KR20160131117A - 복실 배양 용기 및 세포 배양 방법 - Google Patents

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Abstract

복수의 서로 다른 배양 조건에서 배양된 세포를 간편한 작업으로 옮기기 가능한 배양 용기를 제공한다.가스 투과성을 가진 재료를 가공해서 이루어지는 복실 배양 용기 (1)이며, 세포를 배양하기 위한 배양실이 두개 이상 형성되고, 각 배양실 (11, 12)은 적어도 하나의 다른 배양실과 연통하고, 복실 배양 용기의 외부와 연통하기 위한 외부 접속부 (111,121)를 적어도 하나 갖춘 복실 배양 용기로 한다.

Description

복실 배양 용기 및 세포 배양 방법{MULTI-CHAMBER CULTURE VESSEL AND CELL CULTURING METHOD}
본 발명은 세포 배양 기술에 관한 것이며, 특히 여러 다른 배양 환경, 배양 조건에서 세포를 배양 가능한 세포 배양 용기에 관한 것이다.
최근 의약품 생산이나 유전자 치료, 재생 의료, 면역 요법 등의 분야에서 세포나 조직 등을 인공적인 환경 하에서 효율적으로 대량으로 배양하는 것이 요구되고 있다.
세포나 조직 등의 배양 과정에서는, 복수의 서로 다른 배양 환경이나 배양 조건이 필요한 경우가 있다. 또한 여러 서로 다른 배양 환경이나 배양 조건에서 배양된 세포를, 나중의 공정에서 혼합하는 경우도 있다. 이러한 경우에는, 배양된 세포를 복수의 용기 사이에서 옮길 필요가 있었다.
그러나 이러한 세포의 이동을 개방계에서 실시하면 오염을 발생시키는 위험성이 있기 때문에 세포의 이동을 수작업으로 하는 경우는 무균 환경 하에서 작업할 필요가 있었다. 더욱이 이와 같이 세포를 복수의 용기 사이에서 옮기는 경우에는 용액이 흐를 수 있고, 또한 용기의 대응 관계를 엄격히 관리해야 하므로 취급이 번잡하다는 문제가 있었다.
여기서 세포의 이동이나, 배양액의 추가 시에서의 오염을 방지 가능한 기술로서 복수의 배양 용기를 접속함으로써 밀폐계의 세포 배양 키트를 구성하고, 이를 사용하여 세포 배양을 하는 것이 제안되고 있다(특허 문헌 1, 2참조).
일본특허 공개공보 2007-175028호 공보 일본특허 공개공보 2005-058103호 공보
그러나 이와 같은 세포 배양 키트를 사용하더라도 그 취급의 번거로움을 충분히 개선하지 못 하였다.
즉, 이러한 세포 배양 키트를 사용한 경우, 접속하는 배양 용기의 수가 많아지면 튜브가 꼬이거나 또는 배양 용기가 뒤섞여서 어느 것이 어느 것인가를 알 수 없게 되거나 하는 등 역시 그 취급이 번잡하게 된다는 문제가 있었다.
또한 최근에는 자동 세포 배양 장치를 사용한 세포 배양 방법도 제안되었으나, 이러한 복수의 용기로 구성된 세포 배양 키트의 자동 세포 배양 장치에 대한 장착 작업은 매우 번잡하게 되어 버린다는 문제도 있었다.
또한, 림프구 배양을 실시하는 경우, 종래는 일반적으로 항 CD3항체를 고정화한 플라스크에 림프구를 넣어 활성화시킨 후, 활성화된 림프구를 증폭용 배양 백에 옮겨서 배양을 하고 있었다.
현재는 기술적으로는 가스 투과화성을 가진 필름 재료로 구성된 배양 백의 내면에 항 CD3항체를 고정화하여 활성화용 배양 백을 제작하고 이를 증폭용 배양 백에 접속하여 세포 배양 키트를 구성하고, 자동 세포 배양 장치를 사용하여 림프구 배양을 하는 것도 가능하게 되어 있다.
그러나 이와 같은 활성화용 배양 백은 플라스크에 비해서 비용이 상당히 커짐으로 플라스크에서 활성화용 배양 백으로의 치환은 쉽게 이뤄질 수 없었다.
그래서 본 발명자들은 예의 연구하여 하나의 배양 백 내에 복수의 배양실을 형성하여 이들을 연통함으로써 제조 비용이 낮고 취급이 매우 간편한 배양 용기를 제조하는 데 성공하여 본 발명을 완성시켰다.
즉, 본 발명은 여러 서로 다른 배양 환경이나 배양 조건에서 배양된 세포를 간편한 작업으로 옮기기 가능한 복실(復室, Multi-chamber) 배양 용기 및 이를 사용한 세포 배양 방법의 제공을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위해 본 발명의 복실 배양 용기는 가스 투과성을 가진 재료를 가공해서 이루어지는 복실 배양 용기이며, 세포를 배양하기 위한 배양실이 두개 이상 형성되고, 각 배양실은 적어도 하나의 다른 배양실과 연통하고, 또한 상기 복실 배양 용기의 외부와 연통하기 위한 외부 접속부를 적어도 하나 갖춘 구성으로 되어 있다.
