CN109055306A

CN109055306A - 一种无饲养层无血清培养小鼠精原干细胞的体系及方法

Info

Publication number: CN109055306A
Application number: CN201810673342.8A
Authority: CN
Inventors: 白银山; 朱翠; 刘珊珊; 冯美莹; 詹小舒; 王丙云
Original assignee: Foshan University
Current assignee: Foshan University
Priority date: 2018-06-25
Filing date: 2018-06-25
Publication date: 2018-12-21

Abstract

本发明属于细胞生物学领域，涉及小鼠精原干细胞(SSCs)的无饲养层无血清的培养体系的一种方法，本发明通过多聚赖氨酸处理培养材料，增加小鼠SSCs贴壁能力，通过制作Mef细胞上清液，作为添加剂以增加SSCs体外自我更新的促进作用。本发明通过大量实验优化建立的方法有效的促进了小鼠SSCs无饲养层和无血清条件下体外增殖，其生长速度和在饲养层细胞上生长速度接近，维持了精原干细胞特征性的形态和标志性基因表达，干性相关基因维持了较高的表达水平，这说明利用这种方法切实可以实现小鼠SSCs无饲养层和无血清培养；由于操作步骤简单，重复性高。本发明建立的小鼠生殖干细胞无饲养层培养方案，容易操作和推广。

Description

一种无饲养层无血清培养小鼠精原干细胞的体系及方法

技术领域

本发明属于细胞生物学研究技术领域，涉及小鼠精原干细胞体外培养和转基因操作。

背景技术

精原干细胞(spermatogonial stem cells,SSCs)是一类存在于雄性动物体睾丸内生精小管内侧壁的一类维持增殖和分化平衡的成体干细胞，在体外培养过程中，SSCs可以自发表观重组转变成为具有和胚胎干细胞类似生物学功能的多能干细胞。是成体干细胞研究的一个重点。

国外早已成功建立啮齿动物SSCs长期的培养体系(Falciatori et al.,2008；Hamra et al.,2005；Ogawa et al.,2004；Shen et al.,2008)，且这些培养体系中基本上含有饲养层，而且除啮齿动物外，其他物种和人的SSCs长期培养还未成功，所以小鼠SSCs成为生殖干细胞研究主要细胞材料和模型；SSCs培养体系要求苛刻，需要添加大量因子和添加剂，但仍然很难体外维持培养，成为SSCs研究的主要瓶颈之一；此外SSCs转基因也是非常困难工作，常规细胞转基因方法很难在SSCs中应用，因为存在饲养层细胞，导致转基因效率低，稳转细胞系筛选困难，成为SSCs生物学性质研究的另一个重要制约因素。

在长期的研究中，小鼠SSCs的培养方案日益完善，小鼠胚胎成纤维细胞(mouseembryonic fibroblast cells,Mef)饲养层，可以分泌大量因子和外泌体等，是支持小鼠SSCs体外长期自我更新的重要原因，是研究小鼠SSCs实验室获得成功培养的一个重要材料；无饲养层和无血清的培养成为研究SSCs的一项迫切的技术之一；无饲养层培养对于小鼠SSCs转基因操作中具有重要促进作用，减少Mef在转基因和药物筛选中的干扰；此外，无饲养层培养还可以减少操作步骤，减少因Mef质量而造成小鼠SSCs的影响等；对于提高SSCs转基因效率和稳转细胞系的建立，具有重要意义，是小鼠SSCs生物学性质研究提供重要手段。

2014年日本学者采用添加层粘连蛋白替代饲养层细胞，建立小鼠SSCs体外无饲养层培养的方案(Kanatsu-Shinohara M,Ogonuki N,Matoba S,et al.Improved serum-andfeeder-free culture of mouse germline stem cells[J].Biol Reprod.2014,91(4):88.)；同时韩国学者采用基质胶处理的培养皿方法进行无饲养层培养SSCs，建立无饲养层培养的小鼠SSCs的方法(Choi N Y,Park Y S,Ryu J S,et al.A novel feeder-freeculture system for expansion of mouse spermatogonial stem cells[J].MolCells.2014,37(6):473-479.)。本发明建立的方案和上述研究是不同的，结果也成功实现了小鼠SSCs无饲养层和无血清的长期培养，所以具有创新性。

