CN113088486B - 用于分离贴壁细胞的无酶解离液及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了用于分离贴壁细胞的无酶解离液及其制备方法，用于分离贴壁细胞的无酶解离液，包括以下浓度的组分：磷酸氢二钾100～200mg/L、氯化钾200～300mg/L、氯化钠7000～9000mg/L、七水磷酸氢二钠1500～2000mg/L、精氨酸17000～70000mg/L、天冬氨酸钠盐15000～50000mg/L和赖氨酸29000～140000mg/L。本技术方案提出的一种用于分离贴壁细胞的无酶解离液及其制备方法，将天冬氨酸钠盐、赖氨酸和精氨酸进行复配，有利于增强无酶解离液的解离能力，缩短解离时间，且解离后的细胞损伤小，残留物质安全无毒性，以克服现有技术中的不足之处。

Description

用于分离贴壁细胞的无酶解离液及其制备方法
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，尤其涉及一种用于分离贴壁细胞的无酶解离液及其制备方法。
背景技术
细胞培养是指从体内组织取出细胞模拟体内生存环境，在无菌、适当温度及酸碱度和一定的营养条件下，使其生长繁殖并维持结构何功能的一种培养技术。从体内取出的细胞首次培养即为原代培养，这是细胞培养的最初和必经阶段。当原代培养细胞生长到一定时期，受到群体环境限制，就需要转移到另一个容器才能继续生长，这个过程称为传代或继代培养。
目前用于分离贴壁细胞的解离液及其分离方法仍然存在以下存点：对细胞的损伤比较大、毒性大,细胞存活细胞的存活率较低；解离后的贴壁细胞，进行多次细胞传代会影响细胞的活力；操作繁琐，不同操作者之间的实验结果的差异大。
发明内容
本发明的目的在于提出一种用于分离贴壁细胞的无酶解离液及其制备方法，将天冬氨酸钠盐、赖氨酸和精氨酸进行复配，有利于增强无酶解离液的解离能力，缩短解离时间，且解离后的细胞损伤小，残留物质安全无毒性，以克服现有技术中的不足之处。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
用于分离贴壁细胞的无酶解离液，包括以下浓度的组分：磷酸氢二钾100～200mg/L、氯化钾200～300mg/L、氯化钠7000～9000mg/L、七水磷酸氢二钠1500～2000mg/L、精氨酸17000～70000mg/L、天冬氨酸钠盐15000～50000mg/L和赖氨酸29000～140000mg/L。
优选的，包括以下浓度的组分：磷酸氢二钾150～200mg/L、氯化钾200～250mg/L、氯化钠8000～9000mg/L、七水磷酸氢二钠1500～1700mg/L、精氨酸26000～70000mg/L、天冬氨酸钠盐15000～25000mg/L和赖氨酸51000～73000mg/L。
优选的，包括以下浓度的组分：磷酸氢二钾200mg/L、氯化钾200mg/L、氯化钠9000mg/L、七水磷酸氢二钠1500mg/L、精氨酸70000mg/L、天冬氨酸钠盐50000mg/L和赖氨酸140000mg/L。
优选的，所述精氨酸的分子式为C6H14N4O2。
优选的，所述天冬氨酸钠盐的分子式为C4H6NNaO4。
用于分离贴壁细胞的无酶解离液的制备方法，包括以下步骤：
(1)取磷酸氢二钾、氯化钾、氯化钠、七水磷酸氢二钠、精氨酸、天冬氨酸钠盐和赖氨酸，根据上述组分各自的溶解特性分类溶解后混合，得到混合料；
(2)在混合料中加入水，使各组分浓度满足权利要求1～5任意一项所述的用于分离贴壁细胞的无酶解离液，得到混合溶液；
(3)调节混合溶液的pH，得到用于分离贴壁细胞的无酶解离液。
优选的，步骤(2)中，所述水为超纯水。
优选的，步骤(3)中，所述用于分离贴壁细胞的无酶解离液的pH值为7.2～7.4。
本发明的有益效果：
