CN102688200A - 植物类抗癌靶向纳米制剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种植物类抗癌靶向纳米制剂及其制备方法，其特征是，其重量百分比的组成如下：人血白蛋白：43－60%；植物类抗癌药物：1.5－7.5%；分子量为3000-1.8x 106Da的透明质酸：24－40%；纳米粒子稳定剂：3.5－15%，其余组分为水，构成总和为100％。其制备方法包括制备透明质酸-白蛋白共轭物；配制植物类抗癌药溶液；制备靶向纳米制剂。该植物类抗癌靶向纳米制剂稳定性好，并具有生物靶向性。
Description
技术领域
本发明属于医药领域，具体是涉及一种植物类抗癌靶向纳米制剂及其制备方法。
背景技术
植物类药物中的紫杉醇、多西紫杉醇属于广谱抗癌药，已广泛用于治疗乳腺癌、卵巢癌和非小细胞肺癌等恶性肿瘤。在应用过程中这类抗癌药主要面临的问题包括溶解度低，毒副作用高，生物利用率低，易产生抗药性等。
为了解决溶解度低的问题，这类药的传统制剂需要大量使用增溶剂如聚氧乙烯蓖麻油。然而，该辅料不仅可以引起许多副反应，如血管舒张，血压过低，呼吸困难，以及严重过敏等症状，而且，该辅料也不具备对癌细胞的靶向性，抗癌药的生物利用度低下，辅料的毒副作用极为显著。
为了解决辅料毒副作用的问题，人们发明了纳米给药系统，如紫杉醇的蛋白给药系统和脂质体给药系统（US Patent 6,096,331，US Patent 5,916,596）。这类纳米给药系统利用紫杉醇和载体的疏水作用，形成纳米小球，以增加紫杉醇的溶解性；由于载体白蛋白和脂质体的生物相容性，在紫杉醇注射过程中对人体不产生任何毒副作用，因而减小了病人由于辅料的毒副反应所承受的痛苦。由于这类载体的平均粒径在130-150纳米之间，表面的亲水基团不丰富，它们在体内循环过程中易被网状内皮系统中的单核巨噬细胞系统吞噬和清除，然后导向肝、脾、肺、骨髓等单核巨噬细胞系统（MPS），同时，在这些器官中也可通过EPR（Enhanced Permeability retention）增强渗透和保留作用聚集，因此，现有的纳米抗癌药给药系统不仅可以增加抗癌药的溶解度，而且对肝、肺等巨噬细胞丰富的器官有一定的靶向性。这类通过EPR作用的靶向性被称之为被动靶向。
以紫杉醇/白蛋白纳米给药系统为例，这个系统是由白蛋白与紫杉醇结合形成的纳米微粒，这些微粒的大小大在100到150纳米之间，只有人体红细胞的百分之一。在制备过程中，紫杉醇溶于有机溶剂如三氯甲烷，在高压均质条件下紫杉醇溶液与白蛋白溶液共混，通过与白蛋白结构中的疏水部分结合形成疏水的内核，白蛋白的亲水部位则将其疏水内核包裹，形成一个保护层起到稳定所包裹的药物和纳米颗粒的作用。
在系统给药时，由于体内单核巨噬细胞的吞噬作用，紫杉醇/白蛋白纳米粒在体内循环过程中逐步累积到肝，肺，脾等部位，因此，其对这些部位的肿瘤细胞有较好的被动靶向治疗作用；然而，对其它部位如乳腺等部位则其靶向效果并不好；此外，紫杉醇和白蛋白主要是通过疏水作用形成复合物，当其被注射到体内后，由于体内存在大量的白蛋白，体内的白蛋白很容易置换结合在纳米粒中的紫杉醇；复合物中的紫杉醇也可以迅速与体内的白蛋白结合，因为正常细胞既可以吞噬普通的白蛋白，也可以吞噬带有紫杉醇的的白蛋白，所以，紫杉醇/白蛋白复合物对正常细胞的毒性也会较高。
紫杉醇/脂质体纳米给药体系通过脂质体对紫杉醇的包埋，增加紫杉醇的溶解度，在注射过程中由于脂质体的生物相容性，对病人产生的毒副作用较小。然而，在体内脂质体立即与紫杉醇分离，紫杉醇与体内的白蛋白结合。与聚氧乙烯蓖麻油比较，虽然两者都可增加紫杉醇的溶解度，药物动力学相似，但是脂质体的毒副作用则比后者大幅降低。
