CN113073077A - 一种使用封闭式系统培养临床级脐带血间充质干细胞的方法 - Google Patents
一种使用封闭式系统培养临床级脐带血间充质干细胞的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113073077A CN113073077A CN202110373232.1A CN202110373232A CN113073077A CN 113073077 A CN113073077 A CN 113073077A CN 202110373232 A CN202110373232 A CN 202110373232A CN 113073077 A CN113073077 A CN 113073077A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- mscs
- cells
- cord blood
- hucb
- umbilical cord
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0662—Stem cells
- C12N5/0665—Blood-borne mesenchymal stem cells, e.g. from umbilical cord blood
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
- C12N2509/10—Mechanical dissociation
Abstract
本发明涉及细胞治疗技术领域,尤其涉及一种使用封闭式系统培养临床级脐带血间充质干细胞的方法,包括如下步骤:步骤(一)、采集脐带血;步骤(二)、使用一次性封闭系统从脐带血中分离hUCB‑MSCs;步骤(三)、对hUCB‑MSCs进行培养及扩增;步骤(四)、对hUCB‑MSCs进行质量控制。本发明采用一次性封闭系统规模化生产临床级hUCB‑MSCs,并经过严格的间充质干细胞质量控制与安全性评价体系的检测,不仅克服了供体细胞的来源少的问题,并且无伦理学的争议;此外封闭式培养系统降低了MSCs生产过程中外源性污染风险,减轻了环境要求负担,并且保证了产品质量。
Description
技术领域
本发明涉及细胞治疗技术领域,尤其涉及一种使用封闭式系统培养临床级脐带血间充质干细胞的方法。
背景技术
间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)是临床实践中可用于免疫调节和缺血性组织修复的几种干细胞类型之一。它们除了具有自我更新和多向分化潜能之外,还拥有较大的的免疫调节能力。研究发现,在炎症环境下,MSCs能够通过直接接触、细胞因子/趋化因子分泌、微囊泡(外泌体)分泌以及线粒体转移等方式发挥免疫调节作用,促进组织修复和再生。
MSCs是目前干细胞治疗中比较理想的种子细胞之一,在组织修复和再生细胞治疗方面具有潜在的临床价值。
MSCs组织来源十分丰富,广泛存在于包括骨髓、脐带、脐带血、羊膜、胎盘、子宫内膜、脂肪等各种组织中,可分化为脂肪细胞、成骨细胞、成软骨细胞、肌细胞、内皮细胞和神经元等。人脐带血间充质干细胞(Human umbilical cord blood-derived mesenchymalstem cells,hUCB-MSCs)作为MSCs的独特来源具有显著优势:⑴hUCB-MSCs是从出生后的废弃脐带和胎盘中获取的,不涉及伦理问题。⑵脐带血的采集是非侵入性的,取材过程无痛苦,无安全风险且采集方便,容易分离。⑶hUCB-MSCs与成体组织来源的MSCs相比,处于早期新生阶段,具有更强的增殖分化能力和免疫调节能力。⑷hUCB-MSCs相关的免疫发育尚未成熟,免疫源性相对较低,因此降低了排斥的风险;而且由于有胎盘的屏障作用,微生物和肿瘤细胞污染的可能性较小(Van Pham and Phan 2015)。
尽管MSCs在退行性疾病和炎症性疾病的治疗方面具有广阔的应用前景,但其在临床上的转化应用仍需要克服许多困难:MSCs来源多样、供者遗传背景复杂、体外生产过程漫长,从而导致细胞产品质量不稳定。干细胞制品不同于一般的生物制品,其生产制备过程复杂且最终产品不是某一种单一物质而是一类具有生物学效应的细胞,在这一过程中,细胞制品的质量无时不在发生变化,难以保证MSCs临床应用的安全和有效。因此能开发出质量稳定均一的临床级细胞制剂,对临床疾病的治疗至关重要(McGowan,Campbell etal.2018)。
为监管细胞治疗产品,欧盟将基因治疗、细胞治疗和组织工程产品统一归为先进医疗产品(Advanced Therapeutic Medicinal Product,ATMP),有专门的法规对此类产品进行管理。国际上要求其整个生产过程均需符合现行人体组织细胞优良操作规范(goodtissue practice,GTP)和药品生产质量管理规范(good manufacturing practice,GMP)的要求,保证质量和批次间一致性。细胞制品在我国纳入药品进行开发和监管。目前,我国药品监管机构颁布的涉及细胞治疗产品的法规和指导原则主要包括《药品注册管理办法》、《药物非临床研究质量管理规范》、《中华人民共和国药典》(2015年版)、《人体细胞治疗研究和制剂质量控制技术指导原则》、《细胞治疗产品研究与评价技术指导原则》等。
