等位基因的条带。切割产物的预计大小为141bp和124bp。泳道下方的数字表示被破坏的ccr5等位基因的％。使用得自供体A的CD34+细胞进行研究。
图4.与HD-ZFN转导有关的CD34+细胞毒性的分析。使用得自供体A(a)和供体B(b)的CD34+细胞进行研究。显示在使用包含b-球蛋白LCR(HD-bGlob)的HD-Ad5/35对照载体或HD-ZFN载体在所示的MOI下转导后4天时膜联蛋白V-阳性细胞的百分率。通过流式细胞仪分析膜联蛋白V和7AAD的表达，N＝3。c)在使用表达CCR5ZFN的第一代(FG-ZFN)且辅助病毒依赖性(HD-ZFN)Ad5/35载体感染CD34+细胞后的细胞毒性。使用得自供体B的CD34+细胞。N＝3。HD-ZFN与FG-ZFN(MOI 1000):p＝1.51x10-6,HD-ZFN与FG-ZFN(MOI 10,000):p＝2.83x10-8。
图5.LTC-IC的分析。使用HD-bGlob和HD-ZFN在所示的MOI下转导CD34+细胞。3天后，将细胞转移至LTC-IC培养基中并培养5周。然后，将总计3,000个LT-CIC细胞平铺于补充有生长因子和细胞因子的甲基纤维素中。2周后，计数集落。将得自每个平板的所有集落的细胞结合，并分离基因组DNA，在进行T7E1核酸酶测试。a和b)分别用于供体A和B的每个平板的集落的数量。在不同的组中，BFU-E和CFU-GM集落的比例无差异。N＝3个平板，n.s.为无意义，(p>0.05),**p<0.05。c)由使用FG-ZFN和HD-ZFN转导的供体B细胞得到的CFU的数量。d)T7E1核酸酶测试。由供体A得到的CD34+细胞用于使用HD-bGlob和HD-ZFN在5000vp/细胞的MOI下转导。分离得自集落的基因组DNA，并进行T7E1测试。示出CFU/LTC-IC样品的代表性T7E1核酸酶测试。
图6.在NOD/SCID再建群细胞中ccr5基因的敲除。a)研究设计。将得自供体A的低温保存的CD34+细胞在低细胞因子浓度条件下过夜培养，并使用MOI为5,000vp/细胞的HD-bGlob或HD-ZFN转导24小时。然后洗涤细胞，并移植到亚致死量辐射的NOG小鼠中。6周后，将动物安乐死，并收集骨髓细胞、脾细胞和PBMC。通过流式细胞仪，针对泛白细胞标志物CD45来测量收集细胞中人类细胞的百分率。使用缀合抗人CD45抗体的珠，通过磁激活细胞分类方法(MACS)纯化人类供体细胞。CD45+细胞用于T7E1核酸酶测试。b)基于得自骨髓、脾和PBMC的总细胞中人类CD45+细胞的百分率的植入率。N＝3。c)在移植小鼠的骨髓中，由MACS分离的人类CD34+细胞的集落的数量。N＝3。“无Ad”和“HD-ZFN”之间的差异无意义(p＝0.061)。d)在得自移植小鼠的骨髓的人类CD45+细胞中，ccr5基因破坏的分析。
图7.表达球蛋白LCR特异性TALEN的HD-Ad5/35载体的结构和功能分析。a)TALEN的靶位点。显示具有DNase超敏性位点HS1至HS5的球蛋白LCR的结构。下方面板显示通过水平箭头标记的HS2靶位点的5'序列(SEQ ID NO:160和161)。在所述的序列上方和下方的线表明分别为2个TALEN亚单元的结合位点。垂直黑体箭头标记TALEN切割位点。b)HD-Ad5/35的结构。TALENmiR(HD-TALEN)基因组。与ZEN载体相似，2个TALEN亚单元通过2A肽在3'末端与包含miR183/218靶序列的3'UTR连接。TALEN(1)的N-末端包含流感血凝素(HA)标记。c)TALEN在MO7e细胞中的表达。以1000vp/细胞的MOI感染细胞，并使用HA-标记的特异性抗体通过Western印迹来分析裂解物。d)T7E1核酸酶测试分析。在以103,2x103vp/细胞的MOI感染后的48小时后，由MO7e分离基因组DNA，并使用球蛋白LCR H2特异性引物对其进行PCR。PCR产物的预计长度为608,434,174bp。
图8.非限定性和示例性造血干细胞动员和处理时间表的流程图。
图9.使用包含长或短纤维柄的Ad5/35载体的体外转导研究。Ad5/35S和Ad5/35L包含CMV-荧光素酶盒。A)使用因子Z转导表达HSPG的CHO-K1细胞(左侧面板)和缺乏HSPG表达的CHO-E606细胞(99)(右侧面板)的能力。因子X增强的转导需要长纤维柄和HSPG。所用的MOI为50pfu/细胞。FX浓度为7.5μg/ml。N＝3。B)在不同的MOI下人类CD34+细胞的转导。N＝3。
图10.动员后HSC的Ad5/35++体内转导。A)通过s.c.注射人类重组G-CSF(5μg/小鼠/天,4天)、然后在最后一次G-CSF注射后的18小时，s.c.注射AMD3100(5mg/kg)，在huCD46tg小鼠中动员HCS。在AMD-3100后的1小时，i.v.注射总计2x109pfu的Ad5/35++GFP。B)通过在Ad注射后6和72小时并将它们培养2天以允许转基因表达，通过收获PBMC来分析转导。显示GFP-阳性LSK细胞在外周血中的百分率。N＝5。c)在Ad注射后的第3,7和14天，通过收获骨髓和脾在动员的和未动员的动物中分析转导。显示GFP-阳性LSK细胞在骨髓和脾中的百分率。LSK细胞的体内转导在未动员的情况下是无效的。值得注意的是，静脉内注射Ad5/35在小鼠和非人类灵长动物中不会引起肝脏毒性。
发明详述
所引用的所有参考文献均以引用方式全文并入本文。在本申请中，除非另作说明，否则所使用的技术可以在多个公知的参考文献的任意一份中找到，例如MolecularCloning:A Laboratory Manual(Sambrook,et al.,1989,Cold Spring HarborLaboratory Press),Gene Expression Technology(Methods in Enzymology,Vol.185,edited by D.Goeddel,1991.Academic Press,San Diego,CA),“Guide to ProteinPurification”in Methods in Enzymology(M.P.Deutshcer,ed.,(1990)Academic Press,Inc.)；PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications(Innis,etal.1990.Academic Press,San Diego,CA),Culture of Animal Cells:A Manual ofBasic Technique,2nd Ed.(R.I.Freshney.1987.Liss,Inc.New York,NY),Gene Transferand Expression Protocols,pp.109-128,ed.E.J.Murray,The Humana Press Inc.,Clifton,N.J.),以及the Ambion 1998Catalog(Ambion,Austin,TX)。
如本文所用，除非内容中另外作出明确的指示，否则单数形式“a”、“an”和“the”包括复数的参照物。如本文所用，除非另外明确陈述，否则“和”与“或”可交换使用。
如本文所用，氨基酸残基如下缩写：丙氨酸(Ala；A),天冬酰胺(Asn；N),天冬氨酸(Asp；D),精氨酸(Arg；R),半胱氨酸(Cys；C),谷氨酸(Glu；E),谷氨酰胺(Gln；Q),甘氨酸(Gly；G),组氨酸(His；H),异亮氨酸(Ile；I),亮氨酸(Leu；L),赖氨酸(Lys；K),蛋氨酸(Met；M),苯丙氨酸(Phe；F),脯氨酸(Pro；P),丝氨酸(Ser；S),苏氨酸(Thr；T),色氨酸(Trp；W),酪氨酸(Tyr；Y)和缬氨酸(Val；V)。
除非内容中另外作出明确的指示，否则本发明的任何方面的所有实施方案可以组合使用。
除非内容中另外明确要求，否则在整篇描述和权利要求书中，词语动词性的“包含”、动名词性的“包含”等与排他的或穷举的意义相反，解释为包含广泛的含义；换言之，为“包含但不限于”的含义。使用单数或复数的词语还分别包含复数和单数。此外，词语“其中”、“在……上方”、“在……下方”以及类似含义的词语在本申请中使用时，是指本申请作为一个整体，并非指本申请的任何特定的部分。
本发明公开的实施方案的描述无意于穷举的或者将本发明公开限定为所公开的精确的形式。尽管为了说明，本文描述了本发明公开的具体的实施方案和实例，但是在本发明公开的范围，多个等价的修改是可行的，如同相关领域中的那些技术人员所认为的那样。
在第一个方面中，本发明提供了重组核酸表达盒，其包含(a)至少一个第一核酸模块，其包含：
(i)编码核酸酶的第一编码区，其中所述的核酸酶能够在所关注的CD34+细胞基因组靶物中产生DNA断裂；以及
(ii)编码一个或多个miRNA靶位点的第二编码区，其中所述的miRNA靶位点位于第一编码区的3’非翻译区，以及位于第一编码区的翻译终止密码子的下游的至少60个核苷酸，其中与一个或多个编码的miRNA靶位点结合的miRNA在病毒生产细胞中高度表达，但是在细胞中不表达或以较低的水平表达，
其中第一核酸模块与在CD34+细胞中具有活性的启动子可操作地连接。
如以下实例中所示，本发明的表达盒可以用作生产本发明的辅助病毒依赖性腺病毒的基因组，其依次可以用于CD34+细胞(例如造血细胞)中体内基因改造的显著改善的方法。例如所述的盒可以用于克隆至载体(例如质粒)中，其中所述的质粒包含用于辅助病毒依赖性Ad病毒的生产的其他必需成分。
在一个实施方案中，由此衍生的盒或载体进一步包含编码结合CD46腺病毒纤维多肽的第二核酸模块。在另一个实施方案中，由此衍生的盒或载体在重组核酸载体的各个末端包含反向末端重复序列(ITR)，其中所述的ITR衍生自结合CD46腺病毒血清型。在另一个实施方案中，由此衍生的盒或载体进一步包含得自结合CD46腺病毒血清型的包装信号。
本发明的腺病毒(Ad)基因组具有可以容纳大载荷的大容量(～30kb)，包含多个核酸酶表达盒和同源供体模板，其可以用于在体内转导CD34+细胞。在生产型细胞中Ad扩增过程中，如果核酸酶未必抑制，则生产大量的核酸酶。在Ad生产型细胞中，对高水平的核酸酶表达耐受较差，其抑制载体的恢复或对再结合的载体基因组的选择，以及EN表达盒的删除。
辅助病毒依赖性腺病毒的生产在HD腺病毒生产型细胞中通过抑制核酸酶的表达而极大地增强，其是基于生产型细胞与CD34+细胞的miRNA表达图谱通过调节基因表达的miRNA基系统而在本发明中完成的。具体而言，在病毒生产型细胞中高度表达、但是在CD34+细胞中不表达或以较低的水平表达的miRNA的靶位点以与核酸酶mRNA连接的融合物形式由所述的盒转录。当在HD生产型细胞中表达时，miRNA与mRNA靶位点结合，导致核酸酶-mRNA靶位点杂合体降解，由此减少或消除核酸酶在生产型细胞中的表达，并在未进行载体基因组重排的情况下极大地促进(与辅助病毒Ad病毒结合)本发明的重组HD腺病毒的生产。由于CD34+细胞不具有或者具有大幅减少的用于结合miRNA靶位点的miRNA，所以核酸酶的表达发生，从而允许有效的基因编辑。
如本文所用，“生产型细胞”为可以用于生产高效价的腺病毒的任何细胞类型。测定合适的生产型细胞很好地在本领域的技术人员的水平范围内。在一个实施方案中，生产型细胞适用于生产辅助病毒依赖性腺病毒。用于本发明的生产型细胞的非限定性实例包括但不限于人胚肾(HEK)293细胞,HEK 293-Cre细胞,PerC6细胞,HCT 116细胞等。在一个实施方案中，生产型细胞为HEK293细胞或HEK293-Cre细胞。
如本文所用，CD34+细胞为表达作为细胞表面蛋白质的CD34蛋白质的细胞。示例性CD34+细胞为造血祖细胞(例如造血干细胞s(HSC))和其他细胞系的祖/成熟干细胞(即，间充质干细胞,内皮祖细胞,肥大细胞,树突状细胞等)。在一个实施方案中，CD34+细胞为造血祖细胞，例如HSC。
如本文所用，如果miRNA的实时qRT-PCT Ct值低于35，则miRNA在生产型细胞中是“高表达的”。如果miRNA的实时qRT-PCT Ct值大于39，则miRNA以较低的水平表达。如本领域那些技术人员理解的那样，在实时PCR测试中，通过荧光信号的累积来检测阳性反应。Ct(循环阈值)定义为荧光信号跨越阈值(即，超过背景水平)所需的循环数。Ct水平与样品中靶核酸的量呈反比(即，Ct水平越低，则样品中靶核酸的量越高)。39或更高的Ct是表明靶核酸的最低量的弱反应，其中所述的靶核酸代表了感染状态或环境污染。
任何合适的技术都可以用于鉴定在所关注的生产型细胞中高表达而在所关注的CD34+细胞中不表达或以较低的水平表达的miRNA，包括但不限于在以下实例中描述的方法。
在HEK-293和HEK-293-Cre细胞中高表达而在CD34+造血细胞中不表达的示例性miRNA包括但不限于包含以下的RNA序列：
(a)CACUGGUAGA(SEQ ID NO:1)(has-miR183-5p核心)；
(b)UGUGCUUGAUCUAA(SEQ ID NO:2)(has-miR218-5p核心)；以及
(c)CACUAGCACA(SEQ ID NO:3)(miR96-5p核心)。
如以下实例所示，编码miRNA(包含这些miRNA的一个或多个)的靶位点的表达盒在生产型细胞中抑制核酸酶的表达是有效的。如本领域任一技术人员所理解的那样，此类靶位点包含待靶向的miRNA的反向互补序列。在非限定性实例中：
·待靶向的miRNA为5’CACUGGUAGA 3’(SEQ ID NO:1)(has-miR-183-5p核心)；反向互补序列靶位点包含/由5’UCUACCAGUG 3’(SEQ ID NO:4)组成；
·待靶向的miRNA为5’CACUAGCACA 3’(SEQ ID NO:3)(miR-96-5p核心)；反向互补序列靶位点包含/由5’UGUGCUAGUG 3’(SEQ ID NO:5)组成；
·待靶向的miRNA为5’UGUGCUUGAUCUAA 3’(SEQ ID NO:2)(has-miR-218-5p核心)；反向互补序列靶位点包含/由5’UUAGAUCAAGCACA 3’(SEQ ID NO:6)组成；
·待靶向的miRNA为5’UAUGGCACUGGUAGAAUUCACU 3’(SEQ ID NO:14)(has-miR-183-5p)；反向互补序列靶位点包含/由5’AGUGAAUUCUACCAGUGCCAUA 3’(SEQ ID NO:7)组成；
·待靶向的miRNA为5’UUUGGCACUAGCACAUUUUUGCU 3’(SEQ ID NO:73)(miR-96-5p)；反向互补序列靶位点包含/由5’AGCAAAAAUGUGCUAGUGCCAAA 3’(SEQ ID NO:8)组成；
·待靶向的miRNA为5’UUGUGCUUGAUCUAACCAUGU 3’(SEQ ID NO:48)(has-miR-218-5p)；反向互补序列靶位点包含/由5’AGAUGGUUAGAUCAAGCACAA 3’(SEQ ID NO:9)组成。
如本领域那些技术人员所理解的那样，miRNA可以以多种加工形式存在于生产型细胞中，各种形式均包含上文注释的核心序列。因此，在多个其他的实施方案中，靶位点包含或由以下一个或多个序列的反向互补序列(均为5’至3’取向)或它们的组合组成：
miR-hsa-183-5p加工：
UGUAUGGCACUGGUAGAAUU(SEQ ID NO:10)
UGUAUGGCACUGGUAGAAUUCA(SEQ ID NO:11)
UGUAUGGCACUGGUAGAAUUCACU(SEQ ID NO:12)
GUAUGGCACUGGUAGAAUUCACU(SEQ ID NO:13)
UAUGGCACUGGUAGAAUUCACU(SEQ ID NO:14)
UAUGGCACUGGUAGAAUUCACUG(SEQ ID NO:15)
UAUGGCACUGGUAGAAUUCA(SEQ ID NO:16)
UAUGGCACUGGUAGAAUUCAC(SEQ ID NO:17)
UAUGGCACUGGUAGAAUUC(SEQ ID NO:18)
UAUGGCACUGGUAGAAUUCACUGU(SEQ ID NO:19)
UAUGGCACUGGUAGAAUU(SEQ ID NO:20)
UAUGGCACUGGUAGAAU(SEQ ID NO:21)
UAUGGCACUGGUAGAA(SEQ ID NO:22)
UAUGGCACUGGUAGA(SEQ ID NO:23)
AUGGCACUGGUAGAAUUCACU(SEQ ID NO:24)
AUGGCACUGGUAGAAUUCACUG(SEQ ID NO:25)
AUGGCACUGGUAGAAUUCA(SEQ ID NO:26)
AUGGCACUGGUAGAAUUCACUGU(SEQ ID NO:27)
AUGGCACUGGUAGAAUUCAC(SEQ ID NO:28)
AUGGCACUGGUAGAA(SEQ ID NO:29)
AUGGCACUGGUAGAAUU(SEQ ID NO:30)
AUGGCACUGGUAGAAUUC(SEQ ID NO:31)
AUGGCACUGGUAGAAU(SEQ ID NO:32)
UGGCACUGGUAGAAUUCACUG(SEQ ID NO:33)
UGGCACUGGUAGAAUUCAC(SEQ ID NO:34)
CACUGGUAGAAUUCACUG(SEQ ID NO:35)
CACUGGUAGAAUUCA(SEQ ID NO:36)
CACUGGUAGAAUUCAC(SEQ ID NO:37)
CACUGGUAGAAUUCACU(SEQ ID NO:38)
ACUGGUAGAAUUCACU(SEQ ID NO:39)
miR-hsa-218-5p加工：
GUUGUGCUUGAUCUAACCAUGU(SEQ ID NO:40)GUUGUGCUUGAUCUAACCAU(SEQ ID NO:41)
UUGUGCUUGAUCUAACCAUG(SEQ ID NO:42)
UUGUGCUUGAUCUAACCAU(SEQ ID NO:43)
UUGUGCUUGAUCUAACCAUGUGGU(SEQ ID NO:44)UUGUGCUUGAUCUAACCA(SEQ ID NO:45)
UUGUGCUUGAUCUAACCAUGUGG(SEQ ID NO:46)UUGUGCUUGAUCUAAC(SEQ ID NO:47)
UUGUGCUUGAUCUAACCAUGU(SEQ ID NO:48)
UUGUGCUUGAUCUAACC(SEQ ID NO:49)
UUGUGCUUGAUCUAACCAUGUG(SEQ ID NO:50)UUGUGCUUGAUCUAA(SEQ ID NO:51)
UGUGCUUGAUCUAACCAUGU(SEQ ID NO:52)
UGUGCUUGAUCUAACCAUGUG(SEQ ID NO:53)
UGUGCUUGAUCUAACCAUGUGGU(SEQ ID NO:54)
GUGCUUGAUCUAACCAUGU(SEQ ID NO:55)
GUGCUUGAUCUAACCAUGUG(SEQ ID NO:56)
UGCUUGAUCUAACCAUGUG(SEQ ID NO:57)
UGCUUGAUCUAACCAUGU(SEQ ID NO:58)
GCUUGAUCUAACCAUGU(SEQ ID NO:59)
GCUUGAUCUAACCAUG(SEQ ID NO:60)
GCUUGAUCUAACCAU(SEQ ID NO:61)
GCUUGAUCUAACCAUGUGGU(SEQ ID NO:62)
GCUUGAUCUAACCAUGUG(SEQ ID NO:63)
CUUGAUCUAACCAUGU(SEQ ID NO:64)
CUUGAUCUAACCAUGUG(SEQ ID NO:65)
CUUGAUCUAACCAUG(SEQ ID NO:66)
UUGAUCUAACCAUGU(SEQ ID NO:67)
UUGAUCUAACCAUGUG(SEQ ID NO:68)
UUGAUCUAACCAUGUGGU(SEQ ID NO:69)
UUGAUCUAACCAUGUGGUU(SEQ ID NO:70)
UUGAUCUAACCAUGUGG(SEQ ID NO:71)
miR-96-5p加工：
UUUUGGCACUAGCACAUUUUUGCU(SEQ ID NO:72)
UUUGGCACUAGCACAUUUUUGCU(SEQ ID NO:73)
UUUGGCACUAGCACAUUUUUG(SEQ ID NO:74)
UUUGGCACUAGCACAUUUUU(SEQ ID NO:75)
UUUGGCACUAGCACAUUUUUGC(SEQ ID NO:76)
UUUGGCACUAGCACAUUUU(SEQ ID NO:77)
UUUGGCACUAGCACAUUU(SEQ ID NO:78)
UUUGGCACUAGCACA(SEQ ID NO:79)
UUUGGCACUAGCACAUU(SEQ ID NO:80)
UUUGGCACUAGCACAUUUUUGCUU(SEQ ID NO:81)
UUUGGCACUAGCACAU(SEQ ID NO:82)
UUGGCACUAGCACAUUUUUGC(SEQ ID NO:83)
UUGGCACUAGCACAUUUUUGCU(SEQ ID NO:84)
GGCACUAGCACAUUUUUGCU(SEQ ID NO:85)
CACUAGCACAUUUUUGCU(SEQ ID NO:86)
CACUAGCACAUUUUUGC(SEQ ID NO:87)
ACUAGCACAUUUUUG(SEQ ID NO:88)
CUAGCACAUUUUUGCU(SEQ ID NO:89)
CUAGCACAUUUUUGC(SEQ ID NO:90)。
第二编码区可以编码一个或多个miRNA靶位点。因此，在多个实施方案中，第二编码区编码1,2,3,4,5,6或更多的miRNA靶位点(即，所关注的miRNA的反向互补序列)。各个编码的靶位点可以是相同的或不同的。例如所有的靶位点可以是相同的miRNA或相同的miRNA的不同的加工形式。在另一个非限定性实例中，第二编码区可以包含不同miRNA的靶位点；例如包含miR-hsa-183miRNA核心的miRNA的一个或多个靶位点，以及包含miR-hsa-218-5p核心的miRNA的一个或多个靶位点。只要在所述的细胞中，所述的miRNA具有合适的拷贝数，则不同miRNA的靶位点的存在可以使抑制活性的miRNA最多。当在第二编码区编码多于一个的靶位点时，靶位点可以直接相邻，或者可以被可变数量的核苷酸的间隔序列分开。在多个非限定性实例中，间隔序列的长度可以为1-10,2-9,3-8,4-7,或5-6核苷酸。此类间隔序列区可以提供有用的DNA挠性；基于本发明公开，测定编码靶位点之间的间隔序列残基的合适的数量很好地在本领域的技术水平范围内。在多个其他的非限定性实施方案中，第二编码序列可以包含或由选自以下的序列组成：SEQ ID NO:142(miR-183靶位点),SEQ ID NO:143(miR-218靶位点)和SEQ ID NO:144(miR-183/218靶位点)。
在所有的实施方案中，第二编码区位于第一编码区的3’非翻译区，第一编码区的翻译终止密码子下游的至少60个核苷酸处，从而在融合的第一和第二编码区转录后，在miRNA与靶位点(多个)结合时，使mRNA降解的效率最大。第二编码区可以设置于不容易形成二级结构的3’UTR的区域(即，富含AT的区域)中。
第一编码区编码在所关注的CD34+细胞基因组靶物中产生DNA断裂的核酸酶；此类DNA断裂可以为单链断裂或双链断裂。有一些不同的位点特异性核酸内切酶EN平台在所述的基因组中产生位点特异性DNA断裂。一组EN包含DNA结合蛋白质结构域。该组包括具有DNA结合和核酸酶性质的巨核酶，以及其中DNA结合结构域与细菌核酸内切酶FokI融合的锌指核酸酶(ZFN)和转录激活因子样效应器核酸酶(TALEN)。由于通过FokI对DNA的切割需要与DNA每条链结合的2个FokI分子，所以包含FokI的EN的2个亚单元可以通过可切割的肽连接。第二组EN是基于RNA导向的DNA识别，并且使用成簇的规则间隔的短的回文重复序列(CRISPR)/Cas9细菌系统。因此，设计能够在所关注的CD34+细胞基因组靶物中产生DNA断裂的位点特异性EN良好地在本领域的技术水平范围内。非限定性实例在以下实例中提供。
在一个非限定性实施方案中，第一编码区编码靶向人类趋化因子受体5型(CCR5)基因的ZFN，其中所述的第一编码序列包含或由以下序列组成：hCCR5-ZFN
MDYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDKMAPKKKRKVGIHGVPAAMAERPFQCRICMRNFSDRSNLSRHIRTHTGEKPFACDICGRKFAISSNLNSHTKIHTGSQKPFQCRICMRNFSRSDNLARHIRTHTGEKPFACDICGRKFATSGNLTRHTKIHLRGSQLVKSELEEKKSELRHKLKYVPHEYIELIEIARNSTQDRILEMKVMEFFMKVYGYRGKHLGGSRKPDGAIYTVGSPIDYGVIVDTKAYSGGYNLPIGQADEMERYVEENQTRNKHLNPNEWWKVYPSSVTEFKFLFVSGHFKGNYKAQLTRLNHITNCNGAVLSVEELLIGGEMIKAGTLTLEEVRRKFNNGEINFRSGSGEGRGSLLTCGDVEENPGPRMDYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDKMAPKKKRKVGIHGVPAAMAERPFQCRICMRNFSRSDNLSVHIRTHTGEKPFACDICGRKFAQKINLQVHTKIHTGEKPFQCRICMRNFSRSDVLSEHIRTHTGEKPFACDICGRKFAQRNHRTTHTKIHLRGSQLVKSELEEKKSELRHKLKYVPHEYIELIEIARNSTQDRILEMKVMEFFMKVYGYRGKHLGGSRKPDGAIYTVGSPIDYGVIVDTKAYSGGYNLPIGQADEMQRYVKENQTRNKHINPNEWWKVYPSSVTEFKFLFVSGHFKGNYKAQLTRLNHKTNCNGAVLSVEELLIGGEMIKAGTLTLEEVRRKFNNGEINF(SEQ ID NO:91)
在另一个非限定性实施方案中，第一编码区编码靶向人类β-球蛋白基因的ZFN，其中所述的第一编码序列包含或由以下序列组成：TALEN球蛋白
MVYPYDVPDYAELPPKKKRKVGIRIQDLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQHHEALVGHGFTHAHIVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGKQWSGARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQLLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLTPAQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPAQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPAQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPAQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPEQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPEQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPEQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNGGGKQALESIVAQLSRPDPALAALLVKSELEEKKSELRHKLKYVPHEYIELIEIARNPTQDRILEMKVMEFFMKVYGYRGEHLGGSRKPDGAIYTVGSPIDYGVIVDTKAYSGGYNLPIGQADAMQSYVEENQTRNKHINPNEWWKVYPSSVTEFKFLFVSGHFKGNYKAQLTRLNHITNCNGAVLSVEELLIGGEMIKAGTLTLEEVRRKFNNGEINFLDGSGEGRGSLLTCGDVEENPGPVYPYDVPDYAELPPKKKRKVGIRIQDLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQHHEALVGHGFTHAHIVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGKQWSGARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQLLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPAQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPAQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNGGGKQALESIVAQLSRPDPALAALLVKSELEEKKSELRHKLKYVPHEYIELIEIARNPTQDRILEMKVMEFFMKVYGYRGEHLGGSRKPDGAIYTVGSPIDYGVIVDTKAYSGGYNLPIGQAREMQRYVEENQTRNKHINPNEWWKVYPSSVTEFKFLFVSGHFKGNYKAQLTRLNHITNCNGAVLSVEELLIGGEMIKAGTLTLEEVRRKFNNGEINFLD(SEQ ID NO:92)
在另一个非限定性实施方案中，第一编码区编码靶向猴趋化因子受体5型(CCR5)基因的ZFN，其中所述的第一编码序列包含或由以下序列组成：Monkey ZFN-CCR5
MDYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDKMAPKKKRKVGIHGVPAAMAERPFQCRICMRNFSRSDNLSVHIRTHTGEKPFACDICGRKFAANHHRINHTKIHTGSQKPFQCRICMRNFSDRSDLSRHIRTHTGEKPFACDICGRKFARSDHLSRHTKIHTGSQKPFQCRICMRNFSQSGNLARHIRTHTGEKPFACDICGRKFAQRNDRKSHTKIHLRGSQLVKSELEEKKSELRHKLKYVPHEYIELIEIARNSTQDRILEMKVMEFFMKVYGYRGKHLGGSRKPDGAIYTVGSPIDYGVIVDTKAYSGGYNLPIGQADEMERYVEENQTRDKHLNPNEWWKVYPSSVTEFKFLFVSGHFKGNYKAQLTRLNHITNCNGAVLSVEELLIGGEMIKAGTLTLEEVRRKFNNGEINFRSGSGEGRGSLLTCGDVEENPGPRMDYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDKMAPKKKRKVGIHGVPAAMAERPFQCRICMRNFSRSDHLSQHIRTHTGEKPFACDICGRKFATSANRTTHTKIHTGSQKPFQCRICMRNFSERGTLARHIRTHTGEKPFACDICGRKFAQSSDLRRHTKIHTGSQKPFQCRICMRNFSQSSDLSRHIRTHTGEKPFACDICGRKFACRSNLKKHTKIHLRGSQLVKSELEEKKSELRHKLKYVPHEYIELIEIARNSTQDRILEMKVMEFFMKVYGYRGKHLGGSRKPDGAIYTVGSPIDYGVIVDTKAYSGGYNLPIGQADEMQRYVKENQTRNKHINPNEWWKVYPSSVTEFKFLFVSGHFKGNYKAQLTRLNRKTNCNGAVLSVEELLIGGEMIKAGTLTLEEVRRKFNNGEINF(SEQ ID NO:93)
如本领域那些技术人员所理解的那样，所设计的位点特异性EN可以靶向所关注的任何CD34+基因组靶物。在多个非限定性实施方案中，核酸酶在CD34+细胞基因组靶物中能够产生DNA断裂，其中所述的靶物选自编码CCR5,β-球蛋白,补体受体2(CR2)(人类疱疹病毒(EBV)受体),Niemann-Pick病,C1型受体((NPC1)埃博拉病毒受体),血管紧张素转化酶2受体((ACE2)SARS受体)的基因，以及编码如果误叠能够导致溶酶体贮积症的蛋白质的基因。
在另一个实施方案中，第一编码区可以编码经修饰允许在体内进行缩减表达的核酸酶。在一个实施方案中，第一编码区编码核酸酶与PEST肽的融合物，即，富含脯氨酸、谷氨酸、丝氨酸和苏氨酸的肽序列，所述的融合物起到蛋白质降解的信号肽的作用。在一个实施方案中，可以使用编码鸟氨酸脱羧酶(mODC)(残基422–461)的PEST氨基酸序列的序列(FPPEVEEQDDGTLPMSCAQEGMDR)(SEQ ID NO:102)，例如在本发明公开的核酸酶的任何实施方案的N-末端。
在另一个实施方案中，第一编码区编码核酸酶和FRB*结构域(SEQ ID NO:106)的融合物，例如在本发明公开的核酸酶的任何实施方案的N-末端。
纳巴霉素与FKBP12结合，从而形成抑制FKBP12-纳巴霉素相关蛋白质(FRAP)的复合物。FRAP内足以用于FKBP12-纳巴霉素结合的最小区域为称为FRB(FKBP-纳巴霉素结合)的89个氨基酸结构域。具有T2098L取代(FRB*)的FRB的突变形式使得融合蛋白质降解。在使用纳巴霉素募集FKBP12时，融合蛋白质是热力学稳定的，并且靶蛋白的活性得以恢复。因此，可以控制核酸酶表达的时期。
在另一个实施方案中，TALEN DNA识别序列可以在框内与TALENORF的N-末端融合。当在CD34+细胞中表达核酸酶时，其在所述的载体的内部切割其自身基因，由此使核酸酶失活。由于在293细胞中TALEN表达通过miRNA调节而被抑制，所以这种情况在DH-Ad生产中不会发生。此类序列如下所示：
MGHPHPDKLQKGGGSGGGSGGGSDYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDKMAPKKKRKVGIHGVPAAMAERPFQCRICMRNFSDRSNLSRHIRTHTGEKPFACDICGRKFAISSNLNSHTKIHTGSQKPFQCRICMRNFSRSDNLARHIRTHTGEKPFACDICGRKFATSGNLTRHTKIHLRGSQLVKSELEEKKSELRHKLKYVPHEYIELIEIARNSTQDRILEMKVMEFFMKVYGYRGKHLGGSRKPDGAIYTVGSPIDYGVIVDTKAYSGGYNLPIGQADEMERYVEENQTRNKHLNPNEWWKVYPSSVTEFKFLFVSGHFKGNYKAQLTRLNHITNCNGAVLSVEELLIGGEMIKAGTLTLEEVRRKFNNGEINFRSGSGEGRGSLLTCGDVEENPGPRMDYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDKMAPKKKRKVGIHGVPAAMAERPFQCRICMRNFSRSDNLSVHIRTHTGEKPFACDICGRKFAQKINLQVHTKIHTGEKPFQCRICMRNFSRSDVLSEHIRTHTGEKPFACDICGRKFAQRNHRTTHTKIHLRGSQLVKSELEEKKSELRHKLKYVPHEYIELIEIARNSTQDRILEMKVMEFFMKVYGYRGKHLGGSRKPDGAIYTVGSPIDYGVIVDTKAYSGGYNLPIGQADEMQRYVKENQTRNKHINPNEWWKVYPSSVTEFKFLFVSGHFKGNYKAQLTRLNHKTNCNGAVLSVEELLIGGEMIKAGTLTLEEVRRKFNNGEINF(SEQ ID NO:103)
第一编码区和第二编码区所得物的转录受到单一启动子的控制，并得到融合的RNA表达产物。因此，第一编码区和第二编码区可以在它们之间具有任何合适长度的核酸连接体序列，只要所述的连接体序列不包含转录终止多腺苷酸信号。
如本领域那些技术人员理解的那样，HD-Ad载体的插入容量为30kb，其允许容纳多个第一核酸模块(并由此容纳多个第一和第二编码区)，其可以用于例如生成在CD34+细胞中能够同时编辑多个靶基因的HD-Ad以用于基因治疗，或者建立相关的模型以用于多基因人类疾病。
第一和第二编码区的各编码区均可以可操作地连接在CD34+细胞中具有活性的启动子。如本文所用，术语“可操作地连接”是指元件的排列，其中启动子发挥允许第一编码区和第二编码区表达的作用(与启动子与表达盒上编码区之间的距离无关)。可以使用在CD34+细胞中具有活性的任何启动子。在多个非限定性实施方案中，启动子选自EF1α启动子,磷酸甘油酸激酶(PGK)1启动子和泛素基因启动子。在一个实施方案中，启动子在生产型细胞中也具有活性。
在多个其他的实施方案中，驱动第一核酸模块表达的启动子包含或由核酸序列组成，其中所述的核酸序列选自以下所示的序列。
PGK
CACGGGGTTGGGGTTGCGCCTTTTCCAAGGCAGCCCTGGGTTTGCGCAGGGACGCGGCTGCTCTGGGCGTGGTTCCGGGAAACGCAGCGGCGCCGACCCTGGGTCTCGCACATTCTTCACGTCCGTTCGCAGCGTCACCCGGATCTTCGCCGCTACCCTTGTGGGCCCCCCGGCGACGCTTCCTGCTCCGCCCCTAAGTCGGGAAGGTTCCTTGCGGTTCGCGGCGTGCCGGACGTGACAAACGGAAGCCGCACGTCTCACTAGTACCCTCGCAGACGGACAGCGCCAGGGAGCAATGGCAGCGCGCCGACCGCGATGGGCTGTGGCCAATAGCGGCTGCTCAGCGGGGCGCGCCGAGAGCAGCGGCCGGGAAGGGGCGGTGCGGGAGGCGGGGTGTGGGGCGGTAGTGTGGGCCCTGTTCCTGCCCGCGCGGTGTTCCGCATTCTGCAAGCCTCCGGAGCGCACGTCGGCAGTCGGCTCCCTCGTTGACCGAATCACCGACCTCTCTCCCCA(SEQ ID NO:145)
EF1A
GAGTAATTCATACAAAAGGACTCGCCCCTGCCTTGGGGAATCCCAGGGACCGTCGTTAAACTCCCACTAACGTAGAACCCAGAGATCGCTGCGTTCCCGCCCCCTCACCCGCCCGCTCTCGTCATCACTGAGGTGGAGAAGAGCATGCGTGAGGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTGCGTGCCTTGAATTACTTCCACGCCCCTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCTTGCGCTTAAGGAGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCGCTGGGGCCGCCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAAGTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACGCTTTTTTTCTGGCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGGTATTTCGGTTTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTCGGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTCTCAAGCTCGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATCGCCCCGCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGAAAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGCTCAAAATGGAGGACGCGGCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTTTCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCGGGCGCCGTCCAGGCACCTCGATTAGTTCTCGAGCTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGGTTGGGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTGGGTGGAGACTGAAGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGA(SEQ ID NO:146)
泛素基因启动子:
AAGTTTCCAGAGCTTTCGAGGAAGGTTTCTTCAACTCAAATTCATCCGCCTGATAATTTTCTTATATTTTCCTAAAGAAGGAAGAGAAGCGCATAGAGGAGAAGGGAAATAATTTTTTAGGAGCCTTTCTTACGGCTATGAGGAATTTGGGGCTCAGTTGAAAAGCCTAAACTGCCTCTCGGGAGGTTGGGCGCGGCGAACTACTTTCAGCGGCGCACGGAGACGGCGTCTACGTGAGGGGTGATAAGTGACGCAACACTCGTTGCATAAATTTGCgCTCCGCCAGCCCGGAGCATTTAGGGGCGGTTGGCTTTGTTGGGTGAGCTTGTTTGTGTCCCTGTGGGTGGACGTGGTTGGTGATTGGCAGGATCCTGGTATCCGCTACAG(SEQ ID NO:104)
在其中多于一个第一核酸模块的实施方案中，各个模块可以与不同的启动子可操作地连接，只要启动子在生产型细胞和CD34+细胞中具有活性即可。
由此衍生的盒或载体可以包含编码结合CD46腺病毒纤维多肽的第二核酸模块。在所述的盒上无需启动子驱动第二核酸模块的表达；相反，在辅助细胞中生产DH-Ad时，在辅助病毒中表达由腺病毒主要晚期启动子驱动。
如本文所用，术语“纤维多肽”是指包含以下部分的多肽：
(a)N-末端尾结构域或其等价物，其与衣壳的五邻体基体蛋白质相
互作用，并包含用于将蛋白质输送至细胞核所需的信号；
(b)一个或多个柄结构域或其等价物；以及
(c)包含用于受体结合的决定物的C-末端钮结构域或其等价物。
自发组装成同源三聚体的纤维多肽称为“纤维”，其位于衣壳的十二个定点的各个定点基部的腺病毒病毒粒子的外侧。如本文所用，术语“纤维”是指由3个单独的纤维多肽组成的同源三聚体的蛋白质结构。腺病毒纤维介导了与靶宿主细胞结合和内含至靶宿主细胞中。
如本文所用，术语“纤维钮”是指纤维多肽的C-末端结构域，其中所述的纤维多肽能够形成与结合CD46的同源三聚体。纤维蛋白质的C-末端部分可以三聚化，并形成与结合CD46的纤维结构。仅需要纤维钮用于CD46-靶向。因此，第二核酸模块编码腺病毒纤维，其包含与结合CD46的一个或多个人类腺病毒钮结构域或其等价物。当多个钮结构域被编码时，钮结构域可以是相同的或不同的，只要它们与CD46结合即可。如本文所用，钮结构域“功能等价物”为具有一个或多个氨基酸删除、取代或加入的钮结构域，其保持与CD34+细胞表面上的CD46结合。可以根据本领域从业者公知的方法来测定同源三聚体的型。例如可以通过包括在蔗糖梯度中的沉降、对胰蛋白酶水解的抗性和在聚丙烯酰胺凝胶中的电泳淌度的标准来评估纤维钮蛋白质的三聚作用(Hong and Engler,Journal of Virology 70:7071-7078(1996))。关于电泳淌度，纤维钮结构域同源三聚体是极稳定的复合物，并且在与SDS-PAGE之前样品未沸腾(boil)时的三聚体分子量一致的分子量下运行。然而，在固定时，三聚体的结构被破坏，并且蛋白质随后在与蛋白质单体一致的大小下运行。如Wang,H.,et al.,Journal of Virology 81:12785-12792(2007)所述，还可以使用兔多克隆抗-His6-HRP抗体来测定纤维钮蛋白质的三聚作用。
在多个实施方案中，钮结构域选自Ad11钮结构域,Ad16钮结构域,Ad21钮结构域,Ad35钮结构域,Ad50钮结构域和它们的功能等价物。
在多个其他的实施方案中，钮结构域包含或由以下的或其功能等价物的一个或多个的氨基酸序列组成。
Ad11：
WTGVNPTEANCQIMNSSESNDCKLILTLVKTGALVTAFVYVIGVSNNFNMLTTHRNINFTAELFFDSTGNLLTRLSSLKTPLNHKSGQNMATGAITNAKGFMPSTTAYPFNDNSREKENYIYGTCYYTASDRTAFPIDISVMLNRRAINDETSYCIRITWSWNTGDAPEVQTSATTLVTSPFTFYYIREDD(SEQ ID NO:94)；
Ad16：
WTGAKPSANCVIKEGEDSPDCKLTLVLVKNGGLINGYITLMGASEYTNTLFKNNQVTIDVNLAFDNTGQIITYLSSLKSNLNFKDNQNMATGTITSAKGFMPSTTAYPFITYATETLNEDYIYGECYYKSTNGTLFPLKVTVTLNRRMLASGMAYAMNFSWSLNAEEAPETTEVTLITSPFFFSYIREDD(SEQ ID NO:95)；
AD21：
WTGIKPPPNCQIVENTDTNDGKLTLVLVKNGGLVNGYVSLVGVSDTVNQMFTQKSATIQLRLYFDSSGNLLTDESNLKIPLKNKSSTATSEAATSSKAFMPSTTAYPFNTTTRDSENYIHGICYYMTSYDRSLVPLNISIMLNSRTISSNVAYAIQFEWNLNAKESPESNIATLTTSPFFFSYIREDDN(SEQ ID NO:96)；AD35：
WTGINPPPNCQIVENTNTNDGKLTLVLVKNGGLVNGYVSLVGVSDTVNQMFTQKTANIQLRLYFDSSGNLLTDESDLKIPLKNKSSTATSETVASSKAFMPSTTAYPFNTTTRDSENYIHGICYYMTSYDRSLFPLNISIMLNSRMISSNVAYAIQFEWNLNASESPESNIATLTTSPFFFSYITEDDN(SEQ ID NO:97)；以及
AD50：
WTGIKPPPNCQIVENTDTNDGKLTLVLVKNGGLVNGYVSLVGVSDTVNQMFTQKSATIQLRLYFDSSGNLLTDESNLKIPLKNKSSTATSEAATSSKAFMPSTTAYPFNTTTRDSENYIHGICYYMTSYDRSLVPLNISIMLNSRTISSNVAYAIQFEWNLNAKESPESNIATLTTSPFFFSYIREDDN(SEQ ID NO:98)
在另一个实施方案中，腺病毒钮结构域包含SEQ ID NO:100的氨基酸序列，其显示具有改善的CD46的结合容量(参见美国专利No.8,753,639)。
WT AD35：
WTGINPPPNCQIVENTNTNDGKLTLVLVKNGGLVNGYVSLVGVSDTVNQMFTQKTANIQLRLYFDSSGNLLTD/GESDLKIPLKNKSSTATSETVASSKAFMPSTTAYPFNTT/ATRDSENYIHGI/LCYYMTSYDRSLFPLNISIMLNSRMISSNVAYAIQFEWNLNASESPESNIATLTTSPFFFSYITEDDN(SEQ IDNO:99,101(WILD TYPE AD35KNOB),SEQ ID NO:100(MUTANT AD35KNOB))。
在另一个实施方案中，第二核酸模块编码腺病毒纤维多肽，其包含一个或多个人类腺病毒柄结构域或其功能等价物。由于柄结构域对于CD46的结合是不重要的，所以柄结构域可以衍生自任何腺病毒血清型。由此，一个或多个柄结构域可以包含或由得自人类腺病毒血清型1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,它们的组合或它们的功能等价物的一个或多个柄结构域组成。如本文所用，柄结构域的“功能等价物”为允许纤维钮三聚作用的柄结构域或其突变体的任何部分。
在一个实施方案中，各个柄结构域或柄结构域基元选自Ad5柄结构域,Ad11柄结构域,Ad16柄结构域,Ad21柄结构域,Ad35柄结构域,Ad50柄结构域以及它们的功能等价物、它们的组合和它们的功能等价物。需要柄结构域用于纤维钮的三聚作用，需要纤维钮三聚作用用于结合CD46。此类等价物可以由本领域那些技术人员容易地测定。例如使用包含动员的重组CD46的传感器进行的表面等离子体共振(SPR)可以用于确定待评估的重组多肽是否与CD46结合，并结合CD46的竞争研究。
柄结构域可以包含任何数量(例如1至22)的柄结构域或其等价物。因此，在多个实施方案中，柄结构域包含1-22,1-21,1-20,1-19,1-18,1-17,1-16,1-15,1-14,1-13,1-12,1-11,1-10,1-9,1-8,1-7,1-6,1-5,1-4,1-3,1-2,2-22,2-21,2-20,2-19,2-18,2-17,2-16,2-15,2-14,2-13,2-12,2-11,2-10,2-9,2-8,2-7,2-6,2-5,2-4,2-3,3-22,3-21,3-20,3-19,3-18,3-17,3-16,3-15,3-14,3-13,3-12,3-11,3-10,3-9,3-8,3-7,3-6,3-5,3-4,4-22,4-21,4-20,4-19,4-18,4-17,4-16,4-15,4-14,4-13,4-12,4-11,4-10,4-9,4-8,4-7,4-6,4-5,5-22,5-21,5-20,5-19,5-18,5-17,5-16,5-15,5-14,5-13,5-12,5-11,5-10,5-9,5-8,5-7,5-6,6-22,6-21,6-20,6-19,6-18,6-17,6-16,6-15,6-14,6-13,6-12,6-11,6-10,6-9,6-8,6-7,7-22,7-21,7-20,7-19,7-18,7-17,7-16,7-15,7-14,7-13,7-12,7-11,7-10,7-9,7-8,8-22,8-21,8-20,8-19,8-18,8-17,8-16,8-15,8-14,8-13,8-12,8-11,8-10,8-9,9-22,9-21,9-20,9-19,9-18,9-17,9-16,9-15,9-14,9-13,9-12,9-11,9-10,10-22,10-21,10-20,10-19,10-18,10-17,10-16,10-15,10-14,10-13,10-12,10-11,11-22,11-21,11-20,11-19,11-18,11-17,11-16,11-15,11-14,11-13,11-12,12-22,12-21,12-20,12-19,12-18,12-17,12-16,12-15,12-14,12-13,13-22,13-21,13-20,13-19,13-18,13-17,13-16,13-15,13-14,14-22,14-21,14-20,14-19,14-18,14-17,14-16,14-15,15-22,15-21,15-20,15-19,15-18,15-17,15-16,16-22,16-21,16-20,16-19,16-18,16-17,17-22,17-21,17-20,17-19,17-18,18-22,18-21,18-20,18-19,19-22,19-21,19-20,20-22,20-21,21-22,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21或22个柄结构域或其等价物。在存在多于1个柄结构域或其等价物的情况下，各个柄结构域或其等价物可以是一致的，或者一个或多个拷贝的柄结构域或其等价物在单一的重组多肽中可以是不同的。在一个实施方案中，所述的盒编码单一的柄结构域或其等价物。
在另一个实施方案中，一个或多个柄结构域包含选自以下的、它们的组合或它们的等价物的氨基酸序列。
Ad11P fiber,
NGVLTLKCLTPLTTTGGSLQLKVGGGLTVDDTNGFLKENISATTPLVKTGHSIGLPLGAGLGTNENKLCIKLGQGLTFNSNNICIDDNINTL(SEQ ID NO:118)；
AD16,
DGVLTLKCVNPLTTASGPLQLKVGSSLTVDTIDGSLEENITAAAPLTKTNHSIGLLIGSGLQTKDDKLCLSLGDGLVTKDDKLCLSLGDGLITKNDVLCAKLGHGLVFDSSNAITIENNTL(SEQ ID NO:119)；
AD21,
DGVLTLNCLTPLTTTGGPLQLKVGGGLIVDDTDGTLQENIRATAPITKNNHSVELSIGNGLETQNNKLCAKLGNGLKFNNGDICIKDSINTL(SEQ ID NO:120)；
AD35,
DGVLTLKCLTPLTTTGGSLQLKVGGGLTVDDTDGTLQENIRATAPITKNNHSVELSIGNGLETQNNKLCAKLGNGLKFNNGDICIKDSINTL(SEQ ID NO:121)；
AD50,
DGVLTLNCLTPLTTTGGPLQLKVGGGLIVDDTDGTLQENIRVTAPITKNNHSVELSIGNGLETQNNKLCAKLGNGLKFNNGDICIKDSINTL(SEQ ID NO:122)；以及
AD5
PGVLSLRLSEPLVTSNGMLALKMGNGLSLDEAGNLTSQNVTTVSPPLKKTKSNINLEISAPLTVTSEALTVAAAAPLMVAGNTLTMQSQAPLTVHDSKLSIATQGPLTVSEGKLALQTSGPLTTTDSSTLTITASPPLTTATGSLGIDLKEPIYTQNGKLGLKYGAPLHVTDDLNTLTVATGPGVTINNTSLQTKVTGALGFDSQGNMQLNVAGGLRIDSQNRRLILDVSYPFDAQNQLNLRLGQGPLFINSAHNLDINYNKGLYLFTASNNSKKLEVNLSTAKGLMFDATAIAINAGDGLEFGSPNAPNTNPLKTKIGHGLEFDSNKAMVPKLGTGLSFDSTGAITVGNKNNDKLTL(SEQ ID NO:105)。
在另一个实施方案中，一个或多个(或所有)柄结构域或其等价物包含或由根据SEQ ID NO 123或SEQ ID NO:124-129的氨基酸序列组成，其中SEQ ID NO 123如下：
GVL(T/S)LKC(L/V)(T/N)PLTT(T/A)(G/S)GSLQLKVG(G/S)GLTVD(D/T)T(D/N)G(T/F/S)L(Q/K/E)ENI(G/S/K)(A/V)(T/N)TPL(V/T)K(T/S)(G/N)HSI(G/N)L(S/P)(L/I)G(A/P/N)GL(G/Q)(T/I)(D/E)(E/Q)NKLC(T/S/A)KLG(E/Q/N)GLTF(N/D)S(N/S)N(I/S)(C/I)(I/A)(D/N/L)(D/K)N(I/--)NTL；并且
SEQ ID NO:124-129如下：
Ad3柄结构域基元：NSIALKNNTL SEQ ID NO:124
Ad7柄结构域基元：NSNNICINDNINTL SEQ ID NO:125
Ad5柄结构域基元：GAITVGNKNNDKLTL SEQ ID NO:126
Ad11柄结构域基元：NSNNICIDDNINTL SEQ ID NO:127
Ad14柄结构域基元：NSNNICIDDNINTL SEQ ID NO:128
Ad35柄结构域基元：GDICIKDSINTL SEQ ID NO:129。
在本文所示的该序列和其他可变序列中，可变残基以可变注释，而“-”表示该残基可以缺省。
在另一个实施方案中，一个或多个(或所有)柄结构域或其等价物包含或由根据SEQ ID NO 130或SEQ ID NO:SEQ ID NO:124-129的氨基酸序列组成，其中SEQ ID NO 130如下：
GVLTLKCLTPLTTTGGSLQLKVGGGLT(V/I)DDTDG(T/F)L(Q/K)ENI(G/S)ATTPLVKTGHSIGL(S/P)LG(A/P)GLGT(D/N)ENKLC(T/A)KLG(E/Q)GLTFNSNNICI(D/N)DNINTL。
在另一个实施方案中，在重组多肽中的一个或多个(或所有)柄结构域或柄结构域基元包含或由选自以下的氨基酸序列组成：SEQ ID NO:152(Ad3),SEQ ID NO:153(Ad7),SEQ ID NO:154(Ad11),SEQ ID NO:155(Ad14),SEQ ID NO:156(Ad14a)和SEQ ID NO:124-129。
在另一个实施方案中，第二核酸模块编码腺病毒纤维多肽，其包含人类腺病毒尾结构域或其等价物。如本文所用，腺病毒尾结构域的功能等价物为突变体，该突变体保持与衣壳的五邻体基体蛋白质(在辅助病毒Ad病毒)相互接触的能力，并包含用于将蛋白质输送至细胞核所需的信号。所用的尾结构域为与辅助病毒Ad病毒的五邻体基体蛋白质相互接触的尾结构域，其中所述的衣壳用于HD-Ad的生产。因此，如果使用Ad5辅助病毒，则尾结构域衍生自Ad5；如果使用Ad35辅助病毒，则尾结构域得自Ad35等。
在一个实施方案中，尾结构域选自Ad11尾结构域,Ad16尾结构域,Ad21尾结构域,Ad35尾结构域,Ad50尾结构域及其功能等价物。在另一个实施方案中，尾结构域包含以下蛋白质的任意一个的氨基酸序列：
Ad11P
MTKRVRLSDSFNPVYPYEDESTSQHPFINPGFISPNGFTQSP(SEQ ID NO:131)；
AD16
MAKRARLSSSFNPVYPYEDESSSQHPFINPGFISSNGFAQSP(SEQ ID NO:132)；
AD21
MTKRVRLSDSFNPVYPYEDESTSQHPFINPGFISPNGFTQSP(SEQ ID NO:131)；
AD35
MTKRVRLSDSFNPVYPYEDESTSQHPFINPGFISPNGFTQSP(SEQ ID NO:131)；
AD50
MTKRVRLSDSFNPVYPYEDESTSQHPFINPGFISPNGFTQSP(SEQ ID NO:131)。
所述的盒或由其衍生的载体可以在重组核酸载体的各个末端包含反向末端重复序列(ITR)，其中所述的ITR衍生自结合CD46腺病毒血清型，其有助于在单链HD-Ad病毒DNA通过宿主细胞DNA聚合酶复合物转变成双链DNA后在核内形成多联体。ITR的长度通常为大约100-150个核苷酸。因此，在一个实施方案中，ITR得自Ad11,Ad16,Ad21,Ad35和Ad50。在另一个实施方案中，ITR包含或由以下序列的一条序列组成：
AD11P,编号NC_011202
5’ITR:
CATCATCAATAATATACCTTATAGATGGAATGGTGCCAATATGTAAATGAGGTGATTTTAAAAAGTGTGGATCGTGTGGTGATTGGCTGTGGGGTTAACGGCTAAAAGGGGCGGTGCGACCGTGGGAAAATGACGTT(SEQ ID NO:133)；
AD16,编号AY601636
5’ITR
CATTATCTATAATATACCTTATAGATGGAATGGTGCCAACATGTAAATGAGGTAATTTAAAAAAGTGCGCGCTGTGTGGTGATTGGCTGCGGGGTGAACGGCTAAAAGGGGCGG(SEQ ID NO:134)；
AD21,编号KF528688
5’ITR
TATTATATAATATACCTTATAGATGGAATGGTGCCAATATGCAAATGAGGTAATTTAAAAAAGTGCGCGCTGTGTGGTGATTGGCTGCGGGGTGAACGGCTAAAAGGGGCGG(SEQ ID NO:135)；
AD35,编号AC_000019
5’ITR
CATCATCAATAATATACCTTATAGATGGAATGGTGCCAATATGTAAATGAGGTGATTTTAAAAAGTGTGGGCCGTGTGGTGATTGGCTGTGGGGTTAACGGTTAAAAGGGGCGGCGCGGCCGTGGGAAAATGACGTT(SEQ ID NO:136)；AND
AD50,编号AY737798
5’ITR
CAATCAATATAATATACCTTATAGATGGAATGGTGCCAATATGTAAATGAGGTAATTTAAAAAAGTGCGCGCTGTGTGGTGATTGGCTGCGGGGTGAACGGCTAAAAGGGGCGG(SEQ ID NO:137).