1、本技术方案将天冬氨酸、赖氨酸和精氨酸进行复配，他们之间起到协同作用，可有效解离贴壁的细胞，不含酶即可将细胞解离下来，且对细胞损伤小，无毒副作用，细胞存活率高。
2、本技术方案中添加的磷酸氢二钾、氯化钾、氯化钠和七水磷酸氢二钠均为无机盐，有利于调节解离液的渗透压，确保解离的顺利进行。
附图说明
附图对本发明做进一步说明，但附图中的内容不构成对本发明的任何限制。
图1是人间充质干细胞解离前在显微镜下的形态图。
图2是使用本发明后的人间充质干细胞在显微镜下的形态图。
图3是人皮肤成纤维细胞解离前在显微镜下的形态图。
图4是使用本发明后的人皮肤成纤维细胞在显微镜下的形态图。
图5是仓鼠卵巢细胞解离前在显微镜下的形态图。
图6是使用本发明后的仓鼠卵巢细胞在显微镜下的形态图。
图7是人神经母瘤细胞解离前在显微镜下的形态图。
图8是使用本发明后的人神经母瘤细胞在显微镜下的形态图。
具体实施方式
目前用于分离贴壁细胞的解离液及其分离方法仍然存在以下存点：对细胞的损伤比较大、毒性大,细胞存活细胞的存活率较低；解离后的贴壁细胞，进行多次细胞传代会影响细胞的活力；操作繁琐，不同操作者之间的实验结果的差异大。
为了能增强无酶解离液的解离能力，缩短解离时间，同时保证解离后的细胞损伤小，残留物质安全无毒性，本技术方案提出了一种用于分离贴壁细胞的无酶解离液，包括以下浓度的组分：磷酸氢二钾100～200mg/L、氯化钾200～300mg/L、氯化钠7000～9000mg/L、七水磷酸氢二钠1500～2000mg/L、精氨酸17000～70000mg/L、天冬氨酸钠盐15000～50000mg/L和赖氨酸29000～140000mg/L。
现有技术中对贴壁细胞进行分离一般有两种方法，一种是采用酶对贴壁细胞进行分离，由于酶消化强度大，利用该方法对贴壁细胞进行分离时，会令正常细胞受到损伤；另一种是使用EDTA无酶解离液对贴壁细胞进行分离，由于该分离方法的原理是通过结合细胞的钙镁离子，一般解离细胞后，需要对细胞采用PBS清洗后才能铺板，不然EDTA残留容易导致细胞贴壁率受影响。
为了解决上述技术问题，本技术方案筛选出3种具有解离能力的氨基酸，分别是天冬氨酸、赖氨酸和精氨酸，本技术方案将天冬氨酸、赖氨酸和精氨酸进行复配，他们之间起到协同作用，可有效解离贴壁的细胞，不含酶即可将细胞解离下来，且对细胞损伤小，无毒副作用，细胞存活率高。具体地，Ca2+-Mg2+-ATP酶是细胞膜上的一种蛋白，若降低该酶的活性，可引起细胞收缩，从而细胞会被解离下来。本技术方案中添加的精氨酸，其胍基和Ca2+-Mg2+-ATP酶的芳香烃协同作用，从而能有效降低Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性，同时，赖氨酸和天冬氨酸增加了剪切力，达到对细胞解离的作用。进一步地，磷酸氢二钾、氯化钾、氯化钠和七水磷酸氢二钠均为无机盐，有利于调节解离液的渗透压，确保解离的顺利进行。
本技术方案采用天冬氨酸、赖氨酸和精氨酸的组合对细胞进行分离，对细胞损伤小，无毒副作用，细胞存活率高，能有效克服现有采用酶进行细胞解离而产生的细胞破损问题，且本技术方案解离后的细胞，直接离心弃掉上清液即就可铺板，也有效克服了现有采用EDTA无酶解离液对贴壁细胞进行分离而造成的分离步骤繁琐的问题。
经实验证明，本技术方案的无酶解离液，一般细胞4-6分钟之内即可解离完全。细胞解离过程对细胞的损伤较少，解离完成后再接种，细胞活率高、生长状态良好。本技术方案的无酶解离液，解决了传统有酶解离液对细胞损伤大或无酶解离液EDTA残留对细胞的影响造成的问题。
更进一步说明，包括以下浓度的组分：磷酸氢二钾150～200mg/L、氯化钾200～250mg/L、氯化钠8000～9000mg/L、七水磷酸氢二钠1500～1700mg/L、精氨酸26000～70000mg/L、天冬氨酸钠盐15000～25000mg/L和赖氨酸51000～73000mg/L。