MSCs的临床应用需要提供大量的高质量细胞,这就需要按照质量控制标准和GMP要求进行细胞体外大规模生产。hUCB-MSCs是贴壁依赖性细胞,需要贴附于支持物表面或需要细胞培养物支持才能正常增殖。目前有两种系统适合大规模的贴壁细胞培养:微载体培养系统和多层培养瓶系统。由于微载体具有极大的比表面积,间充质干细胞可以贴壁到微载体上,在局限的空间内可以培养出大量的细胞。但微载体生物反应器系统仍存在以下问题。例如,与单层细胞培养不同,微载体-细胞复合物需要复杂的解离方法,数项研究表明使用高浓度胰蛋白酶处理或延长消化时间才能解离微载体-细胞复合物,而这种处理会导致MSCs损伤或表型改变(Sart,Schneider et al.2009,Dos Santos,Campbell et al.2014)。还有研究使用其他蛋白水解酶,例如胶原酶和分散酶消化大孔微载体来收获MSCs(这种方法减轻了细胞的损伤并增加了细胞的解离数目)(Autengruber,Gereke et al.2012,Taghizadeh,Cetrulo et al.2018)。但是,使用这些酶处理细胞可能会使MSCs某些细胞表面分子的表达发生变化。微载体培养系统的任一改变可能会影响细胞接触诱导的免疫抑制或分泌,进而影响MSCs免疫调节能力(Cherian,Bhuvan et al.2020)。
目前大部分起始材料如组织分离(脂肪、脐带、骨髓、脐血等等)都在开放条件下处理;早期MSCs种子细胞在单个传统培养瓶扩增;后期MSCs种子细胞再次转入微载体培养系统或者多层细胞培养瓶培养、扩增进行规模化生产。由于不同MSCs从组织起始材料到终产品的生产工艺是不一样的;从供者组织分离开始,其后的扩增、冻存、直至成品细胞输入到患者体内等一系列体外工艺步骤,均需开展质量控制。
综上所述,本发明设计了制备脐血来源的MSCs(hUCB-MSCs)一系列工艺流程;设计了从起始材料脐血到hUCB-MSCs终产品的全封闭式生产方案,有助于规模化生产临床级hUCB-MSCs,有助于提高hUCB-MSCs的产量和质量,实现稳健的生物工艺设计。也为临床干细胞治疗提供了大量稳定、可靠、安全的细胞来源。
发明内容
为了克服现有技术的不足,本发明的目的在于提供一种临床级脐带血间充质干细胞的规模化培养方法,本发明所述采用的方法可在封闭式系统中获取大量的高质量的hUCB-MSCs,有利hUCB-MSCs的扩增和质量控制,具有经济、高效、低污染风险的特点。
为了实现上述目的,本发明采用如下技术方案:本发明提供一种使用封闭式系统大规模培养临床级脐带血间充质干细胞的方案,包括如下步骤:
(一).脐带血的采集
经伦理审查委员会的批准并且捐赠者签署了知情同意书后,取得合格产妇分娩后的脐带血(符合临床用途)60至120mL,完备脐血登记后,使用TSCD-Ⅱ无菌接管机将脐血采集袋与转移袋进行无菌连接,将血液转移至转移袋,另外采集部分脐带血进行微生物检测。
(二).使用一次性封闭系统从脐带血中分离hUCB-MSCs
使用一次性封闭系统从脐带血中分离hUCB-MSCs的步骤具体为:
(B1)采集脐带血,将脐带血通过白细胞过滤器;
(B2)使用1×PBS冲洗白细胞过滤器,收集白细胞过滤器中捕获的白细胞,再将回收的白细胞接种到单层细胞培养瓶中;
以上工艺流程均在封闭系统中完成。
hUCB-MSCs来源于脐血细胞的贴壁培养。简而言之,首先将脐带血通过白细胞过滤器(Leukocyte reduction filters,LRF)。LRF可以捕获血液中的白细胞,同时允许红细胞,血小板和血浆流经该设备。hUCB-MSCs来源于白细胞中的单核细胞。因此,使用1×PBS将LRF冲洗几次,收集LRF中捕获的白细胞。最后,将回收的白细胞以2×106/mL的密度接种到单层细胞培养瓶中。6-7天后,可观察到hUCB-MSCs样细胞附着在培养瓶底部,将此时的hUCB-MSCs标记为P0,以上工艺流程均是在封闭系统中实现的。
(三).hUCB-MSCs的培养及扩增
hUCB-MSCs的培养及扩增包括如下步骤:
(C1)使用无菌接管机通过密闭无菌管道将预制的GMP级MSCs培养基装入袋中重悬细胞,然后将细胞以1.8-2.2×106/mL的密度转移并接种到细胞培养瓶中;所述GMP级MSCs培养基包括如下含量的原料:DMEM/F-12基础培养基、4-6%(v/v)脐带血血小板富集因子、9-11U/mL肝素钠;
(C2)在37℃,5%CO2培养箱孵育24小时后。每45-50小时使用无菌接管机更换新鲜的MSCs培养基,以上工艺流程都是在封闭细胞培养系统中完成;
(C3)培养6-8天,当hUCB-MSCs汇合度达到90%时,使用非动物源性细胞消化酶将贴壁细胞消化成单个细胞;
(C4)细胞分离为单细胞后,通过无菌接管机连接到容器端口用无菌PBS缓冲液洗涤细胞,随后将细胞转移到转移袋中并离心以除去缓冲液;
(C5)使用预制的GMP级MSCs培养基重悬细胞并以4.8-5.2×105/mL的密度接种到新的多层封闭细胞培养系统密闭容器中;
(C6)再过6-8天,预计接种的hUCB-MSCs再次汇合,采用非动物源性细胞消化酶并再次传到更多层的封闭细胞培养系统密闭容器中,并采用扩增培养基,扩展至第2代;采用的封闭细胞培养系统为多层细胞培养瓶(cell culture vessels)连接封闭式管道建立封闭细胞培养系统;所述多层细胞培养瓶优选但不限于为HYPERStack;
