CN111166768A - 过表达ace2的间充质细胞在制备治疗新型冠状病毒药物方面的应用及其制备方法 - Google Patents

过表达ace2的间充质细胞在制备治疗新型冠状病毒药物方面的应用及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于医疗研究技术领域，涉及新型冠状病毒的治疗药物；本发明公开了过表达ACE2的间充质细胞在制备治疗新型冠状病毒药物方面的应用。本发明还公开了一种用于治疗新型冠状病毒的药物，至少包括过表达ACE2的间充质细胞。本发明另外还公开了过表达ACE2的间充质细胞的制备方法，所述过表达ACE2的间充质细胞通过转染方法获得，将携带有ACE2的质粒转染到间充质细胞。本发明的过表达ACE2的骨髓间充质细胞和受到病毒感染的肺上皮细胞株共同培养时可以显著减少肺上皮细胞的死亡；通过气管内滴注ACE2高水平表达的间充质细胞可以显著减轻新型冠状病毒感染引起的肺损伤，为新型冠状病毒的治疗提供新的治疗方向。

Description

过表达ACE2的间充质细胞在制备治疗新型冠状病毒药物方面 的应用及其制备方法
技术领域
本发明属于医疗研究技术领域，涉及新型冠状病毒的治疗药物，具体涉及过表达ACE2的间充质细胞在制备治疗新型冠状病毒药物方面的应用及其制备方法。
背景技术
新型冠状病毒（COVID-19）已经造成了巨大的人员和经济损失。目前对COVID-19的来源、传染性、感染的传播途径和诊疗方法等尚处于逐渐发现和不断认识的阶段，临床治疗主要以对症治疗和支持治疗为主。2020年1月下旬以来，国内外多个研究团队发现COVID-19是通过病毒棘突（S）蛋白与血管紧张素转化酶2（ACE2）结合入侵肺部细胞；病毒进入人体后，主要通过激活免疫系统，通过细胞因子、炎症因子等导致肺损伤。这说明COVID-19与导致严重急性呼吸综合征（SARS）的冠状病毒（SARS-CoV）一样，都是通过ACE2感染细胞。2月2日bioRxiv预印版平台也发表了来自国内第二军医大学等单位的研究报告，指出重组ACE2蛋白在体外与COVID-19和SARS-CoV的受体结合域（RBD）都具有高亲和力结合，并且具有理想的药理特性，能有效中和SARS-CoV和COVID-19。2月7日美国乔治·梅森大学的Yuntao Wu在《Virologica Sinica》发表综述性文章指出，在SARS-CoV进入人体后，病毒下调ACE2水平，导致肺内ACE2的水平下降，而ACE未受影响，引起肺内ACE2和ACE失衡，这是导致SARS-CoV感染人群肺损伤和肺衰竭的关键病理因素之一。ACE 和ACE 2同属于肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS）和激肽-缓激肽系统（KKS）家族。ACE促进血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）生成，后者激活肺组织上的血管紧张素AT1a受体，诱导支气管平滑肌收缩，增加肺血管通透性、促进肺成纤维细胞增殖、诱导肺泡上皮细胞凋亡，在诱导急性肺损伤时发挥重要作用。ACE2主要生理作用是降低AngⅠ、AngⅡ和Des-Arg缓激肽，促进Ang1-7生成，后者通过特异性Mas受体发挥舒张血管、抗炎、抗增生、抗纤维化和抗肺泡上皮细胞凋亡等作用，达到拮抗AngⅡ的生物学作用。在正常情况下，肺部ACE2和ACE的平衡对于避免肺损伤的病变形成有重要意义。已有研究报道注射人重组ACE2（rhuACE2）蛋白可以改善小鼠的急性肺损伤症状，如肺水肿等得到改善。北美曾开展一项Ⅱ期临床研究，对10例确诊的急性呼吸窘迫综合征患者应用人重组ACE2注射治疗后，发现AngⅡ水平快速下降，Ang1-7水平也得到回升，初步显示在人体补充ACE2能够重塑肺部ACE2/ACE平衡，治疗急性肺损伤具有良好的安全性和可行性。