发明内容

基于此，为了克服上述现有技术的缺陷，本发明提供了一种培养小鼠精原干细胞的培养体系及方法。

本发明的目的在于建立一种无饲养层无血清小鼠SSCs培养方案。

本发明的目的还在于促进小鼠SSCs无饲养层条件下长期维持自我更新。

为了实现上述发明目的，本发明采取了以下技术方案：

一方面，本发明提供了一种小鼠精原干细胞(SSCs)的培养体系，该体系为无血清、无饲养层，以及含有Mef细胞培养上清液。

所述的Mef细胞培养上清液(包含分泌因子和外泌体)用于增加对SSCs自我更新的促进作用。

作为优选的实施方式，所述的Mef细胞上清液的制备方法为：

在含10％FBS的DMEM完全培养基中接种Mef细胞，待细胞长至85-95％时(优选生长到90％)左右时，加入终浓度10μg/mL的丝裂霉素C，黑暗条件下培养4h后(通过添加丝裂霉素C，使饲养层细胞变成不增殖，只能分泌因子和外泌体的细胞)，PBS洗涤三次；随后加入95％Stro-34培养基+1％ITS+55μMβ-巯基乙醇+2％B27+1％L-谷氨酰胺+20ng/mL GDNF+10ng/mL EGF+10ng/mL bFGF+1000IU/mL LIF+1％Penicilin-Stretomycin(青霉素-链霉素)的培养基，培养24h后收集细胞上清液，用0.22μM滤器过滤，即制得Mef细胞上清液，4℃保存，2W内用完。

作为优选的实施方式，Mef细胞上清液该体系中的体积百分比为8～12％。作为更优选的实施方式，Mef细胞上清液该体系中的体积百分比10％。

作为优选的实施方式，本发明培养小鼠SSCs培养体系，含有以下组分：

作为更优选的实施方式，本发明培养小鼠精原干细胞的培养体系，含有以下组分：

另一方面，本发明还提供了一种培养小鼠精原干细胞的方法，使用上述培养小鼠精原干细胞的培养液，包括以下步骤：

(1)利用0.01～0.06％多聚赖氨酸铺板处理，以增加小鼠SSCs贴壁能力；作为优选的实施方式，采用0.01％的多聚赖氨酸铺板处理。

(2)加入上述的培养体系(Stro-34培养基+ITS+β-巯基乙醇+B27+L-谷氨酰胺+GDNF+EGF+bFGF+LIF+双抗(Penicilin-Stretomycin)+Mef细胞上清液)；

(3)再接种0.8～1.2×10⁵个/mL小鼠精原干细胞后；

在5％CO₂和37±1℃的条件下进行培养22～24h后，采取半量换液，换液后培养5～7d，出现典型的精原干细胞集落。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明的培养小鼠精原干细胞的培养液通过添加Mef细胞上清液，其是由Mef细胞培养所分泌的，只使用上清液，不用饲养层，饲养层上清液相比饲养层，存在饲养层分泌的因子和外泌体调控成分，增加了对小鼠SSCs自我更新的促进作用；

(2)采用本发明的培养液培养小鼠SSCs的方法有效的促进了小鼠SSCs无饲养层条件下体外长期自我更新，生长速度和Mef饲养层细胞生长速度相近，保持了小鼠SSCs未分化的特征；

(3)本发明的培养小鼠SSCs的方法操作步骤简单，容易操作、重复性高、成功率高、易于推广。

附图说明

图1为本发明一种无饲养层无血清培养小鼠精原干细胞的体系及方法流程图；

图2为本发明实施例1中小鼠精原干细胞在Mef细胞和无饲养层条件下培养1、7、14和21d的结果，其中，A、B、C和D分别小鼠精原干细胞在Mef细胞上培养1、7、14和21d的结果；E、F、G和H分别为小鼠精原干细胞在无饲养层条件下培养1、7、14和21d的结果；