(C7)通过无菌管道取出一部分hUCB-MSCs用于质量控制;
(C8)将剩余的细胞收集在一起,采用细胞重悬剂重悬,转移至冷冻保存袋中,进行程序性冷冻并储存于液氮中;所述细胞重悬剂包括如下原料:4-5%HAS(v/v)、18-22%DMSO(v/v),余量为脐带血血浆。进一步的,每两天使用TSCD-Ⅱ无菌接管机通过密闭无菌管道更换新鲜的GMP级别MSCs培养基。hUCB-MSCs的扩增将在HYPERStack封闭系统中进行:当hUCB-MSCs样细胞在单层细胞培养瓶中汇合时,用TrypLE-Select对hUCB-MSCs进行消化,用1×PBS洗涤2次,再用新鲜的培养基重悬细胞,然后以5,000个细胞/cm2的密度转移到新的多层HYPERStack容器中,将此时的hUCB-MSCs标记为P1。
当hUCB-MSCs再次汇合时,将通过TrypLE-Select对hUCB-MSCs进行消化,并用1×PBS洗涤2次。对hUCB-MSCs进行采样,以进一步进行表征和质量检测。剩余的细胞将用血浆/4-5%HAS+20%DMSO(v/v)重悬并转移至冷冻保存袋中。上述hUCB-MSCs扩增均通过无菌TSCD-Ⅱ接管机在HYPERStack密闭容器中进行。
所述扩增培养基的制备方法包括如下步骤:
(1)收集去除白细胞的脐带血,使用富浆法分离血小板;
(2)首先250-350g低速离心8-15分钟,取上清,再以2900-3100g高速离心10-20分钟收集血小板沉淀;
(3)将血小板浓度调整至0.8-1.2×1012/L;然后在-80℃和37℃之间反复冻融5-7次,使血小板裂解并释放生长因子;
(4)最后一次融化后的血小板裂解液以4000g高速离心12-18分钟,取上清;
(5)再经62-66℃,10-20分钟使血浆灭活;
(6)最后经过0.22μm无菌过滤器过滤,可得到血小板富集因子;
(7)以4-6%(v/v)的浓度添加到含8-12U/mL肝素钠的DMEM/F-12基础培养基中获得完全培养基,可用于hUCB-MSCs的培养扩增。
(四).hUCB-MSCs的质量控制
hUCB-MSCs的质量控制包括MSCs细胞形态学检测、细胞纯度检测、细胞特性检测、细胞活力、产量和安全性检测:
(C1)倒置相差显微镜观察细胞的生长形态。
(C2)流式细胞术检测以下表面标记物表达情况检测hUCB-MSCs细胞纯度:CD73(+),CD105(+),CD90(+),CD29(+),CD34(-),CD45(-)和HLA-DR(-)。
(C3)通过标准的三谱系分化(成脂、成骨、成软骨)检测hUCB-MSCs的多向分化潜能。
(C4)通过台盼蓝染色或流式细胞术(DRAQ7染色)检测细胞活力。
(C5)通过PBMCs与hUCB-MSCs体外共培养实验检测hUCB-MSCs的免疫调节能力。
(C6)通过核型分析评估hUCB-MSCs的遗传稳定性。
(C7)通过完善的SOP进行无菌性检测,包括内毒素,支原体,真菌以及好氧和厌氧培养试验中的细菌检测。
本发明的有益效果:本发明采用一次性封闭系统规模化生产临床级hUCB-MSCs,并经过严格的间充质干细胞质量控制与安全性评价体系的检测,不仅克服了供体细胞的来源少的问题,并且无伦理学的争议;此外封闭式培养系统降低了MSCs生产过程中外源性污染风险,减轻了环境要求负担,并且保证了产品质量,为间充质干细胞进一步扩大范围的应用于临床奠定了实验基础,也为间充质干细胞的产业化转化奠定的基础。
附图说明
图1为封闭式系统培养方案示意图。
图2为hUCB-MSCs细胞形态图。
图3为hUCB-MSCs细胞表面标记物检测结果。
图4为hUCB-MSCs分化潜能检测结果。
图5为hUCB-MSCs细胞增殖能力检测结果。
图6为PBMCs与hUCB-MSCs体外共培养检测结果。
图7为hUCB-MSCs遗传稳定性检测结果。
具体实施方式
为了便于本领域技术人员的理解,下面结合实施例与附图对本发明作进一步的说明,实施方式提及的内容并非对本发明的限定。
实施例一、脐带血的采集
从合格产妇分娩后的脐带取得合格(无传染性疾病,符合临床用途)的脐带血60至120mL,放入脐带血采集袋中。检查完脐带血采集袋的完整性后,对脐带血样本进行注册。按照GMP推行的无菌工艺模拟实验(Process simulation testing,PST)指南将采集袋中的脐带血转移至新容器中:用TSCD-Ⅱ无菌接管机将脐带血采集袋与血液转移袋进行无菌连接,将血液转移至转移袋,其中通过无菌操作采集部分脐带血以进行微生物检测。TSCD-Ⅱ无菌接管机是一种封闭设备,可用于无菌连接两根聚氯乙烯(PVC)管,保证血液的安全。
实施例二、分离脐带血间充质干细胞
分离脐带血间充质干细胞包括如下步骤:
(B1)将采集的全脐带血离心(300g,15分钟),去除富含血小板的血浆,仅留下血浆的10%-30%;
(B2)采用含EDTA和0.5%(v/v)人白蛋白的1×PBS洗涤剩余的含有白细胞和红细胞的脐带血两次;
(B3)将30mL含脐带血细胞的PBS通过白细胞过滤器(Leukocyte reductionfilters,LRFs)。LRF可以捕获血液中的白细胞,同时允许红细胞,血小板和血浆流经该设备;
(B4)接下来,使用PBS将LRFs冲洗几次,并使用TSCD-Ⅱ无菌接管机将捕获白细胞的LRFs连接到装有EDTA的1×PBS的新输血袋中,回收白细胞。
