CN115216442B - 外泌体的制备方法和培养基及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种外泌体的制备方法和培养基及其应用，涉及外泌体制备的技术领域。该制备方法包括采用丝裂霉素C处理分泌外泌体的细胞。该制备方法可以实现在不改变细胞的代次的情况下，多次获得细胞的外泌体，从而提高了外泌体的产量。缓解了现有技术中存在的，在制备外泌体时，每个代次内仅能收集一次外泌体导致的产量低的技术问题。
Description
技术领域
本发明涉及外泌体制备技术领域，尤其是涉及一种外泌体的制备方法和培养基及其应用。
背景技术
外泌体是一类由细胞分泌直径在30nm～150nm之间的，具有双层脂膜的微小囊泡。其包含原细胞的特异蛋白、miRNA等。目前，对于外泌体，尤其是来自间充质干细胞的外泌体，已有文献报道其具有修复器官，调节免疫功能的作用。
目前提取干细胞外泌体多采用在干细胞融合度达到80％～90％后，收集培养基上清，再采用合适的方法进行制备成干细胞外泌体制剂的方式，但这种方法在每个代次内仅能完成一次外泌体收集。而干细胞其本身临床使用时，对代次有严格规定，这大大限制了外泌体的产量。因此，如何改进外泌体的制备方法是目前有待解决的问题。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种外泌体的制备方法，以缓解现有技术中存在的，在制备外泌体时，每个代次内仅能收集一次外泌体导致的产量低的问题。
本发明的第二目的在于提供一种促进细胞分泌外泌体的培养基。
本发明的第三目的在于提供一种上述外泌体的制备方法，或上述促进细胞分泌外泌体的培养基的应用。
为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种外泌体的制备方法，包括采用丝裂霉素C处理分泌外泌体的细胞。
优选地，所述细胞包括干细胞；
优选地，所述细胞包括间充质干细胞。
优选地，所述制备方法包括：首次收集外泌体后，采用含有丝裂霉素C的培养基培养细胞，更换普通培养基后继续培养细胞并再次收集外泌体。
优选地，在细胞达到80～90％融合度时，首次收集外泌体；
优选地，在细胞达到90％融合度时，首次收集外泌体。
优选地，培养基中丝裂霉素C的浓度至少为0.5μg/ml；
优选地，培养基中丝裂霉素C的浓度为0.5～5μg/ml。
优选地，采用含有丝裂霉素C的培养基培养细胞0.5～3h后更换为普通培养基继续培养；
优选地，采用含有丝裂霉素C的培养基培养细胞2h后更换为普通培养基继续培养。
优选地，所述再次收集外泌体的次数为1～3次；
优选地，收集外泌体的间隔时间为18～36h；
优选地，收集外泌体的间隔时间为24h，共收集3次。
优选地，所述收集外泌体包括采用超速离心的方法收集细胞培养基上清中的外泌体；
优选地，过滤细胞培养基上清，浓缩后再采用超速离心的方法分离细胞培养基上清中的外泌体；
优选地，超速离心细胞培养基上清，复溶沉淀后再次超速离心，收集外泌体；
优选地，超速离心的条件为100,000g转速，离心1h。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种促进细胞分泌外泌体的培养基，所述培养基中含有工作浓度为0.5～5μg/ml的丝裂霉素C；
优选地，所述培养基包括间充质干细胞培养基和的丝裂霉素C。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种上述外泌体的制备方法，或上述促进细胞分泌外泌体的培养基在制备药物中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供了一种外泌体的制备方法，该制备方法包括采用丝裂霉素C处理分泌外泌体的细胞。经丝裂霉素C处理的细胞，能够持续的分泌较高量的外泌体，在收集一次外泌体后，继续培养细胞，仍然可以从细胞培养基上清中分离到较高含量的外泌体。因此本发明提供的制备方法可以实现在不改变细胞的代次的情况下，多次获得细胞的外泌体，从而提高了外泌体的产量。本发明通过实验发现，采用合适浓度的丝裂霉素C处理细胞后，在一代次中多次收集外泌体，外泌体总产量可达单次收集量的约两倍，可见本发明提供的外泌体的制备方法，显著的提高了外泌体的产量，进而为以外泌体为主要或辅助活性成分的药物提供了更多的制备原料，有助于和外泌体相关的药物的研发。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为经丝裂霉素C处理的和未经丝裂霉素C处理的间充质干细胞每次收集上清中的总蛋白浓度的对比；
