CN115227683A - 一种用于肺部疾病治疗的吸入式复合微球及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于肺部疾病治疗的吸入式复合微球及其制备方法，首先是以树枝状大分子聚酰胺‑胺包封小分子化学药物，构建小尺寸纳米小球PM；随后将纳米小球PM进一步封装至透明质酸纳米颗粒中制备粒径可变纳米药物载体HPM；最后，通过乳化交联法将HPM纳米颗粒包封至明胶基质中构建最终的吸入式复合微球GHPM。本发明制备得到的吸入式复合微球可以通过两次粒径变化提高肺部递送效率和肿瘤组织深层穿透能力。

Description

一种用于肺部疾病治疗的吸入式复合微球及其制备方法
技术领域
本发明属于复合微球技术领域，具体涉及到一种用于肺部疾病治疗的吸入式复合微球及其制备方法。
背景技术
纳米药物在肺部疾病治疗中具有巨大的潜力，包括白蛋白紫杉醇、阿霉素脂质体、阿米卡星脂质体等多种纳米药物均已获批用于肺部疾病的临床治疗，并在使用中表现出了优异的疗效。然而，肺部递送效率低下和对病灶组织深层穿透能力不足的问题始终困扰着用于肺部疾病治疗的纳米药物的进一步应用与发展。
由于体循环的限制，通过口服或静脉注射等常规给药手段给予人体的药物很难在肺部实现有效富集，这也就导致了其对肺部疾病疗效不佳的问题。而若是通过吸入疗法治疗肺部疾病则能有效解决这样的问题，作为一种针对肺部的局部靶向给药方式，吸入疗法具有药物生物利用度高、起效快、毒副作用低等多种优势，因而更适于对肺部疾病的治疗。尤其是新兴的干粉吸入制剂，具有使用方便、给药效率高以及药物稳定性好等多种优异性质。然而，粒径小于1μm的纳米颗粒由于质量过小，通过干粉吸入的方式给药时很容易在人体呼气时被再次呼出，因此其肺部递送效率很差。
纳米粒-载体复合物吸入微球能够有效解决纳米药物肺部递送效率低下的问题，复合微球在给药因为具有适宜的粒径而能够有效沉积在肺深处，而在到达呼吸道深层后由于微粒结构被破坏，纳米颗粒随之被释放并进入病灶中发挥药效。这样一种纳米粒-载体复合物吸入微球的设计不仅可以有效提高药物的肺部递送效率，还可以最大程度上保留纳米颗粒本身的优异性质，两者叠加之下可以有效提高药物的抗肿瘤疗效。
与人体正常组织相比，病灶组织具有一些十分特殊的结构特征和微环境。这些特殊环境条件会对纳米药物在体内的命运产生很多特殊的影响，尤其是会限制纳米药物在病灶组织的深处渗透。使得具有较大粒径的常规纳米药物进入人体后仅能停留在病灶组织浅表，而难以穿透至病灶组织深层核心部位，最终导致难以实现预期的治疗效果。与之相比，粒径小于30-50nm的小尺寸纳米药物能够实现对病灶组织的更强渗透，然而它们也存在在体内保留能力较差的问题。为了解决这种问题，具有可变粒径的纳米药物递送系统研究应运而生。简而言之，粒径可变纳米药物递送系统可以在进入体内后在适当时机实现由大变小或由小变大的粒径变化，从而赋予纳米递药系统能够同时实现在病灶部位高保留和高渗透的能力。
因此，开发具有两级粒径可变性质的可变纳米药物-载体复合物吸入微球对于解决常规纳米药物肺部递送效率低下和病灶组织深层穿透能力不足的问题具有十分积极的意义，能够有效提高药物治疗效果。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于肺部疾病治疗的吸入式复合微球及其制备方法，该微球包含药物载体及用于肺部疾病治疗的小分子化学药物，药物载体是一种具有肺部病灶组织组织程序响应性的两级粒径可变药物递送系统，通过药物递送系统的两次粒径变化可以克服肺部递送效率低下和肿瘤组织深层穿透能力不足的问题。该吸入式复合微球通过两级程序响应性的粒径变化进行肺部药物吸入药物递送，微球级颗粒吸入后更易沉积于肺部，而后转变为纳米级进入肿瘤组织滞留，再转变为更小纳米级颗粒深入肿瘤组织内部，有效提高药物生物利用度，发挥药物长效治疗作用。
为达上述目的，本发明提供了一种用于肺部疾病治疗的吸入式复合微球的制备方法，包括以下步骤：
(1)PM纳米球的制备
将PAMAM与小分子化学药物共溶后搅拌并离心，将上清液纯化后，制得PM纳米球；
(2)纳米药物载体的制备
将PM纳米球与透明质酸共溶后，依次加入有机溶剂、交联剂和有机溶剂进行反应，反应结束后离心、洗涤和冻干，制得纳米药物载体；
(3)吸入式复合微球的制备
将纳米药物载体与明胶共溶于热水中，加入油相进行反应，将反应后的混合物冷却后，加入交联剂和有机溶剂，离心、洗涤并冻干后制得吸入式复合微球。
