KR20130057682A - 제대혈 중간엽 줄기세포의 세포 노화유도방법 및 그 억제 방법 및 그 억제용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 제대혈 중간엽 줄기세포의 세포노화유도방법, 제대혈 중간엽 줄기세포의 세포노화 억제 방법 및 제대혈 중간엽 줄기세포의 세포노화 억제용 조성물에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 인간 제대혈 중간엽 줄기세포의 세포노화유도방법, 인간 제대혈 중간엽 줄기세포의 세포노화 억제 방법 및 인간 제대혈 중간엽 줄기세포의 세포노화 억제용 조성물에 관한 것이다.

Description

제대혈 중간엽 줄기세포의 세포 노화유도방법 및 그 억제 방법 및 그 억제용 조성물{Method of inducing cellular senescence of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cell, method of preventing cellular senescence of the same, and composition for preventing cellular senescence of the same}
본 발명은 제대혈 중간엽 줄기세포의 세포 노화유도방법, 제대혈 중간엽 줄기세포의 세포노화(cellular senesence) 억제 방법 및 제대혈 중간엽 줄기세포의 세포 노화 억제용 조성물에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 인간 제대혈 중간엽 줄기세포의 세포 노화유도방법, 인간 제대혈 중간엽 줄기세포의 세포 노화 억제 방법 및 인간 제대혈 중간엽 줄기세포의 세포 노화 억제용 조성물에 관한 것이다.
이온화 방사선(ionizing radiation), 자외선, 산화적 스트레스 및 화학적 돌연변이 물질과 같은 유전체독성 스트레스(Genotoxic stress)는 뉴크레오타이드 변형 및 DNA 절단을 유발한다[Hussain SP, LJ Hofseth and CC Harris. (2003). Nat Rev Cancer 3:276-85;Helleday T, E Petermann, C Lundin, B Hodgson and RA Sharma. (2008). Nat Rev Cancer 8:193-2041,2]. DNA 손상은 세포에 해롭기 때문에, 유전체감시스템(DNA 손상 체크포인트 신호전달 경로를 포함)이 DNA 복구 및 세포 생존을 가능하게 한다. 만약에 DNA 손상이 적절하게 복구되지 않으면, 세포는 세포노화, 세포사멸(apoptosis) 또는 암 으로 진행한다.
세포노화는 비가역적인 세포주기 정지(irreversible cell cycle arrest)로 인하여 세포가 증식하는 능력을 상실하는 현상이다. 세포사멸은 세포군으로부터 손상된 세포를 제거하는 세포의 자살 형태로서 프로그램화된 세포의 죽음을 의미한다[d'Adda di Fagagna F. (2008). Nat Rev Cancer 8:512-22;Campisi J and F d'Adda di Fagagna. (2007). Nat Rev Mol Cell Biol 8:729-40].
이온화방사선은 염기 손상, 염기가 없는 부위(abasic sites), 단일가닥 절단(single-strand breaks;SSBs) 및 이중가닥 절단(double-strand breaks;DSBs)을 포함하는 다양한 DNA 손상을 일으킨다. 이들 DNA 손상은 세포의 증식을 저해하고 DNA손상 복구에 관여하는단백질 등을 활성화 또는 조절하여 DNA 손상회복(DNA repair) 반응을 유도한다. 산소 이온, 산소 자유기 및 퍼옥사이드와 같은 활성산소종(Reactive oxygen species: ROS)은 세포 손상을 유발하는 산화적 스트레스를 유도한다[Cooke MS, MD Evans, M Dizdaroglu and J Lunec. (2003). FASEB J 17:1195-214;Maynard S, SH Schurman, C Harboe, NC de Souza-Pinto and VA Bohr. (2009). Carcinogenesis 30:2-10]. 비록 과량의 ROS는 해롭지만, 세포의 정상적인 기능에 적정 수준의 ROS가 필요하다. 예를 들어, 일부 세포에서는 세포 신호전달뿐 아니라 침입한 미생물의 파괴를 위하여 ROS를 생성한다[Hensley K, KA Robinson, SP Gabbita, S Salsman and RA Floyd. (2000). Free Radic Biol Med 28:1456-62]. 또한 산화적 스트레스는 세포 노화 및 사멸에서 중요한 역할을 한다[Kujoth GC, A Hiona, TD Pugh, S Someya, K Panzer, SE Wohlgemuth, T Hofer, AY Seo, R Sullivan, WA Jobling, JD Morrow, H Van Remmen, JM Sedivy, T Yamasoba, M Tanokura, R Weindruch, C Leeuwenburgh and TA Prolla. (2005). Science 309:481-4;D'Autreaux B and MB Toledano. (2007). Nat Rev Mol Cell Biol 8:813-24].
산화적 스트레스는 세포 내 다양한 기능에 관여한다고 알려져 있다. 과산화수소(Hydrogen peroxide)는 배양된 세포주에서 세포사멸 또는 세포노화를 유도한다[Kujoth GC, A Hiona, TD Pugh, S Someya, K Panzer, SE Wohlgemuth, T Hofer, AY Seo, R Sullivan, WA Jobling, JD Morrow, H Van Remmen, JM Sedivy, T Yamasoba, M Tanokura, R Weindruch, C Leeuwenburgh and TA Prolla. (2005). Science 309:481-4;Giorgio M, M Trinei, E Migliaccio and PG Pelicci. (2007). Nat Rev Mol Cell Biol 8:722-8]. 준치사량(sublethal) 농도의 과산화수소에 반응하여, 초기계대 인간 섬유종세포는 증식 정지(growth arrest) 및 세포노화를 겪지만, 치사량의 농도는 세포사멸을 유도한다[Chen QM, JC Bartholomew, J Campisi, M Acosta, JD Reagan and BN Ames. (1998). Biochem J 332 ( Pt 1):43-50].
