CN113398283A - 一种基于生物膜耦合的可吸入雾化微球及制备方法与应用 - Google Patents
一种基于生物膜耦合的可吸入雾化微球及制备方法与应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113398283A CN113398283A CN202110678021.9A CN202110678021A CN113398283A CN 113398283 A CN113398283 A CN 113398283A CN 202110678021 A CN202110678021 A CN 202110678021A CN 113398283 A CN113398283 A CN 113398283A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- microspheres
- membrane
- inhalable
- atomization
- ace2
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
- A61K9/007—Pulmonary tract; Aromatherapy
- A61K9/0073—Sprays or powders for inhalation; Aerolised or nebulised preparations generated by other means than thermal energy
- A61K9/0078—Sprays or powders for inhalation; Aerolised or nebulised preparations generated by other means than thermal energy for inhalation via a nebulizer such as a jet nebulizer, ultrasonic nebulizer, e.g. in the form of aqueous drug solutions or dispersions
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
- A61K38/46—Hydrolases (3)
- A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- A61K38/4813—Exopeptidases (3.4.11. to 3.4.19)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
- A61K47/61—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule the organic macromolecular compound being a polysaccharide or a derivative thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
- A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
- A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
- A61K9/16—Agglomerates; Granulates; Microbeadlets ; Microspheres; Pellets; Solid products obtained by spray drying, spray freeze drying, spray congealing,(multiple) emulsion solvent evaporation or extraction
- A61K9/1605—Excipients; Inactive ingredients
- A61K9/1629—Organic macromolecular compounds
- A61K9/1652—Polysaccharides, e.g. alginate, cellulose derivatives; Cyclodextrin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
- C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
- C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
- C08B37/0072—Hyaluronic acid, i.e. HA or hyaluronan; Derivatives thereof, e.g. crosslinked hyaluronic acid (hylan) or hyaluronates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/485—Exopeptidases (3.4.11-3.4.19)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/17—Metallocarboxypeptidases (3.4.17)
