CN111471639A

CN111471639A - 一种用于人类辅助生殖的颗粒细胞去除液及其制备方法

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Publication number: CN111471639A
Application number: CN202010471551.1A
Authority: CN
Inventors: 夏旭升; 于跃龙; 尹航; 胡彦新
Original assignee: Dongyun Medical Technology Shanghai Co ltd
Current assignee: Dongyun Medical Technology Shanghai Co ltd
Priority date: 2020-05-29
Filing date: 2020-05-29
Publication date: 2020-07-31

Abstract

一种用于人类辅助生殖的颗粒细胞去除液及其制备方法，用于处理卵子的颗粒细胞的透明质酸酶溶解于含有聚乙烯吡咯烷酮、抗菌素和人血白蛋白的盐溶液中配制而成；其中包含：氯化钠95.00～105.00mmol/L、氯化钾3.45～6.55mmol/L、硫酸镁0.55～0.65mmol/L、氯化钙1.75～2.22mmol/L、磷酸二氢钠0.18～0.39mmol/L、碳酸氢钠3.85～5.45mmol/L、HEPES和MOPS15.00～25.00mmol/L、葡萄糖0.38～0.68mmol/L、丙酮酸钠0.28～0.42mmol/L、乳酸钠12.48～23.68mmol/L、谷氨酰胺0.32mmol/L～0.84mmol/L、非必需氨基酸5～15mmol/L、人血白蛋白5～15mg/mL、硫酸庆大霉素7～14μg/mL、聚乙烯吡咯烷酮2～6g/L、透明质酸酶30～90IU/ml；制备方法为：称量好各种组分并溶于注射级用水中，并经0.2μm滤膜过滤灭菌后，取样测试；使pH值：7.00～7.40；渗透压：250～310mOsm/Kg；细菌内毒素：＜0.25EU/ml；1细胞鼠胚培养到96h：≥80％的囊胚形成率。

Description

一种用于人类辅助生殖的颗粒细胞去除液及其制备方法

技术领域

本发明涉及辅助生殖卵丘细胞与卵子的分离技术，具体涉及一种用于人类辅助生殖的颗粒细胞去除液及其制备方法。

背景技术

透明质酸酶已广泛应用于辅助生殖技术中。其目的是分离卵子周围的卵丘细胞(即颗粒细胞)。透明质酸酶的预期用途：用于卵子显微注射和卵子冷冻之前的卵丘细胞与卵子的分离。

卵子胞浆单精子注射(ICSI)或者卵子冷冻技术中，卵子必须与其周围的卵丘细胞(即颗粒细胞)中分离以便观察卵子的成熟和质量。颗粒细胞分散在粘稠的透明质酸中，透明质酸是一种粘多糖，而“消化”这道屏障的武器就是透明质酸酶。透明质酸酶(hyaluronidase)是能使透明质酸产生低分子化作用酶的总称，一种能够降低体内透明质酸的活性，从而提高组织中液体渗透能力的酶。透明质酸酶可以有效地消化颗粒细胞间的透明质酸，以便通过剥卵吸管(针)机械地去除卵子周围的颗粒细胞，随后实施单精子注射或者卵子冷冻技术。

聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone)简称PVP，是一种非离子型高分子化合物，是N-乙烯基酰胺类聚合物中最具特色的，且被研究得最深、广泛的精细化学品品种。PVP有优良的生理惰性，不参与人体新陈代谢，又具有优良的生物相容性，对皮肤、粘膜、眼等不形成任何刺激。医药级PVP为国际倡导的三大药用新辅料之一，可用做片剂、颗粒剂的粘结剂、注射剂的助溶剂、胶囊的助流剂；眼药的去毒剂，延效剂，润滑剂和包衣成膜剂，液体制剂的分散剂和酶及热敏药物的稳定剂，还可用做低温保存剂。

辅助生殖技术中的颗粒细胞去除液中发挥作用的成份为透明质酸酶。而我国的颗粒细胞去除液几乎完全依赖进口成品，不仅成本高，且溶液经长途运输和海关检查后，其有效性受到不同程度的影响，甚至变质，如果使用低质或变质的溶液，将对辅助生殖的治疗带来不可逆转的后果和风险。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种更优良的用于人类辅助生殖的颗粒细胞去除液。

本发明的另一的目的是，提供一种用于人类辅助生殖的颗粒细胞去除液的制备方法。

为解决上述问题，本发明所采用的技术方案是：

一种用于人类辅助生殖的颗粒细胞去除液，用于处理卵子的颗粒细胞的透明质酸酶溶解于含有聚乙烯吡咯烷酮(Polyvinyl Pyrrolidone,PVP)、抗菌素和人血白蛋白的盐溶液中配制而成。

