CN111394301A - 白皮杉醇在增加多能干细胞分泌外泌体数量及生物活性中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了白皮杉醇在增加多能干细胞分泌外泌体数量及生物活性中的应用。本发明发现使用含有白皮杉醇的培养液培养多能干细胞，可以增加外泌体的分泌数量，而且外泌体的生物活性更高。本发明方法使用以培养基为溶剂配置含有白皮杉醇的培养液，对细胞几乎没有毒性作用，且保证了白皮杉醇在细胞培养过程中药效的发挥。本发明方法简便安全，高效，成本低廉，过程简单可靠且重复性好。

Description

白皮杉醇在增加多能干细胞分泌外泌体数量及生物活性中的 应用

技术领域

本发明属于细胞技术领域，具体涉及白皮杉醇在增加多能干细胞分泌外泌体数量及生物活性中的应用。

背景技术

外泌体(Exosome)是细胞外囊泡的一种，直径在30～100nm，外泌体内含有多种生长因子及细胞因子，如血管内皮生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF)、干细胞因子(Stem Cell Factors，SCF)，并且几乎所有的外泌体都含有生理活性的脂质成分，如1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-l-phosphate，S1P)、神经酰胺-1-磷酸(ceramide-1-phosphate，C1P)。外泌体进入靶细胞后，这些旁分泌因子可与细胞相互作用，如S1P、C1P可抑制细胞凋亡和刺激血管新生。干细胞来源的外泌体是干细胞在静息或缺氧应激、辐照、氧化损伤等刺激下分泌产生的细胞外囊泡。目前干细胞广泛应用于组织修复及缺血性疾病治疗领域。与干细胞比较，作为其旁分泌物的干细胞外泌体具有更稳定的生物特性、降低细胞移植致瘤风险，因此通过干细胞来源的外泌体进行促进血管生成和增强损伤细胞修复，有望成为组织损伤修复的治疗新策略。此外，外泌体成分明确，复杂性低，且不含有DNA成分，避免不同个体间传递遗传信息的风险。间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)具有的多向分化潜能、免疫排斥小、伦理压力低等优点，使其在组织工程和再生医学领域中具有广泛应用，但MSC具有致畸致瘤的风险而导致其在临床方面的推广受限。MSC通过旁分泌释放的细胞因子和生长因子等生物活性因子，能够抑制局部免疫系统，增强血管生成，参与组织修复和再生。

为了得到足够数量MSCs来源的外泌体，目前，促进外泌体释放的方法有：(1)通过剥夺营养素、生长因子和饮食限制，抑制雷帕霉素靶蛋白复合体C1(Mammalian Target ofRapamycin Complex 1，mTORC1)的活性，促进外泌体的释放；(2)通过3D培养，整合素功能阻断，肌动蛋白解聚剂或聚合抑制剂的使用，诱导细胞肌动蛋白解聚；(3)自由基压力，UV放射、膜胆固醇含量降低及胞内钙离子水平升高。但是，肌动蛋白解聚剂或聚合抑制剂成本高昂，UV放射、自由基压力等外界条件刺激不可控，都不适合大量外泌体的释放，且提取过程复杂，得率低。因此，寻找新的增加外泌体释放的方法，对于促进外泌体在再生医学与组织工程领域的应用与发展具有重要的意义。

白皮杉醇(3,3',4,5'-四羟基二苯乙烯，piceatannol)是一种以二苯乙烯为基本母核，苯环不同位置上的氢原子被羟基取代形成多羟基酚类化合物，其化学结构式如下：

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供白皮杉醇在增加多能干细胞分泌外泌体数量及生物活性中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

白皮杉醇在增加多能干细胞分泌外泌体数量及生物活性中的应用。

所述的多能干细胞优选为间充质干细胞；更优选为脐带间充质干细胞。

一种增加多能干细胞分泌外泌体数量及生物活性的方法，包括如下步骤：

(1)将多能干细胞接种至含白皮杉醇的培养液中培养，得到细胞培养液；

(2)离心收集细胞培养液上清，提取外泌体。

步骤(1)中所述的接种的接种量优选为1～2×10⁴个细胞/mL培养液；更优选为2×10⁴个细胞/mL培养液。

步骤(1)中所述的白皮杉醇在培养液中的浓度为25～100mg/mL。

步骤(1)中所述的培养液还包括基础培养基和水；优选为按照如下方法配置：先将白皮杉醇与少量水混合，再用多能干细胞基础培养基稀释至白皮杉醇在培养液中的浓度为25～100mg/mL。