图3为本发明实施例2中小鼠SSCs的免疫荧光染色结果，其中：A为PLZF免疫荧光染色结果；B为小鼠SSCs GFRA1免疫荧光染色结果；C为小鼠SSCs VASA免疫荧光染色结果；

图4为本发明实施例3中小鼠SSCs的生物学性质分析，其中：A为在饲养层和无饲养层条件下的生长曲线；B为小鼠SSCs无饲养层条件下GFRA1流式纯度分析；C为小鼠SSCs无饲养层条件下凋亡分析；D为小鼠SSCs无饲养层条件AP染色分析；

图5为本发明实施例4中培养的小鼠SSCs多能因子表达量分析，其中，A为经过差速离心纯化的Mef饲养层培养的小鼠SSCs；B为经离心富集的无饲养层培养的小鼠SSCs；C为通过Q-PCR检测Mef饲养层和无饲养层培养小鼠SSCs两组细胞关键基因表达量是否存在差异。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例进一步叙述本发明，本发明未述及之处适用于现有技术。下面给出本发明的具体实施例，但实施例仅是为了进一步详细叙述本说明，并不限制本发明的权利要求。以下实施例中所使用的试剂或原料，如无特殊说明，均来源于市售。

实施例1无饲养层和有饲养层培养的小鼠SSCs的形态比较

有饲养层的培养液配方：

无饲养层的培养液配方：

其中，无饲养层的配方中，Mef饲养层上清液的制备方法为：在含10％FBS的DMEM完全培养基中接种Mef细胞，待细胞长至90％左右时，加入终浓度10μg/mL的丝裂霉素C(Sigma)，黑暗条件下培养4h后(通过添加丝裂霉素C，使饲养层细胞变成不增殖，只能分泌因子和外泌体的细胞)，PBS洗涤三次；随后加入95％Stro-34培养基+1％ITS+55μMβ-巯基乙醇+2％B27+1％L-谷氨酰胺+20ng/mL GDNF+10ng/mL EGF+10ng/mL bFGF+1000IU/mL LIF+1％Penicilin-Stretomycin的培养基培养24h后收集细胞上清液，用0.22μM滤器过滤，即制得Mef饲养层上清液，4℃保存，2周内用完。

无饲养层小鼠精原干细胞的培养：

(1)利用多聚赖氨酸(Sigma-P4707；5倍稀释使用，0.01％使用浓度)铺板处理；

(2)加入80％Stro-34培养基(Invitrogen)+1％ITS(Gibco)+55μMβ-巯基乙醇(Gibco)+2％B27(Gibco)+1％L-谷氨酰胺+20ng/mL GDNF(Peprotech)+10ng/mL EGF(Prospec)+10ng/mL bFGF(Peprotech)+1000IU/mL LIF(Millipore)+1％Penicilin-Stretomycin(Gibco)+10％Mef饲养层上清液；

(3)再接种0.8～1.2×10⁵个/mL小鼠精原干细胞后；

(4)在5％CO2和37±1℃的条件下进行培养22～24h后，采取半量换液，换液后培养5～7d，出现典型的精原干细胞集落；继续培养观察细胞形态。

有饲养层小鼠精原干细胞的培养：无需多聚赖氨酸处理培养器材，不需要添加10％Mef细胞上清液，其他与无饲养层小鼠精原干细胞的培养一样。

从图2可以看出，小鼠SSCs在Mef细胞条件下，在-34SFM培养系统中可以维持典型的克隆集落，生长状态类葡萄状，折光性强，培养21d可以长满培养皿，进行传代(如图2A，B，C和D)；

而采用本发明中实施例1的无饲养层的培养液进行培养，小鼠SSCs也可以维持典型的克隆集落，贴壁效果好，细胞折光性强，具有典型的小鼠SSCs形态(如图2E，F，G和H)。