肺部递送效率低下和肿瘤组织深层穿透能力不足是用于治疗肺癌的吸入型纳米药物难以发挥理想药效的两个重要原因。本发明提供了一种基于“特洛伊木马”策略的肺部吸入型程序响应性二级粒径可变药物递送系统，通过药物递送系统的两次粒径变化依次克服这两个难题。第一级粒径可变药物递送系统由肿瘤组织特异性响应型纳米载体透明质酸封装小粒径的PM纳米粒(5nm)所构成HPM，通过HPM向PM的粒径变化解决纳米药物肿瘤组织深层穿透能力不足的问题。HPM本身具有较大的粒径，虽然不能实现对肿瘤组织深层的直接穿透，但是却可以通过EPR效应在肿瘤部位实现较长时间的滞留。另一方面，HPM会在肿瘤组织过表达的透明质酸酶(HAase)作用下被逐渐降解，进而释放出所封装的PM纳米小球，具有正电性的小尺寸PM小球则可以迅速的穿透至肿瘤组织深处，从而有效提高药物的肿瘤组织深层穿透能力。第二级粒径可变药物递送系统是将HPM封装至明胶基质载体制备的纳米粒-载体复合物吸入微球(GHPM)，通过GHPM向HPM的又一次粒径变化解决纳米药物肺部递送效率低下的问题。
本发明提供的用于肺部疾病治疗的吸入式复合微球相比于其他肺部吸入制剂，干粉吸入剂具有吸入效率高、使用简单、环境友好及制剂稳定性好等多种优点，在治疗肺部疾病方面更具优势。然而HPM的粒径过小，如果直接通过干粉吸入的方式递送难以在肺部实现有效的沉积，大多数会在进入呼吸道后被再次呼出体外，因此将HPM封装至明胶基质制备更适于肺部吸入的复合物吸入微球。GHPM具约4μm的适宜粒径，通过干粉吸入的方式给药时可以实现优异的肺部沉积效果。进入肺部后，在体内较高温度和肺癌患者肺部过表达的明胶酶共同作用下，低交联度的明胶微球基质可以被迅速降解，微球内部的HPM纳米颗粒随之被释放，从而实现HPM的高效肺部递送。
进一步地，小分子化学药物为甲氨蝶呤、氨基喋呤、伊达曲沙、三甲曲沙、洛美曲索、伊马替尼、舒尼替尼、吉非替尼、埃克替尼、厄洛替尼、奥希替尼、阿法替尼、瑞戈非尼、曲贝替定、阿来替尼、克唑替尼、布格替尼、塞瑞替尼、达拉非尼、曲美替尼、尼莫司汀、环磷酰胺、去氧氟鸟苷、氟尿嘧啶、氟鸟甙、多柔比星、丝裂霉素、吡柔比星、伊立替康、紫杉醇、替硝唑、阿他美坦、来曲唑或他莫昔芬。
进一步地，PAMAM与小分子化学药物的质量比为2～3:4～5，步骤(1)搅拌的速度为900～1200rpm，搅拌的时间为2～4h；步骤(1)离心的转速为14500～15500rpm，离心的时间为12～18min。
进一步地，PM纳米球与透明质酸的质量比为10～20:25，PM纳米球与透明质酸共溶于纯化水中，透明质酸的分子量为10～600kDa，优选为600kDa。
进一步地，步骤(2)中的有机溶剂为丙酮，交联剂由1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和己二酸二酰肼按照质量比2:1混合制得，纯化水、有机溶剂和交联剂水溶液的体积比为10:32～34:0.25。
进一步地，步骤(2)中的反应在转速为300～900rpm的条件下进行，优选为600rpm，步骤(3)中的反应在转速为600～1000rpm的条件下进行，优选为800rpm。
进一步地，步骤(3)中纳米药物载体与明胶的质量比为1:3～10，优选为1：5，明胶的冻力为100～300Bloom，优选为300Bloom。
进一步地，步骤(3)中的油相由体积比45～55:1的液体石蜡和司盘80混合制得，交联剂为体积分数为45～55％的戊二醛水溶剂，有机溶剂为丙酮。
进一步地，步骤(3)中热水的温度为45～55℃，油相、交联剂、丙酮的比例关系为50～52:0.02:95～105，油相与明胶的比例关系为50～52mL:200mg。
本发明还提供了一种采用上述用于肺部疾病治疗的吸入式复合微球的制备方法制备得到的用于肺部疾病治疗的吸入式复合微球。
综上所述，作为一种程序响应性的二级粒径可变肺部抗癌药物递送系统，本发明提供的用于肺部疾病治疗的吸入式复合微球GHPM具有以下优点：
1)通过肺部干粉吸入的方式给药，使用便捷、给药效率高且药物能够直达肺部病灶，有利于药物在肺部肿瘤组织的高效积累并减轻抗癌药物固有的毒副作用；
2)通过GHPM复合物微球进行肺部吸入给药，有效提高药物沉积率，而由GHPM复合物微球向HPM纳米颗粒的粒径变化可以有效避免体内粘液纤毛清除和巨噬细胞吞噬，有利于提高药物生物利用度；
3)HPM可以在肿瘤组织实现较长时间的保留，有助于药物发挥长效的治疗作用；
4)通过透明质酸封装正电性的PM，隔绝PM在到达肿瘤部位前与外部环境的直接接触，可以有效提高PM的循环稳定性，避免其在循环过程中被迅速清除；
5)HPM是一种尺寸缩小型纳米药物载体，在肿瘤部位可以响应于透明质酸酶而释放出所包封的PM小球，荷正电的小尺寸PM小球可以高效的渗透至肿瘤组织深处，实现对深层肿瘤细胞的杀伤，从而显著增强小分子化学药物的抗肿瘤效果。
附图说明
图1为PM纳米小球的粒径分布和透射电镜图；
图2为HPM纳米颗粒的粒径分布和透射电镜图；
图3为吸入复合微球GHPM的扫描电镜图；
图4为PM纳米小球、HPM纳米颗粒、GHPM复合微球的释放曲线；
图5为HPM纳米颗粒提高药物对肿瘤病灶组织穿透能力的效果；
图6为GHPM复合微球提高药物肺部沉积能力的效果；
图7为吸入复合微球GHPM增强药物对肺部疾病治疗的效果。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