所述的基础培养基优选为无血清基础培养基；当所述的多能干细胞为间充质干细胞时，所述的基础培养基为间充质干细胞无血清培养基。

步骤(1)中所述的培养的条件优选为37℃、5％CO₂培养箱培养。

步骤(1)中所述的培养的时间优选为3～5天。

步骤(2)中所述的离心的转速优选为1000～2000g；更优选为2000g。

步骤(2)中所述的离心的时间优选为25～35min；更优选为30min。

步骤(2)中所述的离心的温度优选为18～22℃；更优选为20℃。

步骤(2)中所述的提取外泌体具体包括如下步骤：

a.在所得细胞培养液上清中加入外泌体分离试剂，混合均匀，孵育；

b.离心去除上清液，所获得的沉淀即为外泌体。

步骤a.中所述的外泌体分离试剂，优选为Invitrogen公司的Total ExosomeIsolation Reagent(from serum)。

所述的外泌体分离试剂的用量，优选为按上清液体积的2/3～1/4计；更优选为1/2。

步骤a.中所述的孵育的条件，优选为在2℃～8℃温度下孵育过夜。

步骤b.中所述的离心的转速，优选为8000～12000g；更优选为10000g。

步骤b.中所述的离心的时间，优选为30～90min；更优选为1h。

步骤b.中所述的离心的温度，优选为2℃～8℃。

上述增加多能干细胞分泌外泌体数量及生物活性的方法在制备外泌体材料中的应用。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明方法中使用的含有白皮杉醇的培养液是独有配置的特定培养液，在增加外泌体分泌的过程中更简便安全和高效，成本低廉，过程简单可靠，且重复性好。

(2)本发明配制的白皮杉醇培养基是以培养基为溶剂，对细胞几乎没有毒性作用，且保证了白皮杉醇在细胞培养过程中药效的发挥。

附图说明

图1为本发明方法得到的外泌体CD63和CD81表达情况的流式细胞仪鉴定结果图，其中图(a)为对照组样本的结果；图(b)为25mg/mL白皮杉醇培养液组样本的结果；图(c)为50mg/mL白皮杉醇培养液组样本的结果；图(d)为100mg/mL白皮杉醇培养液组样本的结果。

图2为本发明方法制得的外泌体粒径的流式细胞仪鉴定结果图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

1.用超纯水将白皮杉醇(成都普瑞法，货号：BP1525-20mg)稀释成不同浓度，得到白皮杉醇浓度分别为25mg/μl、50mg/μl、100mg/μl的白皮杉醇水溶液，备用。

2.脐带间充质干细胞的准备：

(1)用生理盐水将脐带(经同意采集广东省妇幼保健院健康产妇分娩的胎儿的脐带，广东省妇幼保健院)洗净，剪成小段，放入空的培养皿中，用组织镊将脐带撕开，剥离两条动脉血管，撕下分布在血管周围的华尔通氏胶。将分离出来的华尔通氏胶放入50ml离心管中，加入2ml培养基(LONZA 12-725F间充质干细胞无血清培养基，下同)，用剪刀将华尔通氏胶剪成1mm大小的碎块，再加入6ml培养基，混匀后均匀放入6个T25的培养瓶中。

(2)将T25培养瓶放入培养箱中，37℃、5％CO₂培养。

(3)当每个T25培养瓶均长出2～3个集落，每个集落最少有上百个细胞后，将培养瓶中的培养基以及组织块倒出，加入传代用培养基，每个培养瓶2ml；放入培养箱中，37℃、5％CO₂培养。

(4)培养2天后，每个培养瓶中加入生理盐水冲洗2次；冲洗后尽量倒干净生理盐水，然后加入0.25％胰酶，消化1分钟，肉眼可见细胞已经成片地脱离瓶底，轻拍培养瓶，然后显微镜下观察，当所有细胞均脱壁时，加入2～3ml培养基终止消化。

(5)将培养基倒入离心管中，离心，转速为600g，离心时间4分钟，温度为20℃。

(6)将离心后的细胞弃上清，培养基重悬并平均接种至T75培养瓶，加入15ml培养基，摇匀，放入培养箱中37℃、5％CO₂培养，此时细胞为P1代。

(7)当瓶中细胞长满时传代。

3.白皮杉醇处理间充质干细胞：

(1)用培养基将白皮杉醇水溶液进一步稀释成25mg/mL、50mg/mL、100mg/mL的培养液。

(2)将P3代细胞接种于12个T75培养瓶中，接种数量为5×10⁵个/瓶，每三瓶一组，具体分组情况如下：MSC(A)：对照组，加入25mL培养基；MSC(B)：加入25mL浓度为25mg/mL的白皮杉醇培养液；MSC(C)：加入25mL浓度为50mg/mL的白皮杉醇培养液；MSC(D)：加入25mL浓度为100mg/mL的白皮杉醇培养液；摇匀，放入37℃、5％CO2的培养箱中培养。

4.外泌体的分离和鉴定：

(1)将同组的培养液倒出混匀。

(2)将各组混合液分别放入离心管中，离心，转速为2000g，离心时间30分钟，温度为20℃。

(3)离心后收集上清备用。

(4)每组取出10mL上清与外泌体分离试剂(Invitrogen公司的Total ExosomeIsolation(from serum)试剂盒)按2:1的比例混合，并充分混匀，2℃～8℃孵育过夜。