또한 본 발명의 세포 배양 방법은 상기의 복실 배양 용기를 사용한 세포 배양 방법이며, 상기 복실 배양 용기에서의 상기 배양실로서, 림프구를 활성화시키기 위한 항 CD3항체가 고정화된 활성화 배양실과, 활성화된 림프구를 증폭시키기 위한 증폭 배양실이 형성되고, 림프구 및 배양액을 상기 활성화 배양실에 주입하여, 상기 활성화 배양실에서 림프구를 활성화시키고 상기 활성화 배양실에서 상기 증폭 배양실에 활성화된 림프구 및 배양액을 이송하여, 상기 증폭 배양실에서 림프구를 증폭시키는 방법으로 되어 있다.
또한 본 발명의 세포 배양 방법은 상기의 복실 배양 용기를 사용한 세포 배양 방법이며, 상기 복실 배양 용기에서의 상기 배양실로서 백혈구를 림프구와 접착계 세포로 분리하여 접착계 세포를 배양하기 위한 접착계 세포 배양실과, 림프구를 활성화시키기 위한 항 CD3항체가 고정화된 활성화 배양실과, 림프구를 증폭하기 위한 증폭 배양실이 형성되고,
혈액에서 분리된 백혈구 및 배양액을 상기 접착계 세포 배양실에 주입하여 정치하고, 상기 백혈구에서의 접착계 세포를 상기 접착계 세포 배양실 내의 저면에 접착시키고, 이어서 상기 접착계 세포 배양실에서 상기 활성화 배양실에 상기 백혈구에서의 림프구와 배양액을 이송하여, 상기 활성화 배양실에서 림프구를 활성화시키고, 상기 접착계 세포 배양실에 수지상(樹枝狀) 세포에 대한 유도 인자를 포함한 배양액을 주입하여 상기 접착계 세포를 배양하고, 상기 접착계 세포를 수지상 세포에 유도하여, 상기 활성화 배양실에서 상기 증폭 배양실에 활성화된 림프구 및 배양액을 이송하여, 상기 증폭 배양실에서 림프구를 증폭시키는 방법으로 되어있다.
본 발명에 따르면 복수의 서로 다른 배양 조건에서 배양된 세포를 간편한 작업으로 옮기기 가능한 복실 배양 용기 및 이를 사용한 세포 배양 방법을 제공할 수 있다.
도 1은 본 발명의 제1 실시형태에 관한 복실 배양 용기를 나타내는 도이다.
도 2는 본 발명의 제2 실시형태에 관한 복실 배양 용기를 나타내는 도이다.
도 3은 본 발명의 제3 실시형태에 관한 복실 배양 용기를 나타내는 도이다.
도 4는 본 발명의 제3 실시형태에 관한 복실 배양 용기를 사용한 내용물의 이송 방법을 나타내는 도이다.
도 5는 본 발명의 제4 실시형태에 관한 복실 배양 용기를 나타내는 도이다.
도 6은 본 발명의 제5 실시형태에 관한 복실 배양 용기를 나타내는 도이다.
이하, 본 발명의 복실 배양 용기 및 세포 배양 방법의 실시형태에 대해서 자세히 설명한다.
[제1 실시형태]
먼저 본 발명의 제1 실시형태에 관한 복실 배양 용기 및 세포 배양 방법을 도 1을 참조하여 설명한다.
본 실시형태의 복실 배양 용기는 가스 투과성을 가진 재료를 가공해서 이루어진 복실 배양 용기이며, 세포를 배양하기 위한 배양실이 두개 이상 형성되어, 각 배양실은 적어도 하나의 다른 배양실과 연통하고 또한 복실 배양 용기의 외부와 연통하기 위한 외부 접속부를 적어도 하나 갖춘 것을 특징으로 한다.
구체적으로는 도 1에서 복실 배양 용기 (1)는 세포를 배양하기 위한 배양 구획으로서, 배양실 (11)과 배양실 (12)을 갖추고 있다.
배양실 (11)에는 복실 배양 용기 (1)의 외부와 연통하기 위한 외부 접속 포트 (111)와, 다른 배양실과 연통하기 위한 실 간 접속 포트 (112)와 샘플링을 위한 샘플링 포트 (113)가 갖추어져 있다.
외부 접속 포트 (111)는 도시하지 않았지만, 튜브 (2)를 통하여 배양액 공급 용기 등에 접속되어 배양실 (11)에 대한 배양액의 공급을 위해서 사용된다.
실 간 접속 포트 (112)는 배양실 (12)의 실 간 접속 포트 (122)에 튜브 (2)를 통해서 접속되어 배양실 (12)의 내용 액을 배양실 (11)에 이송하기 위해서 사용된다.
샘플링 포트 (113)는 배양실 (11)에서 배양된 세포의 샘플링을 하기위해서 사용된다.