从上面的描述可以看到，已有的抗癌药给药系统的主要缺点为：1、载体在体内不稳定，如脂质体在体内很快分散，抗癌药与体内的循环系统中的白蛋白结合，这样载体实际上只起到对抗癌药增溶的作用而在体内不能起到药物的载体和载体的靶向的作用；2、被动靶向性：由于载药纳米粒子的大小在100到150纳米之间，在体内循环过程中，大部分载药纳米粒子很容易被体内单核巨噬细胞所吞噬，在肝、脾、肺等组织内聚集，对这些组织内的肿瘤有较好的疗效作用，但对其它部位的肿瘤则疗效有限；3、抗癌药不能与载体形成稳定的复合物，药物容易游离到血液中与其中的白蛋白结合；4、纳米抗癌药在体外的溶液中的稳定性只有数小时到一天的时间，抗癌药与白蛋白形成的复合物缓慢解离。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种植物类抗癌靶向纳米制剂，该植物类抗癌靶向纳米制剂稳定性好，并具有生物靶向性。
实现上述目的的技术方案如下：
一种植物类抗癌靶向纳米制剂，其重量百分比的组成如下：
人血白蛋白：43－60%；
植物类抗癌药物：1.5－7.5%；
分子量为3000-1.8x106Da的透明质酸：24－40%；
纳米粒子稳定剂：3.5－15%，
其余组分为水（通常为1－10%），构成总和为100％。
优选地，所述植物类抗癌靶向纳米制剂，其重量百分比的组成如下:
人血白蛋白：45－50%；
植物类抗癌药物：4－5%；
分子量为3000-1.8x106Da的透明质酸：32－38%；
纳米粒子稳定剂：5－7%，其余组分为水（通常为1-7%）。
优选地，所述透明质酸的分子量为：5000-2.0x105Da。
优选地，所述纳米粒子稳定剂是d-α生育酚琥珀酸聚乙二醇酯（TPGS）、PEO-PPO-PEO嵌段共聚物或PVP。这些聚合物的疏水部分与紫杉醇、多西紫杉醇结合并进入白蛋白的疏水区域，亲水部分则在白蛋白表面形成一层亲水层，起到稳定白蛋白和紫杉醇所形成的复合物的作用。
优选地，所述植物类抗癌药物是紫杉醇、多西紫杉醇、喜树碱及其衍生物。
靶向分子透明质酸既可以通过非共价键与白蛋白形成复合物起到靶向作用，也可以通过共价键与白蛋白形成共轭物起到靶向作用。通过共价键制备靶向分子和药物载体的共轭物有两种工艺可以使用，其中先制备靶向分子的活性酯再将靶向分子接到药物载体上比直接通过偶联将靶向分子接到药物载体上反应更利于控制，所形成的共轭物是由靶向分子和白蛋白通过酰胺键形成的而非白蛋白上的氨基和羧基通过酰胺键形成的。
本发明的另一目的是提供上述植物类抗癌靶向纳米制剂的制备方法。
实现上述目的的技术方案如下：
植物类抗癌靶向纳米制剂的制备方法，包括以下步骤：
（1）制备透明质酸-白蛋白共轭物
将透明质酸和人血白蛋白加入到无菌水中溶解，调节溶液pH为5.0-6.0,将1-2倍透明质酸摩尔数的EDCI(1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐)加入到上述溶液中，在室温下搅拌过夜,反应完毕后，透析除去未键合的透明质酸、未反应的EDCI和EDCI的反应产物，冷冻干燥后用PBS缓冲液溶解得到人血白蛋白/透明质酸溶液;或将透明质酸完全溶于0.1M的MES（2-(N-吗啡啉）乙磺酸）缓冲液中，然后加入的偶联剂EDCI和N-羟基硫代琥珀酰亚胺，室温下搅拌反应，得到透明质酸琥珀酰亚胺活性脂；再将透明质酸琥珀酰亚胺活性脂加入到人血白蛋白的水溶液中，调节溶液pH 7.0－7.5，室温下搅拌反应；反应完毕后透析除去未反应的原料和反应副产物，冷冻干燥后，得透明质酸-人血白蛋白共轭物；将透明质酸-人血白蛋白共轭物用PBS缓冲液溶解,得到人血白蛋白/透明质酸溶液；或将人血白蛋白冻干粉，透明质酸溶于PBS缓冲液中，得到人血白蛋白/透明质酸溶液；
（2）配制植物类抗癌药溶液：将植物类抗癌药物和纳米粒子稳定剂溶于有机溶剂中，得到抗癌药溶液；
