JP2005058103A - 閉鎖系細胞培養用容器及び該容器を用いた細胞の増殖培養方法、ならびに該培養方法を用いた免疫治療剤、細胞増殖培養用キット - Google Patents

Abstract

【課題】酸素供給のための装置など余分な装置を必要とせずに、細胞の代謝に必要な酸素などの気体を定常的かつ充分に供給することができ、培養用培地、培養細胞の交換等を完全閉鎖系で細胞汚染がなく、しかも輸送も簡便な細胞培養用容器、およびこれを用いた培養方法、免疫治療剤、培養キットを得る。
【解決手段】細胞培養のための閉鎖系蓋つき容器本体の少なくとも一部が気体透過性シートによって形成されている。これにより従来のように気体供給装置等を組み込むことなく、細胞の代謝に必要な酸素が供給でき、培養培地や細胞等の気体や液体の出し入れを完全閉鎖系で簡便におこなうことができる。

Description

本発明は、閉鎖系で無菌的にリンパ球などの細胞を安全かつ効率的に培養することができ、また培地、細胞等の出し入れを完全閉鎖系で行えるる培養用容器、及び該容器を用いた細胞の増殖培養方法、ならびに該培養方法を用いた免疫治療剤に関する。

閉鎖系で細胞の増殖培養をおこなう際には、細胞の代謝に必要な培養用培地や酸素を供給することが不可欠である。 そこで従来は開放系で細胞の増殖培養を行なうための容器としてネジ蓋を有する細胞培養用フラスコやシャーレなどが用いられてきた。 前者のネジ蓋を有する細胞培養用フラスコでは、酸素の供給および細胞の代謝による培地ｐＨの変化を緩和するための５〜１０％程度の炭酸ガスの供給のために、蓋をゆるめて通気を確保したままの状態で作業を継続させるのが一般的な方法であった。 また、後者のシャーレを用いる細胞培養では、蓋をかぶせたときに本体と蓋との間に僅かな隙間を形成するようにして通気性を確保することがおこなわれている。

しかしながら、これらの方法による場合には細菌汚染をしばしば招くために、最近では図２にあらわしたように、閉鎖系フラスコＡにおける本体部Ｂの開口部に嵌め込まれるネジ蓋Ｃの中心に通気性を確保するためのポリエチレンファイバー製のフィルターＦを嵌め込んだものが開発されている。

ところが、ネジ蓋Ｃの中心に通気性を確保するためのポリエチレンファイバー製のフィルターＦを嵌め込んだフラスコＡを用いる場合においては、培養系内に培養用培地を供給・交換する場合、一度、フラスコ容器の蓋を取り外しておこなう必要があるため、開放した部分から細菌が入り込み細菌汚染を起しやすい不都合や、またその部分から培地が染み出し、容器外の細菌汚染がおきる不都合などが生じた。

また閉鎖系培養容器としてバッグ型の培養容器も開発されたが、バッグ型培養容器による培養の場合、支持体が不安定であることから、静置下での培養が困難で、なおかつ培養容器表面に抗体を固相化する際にも抗体使用量が大量になること、また固相化後の抗体の洗浄の方法が煩雑になる等の問題があって実用的ではない。

本発明は、上記した従来技術に鑑みてなされたものであり、培養用培地交換時に開放系にする必要がなく、細胞の代謝に必要な培養用培地などの液体や炭酸ガスなどの気体を閉鎖系で定常的かつ安全に、しかも充分に供給することができ、細菌汚染がなく、輸送も簡便で、さらに容器に抗体などの物質を固相化することが容易な細胞培養用容器を提供することを目的とする。

本発明は、容器の少なくとも一部が容器の内外に通じる気体透過性シートによって形成された閉鎖系細胞培養用容器、および該容器を用いた細胞の増殖培養方法、ならびに該培養方法を用いた免疫治療剤、細胞増殖培養用キットに関し、具体的には請求項１の発明は、蓋つき容器本体の少なくとも一部が気体透過性シートによって形成されている閉鎖系細胞培養用容器に関する。