所述的盒或由此衍生的载体可以包含得自结合CD46腺病毒血清型的包装信号。因此，在一个实施方案中，包装信号得自Ad11,Ad16,Ad21,Ad35或Ad50。在另一个实施方案中，包装信号包含或由以下序列的一个序列组成：(SEQ ID NO:139-141)，其中SEQ ID NO:139为Ad5包装信号，SEQ ID NO:140为Ad35包装信号，而SEQ ID NO:141为AD5/35包装信号的共同序列。
在另一个实施方案中，包装信号的侧翼为核酸切割信号，包括但不限于loxP位点(使用Cre重组酶)或ftr位点(使用Flp重组酶)。该实施方案有利于基于例如在共感染过程中Cre-或Flp-重组酶-介导的包装信号(侧翼为loxP位点)的切割而除去HD载体制备物的辅助病毒。
本发明的盒以及由其衍生的生产型载体特别用于辅助病毒依赖性腺病毒(HD Ad)的生产，其可以用于基因治疗。在一个实施方案中，所述的盒不编码其他的腺病毒蛋白质，这对于基因治疗应用而言是最佳的，从而避免了在给予基因治疗的患者后的Hd Ad的传播，以及任何其他潜在的毒性问题。
在另一个实施方案中，所述的盒或由其衍生的载体可以进一步包含与在CD34+细胞中具有活性的启动子可操作地连接的转基因。可以使用任何合适的启动子，例如本文所述的那些。该实施方案允许使用所述的盒或由其衍生的载体作为基因治疗的媒介物。HD-Ad载体的插入容量为30kb，其允许容纳多个EN和同源供体模板。这对于为了基因治疗而在HSC中同时编辑多个基因或者建立用于多基因人类疾病的相关模型而言是重要的。在该实施方案中，核酸酶在所关注的CD34+细胞基因组靶物中创造了DNA断裂，从而允许转基因基因组的整合。
在一个实施方案中，第一重组位点和第二重组位点位于转基因的侧翼，其中所述的第一重组位点和第二重组位点靶向CD34+细胞基因组DNA中的位点，其中所述的基因组DNA位于用于转基因的所需的插入位点的侧翼。因此，标准的同源重组技术可以用于所关注的转基因(多个)的基因组整合。基于所关注的基因组靶位点来测定将在所述的盒中使用的合适的重组位点很好地在本领域那是技术人员的水平范围内。
所述的盒或由此衍生的载体的长度优选为至少28kb，并且长度可以为28-35kb。任何合适的核酸序列都可以用作“填充物”序列，如本领域那些技术人员已知的那样。在一个非限定性实施方案中，填充物DNA可以包含碱基错配的人类X-染色体DNA。
所述的核酸盒可以为任何DNA或RNA，并且可以使用标准的分子生物学技术，基于本文的教导而制备和分离。所述的核酸可以包含用于促进所述的盒的表达和/或纯化的其他的结构域。
在另一个方面中，本发明提供了包含本发明的核酸盒的重组核酸载体。可以使用任何合适的载体，包括但不限于质粒载体。在一些实施方案中，所述的载体为穿梭载体(例如穿梭质粒)，其包含所述的HD-Ad基因组的一部分(即，至少第一核酸模块，以及还包含可任选的第二核酸模块和转基因(多个))。此类穿梭载体可以用于生产大量的核酸载体，然后其可以用于将表达盒的所需的区域亚克隆至生产型载体中。在一个实施方案中，穿梭载体包含第一核酸模块，其随后可以克隆至生产型载体中，所述的生产型载体包含第二核酸模块、ITR、填充物序列、包装信号和/或转基因(多个)。在另一个实施方案中，穿梭载体包含第一和第二核酸模块，其随后可以克隆至包含ITR、填充物序列、包装信号和/或转基因(多个)的生产型载体中。在另一个实施方案中，穿梭载体包含第一和第二核酸模块，以及转基因(多个)，其随后可以克隆至包含ITR、填充物序列和包装信号的生产型载体中。基于本发明的教导，合适的穿梭载体和生产型载体(例如质粒载体)的选择良好地在本领域那些技术人员的水平范围内。
在另一个方面中，本发明提供了重组宿主细胞，其包含本发明的任何实施方案的或实施方案的组合的表达盒。重组宿主细胞可以为其中所述的盒可以表达的任何合适的宿主细胞，并且优选为本文所述的生产型细胞，包括但不限于人胚肾(HEK)293细胞,HEK 293-Cre细胞,PerC6细胞,HCT116细胞等。在一个实施方案中，生产型细胞为HEK293细胞或HEK293-Cre细胞。重组宿主细胞可以生产miRNA，所述的盒所编码的miRNA可以与上述miRNA结合。
在另一个实施方案中，宿主细胞进一步包含辅助病毒腺病毒。本发明的HD-Ad载体的生长取决于生产型细胞与辅助病毒Ad载体的共转染，这提供了所有所需的反式的(intrans)Ad蛋白质(即，除了E1和E2区域编码的蛋白质以外的所有病毒蛋白质)，并且还提供了所述的盒上Ad纤维多肽基因表达所需的腺病毒启动子序列(即，Ad主要晚期启动子)。用于生产辅助病毒依赖性腺病毒的辅助病毒腺病毒的使用可在本领域中良好地了解(例如参见Kochanek,S.,G.Schiedner,and C.Volpers.2001.Curr Opin Mol Ther 3:454-463)。在一个实施方案中，在将包含转基因的表达盒克隆至HD-Ad生产型质粒中后，构建体线性化，并转染至HD-Ad生产型细胞的细胞中，其随后被辅助病毒感染。在合适的多个(例如3个)系列预扩增步骤之后，在悬浮培养物中进行大规模的HD-Ad生产。就纯化而言，使用超速离心法，通过氯化铯梯度来分离病毒。
因此，在另一个方面中，本发明提供了用于制备本发明的HD-Ad病毒的方法，其包括在适用于促进表达盒上的基因表达并且辅助病毒腺病毒足以组装辅助病毒依赖性腺病毒的条件下，培养被辅助病毒腺病毒转导的本发明的重组宿主细胞。基于本发明公开，测定用于培养本发明的重组宿主细胞以促进表达盒上基因的表达并且辅助病毒腺病毒足以组装辅助病毒依赖性腺病毒的合适的条件，良好地在本领域那些技术人员的水平范围内。可以使用任何合适的技术来除去HD载体制备物中的辅助病毒。在以下实例中提供了非限定性示例性条件。在一个实施方案中，其中在所述的盒包含位于包装位点侧翼的loxP切割信号的情况下，分离可以包括使用在共感染过程中，包装信号(由loxP位点位于侧翼)的Cre-重组酶-介导的切割。在该实施方案中，可以在表达Cre重组酶的细胞(例如293-Cre)细胞中进行HD-Ad的扩增。
在另一个方面中，本发明提供了重组辅助病毒依赖性腺病毒，其包含本发明的任何实施方案的或实施方案的组合的表达盒作为基因组。可以使用任何合适的方法，包括本文所公开的那些，来制备重组辅助病毒依赖性腺病毒。
在另一个方面中，本发明提供了用于造血细胞基因治疗的方法，其包括使用本发明的任何实施方案的或实施方案的组合的重组辅助细胞依赖性Ad病毒将由骨髓动员得到的造血细胞在体内转导至需要造血细胞基因治疗的受试对象的外周血中，其中所述的核酸酶靶向待破坏的造血细胞基因组基因，其中造血细胞基因组基因的破坏为受试对象提供了治疗益处。
本发明人研发出基于将由骨髓得到的CD34+造血细胞(例如造血干细胞(HSC))动员至外周血流中并给予(例如通过静脉内注射)本发明的任何实施方案的或实施方案的组合的辅助病毒依赖性腺病毒载体来用于HSC基因编辑/治疗的新的体内方法。用于本发明的Hd-Ad载体的细胞受体为CD46，其为在人类HSC上以高水平均匀表达的蛋白质。所述的方法得到动员的CD34+细胞的Hd-Ad转导，转导的CD34+细胞重新收留在骨髓中，以及转导细胞(例如HSC)长期持续地作为所有血细胞系来源。
用于EN基因传递至HSC的本发明的HD-Ad载体平台具有超过其他传递系统的主要益处。i)其允许对具有较低的细胞毒性的原始HSC高效靶向。ii)HD-Ad载体的插入容量为30kb，其允许容纳多个EN和同源供体模板。这可以用于在HSC中同时编辑多个基因，以用于基因治疗或建立用于多基因人类疾病的相关模型。使用HD-AD载体还可以将EN表达盒和具有延长的同源性区域的供体转基因结合至一个载体中。在该内容中，值得注意的是同源重组的效力与同源性区域的长度直接相关。iii)本发明的HD-Ad载体允许在体内转导靶细胞。我们在人类CD34+/NOG和人类CD46-转基因小鼠中的初步研究显示本发明的HD-Ad载体可以在静脉内注射后转导动员的HSC。
转导率受到多种因素的影响，包括靶细胞的可利用性。在HSC未动员的情况下，给予本发明的HD-Ad(例如通过静脉内主色)不会得到CD34+细胞的转导。
在以下实例中，我们示出，在人类CD46转基因(hCD46tg)小鼠和具有植入的人类HSC(NOG/hCD34+)的NOG小鼠中，体内转导的HSC收回至骨髓中，其中所述的HSC保持为功能HSC。在体内转导后3天，至多15％骨髓定位的HSC表达转基因。
可以使用将CD34+造血细胞(例如HSC)动员至外周血中的任何合适的方法。在多个非限定性实施方案中，所述的受试对象给予选自以下的动员剂：粒细胞集落刺激因子(GCSF),Plerixafor(AMD3100；CXCR抑制剂),POL5551(CXCR4拮抗剂(Karpova et al.,Leukemia(2013)27,2322–2331)),BIO5192(VLA-4的小分子抑制剂(Ramirez,et al.,2009.Blood114:1340-1343))和它们的组合。在具体的实施方案中，动员剂可以按照以下方式结合：
(a)粒细胞集落刺激因子(GCSF)+Plerixafor(AMD3100；aCXCR抑制剂)；
(b)GCSF+POL5551(CXCR4拮抗剂)；以及
(c)GSCF+BIO5192(VLA-4的小分子抑制剂)。
可以使用参加医疗人员所确定的在所有环境下都被认为是最合适的动员剂来取得动员。如本领域那些技术人员所理解的那样，动员剂可以一次或多次给予(即，1,2,3,4,5,6或多次)；此类给予为一天内多次，或者分散在多天内。用于动员剂的剂量范围可以由参加医疗人员根据所有的环境来确定。相似地，HD-Ad可以单次或多次(即，1,2,3,4,5,6或多次)给予；此类给予为一天内多次，或者分散在多天内。用于HD-Ad的剂量范围可以由参加医疗人员根据所有的环境来确定。如本领域那些技术人员进一步理解的那样，治疗可以包括1轮或多轮的动员/HD-Ad给予。在多个非限定性实施方案中，可以在AMD3100基动员后大约1小时或在POL5551基动员后大约2小时给予HD-Ad。图8示出另一个非限定性的示例性治疗时间表。
所述的受试对象可以为需要造血细胞基因治疗的任何哺乳动物受试对象，包括但不限于灵长动物、啮齿动物、狗、猫、马等。在一个实施方案中，受试对象为哺乳动物，例如人类。所述的受试对象可以患有造血细胞紊乱(治疗性基因治疗)，或者可以处于此类紊乱的风险之下(预防性基因治疗)。示例性的此类造血细胞紊乱包括但不限于β-珠蛋白生成障碍性贫血,人免疫缺陷性病毒感染和/或获得性免疫缺陷综合征,Ebola病毒感染,Epstein-Barr病毒感染和突发性急性呼吸系统综合征病毒(SARS)感染。在各种情况下，所述的受试对象可以已经患有所述的紊乱，或者可以处于所述的紊乱的风险之下。
例如具有用于HIV感染的两种CD4辅助受体，CCR5和CXCR4。在感染后的早期，由感染的个体分离的HIV主要是CCR5-tropic，表明在感染的早期阶段，这些病毒的选择性益处(54,61)。在大约1％的白种人中发现的ccr5基因中纯合的Δ32删除赋予对HIV-1的天然抗性(4,63)。携带该突变的个体是健康的，最可能的是由于趋化因子系统的多余的性质。在最近的研究中，显示在急性髓性白血病和HIV-1感染的患者中移植得自ccr5Δ32为纯合的供体得到的造血干细胞/祖细胞(HSC)得到对HIV的长期控制(49)。因此，本发明的方法可以用于消除HSC(CD34+细胞)中的CCR5。由于HSC为所有血细胞系的来源，所以ccr5敲除不仅保护CD4+细胞后代免于形成转导的HSC，还均保持淋巴和骨髓细胞类型，而这些细胞是HIV感染的潜在靶物。与CD4+细胞移植物(其具有相对有限的体内寿命)相反，单一的HSC移植允许长期保护或控制HIV/AIDS。在该实施方案中，HD-Ad核酸酶能够在编码CCR5的基因中产生DNA断裂；在一个非限定性实施方案中，核酸酶包含或由SEQ ID NO:91-93的核酸酶组成，并且所述的方法可以用于治疗或限制被HIV感染的或处于发展成HIV风险之下的受试对象(包括但不限于商业性工作者、静脉注射吸毒者、血清不一致关系的人以及不选择使用避孕套的高风险组的成员)的AIDS的发展。
如本领域那些技术人员所理解的那样，相似的技术可以用于治疗或限制Ebola(靶向核酸酶的Niemann-Pick疾病,C1型受体(NPC1))和SARS(靶向核酸酶的血管紧张素转化酶2受体(ACE2))、以及任何其他的紊乱(可以通过抑制/消除HSC中基因的表达来治疗或限制)的发展。
如本文所用，术语动词性的“治疗”、名词性的“治疗”或动名词性的“治疗”是指逆转、减轻、减缓、抑制、减慢或终止待治疗的紊乱的症状或状况的进展或严重性。术语动名词性的“治疗”包括减轻或减缓状况的至少一种不利的作用或症状。如果一个或多个症状减少，则该治疗通常是“有效的”。备选地，如果状况的进展被减慢或阻止，则该治疗是“有效的”。换言之，“治疗”可以不仅包括症状的改善，还包括在缺乏治疗下可预计的症状进展或恶化的停止或减慢。有利的或所需的临床结果包括但不限于与缺乏治疗下所预计的情况相比，一个或多个症状的减轻，缺陷的程度减轻，紊乱的稳定的状态(即，不恶化)，紊乱的延缓或减慢，以及增长的寿命。
如本文所用，术语“给予”是指通过认为合适的方法或途径将重组辅助病毒依赖性Ad病毒放置到受试对象中。HD-Ad可以作为合适的药物配制物的一部分给予；可以使用任何药物可接受的配制物，包括但不限于生理盐水或磷酸盐缓冲的生理盐水。可以通过任何合适的途径(包括静脉内给予)给予治疗，其在所述的受试对象中得到有效的治疗。可以调节剂量方案从而提供最佳的所需的应答(例如治疗性或预防性应答)。合适的剂量范围可以为例如2x10e10vp/kg。重组辅助病毒依赖性Ad病毒可以单一团注传递，或者可以给予多于一次(例如2,3,4,5或更多次)，这可以由主治医师确定。
在另一个方面中，本发明提供了用于造血细胞基因治疗的方法，其包括使用本发明的任何实施方案的或实施方案的组合的重组辅助病毒依赖性Ad病毒将动员的造血细胞体内转导至需要造血细胞基因治疗的受试对象的外周血中，其中重组核酸表达盒包含与在CD34+细胞中具有活性的启动子可操作地连接的转基因，其中所述的转基因的侧翼为至少第一再结合位点和第二再结合位点，其中所述的第一再结合位点和第二再结合位点靶向造血细胞基因组DNA中的位点，其中所述的基因组DNA位于转基因所需的插入位点的侧翼，并且其中转基因插入至所需的插入位点，为受试对象提供了治疗益处。
这方面类似于上文所述的方法，但是包括将靶向的转基因插入至CD34+基因组中(而是，或者与上文公开的靶向的基因破坏结合)，从而治疗或限制疑似可通过造血细胞基因治疗进行治疗的紊乱的发展。
例如β-珠蛋白生成障碍性贫血是先天性溶血性贫血，这是由减少或消除成熟血红蛋白的β-球蛋白链的生产的突变引起的。这种缺陷导致无效性红细胞生成和溶血性贫血。对于缺乏匹配的供体的患者而言，球蛋白基因治疗提供了治愈疗法。因此，本发明的方法可以包括使用HD-Ad载体，其中转基因为β-球蛋白基因、γ-球蛋白基因、球蛋白LCR、抗体基因、T细胞受体基因、嵌合抗原-受体基因。
在本发明的任何方法的一个实施方案中，重组辅助病毒依赖性Ad病毒通过静脉内注射给予。在另一个实施方案中，一个或多个拷贝的miRNA选自SEQ ID NO:1-90。在另一个实施方案中，核酸酶选自锌指核酸酶(ZFN),转录激活因子样效应器核酸酶(TALEN),巨核酶和CRISPR-Cas9核酸酶。在另一个实施方案中，核酸酶能够在CD34+细胞基因组靶物中形成DNA断裂，其中所述的基因组靶物选自CCR5,β-球蛋白,CR2(EBV受体),NPC1(Ebola受体),ACE2(SARS受体)，以及编码如果误叠可以导致溶酶体贮积症疾病的蛋白质的基因。在另一个实施方案中，核酸酶包含91-93的氨基酸序列。
在另一个方面中，本发明提供了重组核酸，其包含两个或多个拷贝的miRNA靶位点，该靶位点包含或由选自SEQ ID NO:1-90的核酸序列的反向互补序列组成。miRNA靶位点可以都是相同的，或者可以是不同的。在多个实施方案中，重组核酸包含2,3,4,5,6,7,8,9,10或更多拷贝的miRNA靶物。在一个实施方案中，miRNA靶位点总计包含用于至少2个不同的miRNA的靶位点。
本发明的该方面的重组核酸可以用作例如与所关注的任何编码区融合的模块，这样在表达与miRNA靶位点结合的miRNA的细胞中表达时，所得的融合RNA将被降解。此类细胞包括但不限于病毒生产型细胞，例如HEK293和HEK293-Cre细胞。该方面的重组核酸可以在本发明的盒和HD-Ad载体中使用，并且还可以在例如任何其他病毒载体(在HEK293和HEK293-Cre细胞中产生，例如慢病毒和r AAV载体)的生产中使用。
在一个实施方案中，重组核酸包含至少一个与miRNA(包含CACUGGUAGA(SEQ IDNO:1)(has-miR183-5p核心)(包括但不限于SEQ ID NO:10至39))结合的miRNA靶位点，和至少一个与miRNA(包含UGUGCUUGAUCUAA(SEQ ID NO:2)(has-miR218-5p核心)(包括但不限于SEQ ID NO:40至71))结合的miRNA靶物。在另一个实施方案中，重组核酸包含至少一个与miRNA(包含CACUGGUAGA(SEQ ID NO:1)(has-miR183-5p核心)(包括但不限于SEQ ID NO:10至39))结合的miRNA靶位点，和至少一个与miRNA(包含CACUAGCACA(SEQ ID NO:3)(miR96-5p核心)(包括但不限于SEQ ID NO:72至90))结合的miRNA靶物。在另一个实施方案中，重组核酸包含至少一个与miRNA(包含UGUGCUUGAUCUAA(SEQ ID NO:2)(has-miR218-5p核心)(包括但不限于SEQ ID NO:40至71))结合的miRNA靶位点，和至少一个与miRNA(包含CACUAGCACA(SEQ ID NO:3)(miR96-5p核心)(包括但不限于SEQ ID NO:72至90))结合的miRNA靶物。在另一个实施方案中，重组核酸包含至少一个与miRNA(包含CACUGGUAGA(SEQID NO:1)(has-miR183-5p核心)(包括但不限于SEQ ID NO:10至39))结合的miRNA靶位点，至少一个与miRNA(包含UGUGCUUGAUCUAA(SEQ ID NO:2)(has-miR218-5p核心)(包括但不限于SEQ ID NO:40至71))结合的miRNA靶物，以及至少一个与miRNA(包含CACUAGCACA(SEQ IDNO:3)(miR96-5p核心)(包括但不限于SEQ ID NO:72至90)结合的miRNA靶物。
在上述实施方案的任意一个的实施方案中，各拷贝的miRNA靶位点被间隔序列分开，其中所述的间隔序列在天然形成的核酸分子中不与miRNA靶位点一起存在。在多个非限定性实例中，间隔序列的长度可以为1-10,2-9,3-8,4-7,或5-6核苷酸。
在其他的实施方案中，本发明提供了核酸表达载体，其包含与启动子序列可操作地连接的本发明该方面的重组核酸。
实施例
实施例1
摘要：
使用位点特异性核酸内切酶编辑的基因组涉及生物医学基础研究以及基因治疗。我们生成了辅助病毒依赖性、衣壳修饰的腺病毒(HD-Ad5/35；Ad5柄(22个柄结构域),Ad5尾和Ad35突变体钮结构域(SEQ ID NO:100))载体，其用于在得自动员的成年供体的人类CD34+造血干细胞(HSC)中进行锌指核酸酶(ZFN)-或转录激活因子样效应器核酸酶(TALEN)-介导的基因组编辑。这些载体的生产需要HD-Ad5/35生产型293-Cre细胞中的ZFN和TALEN的表达受到抑制。为了如此，我们研发了基于293-Cre和CD+34细胞的miRNA表达图谱调节基因表达的miRNA基系统。使用miR-183-5p和miR-218-5p基调节转基因的基因表达，我们首先生产出HD-Ad5/35载体，其表达对HIV共同受体基因ccr5具有特异性的ZFN。我们证明HD-Ad5/35.ZFNmiR在原始HSC中赋予ccr5敲除(即，长期培养起始细胞和NOD/SCID再建群细胞)。在植入的HSC(在移植小鼠的骨髓中发现)中频繁取得的ccr5基因破坏与HIV的治疗在临床上是相关的，其中所述的HIV治疗考虑了所述的这些细胞可以产生多个细胞系，包括所有代表HIV的靶物和储备库的细胞系。我们生产出表达TALEN的第二HD-Ad5/35载体，其中所述的TALEN靶向球蛋白LCR内的DNase超敏区2(HS2)。该载体具有在血红蛋白病中用于靶基因校正的潜力。用于位点特异性核酸内切酶表达的miRNA调节的HD-Ad5/35载体平台具有作为用于治疗的HSC的基因改造工具具有超过目前使用的载体的多个益处。
引言
造血干细胞(HSC)是基因治疗的重要靶物。HSC基因治疗中的主要任务是使用人工的位点特异性核酸内切酶(EN)对HSC基因组的位点特异性修饰，其中所述的核酸内切酶将DNA断裂靶向于预选择的基因组位点。使用EN敲除基因，校正移码突变，或者将野生型cDNA敲入到内源位点或异源位点中。目前具有多种不同的EN平台来在所述的基因组中生成微单特异性DNA断裂[1]。一组EN包含结合DNA的蛋白质结构域。该组包括具有DNA结合和核酸酶性质的巨核酶，以及ZFN和TALEN，其中DNA结合结构域与细菌核酸内切酶FokI融合。由于通过FokI对DNA进行切割需要2个与各DNA链结合的FokI分子，所以包含FokI的EN的2个亚单元必须被表达。第二组EN是基于RNA导向的DNA识别，并且使用CRISPR/Cas9细菌系统。多种方法已经用于将EN表达盒传递至HSC中。由于人为仅需要EN短时表达以便取得靶基因组序列的永久修饰，所以大部分的EN盒传递系统仅允许EN瞬时表达，而未使EN基因整合至宿主基因组中。
使用Krüppel相关的盒(KRAB)的结构域与四环素阻抑物的融合物而允许Tet诱导的转基因表达的载体在我们生产表达CCR5ZFN的HD-Ad载体的尝试中。我们生产出表达GFP的HD-Ad5/35载体，并且显示在Tet诱导下在293细胞中背景表达受到抑制。然而，当我们使用CCR5ZFN基因替代GFP基因时，所得的由纯化颗粒分离的HD-Ad基因组证明基因组重排以及ZFN盒的部分删除(数据未示出)。
为了生成在CD34+细胞中表达EN的HD-Ad5/35载体，我们研发出miRNA调节的系统，其抑制在293细胞中载荷物的表达，但允许其在CD34+细胞中表达。这使我们生产出以高效价表达功能活性的ZFN或TALEN的HD-Ad5/35载体，而在生产过程中不会产生载体基因组的重排。我们证明表达CCR5ZFN的HD-Ad5/35载体在原始人类HSC中赋予了预计的高效的敲除，而未影响这些细胞的生活力和分化潜力。
结果
为了生成在人类造血CD34+干细胞中表达ZFN或TALEN转基因的HD-Ad5/35载体，我们使用miRNA调节的基因表达系统。如果转基因的mRNA包含miRNA(其在给定类型的细胞中以高水平表达)的靶位点，则mRNA将被降解，并且在该类型的细胞中转基因的表达受到抑制。我们着手建立miRNA调节的表达系统，其抑制转基因在HD-Ad生产型细胞(即，293-Cre细胞)中的表达，而通过在2种类型的细胞中建立miRNA表达图谱而赋予其在我们的靶细胞(人类CD34+HSC)中表达。由于Ad感染会干扰miRNA表达图谱，所以我们使用MOI为20pfu/细胞(其为用于HD-Ad载体扩增的MOI)的Ad5/35辅助病毒来感染293-Cre细胞[28]。将由4名不同的成熟(GCSF-动员的)供体得到的CD34+细胞汇合在一起，并使用表达GFP的HD-Ad5/35载体在MOI为2000vp/细胞(其为赋予CD34+细胞高效转导的MOI)下进行感染[18]。在Ad感染后24小时来纯化总的RNA，并在包含>2000不同人类miRNA探针的阵列miRNA芯片上杂交(图1a)。在293-Cre细胞中总计有8种具有高水平表达的候选miRNA(图1a)，但是它们在CD34+细胞中缺乏或较低的表达。通过实时PCR测量候选miRNA的表达水平(图1b)。由候选物列表中除去Hsa-miR-7-5p和hsa-miR-18a-5p，因为它们在CD34+细胞中也以相对高的水平表达。miR-96-5p与其他的miRNA共有miRNA的5′末端的相同的种子序列(即，严格确定miRNA靶物特异性的序列[29])。因此，我们未将miR-96-5p包含在我们的选择中。然后，我们选择2个miRNA(hsa-miR-183-5p和hsa-miR-218-5p)，其在293-Cre细胞中具有最高水平的表达，并且在CD34+细胞中是不可检测的(hsa-miR-183-5p)或者以最低可检测水平表达(hsa-miR-218-5p)。为了建立miRNA调节系统，我们将同源性100％的4个靶位点单独地插入至2个miRNA中，并结合至球蛋白基因的3'非翻译区(UTR)。UTR与GFP基因的3'末端连接，其处于EF1启动子(其为在CD34+细胞中具有高度活性的启动子)的控制之下(图2a)。将GFP表达盒插入至第一代Ad5/35载体中。所述的载体还包含PGK启动子驱动的mCherryTM表达盒，其不受到所选的miRNA的调节。miRNA调节的GFP表达对mCherryTM表达的归一化允许调节不同载体与细胞类型之间的转导效率的差异。我们使用所述的载体转导CD34+细胞和293-Cre细胞，并通过流式细胞仪在后来的48小时分析GFP和mCherryTM的表达(图2b和c)。在293-Cre细胞中，mCherryTM的表达水平与所有4种载体相当，而GFP表达受到包含miRNA靶位点的载体的抑制。基于GFP与mCherryTM的平均荧光强度(MFI)比，使用包含miR183和miR218的靶序列的载体取得最大的抑制(图2b)。在仅包含miR218靶位点的载体与包含miR218和miR183靶位点的组合的载体之间归一化GFP水平的差异是显著的，并且p值随着MOI(MOI5:p＝0.047,MOI10:p＝0.033,MOI20:p＝0.006)的升高而减小表明miR183靶位点有助于GFP表达的抑制。
考虑到第一代Ad载体在293-Cre细胞中复制并由此强烈地表达转基因产物，miR-183/218-基系统控制293-Cre细胞中GFP的表达的能力是值得注意的。这进一步通过以下观察证实：在293-Cre细胞中，归一化的GFP水平不以MOI依赖性的方式增加。相反，在CD34+细胞中，GFP和mCherryTM的表达对于所有载体而言均相当高(图2c)。
使用miRNA-183/218调节的基因表达系统，我们生成了处于EF1α启动子控制之下的表达ZFN的HD-Ad5/35载体(图3a)。ZFN针对HIV辅助受体CCR5的基因[11]。2个ZFN亚单元通过自切割的小核糖核酸病毒2A肽连接，并以聚蛋白的形式表达，其随后被切割。将miRNA控制的ZFN表达盒插入至质粒中，除了病毒ITR和包装信号以外，所述的质粒缺乏编码病毒蛋白质的任何序列[30]。在293-Cre细胞中以高效价生产相应的HD-Ad5/35.ZFNmiR载体(HD-ZFN)。由CsCl梯度纯化的HD-ZFN颗粒分离得到的病毒DNA的限制性分析未表明基因组重排(数据未示出)。为了功能上检验HD-ZFN载体，我们首先在MO7e细胞(其为CD34+生长因子依赖性红白血病细胞系，通常用作HSC基因治疗研究的模型)中进行转导研究[31]。在转导后的第2天，使用一半的细胞，通过Western印迹，使用针对FokI结构域的抗体来分析ZFN的表达(图3b)。由另一半细胞分离基因组DNA，并通过CCR5-ZFN靶位点特异性T7E1核酸酶测试针对ZFN的切割进行分析(图3c)。该分析显示在MO7e细胞中，HD-ZFN在>40％的ccr5等位基因中赋予位点特异性DNA切割。然后，使用得自2个不同供体(供体A和供体B)的人类CD34+细胞进行类似的研究。使用得自供体A的细胞进行的研究示于图3d和e中。在感染后48小时收集的细胞的Western印迹分析中，当在MOI等于或大于5x103vp/细胞下感染细胞时，显示可检测的FokI信号(图3d)。针对ccr5修饰的基因组DNA分析显示对于MOI为103,5x103和104vp/细胞而言，破坏频率分别为13％,8.9％和8.1％。值得注意的是，ccr5的破坏频率并未随着MOI而增加；其反而最可能的是由于载体-或ZFN-相关的毒性而降低。此外，在MOI为103vp/细胞(即，ZFN表达低于Western印迹检测水平的MOI)下感染的细胞中，可见基因破坏。使用得自供体B的CD34+细胞进行第二个研究。得自该供体的CD34+细胞为得自CD34+细胞批料的等分物，其中所述的批料在癌症患者中用于异基因的HSC移植。使用Ad5/35和HD-Ad5/35载体的转导效率与得自供体A的CD34+细胞的转导效率相当。因此，这些细胞可以用于评估载体转导的潜在细胞毒性。而且，供体B细胞的基因组在接近ZFN切割位点的ccr5基因中包含小的核苷酸多态性(数据未示出)。T7E1核酸酶测试不能区分SNP与ZFN-介导的重排，因此在所有样品中显示ccr5破坏，包括未转导的细胞(数据未示出)。
为了评估由HD-Ad5/35载体得到的ZFN的表达是否在我们使用剂量的CD34+细胞中产生细胞毒性，我们在转导后第4天，针对凋亡标志物膜联蛋白V实施流式细胞仪。用于该研究的CD34+细胞得自供体A和B(图4a和b)。尽管研究结果在2个供体之间稍有差异，但是与未转导的细胞和对照(HD-bGlob)载体转导的细胞相比，HD-ZFN转导不会显著地影响细胞生活力。相反，使用表达CCR5-ZFN的第一代Ad5/35载体转导CD34+[11]在本试验构建中以剂量依赖性的方法增加膜联蛋白V-阳性细胞的百分率(图4c)。
下一项任务是显示在原始HSC中HD-ZFN介导CCR5的破坏，以及转导和ZFN表达不会影响这些细胞增殖和分化的能力。为了评估分化的能力，我们将HD-ZFN转导的CD34+细胞进行长期培养起始细胞(LTC-IC)测试。该测试基于原始HSC在至少5周内生产髓细胞后代的能力来测量它们。在转导的CD34+细胞群体中最初呈现的定向细胞系的祖细胞将快速成熟，并由于它们有限的繁殖潜力而在培养的最初3周内小时。在整个培养过程中更多的原始细胞得到保持，并生成一群新的定向细胞系的祖细胞(例如集落形成细胞)，这些祖细胞在后来可以检测，并且在测试结束时使用祖细胞集落测试在半固体培养基中计数。对于对照HD-bGlob和HD-ZFN载体而言，由供体A得到的CD34+细胞的转导比未转导的对少减少大量的集落，其中差异仅对于MOI 5000vp/细胞而言是显著的(图5a)。使用对照载体转导由供体B得到的CD34+细胞不行显著地影响集落形成，但是使用MOI为1000vp/细胞的HD-ZFN进行转导会显著地减少集落形成(图5b)。使用FG-ZFN载体进行转导会抑制集落的形成(图5c)。
为了评价LTC-IC中CCR5破坏的水平，将平板中得自所有集落的细胞合并，分离基因组DNA，并进行T7E1核酸酶测试。在测试结束时，在CFU中HD-ZFN-介导的ccr5基因破坏频率为23.7％(图5d)。这表明所述的载体靶向原始CD34+细胞，并且基于修饰在HSC后代中是持续的。为了进一步支持上述结论，我们研究HD-ZFN载体在NOD/SCID再建群细胞中是否能够介导CCR5的破坏(图6a)。认为这种功能HSC测试潜在地表明在人类试验中条件性接受体再建群的能力[32]。对于该测试而言，我们在低细胞因子条件(防止CD34+细胞分化)下的24小时内，使用MOI为5,000vp/细胞的对照HD-bGlob载体或HD-ZFN载体转导得自供体A的CD34+细胞。转导的细胞被移植至亚致死剂量辐射的NOG小鼠中。在移植后6周，通过流式细胞仪针对骨髓、脾和PBMC中的人类CD45+细胞来分析人类细胞的植入。(值得注意的是，使用得自成熟供体的CD34+细胞的骨髓植入率通常低于使用脐带血衍生的CD34+细胞得到的植入率)。我们发现在移植未转导的CD34+细胞的小鼠中，～6％的骨髓细胞为人类CD45+阳性的(图6b)。HD-ZFN转导细胞的平均骨髓植入率为2.12％，其比未转导的细胞的植入率低大约3倍。有趣的是，使用HD-b Glob载体进行转导会增加植入率。在脾和PBMC中人类CD45+细胞的分析显示相似的植入率，但是在这些组织中很少声称HD-bGlob的转导作用。就进一步的分析而言，使用磁激活细胞分类方法(MACS)纯化人类CD45+细胞。使人类CD45+细胞经过祖细胞/集落测试，从而评估HSC的存在情况(图6c)。在得自小鼠的植入的CD45+细胞中发现相似数量的集落，其中所述的小鼠接受未转导的或HD-ZFN转导的CD34+细胞。集落数量高于HD-bGlob组，表明该载体改善了HSC的生存。在这一点上，上述情况的原因仍是难以捉摸的。为了研究CCR5修饰的频率，通过T7E1核酸酶测试来分析人类CD45+细胞。我们发下ccr5基因破坏的水平在2种移植小鼠中分别为8.4％和12％(图6c)。这些数据表明尽管HD-ZFN转导和/或ZFN表达可以减少CD34+细胞的植入率，但是在HSC中得到ccr5基因的破坏，该破坏在分析时间内在移植小鼠中持续。
为了显示我们的miRNA基方法调节转基因表达的多用途，我们生产表达TALEN的第二载体，其中所述的TALEN靶向球蛋白基因座控制区(LCR)中的Dnase超敏区2(HS2)(图7a)。由于认为靶向DNA序列在定位于活性染色质或DNase HS区时更接近于EN，所以选择所述的位点[33,34]。我们和其他人示出在红细胞和造血干细胞系中，HS2区被开放的染色质标志物占据[35-38]。我们之前还显示携带β-球蛋白基因座控制区的23-kb片段通过系于HS2区上的染色质优选地整合至染色体β-球蛋白LCR中[18,35]。后期的研究是在MO7e细胞中实施的。如使用表达ZFN的HD-Ad5/35载体那样，我们恢复HD-Ad5/35-TALEN病毒载体(在293细胞中不具有mRNA介导的抑制)的早期试图未成功。
为了生成HD-Ad5/35.TALENmiR(HD-TALEN)载体，将TALEN mRNA的3'末端修饰成包含miR-183/218结合位点(图7b)。在不具有可检测的基因组重排下，以高效价(2.5x1012VP/ml)生产HD-TALEN载体(图2b)。在使用HD-TALEN以MOI为1000vp/细胞感染MO7e细胞后，使用抗HA标记抗体，通过Western印迹来检测TALEN的表达(图7c)。T7E1核酸酶测试表明在感染后的第2天，在MO7e细胞中HS2靶位点达到～50％修饰。设置HS2特异性DNA断裂并结合我们的包含球蛋白LCR的HD-Ad5/35的能力与靶向的转基因插入有关。
综合我们的研究显示，就表达ZFN和TALE的HD-Ad5/35载体的生产而言，miRNA细胞是最有效的平台。
讨论
由于ZFN为研发的最初的EN，所以对于这些类型的EN而言已经积累了关于位点特异性和脱靶活性。靶向HIV CCR5辅助受体基因的ZFN首先在临床试验中检验[12]。该试验涉及使用表达CCR5-ZFN的Ad5/35载体体外转导患者CD4+T细胞。最近的工作集中于HSC中ccr5基因的敲除。靶向HSC与CD4+T细胞具有许多益处：i)由于HSC为所有血细胞系的来源，所以CCR5敲除不仅保护CD4细胞，而且还保护所有作为HIV感染的潜在靶物的其余的淋巴和骨髓细胞类型。ii)与CD4+细胞移植相反，单一的HSC移植将潜在地提供HIV-抗性细胞的长期来源，从而可以长期保护或控制HIV/AIDS。Holt等人在2010年报告了在HSC中取得ZFN介导的ccr5基因序列的破坏的最初成功的尝试。该研究证明在NOD/SCID/IL2rγnull(NSG)小鼠中植入修饰的HSC得到对CCR5-tropicHIV-1感染的抗性[3]。尽管受到鼓励，但是数据还表明许多潜在的问题，包括在该试验系统中，使用表达ZFN的质粒通过电穿孔转染的细胞的生活力较差。
为了防范在我们的系统中在293-Cre细胞中高水平的ZFN表达的潜在细胞毒性，我们建立了miRNA基基因调节系统来抑制ZFN转基因。所述的系统是基于由不同的供体汇聚得到的293-Cre细胞和人类CD34+细胞的miRNA表达图谱。使用报告基因的研究显示转基因被高效抑制，其中所述的转基因受到hsa-miR-183-5p和hsa-miR-218-5p的调节。尽管具有miRNA调节的GFP报告基因的背景表达，但是该表达不会以剂量依赖的方式或在病毒复制时增加。不会在病毒复制时增加可能是由于在293-Cre细胞中高水平的miR-183和-218，以及相应靶位点的完全饱和。重要的是，miR183/218-调节系统成功地用于生成表达CCR5ZFN和球蛋白LCRTALEN的HD-Ad5/35载体。潜在地，我们的miRNA调节的方法还与慢病毒或rAAV载体的生产有关，其中所述的载体还使用293细胞作为生产型细胞。
在转导研究中，我们集中于HD-Ad5/35.ZFNmiR(HD-ZFN)。在CD34+细胞中，感染后的第2天分析的ZFN表达低于MO7e细胞。这符合我们之前使用HD-Ad5/35.GFP载体的研究，其中我们显示CD34+细胞的转导在～60％CD34+细胞中得到GFP的表达，和比MO7e细胞中低大约～10倍的平均GFP荧光强度水平。在HD-ZFN转导后的第2天对ccr5基因破坏的分析未显示在该时点时与ZFN表达水平有关。在转导后的后期时点进行分析潜在地显示较高水平的破坏。细胞因子(具体为与非同源的末端连接(NHEJ)DNA修复有关的蛋白质)限制了破坏效率和重排效力。备选地，考虑到CD34+细胞是高度异源的细胞群体，HD-Ad5/35转导、ZFN切割和/或NHEJ可以仅在一部分CD34+细胞中发生。重要的是，我们随后的LTC-IC和NOG小鼠群体研究表明靶向的CD34+细胞包含原始干细胞。
我们发现在我们的系统中，在NOG小鼠中，HD-ZFN转导会降低植入率、存活和/或CD34+细胞的扩张。由于实际上使用HD-bGlob转导的CD34+细胞比未转导的细胞具有更高的植入率，所以上述情况不一定是由于HD-Ad5/35转导和载体相关的毒性本身。因此，我们推测在延长的时期内，所述的情况与ZFN表达有关。在几轮细胞分裂后，未整合的HD-Ad载体基因组消失，但是在未分裂的细胞(例如肝细胞)中，持续更长的时间[43]。由于HSC是低繁殖的，所以HD-Ad5/35基因组可以保持较长的时期，并由此表达ZFN。为了进行基因改造，仅在短时期内表达ZFN便足够了。
值得注意的是，在我们的研究中，我们使用CD34+细胞，其得自成熟G-CSF动员的供体，其为比胎肝或脐带血衍生的CD34+细胞更容易得到的来源，所述的供体与CCR5ZFN用于之前的研究中[2,3]。在植入的HSC(在移植的NOG小鼠的骨髓中发现)中，12％的ccr5基因破坏频率与HIV治疗在临床上是相关的，其中所述的HIV治疗考虑了所述的这些细胞可以产生多个细胞系，包括所有代表HIV的靶物和储备库的细胞系。
我们跟踪的另一个手段是使用球蛋白LCR特异性TALEN以便通过同源重组而增加供体HD-Ad5/35载体的位点特异性整合[18]。
用于将EN基因传递至HSC的本发明的HD-Ad5/35载体平台具有超过其他传递系统的主要益处。i)最重要的是，允许具有较低细胞毒性的原始HSC的高效靶向。ii)HD-Ad载体的插入容量为30kb，其允许容纳多个EN和同源供体模板。这对于为了基因治疗而在HSC中同时编辑多个基因或者建立用于多基因人类疾病的相关模型而言是重要的。HD-AD5/35载体的使用还可以将EN表达盒与具有延长的同源区的供体DNA序列结合至一个载体中。在该内容中，值得注意的是同源重组的效力与同源区的长度直接相关[16]。iii)HD-Ad载体允许在体内转导靶细胞。在小鼠和非人类灵长动物中，在静脉内注射后，HD-Ad5载体高效地转导肝细胞[44,45]。在人类CD34+/NOG和人类CD46-转基因小鼠中，我们的初步研究显示亲和性增强的Ad5/35和HD-Ad5/35载体可以在静脉内注射后转导GCSF/AMD3100动员的HSC[22]。与体外培养/转导以及再次移植到骨髓条件性患者中的HSC基因编辑方法在技术上是复杂的且昂贵的。在多种细胞因子存在下对HSC进行体外培养会影响HSC的生活力、多能性和植入效力。此外，对清髓方案的需要对患者产生了其他的风险。最终，所述的过程是昂贵的，并且尽可以在专用的情况下实施。因此，允许体内HSC基因组编辑的载体细胞是相关的。
总之，我们研发出用于在原始HSC中表达设计的核酸内切酶的miRNA调节的HD-Ad5/35载体平台。该载体系统是为了治疗而用于HSC基因组改造的新的重要工具。
材料和方法
细胞：在Dulbecco改良的Eagle培养基(Invitrogen)培养基中培养293细胞，293-C7-CRE[46]细胞，其中所述的培养基补充有10％胎牛血清(FCS)(HyCloneTM),2mM L-谷氨酰胺,Pen-Strep。将Mo7e细胞[31]保持在包含10％FCS,2mM L-谷氨酰胺,Pen-Strep和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(0.1ng/ml)(PeprotechTM)的RPMI 1640培养基中。由the FredHutchinson Cancer Research Center Cell Processing Core Facility得到得自G-CSF动员的正常供体的原代人类富集CD34+的细胞。我们使用得自2名不同供体的CD34+细胞，计划的“供体A”和“供体B”。由冷冻的原液回收CD34+细胞，并在Iscove改良的Dulbecco培养基(IMDM)中过夜温育，其中所述的培养基补充有20％FCS,0.1mM 2-巯基乙醇,干细胞因子(50ng/ml),DNase I(100μg/ml),2mM L-谷氨酰胺,Flt3配体(Flt3L,50ng/ml),白细胞介素(IL)-3(10U/ml)和促血小板生成素(10ng/ml)。细胞因子和生长因子得自Peptotech。
micro-RNA阵列：使用包含2006种不同的人类miRNA探针的Agilent人类miRNA(8x60K)V18.0实施阵列研究。根据the Qiagen miRNeasyTM试剂盒的方案，由QiagenRNAprotectTM细胞试剂稳定的细胞提取miRNA和RNA。将RNA样品在-80℃下冷冻。根据制造商的说明书，使用miRNA Complete Labeling and Hyb Kit(Agilent Technologies)，在55℃,20rpm的杂交箱中将各个载玻片与100ng Cy3-标记的RNA杂交20小时。杂交后，使用GeneExpression Wash Buffer Kit(Agilent)洗涤载玻片。通过Agilent Microarray Scanner和具有默认设置的Feature Extraction软件10.7扫描载玻片。通过Quantile算法,GeneSpring Software 11.0将原始数据归一化。