(B5)对其进行活细胞计数并去除PBS。
进一步的,将回收的白细胞以2×106/mL的密度接种到单层细胞培养瓶中。6-7天后,可观察到hUCB-MSCs样细胞附着在培养瓶底部,将hUCB-MSCs标记为P0,以上工艺流程均是在封闭系统中实现的。
实施例三、hUCB-MSCs的培养及扩增
hUCB-MSCs的培养及扩增包括如下步骤:
(C1)使用TSCD-Ⅱ无菌接管机通过密闭无菌管道将预制的GMP级MSCs培养基装入袋中重悬细胞,然后将细胞以2×106/mL的密度转移并接种到细胞培养瓶中;所述GMP级MSCs培养基为:DMEM/F-12基础培养基、5%(v/v)脐带血血小板富集因子、10U/mL肝素钠;
(C2)在37℃,5%CO2培养箱孵育24小时后。每两天使用TSCD-Ⅱ无菌接管机更换新鲜的MSCs培养基。培养6-7天后,观察到MSCs样细胞粘附在细胞培养瓶底部,以上工艺流程都是在封闭系统中实现的;
(C3)7天左右,当hUCB-MSCs汇合度达到90%时,使用cGMP级TrypLE-Select消化液(非动物源性重组胰酶替代物)将贴壁细胞消化成单个细胞;
(C4)细胞分离为单细胞后,通过TSCD-Ⅱ无菌接管机连接到容器端口用无菌PBS缓冲液洗涤细胞两次;随后将细胞转移到转移袋中并离心以除去缓冲液;
(C5)使用预制的GMP级MSCs培养基重悬细胞并以5×105/mL的密度接种到新的培养容器中;
(C6)再过7天,预计接种的hUCB-MSCs再次汇合。TrypLE-Select消化细胞并再次传到更多层的HYPERStack密闭容器中,采用扩增培养基,并扩展至第2代;
(C7)取出一部分hUCB-MSCs用于质量控制;
(C8)将剩余的细胞收集在一起,使用血浆/4.5%HAS+20%DMSO(v/v)重悬并转移至冷冻保存袋中,进行程序性冷冻并长期储存于液氮中。上述hUCB-MSCs扩增均通过无菌TSCD-Ⅱ接管机在HYPERStack密闭容器中进行(图1),因此本发明的方法能够实现临床级脐带血间充质干细胞的规模化培养。
实施例四、人血小板裂解液替代胎牛血清大规模扩增hUCB-MSCs
所述实施例三中hUCB-MSCs扩增采用的扩增培养基的制备方法如下:
(1)收集去除白细胞的脐带血,使用富浆法分离血小板;
(2)首先300g低速离心10分钟,取上清,再以3000g高速离心15分钟收集血小板沉淀;
(3)将血小板浓度调整至1.0×1012/L;然后在-80℃和37℃之间反复冻融6次,使血小板裂解并释放生长因子;
(4)最后一次融化后的血小板裂解液以4000g高速离心15分钟,取上清;
(5)再经65℃,15分钟使血浆灭活;
(6)最后经过0.22μm无菌过滤器过滤,可得到血小板富集因子;
(7)以5%(v/v)的浓度添加到含10U/mL肝素钠的DMEM/F-12基础培养基中获得完全培养基,可用于hUCB-MSCs的培养扩增。
本发明通过采用人血小板裂解液替代胎牛血清大规模扩增hUCB-MSCs,人源性血小板裂解液来源于人类,用于相同来源的,不会引起异种蛋白的免疫反应;血小板裂解液含有多种细胞因子,能高效促进hUCB-MSCs的体外扩增,可以作为胎牛血清合适而安全的替代品,大大提高安全性。
实施例五、hUCB-MSCs的质量控制
hUCB-MSCs的质量控制包括MSCs细胞形态学检测、细胞纯度检测、细胞特性检测、细胞活力、产量和安全性检测。
(D1)倒置相差显微镜观察细胞的生长形态(图2)。镜下可见hUCB-MSCs为较规则的纺锤形,排列有方向性,呈现漩涡状、辐射状生长趋势。
(D2)流式细胞术检测以下表面标记物表达情况检测hUCB-MSCs细胞纯度:CD73(+),CD105(+),CD90(+),CD29(+),CD34(-),CD45(-)和HLA-DR(-)。
检测实施例三获得的hUCB-MSCs的8种特异性表面标志物表达情况,具体的阳性标志物:CD73、CD105、CD90、CD29;阴性标志物:CD34、CD45、HLA-DR等7种标志物的流式直标荧光抗体均购自Biolegend。具体的,将P4代的hUCB-MSCs细胞经消化成单细胞后,与以上8种标志物抗体分别混匀,室温避光孵育30分钟后,用PBS洗涤两次,上流式细胞仪检测标志物表达比例。
在本发明中,制备的临床级hUCB-MSCs检测7种特异表面标志物(包括4种阳性标志物和3个阴性标志物)表达结果显示(图3),MSC的阴性标志物均无表达,MSC阳性标志物CD105、CD73的比例均大于95%。
(D3)通过标准的三谱系分化(成脂、成骨、成软骨)检测hUCB-MSCs的多向分化潜能(图4):
1)成脂诱导分化培养基为MesenCultTMAdipogenic Differentiation Kit。操作方法参考试剂盒使用说明书:收集hUCB-MSCs并消化成单细胞后,以合适密度接种于12孔板,StemMACSTM×F培养液培养至细胞汇合度约80%时,更换分化诱导液,以后每隔2天换液,培养21天。油红-O染色鉴定分化结果。显微镜下,可见红色脂滴广泛分布,表明该方法获得的hUCB-MSCs具有成脂分化潜能。
2)成骨诱导分化培养基为MesenCultTMDifferentiation Kit,每隔2天换液1次,培养14天。诱导结束后PBS洗涤细胞1次,4%多聚甲醛固定30分钟,茜素红S染色20分钟鉴定钙结节的产生。显微镜下观察,茜素红S染色可见细胞浆中有大量的钙沉积,表明该方法获得的hUCB-MSCs具有成骨分化潜能。
