CN112430581A - 一种表达ace2蛋白的外泌体的制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种表达ACE2蛋白的外泌体的制备方法，包括步骤如下：构建稳定表达人源ACE2蛋白的hMSC人骨髓间充质干细胞系；通过超速离心法从hMSC人骨髓间充质干细胞系的培养上清液中提取富含ACE2蛋白的外泌体，其能够中和新冠病毒，对新冠病毒有治疗和预防潜力。因此，上述方法制得的一种表达ACE2蛋白的外泌体能应用于制备抗新型冠状病毒SARS‑CoV‑2药物。

Description

一种表达ACE2蛋白的外泌体的制备方法及应用
技术领域
本发明属于医疗技术领域，涉及一种表达ACE2蛋白的外泌体的制备方法及应用。
背景技术
新型冠状病毒属冠状病毒属(Coronavirus)，其基本结构由M蛋白、S 蛋白、N蛋白、E蛋白以及基因组单链RNA和包膜组成。研究表明，新冠病毒与SARS侵染人体的机制相似，均是由S蛋白与人体细胞的ACE2蛋白相结合，从而介导病毒侵染宿主。
血管紧张素转化酶2(ACE2)是羧肽酶ACE的同源物，生理条件下，ACE将血管紧张素Ⅰ(Ang I)转化为血管紧张素II(Ang II)，从而激活肾素-血管紧张素系统(RAS)，而ACE2作为RAS的负调节因子，通过切割灭活Ang II来负调控RAS的激活，从而调节机体的内环境稳态。
外泌体是一类大多数细胞会分泌的、大小30-150nm、由细胞内特殊机制产生的胞外囊泡。外泌体在被宿主细胞分泌出来后，可以通过血液、组织液传递到不同的靶细胞或者器官，利用其所具备的源自供体细胞的各项特征如功能蛋白、lncRNA、microRNA、生化代谢产物等调节靶细胞的生理状态，参与机体周身的生理状态调节。
目前在新型冠状病毒肺炎防治相关的科研工作中，预防以全球性的多类新冠病毒疫苗研发为主流，而治疗则以基本的临床治疗手段为主，二者之间仍存在一定断层，疫苗研发耗时耗力，短期内难以完成。小分子药物一般研制周期很长，目前都是旧药新用，比如氯奎，药效有限。除小分子药物外，血浆疗法虽好，但有一定风险，因为血浆因人而异，是一个复杂的混合物，而且血浆来源有限，不能大规模使用。而随着全球感染人数的持续增加，医疗投入已不堪重负，此时需要能够高效治疗临床患者、阻止患者病情进一步恶化的新方法新手段被开发出来。
发明内容
本发明目的是提供一种表达ACE2蛋白的外泌体的制备方法及应用，来解决上述问题。
本发明的技术方案是：
一种表达ACE2蛋白的外泌体的制备方法及应用，包括步骤如下：
(1)构建稳定表达人源ACE2蛋白的hMSC人骨髓间充质干细胞系；
(2)通过超速离心法从hMSC人骨髓间充质干细胞系的培养上清液中提取富含ACE2蛋白的外泌体。
进一步的，步骤(1)中，所述构建稳定表达人源ACE2蛋白的hMSC人骨髓间充质干细胞系包括如下步骤：
通过聚乙烯亚胺PEI转染体系将pVSV、pGAG、pREV和已构建好含有人源ACE2基因的pLV-puro质粒转入第一细胞培养皿中，在所述第一细胞培养皿中有密度为60％-80％的HEK293T细胞，8～12h后更换新鲜DMEM培养基，在温度为37℃的恒温条件下于CO2培养箱中培养，培养时间大于48h，在培养期间，病毒包装系统会在HEK293T细胞内组装形成含有ACE2基因组的慢病毒颗粒并被释放到DMEM培养基中；
将病毒悬液即所述DMEM培养基转移到第一离心管中，在室温1500rpm 条件下离心3～5min，获得分层的病毒悬液，吸取所述病毒悬液的上清液，并转移至第二离心管中；