산화적 스트레스에 대한 줄기세포의 반응은 잘 알려지지 않았다. 생쥐 배아 줄기세포는 DNA손상 물질 및 ROS에 민감하고 세포사멸을 유발한다[Roos WP, M Christmann, ST Fraser and B Kaina. (2007). Cell Death Differ 14:1422-32;Tichy ED and PJ Stambrook. (2008). Exp Cell Res 314:1929-36]. 그러나 다른 연구들에 의하면 생쥐 배아줄기세포가 높은 수준의 항산화 활성을 가지고 있으며 산화적 스트레스에 유도적인 유전자의 발현증가에 의하여 분화된 세포보다 산화적 스트레스에 더 저항성을 나타낸다는 보고가 있다[Saretzki G, L Armstrong, A Leake, M Lako and T von Zglinicki. (2004). Stem Cells 22:962-71;Saretzki G, T Walter, S Atkinson, JF Passos, B Bareth, WN Keith, R Stewart, S Hoare, M Stojkovic, L Armstrong, T von Zglinicki and M Lako. (2008). Stem Cells 26:455-64].
관련 선행특허로 대한민국 특허공개번호 제1020100127912호는 '줄기세포 생존능 및 증식능 개선용 조성물 '에 관한 발명으로, ADC(arginine decarboxylase) 코딩 뉴클레오타이드 서열이 포함된 유전자 전달체를 포함하는 줄기세포 생존능 또는 증식능 개선용 조성물 및 상기 서열목록에 기재된 ADC코딩 뉴클레오타이드 서열이 포함된 유전자 전달체를 이용하여 줄기세포 생존능 또는 증식능을 개선하는 방법에 관한 것으로, 줄기세포에 ADC 코딩 뉴클레오타이드 서열이 포함된 유전자 전달체를 형질도입 함으로써, 상기 줄기세포의 세포사멸(apoptosis) 및 산화적 스트레스(oxidative stress)로 의한 손상을 억제하고, 줄기세포의 생존능 또는 증식능을 매우 효과적으로 개선시키는 효과를 나타내고, 유전자 치료, 즉 줄기세포를 이용하는 신경질환의 예방 및 치료법에 응용시킬 수 있으며, 상기 신경질환 예방 및 치료 효능을 가지는 의약으로서의 기초적인 자료를 제공한다고 기재되어 있으며,
다른 관련 선행특허로 대한민국 특허공개번호 제1020100120532호는 '노화된 줄기세포의 다능성 및 증식률 재활성화 방법'에 관한 발명으로,(a) 노화된 성체 줄기세포를 저밀도로 배지에 씨딩하는 단계; 및 (b) 상기 노화된 성체 줄기세포를 배양하여 다능성(multipotency) 및 증식률이 재활성화된 성체 줄기세포를 수득하는 단계를 포함하는 노화된 성체 줄기세포의 다능성(multipotency) 재활성화 방법을 제공하며, 노화된 성체줄기세포를 재활성화시킴으로써 환자로부터 추가적인 성체줄기세포 채취 없이 매우 적은 양의 성체줄기세포로 초기 계대배양세포와 동일한 분화력과 증식력을 가지는 성체줄기세포를 대량생산할 수 있고 배아줄기세포보다 안전성면에서 매우 우수한 자가 골수 유래 성체줄기세포의 사용을 증가시킴으로서 다양한 임상분야에서 사용될 수 있다고 기재되어 있다.
본 발명은 상기의 문제점을 해결하고 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 제대혈 중간엽줄기세포의 세포노화 유도방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 제대혈 중간엽줄기세포의 세포노화 억제방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 제대혈 중간엽줄기세포의 분리 및 배양 시 줄기세포의 증식 능력을 증가시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 제대혈 중간엽줄기세포의 세포노화 억제용 조성물을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 항산화제의 외래 투입에 의한 제대혈 중간엽줄기세포의 세포노화(cellular senescence) 억제방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 항산화제는 대표적 항산화제인 폴리에틸렌글리콜-부착된 카탈레이즈(PEG-catalase: 항산화 단백질인 catalase를 세포내로 투입시키기 위하여 PEG를 부착)와 N-아세틸 시스테인(N-acetyl cysteine)을 사용하였으나 이에 한정되지 아니한다.
또 본 발명은 항산화제를 유효성분으로 포함하는 제대혈 중간엽줄기세포의 세포노화(cellular senescence) 억제용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 준치사량(sub-lethal)의 산화적 스트레스를 제대혈 줄기세포에 처리하여 제대혈 중간엽줄기세포의 세포노화를 유도하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 산화적 스트레스는 과산화수소를 포함한 peroxide 계열, Phorbol-12-myristate-13-acetate(TPA), 방사선, 등을 사용하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 일 바람직한 구현예에 있어서, 상기 산화적 스트레스의 준치사량(sub-lethal)은 과산화수소의 경우에는 2~200μM이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 다른 바람직한 구현예에 있어서, 상기 산화적 스트레스의 준치사량(sub-lethal)은 이온화 방사선의 경우에는 1~100 그레이(Gy)인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
이하 본 발명을 설명한다.
본 발명에서 본 발명자들은 인간 제대혈 중간엽줄기세포(이하, 'hUCB-MSCs'라 함)는 항산화 효소들의 발현이 저해되어 있음으로 인하여 항산화 활성이 적음을 밝혔다. 따라서, hUCB-MSCs는 산화적 스트레스 및 이온성 방사선에 민감하다. 준 치사량(Sub-lethal doses)의 산화적 스트레스는 hUCB-MSCs에서 세포노화를 유도한다. hUCB-MSCs에 항산화제의 외래 투입은 산화적 스트레스에 대한 저항성을 부여한다는 것을 밝혔다.