本实施例提供了一种用于肺部疾病治疗的吸入式复合微球GHPM的制备方法，包括以下步骤：
S1制备PM纳米小球
在5mL纯化水中分别加入15mg PAMAM(G4)和25mg甲氨蝶呤(Methotrexate，MTX)，加入磁子以1000rpm搅拌3h；再以15000rpm离心15min后将上清液继续用透析袋透析2h以除去未包封的MTX(MWCO＝2000Da)。样品预冻后在冻干机中冻干24h得到PM纳米小球。
S2制备HPM纳米颗粒
精密量取10mL纯化水置于100mL圆底烧瓶中，搅拌下加入25mg HA(600kDa)和10mg步骤S1制备的PM纳米小球，随后加入17mL丙酮并持续搅拌(600rpm)使HA充分溶解。15min后将溶解有10mg EDCI(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和5mg ADH(己二酸二酰肼)的250μL水溶液加入到体系中。30min后，再加入16.5mL丙酮并继续搅拌3h。最后以15000rpm离心10min分离制备得到的HPM纳米颗粒，并用纯化水洗涤三次，再于-80℃预冻后使用冷冻干燥机将样品冻干备用。
S3制备吸入式复合微球GHPM
以量筒量取50mL液体石蜡和1mL司盘80加入到500mL圆底烧瓶中作为油相，烧瓶置于油浴中以45℃预热1h，同时保持持续搅拌(搅拌速度为800rpm)。随后称取200mg明胶(300Bloom)与40mgHPM置于4mL纯化水中，50℃条件下持续搅拌(搅拌速度为800rpm)15min使明胶充分溶解得到水相。将明胶溶液缓慢滴加到持续搅拌的油相中，然后在45℃下继续搅拌15min。将混合物在冰水浴中冷却30min并连续搅拌(搅拌速度为800rpm)使反应体系降温，随后加入20μL 50％戊二醛水溶液以交联微球。2h后将100mL预冷的丙酮加入到混合物中沉淀形成的明胶微球。将体系转移至50mL离心管中以6000rpm的速度离心收集微球，之后先以预冷的丙酮洗涤三次除去微球表面的石蜡油和表面活性剂，再以异丙醇洗涤三次除去微球表面的丙酮。最后以纯化水重悬后进行冷冻干燥，制得吸入式复合微球GHPM。
实施例2
本实施例提供了一种用于肺部疾病治疗的吸入式复合微球GHPM的制备方法，包括以下步骤：
S1制备PM纳米小球
在5mL纯化水中分别加入10mg PAMAM(G4)和20mg MTX，加入磁子以1000rpm搅拌3h。15000rpm离心15min后将上清液继续用透析袋透析2h以除去未包封的MTX(MWCO＝2000Da)。样品预冻后在冻干机中冻干24h得到PM纳米小球。
S2制备HPM纳米颗粒
精密量取10mL纯化水置于100mL圆底烧瓶中，搅拌下加入25mg HA(600kDa)和10mgPM纳米小球，随后加入17mL丙酮并持续搅拌(600rpm)使HA充分溶解。15min后将溶解有10mgEDCI和5mg ADH的250μL水溶液加入到体系中。30min后，再加入16.5mL丙酮并继续搅拌3h。最后以15000rpm离心10min分离制备得到的HPM纳米颗粒，并用纯化水洗涤三次。于-80℃预冻后使用冷冻干燥机将样品冻干备用。
S3制备吸入式复合微球GHPM
以量筒量取50mL液体石蜡和1mL司盘80加入到500mL圆底烧瓶中作为油相，烧瓶置于油浴中以45℃预热1h，同时保持持续搅拌(搅拌速度为800rpm)。随后称取200mg明胶(300Bloom)与40mgHPM置于4mL纯化水中，50℃条件下持续搅拌(搅拌速度为800rpm)15min使明胶充分溶解得到水相。将明胶溶液缓慢滴加到持续搅拌的油相中，然后在45℃下继续搅拌(搅拌速度为800rpm)15min。将混合物在冰水浴中冷却30min并连续搅拌使反应体系降温，随后加入20μL 50％戊二醛水溶液以交联微球。2h后将100mL预冷的丙酮加入到混合物中沉淀形成的明胶微球。将体系转移至50mL离心管中以6000rpm的速度离心收集微球，之后先以预冷的丙酮洗涤三次除去微球表面的石蜡油和表面活性剂，再以异丙醇洗涤三次除去微球表面的丙酮。最后以纯化水重悬后进行冷冻干燥，制得吸入式复合微球GHPM。
实施例3
本实施例提供了一种用于肺部疾病治疗的吸入式复合微球GHPM的制备方法，包括以下步骤：
S1制备PM纳米小球
在5mL纯化水中分别加入15mg PAMAM(G4)和25mg MTX，加入磁子以1000rpm搅拌3h。15000rpm离心15min后将上清液继续用透析袋透析2h以除去未包封的MTX(MWCO＝2000Da)。样品预冻后在冻干机中冻干24h得到PM纳米小球。
S2制备HPM纳米颗粒
精密量取10mL纯化水置于100mL圆底烧瓶中，搅拌下加入25mg HA(600kDa)和20mgPM，随后加入17mL丙酮并持续搅拌(600rpm)使HA充分溶解。15min后将溶解有10mg EDCI和5mg ADH的250μL水溶液加入到体系中。30min后，再加入16.5mL丙酮并继续搅拌3h。最后以15000rpm离心10min分离制备得到的HPM纳米颗粒，并用纯化水洗涤三次。于-80℃预冻后使用冷冻干燥机将样品冻干备用。