（3）在高速均质、高压均质或超声处理条件下，将上述抗癌药溶液加入到人血白蛋白/透明质酸溶液中，然后除去有机溶剂；过滤冷冻干燥得到植物类抗癌靶向纳米制剂。
在其中一些实施例中，所述有机溶剂为二氯甲烷、氯仿、二氯甲烷与乙醇混合物、或氯仿与乙醇混合物。更优选地，所述有机溶剂为氯仿或乙醇与氯仿的混合物。
步骤（3）中，通过旋转蒸发仪加热至30-45℃减压蒸发除去有机溶剂。
本发明的发明人通过大量实验发现，透明质酸与白蛋白既可以通过离子键和高分子链间的链缠结作用形成高分子的络合物，又可以通过共价键形成更为稳定的共轭聚合物，透明质酸在纳米粒子的表面形成一层亲水层，以避免纳米材料中的白蛋白与血液中的人血白蛋白发生作用，同时避免纳米粒子被循环系统中的巨噬细胞所吞噬。人血白蛋白、抗癌药和纳米稳定剂通过特定的工艺和制备条件形成紧密和稳定的疏水纳米核心，在优选的工艺条件采用高压均质的方法可制得的粒径在100nm左右的靶向纳米制剂。我们选用透明质酸另一个原因是因为HA是自然发生的生物聚合物，在我们的身体的许多器官中都有它的存在。HA具有生物相容性和生物可降解性而且是细胞外基质的主要组成之一。CD44是HA在细胞表面的主要受体，它在上皮细胞，造血细胞和神经元细胞等正常细胞上分布较少，而在癌细胞如淋巴癌细胞、乳腺癌细胞、大肠癌细胞和肺癌细胞上则过分表达。因此，癌细胞对HA的亲和作用和细胞吞噬作用则远远高于正常细胞。因此，我们可以利用HA对癌细胞表面上的CD44的特异结合，以HA为靶向分子，以CD44为受体，设计出对癌细胞具有生物靶向性的纳米释药载体。
为了解决已有释药系统的问题，本发明设计的释药体系具备以下的组分和结构：1、药物载体如人血白蛋白，既能用于药物的包埋并通过形成纳米材料增加药物的溶解性，延长药物在体内的循环，又能与靶向分子结合，形成稳定的复合物；2、靶向分子如透明质酸，用于目标肿瘤细胞表面的受体如CD44的生物靶向，同时在白蛋白载体表面形成一层亲水的凝胶层，既保护纳米粒子不被体内单核细胞吞噬，阻挡载药纳米粒子与体内游离的白蛋白作用，防止抗癌药被游离的白蛋白置换，又可作为药物分子通过扩散和溶解机制逃离纳米粒子的最后一道屏障；3、纳米粒子稳定剂，如疏水分子胆固醇，PEO-PPO-PEO崁段聚合物，d-α生育酚琥珀酸聚乙二醇酯、PVP等，这类分子不仅可以通过疏水作用辅助抗癌药入紫杉醇与白蛋白形成稳定的复合物，也可以利用其亲水高分子链防止循环系统中的白蛋白接近靶向纳米粒子以减少抗癌药被置换；4、抗癌药如紫杉醇，多西紫杉醇，喜树碱等；5、靶向纳米粒子粒径等于或者小于100纳米以逃过体内网状内皮系统，避免在肝区、肺、脾等器官遭到拦截，以延长纳米载药系统在体内的循环时间以利于靶向纳米抗癌药在肿瘤部位的生物靶向性及累积。
本发明所述的植物类抗癌靶向纳米制剂，其具有以下的优点：1、药物纳米体系在体内环境中稳定，载体和药物能形成良好的复合体；2、载体的靶向性应是主动靶向即载体表面的生物靶向分子能与肿瘤细胞上的特异受体结合形成生物靶向性，而非被动靶向性；3、纳米粒子的粒径小于或者略大于100纳米，有利于纳米粒子在体内循环系统中进行较长时间循环而不被单核巨噬细胞吞噬和被肝脏内的网状系统拦截；4、纳米抗癌药在溶液中的稳定性好，适于在溶液状态下长期保存，即载体和抗癌药能够形成稳定的复合物。
附图说明
图1是本发明的的实施例14靶向纳米制剂的稳定性比较结果示意图；
图2是本发明的实施例14的靶向纳米制剂的生物靶向性比较结果示意图；
图3是本发明的实施例14的靶向纳米制剂对肿瘤的抑制作用比较结果示意图；
图4是实施例11、实施例17靶向纳米制剂与泰帝素；羟基喜树碱注射液与稳定性比较结果示意图；
图5是实施例11、实施例17靶向纳米制剂对肿瘤的抑制作用比较结果示意图；