用于所选的miRNA的Qrt-PCR：使用ScanDropTM(Analytik Jena,Germany)测量RNA制备浓度。使用均购自Applied Biosystems的具有miRNA特异性引物的TaqManTM miRNAReverse Transcription Kit实施逆转录，其中使用5ng模板；4℃，6min；16℃，30min；42℃，30min；以及85℃，5min。使用不具有AmpEraseTM UNG的TaqMan 2x Universal PCR MasterMix在7900HT仪器(Applied Biosystems)上以四个重复实施实时PCR，其中在10μl反应体积中使用0.27ng模板；95℃，10分子；95℃，15秒，40个循环；60℃，60秒。在阈值等于0.3下计算Ct值，并且人工基线启动循环为3，结束循环为13。使用“R软件”和“microRNA”生物导体(bioconductor)包来分析5'种子序列中的miRNA同源性[29]。
腺病毒载体：包含miRNA靶位点的Ad5/35-RG：将得自pRG0[47]的GFP-mCherryTM盒转移至腺病毒穿梭质粒pDeltaE1/Sp1(Microbix)中。合成以下miRNA靶位点，并将其插入至穿梭载体的AvrII/SmaI位点。
miR-183靶位点:
5'CTAGGATTATGGCACTGGTAGAATTCACTACTTATGGCACTGGTAGAATTCACTACTTATGGCACTGGTAGAATTCACTACTTATGGCACTGGTAGAATTCACTATCGCCCGGG(SEQ ID NO:147)
miR-218靶位点:
5'CCTAGGAATTTGTGCTTGATCTAACCATGTTTCATTGTGCTTGATCTAACCATGTTTCATTGTGCTTGATCTAACCATGTTTCATTGTGCTTGATCTAACCATGTATCGCCCGGG(SEQ ID NO:148)
miR-183/218靶位点:
5'CCTAGGAT TATGGCACTGGTAGAATTCACT ACT
TATGGCACTGGTAGAATTCACT ACT TATGGCACTGGTAGAATTCACTACT
TATGGCACTGGTAGAATTCACT ATCG TTGTGCTTGATCTAACCATGTTTCAT
TGTGCTTGATCTAACCATGT TTCAT TGTGCTTGATCTAACCATGT
TTCATTGTGCTTGATCTAACCATGT ATCGCCCGGG(SEQ ID NO:149)
生成第一代Ad5/35病毒载体，并如其他处所述进行检验[6]。
在EF1a启动子控制之下的包含miR-182/219调节的CCR5 ZFN的HD-Ad5/35-ZFN
使用pBluescriptTM(pBS)质粒生成用于在HD主链质粒中重组的穿梭质粒。简言之，重组臂由包含穿梭DNA的pHCA质粒扩增得到[30]，并被克隆至pBS中，从而生成用于ZFN-CCR5构建体的pBS-Z和用于Talen-LCR构建体的pBS-T。通过Genescript合成3’UTR和pA序列，并通过AgeI和XhoI克隆至2种穿梭载体中，从而生成pBS-Z-3’UTR-pA和pBS-T-3’UTR-pA。使用BamHI和NheI，由包含EF1a启动子的1335bp片段的PJ204-EF1a-pA提取Ef1a启动子，然后插入2种穿梭质粒中的各位点中，从而生成pBS-Z-Ef1a和pBS-T-EF1a。使用EcoRI和XbaI消化由pBS-CCR5[11]得到的ZFN-CCR5，并将其克隆至穿梭载体中，从而生成pBS-Ef1a-ZFN-CCR5。最后，将合成的以NotI作为侧翼的miR-183/218串联重复序列克隆至pBS-Ef1a-ZFN-CCR5中的各个位点中，从而生成pBS-Ef1a-ZFN-CCR5-miR。使用BstBI将穿梭载体质粒线性化，并在E.coliBJ5183细胞中与pHCA主链载体再结合。然后，使用PmeI将再结合的pHCA-Ef1a-ZFN-CCR5-miR和pHCA-EF1a-Talen-LCR-miR线性化，并使用辅助病毒(HV-Ad5/35)在293-Cre细胞中恢复，从而生成HD-Ad5/35-EF1a-ZFN-CCR5-miR病毒(HD-Ad5/35.ZFNmiR)和HD-Ad5/35-EF1a-Talen-LCR-miR病毒(HD-Ad5/35Talen.miR)。
在EF1a启动子控制之下的包含miR-182/219调节的HS2-LCR TALEN的HD-Ad5/35- TALEN
按照之前所述，由ToolGenTM(Seoul,South Korea)设计HS2-LCR特异性TALEN[48]。TALEN识别序列如图7a所示。将DNA结合结构域与FokI融合。使用血凝素(HA)-标记来标记DNA结合结构域的N-末端，并且其包含细胞核定位信号。TALEN盒处于EF1a启动子的控制之下，并且包含位于3’UTR上游的miR位点。将2个TALEN克隆至pBS-T-EF1a中，并通过2A肽连接。类似于ZFN-CCR5构建体，合成miR183/218串联重复序列，并将其克隆至pBS-EF1a-Talen-LCR的NotI位点，从而生成pBS-EF1a-Talen-LCR-miR。对于病毒的恢复而言，使用PmeI使最终的质粒线性化。
HD-Ad5/35.bGlob(HD-bGlob)
该载体如之前所述[18]。其包含～26kb球蛋白LCR。β-球蛋白启动子控制GFP基因的表达。如其他处详细描述的那样[28]，使用辅助病毒Ad5/35-辅助病毒[42]在293-Cre细胞[28]中生产HD-Ad5/35载体。如其他处所述来测定辅助病毒的污染水平，发现其<0.05％。如其他处所述，证明HDAd基因组结构的DNA分析[28]。
流式细胞仪分析。对于细胞毒性分析而言，使用膜联蛋白V/7AAD凋亡试剂盒(eBiosciences)将Ad转导的CD34+细胞染色。对于由PBMC衍生的细胞的植入分析而言，使用抗hCD45-PE(BD)将骨髓和脾染色。然后使用FlowJoTM软件分析数据。
磁激活细胞分类方法(MACS)。抗人CD45缀合的微珠得自Miltenyi Biotech。根据制造商的说明书进行细胞纯化。
LTC-IC(长期培养起始细胞)测试。将转导的CD34+细胞在包含IMDM的细胞因子中温育48小时，此后，将其转移至长期起始培养条件下。简言之，如StemCell Technologies所述，建立粘附的鼠骨M2-10B4成纤维饲养细胞层。将转导的CD34+细胞加入至饲养层中，并在具有10-6M氢化可的松(HLTM)(StemCell Technologies)的人类长期起始培养基中培养5周，每周更换一半的培养基。5周后，收集细胞，并使其经历集落形成单元测试。
集落形成单元测试。对于集落形成单元测试而言，在以下细胞因子存在下：(IL-350U/ml,SCF 50ng/ml,Epo 2U/ml,G-CSF 6.36ng)，在5％CO2的潮湿气氛下，在37℃下将2x104细胞由LTC-IC转移至MethoCultTM GF H4434培养基(StemCell Technologies)中。
Western印迹。在包含蛋白酶抑制剂的冰冷的PBS(Complete Protease InhibitorCocktail,Roche)中对细胞团进行超声处理，并将包含蛋白质的上清液储存在-80℃下。将总计20μg的总蛋白质适用于Western印迹分析。使用4-15％梯度凝胶(BioRad)，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，然后根据供应商的方案(Mini ProteanIII,BioRad)，转移至硝酸纤维素膜上分离蛋白质。在5％脱脂奶粉(Bio-Rad)中封闭膜，并在具有0.1％Tween-20的Tris-生理盐水(TBS-T)中洗涤。将膜与抗FokI抗体(Sangamo BioSciences),抗HA标记(Roche)或抗-β-肌动蛋白(Sigma Aldrich)温育。使用ECL plus试剂(Amersham)将膜显色。
错配的敏感性核酸酶测试(T7E1测试)。如之前所述，分离基因组DNA[49]。扩增CCR5或LCR区。用于检测CCR5破坏的引物如之前所述[50]。用于HS-LCR位点分析的引物为：
5'AAATCTTGACCATTCTCCACTCTC(SEQ ID NO:150)and5'GGAGACACACAGAAATGTAACAGG(SEQ ID NO:151)。将PCR产物杂交，并使用2.5单位的T7E1(NEB)进行处理。通过10％TBE PAGE(Biorad)分辨消化的PCR产物，并使用溴化乙锭染色。使用ImageQuantTM软件，分析谱带强度。
动物研究。涉及动物的所有试验均是根据the University of Washington列出的机构指南实施的。在无特异性病原体的场地中饲养小鼠。免疫缺陷型NOG小鼠(品种名称：NOD/Shi-scid/IL-2Rγnull)得自the Jackson Laboratory。
CD34+细胞移植。在补充1％热灭活的FCS的PBS中将冷冻保存的CD34+细胞解冻。在包含10％热灭活的FCS,10％BSA,4mM谷氨酰胺和青霉素/链霉素,以及人类细胞因子(TPO(5ng/mL),SCF(25ng/mL),IL-3(20ng/mL),Flt3L(50ng/mL))的IMDM中将新解冻的细胞过夜培养。第二天，使用MOI为5000vp/细胞的HD-bGlob或HD-ZFN感染细胞，并温育24h。未感染的细胞用作对照。第二天，NOG受体小鼠接受300Rad/3Gy全身辐射。在感染后24h，将3x105转导的CD34+细胞与未辐射的NOG小鼠的2.5x105新收集的骨髓细胞混合，并在辐射后4小时i.v.注射至受体小鼠中。在骨髓移植后6周，如下测试植入率：抽取血液样品，裂解红细胞，并使用PE缀合的抗人CD45抗体染色剩余的细胞，再通过流式细胞仪分析。在移植后6周，将骨髓细胞经过使用抗hCD45(Miltenyi)珠的双重分类，并接种于甲基纤维素上。在2周后，计数集落，并经过T7E1核酸酶测试。
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实施例2
CCR5定向的AIDS治疗：对于HIV感染，存在两种CD4的辅助受体(CCR5和CXCR4)。在感染后的早期，由感染的个体分离得到的HIV主要为CCR5-tropic，从而表明CCR5在使用HIV的初始感染中的重要角色。这种情况得到以下事实的支持：在ccr5基因中具有纯合子删除的个体被保护免于HIV。
1.Ad5/35载体：Ad5/35载体包含由人类血清型Ad35衍生的纤维。Ad5/35和Ad35通过CD46感染细胞，CD46为在100％的CD34+细胞上高度表达的受体。缺乏Ad5/35载体的肝脏转导是重要的。静脉内注射Ad5载体得到肝细胞转导，并随后产生肝中毒。Ad5进入肝细胞是由Ad5六邻体与维生素K依赖的凝血因子(具体为因子X(FX))的相互作用而介导的。我们显示，FX不会增加CD46阴性细胞的Ad5/35转导(图9A)。在该研究中使用的Ad5/35包含Ad35纤维柄(w/6个柄基元)和Ad35纤维钮(Ad5/35S)。当Ad35柄被更长的Ad5柄(22个柄基元)(Ad5/35L)替代时，FX会以HSPG依赖性的方式在体外增加CD46阴性细胞的转导(图9A)。这表明较短的且挠性较低的Ad35柄会干扰FX-六邻体的相互作用，并随后干扰肝细胞转导。但是，体外研究表明与相应的长柄Ad5/35载体相比，使用Ad5/35S载体在低MOI下进行的CD46依赖的转导效率较低(图9B)。这最可能是由于以下事实：对于包含短纤维的Ad载体而言，细胞内转运至细胞核是相对无效的。
2.亲和性增强的Ad5/35载体：我们基于重组Ad35纤维钮(SEQ ID NO:100)(对CD46具有改良更多的亲和性)的使用而构建了包含亲和性增强的Ad35纤维(Ad5/35++)的Ad。尽管在人类中，CD46在所有有核细胞上均表达，但是在小鼠中相应的直系同源物仅在睾丸中表达。作为使用静脉内注射的Ad5/35载体用于我们体内转导研究的模型，我们因此使用包含完整人类CD46基因座并以类似于人类的方式和水平表达huCD46的转基因小鼠(huCD46tg小鼠)。在体内，在预建立的CD46高肝脏转移的huCD46tg小鼠中，静脉内注射Ad5/35++得到比亲代Ad5/35载体高效>5倍的肿瘤细胞转导。
3.动员的HSC的体内Ad5/35K++转导：定位于骨髓中的细胞不能通过静脉内注射Ad载体来转导，甚至在所述的载体靶向存在于骨髓上的受体是也是如此。这最有可能是由于HSC在骨髓中有限的可利用性。我们使用在huCD46tg小鼠中使用粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和CXCR4拮抗剂AMD3100(MozobilTM,PlerixaTM)检验动员情况。小鼠中的HSC存在于谱系阴性(Lin-),cKit+和Sca1+(LSK)细胞的亚组中。为了动员huCD46tg小鼠中的HSC，我们使用G-CSF和AMD3100的组合(图10A)。G-CSF/AMD3100动员在AMD3100注射后1小鼠，在外周血中的LSK细胞增加～100倍。此时，我们注射表达亲和性增强的GFP的Ad5/35++载体(122)，并在后来的6和72h分析PBMC中GFP的表达(图10A和B)。研究显示超过20％的动员的LSK细胞可以在外周血中转导，并且GFP阳性LSK细胞的百分率经过时间的流式而下降。这种情况部分是由于在骨髓和脾(即，二级造血器官)中的再定位。在Ad注射后的第3天，骨髓和脾中分别为大约9％和13％的LSK细胞表达GFP。这意味着0.01％的骨髓细胞为转导的LSK细胞。如果人们考虑一个HSC足以使完整的血液细胞再建群，则上述的数字是治疗相关的。此外，我们通过集落形成单位(CFU)测试证明转导的HSC是多能性的，并且保持形成集落的能力。由于该研究中使用的Ad5/35++载体不能整合至HSC基因组中，所以表达GFP的LSK细胞的数量到第14天为止开始减少(图10C)，最可能的原因是由于与第一代Ad5/35载体有关的细胞分裂和细胞毒性。
接着，我们研究人类HSC的Ad5/35++体内转导。使用人类CD34+细胞(NOG/CD34+小鼠)移植亚致死剂量辐射的NOG小鼠(NOD/Shi-scid/IL-2Rγnull)。基于PBMC中人类CD45+细胞，在后来的6周分析植入情况。CD45+百分率为21％和35％。如图2A中所述，NOG/CD34+小鼠随后被动员并注射Ad5/35++-GFP。在Ad注射后的48小鼠，骨髓细胞和PBMC中分别12％和39％的人类CD34+细胞是GFP阳性的。值得注意的是，该模型中仅huCD46阳性细胞是移植的人类细胞，其可以解释比huCD46tg小鼠模型更高的转导率。
序列表
<110> 华盛顿大学
A·利伯
T·帕帕亚诺波罗
M·里克特
K·撒亚艾米诺娃
<120> 使用腺病毒载体的体内基因改造
<130> 15-466-PCT
<150> 61/987340
<151> 2014-05-01
<160> 165
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 10
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 1
cacugguaga 10
<210> 2
<211> 14
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 2
ugugcuugau cuaa 14
<210> 3
<211> 10
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 3
cacuagcaca 10
<210> 4
<211> 10
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 4
ucuaccagug 10
<210> 5
<211> 10
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 5
ugugcuagug 10
<210> 6
<211> 14
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 6
uuagaucaag caca 14
<210> 7
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 7
agugaauucu accagugcca ua 22
<210> 8
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 8
agcaaaaaug ugcuagugcc aaa 23
<210> 9
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 9
agaugguuag aucaagcaca a 21
<210> 10
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 10
uguauggcac ugguagaauu 20
<210> 11
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 11
uguauggcac ugguagaauu ca 22
<210> 12
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 12
uguauggcac ugguagaauu cacu 24
<210> 13
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 13
guauggcacu gguagaauuc acu 23
<210> 14
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 14
uauggcacug guagaauuca cu 22
<210> 15
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 15
uauggcacug guagaauuca cug 23
<210> 16
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 16
uauggcacug guagaauuca 20
<210> 17
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 17
uauggcacug guagaauuca c 21
<210> 18
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 18
uauggcacug guagaauuc 19
<210> 19
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 19
uauggcacug guagaauuca cugu 24
<210> 20
<211> 18
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 20
uauggcacug guagaauu 18
<210> 21
<211> 17
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 21
uauggcacug guagaau 17
<210> 22
<211> 16
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 22
uauggcacug guagaa 16
<210> 23
<211> 15
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 23
uauggcacug guaga 15
<210> 24
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 24
auggcacugg uagaauucac u 21
<210> 25
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 25
auggcacugg uagaauucac ug 22
<210> 26
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 26
auggcacugg uagaauuca 19
<210> 27
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 27
auggcacugg uagaauucac ugu 23
<210> 28
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 28
auggcacugg uagaauucac 20
<210> 29
<211> 15
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 29
auggcacugg uagaa 15
<210> 30
<211> 17
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 30
auggcacugg uagaauu 17
<210> 31
<211> 18
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 31
auggcacugg uagaauuc 18
<210> 32
<211> 16
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 32
auggcacugg uagaau 16
<210> 33
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 33
uggcacuggu agaauucacu g 21
<210> 34
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 34
uggcacuggu agaauucac 19
<210> 35
<211> 18
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 35
cacugguaga auucacug 18
<210> 36
<211> 15
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 36
cacugguaga auuca 15
<210> 37
<211> 16
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 37
cacugguaga auucac 16
<210> 38
<211> 17
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 38
cacugguaga auucacu 17
<210> 39
<211> 16
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 39
acugguagaa uucacu 16
<210> 40
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 40
guugugcuug aucuaaccau gu 22
<210> 41
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 41
guugugcuug aucuaaccau 20
<210> 42
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 42
uugugcuuga ucuaaccaug 20
<210> 43
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 43
uugugcuuga ucuaaccau 19
<210> 44
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 44
uugugcuuga ucuaaccaug uggu 24
<210> 45
<211> 18
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 45
uugugcuuga ucuaacca 18
<210> 46
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 46
uugugcuuga ucuaaccaug ugg 23
<210> 47
<211> 16
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 47
uugugcuuga ucuaac 16
<210> 48
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 48
uugugcuuga ucuaaccaug u 21
<210> 49
<211> 17
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 49
uugugcuuga ucuaacc 17
<210> 50
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 50
uugugcuuga ucuaaccaug ug 22
<210> 51
<211> 15
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 51
uugugcuuga ucuaa 15
<210> 52
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 52
ugugcuugau cuaaccaugu 20
<210> 53
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 53
ugugcuugau cuaaccaugu g 21
<210> 54
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 54
ugugcuugau cuaaccaugu ggu 23
<210> 55
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 55
gugcuugauc uaaccaugu 19
<210> 56
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 56
gugcuugauc uaaccaugug 20
<210> 57
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 57
ugcuugaucu aaccaugug 19
<210> 58
<211> 18
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 58
ugcuugaucu aaccaugu 18
<210> 59
<211> 17
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 59
gcuugaucua accaugu 17
<210> 60
<211> 16
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 60
gcuugaucua accaug 16
<210> 61
<211> 15
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 61
gcuugaucua accau 15
<210> 62
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 62
gcuugaucua accauguggu 20
<210> 63
<211> 18
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 63
gcuugaucua accaugug 18
<210> 64
<211> 16
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 64
cuugaucuaa ccaugu 16
<210> 65
<211> 17
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 65
cuugaucuaa ccaugug 17
<210> 66
<211> 15
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 66
cuugaucuaa ccaug 15
<210> 67
<211> 15
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 67
uugaucuaac caugu 15
<210> 68
<211> 16
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 68
uugaucuaac caugug 16
<210> 69
<211> 18
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 69
uugaucuaac cauguggu 18
<210> 70
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 70
uugaucuaac caugugguu 19
<210> 71
<211> 17
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 71
uugaucuaac caugugg 17
<210> 72
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 72
uuuuggcacu agcacauuuu ugcu 24
<210> 73
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 73
uuuggcacua gcacauuuuu gcu 23
<210> 74
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 74
uuuggcacua gcacauuuuu g 21
<210> 75
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 75
uuuggcacua gcacauuuuu 20
<210> 76
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 76
uuuggcacua gcacauuuuu gc 22
<210> 77
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 77
uuuggcacua gcacauuuu 19
<210> 78
<211> 18
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 78
uuuggcacua gcacauuu 18
<210> 79
<211> 15
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 79
uuuggcacua gcaca 15
<210> 80
<211> 17
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 80
uuuggcacua gcacauu 17
<210> 81
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 81
uuuggcacua gcacauuuuu gcuu 24
<210> 82
<211> 16
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 82
uuuggcacua gcacau 16
<210> 83
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 83
uuggcacuag cacauuuuug c 21
<210> 84
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 84
uuggcacuag cacauuuuug cu 22
<210> 85
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 85
ggcacuagca cauuuuugcu 20
<210> 86
<211> 18
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 86
cacuagcaca uuuuugcu 18
<210> 87
<211> 17
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 87
cacuagcaca uuuuugc 17
<210> 88
<211> 15
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 88
acuagcacau uuuug 15
<210> 89
<211> 16
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 89
cuagcacauu uuugcu 16
<210> 90
<211> 15
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 90
cuagcacauu uuugc 15
<210> 91
<211> 729
<212> PRT
<213> 智人
<400> 91
Met Asp Tyr Lys Asp His Asp Gly Asp Tyr Lys Asp His Asp Ile Asp
1 5 10 15
Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Met Ala Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val
20 25 30
Gly Ile His Gly Val Pro Ala Ala Met Ala Glu Arg Pro Phe Gln Cys
35 40 45
Arg Ile Cys Met Arg Asn Phe Ser Asp Arg Ser Asn Leu Ser Arg His
50 55 60
Ile Arg Thr His Thr Gly Glu Lys Pro Phe Ala Cys Asp Ile Cys Gly
65 70 75 80
Arg Lys Phe Ala Ile Ser Ser Asn Leu Asn Ser His Thr Lys Ile His
85 90 95
Thr Gly Ser Gln Lys Pro Phe Gln Cys Arg Ile Cys Met Arg Asn Phe
100 105 110
Ser Arg Ser Asp Asn Leu Ala Arg His Ile Arg Thr His Thr Gly Glu
115 120 125
Lys Pro Phe Ala Cys Asp Ile Cys Gly Arg Lys Phe Ala Thr Ser Gly
130 135 140
Asn Leu Thr Arg His Thr Lys Ile His Leu Arg Gly Ser Gln Leu Val
145 150 155 160
Lys Ser Glu Leu Glu Glu Lys Lys Ser Glu Leu Arg His Lys Leu Lys
165 170 175
Tyr Val Pro His Glu Tyr Ile Glu Leu Ile Glu Ile Ala Arg Asn Ser
180 185 190
Thr Gln Asp Arg Ile Leu Glu Met Lys Val Met Glu Phe Phe Met Lys
195 200 205
Val Tyr Gly Tyr Arg Gly Lys His Leu Gly Gly Ser Arg Lys Pro Asp
210 215 220
Gly Ala Ile Tyr Thr Val Gly Ser Pro Ile Asp Tyr Gly Val Ile Val
225 230 235 240
Asp Thr Lys Ala Tyr Ser Gly Gly Tyr Asn Leu Pro Ile Gly Gln Ala
245 250 255
Asp Glu Met Glu Arg Tyr Val Glu Glu Asn Gln Thr Arg Asn Lys His
260 265 270
Leu Asn Pro Asn Glu Trp Trp Lys Val Tyr Pro Ser Ser Val Thr Glu
275 280 285
Phe Lys Phe Leu Phe Val Ser Gly His Phe Lys Gly Asn Tyr Lys Ala
290 295 300
Gln Leu Thr Arg Leu Asn His Ile Thr Asn Cys Asn Gly Ala Val Leu
305 310 315 320
Ser Val Glu Glu Leu Leu Ile Gly Gly Glu Met Ile Lys Ala Gly Thr
325 330 335
Leu Thr Leu Glu Glu Val Arg Arg Lys Phe Asn Asn Gly Glu Ile Asn
340 345 350
Phe Arg Ser Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly
355 360 365
Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Arg Met Asp Tyr Lys Asp His Asp
370 375 380
Gly Asp Tyr Lys Asp His Asp Ile Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
385 390 395 400
Met Ala Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Gly Ile His Gly Val Pro Ala
405 410 415
Ala Met Ala Glu Arg Pro Phe Gln Cys Arg Ile Cys Met Arg Asn Phe
420 425 430
Ser Arg Ser Asp Asn Leu Ser Val His Ile Arg Thr His Thr Gly Glu
435 440 445
Lys Pro Phe Ala Cys Asp Ile Cys Gly Arg Lys Phe Ala Gln Lys Ile
450 455 460
Asn Leu Gln Val His Thr Lys Ile His Thr Gly Glu Lys Pro Phe Gln
465 470 475 480
Cys Arg Ile Cys Met Arg Asn Phe Ser Arg Ser Asp Val Leu Ser Glu
485 490 495
His Ile Arg Thr His Thr Gly Glu Lys Pro Phe Ala Cys Asp Ile Cys
500 505 510
Gly Arg Lys Phe Ala Gln Arg Asn His Arg Thr Thr His Thr Lys Ile
515 520 525
His Leu Arg Gly Ser Gln Leu Val Lys Ser Glu Leu Glu Glu Lys Lys
530 535 540
Ser Glu Leu Arg His Lys Leu Lys Tyr Val Pro His Glu Tyr Ile Glu
545 550 555 560
Leu Ile Glu Ile Ala Arg Asn Ser Thr Gln Asp Arg Ile Leu Glu Met
565 570 575
Lys Val Met Glu Phe Phe Met Lys Val Tyr Gly Tyr Arg Gly Lys His
580 585 590
Leu Gly Gly Ser Arg Lys Pro Asp Gly Ala Ile Tyr Thr Val Gly Ser
595 600 605
Pro Ile Asp Tyr Gly Val Ile Val Asp Thr Lys Ala Tyr Ser Gly Gly