(5)10000g离心1h，温度为2℃～8℃。

(6)离心后倒出上清，加入1mL 1×PBS吹打，获得4个样本。

(7)流式细胞仪检测各组样本CD63和CD81表达情况，浓度以及粒径，结果如图1、图2及表1所示。

5.结果分析

(1)流式仪检测结果

如图1所示，对照组及25mg/mL、50mg/mL、100mg/mL白皮杉醇处理组各样本的结果分别为图1(a)、1(b)、1(c)、1(d)，CD63+外泌体比例的数值分别为34.3％、42.4％、52.6％、58.3％；CD81+外泌体比例的数值分别为77.3％、78.6％、73％、72％。从上述数据可以看出，各组CD63+标记的外泌体纯度随着白皮杉醇的浓度增高而增高。CD81+外泌体比例未有明显改变。

(2)外泌体浓度及粒径检测结果

如表1所示，对照组及25mg/mL、50mg/mL、100mg/mL白皮杉醇处理组各样本的外泌体浓度分别为1.21×10¹⁰个/mL、2.03×10¹⁰个/mL、2.44×10¹⁰个/mL、2.60×10¹⁰个/mL。从上述数据可以看出随着白皮杉醇的浓度增加，外泌体的浓度有显著的增高。

如图2所示，对照组及25mg/mL、50mg/mL、100mg/mL白皮杉醇处理组各样本的外泌体平均粒径分别为69.59nm，65.67nm，70.26nm，70.98nm。从上述数据可以看出随着白皮杉醇的浓度增加，干细胞分泌的外泌体的粒径未有明显改变。

表1各处理组样本的外泌体浓度

分组	MSC(A)	MSC(B)	MSC(C)	MSC(D)
					外泌体浓度(个/mL)	1.21×10<sup>10</sup>	2.03×10<sup>10</sup>	2.44×10<sup>10</sup>	2.60×10<sup>10</sup>

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.白皮杉醇在增加多能干细胞分泌外泌体数量及生物活性中的应用。

2.根据权利要求1所述的白皮杉醇在增加多能干细胞分泌外泌体数量及生物活性中的应用，其特征在于：

所述的多能干细胞为间充质干细胞。

3.一种增加多能干细胞分泌外泌体数量及生物活性的方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)将多能干细胞接种至含白皮杉醇的培养液中培养，得到细胞培养液；

(2)离心收集细胞培养液上清，提取外泌体。

4.根据权利要求3所述的增加多能干细胞分泌外泌体数量及生物活性的方法，其特征在于：

步骤(1)中所述的接种的接种量为1～2×10⁴个细胞/mL培养液；

步骤(1)中所述的白皮杉醇在培养液中的浓度为25～100mg/mL。

5.根据权利要求3所述的增加多能干细胞分泌外泌体数量及生物活性的方法，其特征在于：

步骤(1)中所述的培养液按照如下方法配置：先将白皮杉醇与水混合，再用多能干细胞基础培养基稀释至白皮杉醇在培养液中的浓度为25～100mg/mL。

6.根据权利要求3所述的增加多能干细胞分泌外泌体数量及生物活性的方法，其特征在于：

步骤(1)中所述的培养的条件为37℃、5％CO₂培养箱培养；

步骤(1)中所述的培养的时间为3～5天；

步骤(2)中所述的离心的转速为1000～2000g；

步骤(2)中所述的离心的时间为25～35min；

步骤(2)中所述的离心的温度为18～22℃。

7.根据权利要求3所述的增加多能干细胞分泌外泌体数量及生物活性的方法，其特征在于：

步骤(2)中所述的提取外泌体具体包括如下步骤：

a.在所得细胞培养液上清中加入外泌体分离试剂，混合均匀，孵育；

b.离心去除上清液，所获得的沉淀即为外泌体。

8.根据权利要求7所述的增加多能干细胞分泌外泌体数量及生物活性的方法，其特征在于：

步骤a.中所述的外泌体分离试剂的用量按上清液体积的2/3～1/4计；

步骤a.中所述的孵育的条件为在2℃～8℃温度下孵育过夜；

步骤b.中所述的离心的转速为8000～12000g；

步骤b.中所述的离心的时间为30～90min；

步骤b.中所述的离心的温度为2℃～8℃。

9.根据权利要求8所述的增加多能干细胞分泌外泌体数量及生物活性的方法，其特征在于：

步骤a.中所述的外泌体分离试剂的用量按上清液体积的1/2计；

步骤b.中所述的离心的转速为10000g；

步骤b.中所述的离心的时间为1h。

10.权利要求3～9任一项所述的增加多能干细胞分泌外泌体数量及生物活性的方法在制备外泌体材料中的应用。

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