인간 중간엽줄기세포는 조직 재생 및 복구를 위한 세포 및 조직 치료의 세포 원으로 사용되므로 본 발명자들은 유전자독성 스트레스에 대한 인간 제대혈 유래 중간엽줄기세포(hUCB-MSCs)의 생리를 조사하였다. 준 치사량의 활성화 산소종(ROS: reactive oxygen species) 및 이온화 방사선은 hUCB-MSCs에서 세포증식 및 DNA 합성의 감소 및 DNA 손상을 유발하여 세포노화를 야기한다. 이에 반하여, 이 생리적인 변화는 인간 섬유종 세포 및 암 세포에서는 상대적으로 적었다. 즉 산화적 스트레스에 대하여 민감하다. hUCB-MSCs에 외래 투입한 항산화제는 산화적 스트레스 및 이온화 방사선에 대한 저항성을 증가시킨다. 이 결과들은 hUCB-MSCs는 낮은 항산화 효소 활성을 가지고 있어 산화적 스트레스 및 이온화 방사선에 민감하게 반응하여 세포노화를 겪음을 의미한다. 또한 hUCB-MSCs에 항산화제를 투입하여 세포내 항산화 활성을 증가시켜서 산화적 스트레스에 대한 저항성을 증가 시켰다. 따라서 hUCB-MSCs의 증식 및 줄기세포로서의 특성은 산화적 스트레스를 사용하여 조절할 수 있다.
이하 본 발명을 상세하게 설명한다.
동일 농도의 과산화 수소는 인간 섬유종세포 및 암세포에 비하여 hUCB-MSCs에서 더 심한 DNA 절단을 일으키고 그 손상 회복 기간이 hUCB-MSCs에서 더 길다(도 2 및 3A 및 B). 그러나 세 세포타입 모두는 유사한 수준의 DNA 절단를 가질 때, 회복 시간은 비슷하다(도 3C 및 D). DNA 손상으로부터 회복의 유사한 지속 및 DNA-손상 체크포인트 단백질의 활성화는 DNA 복구 및 DNA-손상 체크포인트 기작이 hUCB-MSCs에서도 작동한다는 것을 나타낸다.
비록 이온화 방사선이 hUCB-MSCs, 인간 섬유종 세포 및 암 세포에서 유사한 양의 DNA 절단을 생성하지만(도 9), 이온화방사선 처리 24시간 후 hUCB-MSCs는 인간 섬유종 세포 및 암 세포와 비교하여 DNA 합성 및 세포 증식이 감소하였다(도 1C 및 D). 방사선에 의해 생성된 ROS는 hUCB-MSCs에서 효과적으로 제거되지 못하여 세포노화가 일어났다 (도 7). 따라서 hUCB-MSCs에 외부에서 첨가한 항산화제 PEG-catalase는 세포 증식을 증가시키고 세포노화를 감소시켰다. 이 결과들은 hUCB-MSCs는 방사선에 의해 생성되는 ROS 제거에 결함이 있고 외래 투여한 항산화제는 방사선에 의해 생성된 ROS를 제거함을 의미한다.
본 발명을 통하여 알 수 있는 바와 같이, 산화종 및 이온화 방사선은 중간엽줄기세포의 세포노화를 촉진하여 줄기세포로서의 특성을 감소시켰다. 외래에서 투입된 항산화제는 중간엽줄기세포의 산화적 스트레스 및 이온화 방사선에 대한 저항성을 증진하였다. 중간엽줄기세포의 분리 및 배양 시 항산화제 처리는 세포노화를 방지하여 줄기세포로서의 증식을 증진하였다. 그러므로 중간엽줄기세포의 증식 및 줄기세포로서의 특성은 산화적 스트레스를 사용하여 조절될 수 있다.
도 1은 인간 제대혈 중간엽줄기세포(hUCB-MSCs)의 증식이 유전자독성 스트레스에 민감하다는 것을 나타낸 그림으로, (A, B): hUCB-MSCs (MSC1, 2, 3, 및 4), 인간 섬유종 세포(MRC5, HS68), 및 암 세포 (U2OS, HeLa)를 기재된 농도의 과산화수소로 2시간 처리. (C, D): 감마선으로 조사한 세포를 24시간 동안 배양하고 면역염색함. DNA를 DAPI 염색을 사용하여 육안화하였다. Ki-67 또는 BrdU-양성 세포의 비를 각 비처리 또는 처리된 세포로부터 결정한 후 비처리된 세포에 대한 처리된 세포의 상대적인 비율을 그래프 상에서 각각 나타내었다. 각 실험에 대하여 100개 이상의 세포를 검출하는 적어도 세번의 독자적인 실험을 평균하였다. Ki-67 양성 염색을 나타내는 비처리된 세포의 퍼센트는 : 90.5, U2OS; 87.5, HeLa; 73.9, HS68; 83.5, MRC5; 82, MSC1; 81, MSC2; 69.4, MSC3; 및 58.8, MSC4. Brdu 양성 염색을 나타내는 비처리된 세포의 퍼센트는 : 33.3, U2OS; 37.3, HeLa; 36, HS68; 33.7, MRC5; 30.7, MSC1; 30, MSC2; 25.3, MSC3; 및 28.5, MSC4임.
도 2는 hUCB-MSCs에서 DNA 절단은 산화적 스트레스에 민감하다는 것을 나타낸 그림으로, (A, B): 30 분(A) 또는 2 h (B) 동안 기재된 농도의 과산화수소로 처리된 세포를 DNA 손상을 측정하기 위하여 혜성실험에서 분석한 것. (C): 2시간 샘플의 olive tail moment 값을 Komet 7.0 소프트웨어를 사용하여 측정.