S3制备吸入式复合微球GHPM
以量筒量取50mL液体石蜡和1mL司盘80加入到500mL圆底烧瓶中作为油相，烧瓶置于油浴中以45℃预热1h，同时保持持续搅拌(搅拌速度为800rpm)。随后称取200mg明胶(300Bloom)与40mgHPM置于4mL纯化水中，50℃条件下持续搅拌(搅拌速度为800rpm)15min使明胶充分溶解得到水相。将明胶溶液缓慢滴加到持续搅拌的油相中，然后在45℃下继续搅拌(搅拌速度为800rpm)15min。将混合物在冰水浴中冷却30min并连续搅拌使反应体系降温，随后加入20μL 50％戊二醛水溶液以交联微球。2h后将100mL预冷的丙酮加入到混合物中沉淀形成的明胶微球。将体系转移至50mL离心管中以6000rpm的速度离心收集微球，之后先以预冷的丙酮洗涤三次除去微球表面的石蜡油和表面活性剂，再以异丙醇洗涤三次除去微球表面的丙酮。最后以纯化水重悬后进行冷冻干燥，制得吸入式复合微球GHPM。
实施例4
本实施例提供了一种用于肺部疾病治疗的吸入式复合微球GHPM的制备方法，包括以下步骤：
S1制备PM纳米小球
在5mL纯化水中分别加入15mg PAMAM(G4)和25mg MTX，加入磁子以1000rpm搅拌3h。15000rpm离心15min后将上清液继续用透析袋透析2h以除去未包封的MTX(MWCO＝2000Da)。样品预冻后在冻干机中冻干24h得到PM纳米小球。
S2制备HPM纳米颗粒
精密量取10mL纯化水置于100mL圆底烧瓶中，搅拌下加入25mg HA(600kDa)和20mgPM，随后加入17mL乙醇并持续搅拌(600rpm)使HA充分溶解。15min后将溶解有10mg EDCI和5mg ADH的250μL水溶液加入到体系中。30min后，再加入16.5mL乙醇并继续搅拌3h。最后以15000rpm离心10min分离制备得到的HPM纳米颗粒，并用纯化水洗涤三次。于-80℃预冻后使用冷冻干燥机将样品冻干备用。
S3制备吸入式复合微球GHPM
以量筒量取50mL液体石蜡和1mL司盘80加入到500mL圆底烧瓶中作为油相，烧瓶置于油浴中以45℃预热1h，同时保持持续搅拌(搅拌速度为800rpm)。随后称取200mg明胶(300Bloom)与40mgHPM置于4mL纯化水中，50℃条件下持续搅拌(搅拌速度为800rpm)15min使明胶充分溶解得到水相。将明胶溶液缓慢滴加到持续搅拌的油相中，然后在45℃下继续搅拌15min。将混合物在冰水浴中冷却30min并连续搅拌(搅拌速度为800rpm)使反应体系降温，随后加入20μL 50％戊二醛水溶液以交联微球。2h后将100mL预冷的丙酮加入到混合物中沉淀形成的明胶微球。将体系转移至50mL离心管中以6000rpm的速度离心收集微球，之后先以预冷的丙酮洗涤三次除去微球表面的石蜡油和表面活性剂，再以异丙醇洗涤三次除去微球表面的丙酮。最后以纯化水重悬后进行冷冻干燥，制得吸入式复合微球GHPM。
实施例5
本实施例提供了一种用于肺部疾病治疗的吸入式复合微球GHPM的制备方法，包括以下步骤：
S1制备PM纳米小球
在5mL纯化水中分别加入15mg PAMAM(G4)和25mg MTX，加入磁子以1000rpm搅拌3h。15000rpm离心15min后将上清液继续用透析袋透析2h以除去未包封的MTX(MWCO＝2000Da)。样品预冻后在冻干机中冻干24h得到PM纳米小球。
S2制备HPM纳米颗粒
精密量取10mL纯化水置于100mL圆底烧瓶中，搅拌下加入25mg HA(600kDa)和20mgPM，随后加入17mL丙酮并持续搅拌(600rpm)使HA充分溶解。15min后将溶解有10mg EDCI和5mg ADH的250μL水溶液加入到体系中。30min后，再加入16.5mL丙酮并继续搅拌3h。最后以15000rpm离心10min分离制备得到的HPM纳米颗粒，并用纯化水洗涤三次。于-80℃预冻后使用冷冻干燥机将样品冻干备用。
S3制备吸入式复合微球GHPM
以量筒量取50mL液体石蜡和1mL司盘80加入到500mL圆底烧瓶中作为油相，烧瓶置于油浴中以45℃预热1h，同时保持持续搅拌(搅拌速度为800rpm)。随后称取200mg明胶(150Bloom)与40mgHPM置于4mL纯化水中，50℃条件下持续搅拌(搅拌速度为800rpm)15min使明胶充分溶解得到水相。将明胶溶液缓慢滴加到持续搅拌的油相中，然后在45℃下继续搅拌15min。将混合物在冰水浴中冷却30min并连续搅拌(搅拌速度为800rpm)使反应体系降温，随后加入20μL 50％戊二醛水溶液以交联微球。2h后将100mL预冷的丙酮加入到混合物中沉淀形成的明胶微球。将体系转移至50mL离心管中以6000rpm的速度离心收集微球，之后先以预冷的丙酮洗涤三次除去微球表面的石蜡油和表面活性剂，再以异丙醇洗涤三次除去微球表面的丙酮。最后以纯化水重悬后进行冷冻干燥，制得吸入式复合微球GHPM。