610 615 620
Tyr Asn Leu Pro Ile Gly Gln Ala Asp Glu Met Gln Arg Tyr Val Lys
625 630 635 640
Glu Asn Gln Thr Arg Asn Lys His Ile Asn Pro Asn Glu Trp Trp Lys
645 650 655
Val Tyr Pro Ser Ser Val Thr Glu Phe Lys Phe Leu Phe Val Ser Gly
660 665 670
His Phe Lys Gly Asn Tyr Lys Ala Gln Leu Thr Arg Leu Asn His Lys
675 680 685
Thr Asn Cys Asn Gly Ala Val Leu Ser Val Glu Glu Leu Leu Ile Gly
690 695 700
Gly Glu Met Ile Lys Ala Gly Thr Leu Thr Leu Glu Glu Val Arg Arg
705 710 715 720
Lys Phe Asn Asn Gly Glu Ile Asn Phe
725
<210> 92
<211> 2028
<212> PRT
<213> 智人
<400> 92
Met Val Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Glu Leu Pro Pro Lys
1 5 10 15
Lys Lys Arg Lys Val Gly Ile Arg Ile Gln Asp Leu Arg Thr Leu Gly
20 25 30
Tyr Ser Gln Gln Gln Gln Glu Lys Ile Lys Pro Lys Val Arg Ser Thr
35 40 45
Val Ala Gln His His Glu Ala Leu Val Gly His Gly Phe Thr His Ala
50 55 60
His Ile Val Ala Leu Ser Gln His Pro Ala Ala Leu Gly Thr Val Ala
65 70 75 80
Val Lys Tyr Gln Asp Met Ile Ala Ala Leu Pro Glu Ala Thr His Glu
85 90 95
Ala Ile Val Gly Val Gly Lys Gln Trp Ser Gly Ala Arg Ala Leu Glu
100 105 110
Ala Leu Leu Thr Val Ala Gly Glu Leu Arg Gly Pro Pro Leu Gln Leu
115 120 125
Asp Thr Gly Gln Leu Leu Lys Ile Ala Lys Arg Gly Gly Val Thr Ala
130 135 140
Val Glu Ala Val His Ala Trp Arg Asn Ala Leu Thr Gly Ala Pro Leu
145 150 155 160
Thr Pro Ala Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln
165 170 175
Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp His
180 185 190
Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly
195 200 205
Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln
210 215 220
Asp His Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn
225 230 235 240
Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu
245 250 255
Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Ala Gln Val Val Ala Ile Ala Ser
260 265 270
Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro
275 280 285
Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro Ala Gln Val Val Ala Ile
290 295 300
Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu
305 310 315 320
Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val
325 330 335
Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln
340 345 350
Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro Ala Gln
355 360 365
Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr
370 375 380
Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro
385 390 395 400
Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu
405 410 415
Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu
420 425 430
Thr Pro Ala Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln
435 440 445
Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His
450 455 460
Gly Leu Thr Pro Ala Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly
465 470 475 480
Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln
485 490 495
Asp His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly
500 505 510
Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu
515 520 525
Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Ala Gln Val Val Ala Ile Ala Ser
530 535 540
Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro
545 550 555 560
Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile
565 570 575
Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu
580 585 590
Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val
595 600 605
Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln
610 615 620
Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro Asp Gln
625 630 635 640
Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr
645 650 655
Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro
660 665 670
Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu
675 680 685
Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu
690 695 700
Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln
705 710 715 720
Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His
725 730 735
Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly
740 745 750
Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln
755 760 765
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770 775 780
Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Ser Ile Val Ala Gln Leu Ser Arg Pro
785 790 795 800
Asp Pro Ala Leu Ala Ala Leu Leu Val Lys Ser Glu Leu Glu Glu Lys
805 810 815
Lys Ser Glu Leu Arg His Lys Leu Lys Tyr Val Pro His Glu Tyr Ile
820 825 830
Glu Leu Ile Glu Ile Ala Arg Asn Pro Thr Gln Asp Arg Ile Leu Glu
835 840 845
Met Lys Val Met Glu Phe Phe Met Lys Val Tyr Gly Tyr Arg Gly Glu
850 855 860
His Leu Gly Gly Ser Arg Lys Pro Asp Gly Ala Ile Tyr Thr Val Gly
865 870 875 880
Ser Pro Ile Asp Tyr Gly Val Ile Val Asp Thr Lys Ala Tyr Ser Gly
885 890 895
Gly Tyr Asn Leu Pro Ile Gly Gln Ala Asp Ala Met Gln Ser Tyr Val
900 905 910
Glu Glu Asn Gln Thr Arg Asn Lys His Ile Asn Pro Asn Glu Trp Trp
915 920 925
Lys Val Tyr Pro Ser Ser Val Thr Glu Phe Lys Phe Leu Phe Val Ser
930 935 940
Gly His Phe Lys Gly Asn Tyr Lys Ala Gln Leu Thr Arg Leu Asn His
945 950 955 960
Ile Thr Asn Cys Asn Gly Ala Val Leu Ser Val Glu Glu Leu Leu Ile
965 970 975
Gly Gly Glu Met Ile Lys Ala Gly Thr Leu Thr Leu Glu Glu Val Arg
980 985 990
Arg Lys Phe Asn Asn Gly Glu Ile Asn Phe Leu Asp Gly Ser Gly Glu
995 1000 1005
Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro
1010 1015 1020
Gly Pro Val Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Glu Leu Pro
1025 1030 1035
Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Gly Ile Arg Ile Gln Asp Leu Arg
1040 1045 1050
Thr Leu Gly Tyr Ser Gln Gln Gln Gln Glu Lys Ile Lys Pro Lys
1055 1060 1065
Val Arg Ser Thr Val Ala Gln His His Glu Ala Leu Val Gly His
1070 1075 1080
Gly Phe Thr His Ala His Ile Val Ala Leu Ser Gln His Pro Ala
1085 1090 1095
Ala Leu Gly Thr Val Ala Val Lys Tyr Gln Asp Met Ile Ala Ala
1100 1105 1110
Leu Pro Glu Ala Thr His Glu Ala Ile Val Gly Val Gly Lys Gln
1115 1120 1125
Trp Ser Gly Ala Arg Ala Leu Glu Ala Leu Leu Thr Val Ala Gly
1130 1135 1140
Glu Leu Arg Gly Pro Pro Leu Gln Leu Asp Thr Gly Gln Leu Leu
1145 1150 1155
Lys Ile Ala Lys Arg Gly Gly Val Thr Ala Val Glu Ala Val His
1160 1165 1170
Ala Trp Arg Asn Ala Leu Thr Gly Ala Pro Leu Thr Pro Asp Gln
1175 1180 1185
Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu
1190 1195 1200
Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu
1205 1210 1215
Thr Pro Ala Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys
1220 1225 1230
Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln
1235 1240 1245
Asp His Gly Leu Thr Pro Ala Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn
1250 1255 1260
Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro
1265 1270 1275
Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val Ala
1280 1285 1290
Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln
1295 1300 1305
Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Asp
1310 1315 1320
Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu
1325 1330 1335
Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly
1340 1345 1350
Leu Thr Pro Ala Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly
1355 1360 1365
Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys
1370 1375 1380
Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser
1385 1390 1395
Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu
1400 1405 1410
Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val
1415 1420 1425
Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val
1430 1435 1440
Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro
1445 1450 1455
Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala
1460 1465 1470
Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His
1475 1480 1485
Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly
1490 1495 1500
Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu
1505 1510 1515
Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Ala Gln Val Val Ala Ile Ala
1520 1525 1530
Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu
1535 1540 1545
Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val
1550 1555 1560
Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr
1565 1570 1575
Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr
1580 1585 1590
Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln
1595 1600 1605
Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala
1610 1615 1620
His Gly Leu Thr Pro Ala Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile
1625 1630 1635
Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val
1640 1645 1650
Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Ala Gln Val Val Ala Ile
1655 1660 1665
Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg
1670 1675 1680
Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro Ala Gln
1685 1690 1695
Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu
1700 1705 1710
Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu
1715 1720 1725
Thr Pro Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys
1730 1735 1740
Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln
1745 1750 1755
Ala His Gly Leu Thr Pro Ala Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His
1760 1765 1770
Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro
1775 1780 1785
Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala
1790 1795 1800
Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Ser Ile Val
1805 1810 1815
Ala Gln Leu Ser Arg Pro Asp Pro Ala Leu Ala Ala Leu Leu Val
1820 1825 1830
Lys Ser Glu Leu Glu Glu Lys Lys Ser Glu Leu Arg His Lys Leu
1835 1840 1845
Lys Tyr Val Pro His Glu Tyr Ile Glu Leu Ile Glu Ile Ala Arg
1850 1855 1860
Asn Pro Thr Gln Asp Arg Ile Leu Glu Met Lys Val Met Glu Phe
1865 1870 1875
Phe Met Lys Val Tyr Gly Tyr Arg Gly Glu His Leu Gly Gly Ser
1880 1885 1890
Arg Lys Pro Asp Gly Ala Ile Tyr Thr Val Gly Ser Pro Ile Asp
1895 1900 1905
Tyr Gly Val Ile Val Asp Thr Lys Ala Tyr Ser Gly Gly Tyr Asn
1910 1915 1920
Leu Pro Ile Gly Gln Ala Arg Glu Met Gln Arg Tyr Val Glu Glu
1925 1930 1935
Asn Gln Thr Arg Asn Lys His Ile Asn Pro Asn Glu Trp Trp Lys
1940 1945 1950
Val Tyr Pro Ser Ser Val Thr Glu Phe Lys Phe Leu Phe Val Ser
1955 1960 1965
Gly His Phe Lys Gly Asn Tyr Lys Ala Gln Leu Thr Arg Leu Asn
1970 1975 1980
His Ile Thr Asn Cys Asn Gly Ala Val Leu Ser Val Glu Glu Leu
1985 1990 1995
Leu Ile Gly Gly Glu Met Ile Lys Ala Gly Thr Leu Thr Leu Glu
2000 2005 2010
Glu Val Arg Arg Lys Phe Asn Asn Gly Glu Ile Asn Phe Leu Asp
2015 2020 2025
<210> 93
<211> 844
<212> PRT
<213> Macaca fuscata
<400> 93
Met Asp Tyr Lys Asp His Asp Gly Asp Tyr Lys Asp His Asp Ile Asp
1 5 10 15
Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Met Ala Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val
20 25 30
Gly Ile His Gly Val Pro Ala Ala Met Ala Glu Arg Pro Phe Gln Cys
35 40 45
Arg Ile Cys Met Arg Asn Phe Ser Arg Ser Asp Asn Leu Ser Val His
50 55 60
Ile Arg Thr His Thr Gly Glu Lys Pro Phe Ala Cys Asp Ile Cys Gly
65 70 75 80
Arg Lys Phe Ala Ala Asn His His Arg Ile Asn His Thr Lys Ile His
85 90 95
Thr Gly Ser Gln Lys Pro Phe Gln Cys Arg Ile Cys Met Arg Asn Phe
100 105 110
Ser Asp Arg Ser Asp Leu Ser Arg His Ile Arg Thr His Thr Gly Glu
115 120 125
Lys Pro Phe Ala Cys Asp Ile Cys Gly Arg Lys Phe Ala Arg Ser Asp
130 135 140
His Leu Ser Arg His Thr Lys Ile His Thr Gly Ser Gln Lys Pro Phe
145 150 155 160
Gln Cys Arg Ile Cys Met Arg Asn Phe Ser Gln Ser Gly Asn Leu Ala
165 170 175
Arg His Ile Arg Thr His Thr Gly Glu Lys Pro Phe Ala Cys Asp Ile
180 185 190
Cys Gly Arg Lys Phe Ala Gln Arg Asn Asp Arg Lys Ser His Thr Lys
195 200 205
Ile His Leu Arg Gly Ser Gln Leu Val Lys Ser Glu Leu Glu Glu Lys
210 215 220
Lys Ser Glu Leu Arg His Lys Leu Lys Tyr Val Pro His Glu Tyr Ile
225 230 235 240
Glu Leu Ile Glu Ile Ala Arg Asn Ser Thr Gln Asp Arg Ile Leu Glu
245 250 255
Met Lys Val Met Glu Phe Phe Met Lys Val Tyr Gly Tyr Arg Gly Lys
260 265 270
His Leu Gly Gly Ser Arg Lys Pro Asp Gly Ala Ile Tyr Thr Val Gly
275 280 285
Ser Pro Ile Asp Tyr Gly Val Ile Val Asp Thr Lys Ala Tyr Ser Gly
290 295 300
Gly Tyr Asn Leu Pro Ile Gly Gln Ala Asp Glu Met Glu Arg Tyr Val
305 310 315 320
Glu Glu Asn Gln Thr Arg Asp Lys His Leu Asn Pro Asn Glu Trp Trp
325 330 335
Lys Val Tyr Pro Ser Ser Val Thr Glu Phe Lys Phe Leu Phe Val Ser
340 345 350
Gly His Phe Lys Gly Asn Tyr Lys Ala Gln Leu Thr Arg Leu Asn His
355 360 365
Ile Thr Asn Cys Asn Gly Ala Val Leu Ser Val Glu Glu Leu Leu Ile
370 375 380
Gly Gly Glu Met Ile Lys Ala Gly Thr Leu Thr Leu Glu Glu Val Arg
385 390 395 400
Arg Lys Phe Asn Asn Gly Glu Ile Asn Phe Arg Ser Gly Ser Gly Glu
405 410 415
Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly
420 425 430
Pro Arg Met Asp Tyr Lys Asp His Asp Gly Asp Tyr Lys Asp His Asp
435 440 445
Ile Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Met Ala Pro Lys Lys Lys Arg
450 455 460
Lys Val Gly Ile His Gly Val Pro Ala Ala Met Ala Glu Arg Pro Phe
465 470 475 480
Gln Cys Arg Ile Cys Met Arg Asn Phe Ser Arg Ser Asp His Leu Ser
485 490 495
Gln His Ile Arg Thr His Thr Gly Glu Lys Pro Phe Ala Cys Asp Ile
500 505 510
Cys Gly Arg Lys Phe Ala Thr Ser Ala Asn Arg Thr Thr His Thr Lys
515 520 525
Ile His Thr Gly Ser Gln Lys Pro Phe Gln Cys Arg Ile Cys Met Arg
530 535 540
Asn Phe Ser Glu Arg Gly Thr Leu Ala Arg His Ile Arg Thr His Thr
545 550 555 560
Gly Glu Lys Pro Phe Ala Cys Asp Ile Cys Gly Arg Lys Phe Ala Gln
565 570 575
Ser Ser Asp Leu Arg Arg His Thr Lys Ile His Thr Gly Ser Gln Lys
580 585 590
Pro Phe Gln Cys Arg Ile Cys Met Arg Asn Phe Ser Gln Ser Ser Asp
595 600 605
Leu Ser Arg His Ile Arg Thr His Thr Gly Glu Lys Pro Phe Ala Cys
610 615 620
Asp Ile Cys Gly Arg Lys Phe Ala Cys Arg Ser Asn Leu Lys Lys His
625 630 635 640
Thr Lys Ile His Leu Arg Gly Ser Gln Leu Val Lys Ser Glu Leu Glu
645 650 655
Glu Lys Lys Ser Glu Leu Arg His Lys Leu Lys Tyr Val Pro His Glu
660 665 670
Tyr Ile Glu Leu Ile Glu Ile Ala Arg Asn Ser Thr Gln Asp Arg Ile
675 680 685
Leu Glu Met Lys Val Met Glu Phe Phe Met Lys Val Tyr Gly Tyr Arg
690 695 700
Gly Lys His Leu Gly Gly Ser Arg Lys Pro Asp Gly Ala Ile Tyr Thr
705 710 715 720
Val Gly Ser Pro Ile Asp Tyr Gly Val Ile Val Asp Thr Lys Ala Tyr
725 730 735
Ser Gly Gly Tyr Asn Leu Pro Ile Gly Gln Ala Asp Glu Met Gln Arg
740 745 750
Tyr Val Lys Glu Asn Gln Thr Arg Asn Lys His Ile Asn Pro Asn Glu
755 760 765
Trp Trp Lys Val Tyr Pro Ser Ser Val Thr Glu Phe Lys Phe Leu Phe
770 775 780
Val Ser Gly His Phe Lys Gly Asn Tyr Lys Ala Gln Leu Thr Arg Leu
785 790 795 800
Asn Arg Lys Thr Asn Cys Asn Gly Ala Val Leu Ser Val Glu Glu Leu
805 810 815
Leu Ile Gly Gly Glu Met Ile Lys Ala Gly Thr Leu Thr Leu Glu Glu
820 825 830
Val Arg Arg Lys Phe Asn Asn Gly Glu Ile Asn Phe
835 840
<210> 94
<211> 191
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 94
Trp Thr Gly Val Asn Pro Thr Glu Ala Asn Cys Gln Ile Met Asn Ser
1 5 10 15
Ser Glu Ser Asn Asp Cys Lys Leu Ile Leu Thr Leu Val Lys Thr Gly
20 25 30
Ala Leu Val Thr Ala Phe Val Tyr Val Ile Gly Val Ser Asn Asn Phe
35 40 45
Asn Met Leu Thr Thr His Arg Asn Ile Asn Phe Thr Ala Glu Leu Phe
50 55 60
Phe Asp Ser Thr Gly Asn Leu Leu Thr Arg Leu Ser Ser Leu Lys Thr
65 70 75 80
Pro Leu Asn His Lys Ser Gly Gln Asn Met Ala Thr Gly Ala Ile Thr
85 90 95
Asn Ala Lys Gly Phe Met Pro Ser Thr Thr Ala Tyr Pro Phe Asn Asp
100 105 110
Asn Ser Arg Glu Lys Glu Asn Tyr Ile Tyr Gly Thr Cys Tyr Tyr Thr
115 120 125
Ala Ser Asp Arg Thr Ala Phe Pro Ile Asp Ile Ser Val Met Leu Asn
130 135 140
Arg Arg Ala Ile Asn Asp Glu Thr Ser Tyr Cys Ile Arg Ile Thr Trp
145 150 155 160
Ser Trp Asn Thr Gly Asp Ala Pro Glu Val Gln Thr Ser Ala Thr Thr
165 170 175
Leu Val Thr Ser Pro Phe Thr Phe Tyr Tyr Ile Arg Glu Asp Asp
180 185 190
<210> 95
<211> 190
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 95
Trp Thr Gly Ala Lys Pro Ser Ala Asn Cys Val Ile Lys Glu Gly Glu
1 5 10 15
Asp Ser Pro Asp Cys Lys Leu Thr Leu Val Leu Val Lys Asn Gly Gly
20 25 30
Leu Ile Asn Gly Tyr Ile Thr Leu Met Gly Ala Ser Glu Tyr Thr Asn
35 40 45
Thr Leu Phe Lys Asn Asn Gln Val Thr Ile Asp Val Asn Leu Ala Phe
50 55 60
Asp Asn Thr Gly Gln Ile Ile Thr Tyr Leu Ser Ser Leu Lys Ser Asn
65 70 75 80
Leu Asn Phe Lys Asp Asn Gln Asn Met Ala Thr Gly Thr Ile Thr Ser
85 90 95
Ala Lys Gly Phe Met Pro Ser Thr Thr Ala Tyr Pro Phe Ile Thr Tyr
100 105 110
Ala Thr Glu Thr Leu Asn Glu Asp Tyr Ile Tyr Gly Glu Cys Tyr Tyr
115 120 125
Lys Ser Thr Asn Gly Thr Leu Phe Pro Leu Lys Val Thr Val Thr Leu
130 135 140
Asn Arg Arg Met Leu Ala Ser Gly Met Ala Tyr Ala Met Asn Phe Ser
145 150 155 160
Trp Ser Leu Asn Ala Glu Glu Ala Pro Glu Thr Thr Glu Val Thr Leu
165 170 175
Ile Thr Ser Pro Phe Phe Phe Ser Tyr Ile Arg Glu Asp Asp
180 185 190
<210> 96
<211> 189
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 96
Trp Thr Gly Ile Lys Pro Pro Pro Asn Cys Gln Ile Val Glu Asn Thr
1 5 10 15
Asp Thr Asn Asp Gly Lys Leu Thr Leu Val Leu Val Lys Asn Gly Gly
20 25 30
Leu Val Asn Gly Tyr Val Ser Leu Val Gly Val Ser Asp Thr Val Asn
35 40 45
Gln Met Phe Thr Gln Lys Ser Ala Thr Ile Gln Leu Arg Leu Tyr Phe
50 55 60
Asp Ser Ser Gly Asn Leu Leu Thr Asp Glu Ser Asn Leu Lys Ile Pro
65 70 75 80
Leu Lys Asn Lys Ser Ser Thr Ala Thr Ser Glu Ala Ala Thr Ser Ser
85 90 95
Lys Ala Phe Met Pro Ser Thr Thr Ala Tyr Pro Phe Asn Thr Thr Thr
100 105 110
Arg Asp Ser Glu Asn Tyr Ile His Gly Ile Cys Tyr Tyr Met Thr Ser
115 120 125
Tyr Asp Arg Ser Leu Val Pro Leu Asn Ile Ser Ile Met Leu Asn Ser
130 135 140
Arg Thr Ile Ser Ser Asn Val Ala Tyr Ala Ile Gln Phe Glu Trp Asn
145 150 155 160
Leu Asn Ala Lys Glu Ser Pro Glu Ser Asn Ile Ala Thr Leu Thr Thr
165 170 175
Ser Pro Phe Phe Phe Ser Tyr Ile Arg Glu Asp Asp Asn
180 185
<210> 97
<211> 189
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 97
Trp Thr Gly Ile Asn Pro Pro Pro Asn Cys Gln Ile Val Glu Asn Thr
1 5 10 15
Asn Thr Asn Asp Gly Lys Leu Thr Leu Val Leu Val Lys Asn Gly Gly
20 25 30
Leu Val Asn Gly Tyr Val Ser Leu Val Gly Val Ser Asp Thr Val Asn
35 40 45
Gln Met Phe Thr Gln Lys Thr Ala Asn Ile Gln Leu Arg Leu Tyr Phe
50 55 60
Asp Ser Ser Gly Asn Leu Leu Thr Asp Glu Ser Asp Leu Lys Ile Pro
65 70 75 80
Leu Lys Asn Lys Ser Ser Thr Ala Thr Ser Glu Thr Val Ala Ser Ser
85 90 95
Lys Ala Phe Met Pro Ser Thr Thr Ala Tyr Pro Phe Asn Thr Thr Thr
100 105 110
Arg Asp Ser Glu Asn Tyr Ile His Gly Ile Cys Tyr Tyr Met Thr Ser
115 120 125
Tyr Asp Arg Ser Leu Phe Pro Leu Asn Ile Ser Ile Met Leu Asn Ser
130 135 140
Arg Met Ile Ser Ser Asn Val Ala Tyr Ala Ile Gln Phe Glu Trp Asn
145 150 155 160