도 3은 hUCB-MSCs에서 DNA 손상 후 복구를 나타낸 그림으로, (A, C): 30 분 동안 기재된 농도의 과산화수소로 처리된 세포를 PBS로 세척한 후 기재된 시간 동안 신선한 배지에서 배양한 후 혜성 실험을 수행함. 500 (B) 또는 50 (D) μM의 과산화수소 처리에 대한 olive tail moment 값을 나타냄.
도 4는 산화적 스트레스가 hUCB-MSCs에서 세포 노화를 유도한다는 것을 나타낸 그림으로, (A): 세포를 0 또는 100 μM의 과산화수소로 2시간 배양한 후 세척 후에 4일 동안 더 신선한 배지에서 배양한 후, SA-베타-Gal로 염색. (B): 청색 염색된 세포의 퍼센트(SA-베타-Gal 양성)를 나타냄. 독립적인 3회 실험이 각 실험 당 150 개 이상의 세포에서 수행. (C): 세포를 2000 또는 500 μM의 과산화수소로 2시간 또는 4시간 배양한 후 트립판 블루로 염색하고 사멸된 세포를 헤모사이토미터로 계수함. (D): 10 μM의 TPA로 4시간 처리한 세포를 트립판 블루 용액으로 염색.
도 5는 hUCB-MSCs가 낮은 항산화 활성을 가진다는 것을 나타낸 그림으로, (A): 20 μM의 H2DCFDA로 30분간 배양한 세포를 세척 후 기재된 농도의 과산화수소를 함유한 배지로 30분간 배양. (B): 세포 파쇄액의 전체 항산화 활성을 Trolox E를 사용하여 측정. 1 mg의 세포 파쇄액 당 각 값을 나타냄. (C): catalase, superoxide dismutase (SOD), 및 glutathione peroxidase (GPx)의 활성을 측정함. 1 mg의 세포 파쇄액 당 세포 활성을 나타냄. (D): 각 세포주로부터 40 mg의 전체 단백질을 적당한 항체들로 면역블럿을 하였다. SOD1, superoxide dismutase 1; SOD2, superoxide dismutase 2; GPx1, glutathione peroxidase 1. (E): 각 세포주로부터 1 mg의 mRNA를 실시예에 기재된 프라이머를 사용하여 역전사하였다. 각 RT-PCR 산물의 정량적 데이터를 GAPDH 수준에 대해서 표준화하였다.
도 6은 항산화제의 외래 투입이 산화적 스트레스에 인한 세포 사멸 및 세포 노화로부터 hUCB-MSCs를 막아준다는 것을 보여주는 그림으로, (A): 24시간 동안 200 unit/ml의 PEG-catalase (PEG-Cat)로 배양한 세포를 기재된 농도의 과산화수소를 함유한 신선 배지에서 2시간 동안 배양. 그 세포를 신선 배지로 옮겨서 24시간 배양하고 anti-Ki-67 항체를 사용하여 면역염색함. (B): 24시간 동안 200 unit/ml의 PEG-catalase (PEG-Cat)로 전처리한 세포를 과산화수소를 함유한 신선 배지에서 2시간 동안 배양. 그 세포를 SA-베타-Gal을 사용하여 염색. SA-베타-Gal 양성 세포의 퍼센트를 마이크로그래프의 내부에 표시. (C): 200 unit/ml의 PEG-catalase (PEG-Cat)로 배양한 세포를 500 μM의 과산화수소로 2 또는 4시간 배양하고 수집된 세포를 트립판 블루로 염색하고 계수. (D): hUCB-MSCs MSC1 및 MSC2 세포를 1 mM의 N-acetyl cysteine (NAC)로 6시간 동안 배양하고 그 세포를 기재된 농도의 과산화수소를 함유한 신선 배지에서 2시간 동안 배양. 세포들을 위상차 현미경 하에서 관찰하고 사멸된 세포들을 트립판 블루 염색을 사용하여 계수. 그래프는 3회 독자적인 실험으로부터 얻은 결과를 나타냄.
도 7은 증가된 항산화 활성이 이온화 방사선에 수반하는 세포 노화로부터 hUCB-MSCs를 억제하는 것을 나타낸 그림으로, (A): 24시간 동안 200 unit/ml의 PEG-catalase (PEG-Cat)로 전처리한 hUCB-MSCs MSC1 세포를 감마 선으로 조사한 후 1일 후에 세포를 anti-Ki-67 항체를 사용하여 면역염색. DAPI 염색은 핵을 관찰하기 위하여 사용. Ki-67 염색된 세포의 퍼센트는 그림(상단 패널)에 나타냄. 세 독립적인 실험을 평균화함(하단 패널). (B): 조사 2일 또는 4일 후, MSC1 세포를 SA-베타-Gal을 사용하여 염색하고 위상차 현미경으로 관찰(상단 패널). 그래프는 SA-베타-Gal-염색된 세포의 퍼센트를 나타냄(하단 패널)
도 8은 과산화수소가 hUCB-MSCs의 증식을 저해한다는 것을 나타낸 그림으로, 도 1과 같이 세포를 과산화수소로 처리하고 anti-Ki-67 항체로 면역염색함. 핵을 관찰하기 위하여 DAPI 염색을 사용. 형광 현미경 하에서 세포를 이미지화함.
도 9는 이온화 방사선 조사에 의하여 DNA 손상이 생긴다는 것을 나타낸 그림으로, (A): 감마선 조사된 세포로 그 조사된 세포의 추가적인 배양은 없는 세포를 혜성 실험을 사용하여 분석. (B): Olive tail moments를 도 2에 기재된 것과 같이 측정함.