图2为经丝裂霉素C处理后，多次收集上清中的总蛋白浓度和首次收集上清中的总蛋白浓度对比；
图3为分别采用0.5μg/ml和5μg/ml的丝裂霉素C处理后，制备得到的外泌体的总蛋白浓度。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
需要说明的是：
本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有实施方式以及优选实施方法可以相互组合形成新的技术方案；本文所提到的所有技术特征以及优选特征可以相互组合形成新的技术方案；所涉及的各组分或其优选组分可以相互组合形成新的技术方案。
本发明中，除非有其他说明，数值范围“a～b”表示a到b之间的任意实数组合的缩略表示；本发明所公开的“范围”以下限和上限的形式，可以分别为一个或多个下限，和一个或多个上限。
除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。
丝裂霉素C是从头状链霉菌培养基中分离提取的一种广谱抗肿瘤抗生素，对多种癌症有抗癌作用，其原理是使细胞的DNA解聚，同时阻碍DNA的复制，从而抑制细胞分裂。丝裂霉素C是一种细胞周期非特异性药物，面对细胞周期G1期作用最显著，也对细胞周期S期也起作用。丝裂霉素C临床上目前主要用于胃癌、肺癌、乳腺癌，也用于肝癌、胰腺癌、结直肠癌、食管癌、卵巢癌及癌性腔内积液。也有研究显示丝裂霉素C还可用于预防术后瘢痕黏连和减少瘢痕组织。没有研究显示丝裂霉素C可以用于制备外泌体。
传统获取干细胞外泌体的方法是在干细胞达到约90％融合度时，收集培养上清，连续培养干细胞会导致干细胞老化，使得外泌体得量下降。因此一个代次的干细胞只能收集一次外泌体。收集一次外泌体后的干细胞即使继续培养，也只能收集到低量的外泌体。
本发明发现，丝裂霉素C可以提高外泌体的产量。经丝裂霉素C处理的干细胞，能够持续的分泌较高量的外泌体，在收集一次外泌体后，继续培养干细胞，仍然可以从干细胞培养基上清中分泌到较高含量的外泌体。
基于本发明发现的丝裂霉素C的上述作用，本发明提供了一种在不改变细胞的代次的情况下，多次获得细胞的外泌体的制备方法，该制备方法包括采用丝裂霉素C处理分泌外泌体的细胞。所述丝裂霉素C处理分泌外泌体的细胞中的“处理”指的是使分泌外泌体的细胞与丝裂霉素C形成有效的接触，以使丝裂霉素C对分泌外泌体的细胞形成有效的调控作用，具体的处理形式可采用本领域任选的可接受的形式，例如将丝裂霉素C添加至细胞培养基中，或者将丝裂霉素C与分泌外泌体的细胞混合，在合适的基质和环境中孵育，使丝裂霉素C与细胞形成有效的接触。
几乎所有的活细胞都可以分泌外泌体，因此本发明不限制用于分泌外泌体的细胞的种类，基于目前应用较多的外泌体为来源于干细胞，因此在一些可选的实施方式中，用于制备外泌体的细胞选自干细胞，优选为间充质干细胞。干细胞分泌的外泌体具有多种调控作用，例如促进血管再生、调控与伤口愈合相关的生物过程的相关蛋白质表达、促进成纤维细胞的增殖和迁移以及抑制瘢痕形成。
间充质干细胞是来源于发育早期的中胚层和外胚层，属于多潜能干细胞。最初在骨髓中发现，具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点。目前，国外已有多种以间充质干细胞制剂作为药品用于临床治疗的实例。免疫调节特性和外泌体高生产能力是间充质干细胞所具有的两个显著特征。间充质干细胞衍生的外泌体也具有间充质干细胞的一些免疫调节特性，且间充质干细胞也被认为是产生外泌体能力最强的细胞。间充质干细胞外泌体可以用于治疗肺部、肝脏和神经系统疾病，还具有促进皮肤伤口愈合、软组织修复和缺血心肌修复，抑制疤痕形成、干预肿瘤的发生发展过程等作用。因此基于间充质干细胞的高生产能力以及产生的外泌体具有多种生理调控作用，优选采用间充质干细胞制备外泌体。
在一些可选的实施方式中，所述制备方法包括：首次收集外泌体后，采用含有丝裂霉素C的培养基培养细胞，更换普通培养基后继续培养细胞并再次收集外泌体。
需要说明的是，本发明所述的普通培养基指的是不含有丝裂霉素C的培养基，且所述普通培养基中含有本领域可接受的常规的用于培养细胞的物质，例如用于供给细胞营养和促使细胞生殖增殖的基础物质，以及用于维持细胞生长环境的物质；具体的实例例如可以为但不限于为糖、氨基酸、缓冲物质、抗生素、生长因子、维生素、无机离子和血清中的一种或多种。所述普通培养基可以根据培养的细胞，依据本领域的一般方式进行配制，例如根据本领域众所周知，且如各种一般和更具体的教材、参考文献、工艺手册、商品说明和标准文件等中记载的方法来进行，本发明对此不做限制。所述普通培养基也可以选自市售培养基。