Leu Asn Ala Ser Glu Ser Pro Glu Ser Asn Ile Ala Thr Leu Thr Thr
165 170 175
Ser Pro Phe Phe Phe Ser Tyr Ile Thr Glu Asp Asp Asn
180 185
<210> 98
<211> 189
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 98
Trp Thr Gly Ile Lys Pro Pro Pro Asn Cys Gln Ile Val Glu Asn Thr
1 5 10 15
Asp Thr Asn Asp Gly Lys Leu Thr Leu Val Leu Val Lys Asn Gly Gly
20 25 30
Leu Val Asn Gly Tyr Val Ser Leu Val Gly Val Ser Asp Thr Val Asn
35 40 45
Gln Met Phe Thr Gln Lys Ser Ala Thr Ile Gln Leu Arg Leu Tyr Phe
50 55 60
Asp Ser Ser Gly Asn Leu Leu Thr Asp Glu Ser Asn Leu Lys Ile Pro
65 70 75 80
Leu Lys Asn Lys Ser Ser Thr Ala Thr Ser Glu Ala Ala Thr Ser Ser
85 90 95
Lys Ala Phe Met Pro Ser Thr Thr Ala Tyr Pro Phe Asn Thr Thr Thr
100 105 110
Arg Asp Ser Glu Asn Tyr Ile His Gly Ile Cys Tyr Tyr Met Thr Ser
115 120 125
Tyr Asp Arg Ser Leu Val Pro Leu Asn Ile Ser Ile Met Leu Asn Ser
130 135 140
Arg Thr Ile Ser Ser Asn Val Ala Tyr Ala Ile Gln Phe Glu Trp Asn
145 150 155 160
Leu Asn Ala Lys Glu Ser Pro Glu Ser Asn Ile Ala Thr Leu Thr Thr
165 170 175
Ser Pro Phe Phe Phe Ser Tyr Ile Arg Glu Asp Asp Asn
180 185
<210> 99
<211> 189
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (73)..(73)
<223> X是D或G
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (111)..(111)
<223> X是T或A
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (122)..(122)
<223> X是I或L
<400> 99
Trp Thr Gly Ile Asn Pro Pro Pro Asn Cys Gln Ile Val Glu Asn Thr
1 5 10 15
Asn Thr Asn Asp Gly Lys Leu Thr Leu Val Leu Val Lys Asn Gly Gly
20 25 30
Leu Val Asn Gly Tyr Val Ser Leu Val Gly Val Ser Asp Thr Val Asn
35 40 45
Gln Met Phe Thr Gln Lys Thr Ala Asn Ile Gln Leu Arg Leu Tyr Phe
50 55 60
Asp Ser Ser Gly Asn Leu Leu Thr Xaa Glu Ser Asp Leu Lys Ile Pro
65 70 75 80
Leu Lys Asn Lys Ser Ser Thr Ala Thr Ser Glu Thr Val Ala Ser Ser
85 90 95
Lys Ala Phe Met Pro Ser Thr Thr Ala Tyr Pro Phe Asn Thr Xaa Thr
100 105 110
Arg Asp Ser Glu Asn Tyr Ile His Gly Xaa Cys Tyr Tyr Met Thr Ser
115 120 125
Tyr Asp Arg Ser Leu Phe Pro Leu Asn Ile Ser Ile Met Leu Asn Ser
130 135 140
Arg Met Ile Ser Ser Asn Val Ala Tyr Ala Ile Gln Phe Glu Trp Asn
145 150 155 160
Leu Asn Ala Ser Glu Ser Pro Glu Ser Asn Ile Ala Thr Leu Thr Thr
165 170 175
Ser Pro Phe Phe Phe Ser Tyr Ile Thr Glu Asp Asp Asn
180 185
<210> 100
<211> 189
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 100
Trp Thr Gly Ile Asn Pro Pro Pro Asn Cys Gln Ile Val Glu Asn Thr
1 5 10 15
Asn Thr Asn Asp Gly Lys Leu Thr Leu Val Leu Val Lys Asn Gly Gly
20 25 30
Leu Val Asn Gly Tyr Val Ser Leu Val Gly Val Ser Asp Thr Val Asn
35 40 45
Gln Met Phe Thr Gln Lys Thr Ala Asn Ile Gln Leu Arg Leu Tyr Phe
50 55 60
Asp Ser Ser Gly Asn Leu Leu Thr Asp Glu Ser Asp Leu Lys Ile Pro
65 70 75 80
Leu Lys Asn Lys Ser Ser Thr Ala Thr Ser Glu Thr Val Ala Ser Ser
85 90 95
Lys Ala Phe Met Pro Ser Thr Thr Ala Tyr Pro Phe Asn Thr Thr Thr
100 105 110
Arg Asp Ser Glu Asn Tyr Ile His Gly Ile Cys Tyr Tyr Met Thr Ser
115 120 125
Tyr Asp Arg Ser Leu Phe Pro Leu Asn Ile Ser Ile Met Leu Asn Ser
130 135 140
Arg Met Ile Ser Ser Asn Val Ala Tyr Ala Ile Gln Phe Glu Trp Asn
145 150 155 160
Leu Asn Ala Ser Glu Ser Pro Glu Ser Asn Ile Ala Thr Leu Thr Thr
165 170 175
Ser Pro Phe Phe Phe Ser Tyr Ile Thr Glu Asp Asp Asn
180 185
<210> 101
<211> 189
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 101
Trp Thr Gly Ile Asn Pro Pro Pro Asn Cys Gln Ile Val Glu Asn Thr
1 5 10 15
Asn Thr Asn Asp Gly Lys Leu Thr Leu Val Leu Val Lys Asn Gly Gly
20 25 30
Leu Val Asn Gly Tyr Val Ser Leu Val Gly Val Ser Asp Thr Val Asn
35 40 45
Gln Met Phe Thr Gln Lys Thr Ala Asn Ile Gln Leu Arg Leu Tyr Phe
50 55 60
Asp Ser Ser Gly Asn Leu Leu Thr Gly Glu Ser Asp Leu Lys Ile Pro
65 70 75 80
Leu Lys Asn Lys Ser Ser Thr Ala Thr Ser Glu Thr Val Ala Ser Ser
85 90 95
Lys Ala Phe Met Pro Ser Thr Thr Ala Tyr Pro Phe Asn Thr Ala Thr
100 105 110
Arg Asp Ser Glu Asn Tyr Ile His Gly Leu Cys Tyr Tyr Met Thr Ser
115 120 125
Tyr Asp Arg Ser Leu Phe Pro Leu Asn Ile Ser Ile Met Leu Asn Ser
130 135 140
Arg Met Ile Ser Ser Asn Val Ala Tyr Ala Ile Gln Phe Glu Trp Asn
145 150 155 160
Leu Asn Ala Ser Glu Ser Pro Glu Ser Asn Ile Ala Thr Leu Thr Thr
165 170 175
Ser Pro Phe Phe Phe Ser Tyr Ile Thr Glu Asp Asp Asn
180 185
<210> 102
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 102
Phe Pro Pro Glu Val Glu Glu Gln Asp Asp Gly Thr Leu Pro Met Ser
1 5 10 15
Cys Ala Gln Glu Gly Met Asp Arg
20
<210> 103
<211> 751
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 103
Met Gly His Pro His Pro Asp Lys Leu Gln Lys Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Asp Tyr Lys Asp His Asp Gly Asp Tyr
20 25 30
Lys Asp His Asp Ile Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Met Ala Pro
35 40 45
Lys Lys Lys Arg Lys Val Gly Ile His Gly Val Pro Ala Ala Met Ala
50 55 60
Glu Arg Pro Phe Gln Cys Arg Ile Cys Met Arg Asn Phe Ser Asp Arg
65 70 75 80
Ser Asn Leu Ser Arg His Ile Arg Thr His Thr Gly Glu Lys Pro Phe
85 90 95
Ala Cys Asp Ile Cys Gly Arg Lys Phe Ala Ile Ser Ser Asn Leu Asn
100 105 110
Ser His Thr Lys Ile His Thr Gly Ser Gln Lys Pro Phe Gln Cys Arg
115 120 125
Ile Cys Met Arg Asn Phe Ser Arg Ser Asp Asn Leu Ala Arg His Ile
130 135 140
Arg Thr His Thr Gly Glu Lys Pro Phe Ala Cys Asp Ile Cys Gly Arg
145 150 155 160
Lys Phe Ala Thr Ser Gly Asn Leu Thr Arg His Thr Lys Ile His Leu
165 170 175
Arg Gly Ser Gln Leu Val Lys Ser Glu Leu Glu Glu Lys Lys Ser Glu
180 185 190
Leu Arg His Lys Leu Lys Tyr Val Pro His Glu Tyr Ile Glu Leu Ile
195 200 205
Glu Ile Ala Arg Asn Ser Thr Gln Asp Arg Ile Leu Glu Met Lys Val
210 215 220
Met Glu Phe Phe Met Lys Val Tyr Gly Tyr Arg Gly Lys His Leu Gly
225 230 235 240
Gly Ser Arg Lys Pro Asp Gly Ala Ile Tyr Thr Val Gly Ser Pro Ile
245 250 255
Asp Tyr Gly Val Ile Val Asp Thr Lys Ala Tyr Ser Gly Gly Tyr Asn
260 265 270
Leu Pro Ile Gly Gln Ala Asp Glu Met Glu Arg Tyr Val Glu Glu Asn
275 280 285
Gln Thr Arg Asn Lys His Leu Asn Pro Asn Glu Trp Trp Lys Val Tyr
290 295 300
Pro Ser Ser Val Thr Glu Phe Lys Phe Leu Phe Val Ser Gly His Phe
305 310 315 320
Lys Gly Asn Tyr Lys Ala Gln Leu Thr Arg Leu Asn His Ile Thr Asn
325 330 335
Cys Asn Gly Ala Val Leu Ser Val Glu Glu Leu Leu Ile Gly Gly Glu
340 345 350
Met Ile Lys Ala Gly Thr Leu Thr Leu Glu Glu Val Arg Arg Lys Phe
355 360 365
Asn Asn Gly Glu Ile Asn Phe Arg Ser Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly
370 375 380
Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Arg Met
385 390 395 400
Asp Tyr Lys Asp His Asp Gly Asp Tyr Lys Asp His Asp Ile Asp Tyr
405 410 415
Lys Asp Asp Asp Asp Lys Met Ala Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Gly
420 425 430
Ile His Gly Val Pro Ala Ala Met Ala Glu Arg Pro Phe Gln Cys Arg
435 440 445
Ile Cys Met Arg Asn Phe Ser Arg Ser Asp Asn Leu Ser Val His Ile
450 455 460
Arg Thr His Thr Gly Glu Lys Pro Phe Ala Cys Asp Ile Cys Gly Arg
465 470 475 480
Lys Phe Ala Gln Lys Ile Asn Leu Gln Val His Thr Lys Ile His Thr
485 490 495
Gly Glu Lys Pro Phe Gln Cys Arg Ile Cys Met Arg Asn Phe Ser Arg
500 505 510
Ser Asp Val Leu Ser Glu His Ile Arg Thr His Thr Gly Glu Lys Pro
515 520 525
Phe Ala Cys Asp Ile Cys Gly Arg Lys Phe Ala Gln Arg Asn His Arg
530 535 540
Thr Thr His Thr Lys Ile His Leu Arg Gly Ser Gln Leu Val Lys Ser
545 550 555 560
Glu Leu Glu Glu Lys Lys Ser Glu Leu Arg His Lys Leu Lys Tyr Val
565 570 575
Pro His Glu Tyr Ile Glu Leu Ile Glu Ile Ala Arg Asn Ser Thr Gln
580 585 590
Asp Arg Ile Leu Glu Met Lys Val Met Glu Phe Phe Met Lys Val Tyr
595 600 605
Gly Tyr Arg Gly Lys His Leu Gly Gly Ser Arg Lys Pro Asp Gly Ala
610 615 620
Ile Tyr Thr Val Gly Ser Pro Ile Asp Tyr Gly Val Ile Val Asp Thr
625 630 635 640
Lys Ala Tyr Ser Gly Gly Tyr Asn Leu Pro Ile Gly Gln Ala Asp Glu
645 650 655
Met Gln Arg Tyr Val Lys Glu Asn Gln Thr Arg Asn Lys His Ile Asn
660 665 670
Pro Asn Glu Trp Trp Lys Val Tyr Pro Ser Ser Val Thr Glu Phe Lys
675 680 685
Phe Leu Phe Val Ser Gly His Phe Lys Gly Asn Tyr Lys Ala Gln Leu
690 695 700
Thr Arg Leu Asn His Lys Thr Asn Cys Asn Gly Ala Val Leu Ser Val
705 710 715 720
Glu Glu Leu Leu Ile Gly Gly Glu Met Ile Lys Ala Gly Thr Leu Thr
725 730 735
Leu Glu Glu Val Arg Arg Lys Phe Asn Asn Gly Glu Ile Asn Phe
740 745 750
<210> 104
<211> 387
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 104
aagtttccag agctttcgag gaaggtttct tcaactcaaa ttcatccgcc tgataatttt 60
cttatatttt cctaaagaag gaagagaagc gcatagagga gaagggaaat aattttttag 120
gagcctttct tacggctatg aggaatttgg ggctcagttg aaaagcctaa actgcctctc 180
gggaggttgg gcgcggcgaa ctactttcag cggcgcacgg agacggcgtc tacgtgaggg 240
gtgataagtg acgcaacact cgttgcataa atttgcgctc cgccagcccg gagcatttag 300
gggcggttgg ctttgttggg tgagcttgtt tgtgtccctg tgggtggacg tggttggtga 360
ttggcaggat cctggtatcc gctacag 387
<210> 105
<211> 358
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 105
Pro Gly Val Leu Ser Leu Arg Leu Ser Glu Pro Leu Val Thr Ser Asn
1 5 10 15
Gly Met Leu Ala Leu Lys Met Gly Asn Gly Leu Ser Leu Asp Glu Ala
20 25 30
Gly Asn Leu Thr Ser Gln Asn Val Thr Thr Val Ser Pro Pro Leu Lys
35 40 45
Lys Thr Lys Ser Asn Ile Asn Leu Glu Ile Ser Ala Pro Leu Thr Val
50 55 60
Thr Ser Glu Ala Leu Thr Val Ala Ala Ala Ala Pro Leu Met Val Ala
65 70 75 80
Gly Asn Thr Leu Thr Met Gln Ser Gln Ala Pro Leu Thr Val His Asp
85 90 95
Ser Lys Leu Ser Ile Ala Thr Gln Gly Pro Leu Thr Val Ser Glu Gly
100 105 110
Lys Leu Ala Leu Gln Thr Ser Gly Pro Leu Thr Thr Thr Asp Ser Ser
115 120 125
Thr Leu Thr Ile Thr Ala Ser Pro Pro Leu Thr Thr Ala Thr Gly Ser
130 135 140
Leu Gly Ile Asp Leu Lys Glu Pro Ile Tyr Thr Gln Asn Gly Lys Leu
145 150 155 160
Gly Leu Lys Tyr Gly Ala Pro Leu His Val Thr Asp Asp Leu Asn Thr
165 170 175
Leu Thr Val Ala Thr Gly Pro Gly Val Thr Ile Asn Asn Thr Ser Leu
180 185 190
Gln Thr Lys Val Thr Gly Ala Leu Gly Phe Asp Ser Gln Gly Asn Met
195 200 205
Gln Leu Asn Val Ala Gly Gly Leu Arg Ile Asp Ser Gln Asn Arg Arg
210 215 220
Leu Ile Leu Asp Val Ser Tyr Pro Phe Asp Ala Gln Asn Gln Leu Asn
225 230 235 240
Leu Arg Leu Gly Gln Gly Pro Leu Phe Ile Asn Ser Ala His Asn Leu
245 250 255
Asp Ile Asn Tyr Asn Lys Gly Leu Tyr Leu Phe Thr Ala Ser Asn Asn
260 265 270
Ser Lys Lys Leu Glu Val Asn Leu Ser Thr Ala Lys Gly Leu Met Phe
275 280 285
Asp Ala Thr Ala Ile Ala Ile Asn Ala Gly Asp Gly Leu Glu Phe Gly
290 295 300
Ser Pro Asn Ala Pro Asn Thr Asn Pro Leu Lys Thr Lys Ile Gly His
305 310 315 320
Gly Leu Glu Phe Asp Ser Asn Lys Ala Met Val Pro Lys Leu Gly Thr
325 330 335
Gly Leu Ser Phe Asp Ser Thr Gly Ala Ile Thr Val Gly Asn Lys Asn
340 345 350
Asn Asp Lys Leu Thr Leu
355
<210> 106
<211> 100
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 106
Glu Leu Ile Arg Val Ala Ile Leu Trp His Glu Met Trp His Glu Gly
1 5 10 15
Leu Glu Glu Ala Ser Arg Leu Tyr Phe Gly Glu Arg Asn Val Lys Gly
20 25 30
Met Phe Glu Val Leu Glu Pro Leu His Ala Met Met Glu Arg Gly Pro
35 40 45
Gln Thr Leu Lys Glu Thr Ser Phe Asn Gln Ala Tyr Gly Arg Asp Leu
50 55 60
Met Glu Ala Gln Glu Trp Cys Arg Lys Tyr Met Lys Ser Gly Asn Val
65 70 75 80
Lys Asp Leu Thr Gln Ala Trp Asp Leu Tyr Tyr His Val Phe Arg Arg
85 90 95
Ile Ser Lys Gln
100
<210> 107
<400> 107
000
<210> 108
<400> 108
000
<210> 109
<400> 109
000
<210> 110
<400> 110
000
<210> 111
<400> 111
000
<210> 112
<400> 112
000
<210> 113
<400> 113
000
<210> 114
<400> 114
000
<210> 115
<400> 115
000
<210> 116
<400> 116
000
<210> 117
<400> 117
000
<210> 118
<211> 92
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 118
Asn Gly Val Leu Thr Leu Lys Cys Leu Thr Pro Leu Thr Thr Thr Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Gln Leu Lys Val Gly Gly Gly Leu Thr Val Asp Asp Thr
20 25 30
Asn Gly Phe Leu Lys Glu Asn Ile Ser Ala Thr Thr Pro Leu Val Lys
35 40 45
Thr Gly His Ser Ile Gly Leu Pro Leu Gly Ala Gly Leu Gly Thr Asn
50 55 60
Glu Asn Lys Leu Cys Ile Lys Leu Gly Gln Gly Leu Thr Phe Asn Ser
65 70 75 80
Asn Asn Ile Cys Ile Asp Asp Asn Ile Asn Thr Leu
85 90
<210> 119
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 119
Asp Gly Val Leu Thr Leu Lys Cys Val Asn Pro Leu Thr Thr Ala Ser
1 5 10 15
Gly Pro Leu Gln Leu Lys Val Gly Ser Ser Leu Thr Val Asp Thr Ile
20 25 30
Asp Gly Ser Leu Glu Glu Asn Ile Thr Ala Ala Ala Pro Leu Thr Lys
35 40 45
Thr Asn His Ser Ile Gly Leu Leu Ile Gly Ser Gly Leu Gln Thr Lys
50 55 60
Asp Asp Lys Leu Cys Leu Ser Leu Gly Asp Gly Leu Val Thr Lys Asp
65 70 75 80
Asp Lys Leu Cys Leu Ser Leu Gly Asp Gly Leu Ile Thr Lys Asn Asp
85 90 95
Val Leu Cys Ala Lys Leu Gly His Gly Leu Val Phe Asp Ser Ser Asn
100 105 110
Ala Ile Thr Ile Glu Asn Asn Thr Leu
115 120
<210> 120
<211> 92
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 120
Asp Gly Val Leu Thr Leu Asn Cys Leu Thr Pro Leu Thr Thr Thr Gly
1 5 10 15
Gly Pro Leu Gln Leu Lys Val Gly Gly Gly Leu Ile Val Asp Asp Thr
20 25 30
Asp Gly Thr Leu Gln Glu Asn Ile Arg Ala Thr Ala Pro Ile Thr Lys
35 40 45
Asn Asn His Ser Val Glu Leu Ser Ile Gly Asn Gly Leu Glu Thr Gln
50 55 60
Asn Asn Lys Leu Cys Ala Lys Leu Gly Asn Gly Leu Lys Phe Asn Asn
65 70 75 80
Gly Asp Ile Cys Ile Lys Asp Ser Ile Asn Thr Leu
85 90
<210> 121
<211> 92
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 121
Asp Gly Val Leu Thr Leu Lys Cys Leu Thr Pro Leu Thr Thr Thr Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Gln Leu Lys Val Gly Gly Gly Leu Thr Val Asp Asp Thr
20 25 30
Asp Gly Thr Leu Gln Glu Asn Ile Arg Ala Thr Ala Pro Ile Thr Lys
35 40 45
Asn Asn His Ser Val Glu Leu Ser Ile Gly Asn Gly Leu Glu Thr Gln
50 55 60
Asn Asn Lys Leu Cys Ala Lys Leu Gly Asn Gly Leu Lys Phe Asn Asn
65 70 75 80
Gly Asp Ile Cys Ile Lys Asp Ser Ile Asn Thr Leu
85 90
<210> 122
<211> 92
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 122
Asp Gly Val Leu Thr Leu Asn Cys Leu Thr Pro Leu Thr Thr Thr Gly
1 5 10 15
Gly Pro Leu Gln Leu Lys Val Gly Gly Gly Leu Ile Val Asp Asp Thr
20 25 30
Asp Gly Thr Leu Gln Glu Asn Ile Arg Val Thr Ala Pro Ile Thr Lys
35 40 45
Asn Asn His Ser Val Glu Leu Ser Ile Gly Asn Gly Leu Glu Thr Gln
50 55 60
Asn Asn Lys Leu Cys Ala Lys Leu Gly Asn Gly Leu Lys Phe Asn Asn
65 70 75 80
Gly Asp Ile Cys Ile Lys Asp Ser Ile Asn Thr Leu
85 90
<210> 123
<211> 91
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> X是T或S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> X是L或V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> X是T或N
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (14)..(14)
<223> X是T或A
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (15)..(15)
<223> X是G或S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (24)..(24)
<223> X是G或S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (30)..(30)
<223> X是D或T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (32)..(32)
<223> X是D或N
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (34)..(34)
<223> X是T, F或S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (36)..(36)
<223> X是Q, K或E
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> X是G, S或K
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (41)..(41)
<223> X是A或V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (42)..(42)
<223> X是T或N
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (46)..(46)
<223> X是T或V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (48)..(48)
<223> X是T或S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (49)..(49)
<223> X是G或N
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (53)..(53)
<223> X是G或N
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (55)..(55)
<223> X是S或P
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (56)..(56)
<223> X是L或I
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (58)..(58)
<223> X是A, P或N
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (61)..(61)
<223> X是G或Q
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (62)..(62)
<223> X是T或I
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (63)..(63)
<223> X是D或E
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (64)..(64)
<223> X是Q或E
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (69)..(69)
<223> X是T, S或A
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (73)..(73)
<223> X是E, Q或N
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (78)..(78)
<223> X是D或N
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (80)..(80)
<223> X是S或N
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (82)..(82)
<223> X是S或I
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (83)..(83)
<223> X是C或I
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (84)..(84)
<223> X是A或I
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (85)..(85)
<223> X是D, N或L
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (86)..(86)
<223> X是D或K
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (88)..(88)
<223> X是I或不存在
<400> 123
Gly Val Leu Xaa Leu Lys Cys Xaa Xaa Pro Leu Thr Thr Xaa Xaa Gly
1 5 10 15
Ser Leu Gln Leu Lys Val Gly Xaa Gly Leu Thr Val Asp Xaa Thr Xaa
20 25 30
Gly Xaa Leu Xaa Glu Asn Ile Xaa Xaa Xaa Thr Pro Leu Xaa Lys Xaa
35 40 45
Xaa His Ser Ile Xaa Leu Xaa Xaa Gly Xaa Gly Leu Xaa Xaa Xaa Xaa
50 55 60
Asn Lys Leu Cys Xaa Lys Leu Gly Xaa Gly Leu Thr Phe Xaa Ser Xaa
65 70 75 80
Asn Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asn Xaa Asn Thr Leu
85 90
<210> 124
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 124
Asn Ser Ile Ala Leu Lys Asn Asn Thr Leu
1 5 10
<210> 125
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 125
Asn Ser Asn Asn Ile Cys Ile Asn Asp Asn Ile Asn Thr Leu
1 5 10
<210> 126
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 126
Gly Ala Ile Thr Val Gly Asn Lys Asn Asn Asp Lys Leu Thr Leu
1 5 10 15
<210> 127
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 127
Asn Ser Asn Asn Ile Cys Ile Asp Asp Asn Ile Asn Thr Leu
1 5 10
<210> 128
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 128
Asn Ser Asn Asn Ile Cys Ile Asp Asp Asn Ile Asn Thr Leu
1 5 10
<210> 129
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 129
Gly Asp Ile Cys Ile Lys Asp Ser Ile Asn Thr Leu
1 5 10
<210> 130
<211> 91
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (28)..(28)
<223> X是V或I
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (34)..(34)
<223> X是T或F
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (36)..(36)
<223> X是Q或K
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> X是G或S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (55)..(55)
<223> X是P或S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (58)..(58)
<223> X是P或A
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (63)..(63)
<223> X是D或N
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (69)..(69)
<223> X是T或A
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (73)..(73)