取所述病毒悬液的上清液，加入第二细胞培养皿中，在所述第二细胞培养皿中含有密度为30％的hMSC人骨髓间充质干细胞，按1:1000的比例加入polybrene，进行感染，所述感染的时间大于48h，获得感染病毒的hMSC 人骨髓间充质干细胞；
给所述感染病毒的hMSC人骨髓间充质干细胞更换培养基，并按1:1000 的比例加入puromycin进行筛选作为培养组，同时取一盘同密度未经任何处理的hMSC人骨髓间充质干细胞更换新鲜的培养基并同样加入puromycin作为对照组；
在所述培养组进行puromycin筛选超过48h且在对照组hMSC人骨髓间充质干细胞完全死亡后，所述培养组存活的细胞即为稳定表达人源ACE2蛋白的hMSC人骨髓间充质干细胞系。
进一步的，所述pVSV：pGAG：pREV：已构建好含有人源ACE2基因的pLV-puro质粒的质量比为2.8:5.3:4.1:7.9。
进一步的，所述polybrene的终浓度为5μg/mL，所述puromycin的终浓度为1μg/mL。
进一步的，步骤(2)中，通过超速离心法从hMSC人骨髓间充质干细胞系的培养上清液中提取富含ACE2蛋白的外泌体具体包括步骤：
取稳定表达人源ACE2蛋白的hMSC人骨髓间充质干细胞的培养基，离心10min；收集培养基的上清液，离心20min；转移上清液至第一超离管内，离心1h；收集上清液至第二超离管内，离心70min；弃掉85％的上清液，管内剩余的培养基用无菌PBS溶液吹悬混匀，在温度为4℃的条件下离心70 min，缓慢倒掉上清液，室温晾干3～5min，沉淀即为外泌体。
进一步的，所述离心的温度均为4℃。
进一步的，所述无菌PBS溶液经过0.22μm孔径滤膜过滤。
进一步的，所述外泌体的表面含有大于500μg/ml的ACE2蛋白。
进一步的，所述外泌体重悬于1×PBS缓冲液，并保存在温度为-80℃的条件下。
本发明的另一技术方案是：
一种表达ACE2蛋白的外泌体在制备抗新型冠状病毒SARS-CoV-2药物中的应用。
本发明提供了一种表达ACE2蛋白的外泌体的制备方法及应用，根据 SARS-CoV-2新型冠状病毒侵染宿主细胞的基本机制以及外泌体在机体内的基本功能和生理特性，人工改造外泌体使之表达ACE2蛋白，通过在机体内环境里结合病毒颗粒表面的spike蛋白，阻断spike蛋白与宿主细胞表面 ACE2的结合，从而阻断病毒进入细胞。即富含ACE2蛋白的外泌体能够牢牢地结合到新冠病毒上，改变它的功能，阻止它侵入细胞，所以表达ACE2 的外泌体具有中和新冠病毒的功能，阻止病毒扩散，加速其被代谢及被免疫系统识别的过程，从而实现临床病症的有效治疗。
附图说明
图1为用nanosight检测人骨髓间充质干细胞hMSC和表达ACE2蛋白的人骨髓间充质干细胞hMSC提取的外泌体的直径和密度；
图2为人骨髓间充质干细胞hMSC和表达ACE2蛋白的人骨髓间充质干细胞hMSC提取的外泌体的透射电镜图；
图3为人骨髓间充质干细胞hMSC和表达ACE2蛋白的人骨髓间充质干细胞hMSC提取的外泌体的ACE2蛋白含量的免疫印迹检测结果图；
图4为表达ACE2蛋白的人骨髓间充质干细胞hMSC提取的外泌体中 ACE2蛋白含量的电镜检测结果图；
图5为表达ACE2蛋白的外泌体对新冠假病毒感染表达ACE2的人胚肾细胞HEK293T的作用示意图；
图6为表达ACE2蛋白的外泌体在新冠中和抗体检测试剂盒中的ELISA 结果图；
图7为表达ACE2蛋白的外泌体对新冠病毒感染猴肾细胞Vero-E6的中和作用图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案。但是本发明不限于所列出的实施例，还应包括在本发明所要求的权利范围内其他任何公知的改变。