实施例6
本实施例提供了一种用于肺部疾病治疗的吸入式复合微球GHPM的制备方法，包括以下步骤：
S1制备PM纳米小球
在5mL纯化水中分别加入15mg PAMAM(G5)和25mg MTX，加入磁子以1000rpm搅拌3h。15000rpm离心15min后将上清液继续用透析袋透析2h以除去未包封的MTX(MWCO＝2000Da)。样品预冻后在冻干机中冻干24h得到PM纳米小球。
S2制备HPM纳米颗粒
精密量取10mL纯化水置于100mL圆底烧瓶中，搅拌下加入25mg HA(600kDa)和10mgPM，随后加入17mL丙酮并持续搅拌(600rpm)使HA充分溶解。15min后将溶解有10mg EDCI和5mg ADH的250μL水溶液加入到体系中。30min后，再加入16.5mL丙酮并继续搅拌3h。最后以15000rpm离心10min分离制备得到的HPM纳米颗粒，并用纯化水洗涤三次。于-80℃预冻后使用冷冻干燥机将样品冻干备用。
S3制备吸入式复合微球GHPM
以量筒量取50mL液体石蜡和1mL司盘80加入到500mL圆底烧瓶中作为油相，烧瓶置于油浴中以45℃预热1h，同时保持持续搅拌(搅拌速度为800rpm)。随后称取200mg明胶(300Bloom)与40mgHPM置于4mL纯化水中，50℃条件下持续搅拌(搅拌速度为800rpm)15min使明胶充分溶解得到水相。将明胶溶液缓慢滴加到持续搅拌的油相中，然后在45℃下继续搅拌15min。将混合物在冰水浴中冷却30min并连续搅拌(搅拌速度为800rpm)使反应体系降温，随后加入20μL 50％戊二醛水溶液以交联微球。2h后将100mL预冷的丙酮加入到混合物中沉淀形成的明胶微球。将体系转移至50mL离心管中以6000rpm的速度离心收集微球，之后先以预冷的丙酮洗涤三次除去微球表面的石蜡油和表面活性剂，再以异丙醇洗涤三次除去微球表面的丙酮。最后以纯化水重悬后进行冷冻干燥，制得吸入式复合微球GHPM。
实施例6中的G5表示第五代PAMAM，是在实施例1中的第四代PAMAM的基础上合成。随着代数增加，单分子所占体积增加，其质量以指数形式增大。故G5比G4与药物反应后包载药物更多，但其质量与粒径也相对更大。
试验例1
如图1所示，选用大小适中的第四代PAMAM作为第一级载体包载治疗药物MTX，其较小的粒径有助于提高肿瘤组织穿透性，实现将药物递送至肿瘤组织深处的目标。采用粒度仪观察PM纳米小球，PM纳米小球的粒径表征结果如图1(a)所示，粒径为5.38±0.35nm，PDI＝0.256±0.044，分布良好。同时通过透射电子显微镜对PM的形貌进行了进一步表征，其结果如图1(b)所示。图中可以清楚的观察到大小与粒径测定结果一致的PM纳米小球，同时PM纳米小球也表现出良好的分散性。
试验例2
如图2所示，采用粒度仪观察HPM纳米颗粒，HPM的粒径分布如2(a)所示，纳米颗粒粒径为266.31±1.92nm，并显示出良好的均一度。利用透射电子显微镜对HPM进行了进一步考察，其结果如图2(b)所示，可以看到纳米颗粒呈现出均匀的球形，分散性良好，粒径大小也与粒度仪测试结果一致。
试验例3
如图3所示，通过镀金提高材料导电性后，使用扫描电子显微镜对微球的表面形貌进行了表征，结果如图3所示，复合物微球的分散性和均一性良好，使用Image J图像处理软件对微球粒径进行了计算，结果显示微球的平均粒径为3.77μm，符合肺部吸入给药对微球粒径的要求(1-5μm)。同时，微球表面光滑且分散良好，粘连情况轻微，整体表现出很好的表面形态和吸入性质。
试验例4
如表1所示，通过使用10kDa、50kDa、600kDa的HA作为原料，考察不同分子量HA对HA纳米颗粒粒径的影响；表1结果显示，随着HA分子量的增加，纳米颗粒的粒径逐渐减小，600KDa的HA制备得到的HA纳米颗粒粒径最小(75.51±0.98nm)，同时其粒径分布也最为均匀。
表1不同分子量HA对纳米颗粒粒径的影响
Molecular weight(kDa) Size(nm) PDI
10 280.78±4.14 0.202±0.008
50 243.91±18.62 0.238±0.05
600 75.51±0.98 0.154±0.02
使用丙酮、乙醇、二氯甲烷作为有机相，考察不同溶剂对HA纳米粒子粒径的影响；研究结果如表2所示。当使用DCM和乙醇作为溶剂时，纳米颗粒的粒径不仅较大，均一度也较差，相比之下，以丙酮作为溶剂制备的纳米颗粒有更合适的粒径，均一度也更好。因此，确定丙酮为制备HA纳米颗粒的有机溶剂。
表2不同有机溶剂对纳米颗粒粒径的影响
Organic solvents Size(nm) PDI
DCM 244.44±6.17 0.255±0.022