また請求項２の発明は、気体透過性シートのポアサイズが０．０１μｍ〜１．２μｍの範囲内である請求項１記載の閉鎖系細胞培養用容器に関する。 さらに請求項３の発明は、気体透過性シートのポアサイズが０．１μｍ〜０．２μｍの範囲内である請求項１記載の閉鎖系細胞培養用容器に関する。 さらに請求項４の発明は、気体透過性シートが透明性を有する請求項１〜３のいずれか１に記載の閉鎖系細胞培養用容器に関する。

さらに請求項５の発明は、気体透過性シートがポリオレフィン類等のプラスチック材であるところの請求項１〜４の何れか１に記載の閉鎖系細胞培養用容器に関する。 さらに請求項６の発明は、細胞培養用容器の少なくとも一ヶ所に供給及び排出口を設けた請求項１〜５の何れか１に記載の閉鎖系細胞培養容器に関する。 さらに請求項７の発明は、容器本体内には抗体を固定化できるものであるところの請求項１〜６に記載の閉鎖系細胞培養容器に関する。

さらに請求項８の発明は、蓋つき容器本体の少なくとも一部が気体透過性シートによって形成されている閉鎖系細胞培養用容器内に、末梢血由来細胞または臍帯血由来細胞あるいは骨髄由来細胞に対してＣＤ３抗体等を固定化し、培養用液体培地を入れて細胞の増殖培養をおこなうようにした細胞の増殖培養方法に関する。

さらに請求項９の発明は、蓋つき容器本体の少なくとも一部が気体透過性シートによって形成されている閉鎖系細胞培養用容器を用い、培養用液体培地を用いてＴリンパ球を増殖培養して活性化Ｔリンパ球を得るようにした細胞の増殖培養方法に関する。 さらに請求項１０の発明は、蓋つき容器本体の少なくとも一部が気体透過性シートによって形成されている閉鎖系細胞培養用容器を用い、インターロイキン−２の存在下にＴリンパ球を増殖培養することを特徴とする請求項９に記載の細胞の増殖培養方法に関する。

さらに請求項１１の発明は、蓋つき容器本体の少なくとも一部が気体透過性シートによって形成されている閉鎖系細胞培養用容器を用い、培養用液体培地によりＴリンパ球を増殖培養して得られた活性化Ｔリンパ球含有免疫治療剤に関する。 さらに請求項１２の発明は、蓋つき容器本体の少なくとも一部が気体透過性シートによって形成されている閉鎖系細胞培養用容器と、細胞培養用培地とからなる細胞増殖培養用キットに関する。

さらに請求項１３の発明は、培養用培地がインターロイキン−２を含有するものである請求項１２に記載の細胞増殖培養用キットに関する。 さらに請求項１４の発明は、蓋つき容器本体の少なくとも一部が気体透過性シートによって形成されている閉鎖系細胞培養用容器と、細胞培養用培地と、インターロイキン−２を含有する培養補助剤とからなる細胞増殖培養用キットに関する。

本発明によれば、請求項１〜６の閉鎖系細胞培養容器にあっては、閉鎖系容器本体の少なくとも一部が気体透過性シートによって形成されているところから、従来のように気体供給装置等を組み込むことなく、細胞の代謝に必要な酸素が供給でき、培養培地や細胞等の気体や液体の出し入れを完全閉鎖系で簡便におこなうことができる。

これにより、閉鎖系で無菌的にリンパ球などの細胞を安全かつ効率的で、しかも簡便かつ低コストで培養することができるのみならず、培地を満たした容器内において長時間細胞を維持できることから輸送も簡便になる。 また請求項７〜９の細胞の増殖培養方法にあっては、上記閉鎖系細胞培養用容器を使用することで細胞の安全かつ効率的な増殖培養をおこなうことができる。