图6是实施例11、实施例17靶向纳米制剂的生物靶向性比较结果示意图。
具体实施方式
白蛋白和透明质酸在特定酸碱条件下入pH 3-7可以通过相互间的离子键及范德华力形成稳定的复合物或者通过脂质酸上的羧基和白蛋白上的自由氨基脱水形成酰胺键形成共轭物。然后加入抗癌药如紫杉醇、多稀紫杉醇和纳米材料稳定剂如胆固醇再调控溶液的酸碱度和温度通过纳米粒子核心的白蛋白变性使上数种组分形成一个紧密的疏水的纳米核心及一个亲水的外壳。这个紧密的核心有助于抗癌药的包埋和避免抗癌药的游离出纳米球；亲水的透明质酸层则既可以避免纳米粒子被循环体系中的巨噬细胞吞噬，又可以靶向肿瘤细胞表面的CD44受体。
本发明所用的白蛋白为注射用人血白蛋白，购自安普莱士，上海莱士血制品有限公司。使用前透析除去产品中的添加剂，冷冻干燥得不含添加剂的白蛋白。
以下通过具体实施例对本发明进行进一步的阐述。
实施例1制备紫杉醇/TPGS/透明质酸/白蛋白纳米制剂
（1）将500mg人血白蛋白冻干粉，500mg分子量5000Da的透明质酸溶于20mLPBS缓冲液中；调整溶液的pH为5.5，得到白蛋白/透明质酸溶液；
（2）将50mg的紫杉醇，50mgTPGS溶于1mL的氯仿中；在搅拌条件下将紫杉醇溶液加入到上述白蛋白/透明质酸溶液中，形成初乳；
（3）初乳在高压均质机（9000-40000psi）处理下得到纳米乳剂，纳米乳剂转入旋转蒸发仪在30-45℃减压蒸发快速除去有机溶剂，无菌条件下冷冻干燥得到冻干粉末；冻干粉用生理盐水重悬后在室温下稳定时间小于10小时。经纳米激光粒度仪测定，通过上述方法制备的纳米粒子的平均粒径在160纳米。
实施例2制备紫杉醇/TPGS/透明质酸-白蛋白纳米制剂
（1）称取500mg人血白蛋白冻干粉，溶于20mL无菌水中；加400mg分子量为5KDa的透明质酸到白蛋白溶液中，在充分搅拌下将白蛋白完全溶解；随后，用0.1N的盐酸调整溶液的pH为5.5；将二倍于透明质酸摩尔数的EDCI加入到上述溶液中，在室温下搅拌过夜；反应完毕后，透析除去未键合的透明质酸、未反应的EDCI和EDCI的反应产物，然后冷冻干燥；将上述冷冻干燥的透明质酸-白蛋白共轭物溶于20mL PBS缓冲液中；调整溶液的pH为5.5，得到白蛋白/透明质酸溶液；
（2）将50mg的紫杉醇，50mgTPGS溶于1mL的氯仿中；在搅拌条件下将紫杉醇溶液加入到白蛋白/透明质酸溶液中，形成初乳；
（3）初乳在高压均质机（9000-40000psi）处理下得到纳米乳剂，纳米乳剂转入旋转蒸发仪在30-45℃减压蒸发快速除去有机溶剂，无菌条件下冷冻干燥得到紫杉醇/TPGS/透明质酸-白蛋白纳米制剂冻干粉末。冻干粉用生理盐水重悬后在室温下置放24小时，未见有沉淀生成。经纳米激光粒度仪测定，通过上述方法制备的纳米粒子的平均粒径在140纳米。
实施例3制备紫杉醇/TPGS/透明质酸-白蛋白纳米制剂
（1）制备透明质酸-白蛋白共轭物
先制备透明质酸活性脂：将400毫克的透明质酸（分子量5KDa）溶解在10mL0.1M MES缓冲液中，加入1.2倍透明质酸摩尔数的EDCI，与1.2倍透明质酸摩尔数的N-羟基硫代琥珀酰亚胺；在室温下搅拌反应30分钟即制得透明质酸琥珀酰亚胺活性脂；
将500mg人血白蛋白冻干粉溶解在10mL无菌水中，加入上述透明质酸的琥珀酰亚胺活性脂溶液中；调整pH值至7.0-7.2，在室温下搅拌反应60分钟；反应完成后加入到分子量截至为10，000的透析膜内，透析除去未反应的试剂和反应副产物；将透析后透明质酸-白蛋白溶液冷冻干燥，将冻干的透明质酸-白蛋白溶于pH为5.5的磷酸盐缓冲溶液（PBS缓冲液）中，得到白蛋白/透明质酸溶液；
（2）制备紫杉醇溶液：
称取50mg，紫杉醇，50mgTPGS溶于1mL的氯仿中得紫杉醇溶液；
（3）制备紫杉醇/TPGS/透明质酸-白蛋白纳米制剂