3)成软骨诱导分化培养基为MesenCultTM-ACF Chondrogenic DifferentiationKit,每隔2天换液1次,培养21天。诱导结束后PBS洗涤组织1次,4%多聚甲醛固定过夜,石蜡包埋、切片后采用阿利新蓝染色对软骨进行染色。染色结果可知,诱导后的hUCB-MSCs组织具有软骨形态,且阿利新蓝染色呈强阳性,表明该方法获得的hUCB-MSCs具有成软骨分化潜能。
(D4)通过CCK8试剂盒检测hUCB-MSCs增殖情况。
收集细胞,将细胞密度调整为500/100μL,接种在96孔板中,每孔100μL细胞悬液,每24小时使用CCK8试剂盒检测hUCB-MSCs增殖情况,测试前使用CCK8试剂与细胞孵育2~4小时,孵育后采用酶标仪检测450nm处吸光度(OD值)。一共检测13天,记录OD值并绘制生长曲线(图5)。
(D5)通过PBMCs与hUCB-MSCs体外共培养实验检测hUCB-MSCs的免疫调节能力(图6):
1)通过密度梯度离心,从健康献血者的24至48小时内的外周血中分离外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)。接下来,使用H-胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)渗入法检测hUCB-MSCs对淋巴细胞增殖的影响。
2)取0.9mL hUCB-MSCs(2.5×106)细胞悬液,加入0.1mL丝裂霉素C(400μg/mL),置于37℃水浴30分钟,离心弃上清;用PBS洗涤一次细胞,调整细胞密度为1×106/mL。
3)将hUCB-MSCs以及PBMCs按不同比例混合接种在培养板中,同时设置hUCB-MSCs或PBMCs空白对照组。于37℃5%CO2培养箱内培养5天。
4)在培养结束前16~24小时加入3H-TdR 1μci。
5)培养结束,将细胞收集于玻璃纤维滤纸上,用生理盐水洗涤游离的3H-TdR,将滤片置于60℃烘箱烤干。
6)冷却后使用液体闪烁液计数器检测脉冲数(cpm)来确定PBMCs的增殖情况。
(D6)通过核型分析检测hUCB-MSCs的遗传稳定性。
核型分析通过G显带技术进行,研究染色体稳定性(图7)。
(D7)通过完善的SOP进行无菌性检测以及细胞活率检测,无菌性检测包括内毒素,支原体以及真菌、好氧和厌氧培养试验中的细菌检测,结果表明无菌性检测均呈阴性,总细胞活率达到85%以上,如下表所示,下表为hUCB-MSCs无菌性检测结果:
本发明采用一次性封闭系统规模化生产临床级hUCB-MSCs,并经过严格的间充质干细胞质量控制与安全性评价体系的检测,不仅克服了供体细胞的来源少的问题,并且无伦理学的争议;此外封闭式培养系统降低了MSCs生产过程中外源性污染风险,减轻了环境要求负担,并且保证了产品质量,为间充质干细胞进一步扩大范围的应用于临床奠定了实验基础,也为间充质干细胞的产业化转化奠定的基础。
最后应当说明的是,以上实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对本发明保护范围的限制,尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明,本领域的普通技术人员应当理解,可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (8)
1.一种使用封闭式系统培养临床级脐带血间充质干细胞的方法,其特征在于:包括如下步骤:
步骤(一)、采集脐带血;
步骤(二)、使用一次性封闭系统从脐带血中分离hUCB-MSCs;
步骤(三)、对hUCB-MSCs进行培养及扩增;
步骤(四)、对hUCB-MSCs进行质量控制。
2.根据权利要求1所述的使用封闭式系统培养临床级脐带血间充质干细胞的方法,其特征在于:所述步骤(二)中,使用一次性封闭系统从脐带血中分离hUCB-MSCs的步骤具体为:
(B1)采集脐带血,将脐带血通过白细胞过滤输血器;
(B2)使用1×PBS冲洗白细胞过滤器,收集白细胞过滤器中捕获的白细胞,再将回收的白细胞接种到单层细胞培养瓶中;
以上工艺流程均在封闭系统中完成。
3.根据权利要求1所述的使用封闭式系统培养临床级脐带血间充质干细胞的方法,其特征在于:所述步骤(B2)中,将采集的全脐带血离心,去除富含血小板的血浆,仅留下血浆的10%-30%;采用含EDTA和0.5%(v/v)人白蛋白的1×PBS洗涤剩余的含有白细胞和红细胞的脐带血两次;用1×PBS重悬细胞并将含脐带血细胞的PBS通过白细胞过滤器。
4.根据权利要求1所述的使用封闭式系统培养临床级脐带血间充质干细胞的方法,其特征在于:所述步骤(三)中,对hUCB-MSCs进行培养及扩增步骤具体为:
(C1)使用无菌接管机通过密闭无菌管道将预制的MSCs培养基装入袋中重悬细胞,然后将细胞以1-2.2×106/mL的密度转移并接种到单层细胞培养瓶中;
(C2)在37℃,5%CO2培养箱孵育24小时后。每45-50小时使用无菌接管机更换新鲜的MSCs培养基,以上工艺流程都是在封闭细胞培养系统中完成;
(C3)培养6-8天,当hUCB-MSCs汇合度达到90%时,使用非动物源性细胞消化酶将贴壁细胞消化成单个细胞;