배양실 (12)에는 복실 배양 용기 (1)의 외부와 연통하기 위한 외부 접속 포트 (121)와 다른 배양실과 연통하기 위한 실 간 접속 포트 (122)가 갖추어져있다.
외부 접속 포트 (121)는 도시하지 않았지만 튜브 (2)를 통해서 세포 공급 용기 등에 접속되어 배양실 (12)에 대한 세포 주입을 할 때 사용된다.
실 간 접속 포트 (122)는 배양실 (11)의 실 간 접속 포트 (112)에 튜브 (2)를 통해서 접속되어 배양실 (12)의 내용 액을 배양실 (11)에 이송하기 위해서 사용된다.
복실 배양 용기 (1)를 형성하는 재료로는 세포 배양에 필요한 가스 투과성을 가지고 있는 것이 필요하다. 구체적으로는 5000ml/m2 · day · atm(37℃-80%RH)이상의 산소 투과율을 가지는 것이 바람직하다. 또한 배양 용기 재료는 복실 배양 용기 (1)에서의 내용물을 확인할 수 있도록 투명성을 가지고 있는 것이 바람직하다. 또한 배양 용기 재료는 높은 세포 증식 효율을 실현하기 위해서, 저 세포 독성, 저 용출성 및 방사선 멸균 적성을 가진 것이 바람직하다.
이와 같은 조건을 충족시키는 재료로서는 폴리 에틸렌 수지가 바람직하다. 폴리 에틸렌 수지로는 예를 들어, 폴리 에틸렌, 에틸렌과 α-올레핀의 공중합체, 에틸렌과 초산 비닐의 공중합체, 에틸렌과 아크릴산이나 메타 크릴산 공중합체와 금속 이온을 사용한 아이오노머 등을 들 수 있다. 또한 폴리올레핀, 스티렌계 엘라스토머, 폴리에스테르계 열 가소성 엘라스토머, 실리콘계 열 가소성 엘라스토머, 실리콘 수지 등을 사용할 수도 있다.
이와 같은 가스 투과성 재료를 가열 밀봉(heat seal) 가공이나, 압축 공기 성형, 진공 성형 등의 시트 성형함으로써 본 실시형태의 복실 배양 용기 (1)를 제조할 수 있다.
본 실시형태의 복실 배양 용기 (1)의 형상은 특히 한정되지 않지만 거의 직사각형 모양의 것을 알맞게 사용할 수 있고, 그 내부에 형성되는 각 배양실의 형상도 거의 직사각형 모양으로 하는 것이 바람직하다.
본 실시형태의 복실 배양 용기 (1)에서 각 배양실에 각각 서로 다른 배양기자재를 갖추고, 각각 서로 다른 배양 환경, 배양 조건에서의 세포 배양을 할 수 있도록 하는 것도 바람직하다. 배양실이 세 개 이상일 경우에는 전부의 배양실에 각각 서로 다른 배양기자재를 갖춘다 해도 일부의 배양실에 각각 서로 다른 배양기자재를 갖춰도 된다.
본 실시형태의 복실 배양 용기 (1)에 의한 배양 용도는 특히 한정되지 않지만, 예를 들면, 림프구 배양, DC-LAK요법 (수지상 세포, 림프구 배양), ES세포(배아줄기세포) 배양, iPS세포(유도 만능줄기세포) 배양 등에 알맞게 사용할 수 있다.
이하, 본 실시형태의 복실 배양 용기 (1)에서 복수의 서로 다른 배양 환경, 배양 조건을 형성한 경우의 세포 배양에 대해서 구체 예를 들어 설명한다.
[림프구 배양]
림프구 배양을 실시하는 경우, 배양실 (11)은 그 내면에 특별한 처리를 하지 않고 림프구를 증폭시키기 위한 증폭 배양실로 사용하며, 배양실 (12)은 그 내면에 항 CD3항체를 코팅(고정화) 하여, 림프구를 활성화시키기 위한 활성화 배양실로 쓸 수 있다.
그리고 도 1에 도시한 바와 같이, 배양실 (11)과 배양실 (12)을 접속하는 튜브 (2)에 클립 등의 유로 개폐 수단을 장착하여, 튜브 (2)에서의 유로의 개폐를 제어한다. 또한 유로 개폐 수단으로는 예를 들면 핀치 밸브나 2방 활전(二方活栓) 등을 사용할 수도 있다.
그리고 림프구 및 배양액을 배양실 (12)에 주입하고, 배양실 (12)에서 림프구를 활성화시킨다. 배양실 (12)에 주입한 림프구는 약 3일 정도의 항 CD3항체의 자극에 의해서 활성화된다.
그 후 튜브 (2)의 유로를 개방하고, 배양실 (12)에서 배양실 (11)에 활성화된 림프구 및 배양액을 이송하고, 배양실 (11)에서 림프구를 증폭시킨다.
이 때, 림프구의 증폭과 함께, 배양실 (11)에 배양액을 추가하고, 약 4일에서 10일 정도에서 활성화된 T림프구를 대량으로 얻을 수 있다.