Ethanol 178.52±3.05 0.363±0.009
Acetone 75.51±0.98 0.154±0.02
在300rpm、600rpm以及900rpm搅拌速度下制备，考察不同搅拌速度对HA纳米粒子粒径的影响；表3表明当搅拌速度为300rpm的低速时，纳米颗粒的粒径过大，达到了247.9±2.54nm。同时，当搅拌速度较大时，纳米颗粒粒径也较大，均一性也明显较差。因此，选择600rpm作为后续制备载PM的HA纳米颗粒的搅拌速度。
表3不同搅拌速度对纳米颗粒粒径的影响
Stirring speed(rpm) Size(nm) PDI
300 247.9±2.54 0.154±0.004
600 75.51±0.98 0.154±0.02
900 128.74±2.71 0.311±0.007
以5:1，5:2，5：3的质量比投入HA与PM，考察投料比对HPM的影响，表4中所示，投入HA量恒定不变为25mg，随着投入PM的质量的增加，纳米颗粒的载药量逐渐增加，而药物包封率则呈现下降趋势。投入PM的质量为5mg时纳米颗粒载药量为5.01％，PM为10mg时纳米颗粒载药量为7.05％，提高了2.04％；而当投入的PM为15mg时，其载药量仅比投入10mg PM时提高了0.71％，表明投入PM的质量对纳米颗粒载药量的影响已经明显降低。同时还可以注意到，投入PM 15mg时纳米颗粒的粒径已经达到了322.51nm，而过大的纳米颗粒不利于药物的高效体内递送。因此，综合纳米颗粒粒径和载药情况的结果，确定投入PM的质量为10mg时最佳，即最佳投料比为5：2.
表4不同投药比制备的HPM的理化性质表征
Weight of PM(mg) Size(nm) PDI EE(％) DL(％)
5 188.18±1.37 0.128±0.035 67.83±2.65 5.01±0.24
10 266.31±1.92 0.133±0.001 47.15±6.96 7.05±0.66
15 322.51±4.73 0.186±0.02 39.01±4.23 7.76±0.79
使用100Bloom，250Bloom，300Bloom的明胶作为原料，考察明胶胶强度对GHPM复合微球形状大小的影响；以100Bloom胶冻强度的明胶为原料制备得到的微球粒径过大(超过15μm)，而粒径大于5μm的微粒因易沉积在口咽处而不适于用作肺部干粉吸入给药。以250Bloom和300Bloom两种具有较高胶冻强度明胶原料生产的微球粒径相似，平均粒径均处在1-5μm之间，符合肺部干粉吸入给药的要求。两者相比，由250Bloom明胶制备的微球出现了较强的粘连情况，微球形态和均一性也较差，因此选择300Bloom的高凝胶强度明胶作为后续实验的原料。
使用Span-80和Tween-20作为乳化剂制备明胶微球，考察不同乳化剂对GHPM复合微球形状大小的影响；以Tween-20作为表面活性剂制备得到的明胶微球粒径明显更大，已经超出了肺部干粉吸入给药的要求。经分析，这是因为Tween-20的亲水性较强，其HLB(亲水亲油平衡值)为16.7，更适用于O/W型乳液的制备，在W/O型乳液中，Tween-20难以有效降低水油界面张力及液滴之间的聚结，乳液体系不稳定，因而导致最终形成的明胶微球粒径较大且易于粘结。而Span-80的HLB值为4.3，亲油性更强，能够更好的吸附在分散相小液体上帮助形成稳定的乳状液，从而降低微球的粒径，更符合W/O型乳液制备的需求。因此，选用Span-80继续进行后续实验。
在600rpm，800rpm，1000rpm的搅拌速度下制备不同明胶微球，考察不同搅拌速度对明胶微球的影响；在搅拌速度由600rpm增加至1000rpm的过程中，微球粒径呈现出先减小后增大的变化情况，在800rpm时的微球粒径最小。分析其原因，可能是搅拌速度的增加会增大对水相的剪切力，从而形成更小的小液滴，同时较大的搅拌速度可以减少小液滴之间在速度较慢时易于发生的碰撞，从而使微球粒径减小；而当搅拌速度过大时，形成的乳液稳定性较差，液滴容易发生破裂导致相互聚结，从而使明胶微球粒径变大，同时也导致其均一性较差，因此采用800rpm作为最佳搅拌转速。
以10:1，5:1，3:1的质量比投入明胶与HPM，考察投料比对微球的影响。结果显示随着投入的HPM质量的增加，微球粒径呈现出逐渐增加的趋势，明胶与HPM的质量比为3:1时制备得到的明胶微球粒径已经超出了肺部干粉吸入给药的要求。分析其原因，可能是药物的增加使乳化液中的液滴尺寸增加，最终造成了明胶微球的粒径增加。进一步研究了10:1和5:1两种不同投料比获得的微球的载药量：当明胶与HPM的质量比为10:1时明胶微球的载药量为0.63％；；当质量比增加至5:1时，载药量得到明显提高，达到1.06％。综合考虑粒径和载药量的因素，选择最佳的投料质量比为5:1。
通过以上最优策略实验，最终得到表5所示，最优的药物粒径。