- C12Y304/17023—Angiotensin-converting enzyme 2 (3.4.17.23)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Virology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Otolaryngology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
Abstract
本发明提供了一种基于生物膜耦合的可吸入雾化微球及其制备方法和应用,属于基因工程技术领域。该基于生物膜耦合的可吸入雾化微球包括生物膜、生物膜耦合器和雾化微球,所述生物膜通过生物膜耦合器与雾化微球固定连接;其中,所述生物膜耦合器通过静电吸附作用或脂质层粘附作用与生物膜相耦合,所述雾化微球由甲基丙烯酸化明胶或甲基丙烯酸化透明质酸交联而成。本发明还提供了该可吸入雾化微球的制备方法与应用。该可吸入雾化微球能够继承天然细胞的免疫调控功能,广谱性地吸附包括炎症因子在内的多种生物因子,克服了单克隆抗体成本高、作用机制单一的缺点,同时,耦合于雾化微球的生物膜可以直达呼吸道病变部位,且克服了蛋白质易降解的缺点。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域,具体涉及一种基于生物膜耦合的可吸入雾化微球及其制备方法和应用。
背景技术
新冠病毒感染过程是由其表面的刺突糖蛋白(SPIKE蛋白,S蛋白)与宿主细胞表面的血管紧张素转换酶2(ACE2)的相互识别开启的,因此新冠病毒疫苗是以S蛋白为靶点,通过表达S蛋白诱导人体免疫系统产生能够结合新冠病毒的保护性抗体,从而实现预防感染的目标。
目前预防SARS-Cov-2感染的策略仅限于疫苗,中和抗体都抑制 S蛋白与ACE2受体的结合。这些方法虽然无疑是可行的手段,但在大流行期间的临床应用一直是一个主要问题。疫苗的研制需要一个与紧急情况不兼容的时限,它更倾向于是一种预防性方法,而不是治疗干预,尤其是在严重病例中。限制采用中和抗体可能是由于其有争议的效力。通过肌肉注射注射的中和抗体,其效价比支气管肺泡灌洗样品高2000倍,表明大多数肌肉注射的中和抗体没有被注射到合适的器官室进行病毒中和。此外,目前的病毒中和策略针对特定的病毒种类,而不是受影响的宿主细胞,这很难应用于不同种类的病毒。鉴于病毒积累突变和逃避治疗,疫苗和中和抗体可能会出现效率低下。重组ACE2蛋白循环或吸入给药也被报道用于冠状病毒的预防,但是,由于不可避免的化学和物理不稳定以及大量蛋白酶在支气管肺泡灌洗液中受到很大限制。此外,这些治疗方案侧重于消除SARS-Cov-2 本身,而忽略了严重COVID-19进展的其他重要因素,如抗炎干预的不可或缺作用,尤其是对免疫窘迫患者更易发生病毒性血管渗漏和异常炎症反应。因此,同时发挥综合治疗效果的替代治疗干预措施对于有效的COVID-19治疗是非常可取的。
目前,细胞膜治疗平台由于继承源细胞相关功能和广谱炎症调节能力,为传染病和炎症性疾病的治疗干预提供了新的思路。从细胞泡中融合的诱饵纳米粒子也显示出了COVID-19处理的显著潜力。然而,在病毒清除方面,这些循环诱饵往往在病毒血症发生后将病毒捕获到血液中,对临床恶化的预防仍然被忽视。此外,人肺上皮Ⅱ型细胞的细胞培养是乏味的,这至少部分归因于生长因子的需求,从而导致非预期的成纤维细胞分化。此外,ACE2在人肺上皮Ⅱ型细胞中的表达远未经放大产生,从而阻碍了宿主细胞策略在临床应用中的应用。向肺组织直接输送抗病毒药物和皮质类固醇等治疗药物,希望安全和短暂地改善靶器官的治疗药物,而不是全身性分娩,通常是肌肉注射或静脉注射。在这一行中,调查显示药物的气溶胶输送被证明能激发暂时性肺药物剂量,从而使一种控制良好的剂量药物达到治疗水平,并尽量减少全身毒性。
雾化治疗是一种直接向肺部递送药物的治疗方法,具有高浓度、副作用小等优点,可针对新冠病毒引起的肺部感染治疗。另一方面,基因工程手段用于药物的递送和疾病的治疗已有了重大进展。由于细胞膜天然存在大量炎症受体(可以作为炎症因子的假靶子),因而通过进行ACE2相关基因工程改造,获得一种既可以规模化培养又可以大量高表达ACE2蛋白的细胞膜,是极具研究前景,但该基因工程方面的相关研究有待开展。
发明内容
本发明的目的就是为了解决上述技术问题,从而提供一种基于生物膜耦合的可吸入雾化微球及其制备方法和应用。本发明通过对 HEK293T细胞进行ACE2基因工程改造,从而获得既可以规模化培养又可以大量高表达ACE2蛋白的细胞膜,该类细胞膜凭借ACE2受体,可以吸引新冠病毒、SARS病毒等的攻击,从而减缓肺泡组织的压力。
本发明的技术目的之一是提供一种基于生物膜耦合的可吸入雾化微球,为了实现上述目的,本发明采用的技术方案如下:
一种基于生物膜耦合的可吸入雾化微球,所述可吸入雾化微球包括生物膜、生物膜耦合器和雾化微球,所述生物膜通过生物膜耦合器与雾化微球固定连接;其中,所述生物膜耦合器通过静电吸附作用或脂质层粘附作用与生物膜相耦合,所述生物膜为细胞膜或细胞器膜,所述雾化微球由甲基丙烯酸化明胶或甲基丙烯酸化透明质酸交联而成。
本发明提供的上述基于生物膜耦合的可吸入雾化微球能够继承天然细胞的免疫调控功能,广谱性地吸附包括炎症因子在内的多种生物因子,克服了单克隆抗体成本高、作用机制单一的缺点;同时,耦合于雾化微球的生物膜可以直达呼吸道病变部位,且克服了蛋白质易降解的缺点。
进一步的是,所述生物膜耦合器为透明质酸微球形成的负电层,其通过静电吸附作用与带有正电荷的细胞膜相耦合;或,所述生物膜耦合器为透明质酸或明胶与R1-PEG-R2反应得到的产物,其通过脂质层粘附作用与生物膜相耦合,其中,所述R1为二棕榈酰、二肉豆蔻酰、二油酰磷脂酰、二硬脂酰中的至少一种,所述R2为氨基、羧基、叠氮或巯基。