さらに請求項１０の活性化Ｔリンパ球含有免疫治療剤にあっては、上記閉鎖系細胞培養用容器を用いた細胞の増殖培養方法により製造されるために、緊急需要に対応でき、しかも必要に応じて随時必要量の活性化Ｔリンパ球含有免疫治療剤を提供することが可能となる。

さらに請求項１１〜１３の細胞増殖培養用キットは、これを備えておくだけで、その場にて必要量の活性化Ｔリンパ球含有免疫治療のための細胞を得ることができるために、危急の需要に対応することが可能である。

以下において本発明の具体的な内容を図１の実施例をもとに説明すると、本発明の細胞培養用容器は、前記したように、容器の少なくとも一部が気体透過性シートで形成され、少なくとも一ヶ所に供給及び排出口を設けたものである。 すなわち図１において１は閉鎖系フラスコの容器本体、２は該容器本体１の一部である天面に施した気体透過性シート、３は容器本体の開口部に取り付けられるネジ蓋、４はネジ蓋３の中心部を貫通して先端を容器本体１内に、また他端を培地供給体ユニット６内に、それぞれ臨ませて両者を連絡する中空のチューブをあらわしている。

容器本体１は、培養条件（培地のｐＨなど）によって変性したり、成分が溶け出したりしない材料が選ばれる。 たとえばアクリル樹脂、スチレン（スチロール）、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリスチレン、ＡＢＳ、ＢＳ、ＴＰＸ製その他、保形性・耐薬品性ならびに液体不透過性を有する材質のものであればよい。 また容器本体１は、細胞培養用容器内の細胞を観察できる程度に、透明性を有することが好ましい。 さらに本発明の細胞培養用容器は、通常の細胞培養を行なうために適した形態であればどのような形態でもよいが、密閉構造であることが好ましい。

なお、本発明における密閉構造とは通常の細胞培養を行なうために充分な通気はできるが、容器本体１内の液体が滲みでたり外部の液体が混入したりしないような構造を意味する。 前記構造は、たとえば酸素、炭酸ガスなどの通気は可能であるが容器内の培地が滲みでたり、そこから細菌汚染をおこしたりしないような構造を意味する。

さらに容器本体１の一部に施される気体透過性シート２は、気体透過性のあるもの、つまり気体のプラスチック材料その他の気体透過性シート２への溶解と拡散によって気体を透過させる働きを有するものである必要がある。 気体透過性シート２を得るための重合成分には、シリコン含有モノマーが好ましく、またこれ以外にも、たとえばフッ素含有モノマー、硬度調節モノマー、親水性モノマー、架橋性モノマーなどの通常コンタクトレンズ材料に用いられる重合性モノマーが含まれていてもよく、またポリオレフィン等の材質でもよい。

なおこの場合に、気体透過性にすぐれ、かつ強度を高めるという理由から、たとえばコンタクトレンズの材料を好適に転用使用することができる。 なお気体透過性シート２の成形方法についてはとくに限定がなく、当業者が通常行なっている成形方法を採用することができる。 かかる成形方法としては、たとえば切削加工法などがある。 切削加工法とは、適当な型または容器中で前記のごとく重合を行ない、たとえば棒状、ブロック状、板状などの素材（ポリマー）をえたのち、切削加工などの機械的加工により所望の形状に加工する方法である。

このようにして得られた気体透過性シート２はどのような形状でもよいが、気体透過性の観点からはフィルム形状が好ましい。 たとえばフィルム形状とした場合、その厚さは気体透過性プラスチック材料の強度付与のためには、０．０１ｍｍ以上、好ましくは０．１ｍｍ以上であることが望ましく、さらに良好な気体透過性の付与のためには、５０ｍｍ以下、好ましくは３０ｍｍ以下であることが望ましい。

