CN106906271A - 骨髓间充质干细胞来源的外分泌体的应用及其试验方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种骨髓间充质干细胞来源的外分泌体的应用，将该种外分泌体应用于提高骨髓瘤病人的骨髓瘤细胞药物敏感性，克服了传统的技术偏见。本发明还提供了一种验证该种应用的试验方法，该试验方法可以证明，通过将髓瘤病人骨髓瘤细胞与髓瘤病人间充质干细胞来源的外分泌体进行共同培养，使得髓瘤病人骨髓瘤细胞的药物敏感性得到提高，在对其进行用药后可以发现，骨髓瘤细胞的活细胞数目显著下降，并且呈现出剂量依赖和时间依赖性。由此可见，骨髓瘤病人间充质干细胞来源的外分泌体可以显著的提高骨髓瘤细胞对药物的敏感性，可以将其用于骨髓瘤病人的治疗，对于骨髓瘤治疗领域具有深远意义。

Description

骨髓间充质干细胞来源的外分泌体的应用及其试验方法

技术领域

本发明涉及生命科学领域，具体涉及一种骨髓瘤病人骨髓间充质干细胞来源的外分泌体在提高骨髓瘤细胞药物敏感性中的应用，还涉及一种验证该种应用效果的试验方法。

背景技术

外分泌体（exosome）是由多种细胞分泌到细胞外的小囊泡，具有抗原呈递和诱导抗肿瘤免疫作用。长期以来，细胞来源的外分泌体被认为是无意义的细胞残核，但近年来的研究发现，它是促进细胞间信息交流的重要机制，能稳定存在于人体血液等多种体液中。

外分泌体最早是由Johnstone等人在研究网织红细胞向成熟红细胞转变过程中发现的。它是一种直径约30~100nm，密度介于1.13~1.21g/cm3、双凹圆盘状、外包双层脂质膜的囊泡。蛋白质占据了外分泌体的绝大部分内容物，包括参与其结构形成的蛋白质，如微管蛋白、肌动蛋白等细胞骨架成分，多分布于外分泌体的表面或内腔中；还有膜转运和融合相关蛋白，如Flotillin1、TSG101等以及四跨膜蛋白CD9、CD81。来源于外分泌体的miRNA在干细胞分化的调控、胚胎发育和器官发生、造血和肿瘤发生等生理和病理过程中起重要调节作用。

间充质干细胞来源的外分泌体包含MSC特异性的mRNA，如神经性的RAX2、成骨性的BMPl5、上皮性的CEACAM5以及造血性的EPX等。不同来源的外分泌体有其特异的蛋白和不同的行使功能的关键分子。例如源于网织红细胞的外泌体富含转铁蛋白受体，源于抗原提呈细胞的外泌体含有主要组织相容性复合体Ⅰ、Ⅱ类分子及其共刺激分子，肿瘤细胞自身分泌的外泌体表面富含主要组织相容性复合体分子、伴侣分子热休克蛋白和肿瘤相关抗原。

发明内容

本发明目的是提供一种骨髓瘤病人骨髓间充质干细胞来源的外分泌体的新应用，以提高骨髓瘤病人骨髓瘤细胞的药物敏感性，同时本发明还提供了一种测试髓瘤病人骨髓间充质干细胞来源的外分泌体对骨髓瘤细胞药物敏感性的试验方法。

本发明的技术方案是：一种骨髓间充质干细胞来源的外分泌体的应用，具体应用于提高骨髓瘤病人的骨髓瘤细胞的药物敏感性。

一种骨髓瘤病人骨髓间充质干细胞来源的外分泌体对骨髓瘤细胞药物敏感性影响的试验方法，包括以下步骤：

1）外分泌体的提取

一种可快速从细胞外液中提取外分泌体的方法，提取出的外分泌体量较大，可以保证无菌，且可以用于后续的生物活性实验。具体的步骤如下：

1.1）血清去除外分泌体：血清用超速离心机在4℃条件下，100000xg离心2h，去除沉淀，然后取上清用0.22μm滤膜过滤除菌，即可得到无菌的无外分泌体的血清，抽滤完成后于4℃保存备用；