(C4)细胞分离为单细胞后,通过无菌接管机连接到容器端口用无菌PBS缓冲液洗涤细胞,随后将细胞转移到转移袋中并离心以除去缓冲液;
(C5)使用预制的MSCs培养基重悬细胞并以4.8-5.2×105/mL的密度接种到新的多层封闭细胞培养系统中;
(C6)再过6-8天,预计接种的hUCB-MSCs再次汇合,采用非动物源性细胞消化酶并再次传到更多层的封闭细胞培养系统密闭容器中,采用扩增培养基,并扩展至第2代;
(C7)通过无菌管道取出一部分hUCB-MSCs用于质量控制;
(C8)将剩余的细胞收集在一起,转移至冷冻保存袋中,进行程序性冷冻并储存于液氮中。
5.根据权利要求1所述的使用封闭式系统培养临床级脐带血间充质干细胞的方法,其特征在于:所述步骤(三)中,采用的封闭细胞培养系统为多层细胞培养瓶连接封闭式管道建立封闭细胞培养系统。
6.根据权利要求4所述的使用封闭式系统培养临床级脐带血间充质干细胞的方法,其特征在于:所述步骤(C1)中,所述MSCs培养基包括如下含量的原料:DMEM/F-12基础培养基、4-6%(v/v)脐带血血小板富集因子、9-11U/mL肝素钠。
7.根据权利要求4所述的使用封闭式系统培养临床级脐带血间充质干细胞的方法,其特征在于:所述步骤(C3)中,所述非动物源性细胞消化酶为TrypLE-Select消化液。
8.根据权利要求4所述的使用封闭式系统培养临床级脐带血间充质干细胞的方法,其特征在于:所述步骤(C8)中,剩余的细胞采用细胞重悬剂重悬并转移至冷冻保存袋中保存,所述细胞重悬剂包括如下原料:4-5%HAS(v/v)、10-22%DMSO(v/v),余量为脐带血血浆。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202110373232.1A CN113073077B (zh) | 2021-04-07 | 2021-04-07 | 一种使用封闭式系统培养临床级脐带血间充质干细胞的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202110373232.1A CN113073077B (zh) | 2021-04-07 | 2021-04-07 | 一种使用封闭式系统培养临床级脐带血间充质干细胞的方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN113073077A true CN113073077A (zh) | 2021-07-06 |
CN113073077B CN113073077B (zh) | 2023-03-17 |
Family
ID=76615286
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202110373232.1A Active CN113073077B (zh) | 2021-04-07 | 2021-04-07 | 一种使用封闭式系统培养临床级脐带血间充质干细胞的方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN113073077B (zh) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN115216442A (zh) * | 2022-09-05 | 2022-10-21 | 杭州易文赛生物技术有限公司 | 外泌体的制备方法和培养基及其应用 |
Citations (15)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2005058103A (ja) * | 2003-08-13 | 2005-03-10 | Lymphotec:Kk | 閉鎖系細胞培養用容器及び該容器を用いた細胞の増殖培養方法、ならびに該培養方法を用いた免疫治療剤、細胞増殖培養用キット |
US20090305406A1 (en) * | 2006-01-25 | 2009-12-10 | Robert Pytlik | Method of cultivation of human mesenchymal stem cells, particularly for the treatment of non-healing fractures, and bioreactor for carrying out this cultivation method |
CN101802177A (zh) * | 2008-10-10 | 2010-08-11 | 深圳市嘉天源生物科技有限公司 | 从人或动物胚胎提取间质性干细胞及提取其分泌物的方法 |
US20110263016A1 (en) * | 2008-09-25 | 2011-10-27 | Rancourt Derrick E | Expansion of Embryonic Stem Cells |
CN102517251A (zh) * | 2012-01-12 | 2012-06-27 | 苏州大学附属第一医院 | 一种间充质干细胞及其制备方法和应用 |
CN102876630A (zh) * | 2012-11-05 | 2013-01-16 | 东南大学 | 一种高效分离和扩增人脐带血间充质干细胞的方法 |