进一步的是,所述细胞器膜包括内质网膜、高尔基体膜或细胞质膜,所述细胞膜来源于巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞或红细胞。
进一步的是,所述可吸入雾化微球的直径为5-200μm,内部孔径为2-50μm。
进一步的是,所述生物膜为基因工程改造的ACE2蛋白高表达生物膜,其是通过将人ACE2基因插入pcDNA3.1-3xFlag-C质粒载体,构建得到ACE2-pcDNA3.1-3xFlag-C载体。
进一步的是,所述ACE2-pcDNA3.1-3xFlag-C载体的具体构建方法为:用50uLOpti-MEM稀释0.8ug质粒DNA,轻轻吹吸3-5次混匀,室温下静置5min,然后轻轻颠倒混匀转染试剂,用50uL Opti-MEM稀释2.0uL Lipofectamine TM2000,轻轻吹吸3-5次混匀,室温下静置5min,混合转染试剂和质粒DNA稀释液,轻轻吹吸3-5 次混匀,室温下静置20min,将转染复合物按100uL/孔加入到24孔细胞板中,前后轻摇细胞板混合均匀,将细胞板置于37℃、5%(v/v) CO2培养箱中培养6h,进行换液,换成含10%血清的普通培养基,在37℃,5%(v/v)CO2孵育箱中继续培养24h,即得。
本发明的技术目的之二是提供一种如上所述基于生物膜耦合的可吸入雾化微球的制备方法,其包括以下步骤:
(1)透明质酸甲基丙烯酸酯(HAMA)的合成:以透明质酸和甲基丙烯酸酐为原料,通过酯化反应合成透明质酸甲基丙烯酸酯 (HAMA);
(2)生物膜纳米囊泡的制备:将细胞用PBS缓冲液清洗3次后, 800g离心5min,收集HEK293-ACE2和Raw264.7细胞,在低渗裂解缓冲液中4℃过夜裂解细胞膜,在相同温度下,以20000g离心 25min,离心后,收集上清液,再以100000g离心35min,之后收集含有膜的颗粒,用补充有EDTA的水洗涤,用Bradford试剂定量膜含量,然后将膜于4℃储存,所得膜(HEK293-ACE2和Raw264.7 膜)以1:1的膜蛋白重量比混合,超声处理5min进行融合,然后,在微挤出机上通过100nm孔挤出产物;
(3)吸入式ACE2工程微流控微球的制备:采用微流控装置制备吸入ACE2工程微球,将500mg冻干HAMA完全溶解于10mL 含有0.05g光引发剂的PBS中,作为内水相,然后以5%(w/w)司盘80的石蜡油为连续油相,稳定剪切应力产生的微球液滴,将水相和连续油相分别以15mL/h和800mL/h的流速缓慢注入微流控装置,然后,将浸于石蜡油中的微流控微球进一步转移到10cm细胞培养盘中,并在波长为365nm的蓝光照射下交联30s,然后,将固化的水凝胶微球吸入各离心管中,然后用丙酮和75%乙醇反复洗涤以除去油和表面活性剂,最后,用HEK293-ACE2和Raw264.7膜包被HAMA 微球,混合膜泡与HAMA微球以2:1~3:1(w/w)的比例孵育1h,在频率为50KHz的条件下,用浴式超声仪对混合物进行超声处理3-5 min,形成生物膜耦合的可吸入雾化微球。
进一步的是,步骤(1)中所述透明质酸甲基丙烯酸酯(HAMA) 的制备方法按照如下步骤:将1g透明质酸加入含有30mL DMF的 60mL磷酸盐缓冲液中,并在60℃下完全溶解过夜,然后在连续的电磁搅拌下缓慢滴加8mL甲基丙烯酸酐和适量的NaOH溶液,使pH 值保持在8-9,完全加入甲基丙烯酸酐,在N2气氛下在冰浴中继续反应24h。然后,用5倍冰乙醇稀释混合物以沉淀产物。离心收集的沉淀物溶解在水中,在-80℃冷冻干燥和储存后,超纯水透析5天。
进一步的是,所述细胞裂解液为低渗Tris-HCl缓冲液。
本发明的技术目的之三是提供上述基于生物膜耦合的可吸入雾化微球的应用,是将该可吸入雾化微球用于制备由新冠病毒或SARS 病毒引起的肺炎疾病治疗方面的药物。
本发明的有益效果如下:
本发明将人ACE2基因插入pcDNA3.1-3xFlag-C载体,构建 ACE2-pcDNA3.1-3xFlag-C载体,并导入HEK293-ACE2细胞转染,获得高表达ACE2的HEK293-ACE2细胞。通过免疫荧光成像和定量分析证实HEK293-ACE2细胞上ACE2的高水平表达,HEK293-ACE2 组的荧光是HEK293组的15.6倍以上。该类细胞膜凭借ACE2受体,可以吸引新冠病毒、SARS病毒等的攻击,从而减缓肺泡组织的压力。并能够继承天然细胞的免疫调控功能,广谱性地吸附包括炎症因子在内的多种生物因子,克服了单克隆抗体成本高、作用机制单一的缺点;同时,耦合于雾化微球的生物膜可以直达呼吸道病变部位,且克服了蛋白质易降解的缺点。
附图说明
图1为基因工程化生物膜耦合的可吸入性雾化微球的制备和表征。
图2为可吸入微球的生物相容性表征。
图3为基因工程化生物膜耦合的可吸入性雾化微球(iAE-PMS)对新冠病毒假病毒的感染效力抑制实验。
图4为基因工程化生物膜耦合的可吸入性雾化微球改善肺泡灌洗液中的炎症细胞浸润谱系。
图5为基因工程化生物膜耦合的可吸入性雾化微球广泛减少肺组织炎症细胞浸润,减轻急性肺损伤症状,提高肺炎导致的急性肺损伤后生存率。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合实施例对本发明进行具体描述,有必要指出的是,以下实施例仅仅用于对本发明进行解释和说明,并不用于限定本发明。本领域技术人员根据上述发明内容所做出的一些非本质的改进和调整,仍属于本发明的保护范围。
实施例1
一种基因工程化生物膜耦合的可吸入性雾化微球的制备,按照如下方法:
(1)HAMA的合成:以透明质酸(Sigma-Aldrich)和甲基丙烯酸酐(Sigma-Aldrich)为原料,通过酯化反应合成了HAMA。具体为:将1g透明质酸加入含有30mL DMF的60mLDulbecco磷酸盐缓冲盐水中,并在60℃下完全溶解过夜,然后在连续的电磁搅拌下缓慢滴加8mL甲基丙烯酸酐和适量的NaOH溶液,使pH值保持在8-9,完全加入甲基丙烯酸酐,在N2气氛下在冰浴中继续反应24h,然后,用5倍冰乙醇稀释混合物以沉淀产物,离心收集的沉淀物溶解在水中,在-80℃冷冻干燥和储存后,用超纯水进一步透析5天。
(2)生物膜纳米囊泡的制备:将细胞用PBS缓冲液清洗3次, 800g离心5min,收集HEK293-ACE2和Raw264.7细胞,在低渗裂解缓冲液(Tris-HCl缓冲液)中于4℃过夜裂解细胞膜,在相同温度下,以20000g离心25min收集,离心后,收集上清液,从而再次以100000g离心35分钟,之后收集含有膜的颗粒,用补充有EDTA的水洗涤,用Bradford试剂定量膜含量,然后将膜于4℃储存,所得膜 (HEK293-ACE2和Raw264.7膜)以1:1的膜蛋白重量比混合,超声处理5分钟以允许其融合,然后,在微挤出机上通过100nm孔挤出产物。
(3)吸入式ACE2工程微流控微球的制备:吸入式ACE2工程微球的制备采用定制的微流控装置,包括内芯和外通道。具体为:将 500mg冻干HAMA完全溶解于10mL含有0.05g光引发剂的PBS 中,用作内水相,然后以5%(w/w)span80(Sigma-Aldrich)的石蜡油为连续油相,稳定剪切应力产生的微球液滴,将水相和连续油相分别以15mL/h和800mL/h的流速缓慢注入微流控装置,然后,将浸于石蜡油中的微流控微球进一步转移到10cm细胞培养盘中,并在波长为365nm的蓝光照射下交联30s,然后,将固化的水凝胶微球吸入各离心管中,用丙酮和75%乙醇反复洗涤以除去油和表面活性剂,最后,用HEK293-ACE2和Raw264.7膜包被HAMA微球,混合膜泡与 HAMA微球以2:1(w/w)的比例孵育1h,在频率为50KHz的条件下,用浴式超声仪对混合物进行超声处理5min,形成生物膜耦合的可吸入雾化微球。
实验例1
利用导入的ACE2基因载体成功构建了高表达ACE2的 HEK293-ACE2细胞。将人ACE2基因插入PCNDA3.1-3XFlag-C载体,构建ACE2-PCNDA3.1-3XFlag-C载体(图1A),导入HEK293-ACE2 细胞转染,获得ACE2高表达细胞。随后,通过免疫荧光成像和定量分析证实HEK293-ACE2细胞上ACE2的高水平表达,HEK293-ACE2 组的荧光是HEK293组的15.6倍以上(图1B和C)。
我们获得巨噬细胞定义为M(LPS+IFN),用脂多糖(LPS)和干扰素(IFN)处理Raw264.7巨噬细胞,模拟能与多种复杂免疫调节分子结合并中和的源细胞,以抑制炎症的进展。结果表明,在LPS 和INF中,STAT1+细胞数量高达80.12%,是对照组的4.1倍,实验组高于对照组(图1D)。随后,通过低渗溶解缓冲液、机械破坏以及差速离心的组合清空细胞内容物以获得这些膜。
收集细胞膜,HEK293-ACE2和M(LPS+IFN)利用HAMA微球的电负性,在多孔聚碳酸酯膜上通过纳米孔挤压形成细胞混合囊泡,然后通过静电作用吸附到微球孔上。HEK293-ACE2和M (LPS+IFN)的双层结构和蛋白质功能融合过程保留了细胞膜。此外,由于膜外表面的负电荷远大于膜内表面的负电荷,HEK293-ACE2和 M(LPS+IFN)囊泡倾向于融合到带负电荷的HAMA微球上。最后,我们成功合成了HEK293-ACE2和M(LPS+IFN)双重伪装的iAE-PMS 细胞膜。预先标记HEK293-ACE2和M(LPS+IFN)膜与各种荧光染料融合前,共焦显微镜下观察到荧光信号明显重叠,确定两种囊泡确实一起修饰了微球(图1E)。此外,Westernblotting的特征性蛋白条带显示关键的表面抗原,包括IL-1受体(IL-1R)、L-6受体(IL-6R)、 ACE2受体、TNF受体(TNFR)和Na-K-ATP酶在iAE PMS上成功富集,进一步表明HEK293-ACE2和M(LPS+IFN)的易位水凝胶微球上的细胞膜(图1G)。在表面富集ACE2后,iAE-PMS作为诱饵与假病毒和真SARS-CoV-2竞争结合,保护源细胞免受病毒感染。总之,我们为制备iAE-PMS进行了一系列的质量保证实验,以确保微球的成功合成。
结果发现,微球在PBS中的分散度在10分钟和60分钟时几乎相同,表明iAE PMS在肺中可能具有令人满意的均匀性(图1F)。而高孔隙率的结构可以提高承载能力,更多的膜可以附着到额外的空间。此外,肺气溶胶给药效率主要受空气流速和颗粒大小的影响。在高速下,大颗粒吸入颗粒物倾向于直线运动,不能沿着气流的路径运动,从而显著改变方向,使颗粒物沉积在上呼吸道的气道中。然而,由于惯性效应的影响减小,具有适当直径的颗粒沉降在主支气管和小气道水平。然而,由于布朗运动,最细的颗粒在肺的周围随机扩散。因此,我们测量了肺颗粒的直径。iAE-PMS呈球形,大小主要为10-15 μm(图1H和J)和44.36%的孔分布在直径约为2μm(图1I和K),表明iAE-PMS具有良好的分散性和雾化吸收性能。此外,我们绘制了PMS和iAE PMS在不同培养基中的降解曲线,结果表明,在第15 天,PMS和iAEPMS在RMIP1640培养基中的降解率超过65.68%,在肺泡灌洗液中的降解率超过95.12%,表明iAE PMS的降解率令人满意(图1L和M)。此外,还测定了可溶性蛋白ACE2或iAE-PMS 的稳定性,结果发现,ACE2单独或在iAE PMS中的浓度在-80℃下 5天内没有显著变化,但在37℃的环境中,iAE-PMS显著保护更多的ACE2生物活性不被降解(图1N)。