도 10은 DNA 손상 신호전달 단백질이 hUCB-MSCs에서 활성화된다는 것을 나타낸 그림으로, MSC1 세포를 10 Gy의 감마선, 200 μM의 과산화수소, 또는 10 J/m2 자외선으로 처리. 처리 3 시간 후, 그 세포를 해당 항체로 면역염색함. 핵을 DAPI 염색으로 관찰함.
도 11은 과산화수소는 hUCB-MSCs에서 세포사멸을 유도한다는 것을 나타낸 그림으로, 세포를 기재된 농도의 과산화수소로 2 또는 4 시간 처리한 후 위상차 현미경을 사용하여 관찰함.
도 12는 TPA(phorbol-12-myristate-13-acetate)가 hUCB-MSCs에서 세포 사멸을 야기한다는 것을 나타낸 그림으로, 10 μM의 TPA로 2 또는 4 시간 처리한 세포를 위상차 현미경을 사용하여 관찰함.
도 13은 hUCB-MSCs에서 낮은 항산화 단백질 수준은 낮은 유전자 발현에 기인한다는 것을 나타낸 그림으로, 해당 항체로 면역염색 (A) 및 RT-PCR (B)를 도 5에 기재된 것과 같이 수행.
도 14는 외래적으로 투여된 항산화제가 hUCB-MSCs의 산화적 스트레스에 대한 저항성을 증가시킨다는 것을 나타낸 그림으로, (A, B): hUCB-MSCs (MSC1 및 MSC2) 및 인간 섬유종세포(MRC5 및 HS68)를 200 unit/ml의 PEG-catalase로 미리배양하고 그 세척된 세포를 기재된 농도의 과산화수소를 함유한 배지로 2시간 동안 배양한 후 그 세척된 세포들을 신선 배지에서 24시간 배양 하고 처리 24시간 후 anti-Ki-67 항체로 면역염색을 수반. (C): 그 세포들을 도 6C에 기재된 것과 같이 처리한 후 위상차 현미경으로 이미지화함.
도 15는 증가된 항산화 활성이 hUCB-MSCs에서 이온화 방사선에 대한 저항성을 부여한다는 것을 나타낸 그림으로, 200 unit/ml의 PEG-catalase로 전처리된 인간 1차 세포(MRC5) 및 hUCB-MSCs (MSC2)을 기재된 용량의 이온화 방사산으로 조사함. 조사 1일 후, 그 세포를 Ki-67 항체를 사용하여 면역염색함.
도 16은 제대혈 줄기세포 배양시 (oxidative stress 없는 상태에서) 세포가 노화되며 viability가 감소하는데 항산화제를 첨가하여 배양하면 viabillity감소를 줄일수 있는 결과를 나타낸 그림으로, 이 결과는 줄기세포 분리, 배양 및 보관 시 항산화제를 첨가하면 줄기세포의 수율을 증가시키는데 응용할 수 있음.
이하 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 의도로 기재된 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.
실시예 1: 세포 및 세포배양
hUCB-MSCs는 MEDIPOST Co. Ltd.(대한민국 서울)로부터 얻었다. hUCB-MSCs를 사용한 실험은 MEDIPOST Co., Ltd의 기관생명윤리심의위원회(Institutional Review Board)의 승인을 얻었다. hUCB-MSCs MSC1, MSC2, MSC3, 및 MSC4를 네 다른 공여자로부터 Yang SE, CW Ha, M Jung, HJ Jin, M Lee, H Song, S Choi, W Oh 및 YS Yang. (2004). Cytotherapy 6:476-86;Jang YK, DH Jung, MH Jung, DH Kim, KH Yoo, KW Sung, HH Koo, W Oh, YS Yang 및 SE Yang. (2006). Ann Hematol 85:212-25에 기재된 방법에 따라서 정제하였다. 10% 우태아 혈청(FBS) 및 50 ㎍/ml의 gentamycin(Gibco)가 보충된 최소 필수 알파 배지(알파-MEM)에서 성장한 hUCB-MSCs를 그 지시된 실험에 사용하였다. 노화 시작전(Presenescent) hUCB-MSCs (계대 3에서 5)를 본 발명에서 사용하였다. U2OS (ATCC no. HTB-96), HeLa (ATCC no. CCL-2), HS68 (ATCC no. CRL-1635) 및 IMR90 (ATCC no. CCL-189)는 10% FBS 및 1% penicillin/streptomycin (Welgene)가 보충된 Dulbecco's modified Eagle's 배지에서 성장시켰다.
실시예 2: 유전자혜성 실험( Comet assay )
DNA 절편화를 검출하기 위하여, 알칼라인 혜성 실험을 제조업(Comet Assay®Kit, Trevigen)에 의하여 제공된 지시에 따라서 수행하였다. 수집된 세포를 낮은-녹는점 아가로스와 혼합하고 슬라이드상에 균일하게 스프리드하고 세포 라이시스를 수반하였다. 슬라이드를 4℃에서 알칼라인 풀림 용액(alkaline unwinding solution;pH >13, 200 mM NaOH, 1 mM EDTA)에 1시간 동안 침지한 후 300 mA, 30 분에서 전기영동을 위해서 찬 전기영동 버퍼(pH >13, 200 mM NaOH, 1 mM EDTA)에서 침지하였다. 세포를 SYBR®Green I로 염색하고 형광 현미경하에서 조사하였다. 올리브 테일 모멘트(OTM)의 값은 Komet 7.0 software를 사용하여 정량화하였다.