间充质细胞（MSCs, mesenchymal stem cells）是最早在骨髓中发现的来源于中胚层的一群干细胞，不但具有强大的增殖能力和多向分化潜能，还具有独特的双向免疫调节功能，一方面可以通过细胞间的相互作用及产生细胞因子来抑制树突状细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞和自然杀伤细胞的活性，抑制病毒导致的机体过度免疫应答反应和细胞因子风暴的产生；另一方面可通过趋化作用，显著激活调节性免疫细胞的机能，提高免疫应答的针对性。动物实验结果发现在博来霉素诱导的肺损伤和肺间质纤维化模型中，MSCs经尾静脉注射后能显著提高动物生存率并改善肺部炎症。机制可能有两个，一个是部分MSCs能够植入损伤的肺组织，分化为I和II型上皮细胞、内皮细胞和成纤维细胞，参与受损气道上皮的修复，帮助维持和恢复正常的肺组织功能；另一个是移植的MSCs部分聚集在肺部，可以降低损伤肺组织中IFN-γ、IL-2、IL-1β 和IL-4 等炎症因子的含量，改善肺部细胞微环境，从而减轻肺部炎症。这些研究结果提示移植MSCs有可能在治疗COVID-19引起的肺损伤和细胞因子风暴中具有临床应用价值。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供过表达ACE2的间充质细胞在制备治疗新型冠状病毒药物方面的应用及其制备方法，以解决背景技术中所提出的问题。
本发明的实施例提供过表达ACE2的间充质细胞在制备治疗新型冠状病毒药物方面的应用。
进一步的，所述间充质细胞来源于骨髓、脂肪、脐带、真皮中的任一间充质组织。
本发明的实施例还提供一种用于治疗新型冠状病毒的药物，其特征在于，至少包括过表达ACE2的间充质细胞。
进一步的，所述过表达ACE2的间充质细胞通过转染方法获得。
进一步的，所述过表达ACE2的间充质细胞为细胞悬液。
其中，所述细胞悬液按以下方法制备：将培养的过表达ACE2的间充质细胞用0.25％trypsin-EDTA进行消化制成单细胞悬液，生理盐水洗涤后，再用生理盐水悬浮，即为过表达ACE2的间充质细胞悬液。
优选的，所述过表达ACE2的间充质细胞悬液中细胞浓度为1~10×107 个/ml。
进一步的，所述药物还包括药学上可接受的辅料。
本发明的实施例还提供了过表达ACE2的间充质细胞的制备方法，其特征在于，所述过表达ACE2的间充质细胞通过转染方法获得，将携带有ACE2的质粒转染到间充质细胞。
具体的，过表达ACE2的间充质细胞的制备方法包括以下过程：
（1）利用AdMax 系统，制备重组腺病毒Ad-ACE2并用PCR 方法鉴定；其中，
上游引物为：5 ′-CGTATGGGTGAGTGATTTG-3 ′；
下游引物为：5 ′-AGGAGGCTCGTAAGGTG′；
鉴定无误后扩增病毒并采用HPLC色谱层析纯化；
（2）髂骨穿刺抽取骨髓后分离、培养和纯化骨髓间充质细胞；
（3）按腺病毒感染复数量（MOI）= 300转染骨髓间充质细胞。
本发明的上述技术方案的有益效果如下：本发明利用新型冠状病毒重组SpikeRBD蛋白（由北京义翘神州科技有限公司提供，该蛋白是新型冠状病毒的重要靶点受体结合域蛋白S-RBD，具有很好的结合ACE2受体的活性）在培养的人肺上皮细胞株和小鼠体内分别构建新型冠状病毒感染模型，首次发现过表达ACE2的骨髓间充质细胞和受到病毒感染的肺上皮细胞株共同培养时可以显著减少肺上皮细胞的死亡；通过气管内滴注ACE2高水平表达的间充质细胞可以显著减轻新型冠状病毒感染引起的肺损伤，为新型冠状病毒的治疗提供新的治疗方向。
附图表说明
图1为本发明中转染ACE2的人骨髓间充质细胞（ACE2-MSCs）的检测结果；其中，图1A是PCR检测的结果；图1B荧光酶标仪检测的结果；
图2为本发明中过表达ACE2的骨髓间充质细胞能够减轻血管紧张素2（AngⅡ）引起的人肺上皮细胞的凋亡的检测结果；