实施例2
基因工程化生物膜耦合的可吸入性雾化微球的生物相容性测试
为了评估细胞对PMS和iAE-PMS的细胞毒性和增殖,使用 CCK-8试剂和PBS作为对照。培养皿在37℃下孵育,在不同时间点 (1、3、5和7天)以1:10的体积比向培养基中添加CCK-8试剂后 4小时。随后,将混合溶液接种在新鲜的96孔板中,防止光照,并且在20分钟后通过微孔板读取器(Infinite F50,TECAN,Switzerland) 测量450nm处的吸光度。
活/死染色试验:分别与PMS和iAE-PMS共培养的肺成纤维细胞的细胞活力用活/死染色探针(Life-Tech,USA)进行定性评价。简单地将肺成纤维细胞与1.5mg/ml的PMS或IAEPMS共培养1,3、 5和7天,以完全培养基为空白组。然后用混合染色剂对细胞进行染色,钙黄绿素乙酰氧基甲酯(calcein-AM)和同二聚体乙醚(EthD-1) 37℃共孵育15天,最后用Leica倒置荧光显微镜观察细胞形态。在7 天的培养过程中,观察到少量死亡细胞,细胞密度逐渐增加,而三组的细胞存活率均保持在90%以上,这证实了iAE-PMS对肺成纤维细胞无害(图2A和B)。此外,CCK-8检测结果显示,iAE-PMS组的吸光度从第1天的0.36g/L增加到第7天的1.48g/L,各时间点对细胞增殖活性和细胞活力均无影响,各实验组间差异无统计学意义(图 2C)。所有这些结果证明了iAE-PMS对肺成纤维细胞具有良好的生物相容性。
实施例3
基因工程化生物膜耦合的可吸入性雾化微球抗新冠假病毒感染实验
HEK293-ACE2细胞预先接种,在感染前,将SARS-CoV-2假病毒分别与PMS、HEK293-ACE2囊泡、M1囊泡和iAE-PMS培养基在 37℃持续混合1小时。对照组只加入假病毒。孵育12h后,用荧光显微镜观察荧光图像,流式细胞仪进一步分析(图3)。
从图3可以看出,HEK293-ACE2囊泡和iAE-PMS对SARA-Cov-2 感染的保护率分别提高了85.56%和88.13%,分别是对照组的9.52倍和9.81倍。而PMS组和M1囊泡组未感染细胞仅占15.00%。这表明在其表面显示高水平ACE2的iAE-PMS竞争性地劫持病毒感染。进一步的流式分析表明,iAE-PMS显著降低了SARS-Cov-2病毒的感染率,从91.33%降至9.28%。
实施例4
基因工程化生物膜耦合的可吸入性雾化微球缓解肺部炎症实验
我们提取支气管肺泡灌洗液(BALF)用于流式细胞术分类(图 4A)。为了表征上述炎性细胞因子在BALF中的浸润,研究了浸润的炎性细胞类型和BALF内的分布(图4B)。值得注意的是,与对照组相比,iAE PMS组BALF中所有CD45+、CD4+、CD8+、CD11c+、 CD19+、F4/80+、Ly6G+和CD56+细胞在24小时的浸润分别减少了 50%、60%、30%、17%、40%、50%、60%和20%(图4C)。在ALI 后72小时,这一比率分别为57%、60%、36%、27%、46%、61%、 40%和18%。淋巴细胞计数恢复到正常水平表明iAE-PMS在抑制细胞因子风暴和使肺免疫微环境正常化方面的益处。同样,淋巴细胞计数的恢复也是COVID-19患者临床改善的有力指标,用于预测疾病的状态和这些患者的生存。接下来,利用免疫荧光在组织学上表示肺活检中的这种浸润,证实用iAE PMS治疗时炎症浸润的广泛缓解(图 5A)。在高倍视野下,观察到iAE-PMS组CD3+、CD8+和Ly6G+细胞计数显著下降(图5B和5C)。这些结果进一步证实了iAE-PMS能减轻以中性粒细胞和细胞毒性T细胞为主的肺损伤。此外,虽然我们没有阻断ALI的某些炎症途径,但利用细胞膜进行综合性抗炎治疗是可行的。
实施例5
为了总结iAE-PMS的时间动力学,测量了不同时间点的肺湿/干重比。iAE-PMS组呈现更平坦的多段线,表明iAE-PMS极大地抑制了ALI中的水肿、炎性浸润和显著的蛋白渗出,这与ALI相对分数降低一致(图5D和5E)。之后,在记录存活率曲线的ALI小鼠队列中,对iAE-PMS的作用进行量化。正如预期的那样,iAE-PMS使对照组的存活率从20%提高到50%(图5F)。上述数据表明,iAE-PMS 可以大大减缓ALI炎症症状的进展,但不能逆转。iAE-PMS联合其他治疗可能取得较好的疗效,有待进一步研究。此外,利用脂质样结构,可以通过脂质插入或膜杂交将更多功能性配体引入iAE-PMS系统,从而发挥更好的治疗作用,甚至逆转ALI进展。
Claims (10)
1.一种基于生物膜耦合的可吸入雾化微球,其特征在于,所述可吸入雾化微球包括生物膜、生物膜耦合器和雾化微球,所述生物膜通过生物膜耦合器与雾化微球固定连接;其中,所述生物膜耦合器通过静电吸附作用或脂质层粘附作用与所述生物膜耦合,所述生物膜为细胞膜或细胞器膜,所述雾化微球由甲基丙烯酸化明胶或甲基丙烯酸化透明质酸交联而成。
2.根据权利要求1所述的基于生物膜耦合的可吸入雾化微球,其特征在于,所述生物膜耦合器为透明质酸微球形成的负电层,其通过静电吸附作用与带有正电荷的生物膜相耦合;或,所述生物膜耦合器为透明质酸或明胶与R1-PEG-R2反应得到的产物,其通过脂质层粘附作用与生物膜相耦合,其中,所述R1为二棕榈酰、二肉豆蔻酰、二油酰磷脂酰、二硬脂酰基团中的至少一种,所述R2为氨基、羧基、叠氮或巯基,所述PEG的分子量为2000-5000。
3.根据权利要求1所述的基于生物膜耦合的可吸入雾化微球,其特征在于,所述细胞器膜包括内质网膜、高尔基体膜或细胞质膜,所述细胞膜来源于巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞或红细胞。