すなわち本発明において予定する良好な気体透過性とは、細胞培養する際に細胞の増殖に影響を及ぼさないＣＯ_２、酸素、空気等の気体の通過を意味する。 ただし、気体透過性シートのポアサイズについて、１．２μｍを上回るようにすると気体透過性シートのポアサイズが大きくなり、菌やウイルスが容易にシートを透過し、コンタミネーションの原因となる。

また反対に無菌性を考慮しすぎて、ポアサイズを０．０１μｍを下回るようにするとかえって気体透過性が悪くなり細胞の増殖に悪影響を及ぼす。 したがって本発明において良好な気体透過性を得るためには０．０１μｍ〜１．２μｍの範囲内とするのがよく、さらに良好な細胞の培養を可能とするためには０．１μｍ〜０．２μｍの範囲内とするのが理想的である。

また前記気体透過性シート２は、この場合細胞培養用容器内の細胞を観察できる程度に、透明性を有することが好ましい。

なお、本発明において、前記気体透過性プラスチック材料を親水化させる場合、かかる気体透過性プラスチック材料は、重合成分を重合させて得られた、たとえばブロック状、板状、丸棒状などの所望の形状に加工されていないポリマーであってもよく、該ポリマーから切削加工法などによって得られた、たとえば前記フィルム形状のものであってもよい。

本発明において、プラスチック材料等により構成される前記した気体透過性シート２は、容器本体１のすべてを構成していてもよく、またネジ蓋３等を含めた細胞培養用容器全体を構成していてもよい。 さらに前記気体透過性シート２は培養細胞の接着面を形成していてもよく、たとえば単層培養のばあいには細胞が付着して増殖する面、懸濁培養の場合には浮遊細胞が接着する面構成としてもよい。

なお、前記気体透過性シート２が設けられる面積は、細胞の代謝に必要な酸素などを充分に供給するためには、細胞培養用容器の全表面積に対して１％以上であることが望ましい。 また容器本体１の一部に対する気体透過性シート２の施し方は、たとえば容器本体１の上部天面の一部を切開して開口させるとともに、該開口部を気体透過性シート２で覆い、固定すればよい。

さらにチューブ４は、既述した通りカテーテルなどに汎用されているシリコーン製チューブなどからなり、サンプリングが極力閉鎖的に行えるサンプリング部分になっているのが好ましい。 チューブ４は中空体で、一端をネジ蓋３の中心部を貫通して先端を容器本体１内に、また他端を培地供給体ユニット６内に、それぞれ臨ませて両者を連絡する中空のチューブであり、これによって閉鎖系容器本体１内に対する培地の供給や交換・排出および培地上清や細胞採取をおこなう。

さらにチューブ４の途中には、容器本体１内の培地を排出したり培養上清や細胞を採取するためのサンプリング口５が設けられている。 またサンプリング口５には、通常はその開口部にゴム等の栓体が詰め込まれて閉鎖されている。 一方、培地供給ユニット６は、たとえばシリコーン製チューブ、セルロースアセテート製フィルター、ポンプおよび供給する培地の入った容器などからなる。

上記の構成よりなる細胞培養用容器は、通常行なわれる細胞培養方法に用いることができ、前記培養方法としては、たとえば単層培養、浮遊細胞の静置培養または振盪培養、半固形培養、大量培養、重層化培養などの方法が挙げられる。 さらに、本発明による細胞培養容器の滅菌は各部材を接続する前または接続したのちに行なってもよく、前記滅菌方法としては、たとえばエチレンオキサイドガスによるガス滅菌、紫外線、γ線またはＸ線などによる放射線滅菌、マイクロ波による滅菌などがあげられる。

１．〔閉鎖系培養用フラスコの作製〕
図１にあらわしたような閉鎖系本体容器１からなる培養用フラスコに１０ｃｍ×８ｃｍの大きさで天面の一部を電気カッターで切り取って方形の開口部を開口させる。 さらにフラスコ容器本体１内に空気を吹き付けて切り屑を取り除いた後、上記開口部上に１３ｃｍ×１０ｃｍのフィルター（三菱化学株式会社社製：エクセポール（商品名）：KH2055M）を切り取った穴をふさぐように接着剤にて貼り合わせた。