또한 배양실 (12)의 내면에 그 밖의 생리 활성 물질을 코팅하고, 기타의 세포를 활성화시킨 후 이를 배양실 (11)로 이송하여, 증폭시킬 수도 있다.
[ES세포의 배양]
ES세포의 배양을 하는 경우, 배양실 (11)은 그 내면에 마트리겔(matrigel) 코팅 처리를 하여, ES세포를 증폭시키기 위한 ES세포 배양실로서 사용하고, 배양실 (12)은 미토바이신 C 처리한 MEF(마우스 태아 섬유 아세포)를 충전하여 MEF를 배양하기 위한 MEF배양실로 사용할 수 있다.
다음에 배양실 (12)에서 MEF용 배양액을 제거한 후, 사람 ES세포용 배양액으로 세척하여 배양실 (12)에 사람 ES세포용 배양액을 충전하여, 37℃, 2% 이산화탄소 농도의 조건하에서 MEF를 하룻밤 배양한다. 다음날, 튜브 (2)에서의 유로를 개방하고, 배양실 (12)에서 배양실 (11)로 배양 상등액을 이송한다. 이로써, 배양실 (11)을 MEF-conditioned 배양액을 갖춘 배양실로서 사용할 수 있다.
그리고 미리 준비한 사람 ES세포를 배양실 (11)에 파종하여, MEF-conditioned 배양액(bFGF를 첨가해둔다)에 의해서 37℃, 2% 이산화탄소 농도의 조건하에서 배양하여 사람 ES세포를 증폭시킬 수 있다.
이와 같이 본 실시형태의 복실 배양 용기 (1)에 따르면 오염의 발생을 방지할 수 있고, 또한 배양실 (11)과 배양실 (12)을 일체적으로 다룰 수 있어서 배양실 (11)에서 배양실 (12)에 대한 세포의 옮기는 작업을 쉽게 할 수 있게 되어 있다.
[제2 실시형태]
다음에 본 발명의 제2 실시형태에 관한 복실 배양 용기 및 세포 배양 방법을 도 2를 참조하여 설명한다.
본 실시형태의 복실 배양 용기 (1a)는 이 도에 나타내듯이, 배양실 (11)과 배양실 (12)외에 다시 배양실 (13)을 갖추고 있다.
배양실 (13)에는 복실 배양 용기 (1a)의 외부와 연통하기 위한 외부 접속 포트 (131)와, 다른 배양실과 연통하기 위한 실 간 접속 포트 (132)를 갖추고 있다.
외부 접속 포트 (131)는 도시하지 않았지만, 튜브 (2)를 통해서 세포 공급 용기 등에 접속되어 배양실 (13)에 대한 세포를 주입할 때 사용된다. 실 간 접속 포트 (132)는 배양실 (11)의 실 간 접속 포트 (112) 및 배양실 (12)의 실 간 접속 포트 (122)에 튜브 (2)를 통해서 접속되고, 배양실 (13)의 내용 액을 배양실 (12) 등에 이송하기 위해서 사용할 수 있다. 배양실 (12)에서의 외부 접속 포트 (121)는 도시하지 않았지만 튜브 (2)를 통하여 배양액 공급 용기 등에 접속되어 배양실 (12)에 배양액을 공급하기 위해서 사용할 수 있다.
기타의 점에 대해서는 제1 실시형태의 복실 배양 용기 (1)와 같은 구성으로 할 수 있다.
또한 본 실시형태의 복실 배양 용기 (1a)는 각 배양실에 각각 서로 다른 배양기 재료를 갖춤으로써 다양한 세포 배양을 하는 경우에 사용할 수 있다. 예를 들면 다음과 같은 방법으로, 수지상 세포와 림프구를 배양할 수 있다.
[수지상 세포와 림프구의 배양]
배양실 (11)은 그 내면에 특별한 처리를 하지 않고, 림프구를 증폭시키기 위한 증폭 배양실로 사용하고, 배양실 (12)은 그 내면에 항 CD3항체를 코팅하여, 림프구를 활성화시키기 위한 활성화 배양실로 사용한다. 또한, 배양실 (13)은 그 내면에 접착계 세포를 배양하기 위한 표면 처리를 하여 접착계 세포 배양실로서 사용한다. 이 접착계 세포 배양실은 백혈구를 림프구와 접착계 세포로 분리하여 접착계 세포를 배양하기 위해서 사용된다. 그리고 도 2과 같이, 배양실 (11)과 배양실 (12)을 접속하는 튜브 (2) 위와, 배양실 (12)와 배양실 (13)을 접속하는 튜브 (2) 위에 클립 등의 유로 개폐 수단을 장착하여, 튜브 (2)에서의 유로의 개폐를 제어한다.
그리고, 배양실 (13)에 혈액에서 분리된 백혈구(세포 부유액)와 배양액을 주입하고, 37℃에서 약 2시간 정치한다. 이에 의해서, 백혈구의 접착계 세포는 배양실 (13)의 저면에 접착한다.