실시예 3: 면역염색 및 SA -베타- Gal 염색
커버슬립 상에서 성장한 세포를 상온에서 20 분간 4% paraformaldehyde를 사용하여 고정하고 추가로 20분 동안 PBS의 0.5% Triton X-100를 사용하여 침투하였다. 다음, 세포를 Ki-67 (Abcam), BrdU (Amersham), 및 p53 (Santa Cruz)의 검출을 위한 표시된 항체로 면역염색을 하였다.phospho-H2AX (Ser139), phospho-Chk1 (Ser137), 및 phospho-Chk2 (Thr68)에 대한 항체들은 Cell Signaling로부터 구입하였다. SOD1, SOD2, GPx1, catalase , 및 베타-actin (Sigma)에 대한 항체는 웨스턴 블럿 분석에 사용하였다. SA-베타-Gal 염색은 제조업자의 지시에 따라서 SA-베타-Gal staining kit (Cell Signaling)를 사용하여 수행하였다.
실시예 4: 세포 사멸의 카운팅
세포 계수는 트립판 블루(Invitrogen)에서 세포 현탁액의 1:1 희석액을 사용하여 수행하였다. Wei MC, WX Zong, EH Cheng, T Lindsten, V Panoutsakopoulou, AJ Ross, KA Roth, GR MacGregor, CB Thompson and SJ Korsmeyer. (2001). Science 292:727-30에 기재된 것과 같이, 생존 및 사멸 세포들을 각각 트립판 블루 배제 및 염색된 세포로 헤모사이토미터를 사용하여 계수하였다.
실시예 5: 세포내 ROS 수준의 측정
세포내 ROS 수준을 형광 프로브, 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (H2DCFDA: Sigma, USA)를 사용하여 측정하였다. 이것은 세포에서 세포내 에스터레이즈 및 산화에 의하여 형광 생성물, 2',7'-dichlorodihydrofluorescein (DCF)로 전환된다. 형광 강도는 480 nm에서 여기 및 530 nm에서 방출을 가지는FACS Calibur instrument (BD Bioscience)를 사용하여 측정하였다.
실시예 6: 전체 항산화 능력 및 항산화 효소 활성의 측정
세포 파쇄액의 전체 항산화 능력은 제조업자의 지시에 따라서 Antioxidant Assay Kit (Cayman Chemical Co.)를 사용하여 측정하였다. superoxide dismutase, glutathione peroxidase, 및 catalase의 효소 활성은 어세이 키트(Cayman Chemical Co.)를 사용하여 측정하였다.
실시예 7: RNA 추출 및 역전사
RNA는 RNeasy®mini kit (Qiagen)를 사용하여 표시된 세포로부터 추출하였다. 총 1 ㎍의 RNA를 ONE-STEP RT-PCR Premix Kit (Intron)을 사용하여 역전사하였고 하기 프라이머: SOD1, 5'-AAG GCC GTG TGC GTG CTG AA-3' 및 5'-CAG GTC TCC AAC ATG CCT CT-3'; SOD2, 5'-GCA CAT TAA CGC GCA GAT CA-3' 및 5'-AGC CTC CAG CAA CTC TCC TT-3'; GPx1, 5'-CCT CAA GTA CGT CCG ACC TG-3' 및 5'-CAA TGT CGT TGC GGC ACA CC-3'; catalase, 5'-GCA GAT ACC TGT GAA CTG TC-3' 및 5'-GTA GAA TGT CCG CAC CTG AG-3'; GADPH 1, 5'-GAG CTG AAC GGG AAG CTC ACT GG-3' 및 5'-CAA CTG TGA GGA GGG GAG ATT CAG-3'.
통계 분석을 위하여 평균값은 적어도 3회 독자적인 실험에 의하여 얻었고 Microsoft Excel 소프트웨어의 사용을 통하여 그래프 상에서 작도하였다. 모든 경우에 데이터는 P〈0.05의 값을 유의적으로 간주하였다. 각 그래프의 P-값은 OriginPro 소프트웨어로 계산하였다.
상기 실시예의 결과는 다음과 같다.
hUCB - MSCs 의 증식은 유전자독성 스트레스( Genotoxic stress )에 영향을 받음
세포를 과산화수소의 존재하에서 2시간 배양하였다. 그 후 그 세포를 세척하고 24시간 동안 신선한 배지에서 배양하였다(도 1A 및 도 8). 다음 세포 증식을 세포증식 마커인 anti-Ki-67 항체를 사용하여 Ki-67의 면역염색에 의하여 평가하였다. DNA 합성을 anti-BrdU 항체를 사용하여 BrdU 삽입에 의하여 검출하였다. 인간 1차 및 암세포주와 비교하여, 모두 네 타입의 hUCB-MSCs는 과산화수소 처리에서 세포 증식 및 DNA 합성의 현저한 감소를 나타내었다. 또한 이온화 방사선은 hUCB-MSCs의 세포 증식 및 DNA 합성을 감소시켰다(도 1B).
이 결과들은 hUCB-MSCs의 세포증식은 산화적 스트레스에 영향을 받는다는 것을 시사한다. 모두 네 다른 hUCB-MSCs는 과산화수소 및 이온화 방사선에 유사하게 반응하기 때문에 본 발명자들은 이후 실험에서 MSC1 및 MSC2를 사용하였다.
산화적 스트레스는 hUCB - MSCs 의에서 민감하게 DNA 절단을 생성
혜성 분석을 과산화수소로 세포를 처리한 직후에 수행하였다(도 2A 및 B). 테일에서 길이 및 퍼센트 DNA로부터 얻은 계수인 올리브 테일 모멘트(Moneef MA, BT Sherwood, KJ Bowman, RC Kockelbergh, RP Symonds, WP Steward, JK Mellon 및 GD Jones. (2003). Br J Cancer 89:2271-6;Kumaravel TS 및 AN Jha. (2006). Mutat Res 605:7-16)를 DNA 절단을 정량화하는데 사용하였다(도 2C). 인간 1차 및 암 세포는 200 μM의 과산화수소 이상에서 혜성 테일을 나타내지만, hUCB-MSCs MSC1 및 MSC2는 10 μM의 과산화수소에서 용량의존적으로 테일을 생성하기 시작한다.