图3为本发明中过表达ACE2的骨髓间充质细胞能够减轻新冠病毒感染的人肺上皮细胞的凋亡的检测结果。
具体实施方式
为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施例进行详细描述。
本发明中ACE2为人血管紧张素转化酶2，其基因的序列记载于NCBI, 基因号为(Gene ID: 59272)。
过表达ACE2的间充质细胞在制备治疗新型冠状病毒药物方面的应用。
在进一步的实施例中，所述间充质细胞来源于骨髓、脂肪、脐带、真皮等中的任一间充质组织。
本发明的实施例还提供一种用于治疗新型冠状病毒的药物，至少包括过表达ACE2的间充质细胞。
在进一步的实施例中，所述过表达ACE2的间充质细胞通过转染方法获得。
在进一步的实施例中，所述过表达ACE2的间充质细胞为细胞悬液。
其中，所述细胞悬液按以下方法制备：将培养的过表达ACE2的间充质细胞用0.25％trypsin-EDTA进行消化制成单细胞悬液，生理盐水洗涤后，再用生理盐水悬浮，即为过表达ACE2的间充质细胞悬液。
优选的，所述过表达ACE2的间充质细胞悬液中细胞浓度为1~10×107 个/ml。
在进一步的实施例中，所述药物还包括药学上可接受的辅料。
本发明的实施例还提供了过表达ACE2的间充质细胞的制备方法，其特征在于，所述过表达ACE2的间充质细胞通过转染方法获得，将携带有ACE2的质粒转染到间充质细胞。
具体的，过表达ACE2的间充质细胞的制备方法，具体包括以下过程：
由专业医生在捐献者的髂前上棘后上方行骨髓穿刺术，抽取1ml骨髓。将骨髓与磷酸缓冲盐溶液按1∶1 混合加入到淋巴细胞分离液上层，离心后液体分为四层，最上层约占液柱的1/2，为淡红色的血浆层；第三层约占液柱的1/4，为澄清的淋巴细胞分离液层；在两层的交界处为高约5 mm 的乳白色云雾状层，为单核细胞层（此层为所要提取的细胞层）；最底层紧附试管壁，呈深红色，主要为密度较大的红细胞层。取第二层的细胞，使用含15％FBS的DMEM／F12完全培养基，于37℃、5％CO2。的恒温培养箱中培养24h 后，可见有散在单个细胞贴壁；2-3d 后贴壁细胞开始分裂增殖，由最初的圆形逐渐伸展开，细胞两极朝向不规律，形态不规则，周围有混杂细胞；4-7d 后细胞呈集落样生长，以梭形居多；1w 后细胞扁平，多突起，胞体互相融合。至第3 代后，细胞形态基本单一，呈梭形，流式细胞仪检测约有95%的细胞为CD90+/CD45-/CD11b-。
（1）利用AdMax 系统，制备重组腺病毒Ad-ACE2并用PCR 方法鉴定：上游引物为：5′-CGTATGGGTGAGTGATTTG-3 ′，下游引物为：5 ′-AGGAGGCTCGTAAGGTG′；鉴定无误后扩增病毒并采用HPLC色谱层析纯化；
（2）按腺病毒感染复数量（MOI）= 300转染骨髓间充质细胞；
（3）AEC2酶活性检测是利用AEC2对荧光多肽底物V的水解来检测，AEC2活性可以用单位时间内底物转化成产物的蛋白含量来表示。收集细胞裂解液，加入96孔板中，每孔10 μl，稀释至50μl后与同体积荧光底物充分混匀，37度孵育30分钟，用荧光酶标仪检测，激发和发射波长分别为330 nm 和390 nm。
结果如图1所示，其中，图1A的PCR检测的结果显示，ACE2在正常人骨髓间充质细胞（MSCs）中几乎不表达，转染ACE2的人骨髓间充质细胞（ACE2-MSCs）中ACE2 mRNA水平是对照组的8965.8倍；图1B的荧光酶标仪检测的结果显示，ACE2酶活性是对照组的60.3倍。这两个结果说明已经成功制备了过表达ACE2的人骨髓间充质细胞。
药物效果验证一：过表达ACE2的骨髓间充质细胞能够减轻血管紧张素2（AngⅡ）引起的人肺上皮细胞的凋亡
将正常人骨髓间充质细胞和过表达ACE2的骨髓间充质细胞分别与肺泡上皮细胞Beas-2B共培养，加入终浓度5×10-9M的AngⅡ（每6小时加一次）来模拟病理条件， CCK-8检测肺上皮细胞的活率。
结果如图2所示，和正常人骨髓间充质细胞组（GFP-MSCs组）相比，过表达ACE2的骨髓间充质细胞（GFP-ACE2-MSCs）能够减轻AngⅡ诱导的Beas-2B损伤。
药物效果验证二：过表达ACE2的骨髓间充质细胞能够减轻新冠病毒感染的人肺上皮细胞的凋亡
利用Transwell培养体系将GFP-MSCs和GFP-ACE2-MSCs分别与新冠病毒重组Spike RBD蛋白处理过的肺上皮细胞株Beas-2B共培养，CCK-8检测肺上皮细胞的活率。
结果如图3所示：和正常人骨髓间充质细胞组（GFP-MSCs组）相比，过表达ACE2的骨髓间充质细胞（GFP-ACE2-MSCs）能够减轻新冠病毒感染的Beas-2B损伤。
可行的，在药物在治疗新型冠状病毒时使用过程中，过表达ACE2的间充质细胞悬液的药物用量是以过表达ACE2的间充质细胞个数计数为5~10×106个/kg 体重，局部注射（气管滴入等）1~5次；或 5~10×107个/kg 体重，静脉输注1~5次。
移植过表达ACE2的间充质细胞可在治疗COVID-19感染中会发挥多种作用：1）通过补充ACE2蛋白到肺组织来克服COVID-19引起的ACE2缺乏，平衡ACE/ ACE2功能，降低AngⅡ的水平，从而减轻COVID-19引起的严重肺损伤。2）通过调节免疫反应，减少促炎因子、增加抑炎因子来降低机体的过度炎症反应和细胞因子风暴。3）移植后聚集在肺部的脐带间充质细胞可以改善肺部细胞微环境，保护肺泡上皮细胞。4）归巢到受损部位的部分脐带间充质细胞可以定向分化产生新的功能细胞来行使替代功能，分泌细胞因子对于受损的细胞进行营养和修复，帮助其维持和恢复正常的功能。
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.过表达ACE2的间充质细胞在制备治疗新型冠状病毒药物方面的应用。
2.根据权利要求1所述的过表达ACE2的间充质细胞在制备治疗新型冠状病毒药物方面的应用，其特征在于，所述间充质细胞来源于骨髓、脂肪、脐带、真皮中的任一间充质组织。
3.一种用于治疗新型冠状病毒的药物，其特征在于，至少包括过表达ACE2的间充质细胞。
4.根据权利要求3所述的一种用于治疗新型冠状病毒的药物，其特征在于，所述过表达ACE2的间充质细胞通过转染方法获得。
5.根据权利要求3所述的一种用于治疗新型冠状病毒的药物，其特征在于，所述过表达ACE2的间充质细胞为细胞悬液。
6.根据权利要求5一种用于治疗新型冠状病毒的药物，其特征在于，所述细胞悬液按以下方法制备：将培养的过表达ACE2的间充质细胞用0.25％trypsin-EDTA进行消化制成单细胞悬液，生理盐水洗涤后，再用生理盐水悬浮，即为过表达ACE2的间充质细胞悬液。
7.根据权利要求6一种用于治疗新型冠状病毒的药物，其特征在于，所述过表达ACE2的间充质细胞悬液中细胞浓度为1~10×107 个/ml。
8.根据权利要求3一种用于治疗新型冠状病毒的药物，其特征在于，所述药物还包括药学上可接受的辅料。
9.过表达ACE2的间充质细胞的制备方法，其特征在于，所述过表达ACE2的间充质细胞通过转染方法获得，将携带有ACE2的质粒转染到间充质细胞。
10.根据权利要求1所述的过表达ACE2的间充质细胞的制备方法，其特征在于，包括以下过程：
利用AdMax 系统，制备重组腺病毒Ad-ACE2并用PCR 方法鉴定；其中，
上游引物为：5 ′-CGTATGGGTGAGTGATTTG-3 ′；
下游引物为：5 ′-AGGAGGCTCGTAAGGTG′；
鉴定无误后扩增病毒并采用HPLC色谱层析纯化；
髂骨穿刺抽取骨髓后分离、培养和纯化骨髓间充质细胞；
（3）按腺病毒感染复数量（MOI）= 300转染骨髓间充质细胞。
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