在一些可选的实施方式中，在细胞达到80～90％融合度时，首次收集外泌体，优选在细胞达到90％融合度时，首次收集外泌体。
在一些可选的实施方式中，培养基中丝裂霉素C的浓度至少为0.5μg/ml，本发明通过实验发现，当培养基中含有0.5μg/ml的丝裂霉素C时，就能有效的促进细胞提高外泌体的分泌量，且随着丝裂霉素C的增加并不能进一步的提高外泌体的分泌量，当丝裂霉素C的浓度增加至5μg/ml时，相比于0.5μg/ml的浓度，外泌体的获取量显示稍有下降。因此，培养基中丝裂霉素C的浓度优选在0.5～5μg/ml，例如可以为但不限于为0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5或5μg/ml。
在一些可选的实施方式中，在首次收集外泌体后，先采用含有丝裂霉素C的培养基培养细胞0.5～3h，然后更换为普通培养基继续培养。采用含有丝裂霉素C的培养基培养细胞的时间例如可以为但不限于为0.5、1、1.5、2、2.5或3h，优选为处理2h。
由于本发明采用含有丝裂霉素C的培养基培养处理了用于分泌外泌体的细胞，因此可以实现在一代次细胞中多次收集外泌体，多次收集外泌体可选地按照如下方法实施：将经丝裂霉素C处理后的细胞更换普通培养基培养，在更换普通培养基后至少收集外泌体一次，收集外泌体的间隔时间和收集次数本领域技术人员可根据分泌外泌体的细胞的一般生理生化性质调整，本发明对此不做限制。当更换普通培养基后只收集一次外泌体时，所述间隔时间为更换普通培养基后至收集外泌体的间隔时间；多次收集外泌体时，间隔时间还包括每次收集外泌体之间的间隔时间。收集外泌体的间隔时间优选为18～36h，例如可以为但不限于为18、20、24、30或36h；收集次数例如可以为但不限于为1、2或3次。优选方式为每隔24h收集一次外泌体，共收集3次。
在一些可选的实施方式中，所述收集外泌体包括收集并分离细胞培养基上清中的外泌体，分离细胞培养基上清中的外泌体可采用本领域可接受的一般外泌体分离方法，本发明对此不做限制，例如可以为但不限于为基于超速离心的分离方法、基于尺寸筛的分离方法、基于免疫亲和捕获的分离方法、基于聚合物沉淀的分离方法、极易微流控的分离方法以及基于人工抗体的分离方法。
在一些优选的实施方式中，采用超速离心的分离方法收集外泌体，超速离心的分离方法适用于大剂量样本的分离，分离成本低。优选按照如下方法实施：先过滤细胞培养基上清，将过滤后的细胞培养基上清浓缩后再采用超速离心的方法分离细胞培养基上清中的外泌体，超速离心分离优选分离两次，即将第一次超速离心得到的沉淀复溶后再次超速离心。超速离心的离心条件优选为100,000g转速，离心1h。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种促进细胞分泌外泌体的培养基，所述培养基中含有工作浓度为0.5～5μg/ml的丝裂霉素C，丝裂霉素C的浓度例如可以为但不限于为0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5或5μg/ml。本发明提供的培养基通过添加丝裂霉素C，能够提高细胞在一代次中分泌的外泌体的含量。
本发明提供的培养基除去丝裂霉素C外，还可以含有本领域可接受的任何用于培养细胞的成分，例如用于供给细胞营养和促使细胞生殖增殖的基础物质，以及用于维持细胞生长环境的物质；具体的实例例如可以为但不限于为糖、氨基酸、缓冲物质、抗生素、生长因子、维生素、无机离子和血清中的一种或多种。
在一些可选的实施方式中，所述培养基用于促进间充质干细胞分泌外泌体，因此所述培养基包括间充质干细胞培养基和丝裂霉素C，所述间充质干细胞培养基可选择本领域常规的用于间充质干细胞培养基，本发明对此不做限制。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了上述外泌体的制备方法，或上述促进细胞分泌外泌体的培养基在制备药物中的应用。本发明提供的上述外泌体的制备方法或上述培养基可以提高细胞一代次外泌体的产量，因此将其应用于制备以外泌体作为主要活性成分或辅助成分的药物中，可以提高药物原料的产量，降低药物制备成本。本发明不限制用于制备的药物的用途，所述药物的用途可以为但不限于为修复器官、调节免疫功能、肿瘤治疗或预防或治疗心血管疾病等。
下面结合优选实施例进一步说明本发明的技术方案和有益效果。
实施例1
本实施例提供了一种外泌体制剂的制备方法，包括：
接种密度为6000/cm2的间充质干细胞，待细胞长至90％融合度时收集培养基上清。更换为含0.5μg/ml丝裂霉素C的培养基，处理2h后，更换新鲜培养基继续培养。每24h后收集一次培养基，持续3天。