4.根据权利要求1所述的基于生物膜耦合的可吸入雾化微球,其特征在于,所述可吸入雾化微球的直径为5-200μm,内部孔径为2-50μm。
5.根据权利要求1所述的基于生物膜耦合的可吸入雾化微球,其特征在于,所述生物膜为基因工程改造的ACE2蛋白高表达生物膜,所述基因工程改造是通过将人ACE2基因插入pcDNA3.1-3xFlag-C质粒载体,构建得到ACE2-pcDNA3.1-3xFlag-C载体。
6.根据权利要求5所述的基于生物膜耦合的可吸入雾化微球,其特征在于,所述ACE2-pcDNA3.1-3xFlag-C载体的具体构建方法为:
A1:用50μL Opti-MEM培养基稀释0.8μg质粒DNA,混匀后室温下静置5min;
A2:使用前混匀Lipofectamine TM 2000转染试剂,取2.0μL转染试剂用50μL Opti-MEM培养基稀释,混匀后室温下静置5min;
A3:混合转染试剂和质粒DNA的稀释液,混匀后室温下静置20min,将转染复合物按100μL/孔加入到24孔细胞板中,并前后轻轻摇动细胞板使混合液与孔中的培养液混匀,将细胞板置于37℃、5v/v%CO2的培养箱中培养6h;
A4:进行换液,换成含10%血清的普通培养基,在37℃、5v/v%CO2孵育箱中继续培养24h,即得。
7.一种如权利要求1-6任一项所述基于生物膜耦合的可吸入雾化微球的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)透明质酸甲基丙烯酸酯的合成:以透明质酸和甲基丙烯酸酐为原料,通过酯化反应合成透明质酸甲基丙烯酸酯;
(2)生物膜纳米囊泡的制备:将细胞用PBS缓冲液清洗,800g离心5min,收集HEK293-ACE2和Raw264.7细胞,在细胞裂解液中于4℃过夜裂解细胞膜,然后在4℃下以20000g离心25min,收集上清液,再以100000g离心35min,收集含有膜的颗粒,用含有EDTA的水洗涤,用Bradford试剂定量膜含量,将所得的HEK293-ACE2膜和Raw264.7膜以膜蛋白重量比1:1混合,超声融合,然后在微挤出机上挤出产物;
(3)吸入式ACE2工程微流控微球的制备:采用微流控装置制备吸入式ACE2工程微球,将500mg冻干的透明质酸甲基丙烯酸酯溶解于10mL含有0.05g光引发剂的PBS缓冲液中作为内水相,然后以含5w/w%司盘80的石蜡油作为连续油相,将水相和连续油相分别以15mL/h和800mL/h的流速注入微流控装置,得到微流控微球,将微流控微球转移到细胞培养盘中,在波长为365nm的蓝光照射下交联30s,得到固化的水凝胶微球,用HEK293-ACE2和Raw264.7膜包被水凝胶微球,将混合膜泡与水凝胶微球以质量比2:1~3:1孵育1h,对混合物进行超声处理,形成生物膜耦合的可吸入雾化微球。
8.根据权利要求7所述的制备方法,其特征在于,步骤(1)中所述透明质酸甲基丙烯酸酯的具体制备方法按照如下步骤:
将1g透明质酸加入含有30mL DMF的磷酸盐缓冲液中,60℃下溶解过夜,然后在连续搅拌下缓慢滴加8mL甲基丙烯酸酐和适量NaOH溶液,使pH值保持在8-9,然后加入甲基丙烯酸酐,在N2气氛下于冰浴中继续反应24h,用5倍冰乙醇稀释反应后的混合物,离心收集沉淀物后将其溶解在水中,冷冻干燥储存,超纯水透析5天。
9.根据权利要求7所述的制备方法,其特征在于,所述细胞裂解液为低渗Tris-HCl缓冲液。
10.一种如权利要求1-6任一项所述基于生物膜耦合的可吸入雾化微球或如权利要求7-9任一项所述方法制备得到的基于生物膜耦合的可吸入雾化微球的应用,其特征在于,是将该可吸入雾化微球用于制备由新冠病毒或SARS病毒引起的肺炎疾病治疗方面的药物。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202110678021.9A CN113398283B (zh) | 2021-06-18 | 2021-06-18 | 一种基于生物膜耦合的可吸入雾化微球及制备方法与应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202110678021.9A CN113398283B (zh) | 2021-06-18 | 2021-06-18 | 一种基于生物膜耦合的可吸入雾化微球及制备方法与应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN113398283A true CN113398283A (zh) | 2021-09-17 |
CN113398283B CN113398283B (zh) | 2022-12-27 |
Family
ID=77681441
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202110678021.9A Active CN113398283B (zh) | 2021-06-18 | 2021-06-18 | 一种基于生物膜耦合的可吸入雾化微球及制备方法与应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN113398283B (zh) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN113995891A (zh) * | 2021-10-12 | 2022-02-01 | 重庆医科大学附属第一医院 | 一种自更新水合润滑载药水凝胶微球及其制备方法与应用 |
CN115227683A (zh) * | 2022-08-01 | 2022-10-25 | 重庆大学 | 一种用于肺部疾病治疗的吸入式复合微球及其制备方法 |