此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
实施例1
稳定表达ACE2蛋白的人骨髓间充质干细胞hMSC来源外泌体的提取和鉴定。
1.稳定表达ACE2的hMSC人骨髓间充质干细胞系的构建
(1)通过聚乙烯亚胺PEI转染体系将pVSV、pGAG、pREV和已构建好含有人源ACE2基因的pLV-puro质粒按一定比例转入10cm细胞培养皿密度70％的HEK293T细胞中，8～12h后换10mL新鲜DMEM培养基，在37℃恒温CO2培养箱中培养48h以上，期间病毒包装系统会在细胞内组装形成含有ACE2基因组的慢病毒颗粒并被释放到细胞培养基中。
(2)将病毒悬液即细胞培养基转移到15mL离心管，室温1500rpm 离心3～5min，小心吸取上清转移至另一个干净的15mL离心管，切勿吸到或吹起管底的细胞碎片沉淀。取用20mL注射器及0.45μm孔径的滤膜将病毒悬液过滤，分装到1.5mL离心管内，可放在-80℃冰箱长期保存。
(3)取1mL病毒悬液加入10cm细胞培养皿密度30％的人骨髓间充质干细胞hMSC中，按1:1000比例加入polybrene(终浓度5ug/mL)，感染 48h以上。
(4)给感染病毒的hMSC细胞换10mL新鲜DMEM培养基，并按 1:1000比例加入puromycin(终浓度1ug/mL)进行筛选。同时取一盘同密度未经任何处理的hMSC细胞换10mL新鲜DMEM培养基并同样加入 puromycin(终浓度1ug/mL)作为对照组。
(5)puromycin(终浓度1ug/mL)筛选48h后且在对照组hMSC细胞完全死亡后，培养组中存活的细胞为稳定表达ACE2的hMSC人骨髓间充质干细胞系。
2.稳定表达ACE2的人骨髓间充质干细胞hMSC来源外泌体的提取与鉴定
(1)稳定表达ACE2的hMSC人骨髓间充质干细胞的培养基上清液， 500g 4℃离心10min；收集上清液，2000g 4℃离心20min；转移上清液至 38.6mL超离管内，10000g 4℃离心1h；收集上清液至新的超离管内，100000 g 4℃离心70min；弃掉85％的上清液，管内剩余的培养基用25mL 0.22μm 孔径滤膜过滤过的无菌PBS溶液吹悬混匀，100000g 4℃离心70min，缓慢倒掉上清液，室温晾干3～5min，沉淀即为外泌体，将外泌体重悬于0.2ml PBS缓冲液，分装保存于-80℃备用。
(2)取20μL外泌体悬液，用0.22μm滤膜过滤的无菌PBS稀释，用纳米粒子示踪系统Nanosight检测提取到的外泌体的粒径、密度，观测浓度位于107～108个/mL为宜。请参阅图1，图1为用nanosight检测人骨髓间充质干细胞hMSC和表达ACE2蛋白的人骨髓间充质干细胞hMSC提取的外泌体的直径和密度。如图1所示，颗粒直径参数(50-150nm)均与外泌体的特征相一致。
(3)取50μL外泌体悬液，100000g超速离心2h，弃掉40μL上清液，用剩余10μL PBS反复轻柔吹匀以浓缩外泌体悬液，将悬液滴于经辉光放电处理的铜网上，充分吸附后用醋酸双氧铀负染样品，用冷冻透射电镜观察外泌体形态。请参阅图2，图2为人骨髓间充质干细胞hMSC和表达ACE2 蛋白的人骨髓间充质干细胞hMSC提取的外泌体的透射电镜图。如图2所示，电镜观察到的颗粒形态(中间凹空边缘明亮)和颗粒大小(50-150nm)也与外泌体电镜特征相一致，因此，可以得知分离得到的即为外泌体。