表5PM纳米小球、HPM纳米颗粒、GHPM复合微球的粒径
PM HPM GHPM
Size 5.38±0.35nm 266.31±1.92nm 3.77±1.05μm
试验例5
如图4所示，研究了PM纳米小球、HPM纳米颗粒、GHPM复合微球在有无酶情况下的体外模拟环境下的释放行为。
将PM包封于HA纳米颗粒后，其48h内的累计释放率仅为49.1％，远远低于其自身98.4％的药物释放率。而在有HAase的条件下，HPM的在48h内的累计释放率得到了很大提升，达到85％。而HAase的存在还显著提高了HPM的药物释放速度，8h内的药物累计释放率即达到77.3％，是无HAase时(41.3％)的近两倍。由此表明HAase对HA纳米颗粒基质的降解能够显著改善HPM的药物释放行为，使更多的药物被释放出来，进而达到提高治疗药效的目标。通过明胶包封HPM得到GHPM，其无Enzyme情况下48h释药率仅10％左右，存在Enzyme的情况下释药率可达到66％。图4有效说明了所制备的两级粒径可变微球可以在生理条件下释放药物，达到治疗作用。
试验例6
如图5所示，为了验证HPM载体体系能否有效提高药物的肿瘤组织深层穿透能力，以与体内肿瘤性质更相近的3D肿瘤细胞球体进行了PF和HPF的A549肿瘤球体深层穿透实验。实现建立体外3D肿瘤球体模型，以新鲜的DMEM培养基溶解琼脂粉，配制成浓度为2％的琼脂溶液，并通过高压灭菌锅在121℃下对琼脂溶液进行高压灭菌。将琼脂溶液从高压灭菌锅中取出后，趁热将琼脂溶液铺在24孔细胞培养板中，注意使琼脂均匀平铺在孔中，静置备用。待培养的A549细胞生长至对数生长期后，以胰酶将其消化并充分重悬，适当稀释后以移液枪吸取20μL细胞悬液(2×103个细胞)滴于24孔板盖板下。首先将滴有悬滴的孔板置于培养箱中培养48h使细胞球体初步形成，之后将细胞悬滴转移至铺有琼脂的孔中并添加新鲜的DMEM完全培养基继续培养7d，期间以显微镜进行监测。然后进行穿透效果检测，待培养的3D肿瘤球体生长至合适大小后(约300μm)将肿瘤球体转移至新的12孔板中进行肿瘤球体深层穿透实验。向各孔中分别加入1mL含有PF、HPF以及HPF+HAase的新鲜DMEM培养基(FITC：2μg mL-1，HAase：200U mL-1)，随后置于37℃下避光孵育4h。将肿瘤球体自孔板中吸出，并以PBS洗涤三次以充分取出未被摄取的染料，最后将肿瘤球体置于共聚焦培养皿中以激光共聚焦显微镜进行拍照。拍照时沿着肿瘤球体Z轴在中心位置进行拍摄，以充分表征荧光的穿透情况。
实验结果如图5所示，与载荧光染料共同孵育4h后，PF组与HPF+HAase组均表现出较强的荧光穿透能力，在肿瘤球体深处中心位置均表现出很强的绿色荧光，这与PAMAM纳米颗粒具有更强的肿瘤组织深层穿透能力的理论一致。而未经HAase处理的HPF组整体荧光较弱，这是因为A549肿瘤细胞对HPF的摄取能力低于PF纳米颗粒。同时，可以观察到HPF组的绿色荧光大多数集中于A549肿瘤球体的外周部分，而PF组和HPF+HAase组的绿色荧光则是均匀的分布在整个肿瘤球体内部，表明HPM在无HAase降解的情况下穿透至肿瘤组织深处的能力较差，大多仅能停留在肿瘤组织的外周细胞中。肿瘤球体深层穿透实验的结果证明，我们设计构建的HPF纳米颗粒可以在有HAase的环境中实现很好的肿瘤组织深层穿透，这对于提高化疗药物疗效具有重要作用。
试验例7
如图6所示，为评估GHPM微球的肺部沉积能力效果，本试验例利用小动物活体成像仪在小鼠体内进行了进一步研究。
首先构建载FITC的HPF纳米颗粒和GHPF微球，经冷冻干燥后置于4℃冰箱备用。通过尾静脉注射B16F10细胞的方式在Balb/c小鼠体内诱导建立肺部转移黑色素瘤模型，每只鼠注射5×105个处于对数生长期的肿瘤细胞。接种肿瘤细胞10d后进行实验，小鼠以4％水合氯醛麻醉后固定在操作台上，随后以专用的干粉喷雾器将HPF纳米颗粒和GHPF微球(FITC＝2mg)分别通过声门处递送至小鼠肺部，给药后将小鼠放回笼内，每组设立三个平行对照。给药2h后，通过颈椎脱臼法处死小鼠并解剖取出小鼠肺部。以PBS清洗肺部表面血液后，通过小动物活体成像仪对小鼠肺部荧光强度情况进行检测。
研究结果如图6所示，吸入了GHPF微球的小鼠肺部荧光强度明显强于吸入HPF纳米颗粒的小鼠。同时，GHPF微球组小鼠肺部的荧光广泛的分布在肺部各处，而HPF纳米颗粒荧光分布范围则明显更小。以上结果证实了GHPF微球可以有效改善HPF纳米颗粒的肺部沉积性能，可以将HPF纳米颗粒更高效递送至肺部深处。
试验例8
在小鼠肺部肿瘤模型上考察吸入复合微球GHPM增强药物对肺部疾病治疗的效果。