更进一步说明，包括以下浓度的组分：磷酸氢二钾200mg/L、氯化钾200mg/L、氯化钠9000mg/L、七水磷酸氢二钠1500mg/L、精氨酸70000mg/L、天冬氨酸钠盐50000mg/L和赖氨酸140000mg/L。
在研究过程中，发明人无酶解离液中各组分浓度与细胞解离时间和后续解离能力的对应关系进行分析。结果表明：当无酶解离液包括以下浓度的组分：磷酸氢二钾200mg/L、氯化钾200mg/L、氯化钠9000mg/L、七水磷酸氢二钠1500mg/L、精氨酸70000mg/L、天冬氨酸钠盐50000mg/L和赖氨酸140000mg/L，达到极佳的解离效果。
更进一步说明，所述精氨酸的分子式为C6H14N4O2。
具体地，精氨酸的分子式为C6H14N4O2，其为氨基酸类化合物，在人体内参与鸟氨酸循环，促进尿素的形成，使人体内产生的氨经鸟氨酸循环转变成无毒的尿素，由尿中排出，从而降低血氨浓度。有较高浓度的氢离子，有助于纠正肝性脑病时的酸碱平衡。进一步地，精氨酸拥有一种碱性的、易于水解的化学基团-胍基，本技术方案利用精氨酸上的胍基和Ca2+-Mg2+-ATP酶的芳香烃协同作用，从而能有效降低Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性。
更进一步说明，所述天冬氨酸钠盐的分子式为C4H6NNaO4。
在本技术方案的一个实施例中，天冬氨酸钠盐选用L-天冬氨酸钠，具体地，L-天冬氨酸钠的分子式为C4H6NNaO4，其具有优良的显鲜、防腐作用，广泛应用于食品行业的显鲜剂、防腐剂，可替代味精。在医药行业，可作为心脏病类药物、肝功能促进剂、氨解毒剂、疲劳消除剂和氨基酸输液的主要原料。而在本技术方案中，L-天冬氨酸钠可有效增强对细胞的剪切力，同时，其与赖氨酸协同作用，能有效达到对细胞解离的作用。
本技术方案还提出了一种用于分离贴壁细胞的无酶解离液的制备方法，包括以下步骤：
(1)取磷酸氢二钾、氯化钾、氯化钠、七水磷酸氢二钠、精氨酸、天冬氨酸钠盐和赖氨酸，根据上述组分各自的溶解特性分类溶解后混合，得到混合料；
(2)在混合料中加入水，使各组分浓度满足权利要求1～5任意一项所述的用于分离贴壁细胞的无酶解离液，得到混合溶液；
(3)调节混合溶液的pH，得到用于分离贴壁细胞的无酶解离液。
本技术方案还提出了一种用于分离贴壁细胞的无酶解离液的制备方法，步骤简单，操作性强。
更进一步说明，步骤(2)中，所述水为超纯水。
更进一步说明，步骤(3)中，所述用于分离贴壁细胞的无酶解离液的pH值为7.2～7.4。
在本技术方案的一个实施例中，用于分离贴壁细胞的无酶解离液的pH值为7.2～7.4，该pH值能使得解离达到最佳效果，同时，该pH值的环境下，利于细胞生存。
下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。
需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。
实施例1-一种用于分离贴壁细胞的无酶解离液的制备方法
(1)取磷酸氢二钾、氯化钾、氯化钠、七水磷酸氢二钠、精氨酸、天冬氨酸钠盐和赖氨酸，根据上述组分各自的溶解特性分类溶解后混合，得到混合料；
(2)在混合料中加入水，得到混合溶液；
(3)调节混合溶液的pH值为7.2，得到用于分离贴壁细胞的无酶解离液，其中，无酶解离液包括以下浓度的组分：磷酸氢二钾150mg/L、氯化钾250mg/L、氯化钠8000mg/L、七水磷酸氢二钠1700mg/L、精氨酸17000mg/L、天冬氨酸钠盐15000mg/L和赖氨酸29000mg/L。
实施例2-一种用于分离贴壁细胞的无酶解离液的制备方法
(1)取磷酸氢二钾、氯化钾、氯化钠、七水磷酸氢二钠、精氨酸、天冬氨酸钠盐和赖氨酸，根据上述组分各自的溶解特性分类溶解后混合，得到混合料；