다음에 배양실 (12)과 배양실 (13)을 접속하는 튜브 (2)에서의 유로를 개방하여, 배양실 (13)에서 배양실 (12)로 백혈구에서의 부유계 세포(림프구)와 배양액을 이송한다. 그리고, 배양실 (12)에서 림프구를 활성화시킨다.
이어 배양실 (13)에 100ng/ml의 GM-CSF(Granulocyte Macrophage colony-stimulating Factor, 과립구 대식 세포 콜로니 자극 인자)와 50ng/ml의 IL-4(Interleukin-4, 인터류킨-4) (이들을 수지상 세포에의 유도 인자로 일컫는 경우가 있음)를 첨가한 배양액(AIM-V, Life Technologies사제 등)를 첨가하여, 접착계 세포를 37℃, 5% 이산화탄소 농도의 조건하에서 약 5일 동안 배양한다.
이렇게 하여 접착계 세포에서 유도된 미숙한 수지상 세포에 암 항원을 제시하여 약 2일 동안 배양하여 성숙한 수지상 세포를 얻을 수 있다.
한편, 배양실 (12)로 이동한 림프구는 약 3일 정도의 항 CD3항체의 자극에 의해서 활성화된다.
그 후, 배양실 (11)과 배양실 (12)을 접속하는 튜브 (2)에서의 유로를 개방하고, 배양실 (12)에서 배양실 (11)로 활성화된 림프구 및 배양액을 이송하여 배양실 (11)에서 림프구를 증폭시킨다. 이때, 림프구의 증폭과 함께, 배양실 (11)에 배양액을 추가하여 약 4일 정도에서 활성화된 T림프구(T세포)를 대량으로 얻을 수 있다.
최종적으로는 이들 세포를 조제하여, 수지상 세포와 림프구를 각각 사람에게 투여할 수 있다.
이와 같이 본 실시형태의 복실 배양 용기 (1a)에 따르면 배양실을 3 개 이상 갖추고 있더라도 이들을 하나의 배양 용기 내에 갖춤으로써 일체적으로 다룰 수 있기 때문에 세포의 옮기는 작업을 쉽게 할 수 있고 복잡한 배양 공정을 간단한 조작으로 실시할 수 있다.
[제3 실시형태]
다음에 본 발명의 제3 실시형태에 관한 복실 배양 용기 및 세포 배양 방법을 도 3 및 도 4를 참조하여 설명한다.
본 실시형태의 복실 배양 용기는 그 하나의 변에, 튜브를 사용하여 접속된 두개 이상의 실 간 접속부가 갖추어지고, 각 배양실에서의 실 간 접속부가 갖추어진 변과, 복실 배양 용기에서의 해당 한 변과의 거리가 각 배양실의 정렬 순으로 크게 또는 작아지게 각 배양실이 형성된 것을 특징으로 한다. 기타의 점에 대해서는 제1 실시형태의 복실 배양 용기 (1)와 같은 구성으로 할 수 있다.
구체적으로는 도 3과 같이 실 간 접속 포트 (112와 122)가 갖추어진 복실 배양 용기 (1b)에서의 변과, 배양실 (11)에서의 실 간 접속 포트 (112)를 갖춘 변과의 거리 (d1)와, 실 간 접속 포트 (112와 122)를 갖춘 복실 배양 용기 (1)에서의 변과, 배양실 (12)에서의 실 간 접속 포트 (122)를 갖춘 변과의 거리 (d2)와의 차이가 소정의 크기 (d)가 되도록 배양실 (11) 및 배양실 (12)이 형성되어 있다. 이 d (=d2-d1)는 3mm 이상으로 하는 것이 바람직하고, 5mm~50mm로 하는 것이 보다 바람직하고, 7mm~20mm로 하는 것이 더욱 바람직하다.
이로써 복실 배양 용기 (1b)를 기울이는 것만으로, 배양실 (12)에서 배양실 (11)에 대한 내용물의 이송을 알맞게 할 수 있게 된다.
즉, 본 실시형태의 복실 배양 용기 (1b)를 각 배양실 (11)과 (12)에서의 실 간 접속부 (112와 122)를 갖춘 변과, 실 간 접속 포트 (112와 122)를 갖춘 복실 배양 용기 (1b)에서의 변과의 거리가 큰 배양실일수록 위쪽으로 위치시키고 또한 실 간 접속부 (112와 122)를 갖춘 복실 배양 용기 (1b)에서의 변이 하향이 되도록 하면서 복실 배양 용기 (1b)의 한 귀퉁이가 최하단에 위치하도록 복실 배양 용기 (1b)를 기울여서 위쪽으로 위치한 배양실에서 아래쪽에 위치한 배양실로 향해서 내용물의 이송을 한다.