비록 24시간 조사된 세포의 배양이 수반된 이온화방사선은 hUCB-MSCs의 DNA합성 및 세포 증식을 감소시키지만(도 1B 및 C), 추가 배양없는 이온화방사선 자체는 다른 세포와 유사한 수준의 hUCB-MSCs에서 혜성 테일 생성을 나타낸다(도 9). 이것은 DNA 절단이 과산화수소 유도된 산화적 스트레스 하에서 hUCB-MCSs에서 일어나기 쉽게한다는 것을 시사한다.
혜성 실험은 DNA 절단의 정도 뿐 아니라 DNA 절단의 복구 정도를 측정하는데 사용될 수 있다. DNA 절단의 회복 능력은 혜성 테일의 사라지는데 필요한 시간을 측정하여서 평가하였다 (도 3). 인간 1차 및 암 세포는 500 μM의 과산화수소로 처리하였고; 약 3시간 후, 테일 기저 수준에 도달하였다(도 3A 및 B). 그러나, hUCB-MSCs 테일은 3시간 동안 지속되었다. 동일한 과산화수소 농도는 1차 및 암세포보다 hUCB-MSCs에서 더 심한 DNA 절단을 생성한다 (도 2), hUCB-MSCs를 50 mM의 과산화수소로 처리하고, 그 후에 hUCB-MSCs는 500 μM로 처리된 1차 및 암 세포와 유사한 수준의 혜성 테일을 나타내었다(도 3C 및 D). 50 μM에서 hUCB-MSCs 테일은 3 시간 이내에 기전 수준으로 감소하였다.
또 본 발명자들은 DNA-손상 체크포인트 신호전달에 관여하는 단백질의 활성화를 검출하였다(도 10). DNA-손상 체크포인트 신호전달에 관여하는 H2AX, Chk1, 및 Chk2의 인산화, 및 p53의 축적은 과산화수소, 이온화방사선 및 UV 선 처리를 수반하는 hUCB-MSCs에서 관찰되었다.
산화적 스트레스는 hUCB - MSCs 에서 세포노화를 유도
2시간 동안 과산화수소로 처리한 세포를 세척하고 4일 동안 신선한 배지에서 더 배양하였다(도 4A 및 B). 세포 노화를 검출하는 마커인 senescence-associated beta-galactosidase (SA-베타-Gal)으로 염색한 세포는 ,hUCB-MSCs는 세포 노화를 나타내었다. 또, ≥200 μM 과산화수소는 세포가 세포사멸을 나타내는 둥근, 더 작은 또는 부유하는 형태가 된다(도 10). 트립판 블루 염색은 과산화수소가 hUCB-MSCs에서 세포 사멸을 유도한다는 것을 확인하였다(도 4C). 대조적으로 인간 1차 세포는 세포 노화 및 사멸에 상대적으로 저항적이다. 이것은 준치사량의 과산화수소는 hUCB-MSCs에서 세포 노화를 유도한다는 것을 시사한다.
protein kinase C의 활성화를 통하여 ROS를 생성하는 Phorbol-12-myristate-13-acetate (TPA)는 hUCB-MSCs의 세포 생존을 감소시켰고(도 4D 및 도 11), 이것은 hUCB-MSC의 활성산소종에 대한 민감도는 과산화수소 뿐 아니라 다른 산화적 스트레스에도 민감함을 의미한다.
hUCB-MSCs에서 낮은 항산화 활성
산화적 스트레스에 대한 hUCB-MSCs의 민감도는 이들 세포가 ROS 제거 능력이 저하되어 잇음을 의미한다. 과산화수소로 처리 후, 세포내 ROS의 수준은 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (H2DCFDA)를 사용하여 측정하였다(도 5A). 과산화수소 처리는 인간 1차 및 암 세포에 비하여 hUCB-MSC에서 더 과량의 ROS축적을 야기하였다. 심지어 50 μM의 과산화수소에서, hUCB-MSCs에서 ROS 수준은 1차 및 암 세포에서 200μM에서 보다 더 높았다. 이 증가된 세포내 ROS 수준은 hUCB-MSCs가 ROS 소거에서 결손될 수 있다는 것을 시사한다.
전체 세포 항산화 능력은 수용성 비타민 E 유도체인 Trolox를 사용하여 측정하였다(도 5B). 과산화수소의 부존재에서 성장한 hUCB-MSC 세포의 파쇄액은 섬유종세포 및 암 세포의 것에 비하여 적어도 3배 낮은 항산화 능력을 가졌다. 세포 항산화 활성은 주로 catalase, superoxide dismutase, 및 glutathione peroxidase를 포함하는 ROS를 소거하는 효소의 효과이다. 효소 활성(도 5C), 웨스턴 블럿을 사용하여 결정된 것과 같은 단백질 양(도 5D 및 도 12A), 및 RT-PCR에 의하여 측정된 mRNA 수준(도 5E 및 도 12B)은 섬유종세포 및 암 세포에서보다 더 hUCB-MSCs에서 낮았다. 이 결과들은 hUCB-MSCs의 항산화 능력은 감소된 유전자 발현으로 인하여 낮은 항산화 효소 활성에 의하여 야기된다는 것을 시사한다.