在搅拌条件下将紫杉醇溶液加入到白蛋白/透明质酸溶液中，形成初乳；初乳在高压均质机（9000-40000psi）处理下得到纳米乳剂，纳米乳剂转入旋转蒸发仪在30-45℃减压蒸发快速除去有机溶剂，无菌条件下冷冻干燥得到冻干粉末。冻干粉用生理盐水重悬后在室温下置放24小时，未见有沉淀生成。经纳米激光粒度仪测定，通过上述方法制备的纳米粒子的平均粒径在100纳米。
实施例4制备紫杉醇/透明质酸-白蛋白纳米制剂
具体实施过程同实施例3，透明质酸的量由400mg改为200mg。纳米粒子的平均粒径为110纳米，稳定时间小于36小时。
实施例5制备紫杉醇/TPGS/透明质酸-白蛋白纳米制剂
具体实施过程同实施例3，紫杉醇的量由50mg调整为30mg。
实施例6制备紫杉醇/TPGS/透明质酸-白蛋白纳米制剂
具体实施过程同实施例3，紫杉醇的量由50mg调整为75mg。纳米粒子的平均粒径为110纳米，与实施例3相比稳定时间变短。
实施例7制备紫杉醇/TPGS/透明质酸-白蛋白纳米制剂
具体实施过程同实施例3，透明质酸的分子量由5000变为20000。纳米粒子的平均粒径为120纳米，稳定时间基本不变。
实施例8制备紫杉醇/TPGS/透明质酸-白蛋白纳米制剂
具体实施过程同实施例3，稳定剂TPGS量由50mg变为150mg。纳米粒子的平均粒径为110纳米，与实施例3相比稳定时间几乎不变。
实施例9制备紫杉醇/PEO-PPO-PEO/透明质酸-白蛋白纳米制剂
具体实施过程同实施例3，除了稳定剂由TPGS变为PEO-PPO-PEO。纳米粒子的平均粒径为125纳米。
实施例10制备紫杉醇/PVP/透明质酸-白蛋白纳米制剂
具体实施过程同实施例3，除了稳定剂由TPGS变为PVP。纳米粒子的平均粒径为110纳米。
实施例11制备多西紫杉醇/TPGS/透明质酸-白蛋白纳米制剂
具体实施过程同实施例3，除了药物由紫杉醇变为多烯紫杉醇。纳米粒子的平均粒径为110纳米。
实施例12制备紫杉醇/TPGS/透明质酸-白蛋白纳米制剂
具体实施过程同实施例3，除了溶剂由氯仿改为二氯甲烷。
实施例13制备紫杉醇/TPGS/透明质酸-白蛋白纳米制剂
具体实施过程同实施例3，除了溶剂由氯仿改为乙醇：二氯甲烷1:9（1.0mL）。与实施例3相比，得到的纳米制剂粒径更小，稳定时间更长，但紫杉醇体外24h释放多于实施例3的制剂。
实施例14制备紫杉醇/TPGS/透明质酸-白蛋白纳米制剂
具体实施过程同实施例3，除了溶剂由氯仿改为乙醇：氯仿1:9（1.0mL）。与实施例3相比，得到的纳米制剂粒径更小，稳定时间更长，与实施例13类似。
实施例15制备紫杉醇/TPGS/透明质酸-白蛋白纳米制剂
（1）制备透明质酸-白蛋白共轭物
先制备透明质酸活性脂：将400毫克的透明质酸（分子量5KDa）溶解在10mL0.1M MES缓冲液中，加入1.2倍透明质酸摩尔数的EDCI，与1.2倍透明质酸摩尔数的N-羟基硫代琥珀酰亚胺；在室温下搅拌反应30分钟即制得透明质酸琥珀酰亚胺活性脂；
将500mg人血白蛋白冻干粉溶解在10mL无菌水中，加入上述透明质酸的琥珀酰亚胺活性脂溶液中；调整pH值至7.0-7.2，在室温下搅拌反应60分钟；反应完成后加入到分子量截至为10，000的透析膜内，透析除去未反应的试剂和反应副产物；将透析后透明质酸-白蛋白溶液冷冻干燥；
（2）制备紫杉醇溶液：
称取50mg，紫杉醇，50mgTPGS溶于1.0mL1：1的乙醇/氯仿混合液中使之全部溶解即得紫杉醇溶液；
（3）制备紫杉醇/TPGS/透明质酸-白蛋白纳米制剂
将冻干的透明质酸-白蛋白溶于pH为5.7的磷酸盐缓冲溶液中，在高速均质条件下（10000-20000rpm，5min）将紫杉醇溶液加入到白蛋白/透明质酸溶液中，形成纳米乳剂；纳米乳剂转入旋转蒸发仪在30-45℃减压蒸发快速除去有机溶剂，无菌条件下冷冻干燥得到冻干粉末。冻干粉用生理盐水重悬后在室温下置放4-6小时，观察到有沉淀生成。经纳米激光粒度仪测定，通过上述方法制备的纳米粒子的平均粒径在300纳米以上。
实施例16制备紫杉醇/TPGS/透明质酸-白蛋白纳米制剂
（1）制备透明质酸-白蛋白共轭物
先制备透明质酸活性脂：将400毫克的透明质酸（分子量2x105Da）溶解在10mL0.1M MES缓冲液中，加入1.2倍透明质酸摩尔数的EDCI，与1.2倍透明质酸摩尔数的N-羟基硫代琥珀酰亚胺；在室温下搅拌反应30分钟即制得透明质酸琥珀酰亚胺活性脂；
将500mg人血白蛋白冻干粉溶解在10mL无菌水中，加入上述透明质酸的琥珀酰亚胺活性脂溶液中；调整pH值至7.0-7.2，在室温下搅拌反应60分钟；反应完成后加入到分子量截至为10，000的透析膜内，透析除去未反应的试剂和反应副产物；将透析后透明质酸-白蛋白溶液冷冻干燥；
（2）制备紫杉醇溶液：
称取50mg，紫杉醇，50mgTPGS溶于1.0mL1：9的乙醇/氯仿混合液中使之全部溶解即得紫杉醇溶液；
（3）制备紫杉醇/TPGS/透明质酸-白蛋白纳米制剂
将冻干的透明质酸-白蛋白溶于pH为5.7的磷酸盐缓冲溶液中，加入到白蛋白/透明质酸溶液中，用超声波处理器处理5min，功率200W，形成纳米乳剂，纳米乳剂转入旋转蒸发仪在30-45℃减压蒸发快速除去有机溶剂，无菌条件下冷冻干燥得到冻干粉末。冻干粉用生理盐水重悬后在室温下置放4小时，观察到有沉淀生成。经纳米激光粒度仪测定，通过上述方法制备的纳米粒子的粒径超过300纳米。
实施例17：制备喜树碱/TPGS/透明质酸-白蛋白纳米制剂
（1）制备透明质酸-白蛋白共轭物
先制备透明质酸活性脂：将400毫克的透明质酸（分子量5KDa）溶解在10mL0.1M MES缓冲液中，加入1.2倍透明质酸摩尔数的EDCI，与1.2倍透明质酸摩尔数的N-羟基硫代琥珀酰亚胺；在室温下搅拌反应30分钟即制得透明质酸琥珀酰亚胺活性脂；
将500mg人血白蛋白冻干粉溶解在10mL无菌水中，加入上述透明质酸的琥珀酰亚胺活性脂溶液中；调整pH值至7.0-7.2，在室温下搅拌反应60分钟；反应完成后加入到分子量截至为10，000的透析膜内，透析除去未反应的试剂和反应副产物；将透析后透明质酸-白蛋白溶液冷冻干燥；
（2）制备喜树碱溶液：
称取50mg喜树碱，50mgTPGS溶于1mL的氯仿中得喜树碱溶液；
（3）制备喜树碱/TPGS/透明质酸-白蛋白纳米制剂
将冻干的透明质酸-白蛋白溶于pH为5.5的磷酸盐缓冲溶液中，在搅拌条件下将喜树碱溶液加入到白蛋白/透明质酸溶液中，形成初乳。初乳在高压均质机（9000-40000psi）处理下得到纳米乳剂，纳米乳剂转入旋转蒸发仪在30-45℃减压蒸发快速除去有机溶剂，无菌条件下冷冻干燥得到冻干粉末。冻干粉用生理盐水重悬后在室温下置放24小时，未见有沉淀生成。经纳米激光粒度仪测定，通过上述方法制备的纳米粒子的平均粒径在110纳米。
实施例18
（1）纳米制剂中各组分含量测定：
取10mg上述实施例制备的纳米制剂,加入1ml氯仿，用漩涡振荡器充分震荡，萃取出制剂中的药物及稳定剂，取出上清液，经0.22μm滤膜过滤后，用高压液相色谱检测药物及稳定剂含量。用纯化水把不溶部分溶解，用高压液相色谱法检测透明质酸浓度，双缩脲法检测白蛋白含量。
（2）纳米制剂在溶液中稳定性考查：
取冻干的上述实施例制备的纳米制剂10mg，用2mL无菌过滤后的生理盐水重悬，置室温下保存，观察混悬液状态、有无沉淀及出现沉淀时间。
（3）紫杉醇与人血清白蛋白结合的稳定性的比较
将50mg紫杉醇纳米制剂放入截流分子量为5000的透析膜中置于pH值为7.2的PBS缓冲溶液（含0.2%质量分数的土温80）中。定时取出定量的PBS缓冲溶液，用0.22微米的滤膜过滤，然后用高压液相色谱进行分析。