구체적으로는 도 4와 같이 실 간 접속 포트 (112와 122)를 갖춘 복실 배양 용기 (1)에서의 변과, 실 간 접속 포트가 갖춰진 배양실의 변과의 거리가 보다 큰 배양실 (12)을 위쪽으로 위치시키고, 또한 실 간 접속 포트 (112와 122)를 갖춘 복실 배양 용기 (1b)에서의 변이 비스듬히 하향하도록 하면서 복실 배양 용기 (1b)의 한 귀퉁이가 최하단에 위치하게 복실 배양 용기 (1b)를 기울인다. 이로써 배양실 (12)의 내용물을 튜브 (2)를 통해서, 배양실 (11)에 자연스럽게 이송시킬 수 있게 된다.
한편 예를 들면, 제1 실시형태에서의 복실 배양 용기 (1)를 도 4와 같이 기울인 경우는, 배양실 (12)에서 배양실 (11)에 내용물을 이송시키기 위해서 충분한 압력 차를 얻지 못하고, 배양실 (12)내에 내용물이 남게 된다는 문제가 있었다.
이에 대해서 본 실시형태의 복실 배양 용기 (1b)에 따르면 배양실 (12)에서의 내용물의 잔존을 크게 감소할 수도 있다.
[제4 실시형태]
다음에 본 발명의 제4 실시형태에 관한 복실 배양 용기 및 세포 배양 방법에 대해서 도 5를 참조하여 설명한다.
본 실시형태의 복실 배양 용기는 각 배양실을 다른 배양실과 연통하기 위한 유로가 복실 배양 용기 내에서 필름 재료를 가열 밀봉 가공하여 형성된 것을 특징으로 한다.
구체적으로는 도 5와 같이 복실 배양 용기 (1c)에서 배양실 (11)과 배양실 (12)을 연통한 이송 수로 (3)가 형성되어 있다. 이 때문에, 배양실 (11)과 배양실 (12)에서 실 간 접속 포트가 생략되어 있다. 기타의 점에 대해서는 제1 실시형태의 복실 배양 용기 (1)와 같은 구성으로 할 수 있다.
이송 유로 (3)는 물리적 수단에 의해서 개폐를 제어할 수 있다. 이 물리적 수단으로서는 예를 들면 압압 부재 등을 사용할 수 있어서 그 압입량을 제어함으로써 이송 유로 (3)를 개폐할 수 있다.
이와 같은 본 실시형태의 복실 배양 용기 (1c)에 따르면 배양실 (11)과 배양실 (12)을 튜브 (2)로 접속할 필요 없이, 또한 각 배양실에서의 실 간 접속 포트를 생략할 수 있으며, 보다 구조의 간단한 복실 배양 용기를 얻는 것이 가능하게 된다. 또한 각 배양실 사이를 접속하는 튜브가 없으므로 그 취급이 매우 간단하고, 자동 배양 장치에 장착하는 경우에도 아주 쉽게 할 수 있다.
[제5 실시형태]
다음에 본 발명의 제5 실시형태에 관한 복실 배양 용기 및 세포 배양 방법을 도 6을 참조하여 설명한다.
본 실시형태의 복실 배양 용기 (1d)는 도 6과 같이 세포를 활성화시키기 위한 활성화 배양실인 배양실 (12)과, 세포를 증폭시키기 위한 증폭 배양실인 배양실 (11)과, 세포를 샘플링하기 위한 샘플링실 (14)과, 세포를 회수하기 위한 회수실 (15)를 갖추고 있다.
그리고, 배양실 (12)과 배양실 (11)을 연통하는 이송 유로 (3)가 형성되는 동시에 배양실 (11)과 샘플링실 (14)사이 및 배양실 (11)과 회수실 (15)사이에도 이송 유로 (3)가 필름 재료를 가열 밀봉 가공하여 형성되어 있다.
또한 샘플링실 (14)과 회수실 (15)의 주위에는 이들을 각각 쉽게 떼어 낼 수 있도록, 점선, 슬릿, 노치(가는 홈) 등으로 이루어진 용이 절단부 (4)가 형성되어 있다. 또한 이와 같은 용이 절단부 (4)를 각 배양실을 분리하기 위해서 형성해도 된다.
본 실시형태의 복실 배양 용기 (1d)는 예를 들면 다음과 같이, 림프구 배양 등에 사용할 수 있다.
제1 실시형태와 마찬가지로 배양실 (11)을 그 내면에 특별한 처리를 하지 않고, 림프구를 증폭시키기 위한 증폭 배양실로 사용하여 배양실 (12)을 그 내면에 항 CD3항체를 고정화하여, 림프구를 활성화시키기 위한 활성화 배양실로 사용한다.
또한 샘플링실 (14)을 배양실 (11)에서의 배양 세포를 샘플링하기 위해서 사용하고, 회수실 (15)을 배양실 (11)에서의 배양 세포의 일정량을 회수하기 위해서 사용한다.
그리고, 배양실 (12)과 배양실 (11)을 연통하는 이송 유로 (3)를 물리적 수단에 의해서 닫은 후, 배양실 (12)에 림프구와 배양액을 주입하여, 림프구를 활성화시킨다. 또한 샘플링실 (14)과 배양실 (11) 및 회수실 (15)과 배양실 (11)을 연통하는 이송 유로 (3)도 물리적 수단에 의해서 닫아 둔다.