1.2）细胞用含有10%无外分泌体血清的培养基培养，培养24~72h后可用于提取细胞分泌到细胞外液中的外分泌体；

1.3）16%PEG储存液的制备：称取5.944g氯化钠和16g PEG8000，溶解于100ml去离子水中，磁力搅拌器搅拌溶解完成后用0.22μm滤膜过滤除菌，即可得到无菌的16%PEG储存液，4℃保存备用；

1.4）取步骤1.2）中由含10%无外分泌体血清的培养基培养的细胞悬液于15ml离心管中，1000rpm离心5min，去除细胞；

1.5）然后转移步骤1.4）中15ml离心管内的上清于一支15ml离心管中，3000rpm~4000rpm离心30min，去除细胞碎屑及大的囊泡；

1.6）接着吸取步骤1.5）中15ml离心管内的上清于另一支15ml离心管中，加入等体积的16%PEG储存液，使得PEG的工作浓度达到8%，4℃过夜孵育，使其聚集沉降；

1.7）次日，将步骤1.6）中得到的细胞上清和PEG混合液于3000rpm~4000rpm条件下离心60min，离心完成后去上清，所得沉淀即为从细胞外液中所提取到的外分泌体。

2）外分泌体的定量

2.1）取步骤1.6）中得到的细胞上清和PEG混合液1ml，于3000rpm~4000rpm条件下离心60min，离心完成后去上清，所得沉淀即为从细胞外液中所提取到的外分泌体；

2.2）向步骤2.1）中提取到的外分泌体中加入100ul 1×细胞裂解液，超声波破碎仪破碎五次，使其充分裂解，然后用BCA蛋白定量法测定浓度，即可知道1ml细胞上清和PEG混合液中可提取的外分泌体的量；

2.3）根据比例，取不同体积同批次的细胞上清和PEG混合液于3000rpm~4000rpm条件下离心60min，即可得到不同量的外分泌体，用于后续的细胞活性实验。

3）外分泌体活性实验

3.1）按照步骤2）的方法提取出不同量的外分泌体；

3.2）铺板5×105骨髓瘤细胞于96孔细胞板中，加入不同量的外分泌体；

3.3）培养一段时间后，于每孔中加入对骨髓瘤半致死浓度的咔菲佐米，37℃，5%CO2条件下培养3~4天；

3.4）然后于每孔中加入10ul CCK8，37℃，5%CO2条件下培养1~2h后，用酶标仪测定450nm处的吸光度值。

本发明的优点是：

本发明克服了传统的技术偏见，提供了一种骨髓瘤病人间充质干细胞来源的外分泌体的新应用，具体用于提高骨髓瘤病人骨髓瘤细胞的药物敏感性。本发明同时提供的试验方法可以证明，通过将骨髓瘤病人骨髓瘤细胞与骨髓瘤病人间充质干细胞来源的外分泌体进行共同培养，使得骨髓瘤病人骨髓瘤细胞的药物敏感性得到提高，在对其进行用药后可以发现，骨髓瘤细胞的活细胞数目显著下降，并且呈现出剂量依赖和时间依赖性。由此可见，骨髓瘤病人间充质干细胞来源的外分泌体可以显著的提高骨髓瘤细胞对药物的敏感性，可以将其用于骨髓瘤病人的治疗，对于骨髓瘤治疗领域具有深远意义。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。本发明的具体实施方式由以下实施例及其附图详细给出。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1为与骨髓瘤病人间充质干细胞来源的外分泌体共同培养24小时后的骨髓瘤细胞u266对药物敏感性影响的剂量依赖性曲线图。