实施例2无饲养层培养小鼠SSCs生殖因子检测

对采用实施例1的方法培养的小鼠SSCs特异性的生殖因子进行免疫荧光检测，步骤如下：

1)在六孔板中接种6孔，进行小鼠SSCs进行无饲养层培养，待克隆集落长到合适大小时，进行免疫荧光检测；

2)用4％多聚甲醛固定细胞10～30min后，PBS洗3次，每次3min；

3)加入0.5％Triton穿孔破膜处理10min，PBS洗3次，每次3min；

4)加入1％BSA(10％山羊血清)封闭30min(封闭完不用洗)；

5)加入1％BSA稀释的一抗(鼠源PLZF Santa Cruz-sc-28319，鼠源GFRA1 SantaCruz-sc-271546和鼠源VASA Abcam-AB13840)，置于4℃过夜，PBS洗3次，每次5min；

6)加入1％BSA稀释的二抗(绿光二抗Goat Anti-mouse IgG Alexa 488，Invitrogen-A11001和红光二抗Donkey Anti-mouse IgG Alexa 568，Invitrogen-A10037)，置于37℃反应1h，PBS洗3次，每次5min；

7)加入终浓度为10μg/mL的Hochest33342(Molecular Probes公司)对细胞核染色5～10min，PBS洗3次，每次3min；

8)抗淬灭剂封片，拍照。

免疫荧光检测结果显示：小鼠SSCs的克隆集落展现出表达核转录因子PLZF(图3A)，膜表面蛋白GFRA1(图3B)和VASA(图3C)等蛋白，这说明小鼠SSCs在体外维持了自我更新的特征。

试验例3无饲养层培养小鼠SSCs的生物学性质分析

对采用有饲养层培养液和实施例1的无饲养层的方法培养的小鼠SSCs的增殖速度、细胞纯度、细胞凋亡、小鼠SSCs干性进行了检测和分析。

1、细胞计数测定增殖速度

1)取1块6孔板，其中3个孔，在含10％FBS(Gibco)的DMEM完全培养基中接种Mef细胞，待细胞长至90％左右时，加入终浓度10μg/mL丝裂霉素C(Sigma)，黑暗条件下培养4h，然后换用10％FBS(Gibco)的DMEM完全培养基培养，待接入小鼠SSCs细胞；另外3个孔(无饲养层)用0.01％的多聚赖氨酸每孔加入1mL，放入培养箱，超过12h后，弃去多聚赖氨酸液体，添加实施例1的无饲养层培养液，放入培养箱待接入小鼠SSCs细胞；

2)将Mef饲养层扩增小鼠SSCs消化收集后，通过计数，以2×10⁴个的数量接种到6孔板中6个孔中，应用实施例1的培养液进行培养；

3)在培养至7，14和21d时，分别通过胰酶消化差速离心，通过血细胞技术板计算对应的细胞数，最后绘制生长曲线。

结果表明，无饲养层培养小鼠SSCs和在Mef饲养层下培养小鼠SSCs增殖特征相一致，略低于Mef饲养层培养的增殖速度(如图4A)。

2、流式检测细胞纯度

1)收集无饲养层培养小鼠SSCs到15mL离心管中，178g离心3min，去上清，并设置对照组(阴性对照组，即免疫荧光检测第5步中，一抗只加入IgG，其他步骤都相同)；

2)加入4％多聚甲醛固定10～30min后，178g离心3min，PBS洗3次；

3)加入0.5％Triton-100穿孔破膜处理10min，178g离心3min，PBS洗3次；

4)加入1％BSA(10％山羊血清)封闭30min；

5)加入鼠源一抗GFRA1(Santa Cruz-sc-271546)，置于4℃30～60min孵育(对照组加入鼠IgG)；后用PBS洗涤3次，每次5min；

6)试验组和对照组同时加入1％BSA稀释的红光二抗Donkey Anti-mouse IgGAlexa 568，Invitrogen-A10037，置于37℃反应1h，PBS洗3次，每次5min；

7)上机检测。

利用流式细胞仪分析无饲养层条件下小鼠SSCs表达，GFRA1的表达比例达到99.84％，显示了无饲养层条件下，SSCs可以维持自我更新状态，并达到很高比例的纯度(如图4B)；