ついでネジ蓋３の中央に電動ドリルで直径５ｍｍ程度の穴をあけ、その穴に長さ２０ｃｍ、直径３ｍｍのチューブ４の一端をネジ蓋３に溶着して固定するとともに、該ネジ蓋３をフラスコの容器本体１の開口部に螺入締め付けしてしっかりと取り付け、さらにチューブ４の先をチューブシーラーを用いてシールし、透明のビニール袋に入れて包装するとともに、γ線滅菌した。

２．〔閉鎖系培養用抗体固相化フラスコの調製〕
ダルベッコりん酸緩衝液（以下ＰＢＳ（−）と略すこともある）で５μｇ／ｍｌに調製しておいたＯＫＴ３溶液（ヤンセン協和株式会社製）を、上記１で作製した培養用閉鎖系フラスコ内に１０ｍｌ入れ、底面に溶液を均一に浸した。

一晩冷蔵庫で保存後、閉鎖系フラスコのＯＫＴ３溶液を抜き取った。 生理食塩水５０ｍｌをフラスコに注ぎ込み激しく振った後、液を捨てた。 再度、生理食塩水５０ｍｌをフラスコに注ぎ込み激しく振った後、液を捨て、使用直前まで冷蔵庫で使用直前まで保存した。

３．〔開放系培養用抗体固相化フラスコの調製〕
ダルベッコりん酸緩衝液で５μｇ／ｍｌに調製しておいたＯＫＴ３溶液を、前記した閉鎖系培養用フラスコ内に１０ｍｌ入れ、底面に溶液を均一に浸した。 一晩冷蔵庫で保存後、開放系フラスコのＯＫＴ３溶液を抜き取った。 生理食塩水５０ｍｌをフラスコに注ぎ込み激しく振った後、液を捨てた。再度、生理食塩水５０ｍｌをフラスコに注ぎ込み激しく振った後、液を捨て、使用直前まで冷蔵庫で使用直前まで保存した。

４．〔末梢血の提供〕
健常人から末梢血５０ｍｌをヘパリン加採血した。

５．〔リンパ球の調製〕
上記４で採血した末梢血に等量のＲＰＭＩ１６４０培地を加え、予め数本の遠心管（１５ｍｌ）に分注しておいたリンホセパールＩ（免疫生物研究所製）に重層し、１８００ｒｐｍで１５分間遠心した。 遠心後、リンパ球層をピペットにより集め、ＲＰＭＩ１６４０培地３０ｍｌと混和後、２本に分注し、遠心分離を行なった（１８００ｒｐｍ、１０分間）。

上澄みを除去後、細胞ペレットを良くほぐし、これに培養液（カナマイシン６０μｇ／ｍｌ、ストレプトマイシン２０μｇ／ｍｌ、グルタミン２ｍＭ、オキザロ酢酸１ｍＭ、ピルビン酸ナトリウム１ｍＭ、ＨＥＰＥＳ１０ｍＭ、インスリン０．２Ｕ／ｍｌを含むＲＰＭＩ１６４０培地に、ヒト血清１０％およびインターロイキンー２ ７００Ｕ／ｍｌを添加したもの）５０ｍｌをそれぞれのチューブに加え、細胞懸濁液を調製した。

上記２．の「閉鎖系培養用抗体固相化フラスコの調製」、および３．の「開放系培養用抗体固相化フラスコの調製」により作製したＯＫＴ３固相化フラスコ（閉鎖系フラスコおよび開放系フラスコ）をＰＢＳ（−）により２回洗浄した。 洗浄後、上記細胞懸濁液をＯＫＴ３固相化フラスコに接種し、５％炭酸ガス、飽和湿度下、摂氏３７度で培養をおこなった。 接種時の細胞数はそれぞれ総細胞数は１．０×１０^７個（細胞濃度は２×１０^５個／ｍｌ）だった。