(4)外泌体裂解液(2.5％SDS溶于8M尿素，溶剂为双蒸水)室温裂解外泌体30min，经BCA蛋白浓度测定，确定外泌体的总蛋白浓度；利用免疫印迹检测外泌体负载的ACE2以及外泌体的标志物TSG101,ALIX等。请参阅图3，图3为人骨髓间充质干细胞hMSC和表达ACE2蛋白的人骨髓间充质干细胞hMSC提取的外泌体的ACE2蛋白含量的免疫印迹检测结果图。如图3所示，相比于普通人骨髓间充质干细胞hMSC来源的外泌体，表达ACE2的人骨髓间充质干细胞hMSC的外泌体富含ACE2蛋白。
(5)利用胶体金免疫电镜检测外泌体膜上的ACE2及外泌体特异性标志物TSG101。请参阅图4，图4为表达ACE2蛋白的人骨髓间充质干细胞 hMSC提取的外泌体中ACE2蛋白含量的电镜检测结果图。如图4所示，依赖于抗ACE2抗体以及胶体金的特异性识别，表达ACE2的外泌体表面特异性结合很多胶体金颗粒，而对照组中的野生型外泌体表面没有结合胶体金颗粒。另外，利用外泌体特异性标志物TSG101的特异性抗体孵育纯化的外泌体，胶体金颗粒也会特异结合在外泌体膜表面，而用空白对照IgG抗体孵育外泌体，则没有胶体金颗粒结合。以上结果进一步表明纯化得到的是外泌体，且表达ACE2的的外泌体表面富含ACE2蛋白。
实施例2
检测实施例1中提取的富含人源ACE2的外泌体对新冠假病毒的中和作用。
在本实施例中，假病毒(pseudovirus)又称“伪病毒”，是一类嵌合型病毒颗粒，是在一种复制缺陷型病毒(病毒载体)的表面上表达另一种病毒的重组糖蛋白的嵌合病毒颗粒。假病毒被推荐为病毒核酸检测试剂盒用阳性质控品。
1.稳定表达ACE2的HEK293T人胚肾细胞系的构建
(1)通过聚乙烯亚胺PEI转染体系将pVSV、pGAG、pREV和已构建好含有人源ACE2基因的pLV-puro质粒按一定比例转入10cm细胞培养皿密度 70％的HEK293T细胞中，8～12h后换10mL新鲜DMEM培养基，在37℃恒温 CO2培养箱中培养48h以上，期间病毒包装系统会在细胞内组装形成含有 ACE2基因组的慢病毒颗粒并被释放到细胞培养基中。
(2)将病毒悬液即细胞培养基转移到15mL离心管，室温1500rpm离心 3～5min，小心吸取上清转移至另一个干净的15mL离心管，切勿吸到或吹起管底的细胞碎片沉淀。取用20mL注射器及0.45μm孔径的滤膜将病毒悬液过滤，分装到1.5mL离心管内，可放在-80℃冰箱长期保存。
(3)取1mL病毒悬液加入10cm细胞培养皿密度30％的人骨髓间充质干细胞hMSC中，按1:1000比例加入polybrene(终浓度5ug/mL)，感染48h 以上。
(4)给感染病毒的HEK293T细胞换10mL新鲜DMEM培养基，并按 1:1000比例加入puromycin(终浓度1ug/mL)进行筛选。同时取一盘同密度未经任何处理的hMSC细胞换10mL新鲜DMEM培养基并同样加入puromycin (终浓度1ug/mL)作为对照组。
(5)puromycin(终浓度1ug/mL)筛选48h后且在对照组HEK293T细胞完全死亡后，判断存活的细胞可能为稳定表达ACE2的HEK293T人胚肾细胞系。取一部分稳转细胞裂解，Western blot并用anti-ACE2抗体检测，验证稳转细胞系具有表达人源ACE2的能力。
2.稳定表达ACE2的HEK293T人胚肾细胞作为假病毒感染靶细胞鉴定富含人源ACE2的外泌体对新冠假病毒的中和作用。
(1)在48孔板内铺稳定表达ACE2的HEK293T人胚肾细胞，密度严格控制在20～25％之间，即细胞量为40000个/孔。
(2)待细胞贴好后，按MOI＝0.5，MOI＝1，分别加入不同量的新冠假病毒，每组3个孔重复。同时在每组中分别加入20μg外泌体处理。
(3)假病毒和外泌体共处理24h后换成新鲜培养基，继续培养24-48 h，保证细胞状态良好。