3、Annexin V/PI双染色法分析细胞凋亡

1)细胞收集：将已制成悬液的小鼠SSCs调至10⁶个/mL，弃去培养液；

2)用孵育缓冲液(10mmol/L HEPES/NaOH，pH7.4，140mmol/L NaCl，5mmol/LCaCl₂)洗涤1次，1000r/min离心5min，弃去上清；

3)用100μL的标记液(FITC-Annexin V和PI加入到孵育缓冲液中，终浓度均为1μg/mL)重悬细胞，室温下避光孵育10～15min；

4)1000r/min离心5min，收集细胞；加入荧光(SA-FLOUS)溶液4℃下孵育20min，避光并不时振动；

5)流式细胞仪分析：流式细胞仪激发光波长用488nm，用一波长为515nm的通带滤器检测FITC荧光，另一波长大于560nm的滤器检测PI。

流式细胞技术进行凋亡分析，显示无饲养层条件下，小鼠SSCs无凋亡(如图4C)；

4、碱性磷酸酶染色进行小鼠SSCs干性分析

1)将要检测的小鼠SSCs加入4％多聚甲醛室温下固定20min，并用PBS洗3遍，每次5min；

2)按照1mL 碱性磷酸酶缓冲液中加入6.6μL NBT和3.3μL BCIP(vector)配制混合液，充分混匀后，加入混合液；

3)室温下闭光孵育10～15min，用PBS清洗并终止反应，显微镜下观察拍照。

碱性磷酸酶染色进行小鼠SSCs干性分析，结果显示无饲养层条件下小鼠SSCs维持干性，未发生分化(如图4D)。

实施例4无饲养层培养小鼠SSCs多能因子表达量分析

Mef饲养层和无饲养层培养小鼠SSCs贴附程度并不相同，通过使用0.25％胰酶(Gibico)消化，3min后，使用含10％FBS(Gibco)的DMEM培养基终止，通过差速离心来纯化Mef饲养层培养的小鼠SSCs(如图5A)；通过离心富集无饲养层培养的小鼠SSCs(如图5B)；通过Q-PCR检测两类细胞关键基因表达量是否存在差异，结果显示Oct4，c-Myc，Klf4和Tet2(这些基因是促进SSCs增殖调控的基因)等表达水平并无明显差异变化，但因子Lin28和Parp1(促进SSCs增殖的基因)呈现了显著上调，结果显示了，无饲养层培养方案和有饲养层方案的差异，显示出无饲养层有促进小鼠SSCs自我更新能力加强的趋势(如图5C)。

其中，定量PCR检测引物如表1所示。

表1定量PCR及检测引物表

备注β-actin为内参引物。

RT-PCR及qRT-PCR实验，包括以下步骤：

1、细胞总RNA的提取(Qiagen微量抽提试剂盒)

1)微量样品，加入新配好的裂解液80μL(裂解液：1mL的Buffer RLT中含10μL巯基乙醇，使用前配制)；

2)加入80μL 70％的乙醇，用枪头混匀，不要离心；

3)将样品转移至试剂盒中提供的Spin column中，装配2mL收集管，轻轻盖上盖子，8000g离心15s，弃去穿透液，放回收集管；

4)加入350μL buffer RW1，轻轻盖上盖子，8000g离心15s，弃穿透液，放回收集管；

5)将80μL DNaseⅠ直接滴到硅质膜上，室温静置15min，务必直接全部滴上，否则DNA会消化不完全；

6)加入350μL buffer RW1，8000g离心15s，弃穿透液及收集管；

7)更换新的2mL收集管，加入500μL buffer RPE(已按要求加入了无水乙醇)，轻轻盖上盖子，8000g离心15s，弃穿透液；

8)加入500μL buffer RPE，轻轻盖上盖子，8000g离心2min，彻底去除乙醇，弃穿透液及收集管，取下Spin column时避免接触到穿透液，乙醇会影响回收；