CN116270525A (zh) * | 2023-02-22 | 2023-06-23 | 南京华盖制药有限公司 | 一种用于治疗肺部细菌感染性肺炎的可吸入仿生纳米材料及其制备方法和应用 |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20040258753A1 (en) * | 2001-12-21 | 2004-12-23 | Jo Demeester | Pulsed bio-agent delivery systems based on degradable polymer solutions or hydrogels |
US20090269396A1 (en) * | 2006-10-24 | 2009-10-29 | Aradigm Corporation | Dual action, inhaled formulations providing both an immediate and sustained release profile |
US20150250891A1 (en) * | 2012-09-06 | 2015-09-10 | Nanyang Technological University | Hyaluronic acid-based drug delivery systems |
CN112430581A (zh) * | 2020-11-09 | 2021-03-02 | 苏州大学 | 一种表达ace2蛋白的外泌体的制备方法及应用 |
CN112646781A (zh) * | 2020-12-25 | 2021-04-13 | 广东省人民医院 | 一种包含人ace2蛋白的外泌体及其应用 |
-
2021
- 2021-06-18 CN CN202110678021.9A patent/CN113398283B/zh active Active
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20040258753A1 (en) * | 2001-12-21 | 2004-12-23 | Jo Demeester | Pulsed bio-agent delivery systems based on degradable polymer solutions or hydrogels |
US20090269396A1 (en) * | 2006-10-24 | 2009-10-29 | Aradigm Corporation | Dual action, inhaled formulations providing both an immediate and sustained release profile |
US20150250891A1 (en) * | 2012-09-06 | 2015-09-10 | Nanyang Technological University | Hyaluronic acid-based drug delivery systems |
CN112430581A (zh) * | 2020-11-09 | 2021-03-02 | 苏州大学 | 一种表达ace2蛋白的外泌体的制备方法及应用 |
CN112646781A (zh) * | 2020-12-25 | 2021-04-13 | 广东省人民医院 | 一种包含人ace2蛋白的外泌体及其应用 |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
LANG RAO等: "Decoy nanoparticles protect against COVID-19 by concurrently adsorbing viruses and inflammatory cytokines", 《PNAS》 * |
QIANGZHE ZHANG等: "Cellular Nanosponges Inhibit SARS-CoV-2 Infectivity", 《NANO LETT.》 * |
ZHIYUANFAN等: "A new class of biological materials: Cell membrane-derived hydrogel scaffolds", 《BIOMATERIALS》 * |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN113995891A (zh) * | 2021-10-12 | 2022-02-01 | 重庆医科大学附属第一医院 | 一种自更新水合润滑载药水凝胶微球及其制备方法与应用 |
CN113995891B (zh) * | 2021-10-12 | 2023-11-24 | 重庆医科大学附属第一医院 | 一种自更新水合润滑载药水凝胶微球及其制备方法与应用 |
CN115227683A (zh) * | 2022-08-01 | 2022-10-25 | 重庆大学 | 一种用于肺部疾病治疗的吸入式复合微球及其制备方法 |
CN115227683B (zh) * | 2022-08-01 | 2023-12-19 | 重庆大学 | 一种用于肺部疾病治疗的吸入式复合微球及其制备方法 |