(2)在混合料中加入水，得到混合溶液；
(3)调节混合溶液的pH值为7.2，得到用于分离贴壁细胞的无酶解离液，其中，无酶解离液包括以下浓度的组分：磷酸氢二钾100mg/L、氯化钾300mg/L、氯化钠7000mg/L、七水磷酸氢二钠2000mg/L、精氨酸26000mg/L、天冬氨酸钠盐25000mg/L和赖氨酸73000mg/L。
实施例3-一种用于分离贴壁细胞的无酶解离液的制备方法
(1)取磷酸氢二钾、氯化钾、氯化钠、七水磷酸氢二钠、精氨酸、天冬氨酸钠盐和赖氨酸，根据上述组分各自的溶解特性分类溶解后混合，得到混合料；
(2)在混合料中加入水，得到混合溶液；
(3)调节混合溶液的pH值为7.2，得到用于分离贴壁细胞的无酶解离液，其中，无酶解离液包括以下浓度的组分：磷酸氢二钾200mg/L、氯化钾200mg/L、氯化钠9000mg/L、七水磷酸氢二钠1500mg/L、精氨酸35000mg/L、天冬氨酸钠盐25000mg/L和赖氨酸73000mg/L。
实施例4-一种用于分离贴壁细胞的无酶解离液的制备方法
(1)取磷酸氢二钾、氯化钾、氯化钠、七水磷酸氢二钠、精氨酸、天冬氨酸钠盐和赖氨酸，根据上述组分各自的溶解特性分类溶解后混合，得到混合料；
(2)在混合料中加入水，得到混合溶液；
(3)调节混合溶液的pH值为7.2，得到用于分离贴壁细胞的无酶解离液，其中，无酶解离液包括以下浓度的组分：磷酸氢二钾200mg/L、氯化钾200mg/L、氯化钠9000mg/L、七水磷酸氢二钠1500mg/L、精氨酸70000mg/L、天冬氨酸钠盐50000mg/L和赖氨酸140000mg/L。
实验 解离液解离细胞
采用本发明实施例1-4的用于分离贴壁细胞的无酶解离液来解离细胞，同时以传统EDTA消化液(武汉普诺赛生物科技有限公司产品)；
(1)解离时间对比：对比本发明实施例1-4的无酶解离液和传统EDTA消化液将细胞完全解离下来所用的时间，如下表1所示：
Figure BDA0002959691170000081
(2)解离采用本发明实施例3的用于分离贴壁细胞的无酶解离液来解离细胞，对比不同细胞解离前后的电镜图片，如图1～8所示。
由图可知，经过本技术方案的用于分离贴壁细胞的无酶解离液处理后，细胞均可正常解离。
以上结合具体实施例描述了本发明的技术原理。这些描述只是为了解释本发明的原理，而不能以任何方式解释为对本发明保护范围的限制。基于此处的解释，本领域的技术人员不需要付出创造性的劳动即可联想到本发明的其它具体实施方式，这些方式都将落入本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种用于分离贴壁细胞的无酶解离液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）取磷酸氢二钾、氯化钾、氯化钠、七水磷酸氢二钠、精氨酸、天冬氨酸钠盐和赖氨酸，根据上述组分各自的溶解特性分类溶解后混合，得到混合料；
（2）在混合料中加入水，得到混合溶液；其中，磷酸氢二钾的浓度为200mg/L、氯化钾的浓度为200mg/L、氯化钠的浓度为9000mg/L、七水磷酸氢二钠的浓度为1500mg/L、精氨酸的浓度为35000mg/L、天冬氨酸钠盐的浓度为25000mg/L和赖氨酸的浓度为73000mg/L；
（3）调节混合溶液的pH，得到用于分离贴壁细胞的无酶解离液。
2.如权利要求1所述的用于分离贴壁细胞的无酶解离液的制备方法，其特征在于：步骤（2）中，所述水为超纯水。
3.根据权利要求1所述的用于分离贴壁细胞的无酶解离液的制备方法，其特征在于：步骤（3）中，所述用于分离贴壁细胞的无酶解离液的pH值为7.2～7.4。
4.根据权利要求1~3任一项所述的制备方法制备获得的无酶解离液。
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