(4)通过观察统计带有GFP荧光的HEK293T细胞，分析评估富集人源ACE2的外泌体对新冠假病毒的中和能力。请参阅图5，图5为表达ACE2 蛋白的外泌体对新冠假病毒感染表达ACE2的人胚肾细胞HEK293T的作用示意图。如图5所示，在没有外泌体处理的假病毒感染组，被感染的HEK293T 细胞因病毒携带的GFP基因而呈现绿色，且随着病毒滴度的增加，被感染的 HEK293T细胞随之增多。而在外泌体处理组，假病毒无法感染HEK293T细胞，因此HEK293T细胞因未被感染而不呈现绿色。上述结果说明表达ACE2 的外泌体对新冠假病毒具有中和能力。
实施例3
检测实施例1中提取的富含人源ACE2的外泌体对新冠病毒的中和作用。
(1)在96孔板内按10000个/孔铺VERO E6非洲绿猴肾细胞。
(2)第二天待细胞贴壁后，将40μl不同浓度的外泌体与40μl含有 100倍50％组织细胞感染量(TCID50)的新冠病毒混合，在37℃下放置2小时，然后将混合液加入到VERO E6细胞中，每组3个孔重复。
(3)继续培养5天左右，通过观察VERO E6非洲绿猴肾细胞的存活情况，分析评估富集人源ACE2的外泌体对新冠病毒的中和能力。请参阅图 6，图6为表达ACE2蛋白的外泌体在新冠中和抗体检测试剂盒中的ELISA 结果图。如图6所示，对照组的外泌体对新冠病毒侵染VERO E6细胞没有中和能力，而表达ACE2的外泌体则能中和新冠病毒侵染VERO E6细胞从而避免VERO E6细胞的死亡，且表达ACE2的外泌体的中和病毒的能力随着外泌体浓度的增加而增加。上述结果说明富含人源ACE2的外泌体对新冠病毒有显著的中和作用。
实施例4
检测实施例1中提取的富含人源ACE2的外泌体对新冠病毒的中和作用。
(1)将制备好的外泌体按不同比例稀释，分别取60μl外泌体和60μl HRP-RBD溶液混匀，在37℃下反应30分钟。
(2)取100μl反应液到ELISA孔板中，每组重复3个孔，放于37℃孵育15分钟。
(3)吸去反应液，用260μl wash buffer洗4次。
(4)将ELISA孔板倒置于干净的吸水纸吸干多余的液体。
(5)加入100μl TMB buffer到每个孔，将ELISA孔板避光放置到20-25 度15分钟。
(6)加入50μl stop buffer到每个孔终止反应。
(7)用多功能酶标仪测OD450 nm的吸光值。请参阅图7，图7为表达 ACE2蛋白的外泌体对新冠病毒感染猴肾细胞Vero-E6的中和作用图。如图7 所示，普通外泌体由于不含ACE2，无法与HRP-RBD结合，导致HRP-RBD 与ELISA孔板上偶联的受体结合，并不能被washbuffer洗掉，在加入TMB 底物后发出荧光并被酶标仪检测到。而富含ACE2的外泌体通过与HRP-RBD 特异性结合，阻断了HRP-RBD与ELISA孔板上偶联受体的结合，进而被 washbuffer洗掉，因此在加入TMB底物后，ELISA板的孔内没有HRP-RBD 催化底物，不能发出荧光，且富含ACE2的外泌体的阻断能力随着外泌体浓度的增加而增加。上述结果说明提取的富含人源ACE2的外泌体对新冠病毒有显著的中和作用。
综上所述，本发明所述的一种表达ACE2蛋白的外泌体的制备方法及应用，能够中和新冠病毒，对新冠病毒有治疗和预防潜力。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (10)

1.一种表达ACE2蛋白的外泌体的制备方法，其特征在于，包括步骤如下：
(1)构建稳定表达人源ACE2蛋白的hMSC人骨髓间充质干细胞系；
(2)通过超速离心法从hMSC人骨髓间充质干细胞系的培养上清液中提取富含ACE2蛋白的外泌体。