CN116270525A (zh) * | 2023-02-22 | 2023-06-23 | 南京华盖制药有限公司 | 一种用于治疗肺部细菌感染性肺炎的可吸入仿生纳米材料及其制备方法和应用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN113398283B (zh) | 2022-12-27 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN113398283B (zh) | 一种基于生物膜耦合的可吸入雾化微球及制备方法与应用 | |
Pitchaimani et al. | Natural killer cell membrane infused biomimetic liposomes for targeted tumor therapy | |
Lee et al. | Thiolated chitosan nanoparticles enhance anti-inflammatory effects of intranasally delivered theophylline | |
Foster et al. | Microparticulate uptake mechanisms of in‐vitro cell culture models of the respiratory epithelium | |
WO2021174738A1 (zh) | 表面pd-l1分子过表达的间充质干细胞膜包被的仿生纳米颗粒及其制备和应用 | |
Chen et al. | Nanotraps for the containment and clearance of SARS-CoV-2 | |
Cronin et al. | Nanomaterials and innate immunity: a perspective of the current status in nanosafety | |
Merkel et al. | Pulmonary gene delivery using polymeric nonviral vectors | |
JP7480143B2 (ja) | 吸入用細胞外小胞 | |
Shen et al. | Distribution and cellular uptake of PEGylated polymeric particles in the lung towards cell-specific targeted delivery | |
Machhi et al. | A role for extracellular vesicles in SARS-CoV-2 therapeutics and prevention | |
Kan et al. | Airway epithelial-targeted nanoparticles for asthma therapy | |
Petrizzo et al. | Functional characterization of biodegradable nanoparticles as antigen delivery system | |
CN113197880B (zh) | 一种巨噬细胞外泌体膜包被仿生纳米颗粒及其制备方法和应用 | |
KR20200030084A (ko) | 씨디39 기질 줄기세포 단리 방법 및 용도 | |
Spindler et al. | Nano-in-micro-particles consisting of PLGA nanoparticles embedded in chitosan microparticles via spray-drying enhances their uptake in the olfactory mucosa | |
Liu et al. | The impact of arginine-modified chitosan–DNA nanoparticles on the function of macrophages | |
Carlson et al. | Interleukin‐10 and Transforming Growth Factor‐β Cytokines Decrease Immune Activation During Normothermic Ex Vivo Machine Perfusion of the Rat Liver | |
Liu et al. | Chrysanthemum sporopollenin: A novel vaccine delivery system for nasal mucosal immunity | |
JP2017516834A (ja) | 免疫療法のための抗原負荷キトサンナノ粒子 | |
WO2021169149A1 (en) | Catalase nanoparticles and methods for use | |
WO2023036345A1 (zh) | 一种雾化吸入的载药纳米颗粒以及用于治疗肺纤维化的siRNA序列组及其设计方法 | |
Li et al. | Advanced Generation Therapeutics: Biomimetic Nanodelivery System for Tumor Immunotherapy | |
Areny-Balagueró et al. | Bioengineered extracellular vesicles: future of precision medicine for sepsis | |
RU2799315C2 (ru) | Внеклеточные везикулы для ингаляции |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |