CN113817684A - 一种具有高淋巴结转移潜力的中国人肺腺癌细胞系及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种具有高淋巴结转移潜力的中国人肺腺癌细胞系及应用，细胞系的保藏编号为CCTCC NO：C2021215。本发明细胞系与其他肺腺癌细胞系无同源性，且本发明细胞系具有染色体异常核型。该发明细胞系可在体外连续传代培养而保持肺腺癌肿瘤细胞的生物学特性不变。本发明细胞系与其他肺腺癌细胞系相比，有相似的生长、增殖、迁侵袭能力，并且可诱导小鼠皮下成瘤，适合作为细胞和动物模型用于研发肺腺癌相关诊断、治疗、药物研究。
Description
技术领域
本发明创造属于生物技术领域，尤其是涉及一种具有高淋巴结转移潜力的中国人肺腺癌细胞系及应用。
背景技术
肺癌是最常见的癌症之一，目前仍是全球癌症致死的主要原因。癌症数据显示，非小细胞肺癌约占所有肺癌发生的85％，中国在过去的40年里，肺癌死亡率增加了4倍，取代胃癌成为中国人口癌症死亡的主要原因，并且我国肺癌的发病率及死亡率仍呈逐年上升的趋势。早期肺癌5年生存率可达到55％，而晚期仅在4％左右。目前，作为肺癌中占比最大的肺腺癌，其发病机制尚未完全阐明，为了深入了解肺腺癌的发病机理、转移及预后方面的相关研究，需要建立合适的细胞系模型。
通过对细胞数据库ATCC、DSMZ、JCRB、COG等检索得知，目前已建立的肺腺癌细胞主要来自西方国家，其遗传背景与亚洲人群存在相当的差异，国内已建立的肺腺癌细胞株较少，并且易受污染，使得中国人肺腺癌的研究不能深入开展。同时，已知多数的肺腺癌细胞株长期在体外传代，多数细胞系经过数十年的培养通常在遗传学和细胞表型上有所改变或缺失，丧失了原始肿瘤组织的特性，细胞株分子生物学实验结果与临床个体结果差异很大，阻碍了肺腺癌的研究进展。
发明内容
有鉴于此，本发明创造旨在克服现有技术中的缺陷，提出一种具有高淋巴结转移潜力的中国人肺腺癌细胞系，该细胞系与现有肺腺癌组织不同源的，同时也具有染色体异常核型，在体外连续传代培养而保持肺腺癌肿瘤细胞的生物学特性不变的中国人肺腺癌细胞系。该中国人肺腺癌细胞系能够完成各种生物学实验，并且能诱导小鼠皮下成瘤，为深入研究中国人群或是亚洲人群的肺腺癌发病机制及药物与其他治疗提供了新的研究模型，具有重要理论和实际应用价值。
为达到上述目的，本发明创造的技术方案是这样实现的：
本发明的细胞系于2021年9月2日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)(地址：中国.武汉.武汉大学即湖北省武汉市武昌区武汉大学保藏中心，邮编：430072)，培养物名称为人肺腺癌淋巴结转移灶细胞株ZX2021H，保藏编号为CCTCC NO：C2021215。
本发明的另一个目的是提供一种上述中国人肺腺癌细胞系传代培养获得的子代细胞系。
本发明的另一个目的是提供一种上述细胞系或子代细胞系在制备肺腺癌的相关诊断试剂的用途。
本发明的另一个目的是提供一种上述细胞系或子代细胞系在构建肺腺癌的动物模型的用途。
本发明的另一个目的是提供一种上述细胞系或子代细胞系在制备预防和/或治疗肺腺癌的药物的用途。
本发明的另一个目的是提供一种上述细胞系或子代细胞系在筛选预防和/或治疗肺腺癌的药物的用途。
本发明的另一个目的是提供一种上述细胞系的建立方法，包括如下步骤：
(1)原代培养：获取中国人肺腺癌颈部淋巴结转移组织，清洗后将组织块浸泡在培养皿中的培养液Ⅰ中，将培养皿中的组织块剪碎，37℃、5％CO2条件下培养至细胞长满培养皿80％以上，培养期间更换培养液；
(2)传代培养：当细胞铺满培养皿底部后，弃掉原代培养的培养液，向培养皿中加入胰蛋白酶EDTA消化液，待细胞脱落后，加入培养液Ⅱ终止消化，传代至50代以上，得到中国人肺腺癌细胞系。
优选的，原代培养中使用的培养液Ⅰ为含20％胎牛血清的McCoy's5A培养基。
优选的，传代培养中使用的胰蛋白酶EDTA消化液中含有0.25％胰蛋白酶和0.53mMEDTA。
优选的，传代培养中使用的培养液Ⅱ为含10％胎牛血清和1％青链霉素的McCoy's5A培养基。
相对于现有技术，本发明创造具有以下优势：
(1)本发明的细胞系可在体外连续传代培养而保持肺腺癌肿瘤细胞的生物学特性不变；
(2)本发明的细胞系皮下接种免疫缺陷小鼠后致瘤率达到100％，适合作为动物模型用于研发肺腺癌相关诊断、治疗、药物研究；
(3)本发明的细胞系STR分型显示各基因座均未出现多等位基因现象。细胞中没有发现人类细胞交叉污染，与其他肺腺癌细胞系无同源性，且本发明细胞系具有染色体异常核型；
(4)本发明的细胞系与其他肺癌细胞系有着相近的增殖、迁移、侵袭能力，在肺腺癌的研究发明具有广阔前景。
附图说明
图1是本发明细胞系分别在1、5、10、15、20代在倒置显微镜下放大20倍和40倍的细胞形态。
图2是本发明细胞系的染色体核型分析图。
图3是本发明细胞系的STR鉴定结果。
图4是本发明细胞系的细胞生长增殖曲线。
图5是本发明细胞系在免疫缺陷小鼠的皮下成瘤图。
具体实施方式
除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明创造所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下面结合实施例来详细说明本发明创造。
实施例1人肺腺癌细胞株ZX2021H的建立方法
(1)原代培养：从一例肺腺癌颈部淋巴结转移的患者(中国人，男，天津医科大学总医院就诊，术后病理示肺腺癌，该患者已签署知情同意书)获得新鲜的肺腺癌颈部淋巴结转移组织标本一块，约0.3*0.3*0.3cm3大小，用PBS缓冲液冲洗组织3次，尽量去除纤维结缔组织和坏死组织，将肿瘤组织块浸泡在含20％胎牛血清McCoy's5A培养基(本发明的McCoy's5A培养基为该领域常见的培养基)的培养皿中。将培养皿中组织块剪碎，放入入37℃孵箱5％CO2条件下培养至细胞长满培养皿80％以上，每1-2天换液一次，当细胞铺满培养皿底部后，进行细胞消化，剔除前期增殖迅速的纤维细胞，多次传代后完全去除正常的纤维结缔组织。
(2)传代培养：弃掉原代培养的培养液，向培养皿中加入胰蛋白酶EDTA消化液(含0.25％胰蛋白酶、0.53m MEDTA)，待细胞脱落后，加入McCoy's 5A培养液(含10％胎牛血清、1％青链霉素)终止消化，细胞生长良好，形态较为均一。传代至50代以上，得到中国人肺腺癌细胞系ZX2021H。
实施例2细胞形态观察
将培养的1、5、10、15、20代实施例1得到的细胞系置于倒置荧光显微镜下，在明视野下进行拍照，可看到细胞呈不规则形，细胞核明显，细胞体积较大，呈贴壁生长，细胞铺满瓶底后有重叠现象，接触抑制消失，重叠性生长，反映了癌细胞恶性增殖的特点。各代细胞代谢始终保持旺盛，形态稳定，倍增时间大约为24小时，细胞冻存后复苏良好，到第50代细胞表型仍然不变。如图1所示。
实施例3染色体核型分析
将第30代细胞37℃，5％CO2培养箱中培养以获得大量分裂细胞；将处于对数生长期的细胞加入秋水仙素并摇匀，继续培养3小时，使进行分裂的细胞停止于分裂中期，以便染色体的观察；消化细胞，放入离心管，离心弃上清；加入低渗液混匀，并在37℃水浴箱中低渗膨胀细胞30分钟，减少染色体间的相互缠绕和重叠，再向离心管内加入新鲜固定液(冰醋酸：甲醇＝3:1)1ml，混匀，1000rpm，离心10min，弃上清；加入新鲜固定液10ml并吹匀，室温固定20min，离心，去上清，再固定；加入新鲜固定液250ul，轻轻吹匀，在距离载玻片15cm的高度，滴一滴悬液，空气充分干燥，用Giemsa染色染色液染色后取出水洗，待干；中性树脂封闭，在显微镜下观察染色体的结构和数量并拍照。
染色体核型分析显示：本发明中国人肺腺癌细胞系核型分析显示染色体结构和数目均表现异常，介于近2倍与近3倍体核型，染色体核型存在复杂的缺失、易位等染色体畸变，如图2所示。
实施例4STR鉴定显示
该株细胞DNA进行细胞STR分型结果显示，各基因座均未出现多等位基因现象。细胞中没有发现人类细胞交叉污染。如图3所示。
实施例5细胞系生长曲线绘制
为与其他肺腺癌细胞系对比其增殖迁移能力，本实施例取生长良好的对数生长期H1299细胞与该细胞系ZX2021H，用胰酶消化制成单细胞悬液，用计数板计数细胞悬液浓度后，配制成实验需要的细胞浓度2.5×104个/mL；
每孔以200μL接种至96孔板，使细胞终浓度为5000个/孔，每组5个复孔，培养板放入孵箱养(在37℃，5％CO2的条件下)；
分别在24、48、72、96h，向各组的5孔细胞中加入CCK-8 10uL，另外取三个复孔只加对应的培养基，置孵箱培养1-4h后取出，用酶标仪测定在450nm处的吸光度，取均值，只加培养基的复孔作为空白对照，以时间为横轴，吸光值为纵轴绘制细胞生长曲线，图4可见本发明细胞系生长速度与H1299相近。
实施例6克隆形成实验检测其增殖能力
分别取对数期生长的本发明细胞系和H1299，消化，重悬，配制成实验需要的细胞浓度2.5×104个/mL，以每孔200μL接种至6孔板，每个细胞重复2孔，放入37℃，5％CO2细胞孵育箱内培养，当培养皿中出现肉眼可见的集落时(1-2周)，终止培养，吸净培养基，加入结晶紫染色30min，弃掉结晶紫，用PBS冲洗2遍，使用扫描仪拍摄，计算克隆形成的数目以及克隆形成率。结果表明本发明细胞系的克隆形成率与H1299相似。
实施例7细胞迁移及侵袭实验检测其转移能力
在4℃条件下，取出180μL无血清培养基，并与20μL基质胶混合,在24孔板的其中2个孔的小室中各加入100μL混合溶液，放入37℃恒温培养箱中2h待胶水化。分别取对数期生长的该发明细胞系和H1299，用胰酶消化、重悬、计数，各取6万个细胞分别接种于24孔板未铺胶小室的上室中，再各取12万个细胞分别接种于24孔板铺胶小室的上室中，将800μL含10％血清培养基添加到下室，并在恒温培养箱中培养24h。最后，取出小室，弃掉培养基，加入结晶紫染色剂并在室温下孵育30min。用PBS清洗后，用棉签轻轻擦拭小室上表面细胞，并在倒置荧光显微镜下拍照，取5个视野计数穿膜细胞数，计算平均值。结果表明该发明细胞系与H1299在24h后穿膜细胞数量无明显差异，表明其迁移与侵袭能力与H1299相似。
实施例8体内成瘤能力检测
向免疫缺陷小鼠皮下接种细胞悬液，观察体内成瘤能力，消化对数生长期的该发明细胞系，用生理盐水洗2遍后制成细胞悬液，浓度为1×107个/mL，分别接种在4只免疫缺陷小鼠单侧臀部皮下，观察其体内成瘤能力，图5显示接种27天肿瘤直径分别达到13.04×13.74，12.65×14.13，12.28×14.18，11.23×10.13，致瘤率100％。
以上所述仅为本发明创造的较佳实施例而已，并不用以限制本发明创造，凡在本发明创造的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明创造的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种具有高淋巴结转移潜力的中国人肺腺癌细胞系，其特征在于：所述细胞系于2021年9月2日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)(地址：中国.武汉.武汉大学即湖北省武汉市武昌区武汉大学保藏中心，邮编：430072)，培养物名称为人肺腺癌淋巴结转移灶细胞株ZX2021H，保藏编号为CCTCC NO：C2021215。
2.一种权利要求1所述的中国人肺腺癌细胞系传代培养获得的子代细胞系。
3.权利要求1所述的细胞系或权利要求3所述的子代细胞系在制备肺腺癌的相关诊断试剂的用途。
4.权利要求1所述的细胞系或权利要求3所述的子代细胞系在构建肺腺癌的动物模型的用途。
5.权利要求1所述的细胞系或权利要求3所述的子代细胞系在制备预防和/或治疗肺腺癌的药物的用途。
6.权利要求1所述的细胞系或权利要求3所述的子代细胞系筛选预防和/或治疗肺腺癌的药物的用途。
7.一种权利要求1所述的细胞系的建立方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)原代培养：获取中国人肺腺癌颈部淋巴结转移组织，清洗后将组织块浸泡在培养皿中的培养液Ⅰ中，将培养皿中的组织块剪碎，37℃、5％CO2条件下培养至细胞长满培养皿80％以上，培养期间更换培养液；
(2)传代培养：当细胞铺满培养皿底部后，弃掉原代培养的培养液，向培养皿中加入胰蛋白酶EDTA消化液，待细胞脱落后，加入培养液Ⅱ终止消化，传代至50代以上，得到中国人肺腺癌细胞系。
8.根据权利要求7所述的细胞系的建立方法，其特征在于：原代培养中使用的培养液Ⅰ为含20％胎牛血清的McCoy's 5A培养基。
9.根据权利要求7所述的细胞系的建立方法，其特征在于：传代培养中使用的胰蛋白酶EDTA消化液中含有0.25％胰蛋白酶和0.53m MEDTA。
10.根据权利要求7所述的细胞系的建立方法，其特征在于：传代培养中使用的培养液Ⅱ为含10％胎牛血清和1％青链霉素的McCoy's 5A培养基。
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