CN116121191A - 一种人乳腺恶性叶状肿瘤细胞系sysh-mpt-04及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及动物细胞系模型技术领域，公开了一种人乳腺恶性叶状肿瘤细胞株及其子代细胞系和应用。该细胞系命名为人乳腺恶性叶状肿瘤细胞系SYSH‑MPT‑04，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC，NO.C2022190。该细胞系不需要进行永生化处理，可稳定体外无限传代，培养工艺简单，成本低，特别适宜量产市场化。可作为细胞模型对研究人乳腺恶性叶状肿瘤生物学特性及治疗药物具有促进作用。
Description
技术领域
本发明涉及动物细胞系模型技术领域，尤其是一种人乳腺恶性叶状肿瘤细胞系及其建立方法和应用。
背景技术
人乳腺叶状肿瘤是一种较为罕见的纤维上皮性肿瘤，发病率约为全部乳腺肿瘤的1％。恶性叶状肿瘤预后差，复发率高达65％，可通过血行转移，转移率高达43.1％。研究发现恶性叶状肿瘤对放疗、化疗、免疫治疗均不敏感，因此恶性叶状肿瘤患者常因全身多处转移而死亡。目前医药界对人乳腺叶状恶性肿瘤的生物学和其抗肿瘤药物的相关研究还处于初步阶段，原因主要有两方面:一是人乳腺叶状恶性肿瘤较为罕见，二是市面上难以获得稳定数量足够的细胞模型。人乳腺恶性叶状肿瘤的研究主要基于该肿瘤原代细胞，然而分离肿瘤原代细胞的耗费大，周期长，使得人乳腺恶性叶状肿瘤的致病机制、发生发展机制、治疗靶点、抗肿瘤药物筛选等方面的研究均受到了限制。
细胞系通常指能在体外传代大于50代的细胞。一些细胞在外界的刺激下可获得无限增殖的能力，而大多数细胞在体外传代次数是有限的，人们可以通过转染外源永生化基因(如HPV、SV40T等病毒基因)使这些细胞获得永生化能力。例如，公布号为CN111019898A、CN114717190A的中国专利申请公开的两种人乳腺恶性叶状肿瘤细胞系均通过转染外源永生化基因获得。然而，构建永生化细胞株的成本高，且由于插入了外源基因，对细胞的代谢和通路产生一定的影响,较难获得稳定的子代细胞系。
通过非转染的常规方法体外培养细胞系，因原代细胞株的特性不同，大多数细胞在体外传代次数有限，亦很难获得生物遗传性状稳定的子代细胞系，且生长速度慢，不适合量产市场化。因此，寻求一种适合稳定传代，培养工艺简单具有代表性的细胞株(系)是非常必要的。
发明内容
基于上述问题，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足，提供一种人恶性叶状肿瘤细胞株SYSH-MPT-04及其子代细胞系，并进一步公开其细胞系的建立方法和相关应用。该细胞株(系)来源于中国人乳腺恶性叶状肿瘤组织提取的原代细胞，该细胞株和细胞系不需要进行永生化处理，可稳定体外无限传代，特别适合量产市场化培养。
本发明的细胞系命名为人乳腺恶性叶状肿瘤细胞系SYSH-MPT-04(简称细胞系SYSH-MPT-04)，其细胞株命名为人乳腺恶性叶状肿瘤细胞株SYSH-MPT-04(简称细胞株SYSH-MPT-04)，该细胞系保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2022年6月28日；保藏地址为：中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC,NO.C2022190。
本发明的细胞株的子代细胞系的建立方法，包括以下步骤：取对数生长期的细胞株SYSH-MPT-04在体外培养传代，细胞培养条件为：37℃，5％CO2细胞培养箱；所用培养基为DMEM/F12培养基，该培养基中含有终浓度为20ng/mL的表皮细胞生长因子,0.5mg/mL的氢化可的松,10ug/mL的胰岛素，以及占所述培养基总体积1％的青链霉素双抗；传代时，用胰酶消化细胞，按1:2的比例传代。
本发明细胞株及其子代细胞系的应用：
1.本细胞系SYSH-MPT-04在作为人乳腺恶性叶状肿瘤细胞模型或动物模型中的应用，所述的应用范围包括在研究人乳腺恶性叶状肿瘤致病、发生、发展、转移和耐药机制，相关信号通路和药物靶点方面的应用。
2.本细胞系SYSH-MPT-04在筛选和评估人乳腺恶性叶状肿瘤诊断或检测试剂中的应用。
3.本细胞系SYSH-MPT-04在筛选和评估治疗人乳腺恶性叶状肿瘤药物中的应用。
本发明的细胞株(系)SYSH-MPT-04具有以下优点：