KR20130057682A (ko) * | 2011-11-24 | 2013-06-03 | 서울대학교산학협력단 | 제대혈 중간엽 줄기세포의 세포 노화유도방법 및 그 억제 방법 및 그 억제용 조성물 |
CN103153318A (zh) * | 2010-09-02 | 2013-06-12 | 生命技术公司 | 用于细胞的生物反应器放大的细胞培养系统 |
WO2013085020A1 (ja) * | 2011-12-09 | 2013-06-13 | Kuroiwa Yasuyuki | 細胞培養方法および培養装置 |
CN103352026A (zh) * | 2013-07-24 | 2013-10-16 | 黑龙江天晴干细胞有限公司 | 人脐带血富血小板裂解液培养自体脐带间充质干细胞方法 |
CN106665559A (zh) * | 2016-12-28 | 2017-05-17 | 广州沙艾生物科技有限公司 | 一种免疫细胞冻存液及其应用 |
CN107735119A (zh) * | 2015-12-29 | 2018-02-23 | 热起源公司 | 细胞分离装置、系统和方法 |
CN109153970A (zh) * | 2016-05-17 | 2019-01-04 | 新加坡科技研究局 | 人类干细胞衍生的内皮细胞、内皮-肝细胞共培养系统以及其用途 |
CN110564612A (zh) * | 2013-06-24 | 2019-12-13 | 威尔逊沃夫制造公司 | 用于透气性细胞培养过程的封闭系统装置和方法 |
CN112522104A (zh) * | 2020-12-29 | 2021-03-19 | 弘康信达(江苏)医学研究有限公司 | 一种间充质干细胞培养容器及培养方法 |
-
2021
- 2021-04-07 CN CN202110373232.1A patent/CN113073077B/zh active Active
Patent Citations (15)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2005058103A (ja) * | 2003-08-13 | 2005-03-10 | Lymphotec:Kk | 閉鎖系細胞培養用容器及び該容器を用いた細胞の増殖培養方法、ならびに該培養方法を用いた免疫治療剤、細胞増殖培養用キット |
US20090305406A1 (en) * | 2006-01-25 | 2009-12-10 | Robert Pytlik | Method of cultivation of human mesenchymal stem cells, particularly for the treatment of non-healing fractures, and bioreactor for carrying out this cultivation method |
US20110263016A1 (en) * | 2008-09-25 | 2011-10-27 | Rancourt Derrick E | Expansion of Embryonic Stem Cells |
CN101802177A (zh) * | 2008-10-10 | 2010-08-11 | 深圳市嘉天源生物科技有限公司 | 从人或动物胚胎提取间质性干细胞及提取其分泌物的方法 |
CN103153318A (zh) * | 2010-09-02 | 2013-06-12 | 生命技术公司 | 用于细胞的生物反应器放大的细胞培养系统 |
KR20130057682A (ko) * | 2011-11-24 | 2013-06-03 | 서울대학교산학협력단 | 제대혈 중간엽 줄기세포의 세포 노화유도방법 및 그 억제 방법 및 그 억제용 조성물 |
WO2013085020A1 (ja) * | 2011-12-09 | 2013-06-13 | Kuroiwa Yasuyuki | 細胞培養方法および培養装置 |
CN102517251A (zh) * | 2012-01-12 | 2012-06-27 | 苏州大学附属第一医院 | 一种间充质干细胞及其制备方法和应用 |
CN102876630A (zh) * | 2012-11-05 | 2013-01-16 | 东南大学 | 一种高效分离和扩增人脐带血间充质干细胞的方法 |
CN110564612A (zh) * | 2013-06-24 | 2019-12-13 | 威尔逊沃夫制造公司 | 用于透气性细胞培养过程的封闭系统装置和方法 |
CN103352026A (zh) * | 2013-07-24 | 2013-10-16 | 黑龙江天晴干细胞有限公司 | 人脐带血富血小板裂解液培养自体脐带间充质干细胞方法 |
CN107735119A (zh) * | 2015-12-29 | 2018-02-23 | 热起源公司 | 细胞分离装置、系统和方法 |
CN109153970A (zh) * | 2016-05-17 | 2019-01-04 | 新加坡科技研究局 | 人类干细胞衍生的内皮细胞、内皮-肝细胞共培养系统以及其用途 |