외래 항산화제는 산화적 스트레스에 hUCB-MSCs가 저항성을 가지는 것을 도움
본 발명자들은 catalase의 막 투과 형태인 polyethylene glycol-부착된 catalase (PEG-catalase)를 외래 첨가하여 산화적 스트레스에 저항성을 증가하는지를 조사하였다. PEG-catalase로 전처리는 hUCB-MSCs의 증식은 과산화수소에 대하여 저항성을 가지는 것을 가능하게 하였고(도 6A 및 도 13A) 세포 노화 세포의 군을 감소시켰다(도 6B). 또한 이 처리는 과산화수소-유도된 hUCB-MSC 세포 사멸을 감소시켰다 (도 6C). 대조적으로 인간 섬유종세포의 PEG-catalase 처리는 세포 생존률을 크게 변화시키지 않았다(도 13C). glutathione 합성에 대한 전구체로 작용하는 항산화제 N-acetyl cysteine로 전처리는 hUCB-MSCs에서 과산화수소 유도된 세포 사멸을 감소시켰다(도 6D). 따라서 증가된 항산화 활성은 hUCB-MSCs에서 산화적 스트레스에 대한 저항성을 부여한다. 따라서 산화적 스트레스에 대한 hUCB-MSCs의 민감도는 낮은 세포 항산화 활성으로부터 야기된다.
이온화 방사선은 섬유종 세포 및 암 세포와 비교하여 hUCB-MSCs에서 DNA 합성 및 증식을 감소시킨다(도 1C 및 D).
따라서 본 발명자들은 PEG-catalase로 전처리로부터 야기한 증가된 항산화 활성은 hUCB-MSCs에 대한 이온화방사선에 대한 저항성을 부여하는지를 테스트하였다(도 7). PEG-catalase 전처리는 hUCB-MSCs에서 증식을 증가시켰고(도 7A) 세포노화를 감소시켰다(도 7B). 그러나 PEG-catalase 전처리는 인간 MRC5 세포에 영향이 없었다(도 14). 이 결과들은 이온화 방사선에 대한 세포 증식에서 hUCB-MSCs의 민감도는 적어도 부분적으로 그들의 낮은 항산화 활성에 기인한다는 것을 시사한다.
hUCB-MSCs(MSC1 및 MSC2)를 배양할 때 PEG-catalase를 세포 배양액에 첨가하면 세포노화를 억제하여 증식할 수 있는 세포 수를 증가시켰다 (도 16)
도 16은 방사선, 활성산소종과 같이 산화적 스트레스를 유도한 경우, 즉 외부 산화적 스트레스가 존재하지 않는 상태에서 hUCB-MSCs가 암세포가 아니므로 결국에는 세포노화가 진행되는데 세포 배양시 항산화제를 첨가한 배양액에 키웠을 때 세포노화 진행 속도를 늦출 수 있다는 것을 나타낸다. 이 원리를 생각해보면, 암세포는 세포 배양을 계속 진행하더라도 세포노화가 일어나지 않는다. 하지만 hUCB-MSCs와 섬유종 세포(primary cell) 등의 비암세포는 세포가 일정 횟수의 분열을 진행한 후에는 세포 노화가 진행된다. 하지만 일반적으로 hUCB-MSCs는 primary cell 보다 세포 배양시 세포 노화가 일찍 진행된다고 알려져 있는데, 이 연구 결과를 토대로 생각해보자면, (hUCB-MSCs는 암세포나 primary cell 보다 항산화력이 떨어진 상태이므로) 모든 세포는 정상적인 metabolism 에 의해 세포 내 활성산소종이 증가하는데 hUCB-MSCs는 증가한 활성산소종을 효과적으로 제거하지 못하기 때문에, 세포 내 증가한 활성산소종으로 인해 DNA 손상을 입게 되고 더 많은 양의 DNA 손상으로 인해 세포노화가 일찍 진행되었다고 생각할 수 있다. 반대로 배양액에 항산화제를 첨가해주게 되면 metabolism 의해 생긴 활성산소종을 제거할 수 있기 때문에 primary cell 과 비슷한 정도의 속도로 세포 노화가 진행된다고 생각할 수 있다.

Claims (8)

  1. 항산화제의 외래 투입에 의한 제대혈 중간엽 줄기세포의 세포 노화(cellular senescence) 억제방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항산화제는 폴리에틸렌글리콜-부착된 카탈레이즈(PEG-catalase) 또는 N-아세틸 시스테인(acetyl cysteine)인 것을 특징으로 하는 제대혈 중간엽 줄기세포의 세포 노화(cellular senescence) 억제방법.
  3. 폴리에틸렌글리콜-부착된 카탈레이즈(PEG-catalase) 또는 N-아세틸 시스테인(acetyl cysteine)을 유효성분으로 포함하는 제대혈 중간엽 줄기세포의 세포 노화(cellular senescence) 억제용 조성물.
  4. 준치사량(sub-lethal)의 산화적 스트레스를 제대혈 줄기세포에 처리하여 제대혈 중간엽 줄기세포의 세포 노화를 유도하는 방법.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 산화적 스트레스는 과산화수소, 이온화 방사선, 또는 자외선인 것을 특징으로 하는 제대혈 중간엽 줄기세포의 세포 노화를 유도하는 방법.
  6. 제 4항 또는 제 5항에 있어서, 상기 산화적 스트레스의 준치사량(sub-lethal)은 과산화수소의 경우에는 10∼200μM인 것을 특징으로 하는 제대혈 중간엽 줄기세포의 세포 노화를 유도하는 방법.
  7. 제 4항 또는 제 5항에 있어서, 상기 산화적 스트레스의 준치사량(sub-lethal)은 이온화 방사선의 경우에는 1∼100 그레이(Gy)인 것을 특징으로 하는 제대혈 중간엽 줄기세포의 세포 노화를 유도하는 방법.
  8. 제대혈 중간엽줄기세포의 분리 및 배양시 항산화제를 투여하여 줄기세포로의 특성을 유지하게하여 줄기세포 수율을 증가시키는 방법.
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