将每次收集的培养基上清，4℃，2000g离心10min，取上清。0.22μm滤器过滤后，使用100kDa MW超滤管浓缩至10ml。4℃，10万g离心1h，弃上清，加入0.5ml PBS重悬，重复该步骤。0.22μm滤膜过滤后，即为单次收集外泌体制剂。
将各单次收集制得到的外泌体制剂混合到一个管，然后4℃，10万g离心1h，弃上清，加入0.5ml PBS重悬，重复该步骤。0.22μm滤膜过滤后得到多次收集外泌体制剂。
实施例2
接种密度为6000/cm2的间充质干细胞，待细胞长至90％融合度时收集培养基上清。更换为含5μg/ml丝裂霉素C的培养基，处理2h后，更换新鲜培养基继续培养。每24h后收集一次培养基，持续3天。
将每次收集的培养基上清，4℃，2000g离心10min，取上清。0.22μm滤器过滤后，使用100kDa MW超滤管浓缩至10ml。4℃，10万g离心1h，弃上清，加入0.5ml PBS重悬，重复该步骤。0.22μm滤膜过滤后，即为单次收集外泌体制剂。
将各单次收集制得到的外泌体制剂混合到一个管，然后4℃，10万g离心1h，弃上清，加入0.5ml PBS重悬，重复该步骤。0.22μm滤膜过滤后得到多次收集外泌体制剂。
对比例1
接种密度为6000/cm2的间充质干细胞，待细胞长至90％汇合时收集培养基上清。更换新鲜培养基后，每24h收集一次上清。
将每次收集的培养基上清，4℃，2000g离心10min，取上清。0.22μm滤器过滤后，使用100kDa MW超滤管浓缩至10ml。4℃，10万g离心1h，弃上清，加入0.5ml PBS重悬，重复该步骤。0.22μm滤膜过滤后，即为单次收集外泌体制剂。
将各单次收集制得到的外泌体制剂混合到一个管，然后4℃，10万g离心1h，弃上清，加入0.5ml PBS重悬，重复该步骤。0.22μm滤膜过滤后得到多次收集外泌体制剂。
效果例1
测定实施例1和对比例1各单次收集外泌体制剂中的总蛋白浓度，总蛋白浓度根据BCA蛋白浓度测定试剂盒(购置于碧云天生物技术有限公司)的操作说明进行。实验结果如图1所示(****表示表示单次与多次的组比较差异极显著(p＜0.0001))，从图1可以看出，在第一次收集的上清后，实施例1与对比例1的外泌体制剂中总蛋白浓度相当，但是由于经丝裂霉素C的处理，实施例1提供的制备方法在第2次～第4次收集的上清中，还具有较高浓度的总蛋白。即除第一次外，之后每次收集的上清中外泌体的产量，均高于对照组。说明丝裂霉素C诱导了间充质干细胞持续的分泌外泌体，增加了细胞一代次外泌体的产量。
比较实施例1第一次收集后制备得到的单次收集外泌体制剂和实施例1制备得到的多次收集外泌体制剂中的总蛋白浓度，结果如图2所示(***表示单次与多次的组比较差异极显著(p＜0.001))，显示多次收集外泌体量为单次的约2倍。
比较实施例1和实施例2制备得到的多次收集外泌体制剂中的总蛋白浓度，结果如图3所示(**表示两组有显著差异(p<0.01))，从图3可以看出，采用0.5μg/ml丝裂霉素C就能有效的诱导间充质干细胞持续的分泌外泌体，增加丝裂霉素C含量并不能显著提高外泌体产量，反而会降低总产量。因此诱导间充质干细胞持续的分泌外泌体的丝裂霉素C的浓度优选在0.5～5μg/ml。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (6)
1.外泌体的制备方法，其特征在于，接种间充质干细胞，待细胞长至90％融合度时收集培养基上清，更换为含丝裂霉素C的培养基，处理2h后，更换普通培养基继续培养，每24h后收集一次培养基，收集次数为1~3次；
培养基中丝裂霉素C的浓度为0.5~5 µg/ml。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述收集外泌体包括采用超速离心的方法收集细胞培养基上清中的外泌体。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述收集外泌体包括过滤细胞培养基上清，浓缩后再采用超速离心的方法分离细胞培养基上清中的外泌体。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述收集外泌体包括超速离心细胞培养基上清，复溶沉淀后再次超速离心，收集外泌体。
5. 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，超速离心的条件为100,000 g转速，离心1h。
6.权利要求1-5任一项所述的外泌体的制备方法在制备药物中的应用。
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