さらに３日後に、これに培養液５０ｍｌを加え、４日後にさらに培養液１５０ｍｌを加え、懸濁後培養を行なった。 ７日後に、フラスコ内の培養液約２５０ｍｌ（閉鎖系フラスコの総細胞数は３．１×１０^８個、開放系フラスコの総細胞数は３．３×１０^８個だった。）を、ＬＬ−７培養液（日研生物医学研究所製）７５０ｍｌに加え、ガス透過性培養バッグを用いて、５％炭酸ガス存在下、摂氏３７度にて培養させた。

さらに、１２日目に１リットルの培養液を加え、これを２バッグのガス透過性培養バッグで培養した。 １６日目に細胞をカウントしたところ、閉鎖系フラスコからの培養の総細胞数は５．９×１０^９個、開放系フラスコの総細胞数は６．２×１０^９個だった。 この場合、閉鎖系培養での培地の添加、細胞懸濁液のサンプリングは全て無菌接合装置とシーラ―を用い閉鎖的に行った。

６．〔トリパンブルー溶液による細胞数の測定〕
上記５．において、細胞数測定用にサンプリングした細胞懸濁液１０μｌを２０μｌのトリパンブルー溶液と混合し、血球計算版に１０μｌアプライし、顕微鏡下で細胞数を測定した。

７．〔細胞の表面抗原の解析〕
上記５．において１６日目の細胞懸濁液をサンプリングし、遠心機を用い、６０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心し、細胞を沈殿させた。 上清をきれいに吸い取った後、ＰＢＳ（−）８μｌ、ＣＤ３／ＨＬＡ―ＤＲ抗体８μｌとＣＤ４／ＣＤ８抗体８μｌをそれぞれのチューブに入れ良く攪拌した後、４℃で３０分間反応させた。

反応後、シース液８００μｌをそれぞれのチューブに入れ、ボルテックスで攪拌した後、６，０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心し、細胞を沈殿させた。 上清をきれいに吸い取った後、シース液を８００μｌ加え、ピペッティングし、細胞をほぐした後、ＦＡＣＳ測定用チューブに入れた。

この場合のＦＡＣＳはＦＡＣＳｃａｎを使用した。 ＦＡＣＳの測定はマニュアルに従って行った。 その結果、ＣＤ３、ＨＬＡ―ＤＲ、ＣＤ４及びＣＤ８陽性細胞の占める比率は閉鎖系フラスコからの培養の場合は９８、８２、３２及び２８％であるのに対し、開放系フラスコの場合は９８、７９、３０及び２０％であり、これにより閉鎖系フラスコを用いた培養法はＴ細胞を活性化・増殖することに優れていることが明らかとなった。

また、蓋つき容器本体の少なくとも一部が気体透過性シートによって形成されている閉鎖系細胞培養用容器内に、末梢血由来細胞または臍帯血由来細胞あるいは骨髄由来細胞に対してＣＤ３抗体あるいはインターロイキン−２の存在下等の培養用液体培地を混ぜた混合液を入れてＴリンパ球などの細胞の増殖培養をおこなう細胞の増殖培養方法を実施することもできる。

さらに上記閉鎖系細胞培養用容器を用い、培養用液体培地によりＴリンパ球を増殖培養することによって活性化Ｔリンパ球含有免疫治療剤を得ることもできる。 さらに上記閉鎖系細胞培養用容器と、インターロイキン−２などを含有する胞培養用培地、あるいはインターロイキン−２を含有する培養補助剤などを１組とした細胞増殖培養用キットとして用いることも可能である。