9)将Spin column移至新的2mL收集管，并开盖做高速离心2min，弃穿透液和收集管。更换新的1.5mL收集管，直接滴加20～40μL RNase-free water在膜中心，最高转速离心2min。重复洗脱一次可增加回收量，-80℃保存或立即合成cDNA。

2、总RNA浓度测定

2％琼脂糖凝胶电泳跑RNA样品检测RNA是否降解，NANODROP 2000检测RNA的浓度及纯度，纯度控制在OD260/OD280为1.8～2.0之间，根据RNA浓度计算出样本RNA调至1μg的体积。

3RT-PCR和qRT-PCR步骤

逆转录检测1st strand cDNA synthesis采用二步法，第一步：反应体系：样本RNA1μg，Random 6mers primer 1μL，dNTP 1μL，蒸馏水配平至10μL，反应条件为：65℃5min，冰上急冷；第二步：反应体系：第一步变性、退火后反应液10μL，5×PrimeScript TM Buffer 4μL，Rnase Inhibitor(40U/μL)0.5μL，PrimeScript TM Rnase(200U/μL)1μL，蒸馏水4.5μL，总体系20μL，反应条件：30℃10min，42℃60min，70℃15min，4℃1h。

qRT-PCR检测采用20μL体系，体系为：SYBR Premix EX Taq 10μL；混合引物(使用浓度10pM)0.8μL；Rox Reference Dye II(50×)0.4μL；DNA模板2μL；无菌水6.8μL。反应条件为：95℃30S，95℃5S、60℃34S(40个循环)，95℃15S，60℃1min，95℃15S。其中β-actin为内参照，所用引物如表1所示。样本中目的基因的相对表达量需用公式计算获得，将对照组目的基因的表达量设定为1。

结果显示Oct4，c-Myc，Klf4和Tet2表达水平无差异；Lin28和Parp1无饲养层培养条件下表达水平显著高于饲养层组(图5)，显示出了无饲养层方案确实有效维持小鼠SSCs自我更新关键因子的表达。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 一种无饲养层无血清培养小鼠精原干细胞的体系及方法

<120> 佛山科学技术学院

<141> 2018-06-22

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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tgctgtccct gtatgcctct g 21

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Claims

1.一种小鼠精原干细胞的培养体系，其特征在于，所述的培养体系无血清、无饲养层，但需要Mef细胞培养上清液。

2.根据权利要求1所述的培养体系，其特征在于，所述的Mef细胞上清液含有Mef细胞分泌因子和外泌体等，可以支持小鼠SSCs体外自我更新。

3.根据权利要求2所述的培养体系，Mef细胞上清液该体系中的体积百分比为8～12％。

4.根据权利要求2所述的培养体系，Mef细胞上清液该体系中的体积百分比10％。

5.根据权利要求1所述的培养体系，其特征在于，含有以下的组分：

6.根据权利要求1所述的培养体系，其特征在于，含有以下的组分：

7.根据权利要求1-6任一所述培养体系，其特征在于，所述的Mef细胞上清液制备方法为：在含10％FBS的DMEM完全培养基中接种Mef细胞，待细胞长至85-95％时，加入终浓度10μg/mL丝裂霉素C，黑暗条件下培养4h后，PBS洗涤三次；加入95％Stro-34培养基+1％ITS+55μMβ-巯基乙醇+2％B27+1％L-谷氨酰胺+20ng/mL GDNF+10ng/mL EGF+10ng/mL bFGF+1000IU/mL LIF+1％Penicilin-Stretomycin的培养基培养24h，后0.22μM滤器过滤，4℃保存，2周内用完。

8.一种培养小鼠精原干细胞的方法，其特征在于，包含以下步骤：

(1)利用0.01～0.06％多聚赖氨酸铺板处理；

(2)加入权利要求1-6任一所述的培养体系；

(3)再接种0.8～1.2×10⁵个/mL小鼠精原干细胞后；

(4)在5％CO₂和37±1℃的条件下进行培养22～24h后，采取半量换液，换液后培养5～7d。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的步骤(1)中，采用0.01％多聚赖氨酸铺板处理。