림프구를 활성화한 다음, 배양실 (12)과 배양실 (11)간 이송 유로 (3)를 개방하여 배양실 (12)에서 림프구와 배양액을 배양실 (11)에 밀어내어 활성화된 림프구를 배양실 (11)에 이송시켜서 배양실 (11)에서 림프구를 증폭시킨다. 이때, 림프구의 증폭과 함께, 외부 접속 포트 (111)을 통해서, 배양액 공급 용기에서 배양실 (11)에 필요한 배양액을 추가할 수 있다. 이 배양액의 추가는 무균 접합 장치 등을 사용함으로써 무균적으로 실시하는 것도 가능하다. 또한, 배양액의 성분을 개량하여, 배양실 (11)에 추가 배양액을 미리 충전해두도록 할 수도 있다. 또한 본 실시형태의 복실 배양 용기 (1d)에 배양액 공급실을 형성하여, 배양액 공급실에서 배양실 (11)에 배양액을 추가 가능하게 할 수도 있다.
또한, 배양실 (11)에서 배양된 세포를 샘플링하는 경우에는 샘플링실 (14)과 배양실 (11)간의 이송 유로 (3)를 개방하고, 배양실 (11)에서 샘플링실 (14)에 림프구와 배양액을 소량 이송한 후 샘플링실 (14)과 배양실 (11)간의 이송 유로 (3)를 가열 밀봉 등으로 용단 (녹여서 절단)하여, 샘플링실 (14)을 이 절단부 (4)에 따라서 절취하여 세포 해석이나 검사 등에 사용할 수 있다.
또한 배양 세포의 일부를 회수하여 2회로 나누어 의료 방법 등을 실시하는 경우에는 회수실 (15)과 배양실 (11)간의 이송 유로 (3)를 개방하고 배양실 (11)에서 회수실 (15)에 림프구와 배양액을 필요량 이송한 후 회수실 (15)과 배양실 (11)간의 이송 유로 (3)를 가열 밀봉 등으로 용단하여, 회수실 (15)을 이 절단부(4)에 따라서 절취하여 회수실 (15)에 수용된 림프구를 투여 등에 사용할 수가 있다.
이와 같이 본 실시형태의 복실 배양 용기 (1d)에 의하면 이들의 작업을 모두 폐쇄계의 복실 배양 용기 (1d)내에서 실시할 수 있어서 무균성을 보장한 상태에서 세포 배양을 간편하게 할 수 있게 된다.
또한 본 실시형태의 복실 배양 용기 (1d)는 유로가 일체화된 복실 배양 용기이기 때문에 실 바(Seal bar)를 설계하는 것만으로 다양한 실(室)과 유로를 간편하게 저비용으로 제작할 수 있다. 또한 자동 조절 장치에 세팅할 때에도 복잡한 튜브의 장착이 불필요하게 되므로 작업 효율이 높아질 뿐 아니라 장착 오류 등의 리스크도 저감할 수 있게 되어 있다.
본 발명은 이상의 실시형태나 실시 예에 한정되는 것은 아니고 본 발명의 범위 내에서 다양한 변경 실시가 가능하다는 것을 말할 필요도 없다.
예를 들면 상기 각 실시형태를 조합한 것으로 하거나 접착계 세포의 수송을 위해서 접착계 세포를 배양실의 내면에 박리하기 위한 효소 용액을 배양실에 공급하기 위한 효소 용액 공급 용기 및 그 효소의 작용을 저해하기 위한 저해제 용액을 배양실에 공급하기 위한 저해제 용액 공급 용기를 갖추게 하거나 하는 등 적절하게 변경할 수 있다.
본 발명은 의약품 생산이나 유전자 치료, 재생 의료, 면역 요법 등의 분야에서 폐쇄계의 배양 용기를 사용하여 세포를 배양하는 경우에 알맞게 사용할 수 있다.
1,1a, 1b, 1c, 1d 복실 배양 용기
11 배양실
111 외부 접속 포트
112 실 간 접속 포트
113 샘플링 포트
12 배양실
121 외부 접속 포트
122 실 간 접속 포트
13 배양실
131 외부 접속 포트
132 실 간 접속 포트
14 샘플링실
141 외부 접속 포트
15 회수실
151 외부 접속 포트
2 이송 튜브
3 이송 유로
4 용이절단부

Claims (11)

  1. 가스 투과성을 가진 재료를 가공하여 이루어지는 복실 배양 용기이며, 세포를 배양하기 위한 배양실이 두개 이상 형성되고, 각 배양실은 적어도 하나의 다른 배양실과 연통하고, 또한 상기 복실 배양 용기의 외부와 연통하기 위한 외부 접속부를 적어도 하나 갖춘 것을 특징으로 하는 복실 배양 용기.
  2. 제1항에 있어서, 상기 각 배양실에, 상기 다른 배양실과 연통하기 위한 실 간 접속부가 각각 갖추어지고, 상기 실 간 접속부끼리 튜브를 사용하여 접속된 것을 특징으로 하는 복실 배양 용기.