<223> X是E或Q
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (85)..(85)
<223> X是D或N
<400> 130
Gly Val Leu Thr Leu Lys Cys Leu Thr Pro Leu Thr Thr Thr Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Gln Leu Lys Val Gly Gly Gly Leu Thr Xaa Asp Asp Thr Asp
20 25 30
Gly Xaa Leu Xaa Glu Asn Ile Xaa Ala Thr Thr Pro Leu Val Lys Thr
35 40 45
Gly His Ser Ile Gly Leu Xaa Leu Gly Xaa Gly Leu Gly Thr Xaa Glu
50 55 60
Asn Lys Leu Cys Xaa Lys Leu Gly Xaa Gly Leu Thr Phe Asn Ser Asn
65 70 75 80
Asn Ile Cys Ile Xaa Asp Asn Ile Asn Thr Leu
85 90
<210> 131
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 131
Met Thr Lys Arg Val Arg Leu Ser Asp Ser Phe Asn Pro Val Tyr Pro
1 5 10 15
Tyr Glu Asp Glu Ser Thr Ser Gln His Pro Phe Ile Asn Pro Gly Phe
20 25 30
Ile Ser Pro Asn Gly Phe Thr Gln Ser Pro
35 40
<210> 132
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 132
Met Ala Lys Arg Ala Arg Leu Ser Ser Ser Phe Asn Pro Val Tyr Pro
1 5 10 15
Tyr Glu Asp Glu Ser Ser Ser Gln His Pro Phe Ile Asn Pro Gly Phe
20 25 30
Ile Ser Ser Asn Gly Phe Ala Gln Ser Pro
35 40
<210> 133
<211> 137
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 133
catcatcaat aatatacctt atagatggaa tggtgccaat atgtaaatga ggtgatttta 60
aaaagtgtgg atcgtgtggt gattggctgt ggggttaacg gctaaaaggg gcggtgcgac 120
cgtgggaaaa tgacgtt 137
<210> 134
<211> 114
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 134
cattatctat aatatacctt atagatggaa tggtgccaac atgtaaatga ggtaatttaa 60
aaaagtgcgc gctgtgtggt gattggctgc ggggtgaacg gctaaaaggg gcgg 114
<210> 135
<211> 112
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 135
tattatataa tataccttat agatggaatg gtgccaatat gcaaatgagg taatttaaaa 60
aagtgcgcgc tgtgtggtga ttggctgcgg ggtgaacggc taaaaggggc gg 112
<210> 136
<211> 137
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 136
catcatcaat aatatacctt atagatggaa tggtgccaat atgtaaatga ggtgatttta 60
aaaagtgtgg gccgtgtggt gattggctgt ggggttaacg gttaaaaggg gcggcgcggc 120
cgtgggaaaa tgacgtt 137
<210> 137
<211> 114
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 137
caatcaatat aatatacctt atagatggaa tggtgccaat atgtaaatga ggtaatttaa 60
aaaagtgcgc gctgtgtggt gattggctgc ggggtgaacg gctaaaaggg gcgg 114
<210> 138
<211> 541
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 138
catcatcaat aatatacctt attttggatt gaagccaata tgataatgag ggggtggagt 60
ttgtgacgtg gcgcggggcg tgggaacggg gcgggtgacg tagtagtgtg gcggaagtgt 120
gatgttgcaa gtgtggcgga acacatgtaa gcgacggatg tggcaaaagt gacgtttttg 180
gtgtgcgccg gatccaataa cttcgtatag catacattat acgaagttat aagtactgaa 240
ttcggatccg gtgtacacag gaagtgactt ttaacgcgcg gtttgttacg gatgttgtag 300
taaatttgtc tagggccgag taagatttga ccgtttacgc ggggactttg aataagagcg 360
agtgaaatct gaataatttt gttgtactca tagcgcgtaa tctctagacg ttatataatt 420
cgaatttgta cccggggatc caataacttc gtatagcata cattatacga agttataagt 480
actgaattcg gatcctctag ctagagtcga cctgcaggca tgctctagac tcgagggatc 540
t 541
<210> 139
<211> 180
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 139
gtgtacacag gaagtgacaa ttttcgcgcg gttttaggcg gatgttgtag taaatttggg 60
cgtaaccgag taagatttgg ccattttcgc gggaaaactg aataagagga agtgaaatct 120
gaataatttt gtgttactca tagcgcgtaa tatttgtcta gggccgcggg gactttgacc 180
<210> 140
<211> 210
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 140
acgcataaaa aggcttcttt tctcacggaa ctacttagtt ttcccacggt atttaacagg 60
aaatgaggta gttttgaccg gatgcaagtg aaaattgctg attttcgcgc gaaaactgaa 120
tgaggaagtg tttttctgaa taatgtggta tttatggcag ggtggagtat ttgttcaggg 180
ccaggtagac tttgacccat tacgtggagg 210
<210> 141
<211> 178
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 141
ctgtacacac gaaacgacaa ttttcccacg gtattaaaca gaaaatgaag taaatttgac 60
cggaaccaag taaaaattgc ccattttcgc gcgaaaactg aatgaggaag tgaaatctga 120
ataatgtggt attaatcaca gcgcggaata tttgtccagg gccacggaga ctttgacc 178
<210> 142
<211> 114
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(6)
<223> 任选地不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (105)..(114)
<223> 任选地不存在
<400> 142
ctaggattat ggcactggta gaattcacta cttatggcac tggtagaatt cactacttat 60
ggcactggta gaattcacta cttatggcac tggtagaatt cactatcgcc cggg 114
<210> 143
<211> 115
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(9)
<223> 任选地不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (106)..(115)
<223> 任选地不存在
<400> 143
cctaggaatt tgtgcttgat ctaaccatgt ttcattgtgc ttgatctaac catgtttcat 60
tgtgcttgat ctaaccatgt ttcattgtgc ttgatctaac catgtatcgc ccggg 115
<210> 144
<211> 215
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(8)
<223> 任选地不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (206)..(215)
<223> 任选地不存在
<400> 144
cctaggatta tggcactggt agaattcact acttatggca ctggtagaat tcactactta 60
tggcactggt agaattcact acttatggca ctggtagaat tcactatcgt tgtgcttgat 120
ctaaccatgt ttcattgtgc ttgatctaac catgtttcat tgtgcttgat ctaaccatgt 180
ttcattgtgc ttgatctaac catgtatcgc ccggg 215
<210> 145
<211> 513
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 145
cacggggttg gggttgcgcc ttttccaagg cagccctggg tttgcgcagg gacgcggctg 60
ctctgggcgt ggttccggga aacgcagcgg cgccgaccct gggtctcgca cattcttcac 120
gtccgttcgc agcgtcaccc ggatcttcgc cgctaccctt gtgggccccc cggcgacgct 180
tcctgctccg cccctaagtc gggaaggttc cttgcggttc gcggcgtgcc ggacgtgaca 240
aacggaagcc gcacgtctca ctagtaccct cgcagacgga cagcgccagg gagcaatggc 300
agcgcgccga ccgcgatggg ctgtggccaa tagcggctgc tcagcggggc gcgccgagag 360
cagcggccgg gaaggggcgg tgcgggaggc ggggtgtggg gcggtagtgt gggccctgtt 420
cctgcccgcg cggtgttccg cattctgcaa gcctccggag cgcacgtcgg cagtcggctc 480
cctcgttgac cgaatcaccg acctctctcc cca 513
<210> 146
<211> 1335
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 146
gagtaattca tacaaaagga ctcgcccctg ccttggggaa tcccagggac cgtcgttaaa 60
ctcccactaa cgtagaaccc agagatcgct gcgttcccgc cccctcaccc gcccgctctc 120
gtcatcactg aggtggagaa gagcatgcgt gaggctccgg tgcccgtcag tgggcagagc 180
gcacatcgcc cacagtcccc gagaagttgg ggggaggggt cggcaattga accggtgcct 240
agagaaggtg gcgcggggta aactgggaaa gtgatgtcgt gtactggctc cgcctttttc 300
ccgagggtgg gggagaaccg tatataagtg cagtagtcgc cgtgaacgtt ctttttcgca 360
acgggtttgc cgccagaaca caggtaagtg ccgtgtgtgg ttcccgcggg cctggcctct 420
ttacgggtta tggcccttgc gtgccttgaa ttacttccac gcccctggct gcagtacgtg 480
attcttgatc ccgagcttcg ggttggaagt gggtgggaga gttcgaggcc ttgcgcttaa 540
ggagcccctt cgcctcgtgc ttgagttgag gcctggcctg ggcgctgggg ccgccgcgtg 600
cgaatctggt ggcaccttcg cgcctgtctc gctgctttcg ataagtctct agccatttaa 660
aatttttgat gacctgctgc gacgcttttt ttctggcaag atagtcttgt aaatgcgggc 720
caagatctgc acactggtat ttcggttttt ggggccgcgg gcggcgacgg ggcccgtgcg 780
tcccagcgca catgttcggc gaggcggggc ctgcgagcgc ggccaccgag aatcggacgg 840
gggtagtctc aagctcgccg gcctgctctg gtgcctggcc tcgcgccgcc gtgtatcgcc 900
ccgccctggg cggcaaggct ggcccggtcg gcaccagttg cgtgagcgga aagatggccg 960
cttcccggcc ctgctgcagg gagctcaaaa tggaggacgc ggcgctcggg agagcgggcg 1020
ggtgagtcac ccacacaaag gaaaagggcc tttccgtcct cagccgtcgc ttcatgtgac 1080
tccacggagt accgggcgcc gtccaggcac ctcgattagt tctcgagctt ttggagtacg 1140
tcgtctttag gttgggggga ggggttttat gcgatggagt ttccccacac tgagtgggtg 1200
gagactgaag ttaggccagc ttggcacttg atgtaattct ccttggaatt tgcccttttt 1260
gagtttggat cttggttcat tctcaagcct cagacagtgg ttcaaagttt ttttcttcca 1320
tttcaggtgt cgtga 1335
<210> 147
<211> 114
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 147
ctaggattat ggcactggta gaattcacta cttatggcac tggtagaatt cactacttat 60
ggcactggta gaattcacta cttatggcac tggtagaatt cactatcgcc cggg 114
<210> 148
<211> 115
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 148
cctaggaatt tgtgcttgat ctaaccatgt ttcattgtgc ttgatctaac catgtttcat 60
tgtgcttgat ctaaccatgt ttcattgtgc ttgatctaac catgtatcgc ccggg 115
<210> 149
<211> 215
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 149
cctaggatta tggcactggt agaattcact acttatggca ctggtagaat tcactactta 60
tggcactggt agaattcact acttatggca ctggtagaat tcactatcgt tgtgcttgat 120
ctaaccatgt ttcattgtgc ttgatctaac catgtttcat tgtgcttgat ctaaccatgt 180
ttcattgtgc ttgatctaac catgtatcgc ccggg 215
<210> 150
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 150
aaatcttgac cattctccac tctc 24
<210> 151
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 151
ggagacacac agaaatgtaa cagg 24
<210> 152
<211> 91
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 152
Asn Gly Val Leu Ser Leu Lys Cys Val Asn Pro Leu Thr Thr Ala Ser
1 5 10 15
Gly Ser Leu Gln Leu Lys Val Gly Ser Gly Leu Thr Val Asp Thr Thr
20 25 30
Asp Gly Ser Leu Glu Glu Asn Ile Lys Val Asn Thr Pro Leu Thr Lys
35 40 45
Ser Asn His Ser Ile Asn Leu Pro Ile Gly Asn Gly Leu Gln Ile Glu
50 55 60
Gln Asn Lys Leu Cys Ser Lys Leu Gly Asn Gly Leu Thr Phe Asp Ser
65 70 75 80
Ser Asn Ser Ile Ala Leu Lys Asn Asn Thr Leu
85 90
<210> 153
<211> 92
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 153
Asp Gly Val Leu Thr Leu Lys Cys Leu Thr Pro Leu Thr Thr Thr Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Gln Leu Lys Val Gly Gly Gly Leu Thr Ile Asp Asp Thr
20 25 30
Asp Gly Phe Leu Lys Glu Asn Ile Ser Ala Thr Thr Pro Leu Val Lys
35 40 45
Thr Gly His Ser Ile Gly Leu Ser Leu Gly Pro Gly Leu Gly Thr Asn
50 55 60
Glu Asn Lys Leu Cys Ala Lys Leu Gly Glu Gly Leu Thr Phe Asn Ser
65 70 75 80
Asn Asn Ile Cys Ile Asn Asp Asn Ile Asn Thr Leu
85 90
<210> 154
<211> 92
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 154
Asn Gly Val Leu Thr Leu Lys Cys Leu Thr Pro Leu Thr Thr Thr Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Gln Leu Lys Val Gly Gly Gly Leu Thr Val Asp Asp Thr
20 25 30
Asn Gly Phe Leu Lys Glu Asn Ile Ser Ala Thr Thr Pro Leu Val Lys
35 40 45
Thr Gly His Ser Ile Gly Leu Pro Leu Gly Ala Gly Leu Gly Thr Asn
50 55 60
Glu Asn Lys Leu Cys Ile Lys Leu Gly Gln Gly Leu Thr Phe Asn Ser
65 70 75 80
Asn Asn Ile Cys Ile Asp Asp Asn Ile Asn Thr Leu
85 90
<210> 155
<211> 91
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 155
Gly Val Leu Thr Leu Lys Cys Leu Thr Pro Leu Thr Thr Thr Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Gln Leu Lys Val Gly Gly Gly Leu Thr Val Asp Asp Thr Asp
20 25 30
Gly Thr Leu Gln Glu Asn Ile Gly Ala Thr Thr Pro Leu Val Lys Thr
35 40 45
Gly His Ser Ile Gly Leu Ser Leu Gly Ala Gly Leu Gly Thr Asp Glu
50 55 60
Asn Lys Leu Cys Thr Lys Leu Gly Glu Gly Leu Thr Phe Asn Ser Asn
65 70 75 80
Asn Ile Cys Ile Asp Asp Asn Ile Asn Thr Leu
85 90
<210> 156
<211> 92
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 156
Asp Gly Val Leu Thr Leu Lys Cys Leu Thr Pro Leu Thr Thr Thr Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Gln Leu Lys Val Gly Gly Gly Leu Thr Val Asp Asp Thr
20 25 30
Asp Gly Thr Leu Gln Glu Asn Ile Gly Ala Thr Thr Pro Leu Val Lys
35 40 45
Thr Gly His Ser Ile Gly Leu Ser Leu Gly Ala Gly Leu Gly Thr Asp
50 55 60
Glu Asn Lys Leu Cys Thr Lys Leu Gly Glu Gly Leu Thr Phe Asn Ser
65 70 75 80
Asn Asn Ile Cys Ile Asp Asp Asn Ile Asn Thr Leu
85 90
<210> 157
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 157
uggaagacua gugauuuugu ugu 23
<210> 158
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 158
uaaggugcau cuagugcaga uag 23
<210> 159
<211> 44
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 159
cagugcaaug uuaaaagggc aucagugcaa uguuaaaagg gcau 44
<210> 160
<211> 104
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 160
ctgttatttt ttacttggac tcttgtgggg aataagatac atgttttatt cttatttatg 60
attcaagcac tgaaaatagt gtttagcatc cagcaggtgc ttca 104
<210> 161
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 161
ctgttatttt ttacttggac tcttgtgggg aataagatac atgcactgaa aatagtgttt 60
agcatccagc aggtgcttca 80
<210> 162
<211> 590
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 162
Gln Lys Arg Ala Arg Pro Ser Glu Asp Thr Phe Asn Pro Val Tyr Pro
1 5 10 15
Tyr Asp Thr Glu Thr Gly Pro Pro Thr Val Pro Phe Leu Thr Pro Pro
20 25 30
Phe Val Ser Pro Asn Gly Phe Gln Glu Ser Pro Pro Gly Val Leu Ser
35 40 45
Leu Arg Leu Ser Glu Pro Leu Val Thr Ser Asn Gly Met Leu Ala Leu
50 55 60
Lys Met Gly Asn Gly Leu Ser Leu Asp Glu Ala Gly Asn Leu Thr Ser
65 70 75 80
Gln Asn Val Thr Thr Val Ser Pro Pro Leu Lys Lys Thr Lys Ser Asn
85 90 95
Ile Asn Leu Glu Ile Ser Ala Pro Leu Thr Val Thr Ser Glu Ala Leu
100 105 110
Thr Val Ala Ala Ala Ala Pro Leu Met Val Ala Gly Asn Thr Leu Thr
115 120 125
Met Gln Ser Gln Ala Pro Leu Thr Val His Asp Ser Lys Leu Ser Ile
130 135 140
Ala Thr Gln Gly Pro Leu Thr Val Ser Glu Gly Lys Leu Ala Leu Gln
145 150 155 160
Thr Ser Gly Pro Leu Thr Thr Thr Asp Ser Ser Thr Leu Thr Ile Thr
165 170 175
Ala Ser Pro Pro Leu Thr Thr Ala Thr Gly Ser Leu Gly Ile Asp Leu
180 185 190
Lys Glu Pro Ile Tyr Thr Gln Asn Gly Lys Leu Gly Leu Lys Tyr Gly
195 200 205
Ala Pro Leu His Val Thr Asp Asp Leu Asn Thr Leu Thr Val Ala Thr
210 215 220
Gly Pro Gly Val Thr Ile Asn Asn Thr Ser Leu Gln Thr Lys Val Thr
225 230 235 240
Gly Ala Leu Gly Phe Asp Ser Gln Gly Asn Met Gln Leu Asn Val Ala
245 250 255
Gly Gly Leu Arg Ile Asp Ser Gln Asn Arg Arg Leu Ile Leu Asp Val
260 265 270
Ser Tyr Pro Phe Asp Ala Gln Asn Gln Leu Asn Leu Arg Leu Gly Gln
275 280 285
Gly Pro Leu Phe Ile Asn Ser Ala His Asn Leu Asp Ile Asn Tyr Asn
290 295 300
Lys Gly Leu Tyr Leu Phe Thr Ala Ser Asn Asn Ser Lys Lys Leu Glu
305 310 315 320
Val Asn Leu Ser Thr Ala Lys Gly Leu Met Phe Asp Ala Thr Ala Ile
325 330 335
Ala Ile Asn Ala Gly Asp Gly Leu Glu Phe Gly Ser Pro Asn Ala Pro
340 345 350
Asn Thr Asn Pro Leu Lys Thr Lys Ile Gly His Gly Leu Glu Phe Asp
355 360 365
Ser Asn Lys Ala Met Val Pro Lys Leu Gly Thr Gly Leu Ser Phe Asp
370 375 380
Ser Thr Gly Ala Ile Thr Val Gly Asn Lys Asn Asn Asp Lys Leu Thr
385 390 395 400
Leu Trp Thr Gly Ile Asn Pro Pro Pro Asn Cys Gln Ile Val Glu Asn
405 410 415
Thr Asn Thr Asn Asp Gly Lys Leu Thr Leu Val Leu Val Lys Asn Gly
420 425 430
Gly Leu Val Asn Gly Tyr Val Ser Leu Val Gly Val Ser Asp Thr Val
435 440 445
Asn Gln Met Phe Thr Gln Lys Thr Ala Asn Ile Gln Leu Arg Leu Tyr
450 455 460
Phe Asp Ser Ser Gly Asn Leu Leu Thr Glu Glu Ser Asp Leu Lys Ile
465 470 475 480
Pro Leu Lys Asn Lys Ser Ser Thr Ala Thr Ser Glu Thr Val Ala Ser
485 490 495
Ser Lys Ala Phe Met Pro Ser Thr Thr Ala Tyr Pro Phe Asn Thr Thr
500 505 510
Thr Arg Asp Ser Glu Asn Tyr Ile His Gly Ile Cys Tyr Tyr Met Thr
515 520 525
Ser Tyr Asp Arg Ser Leu Phe Pro Leu Asn Ile Ser Ile Met Leu Asn
530 535 540
Ser Arg Met Ile Ser Ser Asn Val Ala Tyr Ala Ile Gln Phe Glu Trp
545 550 555 560
Asn Leu Asn Ala Ser Glu Ser Pro Glu Ser Asn Ile Ala Thr Leu Thr
565 570 575
Thr Ser Pro Phe Phe Phe Ser Tyr Ile Thr Glu Asp Asp Asn
580 585 590
<210> 163
<211> 729
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 163
Met Asp Tyr Lys Asp His Asp Gly Asp Tyr Lys Asp His Asp Ile Asp
1 5 10 15
Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Met Ala Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val
20 25 30
Gly Ile His Gly Val Pro Ala Ala Met Ala Glu Arg Pro Phe Gln Cys
35 40 45
Arg Ile Cys Met Arg Asn Phe Ser Asp Arg Ser Asn Leu Ser Arg His
50 55 60
Ile Arg Thr His Thr Gly Glu Lys Pro Phe Ala Cys Asp Ile Cys Gly
65 70 75 80
Arg Lys Phe Ala Ile Ser Ser Asn Leu Asn Ser His Thr Lys Ile His
85 90 95
Thr Gly Ser Gln Lys Pro Phe Gln Cys Arg Ile Cys Met Arg Asn Phe
100 105 110
Ser Arg Ser Asp Asn Leu Ala Arg His Ile Arg Thr His Thr Gly Glu
115 120 125
Lys Pro Phe Ala Cys Asp Ile Cys Gly Arg Lys Phe Ala Thr Ser Gly
130 135 140
Asn Leu Thr Arg His Thr Lys Ile His Leu Arg Gly Ser Gln Leu Val
145 150 155 160
Lys Ser Glu Leu Glu Glu Lys Lys Ser Glu Leu Arg His Lys Leu Lys
165 170 175
Tyr Val Pro His Glu Tyr Ile Glu Leu Ile Glu Ile Ala Arg Asn Ser
180 185 190
Thr Gln Asp Arg Ile Leu Glu Met Lys Val Met Glu Phe Phe Met Lys
195 200 205
Val Tyr Gly Tyr Arg Gly Lys His Leu Gly Gly Ser Arg Lys Pro Asp
210 215 220
Gly Ala Ile Tyr Thr Val Gly Ser Pro Ile Asp Tyr Gly Val Ile Val
225 230 235 240
Asp Thr Lys Ala Tyr Ser Gly Gly Tyr Asn Leu Pro Ile Gly Gln Ala
245 250 255
Asp Glu Met Glu Arg Tyr Val Glu Glu Asn Gln Thr Arg Asn Lys His
260 265 270
Leu Asn Pro Asn Glu Trp Trp Lys Val Tyr Pro Ser Ser Val Thr Glu
275 280 285
Phe Lys Phe Leu Phe Val Ser Gly His Phe Lys Gly Asn Tyr Lys Ala
290 295 300
Gln Leu Thr Arg Leu Asn His Ile Thr Asn Cys Asn Gly Ala Val Leu
305 310 315 320
Ser Val Glu Glu Leu Leu Ile Gly Gly Glu Met Ile Lys Ala Gly Thr
325 330 335
Leu Thr Leu Glu Glu Val Arg Arg Lys Phe Asn Asn Gly Glu Ile Asn
340 345 350
Phe Arg Ser Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly
355 360 365
Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Arg Met Asp Tyr Lys Asp His Asp
370 375 380
Gly Asp Tyr Lys Asp His Asp Ile Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
385 390 395 400
Met Ala Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Gly Ile His Gly Val Pro Ala
405 410 415
Ala Met Ala Glu Arg Pro Phe Gln Cys Arg Ile Cys Met Arg Asn Phe
420 425 430
Ser Arg Ser Asp Asn Leu Ser Val His Ile Arg Thr His Thr Gly Glu
435 440 445
Lys Pro Phe Ala Cys Asp Ile Cys Gly Arg Lys Phe Ala Gln Lys Ile
450 455 460
Asn Leu Gln Val His Thr Lys Ile His Thr Gly Glu Lys Pro Phe Gln
465 470 475 480
Cys Arg Ile Cys Met Arg Asn Phe Ser Arg Ser Asp Val Leu Ser Glu
485 490 495
His Ile Arg Thr His Thr Gly Glu Lys Pro Phe Ala Cys Asp Ile Cys
500 505 510
Gly Arg Lys Phe Ala Gln Arg Asn His Arg Thr Thr His Thr Lys Ile
515 520 525
His Leu Arg Gly Ser Gln Leu Val Lys Ser Glu Leu Glu Glu Lys Lys
530 535 540
Ser Glu Leu Arg His Lys Leu Lys Tyr Val Pro His Glu Tyr Ile Glu
545 550 555 560
Leu Ile Glu Ile Ala Arg Asn Ser Thr Gln Asp Arg Ile Leu Glu Met
565 570 575
Lys Val Met Glu Phe Phe Met Lys Val Tyr Gly Tyr Arg Gly Lys His
580 585 590
Leu Gly Gly Ser Arg Lys Pro Asp Gly Ala Ile Tyr Thr Val Gly Ser
595 600 605
Pro Ile Asp Tyr Gly Val Ile Val Asp Thr Lys Ala Tyr Ser Gly Gly
610 615 620
Tyr Asn Leu Pro Ile Gly Gln Ala Asp Glu Met Gln Arg Tyr Val Lys
625 630 635 640
Glu Asn Gln Thr Arg Asn Lys His Ile Asn Pro Asn Glu Trp Trp Lys
645 650 655
Val Tyr Pro Ser Ser Val Thr Glu Phe Lys Phe Leu Phe Val Ser Gly
660 665 670
His Phe Lys Gly Asn Tyr Lys Ala Gln Leu Thr Arg Leu Asn His Lys
675 680 685
Thr Asn Cys Asn Gly Ala Val Leu Ser Val Glu Glu Leu Leu Ile Gly
690 695 700
Gly Glu Met Ile Lys Ala Gly Thr Leu Thr Leu Glu Glu Val Arg Arg
705 710 715 720
Lys Phe Asn Asn Gly Glu Ile Asn Phe
725
<210> 164
<211> 2028
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 164
Met Val Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Glu Leu Pro Pro Lys
1 5 10 15
Lys Lys Arg Lys Val Gly Ile Arg Ile Gln Asp Leu Arg Thr Leu Gly
20 25 30
Tyr Ser Gln Gln Gln Gln Glu Lys Ile Lys Pro Lys Val Arg Ser Thr
35 40 45