图2为与骨髓瘤病人间充质干细胞来源的外分泌体共同培养48小时后的骨髓瘤细胞u266对药物敏感性影响的剂量依赖性曲线图。

图3为与骨髓瘤病人间充质干细胞来源的外分泌体共同培养24、48、72小时后的骨髓瘤细胞u266对药物敏感性影响的时间依赖性曲线图。

具体实施方式

下面将参照附图并结合实施例，来详细说明本发明。

一种骨髓间充质干细胞来源的外分泌体的应用，具体应用于提高骨髓瘤病人的骨髓瘤细胞的药物敏感性。

一种骨髓瘤病人骨髓间充质干细胞来源的外分泌体对骨髓瘤细胞药物敏感性影响的试验方法，包括以下步骤：

1）外分泌体的提取

一种可快速从细胞外液中提取外分泌体的方法，提取出的外分泌体量较大，可以保证无菌，且可以用于后续的生物活性实验。具体的步骤如下：

1.1）血清去除外分泌体：血清用超速离心机在4℃条件下，100000xg离心2h，去除沉淀，然后取上清用0.22μm滤膜过滤除菌，即可得到无菌的无外分泌体的血清，抽滤完成后于4℃保存备用；

1.2）细胞用含有10%无外分泌体血清的培养基培养，培养24~72h后可用于提取细胞分泌到细胞外液中的外分泌体；

1.3）16%PEG储存液的制备：称取5.944g氯化钠和16g PEG8000，溶解于100ml去离子水中，磁力搅拌器搅拌溶解完成后用0.22μm滤膜过滤除菌，即可得到无菌的16%PEG储存液，4℃保存备用；

1.4）取步骤1.2）中由含10%无外分泌体血清的培养基培养的细胞悬液于15ml离心管中，1000rpm离心5min，去除细胞；

1.5）然后转移步骤1.4）中15ml离心管内的上清于一支15ml离心管中，3000rpm~4000rpm离心30min，去除细胞碎屑及大的囊泡；

1.6）接着吸取步骤1.5）中15ml离心管内的上清于另一支15ml离心管中，加入等体积的16%PEG储存液，使得PEG的工作浓度达到8%，4℃过夜孵育，使其聚集沉降；

1.7）次日，将步骤1.6）中得到的细胞上清和PEG混合液于3000rpm~4000rpm条件下离心60min，离心完成后去上清，所得沉淀即为从细胞外液中所提取到的外分泌体。

2）外分泌体的定量

2.1）取步骤1.6）中得到的细胞上清和PEG混合液1ml，于3000rpm~4000rpm条件下离心60min，离心完成后去上清，所得沉淀即为从细胞外液中所提取到的外分泌体；

2.2）向步骤2.1）中提取到的外分泌体中加入100ul 1×细胞裂解液，超声波破碎仪破碎五次，使其充分裂解，然后用BCA蛋白定量法测定浓度，即可知道1ml细胞上清和PEG混合液中可提取的外分泌体的量；

2.3）根据比例，取不同体积同批次的细胞上清和PEG混合液于3000rpm~4000rpm条件下离心60min，即可得到不同量的外分泌体，用于后续的细胞活性实验。

3）外分泌体活性实验

3.1）按照步骤2）的方法提取出不同量的外分泌体；

3.2）铺板5×105骨髓瘤细胞于96孔细胞板中，加入不同量的外分泌体；

3.3）培养一段时间后，于每孔中加入对骨髓瘤半致死浓度的咔菲佐米，37℃，5%CO2条件下培养3~4天；

3.4）然后于每孔中加入10ul CCK8，37℃，5%CO2条件下培养1~2h后，用酶标仪测定450nm处的吸光度值。

为了测试骨髓瘤病人骨髓间充质干细胞来源的外分泌体对于提高骨髓瘤细胞药物敏感性的作用，本发明的实施例分别对药敏感骨髓瘤病人间充质干细胞来源外分泌体对骨髓瘤细胞活力影响的剂量依赖性和时间依赖性进行试验。

实施例1

测试药敏感骨髓瘤病人间充质干细胞来源外分泌体对骨髓瘤细胞活力影响的剂量依赖性。

（1）骨髓瘤患者的间充质干细胞更换10%无外分泌体血清的DMEM低糖培养基培养，培养48h后提取外分泌体；

（2）取间充质干细胞上清液于15ml离心管中，1000rpm离心5min，去除细胞；

（3）然后转移细胞液上清于另一根15ml离心管中，4000rpm离心30min，去除细胞碎屑及大的囊泡；

（4）吸取上一步离心得到的上清于第三根15ml离心管中，加入与上清液等体积的16%PEG储存液，使得PEG的工作浓度达到8%，4℃过夜孵育，使其聚集沉降；

（5）次日，取1ml上一步的细胞上清和PEG混合液于4000rpm条件下离心60min，离心完成后去上清，所得沉淀即为从细胞外液中所提取到的外分泌体；

（6）所得外分泌体用100ul 1×细胞裂解液，超声波破碎仪破碎五次，使其充分裂解，然后用BCA蛋白定量法测定其浓度；测得1ml细胞上清和PEG混合液中所含外分泌体为15ug；

（7）分别取1ml、2ml、3ml细胞上清和PEG混合液于15ml离心管中，4000rpm条件下离心60min，离心完成后去上清，所得外分泌体用20ul 1640培养基重悬；

（8）铺板5×105骨髓瘤细胞u266于96孔细胞板中，每个梯度设置三个复孔，每孔80ul细胞悬液，然后加入20ul外分泌体悬液，同时以无细胞的培养基作为空白对照，每孔加100ul1640培养基，以不加外分泌体作为阴性对照，即每孔100ul 细胞悬液；

（9）二者共培养24h或48h后每孔加入相应浓度的咔菲佐米，使其在体系中的浓度为19nM，即测得的咔菲佐米对骨髓瘤细胞u266的IC50值，37℃，5%CO2条件下培养3天后加入CCK8检测其吸光度；

（10）在上述96孔细胞板中每孔加入10ul CCK8，37℃，5%CO2条件下培养1~2h后用酶标仪测定其在450nm处的吸光度值，然后根据软件算得其细胞活力的变化。

图1和图2为与骨髓瘤病人间充质干细胞来源的外分泌体共同培养24和48小时后的骨髓瘤细胞u266对药物敏感性影响的剂量依赖性曲线图。

参见图1和图2所示，加入骨髓瘤病人间充质干细胞来源的外分泌体后，骨髓瘤细胞u266的活细胞数目显著下降，并且呈现出剂量依赖，由此可见，骨髓瘤病人间充质干细胞来源的外分泌体可以显著的提高骨髓瘤细胞对药物的敏感性，并且有一定的剂量依赖性。

实施例2

测试药敏感骨髓瘤病人间充质干细胞来源外分泌体对骨髓瘤细胞活力影响的时间依赖性。

（1）骨髓瘤患者来源的间充质干细胞更换含有10%无外分泌体血清的DMEM低糖培养基培养，培养72h后提取外分泌体；

（2）取间充质干细胞上清液于15ml离心管中，1000rpm离心5min，去除细胞；

（3）、然后转移细胞液上清于另一根15ml离心管中，4000rpm离心30min，去除细胞碎屑及大的囊泡；

（4）吸取上一步离心得到的上清于第三根15ml离心管中，加入与上清液等体积的16%PEG储存液，使得PEG的工作浓度达到8%，4℃过夜孵育，使其聚集沉降；

（5）次日，取1ml上一步得到的细胞上清和PEG混合液于4000rpm条件下离心60min，离心完成后去上清，所得沉淀即为从细胞外液中所提取到的外分泌体；

（6）所得外分泌体用100ul 1×细胞裂解液，超声波破碎仪破碎五次，使其充分裂解，然后用BCA蛋白定量法测定其浓度；测得1ml细胞上清和PEG混合液中所含外分泌体为15ug；

（7）分别取1ml、2ml细胞上清和PEG混合液于15ml离心管中，4000rpm条件下离心60min，离心完成后去上清，所得外分泌体用20ul 1640培养基重悬；

（8）铺板5×105骨髓瘤细胞u266于96孔细胞板中，每个梯度设置三个复孔，每孔80ul细胞悬液，然后加入20ul外分泌体悬液，同时以无细胞的培养基作为空白对照，每孔加100ul1640培养基，以不加外分泌体作为阴性对照，即每孔100ul 细胞悬液；