优选的，所述透明质酸酶为透明质酸酶(羊睾丸)，浓度为30～90IU/ml。

优选的，所述聚乙烯吡咯烷酮为PVP-K30，浓度为2～6g/L。

优选的，所述抗菌素为硫酸庆大霉素,浓度为7～14μg/ml。

优选的，所述人血白蛋白浓度为5～15mg/mL。

优选的，所述盐溶液是以4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)和3-(N-吗啉基)丙磺酸(MOPS)为缓冲剂，以钠、钾、镁、钙离子为基础，并以葡萄糖、丙酮酸钠、乳酸钠、谷氨酰胺、非必需氨基酸为能量物质的化合物培养溶液；其中包含：氯化钠95.00～105.00mmol/L、氯化钾3.45～6.55mmol/L、硫酸镁0.55～0.65mmol/L、氯化钙1.75～2.22mmol/L、磷酸二氢钠0.18～0.39mmol/L、碳酸氢钠3.85～5.45mmol/L、HEPES和MOPS 15.00～25.00mmol/L、葡萄糖0.38～0.68mmol/L、丙酮酸钠0.28～0.42mmol/L、乳酸钠12.48～23.68mmol/L、谷氨酰胺0.32mmol/L～0.84mmol/L、非必需氨基酸5～15mmol/L。

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：

一种用于人类辅助生殖的颗粒细胞去除液的制备方法，包括以下步骤：

(1)称量各种无机盐组分溶于注射级用水中，配制成盐溶液，

(2)加入硫酸庆大霉素、葡萄糖、丙酮酸钠、乳酸钠和谷氨酰胺溶于盐溶液中；溶解过程先加固体原料，再加液体原料；

(3)加入所述非必需氨基酸,聚乙烯吡咯烷酮(PVP),人血白蛋白以及透明质酸酶；

(4)检测步骤(3)所得盐溶液的渗透压和pH值，并记录最终渗透压和pH值；所述渗透压保持为250～310mOsm/Kg，所述pH值保持为7.00～7.40；

(5)将步骤(4)所得溶液经过0.2μm滤膜过滤灭菌后，取样测试；测试参数：

A、pH值：7.00～7.40；

B、渗透压：250～310mOsm/Kg；

C、内毒素：＜0.25EU/ml；

D、1细胞鼠胚培养到96h：≥80％的囊胚形成率；

(6)将配置好的溶液进行无菌分装和贴标签。

附图说明

图1为实施例1用于去除小鼠卵子周围的颗粒细胞的使用效果对比1；

图2为实施例2用于去除小鼠卵子周围的颗粒细胞的使用效果对比2。

图中：1、卵子；2、颗粒细胞。

具体实施方式

下面将对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本发明的一部分实施方式，而不是全部的实施方式。

文中所述的硫酸庆大霉素、人血白蛋白均为符合药典要求的药品；4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)、3-(N-吗啉基)丙磺酸(MOPS)、氯化钠、氯化钾、硫酸镁、氯化钙、磷酸二氢钠、碳酸氢钠、葡萄糖、丙酮酸钠、乳酸钠、谷氨酰胺、非必需氨基酸等均为低细菌内毒素(细菌内毒素＜0.25EU/ml)的化学试剂。非必需氨基酸为L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、甘氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸等比例的混合物。

实施例1一种用于人类辅助生殖的颗粒细胞去除液

所述盐溶液是以HEPES和MOPS为缓冲剂，以钠、钾、镁、钙离子为基础，并以葡萄糖、丙酮酸钠、乳酸钠、谷氨酰胺、非必需氨基酸为能量物质的化合物培养溶液；其中包含：氯化钠95.45mmol/L、氯化钾3.85mmol/L、硫酸镁0.65mmol/L、氯化钙2.12mmol/L、磷酸二氢钠0.28mmol/L、碳酸氢钠5.25mmol/L、HEPES和MOPS 25.00mmol/L、葡萄糖0.46mmol/L、丙酮酸钠0.32mmol/L、乳酸钠14.45mmol/L、谷氨酰胺0.41mmol/L、人血白蛋白12mg/mL、非必须氨基酸5mmol/L、硫酸庆大霉素12μg/mL、聚乙烯吡咯烷酮6g/L、透明质酸酶80IU/ml。

具体制备方法包括以下步骤：

(1)称量各种无机盐组分溶于注射级用水中，配制成盐溶液，

A、pH值：7.00～7.40；

B、渗透压：250～310mOsm/Kg；

C、内毒素：＜0.25EU/ml；

D、1细胞鼠胚培养到96h：≥80％的囊胚形成率；

(6)将配置好的溶液进行无菌分装和贴标签。

实施例2一种用于人类辅助生殖的颗粒细胞去除液

所述盐溶液是以HEPES和MOPS为缓冲剂，以钠、钾、镁、钙离子为基础，并以葡萄糖、丙酮酸钠、乳酸钠、谷氨酰胺、非必需氨基酸为能量物质的化合物培养溶液；其中包含：氯化钠97.55mmol/L、氯化钾3.55mmol/L、硫酸镁0.55mmol/L、氯化钙1.88mmol/L、磷酸二氢钠0.22mmol/L、碳酸氢钠4.15mmol/L、HEPES和MOPS 22.5mmol/L、葡萄糖0.54mmol/L、丙酮酸钠0.38mmol/L、乳酸钠22.45mmol/L、谷氨酰胺0.82mmol/L，人血白蛋白14mg/mL、非必须氨基酸10mmol/L、硫酸庆大霉素14μg/mL、聚乙烯吡咯烷酮3g/L、透明质酸酶50IU/ml。