上記の構成よりなる閉鎖系の細胞培養用容器、およびこれを用いた細胞の増殖培養方法、ならびに該培養方法を用いた免疫治療剤、細胞増殖培養用キットは、既述したように通常行なわれる細胞培養方法に用いるほかに、培養細胞としては例えばリンパ球細胞、造血幹細胞、皮膚細胞、軟骨細胞、骨細胞、歯細胞などヒト由来細胞であれば適用が可能である。

また通常の動物細胞や植物細胞でもよく、前記培養細胞としては、たとえば線維芽細胞（３Ｔ３細胞など）、哺乳動物皮膚由来表皮細胞または線維芽細胞、メラノサイト、メンケル細胞、血管内皮細胞、ハイブリドーマなどがあげられる。 またこの場合の細胞培養に用いられる培地は、通常の細胞培養に用いられる液体培地、半固形培地、固形培地であればよく、培養の目的、培養する細胞などに応じて選択される。

本発明の一実施例である閉鎖系細胞培養用容器の使用状態をあらわした概略斜視図。 従来の細胞培養用容器の一例をあらわした斜視図。

符号の説明

１ 閉鎖系容器本体
２ 気体透過性シート
３ ネジ蓋
４ チューブ
５ サンプリング口
６ 培地供給ユニット

Claims (14)

1. 蓋つき容器本体の少なくとも一部が気体透過性シートによって形成されている閉鎖系細胞培養用容器。
2. 気体透過性シートのポアサイズが０．０１μｍ〜１．２μｍの範囲内である請求項１記載の閉鎖系細胞培養用容器。
3. 気体透過性シートのポアサイズが０．１μｍ〜０．２μｍの範囲内である請求項１記載の閉鎖系細胞培養用容器。
4. 気体透過性シートが透明性を有する請求項１〜３のいずれか１に記載の閉鎖系細胞培養用容器。
5. 気体透過性シートがポリオレフィン類等のプラスチック材であるところの請求項１〜４の何れか１に記載の閉鎖系細胞培養用容器。
6. 細胞培養用容器の少なくとも一ヶ所に供給及び排出口を設けた請求項１〜５の何れか１に記載の閉鎖系細胞培養容器。
7. 容器本体内には抗体を固定化できるものであるところの請求項１〜６に記載の閉鎖系細胞培養容器。
8. 蓋つき容器本体の少なくとも一部が気体透過性シートによって形成されている閉鎖系細胞培養用容器内に、末梢血由来細胞または臍帯血由来細胞あるいは骨髄由来細胞に対してＣＤ３抗体等を固定化し、培養用液体培地を入れて細胞の増殖培養をおこなうようにした細胞の増殖培養方法
9. 蓋つき容器本体の少なくとも一部が気体透過性シートによって形成されている閉鎖系細胞培養用容器を用い、培養用液体培地を用いてＴリンパ球を増殖培養して活性化Ｔリンパ球を得るようにした細胞の増殖培養方法。
10. 蓋つき容器本体の少なくとも一部が気体透過性シートによって形成されている閉鎖系細胞培養用容器を用い、インターロイキン−２の存在下にＴリンパ球を増殖培養することを特徴とする請求項９に記載の細胞の増殖培養方法。
11. 蓋つき容器本体の少なくとも一部が気体透過性シートによって形成されている閉鎖系細胞培養用容器を用い、培養用液体培地によりＴリンパ球を増殖培養して得られた活性化Ｔリンパ球含有免疫治療剤。
12. 蓋つき容器本体の少なくとも一部が気体透過性シートによって形成されている閉鎖系細胞培養用容器と、細胞培養用培地とからなる細胞増殖培養用キット。
13. 培養用培地がインターロイキン−２を含有するものである請求項１２に記載の細胞増殖培養用キット。
14. 蓋つき容器本体の少なくとも一部が気体透過性シートによって形成されている閉鎖系細胞培養用容器と、細胞培養用培地と、インターロイキン−２を含有する培養補助剤とからなる細胞増殖培養用キット。

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