1.本发明的细胞系不需要进行永生化处理，在常规培养条件下能在体外无限传代，生长速度快，易于培养，生物遗传性状稳定，保留了其原代细胞的增殖、克隆形成、迁移、侵袭和克隆形成能力，α-SMA和FAP的表达水平与原代细胞相似，在21个STR位点的拷贝数也与原代细胞相同。因此细胞系SYSH-MPT-04能代表原代细胞，用于人乳腺恶性叶状肿瘤体外生物学功能的研究。
2.培养工艺简单，成本低，特别适宜量产市场化，可填补目前市面上缺乏人乳腺恶性叶状肿瘤细胞系模型的空白。对人乳腺恶性叶状肿瘤生物学特性及治疗药物研究方面具有很大的促进作用。
附图说明
图1是本发明细胞系SYSH-MPT-04经4％多聚甲醛固定，结晶紫染色后在光学显微镜下的照片。
图2是人乳腺恶性叶状肿瘤细胞系HJP-0320所对应的原代细胞MPTPC1、本发明细胞系SYSH-MPT-04及对应原代细胞MPTPC4的传代状况照片(A)及CCK8检测的增殖速率图(B)。
图3是本发明细胞系SYSH-MPT-04及原代细胞MPTPC1、MPTPC4克隆形成、迁移、侵袭能力试验的结果图。
图4是本发明细胞系SYSH-MPT-04及其原代细胞MPTPC4中恶性叶状肿瘤标志物α-SMA和FAP的mRNA(A)和蛋白质(B)表达水平试验结果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
本发明的人乳腺恶性叶状肿瘤细胞系SYSH-MPT-04通过以下方法获得：
1.肿瘤标本来源：分离MPTPC1的人乳腺恶性叶状肿瘤标本来源于47岁女性患者的右乳肿物，MPTPC1是人恶性叶状肿瘤细胞系HJP-0320的原代细胞，公开于公布号为CN111019898A的专利申请中。
分离SYSH-MPT-04的恶性叶状肿瘤标本来源于51岁女性患者的右乳肿物，肿物大小为9cm×8.2cm×6.1cm。该患者本次术后又出现了2次复发，复发间期约6个月，在最后一次复发切除肿瘤后11个月，患者出现咳嗽并发现双肺多发转移灶。这些临床数据说明该例恶性叶状肿瘤恶性程度高，有较强的增殖、侵袭能力，是代表性的人乳腺恶性叶状肿瘤。
2.肿瘤原代细胞的分离和培养：用无菌手术刀将上述肿瘤组织正中切开，取活力旺盛增生活跃的组织，用无菌PBS洗涤3次，去除其中的脂肪组织和坏死组织后用无菌手术刀将组织剁成糊状，转移至50mL离心管中，加入含有Ⅲ型胶原酶消化(1mg/mL，Worthington)的DMEM/F12，锡箔纸避光，37度消化1小时。消化后的细胞悬液用70μm的滤网过滤，随后250g离心10min，沉淀用PBS洗涤1次后接种于培养皿。细胞培养条件为：37℃，5％CO2细胞培养箱，所用培养基为Invitrogen品牌的DMEM/F12培养基；其中添加终浓度为20ng/mL,Peprotech品牌的表皮细胞生长因子；0.5mg/mL,Sigma品牌的氢化可的松；10ug/mL,Sigma品牌的胰岛素；以及占所述培养基总体积1％,Invitrogen品牌的青链霉素双抗；传代时，用Gibco品牌的Tryple胰酶消化细胞，按1:2的比例传代。
3.持续传代：在体外持续传代培养上述人乳腺恶性叶状肿瘤原代细胞，观察细胞形态、增殖速度的改变。第3-5代的早期恶性叶状肿瘤原代细胞(Early MPTPC1)形态呈长梭形，当传代至第15代以后，晚期原代细胞Later MPTPC1的形态发生改变，变成肥大的不规则型，且增殖速率明显变慢。而MPTPC4传至62代以上，该细胞仍维持原本长梭形的间质细胞形态，并保留了较快的增殖速度(见图2)，说明该细胞为可无限传代的人乳腺恶性叶状肿瘤细胞系，命名为人乳腺恶性叶状肿瘤细胞系SYSH-MPT-04，形态如图1所示。
实施例2
对实施例1得到的人乳腺恶性叶状肿瘤细胞系SYSH-MPT-04进行鉴定，具体包括以下几个方面：
1.体外功能实验：比较早期、晚期人乳腺恶性叶状肿瘤原代细胞MPTPC1、人乳腺恶性叶状肿瘤细胞系SYSH-MPT-04与其原代细胞的体外细胞增殖、克隆形成、迁移、侵袭和胶原收缩能力。
细胞增殖实验：将细胞种在Corning品牌的96孔细胞培养板，每孔种1000个细胞，每组3个复孔，每隔24h吸去培养基，加入含10μL APExBio品牌的CCK8的无血清培养基，37度孵育2h后用酶标仪检测450nm处的吸光值，共检测0、24、48、72、96h五个时间点。
克隆形成实验：将细胞种在Corning品牌的6孔细胞培养板，每孔种100个细胞，每组3个复孔，每3天更换培养基，10天后去培养基，PBS洗1遍，加入1mL 4％多聚甲醛固定15min，加入结晶紫染色15min，用水冲洗，晾干后计数克隆数目。
细胞迁移实验：Corning品牌的transwell小室上室加入200μL含20000个细胞的无血清培养基，下室加入600μL完全培养基。37度培养24h后收集小室，4％多聚甲醛固定15min，结晶紫染色15min，用水冲洗后晾干，镜下随机5个视野计数细胞个数，取平均值。
细胞侵袭实验：按1：8比例用无血清培养基稀释BD品牌的基质胶，预先在transwell小室上室底部铺一层基质胶，其余步骤同迁移实验。
胶原收缩实验：将细胞与Corning品牌的酸溶性胶原蛋白Ⅰ混合，随后将胶原蛋白/细胞混合物接种到包覆牛血清白蛋白的24孔细胞培养板中，37度孵育30min后即向每孔加入1mL培养基。培养36h后，对胶原凝胶进行显像，并测量凝胶的收缩长度。
结果如图3，Later MPTPC1的增殖、克隆形成、迁移、侵袭和胶原收缩能力明显低于Early MPTPC1，而人乳腺恶性叶状肿瘤细胞系SYSH-MPT-04的体外生物学功能与原代细胞相同。
2.实时荧光定量PCR、免疫荧光：比较人乳腺恶性叶状肿瘤细胞系SYSH-MPT-04与其原代细胞中恶性叶状肿瘤标志物(α-SMA和FAP)的表达水平。
实时荧光定量PCR：消化细胞后用ESscience品牌的RNA快速提取试剂盒提取总RNA。取1μg RNA用诺唯赞品牌的
II Q RT SuperMix试剂盒去除基因组DNA，用ChamQ
qPCR Master Mix试剂盒逆转录为cDNA。配制以下反应体系：3.4μL cDNA，5μLChamQ SYBR qPCR Green Master Mix，0.6μL引物混合物，1μL DEPC水。在实时荧光定量PCR仪器上进行以下程序反应：95度30sec预变性；95度10sec，60度30sec，循环反应40次；95度15sec，60度60sec，95度15sec采集融解曲线。
免疫荧光：用4％多聚甲醛固定细胞，索莱宝品牌的0.1％Triton X-100破膜，用山羊血清封闭30min后以1：50的比例加入R&D品牌的α-SMA和Abcam品牌的FAP的抗体，于4度孵育过夜；用PBST洗后以1：50的比例加入中杉金桥品牌的荧光二抗，室温孵育2h，PBST洗后加入DAPI染液孵育15min，PBST洗后于共聚焦显微镜采集照片。
结果如图4，人乳腺恶性叶状肿瘤细胞系SYSH-MPT-04与原代细胞中α-SMA和FAP的mRNA和蛋白质表达水平相似。
3.STR鉴定：对人乳腺恶性叶状肿瘤细胞系SYSH-MPT-04及其原代细胞进行STR鉴定。结果如表1，人乳腺恶性叶状肿瘤细胞系SYSH-MPT-04在21个STR位点的拷贝数与原代细胞完全匹配，说明人乳腺恶性叶状肿瘤细胞系SYSH-MPT-04与原代细胞是同源的，没有被其他细胞污染。
表1
以上结果说明，人乳腺恶性叶状肿瘤细胞系SYSH-MPT-04不需要进行永生化处理，在常规培养条件下能在体外无限传代，生长速度快，易于培养，性状稳定，保留了其原代细胞的增殖、克隆形成、迁移、侵袭和克隆形成能力，α-SMA和FAP的表达水平与原代细胞相似，在21个STR位点的拷贝数也与原代细胞相同。因此人乳腺恶性叶状肿瘤细胞系SYSH-MPT-04能代表原代细胞，用于人乳腺恶性叶状肿瘤体外生物学功能的研究。
Claims (8)
1.一种人乳腺恶性叶状肿瘤细胞株，其特征在于：所述细胞株命名为人乳腺恶性叶状肿瘤细胞株SYSH-MPT-04，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC,NO.C2022190。
2.如权利要求1所述的细胞株的子代细胞系。
3.如权利要求2所述的子代细胞系的建立方法，包括以下步骤：取对数生长期的人乳腺恶性叶状肿瘤细胞株SYSH-MPT-04在体外培养传代，细胞培养条件为：37℃，5％CO2细胞培养箱；所用培养基为DMEM/F12培养基，该培养基中含有终浓度为20ng/mL的表皮细胞生长因子,0.5mg/mL的氢化可的松,10ug/mL的胰岛素，以及占所述培养基总体积1％的青链霉素双抗；传代时，用胰酶消化细胞，按1:2的比例传代。
4.如权利要求1所述的细胞株或权利要求2所述的细胞系在作为人乳腺恶性叶状肿瘤细胞模型中的应用。
5.如权利要求1所述的细胞株或权利要求2所述的细胞系在建立人乳腺恶性叶状肿瘤动物模型中的应用。
6.如权利要求4或5所述的应用，其特征在于：所述的应用范围包括在研究人乳腺恶性叶状肿瘤致病、发生、发展、转移和耐药机制，相关信号通路和药物靶点方面的应用。
7.如权利要求1所述的细胞株或权利要求2所述的细胞系在筛选和评估人乳腺恶性叶状肿瘤诊断或检测试剂中的应用。
8.如权利要求1所述的细胞株或权利要求2所述的细胞系在筛选和评估抗人乳腺恶性叶状肿瘤药物中的应用。
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