表1各实施例纳米制剂的相关参数（其余组分为水，构成总和为100％）
从表1得出，白蛋白-透明质酸共轭物与紫杉醇结合的稳定性明显强于白蛋白/透明质酸混合物与紫杉醇结合的稳定性（实施例1）。减少白蛋白-透明质酸共轭物中透明质酸含量（实施例4中减少透明质酸投料量，实施例2中未加EDCI，人血白蛋白与透明质酸反应效率低，同样共轭物中透明质酸含量低），紫杉醇结合的稳定性同样降低，透明质酸分子量增加（实施例7），紫杉醇释出同样增多。改变有机溶剂组分（实施例13、14，溶剂由氯仿调整为乙醇、氯仿混合物）得到的纳米制剂粒径更小。大部分实施例制剂与紫杉醇白蛋白结合型（Abraxane）相比，稳定时间增加，Abraxane稳定时间一般不超过8h。（4）将泰素、Abraxane进行同样的操作以比较紫杉醇与白蛋白结合的稳定性。同样方法比较泰帝素与实施例11，羟基喜树碱注射液与实施例17药物稳定性。图1是实施例14制剂与泰素、Abraxane稳定性比较。图4是实施例11制剂与泰帝素；羟基喜树碱注射液与实施例17稳定性比较。
由于加强紫杉醇与白蛋白的结合，减少了自由的紫杉醇，提高了紫杉醇的生物靶向性，降低其毒副作用。此外，紫杉醇的最大给药，体内半衰期和AUC都有提高。由此，增加紫杉醇的疗效，有效地降低其副作用。图1显示，在我们的释放条件下，即0.2%的Tween为表面活性剂的介质中，实施例14制剂与紫杉醇白蛋白纳米制剂（Abraxane）和紫杉醇制剂（泰素）比较，前者的稳定性有了极大的提高，24小时透析后，只有约20%的紫杉醇游离出来，而紫杉醇白蛋白却有近60%的紫杉醇游离出来，而紫杉醇注射液（泰素）本身100%释放。图4显示实施例11与泰帝素（多烯紫杉醇注射液），实施例17与喜树碱注射液体外释放不同。
实施例19：动物实验：
（1）抑瘤实验：使用BALB/c裸鼠构建人MX-1乳腺癌细胞荷瘤小鼠模型，待肿瘤生长至150-300mm3时将小鼠随机分为生理盐水阴性组，实施例12药物组，泰素（Taxol）组，紫杉醇白蛋白结合型（Abraxane）组，实施例11药物组、泰帝素（多西紫杉醇）、喜树碱注射液、实施例17药物组，每组6只小鼠。开始尾静脉注射药物，剂量为10mg/kg，每五天注射一次，连续注射五次，在试验过程中每两天测量肿瘤体积一次，其体积计算方法如下：V=d2D/2,其中d为短方向的长度，D为长方向的长度。结果参见图3，图5。
（2）药物在小鼠体内的分布：
靶向纳米紫杉醇在体内的分布的测定是通过使用14C标记的紫杉醇来完成的。将靶向纳米紫杉醇制剂以5mg/mL的剂量通过尾经脉注射到已接种H22肿瘤细胞-7天后的小鼠体内。注射后的小鼠在24小时后处死，分别取内脏和肿瘤，测定其放射强度。紫杉醇在小鼠各器官中的分布=器官中的放射强度/总放射强度X 100%。结果参见图2。多西紫杉醇和喜树碱同样采用该方法检测，结果见图6。
制剂的生物靶向性
本发明的主要的技术革新在于加入靶向分子到白蛋白上，使其增加了生物靶向性，有效地提高了纳米制剂在肿瘤内的聚集，提高了紫杉醇的生物利用率。由图2可见，与白蛋白的非靶向纳米制剂比较，白蛋白的靶向纳米制剂经脉注射后在体内的器官中的分布有了许多变化，在肿瘤中的累积率有了显著的提高。图6显示了多烯紫杉醇和喜树碱靶向纳米制剂比普通制剂药物在肿瘤中的累积率有了显著的提高。
（3）制剂的粒径减小
由于纳米制剂的粒径减小，在肝区、肺部和脾部的截流减少，同时延长了纳米制剂再体内的循环时间，因此，不仅大幅降低了紫杉醇的毒副作用，也增加了紫杉醇在肿瘤中的累积，更有效地提高了紫杉醇对肿瘤细胞的杀伤作用。
紫杉醇纳米制剂在体内的动力学也有了变化：半衰期增加，最大血浓度减小，外推的AUC%显著增加，靶向纳米紫杉醇的疗效显著提高。