Val Ala Gln His His Glu Ala Leu Val Gly His Gly Phe Thr His Ala
50 55 60
His Ile Val Ala Leu Ser Gln His Pro Ala Ala Leu Gly Thr Val Ala
65 70 75 80
Val Lys Tyr Gln Asp Met Ile Ala Ala Leu Pro Glu Ala Thr His Glu
85 90 95
Ala Ile Val Gly Val Gly Lys Gln Trp Ser Gly Ala Arg Ala Leu Glu
100 105 110
Ala Leu Leu Thr Val Ala Gly Glu Leu Arg Gly Pro Pro Leu Gln Leu
115 120 125
Asp Thr Gly Gln Leu Leu Lys Ile Ala Lys Arg Gly Gly Val Thr Ala
130 135 140
Val Glu Ala Val His Ala Trp Arg Asn Ala Leu Thr Gly Ala Pro Leu
145 150 155 160
Thr Pro Ala Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln
165 170 175
Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp His
180 185 190
Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly
195 200 205
Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln
210 215 220
Asp His Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn
225 230 235 240
Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu
245 250 255
Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Ala Gln Val Val Ala Ile Ala Ser
260 265 270
Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro
275 280 285
Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro Ala Gln Val Val Ala Ile
290 295 300
Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu
305 310 315 320
Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val
325 330 335
Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln
340 345 350
Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro Ala Gln
355 360 365
Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr
370 375 380
Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro
385 390 395 400
Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu
405 410 415
Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu
420 425 430
Thr Pro Ala Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln
435 440 445
Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His
450 455 460
Gly Leu Thr Pro Ala Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly
465 470 475 480
Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln
485 490 495
Asp His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly
500 505 510
Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu
515 520 525
Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Ala Gln Val Val Ala Ile Ala Ser
530 535 540
Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro
545 550 555 560
Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile
565 570 575
Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu
580 585 590
Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val
595 600 605
Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln
610 615 620
Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro Asp Gln
625 630 635 640
Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr
645 650 655
Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro
660 665 670
Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu
675 680 685
Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu
690 695 700
Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln
705 710 715 720
Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His
725 730 735
Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly
740 745 750
Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln
755 760 765
Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly
770 775 780
Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Ser Ile Val Ala Gln Leu Ser Arg Pro
785 790 795 800
Asp Pro Ala Leu Ala Ala Leu Leu Val Lys Ser Glu Leu Glu Glu Lys
805 810 815
Lys Ser Glu Leu Arg His Lys Leu Lys Tyr Val Pro His Glu Tyr Ile
820 825 830
Glu Leu Ile Glu Ile Ala Arg Asn Pro Thr Gln Asp Arg Ile Leu Glu
835 840 845
Met Lys Val Met Glu Phe Phe Met Lys Val Tyr Gly Tyr Arg Gly Glu
850 855 860
His Leu Gly Gly Ser Arg Lys Pro Asp Gly Ala Ile Tyr Thr Val Gly
865 870 875 880
Ser Pro Ile Asp Tyr Gly Val Ile Val Asp Thr Lys Ala Tyr Ser Gly
885 890 895
Gly Tyr Asn Leu Pro Ile Gly Gln Ala Asp Ala Met Gln Ser Tyr Val
900 905 910
Glu Glu Asn Gln Thr Arg Asn Lys His Ile Asn Pro Asn Glu Trp Trp
915 920 925
Lys Val Tyr Pro Ser Ser Val Thr Glu Phe Lys Phe Leu Phe Val Ser
930 935 940
Gly His Phe Lys Gly Asn Tyr Lys Ala Gln Leu Thr Arg Leu Asn His
945 950 955 960
Ile Thr Asn Cys Asn Gly Ala Val Leu Ser Val Glu Glu Leu Leu Ile
965 970 975
Gly Gly Glu Met Ile Lys Ala Gly Thr Leu Thr Leu Glu Glu Val Arg
980 985 990
Arg Lys Phe Asn Asn Gly Glu Ile Asn Phe Leu Asp Gly Ser Gly Glu
995 1000 1005
Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro
1010 1015 1020
Gly Pro Val Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Glu Leu Pro
1025 1030 1035
Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Gly Ile Arg Ile Gln Asp Leu Arg
1040 1045 1050
Thr Leu Gly Tyr Ser Gln Gln Gln Gln Glu Lys Ile Lys Pro Lys
1055 1060 1065
Val Arg Ser Thr Val Ala Gln His His Glu Ala Leu Val Gly His
1070 1075 1080
Gly Phe Thr His Ala His Ile Val Ala Leu Ser Gln His Pro Ala
1085 1090 1095
Ala Leu Gly Thr Val Ala Val Lys Tyr Gln Asp Met Ile Ala Ala
1100 1105 1110
Leu Pro Glu Ala Thr His Glu Ala Ile Val Gly Val Gly Lys Gln
1115 1120 1125
Trp Ser Gly Ala Arg Ala Leu Glu Ala Leu Leu Thr Val Ala Gly
1130 1135 1140
Glu Leu Arg Gly Pro Pro Leu Gln Leu Asp Thr Gly Gln Leu Leu
1145 1150 1155
Lys Ile Ala Lys Arg Gly Gly Val Thr Ala Val Glu Ala Val His
1160 1165 1170
Ala Trp Arg Asn Ala Leu Thr Gly Ala Pro Leu Thr Pro Asp Gln
1175 1180 1185
Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu
1190 1195 1200
Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu
1205 1210 1215
Thr Pro Ala Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys
1220 1225 1230
Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln
1235 1240 1245
Asp His Gly Leu Thr Pro Ala Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn
1250 1255 1260
Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro
1265 1270 1275
Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val Ala
1280 1285 1290
Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln
1295 1300 1305
Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Asp
1310 1315 1320
Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu
1325 1330 1335
Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly
1340 1345 1350
Leu Thr Pro Ala Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly
1355 1360 1365
Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys
1370 1375 1380
Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser
1385 1390 1395
Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu
1400 1405 1410
Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val
1415 1420 1425
Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val
1430 1435 1440
Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro
1445 1450 1455
Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala
1460 1465 1470
Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His
1475 1480 1485
Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly
1490 1495 1500
Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu
1505 1510 1515
Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Ala Gln Val Val Ala Ile Ala
1520 1525 1530
Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu
1535 1540 1545
Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val
1550 1555 1560
Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr
1565 1570 1575
Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr
1580 1585 1590
Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln
1595 1600 1605
Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala
1610 1615 1620
His Gly Leu Thr Pro Ala Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile
1625 1630 1635
Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val
1640 1645 1650
Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Ala Gln Val Val Ala Ile
1655 1660 1665
Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg
1670 1675 1680
Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro Ala Gln
1685 1690 1695
Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu
1700 1705 1710
Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu
1715 1720 1725
Thr Pro Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys
1730 1735 1740
Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln
1745 1750 1755
Ala His Gly Leu Thr Pro Ala Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His
1760 1765 1770
Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro
1775 1780 1785
Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala
1790 1795 1800
Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Ser Ile Val
1805 1810 1815
Ala Gln Leu Ser Arg Pro Asp Pro Ala Leu Ala Ala Leu Leu Val
1820 1825 1830
Lys Ser Glu Leu Glu Glu Lys Lys Ser Glu Leu Arg His Lys Leu
1835 1840 1845
Lys Tyr Val Pro His Glu Tyr Ile Glu Leu Ile Glu Ile Ala Arg
1850 1855 1860
Asn Pro Thr Gln Asp Arg Ile Leu Glu Met Lys Val Met Glu Phe
1865 1870 1875
Phe Met Lys Val Tyr Gly Tyr Arg Gly Glu His Leu Gly Gly Ser
1880 1885 1890
Arg Lys Pro Asp Gly Ala Ile Tyr Thr Val Gly Ser Pro Ile Asp
1895 1900 1905
Tyr Gly Val Ile Val Asp Thr Lys Ala Tyr Ser Gly Gly Tyr Asn
1910 1915 1920
Leu Pro Ile Gly Gln Ala Arg Glu Met Gln Arg Tyr Val Glu Glu
1925 1930 1935
Asn Gln Thr Arg Asn Lys His Ile Asn Pro Asn Glu Trp Trp Lys
1940 1945 1950
Val Tyr Pro Ser Ser Val Thr Glu Phe Lys Phe Leu Phe Val Ser
1955 1960 1965
Gly His Phe Lys Gly Asn Tyr Lys Ala Gln Leu Thr Arg Leu Asn
1970 1975 1980
His Ile Thr Asn Cys Asn Gly Ala Val Leu Ser Val Glu Glu Leu
1985 1990 1995
Leu Ile Gly Gly Glu Met Ile Lys Ala Gly Thr Leu Thr Leu Glu
2000 2005 2010
Glu Val Arg Arg Lys Phe Asn Asn Gly Glu Ile Asn Phe Leu Asp
2015 2020 2025
<210> 165
<211> 844
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 165
Met Asp Tyr Lys Asp His Asp Gly Asp Tyr Lys Asp His Asp Ile Asp
1 5 10 15
Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Met Ala Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val
20 25 30
Gly Ile His Gly Val Pro Ala Ala Met Ala Glu Arg Pro Phe Gln Cys
35 40 45
Arg Ile Cys Met Arg Asn Phe Ser Arg Ser Asp Asn Leu Ser Val His
50 55 60
Ile Arg Thr His Thr Gly Glu Lys Pro Phe Ala Cys Asp Ile Cys Gly
65 70 75 80
Arg Lys Phe Ala Ala Asn His His Arg Ile Asn His Thr Lys Ile His
85 90 95
Thr Gly Ser Gln Lys Pro Phe Gln Cys Arg Ile Cys Met Arg Asn Phe
100 105 110
Ser Asp Arg Ser Asp Leu Ser Arg His Ile Arg Thr His Thr Gly Glu
115 120 125
Lys Pro Phe Ala Cys Asp Ile Cys Gly Arg Lys Phe Ala Arg Ser Asp
130 135 140
His Leu Ser Arg His Thr Lys Ile His Thr Gly Ser Gln Lys Pro Phe
145 150 155 160
Gln Cys Arg Ile Cys Met Arg Asn Phe Ser Gln Ser Gly Asn Leu Ala
165 170 175
Arg His Ile Arg Thr His Thr Gly Glu Lys Pro Phe Ala Cys Asp Ile
180 185 190
Cys Gly Arg Lys Phe Ala Gln Arg Asn Asp Arg Lys Ser His Thr Lys
195 200 205
Ile His Leu Arg Gly Ser Gln Leu Val Lys Ser Glu Leu Glu Glu Lys
210 215 220
Lys Ser Glu Leu Arg His Lys Leu Lys Tyr Val Pro His Glu Tyr Ile
225 230 235 240
Glu Leu Ile Glu Ile Ala Arg Asn Ser Thr Gln Asp Arg Ile Leu Glu
245 250 255
Met Lys Val Met Glu Phe Phe Met Lys Val Tyr Gly Tyr Arg Gly Lys
260 265 270
His Leu Gly Gly Ser Arg Lys Pro Asp Gly Ala Ile Tyr Thr Val Gly
275 280 285
Ser Pro Ile Asp Tyr Gly Val Ile Val Asp Thr Lys Ala Tyr Ser Gly
290 295 300
Gly Tyr Asn Leu Pro Ile Gly Gln Ala Asp Glu Met Glu Arg Tyr Val
305 310 315 320
Glu Glu Asn Gln Thr Arg Asp Lys His Leu Asn Pro Asn Glu Trp Trp
325 330 335
Lys Val Tyr Pro Ser Ser Val Thr Glu Phe Lys Phe Leu Phe Val Ser
340 345 350
Gly His Phe Lys Gly Asn Tyr Lys Ala Gln Leu Thr Arg Leu Asn His
355 360 365
Ile Thr Asn Cys Asn Gly Ala Val Leu Ser Val Glu Glu Leu Leu Ile
370 375 380
Gly Gly Glu Met Ile Lys Ala Gly Thr Leu Thr Leu Glu Glu Val Arg
385 390 395 400
Arg Lys Phe Asn Asn Gly Glu Ile Asn Phe Arg Ser Gly Ser Gly Glu
405 410 415
Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly
420 425 430
Pro Arg Met Asp Tyr Lys Asp His Asp Gly Asp Tyr Lys Asp His Asp
435 440 445
Ile Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Met Ala Pro Lys Lys Lys Arg
450 455 460
Lys Val Gly Ile His Gly Val Pro Ala Ala Met Ala Glu Arg Pro Phe
465 470 475 480
Gln Cys Arg Ile Cys Met Arg Asn Phe Ser Arg Ser Asp His Leu Ser
485 490 495
Gln His Ile Arg Thr His Thr Gly Glu Lys Pro Phe Ala Cys Asp Ile
500 505 510
Cys Gly Arg Lys Phe Ala Thr Ser Ala Asn Arg Thr Thr His Thr Lys
515 520 525
Ile His Thr Gly Ser Gln Lys Pro Phe Gln Cys Arg Ile Cys Met Arg
530 535 540
Asn Phe Ser Glu Arg Gly Thr Leu Ala Arg His Ile Arg Thr His Thr
545 550 555 560
Gly Glu Lys Pro Phe Ala Cys Asp Ile Cys Gly Arg Lys Phe Ala Gln
565 570 575
Ser Ser Asp Leu Arg Arg His Thr Lys Ile His Thr Gly Ser Gln Lys
580 585 590
Pro Phe Gln Cys Arg Ile Cys Met Arg Asn Phe Ser Gln Ser Ser Asp
595 600 605
Leu Ser Arg His Ile Arg Thr His Thr Gly Glu Lys Pro Phe Ala Cys
610 615 620
Asp Ile Cys Gly Arg Lys Phe Ala Cys Arg Ser Asn Leu Lys Lys His
625 630 635 640
Thr Lys Ile His Leu Arg Gly Ser Gln Leu Val Lys Ser Glu Leu Glu
645 650 655
Glu Lys Lys Ser Glu Leu Arg His Lys Leu Lys Tyr Val Pro His Glu
660 665 670
Tyr Ile Glu Leu Ile Glu Ile Ala Arg Asn Ser Thr Gln Asp Arg Ile
675 680 685
Leu Glu Met Lys Val Met Glu Phe Phe Met Lys Val Tyr Gly Tyr Arg
690 695 700
Gly Lys His Leu Gly Gly Ser Arg Lys Pro Asp Gly Ala Ile Tyr Thr
705 710 715 720
Val Gly Ser Pro Ile Asp Tyr Gly Val Ile Val Asp Thr Lys Ala Tyr
725 730 735
Ser Gly Gly Tyr Asn Leu Pro Ile Gly Gln Ala Asp Glu Met Gln Arg
740 745 750
Tyr Val Lys Glu Asn Gln Thr Arg Asn Lys His Ile Asn Pro Asn Glu
755 760 765
Trp Trp Lys Val Tyr Pro Ser Ser Val Thr Glu Phe Lys Phe Leu Phe
770 775 780
Val Ser Gly His Phe Lys Gly Asn Tyr Lys Ala Gln Leu Thr Arg Leu
785 790 795 800
Asn Arg Lys Thr Asn Cys Asn Gly Ala Val Leu Ser Val Glu Glu Leu
805 810 815
Leu Ile Gly Gly Glu Met Ile Lys Ala Gly Thr Leu Thr Leu Glu Glu
820 825 830
Val Arg Arg Lys Phe Asn Asn Gly Glu Ile Asn Phe
835 840

Claims (50)

1.一种重组核酸表达盒，其包含至少一个第一核酸模块，其包含：
(i)编码核酸酶的第一编码区，其中所述的核酸酶能够在所关注的CD34+细胞基因组靶物中产生DNA断裂；以及
(ii)编码一个或多个miRNA靶位点的第二编码区，其中所述的miRNA靶位点位于所述的第一编码区的3’非翻译区，并且在所述的第一编码区的翻译终止密码子下游的至少60个核苷酸，其中与所述的一个或多个编码的miRNA靶位点结合的miRNA在病毒生产型细胞中高度表达，但是在CD34+细胞中不表达或以低水平表达，
其中所述的第一核酸模块与在CD34+细胞中具有活性的启动子可操作地连接。
2.权利要求1所述的重组核酸表达盒，其进一步包含编码结合CD46的腺病毒纤维多肽第二核酸模块。
3.权利要求1或2所述的重组核酸表达盒，其进一步包含位于所述的重组核酸载体的各个末端的反向末端重复序列(ITR)，其中所述的ITR衍生自结合CD46的腺病毒血清型。
4.权利要求1-3所述的重组核酸表达盒，其进一步包含得自结合CD46的腺病毒血清型的包装信号。
5.权利要求4的任意一项所述的重组核酸表达盒，其中所述的一个或多个miRNA靶位点包含选自以下的1个、2个或所有3个miRNA的反向互补序列：(a)CACUGGUAGA(SEQ ID NO:1)(has-miR183-5p核心),(b)UGUGCUUGAUCUAA(SEQ ID NO:2)(has-miR218-5p核心)；和(c)CACUAGCACA(SEQ ID NO:3)(miR96-5p核心)。
6.权利要求1-5的任意一项所述的重组核酸表达盒，其中所述的一个或多个miRNA靶位点包含选自SEQ ID NO:1-90的miRNA的反向互补序列。
7.权利要求1-6的任意一项所述的重组核酸表达盒，其中所述的第二编码区编码至少4个miRNA靶位点。
8.权利要求1-7的任意一项所述的重组核酸表达盒，其中1-10个核苷酸的间隔序列存在于各个编码的miRNA靶位点之间。
9.权利要求1-8的任意一项所述的重组核酸表达盒，其中所述的核酸酶选自锌指核酸酶(ZFN),转录激活因子样效应器核酸酶(TALEN),巨核酶和CRISPR-Cas9核酸酶。
10.权利要求1-9的任意一项所述的重组核酸表达盒，其中所述的核酸酶包含多肽的氨基酸序列，其中所述的多肽选自SEQ ID NO 91-93和103。
11.权利要求1-10的任意一项所述的重组核酸表达盒，其中所述的核酸酶能够在CD34+细胞基因组靶物中产生DNA断裂，其中所述的CD34+细胞基因组靶物选自编码趋化因子受体5型(CCR5),β-球蛋白,补体受体2(CR2)(人类疱疹病毒(EBV)受体),Niemann-Pick病,C1型受体((NPC1)埃博拉病毒受体),血管紧张素转化酶2受体((ACE2)SARS受体)的基因，以及编码如果误叠能够导致溶酶体贮积症的蛋白质的基因。
12.权利要求1-11的任意一项所述的重组核酸表达盒，其中所述的启动子选自EF1α启动子,磷酸甘油酸激酶(PGK)1启动子和泛素基因启动子。
13.权利要求2-12的任意一项所述的重组核酸表达盒，其中所述的第二核酸模块编码腺病毒纤维多肽，其包含与CD46结合的一个或多个人类腺病毒钮结构域或其功能等价物。
14.权利要求13所述的重组核酸表达盒，其中所述的钮结构域选自Ad11钮结构域,Ad16钮结构域,Ad21钮结构域,Ad35钮结构域,Ad50钮结构域及其功能等价物。
15.权利要求13或14所述的重组核酸表达盒，其中所述的钮结构域选自SEQ ID NO:94-101。
16.权利要求2-15的任意一项所述的重组核酸表达盒，其中所述的第二核酸模块编码腺病毒纤维多肽，其包含一个或多个人类腺病毒柄结构域或其功能等价物。
17.权利要求16所述的重组核酸表达盒，其中所述的一个或多个人类腺病毒柄结构域选自一个或多个Ad5柄结构域,一个或多个Ad11柄结构域,一个或多个Ad16柄结构域,一个或多个Ad21柄结构域,一个或多个Ad35柄结构域,一个或多个Ad50柄结构域,它们的组合及其功能等价物。
18.权利要求16或17所述的重组核酸表达盒，其中所述的一个或多个人类腺病毒柄结构域选自SEQ ID NO:105,118-130和152-156。
19.权利要求2-18的任意一项所述的重组核酸表达盒，其中所述的第二核酸模块编码腺病毒纤维多肽，其包含人类腺病毒尾结构域或其等价物。
20.权利要求19所述的重组核酸表达盒，其中所述的人类腺病毒尾结构域选自Ad11尾结构域,Ad16尾结构域,Ad21尾结构域,Ad35尾结构域,Ad50尾结构域,及其功能等价物。
21.权利要求20所述的重组核酸表达盒，其中所述的人类腺病毒尾结构域选自SEQ IDNO:131-132。
22.权利要求3-21的任意一项所述的重组核酸表达盒，其中所述的ITR得自Ad11,Ad16,Ad21,Ad35,或Ad50。
23.权利要求3-22的任意一项所述的重组核酸表达盒，其中所述的ITR包含选自SEQ IDNO:133-137的多核苷酸。
24.权利要求4-23的任意一项所述的重组核酸表达盒，其中所述的包装信号包含Ad11,Ad16,Ad21,Ad35,或Ad50包装信号。
25.权利要求4-24的任意一项所述的重组核酸表达盒，其中所述的包装信号包含选自SEQ ID NO:138-141的多核苷酸。
26.权利要求4-25的任意一项所述的重组核酸表达盒，其中所述的包装信号的侧翼为核酸切割信号。
27.权利要求1-26的任意一项所述的重组核酸表达盒，其中所述的盒不编码其他的腺病毒蛋白质。
28.权利要求1-27的任意一项所述的重组核酸表达盒，其进一步包含与第二启动子可操作地连接的转基因，其中所述的第二启动子在CD34+细胞中具有活性。
29.权利要求28所述的重组核酸表达盒，其进一步包含位于所述的转基因侧翼的至少第一再结合位点和第二再结合位点，其中所述的第一再结合位点和所述的第二再结合位点靶向CD34+细胞基因组DNA中的位点，该位点为转基因所需的插入位点的侧翼。
30.权利要求28或29所述的重组核酸表达盒，其中所述的转基因选自-CCR5,β-球蛋白,补体受体2(CR2)(人类疱疹病毒(EBV)受体),Niemann-Pick病,C1型受体((NPC1)埃博拉病毒受体),血管紧张素转化酶2受体((ACE2)SARS受体)的基因，以及编码如果误叠能够导致溶酶体贮积症的蛋白质的基因。
31.一种重组核酸载体，其包含权利要求1-30的任意一项所述的重组核酸表达盒。
32.权利要求1-30的任意一项所述的重组核酸表达盒，或权利要求32所述的重组核酸载体，其中所述的盒的长度为至少28kb。
33.一种重组宿主细胞，其中包含权利要求1-32的任意一项所述的表达盒或重组核酸载体。
34.权利要求33所述的重组宿主细胞，其中所述的宿主细胞产生miRNA，该miRNA与由所述的盒所编码的miRNA靶位点结合。
35.权利要求33-34的任意一项所述的重组宿主细胞，其进一步包含辅助病毒腺病毒和/或辅助病毒腺病毒载体。
36.权利要求33-35的任意一项所述的重组宿主细胞，其中所述的宿主细胞选自人胚肾(HEK)293细胞,HEK 293-Cre细胞,PerC6细胞和HCT 116细胞。
37.一种重组辅助病毒依赖性腺病毒，其包含权利要求1-32的任意一项所述的表达盒或重组核酸载体。
38.一种用于制备权利要求37所述的重组辅助病毒依赖性腺病毒的方法，其包括在在适用于促进所述的表达盒上的基因表达的以及使所述的辅助病毒腺病毒足以组装所述的辅助病毒依赖性腺病毒的条件下培养权利要求33-36的任意一项所述的重组宿主细胞。
39.一种用于造血细胞基因治疗的方法，其包括使用权利要求37所述的重组辅助病毒依赖性Ad病毒将动员的造血细胞体内转导至需要造血细胞基因治疗的受试对象的外周血中，其中所述的核酸酶靶向有待破坏的造血细胞基因组的基因，其中所述的造血细胞基因组的基因的破坏为所述的受试对象提供了治疗益处。
40.一种用于造血细胞基因治疗的方法，其包括使用权利要求37所述的重组辅助病毒依赖性Ad病毒将动员的造血细胞体内转导至需要造血细胞基因治疗的受试对象的外周血中，其中所述的重组核酸表达盒包含与在CD34+细胞中具有活性的启动子可操作地连接的转基因，其中所述的转基因的侧翼为至少第一再结合位点和第二再结合位点，其中所述的第一再结合位点和第二再结合位点靶向造血细胞基因组DNA中的位点，该位点为所述的转基因的所需的插入位点的侧翼，并且其中将所述的转基因插入至所述的所需的插入位点中为所述的受试对象提供了治疗益处。
41.权利要求39或40所述的方法，其中所述的造血细胞通过向所述的受试对象给予动员剂而被动员至外周血中，其中所述的动员剂选自粒细胞集落刺激因子(GCSF),Plerixafor(AMD3100；CXCR抑制剂),POL5551(CXCR4(C-X-C趋化因子受体4型)拮抗剂),BIO5192(VLA-4的小分子抑制剂)和它们的组合。
42.权利要求39-41的任意一项所述的方法，其中所述的受试对象为人类。
43.权利要求39-42的任意一项所述的方法，其中所述的受试对象患有或处于发展成选自以下的紊乱的风险之下：β-珠蛋白生成障碍性贫血,人免疫缺陷性病毒感染和/或获得性免疫缺陷性综合征,Ebola病毒感染,Epstein-Barr病毒感染和突发性急性呼吸综合征病毒(SARS)感染。
44.权利要求39-43的任意一项所述的方法，其中通过静脉内注射给予所述的重组辅助病毒依赖性Ad病毒。
45.一种包含2个或多个拷贝的miRNA靶位点的重组核酸，其中所述的miRNA靶位点包含选自SEQ ID NO:1-90的核酸序列的反向互补序列。
46.权利要求45所述的重组核酸，其包含至少4个拷贝的所述的miRNA靶位点。
47.权利要求45或46所述的重组核酸，其中所述的miRNA靶位点总计包含用于至少2个不同的miRNA的靶位点。
48.权利要求45-47的任意一项所述的重组核酸，其中1-10个核苷酸的间隔序列存在于各个编码的miRNA靶位点之间。
49.权利要求45-48的任意一项所述的重组核酸，其进一步包含位于所述的2个或多个拷贝的miRNA靶位点上游的、用于所关注的蛋白质的编码区，其中所述的2个或多个拷贝的miRNA位于所述的编码区的3’非翻译区内，并且在所述的编码区的翻译终止密码子下游的至少60个核苷酸。
50.一种合适表达载体，其包含与启动子序列可操作地连接的权利要求45-49的任意一项所述的重组核酸。
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