（9）二者共培养24h、48h、72h后每孔加入相应浓度的咔菲佐米，使其在体系中的浓度为19nM，即测得的咔菲佐米对骨髓瘤细胞u266的IC50值，37℃，5%CO2条件下培养3天后加入CCK8检测其吸光度；

（10）在上述96孔细胞板中每孔加入10ul CCK8，37℃，5%CO2条件下培养1~2h后用酶标仪测定其在450nm处的吸光度值，然后根据软件算得其细胞活力的变化。

图3即为与骨髓瘤病人间充质干细胞来源的外分泌体共同培养24、48、72小时后的骨髓瘤细胞u266对药物敏感性影响的时间依赖性曲线图。

参见图3所示，加入骨髓瘤病人间充质干细胞来源的外分泌体后，骨髓瘤细胞u266的活细胞数目显著下降，并且呈现出时间依赖，由此可见，骨髓瘤病人间充质干细胞来源的外分泌体可以显著的提高骨髓瘤细胞对药物的敏感性，并且有一定的时间依赖性。

当然上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明主要技术方案的精神实质所做的修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种骨髓间充质干细胞来源的外分泌体的应用，其特征在于：该种外分泌体用于提高骨髓瘤病人的骨髓瘤细胞的药物敏感性。

2.一种用于验证如权利要求1所述的应用的试验方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）外分泌体的提取

1.1）血清去除外分泌体：血清用超速离心机在4℃条件下，100000xg离心2h，去除沉淀，然后取上清用0.22μm滤膜过滤除菌，即可得到无菌的无外分泌体的血清，抽滤完成后于4℃保存备用；

1.2）细胞用含有10%无外分泌体血清的培养基培养，培养24~72h后可用于提取细胞分泌到细胞外液中的外分泌体；

1.3）16%PEG储存液的制备：称取5.944g氯化钠和16g PEG8000，溶解于100ml去离子水中，磁力搅拌器搅拌溶解完成后用0.22μm滤膜过滤除菌，即可得到无菌的16%PEG储存液，4℃保存备用；

1.4）取步骤1.2）中由含10%无外分泌体血清的培养基培养的细胞悬液于15ml离心管中，1000rpm离心5min，去除细胞；

1.5）然后转移步骤1.4）中15ml离心管内的上清于一支15ml离心管中，3000rpm~4000rpm离心30min，去除细胞碎屑及大的囊泡；

1.6）接着吸取步骤1.5）中15ml离心管内的上清于另一支15ml离心管中，加入等体积的16%PEG储存液，使得PEG的工作浓度达到8%，4℃过夜孵育，使其聚集沉降；

1.7）次日，将步骤1.6）中得到的细胞上清和PEG混合液于3000rpm~4000rpm条件下离心60min，离心完成后去上清，所得沉淀即为从细胞外液中所提取到的外分泌体；

2）外分泌体的定量

2.1）取步骤1.6）中得到的细胞上清和PEG混合液1ml，于3000rpm~4000rpm条件下离心60min，离心完成后去上清，所得沉淀即为从细胞外液中所提取到的外分泌体；

2.2）向步骤2.1）中提取到的外分泌体中加入100ul 1×细胞裂解液，超声波破碎仪破碎五次，使其充分裂解，然后用BCA蛋白定量法测定浓度，即可知道1ml细胞上清和PEG混合液中可提取的外分泌体的量；

2.3）根据比例，取不同体积同批次的细胞上清和PEG混合液于3000rpm~4000rpm条件下离心60min，即可得到不同量的外分泌体，用于后续的细胞活性实验；

3）外分泌体活性实验

3.1）按照步骤2）的方法提取出不同量的外分泌体；

3.2）铺板5×105骨髓瘤细胞于96孔细胞板中，加入不同量的外分泌体；

3.3）培养一段时间后，于每孔中加入对骨髓瘤半致死浓度的咔菲佐米，37℃，5%CO2条件下培养3~4天；

3.4）然后于每孔中加入10ul CCK8，37℃，5%CO2条件下培养1~2h后，用酶标仪测定450nm处的吸光度值。