表2．不同制剂的药代动力学参数
（4）增加紫杉醇与白蛋白结合，减少游离的紫杉醇
由于在靶向纳米制剂中，紫杉醇和白蛋白可以紧密结合，形成稳定的复合物，与紫杉醇白蛋白纳米制剂，紫杉醇蓖麻油制剂比较，前者的疗效有了显著的提高。如图3所示，靶向纳米制剂对肿瘤的抑制作用最强，其生物疗效远高于紫杉醇白蛋白制剂和紫杉醇蓖麻油制剂。对多烯紫杉醇和喜树碱来说，靶向制剂具有同样效果，如图5所示。
由表2可以看出，靶向紫杉醇纳米制剂的最大药物承受力增加，半致死量增加，说明其毒副作用减小。
表3
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (9)
1.一种植物类抗癌靶向纳米制剂，其特征是，其重量百分比的组成如下：
人血白蛋白：43－60%；
植物类抗癌药物：1.5－7.5%；
分子量为3000-1.8x106Da的透明质酸：24－40%；
纳米粒子稳定剂：3.5－15%；
其余组分为水，构成总和为100％。
2.根据权利要求1所述的植物类抗癌靶向纳米制剂，其特征是，其重量百分比的组成如下:
人血白蛋白：45－50%；
植物类抗癌药物：3－5%；
分子量为3000-1.8x106Da的透明质酸：32－38%；
纳米粒子稳定剂：5－7%；
其余组分为水，构成总和为100％。
3.根据权利要求1或2所述的植物类抗癌靶向纳米制剂，其特征是，所述透明质酸的分子量为5000-2x105Da。
4.根据权利要求1或2所述的植物类抗癌靶向纳米制剂，其特征是，所述纳米粒子稳定剂是d-α生育酚琥珀酸聚乙二醇酯、PEO-PPO-PEO嵌段共聚物、PVP中的一种或几种。
5.根据权利要求1或2所述的植物类抗癌靶向纳米制剂，其特征是，所述植物类抗癌药物是紫杉醇、多西紫杉醇、喜树碱及其衍生物。
6.制备权利要求1-5任一项所述的植物类抗癌靶向纳米制剂的方法，其特征是，其步骤如下：
（1）制备透明质酸-白蛋白共轭物
将透明质酸和人血白蛋白加入到无菌水中溶解，调节溶液pH为5.0-6.0,将1-2倍透明质酸摩尔数的EDCI加入到上述溶液中，在室温下搅拌过夜,反应完毕后，透析除去未键合的透明质酸、未反应的EDCI和EDCI的反应产物，冷冻干燥后用PBS缓冲液溶解得到人血白蛋白/透明质酸溶液;或
将透明质酸完全溶于0.1M的MES缓冲液中，然后加入偶联剂EDCI和N-羟基硫代琥珀酰亚胺，室温下搅拌反应，得到透明质酸琥珀酰亚胺活性脂；再将透明质酸琥珀酰亚胺活性脂加入到人血白蛋白的水溶液中，调节溶液pH 7.0－7.5，室温下搅拌反应；反应完毕后透析除去未反应的原料和反应副产物，冷冻干燥后，得透明质酸-人血白蛋白共轭物；将透明质酸-人血白蛋白共轭物用PBS缓冲液溶解,得到人血白蛋白/透明质酸溶液；或
将人血白蛋白冻干粉，透明质酸溶于PBS缓冲液中，得到人血白蛋白/透明质酸溶液；
（2）配制植物类抗癌药溶液：将植物类抗癌药物和纳米粒子稳定剂溶于有机溶剂中，得到抗癌药溶液；
（3）在高速均质、高压均质或超声处理条件下，将上述抗癌药溶液加入到人血白蛋白-透明质酸溶液中，然后除去有机溶剂；过滤冷冻干燥得到植物类抗癌靶向纳米制剂。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征是，所述有机溶剂为二氯甲烷、氯仿、二氯甲烷与乙醇混合溶剂、或氯仿与乙醇混合溶剂。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征是，所述有机溶剂为氯仿或乙醇与氯仿的混合物。
9.根据权利要求6－8任一项所述的制备方法，其特征是，步骤（3）中，通过旋转蒸发仪中加热至30-45℃减压蒸发除去有机溶剂。
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