  3. 제1항에 있어서, 상기 각 배양실을 상기 다른 배양실과 연통하기 위한 유로가 상기 복실 배양 용기 내에서 가스 투과성을 가진 필름 재료를 가열 밀봉 가공하여 형성된 것을 특징으로 하는 복실 배양 용기.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양실로서 적어도, 세포를 활성화시키기 위한 활성화 배양실과, 세포를 증폭시키기 위한 증폭 배양실을 갖춘 것을 특징으로 하는 복실 배양 용기.
  5. 제3항에 있어서, 상기 배양실로서 세포를 활성화시키기 위한 활성화 배양실과, 세포를 증폭시키기 위한 증폭 배양실을 갖춤과 동시에, 세포를 샘플링하기 위한 샘플링실과, 세포를 회수하기 위한 회수실을 갖추고, 상기 활성화 배양실과 상기 증폭 배양실을 연통하는 상기 유로가 형성되고, 상기 증폭 배양실과 상기 샘플링실 간 및 상기 증폭 배양실과 상기 회수실 간의 각각에, 유로가 상기 복실 배양 용기 내에서 가스 투과성을 가진 필름 재료를 가열 밀봉 가공하여 형성된 것을 특징으로 하는 복실 배양 용기.
  6. 제5항에 있어서, 상기 각 배양실, 상기 샘플링실 및 상기 회수실로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 실을 떼어 내기 위한 용이 절단부를 형성한 것을 특징으로 하는 복실 배양 용기.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 전부 또는 일부의 상기 배양실에 각각 다른 배양기재를 갖춘 것을 특징으로 하는 복실 배양 용기.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복실 배양 용기가 거의 직사각형 모양이며 상기 복실 배양 용기의 하나의 변에 튜브를 사용하여 접속된 두개 이상의 상기실 간 접속부가 갖추어지고 상기 각 배양실에서의 상기실 간 접속부가 갖추어진 변과, 상기 복실 배양 용기의 한 변과의 거리가 상기 각 배양실의 늘어선 순서에 크게 또는 작아지게, 상기 각 배양실이 형성된 것을 특징으로 하는 복실 배양 용기.
  9. 제8항의 복실 배양 용기를 사용한 세포 배양 방법이며,
    상기 각 배양실에서의 상기 실 간 접속부가 갖추어진 변과, 상기 복실 배양 용기의 한 변과의 거리가 큰 배양실일수록 위쪽으로 위치시키고, 상기 실 간 접속부가 갖춰진 상기 복실 배양 용기에서의 변이 비스듬히 하향하도록 하면서, 상기 복실 배양 용기의 한 귀퉁이가 최하단에 위치하도록 상기 복실 배양 용기를 기울여서, 위쪽으로 위치하는 배양실에서 아래쪽으로 위치하는 배양실로 향해서 내용물의 이송을 하는 것을 특징으로 하는 세포 배양 방법.
  10. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 복실 배양 용기를 사용한 세포 배양 방법이며,
    상기 복실 배양 용기에서의 상기 배양실로서, 림프구를 활성화시키기 위한 항 CD3항체가 고정화된 활성화 배양실과, 림프구를 증폭시키기 위한 증폭 배양실이 형성되고,
    림프구 및 배양액을 상기 활성화 배양실에 주입하여, 상기 활성화 배양실에서 림프구를 활성화시키고,
    상기 활성화 배양실에서 상기 증폭 배양실에 활성화된 림프구 및 배양액을 이송하여, 상기 증폭 배양실에서 림프구를 증폭시키는 것을 특징으로 하는 세포 배양 방법.
  11. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 복실 배양 용기를 사용한 세포 배양 방법이며,
    상기 복실 배양 용기에서의 상기 배양실로서 백혈구를 림프구와 접착계 세포로 분리하여 접착계 세포를 배양하기 위한 접착계 세포 배양실과, 림프구를 활성화시키기 위한 항 CD3항체가 고정화된 활성화 배양실과, 림프구를 증폭하기 위한 증폭 배양실이 형성되고,
    혈액에서 분리된 백혈구 및 배양액을 상기 접착계 세포 배양실에 주입하여 정치(靜置)하고, 상기 백혈구에서의 접착계 세포를 상기 접착계 세포 배양실 내의 저면에 접착시키고,
    이어, 상기 접착계 세포 배양실에서 상기 활성화 배양실에 상기 백혈구에서의 림프구와 배양액을 이송하여, 상기 활성화 배양실에서 림프구를 활성화시키고,
    상기 접착계 세포 배양실에 수지상 세포에의 유도 인자를 포함한 배양액을 주입하여 상기 접착계 세포를 배양하고 상기 접착계 세포를 수지상 세포로 유도하여,
    상기 활성화 배양실에서 상기 증폭 배양실에 활성화된 림프구 및 배양액을 이송하여, 상기 증폭 배양실에서 림프구를 증폭시키는 것을 특징으로 하는 세포 배양 방법.

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