2.根据权利要求1所述的一种表达ACE2蛋白的外泌体的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述构建稳定表达人源ACE2蛋白的hMSC人骨髓间充质干细胞系包括如下步骤：
通过聚乙烯亚胺PEI转染体系将pVSV、pGAG、pREV和已构建好含有人源ACE2基因的pLV-puro质粒转入第一细胞培养皿中，在所述第一细胞培养皿中有密度为60％-80％的HEK293T细胞，8～12h后更换新鲜DMEM培养基，在温度为37℃的恒温条件下于CO2培养箱中培养，培养时间大于48h，在培养期间，病毒包装系统会在HEK293T细胞内组装形成含有ACE2基因组的慢病毒颗粒并被释放到DMEM培养基中；
将病毒悬液即所述DMEM培养基转移到第一离心管中，在室温1500rpm条件下离心3～5min，获得分层的病毒悬液，吸取所述病毒悬液的上清液，并转移至第二离心管中；
取所述病毒悬液的上清液，加入第二细胞培养皿中，在所述第二细胞培养皿中含有密度为30％的hMSC人骨髓间充质干细胞，按1:1000的比例加入polybrene，进行感染，所述感染的时间大于48h，获得感染病毒的hMSC人骨髓间充质干细胞；
给所述感染病毒的hMSC人骨髓间充质干细胞更换培养基，并按1:1000的比例加入puromycin进行筛选作为培养组，同时取一盘同密度未经任何处理的hMSC人骨髓间充质干细胞更换新鲜的培养基并同样加入puromycin作为对照组；
在所述培养组进行puromycin筛选超过48h且在对照组hMSC人骨髓间充质干细胞完全死亡后，所述培养组存活的细胞即为稳定表达人源ACE2蛋白的hMSC人骨髓间充质干细胞系。
3.根据权利要求2所述的一种表达ACE2蛋白的外泌体的制备方法，其特征在于：所述pVSV：pGAG：pREV：已构建好含有人源ACE2基因的pLV-puro质粒的质量比为2.8:5.3:4.1:7.9。
4.根据权利要求2所述的一种表达ACE2蛋白的外泌体的制备方法，其特征在于：所述polybrene的终浓度为5μg/mL，所述puromycin的终浓度为1μg/mL。
5.根据权利要求1所述的一种表达ACE2蛋白的外泌体的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，通过超速离心法从hMSC人骨髓间充质干细胞系的培养上清液中提取富含ACE2蛋白的外泌体具体包括步骤：
取稳定表达人源ACE2蛋白的hMSC人骨髓间充质干细胞系的培养基，离心10min；收集培养基的上清液，离心20min；转移上清液至第一超离管内，离心1h；收集上清液至第二超离管内，离心70min；弃掉85％的上清液，管内剩余的培养基用无菌PBS溶液吹悬混匀，在温度为4℃的条件下离心70min，缓慢倒掉上清液，室温晾干3～5min，沉淀即为外泌体。
6.根据权利要求5所述的一种表达ACE2蛋白的外泌体的制备方法，其特征在于：所述离心的温度均为4℃。
7.根据权利要求5所述的一种表达ACE2蛋白的外泌体的制备方法，其特征在于：所述无菌PBS溶液经过0.22μm孔径滤膜过滤。
8.根据权利要求5所述的一种表达ACE2蛋白的外泌体的制备方法，其特征在于：所述外泌体的表面含有大于500μg/ml的ACE2蛋白。
9.根据权利要求5所述的一种表达ACE2蛋白的外泌体的制备方法，其特征在于：所述外泌体重悬于1×PBS缓冲液，并保存在温度为-80℃的条件下。
10.一种表达ACE2蛋白的外泌体在制备抗新型冠状病毒SARS-CoV-2药物中的应用。
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