一种用于人类辅助生殖的颗粒细胞去除液的使用方法

在实验室里，将颗粒细胞去除液在37℃的培养箱内预热至少30分钟，然后，将卵子置于含有颗粒细胞去除液的培养皿内；在37℃的环境下孵育60秒，通过显微镜观察，用剥卵吸管(针)机械的去除卵子周围的颗粒细胞，然后洗涤剥除颗粒细胞的卵子，并移到37℃的CO₂培养箱内培养，为单精子注射或者卵子冷冻保存备用。

本发明颗粒细胞去除液与现有的颗粒细胞去除液不同，其添加聚乙烯吡咯烷酮。作为一种合成水溶性高分子化合物,在颗粒细胞去除液中添加2-6g/L浓度的聚乙烯吡咯烷酮，使颗粒细胞去除液中的透明质酸酶顺利与其水溶液中的聚乙烯吡咯烷酮形成络合反应，可保证在使用过程中长效稳定的释放透明质酸酶发生作用。再者聚乙烯吡咯烷酮是一种非离子型高分子化合物，其分子长链可形成胶体保护作用，可持久的保护透明质酸酶不被颗粒细胞去除液中的其他物质降解。其添加的硫酸庆大霉素对革兰阴性和阳性细菌及支原体有抑菌或杀菌作用,比现有配方中的青霉素更能有效地抑制和杀死细菌。且庆大霉素是为数不多的热稳定性的抗生素,而青霉素的钾盐和钠盐的水溶液均很不稳定。其添加的HEPES和MOPS缓冲系统可以避免颗粒细胞去除液对CO₂的依赖性,这一缓冲系统在空气中可以维持生理pH。且具有使细胞膜稳定、不与金属离子结合等优点。颗粒细胞去除液中添加蛋白的作用包括通过结合脂肪酸抑制脂肪的过氧化反应，从而稳定和保护细胞膜；结合各种抗体，重金属、脂蛋白和未明确的毒性物质；维持交替渗透压的稳定。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种用于人类辅助生殖的颗粒细胞去除液及其制备方法，其特征在于，用于处理卵子的颗粒细胞的透明质酸酶溶解于含有聚乙烯吡咯烷酮(Polyvinyl Pyrrolidone,PVP)、抗菌素和人血白蛋白的盐溶液中配制而成。

2.根据权利要求1所述的一种用于人类辅助生殖的颗粒细胞去除液及其制备方法，其特征在于，所述透明质酸酶为透明质酸酶(羊睾丸)，浓度为30～90IU/ml。

3.根据权利要求1所述的一种用于人类辅助生殖的颗粒细胞去除液及其制备方法，其特征在于，所述聚乙烯吡咯烷酮为PVP-K30，浓度为2～6g/L。

4.根据权利要求1所述的一种用于人类辅助生殖的颗粒细胞去除液及其制备方法，其特征在于，所述抗菌素为硫酸庆大霉素,浓度为7～14μg/ml。

5.根据权利要求1所述的一种用于人类辅助生殖的颗粒细胞去除液及其制备方法，其特征在于，所述人血白蛋白浓度为5～15mg/mL。

6.根据权利要求1所述的一种用于人类辅助生殖的颗粒细胞去除液及其制备方法，其特征在于，所述盐溶液是以4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)和3-(N-吗啉基)丙磺酸(MOPS)为缓冲剂，以钠、钾、镁、钙离子为基础，并以葡萄糖、丙酮酸钠、乳酸钠、谷氨酰胺、非必需氨基酸为能量物质的化合物培养溶液；其中包含：氯化钠95.00～105.00mmol/L、氯化钾3.45～6.55mmol/L、硫酸镁0.55～0.65mmol/L、氯化钙1.75～2.22mmol/L、磷酸二氢钠0.18～0.39mmol/L、碳酸氢钠3.85～5.45mmol/L、HEPES和MOPS 15.00～25.00mmol/L、葡萄糖0.38～0.68mmol/L、丙酮酸钠0.28～0.42mmol/L、乳酸钠12.48～23.68mmol/L、谷氨酰胺0.32mmol/L～0.84mmol/L、非必需氨基酸5～15mmol/L。

7.根据权利要求1所述的一种用于人类辅助生殖的颗粒细胞去除液及其制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

(1)称量各种无机盐组分溶于注射级用水中，配制成盐溶液，

A、pH值：7.00～7.40；

B、渗透压：250～310mOsm/Kg；

C、内毒素：＜0.25EU/ml；

D、1细胞鼠胚培养到96h：≥80％的囊胚形成率；

(6)将配置好的溶液进行无菌分装和贴标签。