首先通过尾静脉注射B16F10细胞的方式在Balb/c小鼠体内诱导建立肺部转移黑色素瘤模型，每只鼠注射5×105个处于对数生长期的肿瘤细胞。接种肿瘤细胞7d后，将荷瘤小鼠随机分为5组，每组5只。Ⅰ组经尾静脉注射生理盐水，Ⅱ组经尾静脉注射MTX，其余三组通过肺部干粉吸入给药的方式分别给予PM，HPM及GHPM(MTX＝15mg/kg)。每两天给药一次，给药周期持续两周，过程中每两天监测一次小鼠体重。最后一次给药结束后第二天，通过颈椎脱臼法处死小鼠，分别解剖取肺拍照并计数肿瘤结节。由肺部照片---图7(a)可以明显观察到各治疗组的小鼠肺部肿瘤情况相比于阴性对照组都有不同程度的降低。其中，GHPM吸入微球治疗组的小鼠肺部表现出最轻的肿瘤负担，肺部仅有极少数黑色素瘤结节出现。
为了更直观的比较各组的治疗效果，对各组小鼠的肺部黑色素瘤结节进行了计数，结果如图7(b)所示：生理盐水处理组的小鼠肺部肿瘤结节数量最多，MTX、PM、HPM治疗组的肿瘤结节数量均有一定降低，但是结节数量仍较多，而GHPM组小鼠的肺部肿瘤结节数量则表现出了十分显著的降低，表明GHPM复合物微球给药系统能够在通过干粉吸入的方式给药时有效提高化疗疗效。在治疗期间，还监测了各组小鼠的体重情况—如图7(c)，所有小鼠的体重均在一定范围内波动，未出现明显降低。
虽然对本发明的具体实施方式进行了详细地描述，但不应理解为对本专利的保护范围的限定。在权利要求书所描述的范围内，本领域技术人员不经创造性劳动即可作出的各种修改和变形仍属本专利的保护范围。

Claims (10)

1.一种用于肺部疾病治疗的吸入式复合微球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)PM纳米球的制备
将PAMAM与小分子化学药物共溶后搅拌并离心，将上清液纯化后，制得PM纳米球；
(2)纳米药物载体的制备
将PM纳米球与透明质酸共溶后，依次加入有机溶剂、交联剂和有机溶剂进行反应，反应结束后离心、洗涤和冻干，制得纳米药物载体；
(3)吸入式复合微球的制备
将纳米药物载体与明胶共溶于热水中，加入油相进行反应，将反应后的混合物冷却后，加入交联剂和有机溶剂，离心、洗涤并冻干后制得吸入式复合微球。
2.如权利要求1所述的用于肺部疾病治疗的吸入式复合微球的制备方法，其特征在于，所述小分子化学药物为甲氨蝶呤、氨基喋呤、伊达曲沙、三甲曲沙、洛美曲索、伊马替尼、舒尼替尼、吉非替尼、埃克替尼、厄洛替尼、奥希替尼、阿法替尼、瑞戈非尼、曲贝替定、阿来替尼、克唑替尼、布格替尼、塞瑞替尼、达拉非尼、曲美替尼、尼莫司汀、环磷酰胺、去氧氟鸟苷、氟尿嘧啶、氟鸟甙、多柔比星、丝裂霉素、吡柔比星、伊立替康、紫杉醇、替硝唑、阿他美坦、来曲唑或他莫昔芬。
3.如权利要求1所述的用于肺部疾病治疗的吸入式复合微球的制备方法，其特征在于，所述PAMAM与小分子化学药物的质量比为2～3:4～5，所述步骤(1)搅拌的速度为900～1200rpm，搅拌的时间为2～4h；所述步骤(1)离心的转速为14500～15500rpm，离心的时间为12～18min。
4.如权利要求1所述的用于肺部疾病治疗的吸入式复合微球的制备方法，其特征在于，所述PM纳米球与透明质酸的质量比为10～20:25，所述PM纳米球与透明质酸共溶于纯化水中，透明质酸的分子量为10～600kDa。
5.如权利要求1所述的用于肺部疾病治疗的吸入式复合微球的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中的有机溶剂为丙酮，交联剂由1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和己二酸二酰肼按照质量比2:1混合制得。
6.如权利要求1所述的用于肺部疾病治疗的吸入式复合微球的制备方法，其特征在于，步骤(2)中的反应在转速为300～900rpm的条件下进行，步骤(3)中的反应在转速为600～1000rpm的条件下进行。
7.如权利要求1所述的用于肺部疾病治疗的吸入式复合微球的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中纳米药物载体与明胶的质量比为1:3～10，所述明胶的冻力为100～300Bloom。
8.如权利要求1所述的用于肺部疾病治疗的吸入式复合微球的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中的油相由体积比45～55:1的液体石蜡和司盘80混合制得，所述交联剂为体积分数为45～55％的戊二醛水溶剂，所述有机溶剂为丙酮。
9.如权利要求1或8所述的用于肺部疾病治疗的吸入式复合微球的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中热水的温度为45～55℃，油相、交联剂、丙酮的体积比为50～52:0.02:95～105，所述油相与明胶的比例关系为50～52mL:200mg。
10.采用权利要求1～9任一项所述的用于肺部疾病治疗的吸入式复合微球的制备方法制备得到的用于肺部疾病治疗的吸入式复合微球。
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