CN106665559A (zh) * | 2016-12-28 | 2017-05-17 | 广州沙艾生物科技有限公司 | 一种免疫细胞冻存液及其应用 |
CN112522104A (zh) * | 2020-12-29 | 2021-03-19 | 弘康信达(江苏)医学研究有限公司 | 一种间充质干细胞培养容器及培养方法 |
Non-Patent Citations (6)
Title |
---|
KUNIKAZU TSUJI等: "Effects of Different Cell-Detaching Methods on the Viability and Cell Surface Antigen Expression of Synovial Mesenchymal Stem Cells", 《CELL TRANSPLANTATION》 * |
曾琴兵等: "重组人促红细胞生成素促进体外培养的人骨髓间充质干细胞增殖", 《中华器官移植杂志》 * |
浦仕彪等: "血小板裂解液大规模扩增人脐带间充质干细胞", 《中国生物制品学杂志》 * |
王佃亮: "脐带间充质干细胞制剂生产及相关要求――《脐带间充质干细胞》连载之三", 《中国生物工程杂志》 * |
贺鹏程等: "《造血干细胞移植规范化应用新进展》", 30 April 2013, 西安交通大学出版社 * |
陈津等: "大规模间充质干细胞培养技术评估报告", 《中国医药生物技术》 * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN115216442A (zh) * | 2022-09-05 | 2022-10-21 | 杭州易文赛生物技术有限公司 | 外泌体的制备方法和培养基及其应用 |
CN115216442B (zh) * | 2022-09-05 | 2024-04-16 | 杭州易文赛生物技术有限公司 | 外泌体的制备方法和培养基及其应用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN113073077B (zh) | 2023-03-17 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US9770470B2 (en) | Closed system separation of adherent bone marrow stem cells for regenerative medicine applications | |
US6140122A (en) | Process for preparing macrophages, kits, and compositions for the use of this process | |
WO2020103192A1 (zh) | 外泌体的提取方法 | |
CN107475190B (zh) | 一种脂肪svf细胞临床级高效制备和冻存的方法及其用途 | |
CN112048470B (zh) | 一种利用人诱导多能干细胞制备临床级别间充质干细胞制剂的方法 | |
CN107418930B (zh) | 一种纯化与扩增人骨髓间充质干细胞的制备方法 | |
CN114591905B (zh) | 一种人红细胞制备凋亡囊泡的方法与应用 | |
CN107164326B (zh) | 一种3D培养自体脂肪MSCs来源的神经前体细胞的方法 | |
JP2016509863A (ja) | 細胞、臍帯血収集のための方法及び装置、並びに細胞の単離のための方法及び装置 | |
CN107385517A (zh) | 间充质干细胞库的构建方法 | |
JP2016509863A5 (zh) | ||
CN111826348A (zh) | 一种人诱导性多能干细胞来源的间充质干细胞体外高效制备方法和应用 | |
CN112608896A (zh) | 一种nk细胞的培养方法及其应用 | |
CN110872574B (zh) | 一种高效可靠的hESC-MSC制备方法 | |
CN113073077B (zh) | 一种使用封闭式系统培养临床级脐带血间充质干细胞的方法 | |
CN109628388B (zh) | 用消化酶组合物从胎盘血管分离间充质干细胞 | |
CN116355843A (zh) | 一种用于改善卵母细胞质量的自体线粒体 | |
CN104630135B (zh) | 大规模制备肝干细胞的方法与用途 | |
CN111621473A (zh) | 一种新型人源脂肪干细胞制剂的制备方法 | |
CN115125192A (zh) | 一种骨髓上清液及其在细胞培养中的应用 | |
CN111394301B (zh) | 白皮杉醇在增加多能干细胞分泌外泌体数量及生物活性中的应用 | |
CN115029305A (zh) | 猪FAPs细胞分离鉴定方法及FAPs细胞的用途 | |
CN110592007B (zh) | 一种间充质干细胞及其制备方法和应用 | |
CN114058576A (zh) | 一种血小板裂解液及其制备方法和应用 | |
CN113774019A (zh) | 一种脐带血间充质干细胞无血清培养基、培养方法及其应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |