JP5659448B2 - 培養容器及び同容器を用いた細胞培養方法 - Google Patents

Description

本発明は、細胞への遺伝子導入及び当該遺伝子導入後の細胞を培養する培養容器及び同容器を用いた細胞培養方法に関する。

従来、実験室レベルでの培養、例えば、研究目的の培養、検査目的の培養、評価目的の培養の何れにおいても、スチレン樹脂製のシャーレ、フラスコ等が使用されてきた。さらに、近年、細胞医療の発展もあって、治療目的の培養も頻繁に行われるようになってきたが、これに使用される培養用容器も、ほとんどの場合において、実験室レベルの実験と同じようにスチレン樹脂製のシャーレ、フラスコ等が、そのまま使用されているのが現状である。

これらの治療目的の培養には、例えば、患者の角膜細胞の培養、皮膚細胞の培養、軟骨細胞の培養等があり、患者のそれら細胞は培養・増殖され、膜状、または、板状に再生して患者に移植される。
また、患者から採取した血球系細胞、例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、造血幹細胞等を培養し、すなわち、細胞を活性化、誘導、または、変異させ、さらには、増殖させてから、患者の体内に戻し、抗ウイルス治療、抗がん治療等を行うものもある。

このように、培養細胞等を医療目的に使用する場合、特に、培養によって得られた細胞、蛋白質、その他の成分を体内に戻すような場合には、その工程に使用される培養用の容器は、培養性能が良く、溶出物の少ない安全性の高い樹脂により形成され、さらに、その容器形態は、培養中の細胞が細菌，カビ，酵母，ウイルス等（以下、総称して、単に「微生物」という。）に汚染される機会が少なく、取扱い易いもの、すなわち、無菌操作性の良いものでなければならない。

ところが、従来用いられているスチレン樹脂製のシャーレ、フラスコは、医療目的の培養に使用するには、いろいろな面で、例えば、安全性の面においても、微生物汚染の面においても、その操作性においても、必ずしも満足できるものではない。培養性能については、さらに、性能の向上が望まれている。

容器を形成する樹脂の安全性について言えば、スチレン樹脂は、医療用具等に使用されるレベルの安全性、例えば、輸液セット基準のレベルの安全性は確保されているものの、最高の安全性を保証する日本薬局方のプラスチック製医薬品容器試験法に適合するレベルの安全性は確保できていない。さらに、スチレン樹脂から抽出されるダイマーまたはトリマーには環境ホルモン物質の疑いがあり、未だにその安全性が確認されていない。

また、培養中の微生物汚染の面について言えば、スチレン樹脂製のシャーレ、フラスコは、微生物汚染の危険性の大きい容器と言わざるを得ない。
すなわち、培養には、開始時に、培地、培養細胞、添加物等を容器内に注入する操作と、終了時に、培養細胞や細胞が合成したタンパク質等の収穫物を取り出す操作が必ず必要であり、さらに、培養期間中に、別の容器に拡大培養したり、培地や添加物等を補充する操作を繰り返し行う必要がある場合が多い。

スチレン樹脂製のシャーレ、フラスコでは、通常、この作業を、蓋を開けて開口部を大気中に開放させたまま、ピペット等で行わなければならず、さらに、この操作を繰り返し行わなければならないので、この間に開口部から微生物が進入し、培養中の細胞が微生物に汚染される機会が極めて多く、従来のスチレン樹脂製のシャーレ、フラスコは、微生物汚染の危険性の高い容器と言わざるを得ない。

通常、この操作は、無菌室や無菌ブース内で行われるので、汚染される危険性は少ないとはいうものの、無菌室や無菌ブース内といわれる空間は、管理により、空間の単位体積あたりの菌数を一定数以下に押さえているだけであって、無菌室や無菌ブース内の空間に微生物等がいないわけではなく、開口部が開放されている時間が長ければ長いほど、また、開放時の操作が複雑になればなるほど、汚染される危険性が増すことになる。

実際に、培養操作中に微生物に汚染されてしまうケースも多く報告されており、特に、培養経験の少ない未熟な作業者、緻密な作業が苦手な作業者等による操作において発生する頻度が高く、作業者を選んで作業にあたらせなければならないことも多い。

また、操作性について言えば、スチレン樹脂製のシャーレ、フラスコを使用する培養システムにおいては、単に、スチレン樹脂製のシャーレ、フラスコの取扱いだけでなく、これらの容器を使うシステム全体の操作性をも悪くしていると考えられる。
すなわち、スチレン樹脂製のシャーレ、フラスコを使用して培養を行う場合、培養容器の取扱いだけでなく、培養用具、例えば、ピペット等の取扱いについても、熟練が要求されることになる。

作業者に熟練が要求されることは、熟練者からみれば問題ない作業であっても、その操作が煩雑で、操作ミスが発生しやすく、その操作ミスが大きなリスクに繋がることを意味するものであり、その操作性が改善されるべきものであることは明らかである。

また、培養性能について言えば、スチレン樹脂製のシャーレ、フラスコは、これまで、いろいろな細胞を培養するために、各種の表面処理、各種の蛋白質のコーティング等が行われてきたが、必ずしも、スチレン樹脂を基材とする培養容器で全ての細胞が効率よく培養できているわけではなく、スチレン樹脂に代わる、スチレン樹脂と同等または、それ以上の培養効率が期待できる基材樹脂の出現が期待されている。

本発明が解決しようとする課題は、スチレン樹脂製のシャーレ、フラスコ等と同等またはそれ以上の培養性能を有し、安全性が高く、医療目的の遺伝子導入及びその後の細胞培養に使用するのに相応しい培養容器並びに同容器を用いた細胞培養方法を提供することにある。

すなわち、本発明が解決しようとする課題は、前記培養目的の内の少なくとも一つ以上を達成するべく、スチレン樹脂製のシャーレ、フラスコの培養性能と同等またはそれを上回る性能を有し、日本薬局方のプラスチック製医薬品容器試験法に適合するレベルの安全性を有する培養容器及び同容器を用いた細胞培養方法を提供することにある。

また、本発明が解決しようとする課題は、微生物汚染の危険性が少なく、操作性が良い培養容器及び同容器を用いた細胞培養方法を提供することにある。すなわち、本発明が解決しようとする課題は、無菌環境がそれほど厳しくない環境下においても、また、培養の熟練者でなくても、操作が容易であって、操作ミスが少なく、その操作ミスが大事に至らず、さらには、容器内が容易には汚染されないような培養容器及び同容器を用いた細胞培養方法を提供することにある。

請求項１に記載の発明は、細胞への遺伝子導入と当該遺伝子導入後の細胞を培養するための袋状の培養容器であって、互いに対面位置して周縁が封止された一対の第一及び第二の壁部にて形成された容器本体と、その容器本体内に内容液を充填し又は前記本体から前記内容液を排出させるためのポートとを備え、細胞培養時に底面となる前記第一の壁部が低密度ポリエチレンとその容器内側に位置する表面に膜状に形成されたシクロオレフィン樹脂層とから形成され、細胞培養時に上面となる前記第二の壁部が柔軟性ならびに気体透過性を有するエチレン酢酸ビニルで形成されていることを特徴とする。
すなわち、シクロオレフィン樹脂は、スチレン樹脂と同等またはそれ以上に細胞の培養適性があり、細胞がシクロオレフィン樹脂を直接または間接的に足場とすることができるので、この足場となるシクロオレフィン樹脂を細胞と接触する容器の内面に設けることによって、スチレン樹脂製のシャーレ、フラスコの培養性能と同等またはそれを上回る培養性能を得易い。しかも、シクロオレフィンは日本薬局方のプラスチック製医薬品容器試験法レベルの安全性を確保し易い。そのため、安全性が高い、医療目的の培養に使用するのに相応しい培養容器を提供することができる。

ここで、細胞が間接的に接触するとは、シクロオレフィン樹脂面に接着または吸着した糖鎖、タンパク質等の生化学物質を介して、細胞がシクロオレフィン樹脂に足場として接着したり、細胞が細胞表面に発現させたレセプターにより、周囲の環境情報を得るためにシクロオレフィン樹脂に一時的に結合したりすることを言う。

ここで言うシクロオレフィン樹脂には、シクロオレフィンポリマー（シクロオレフィン の開環重合体）、シクロオレフィンコポリマー（シクロオレフィン とαオレフィンの付加共重合体）がある。シクロオレフィンポリマーとしては、例えば、複素環モノオレフィンを環状オレフィンメタセシス重合後水素化した樹脂であるゼオネックス（登録商標）（日本ゼオン（株）製）やゼオノア（登録商標）（日本ゼオン（株）製）、官能基をもった複素環モノオレフィンを環状オレフィンメタセシス重合後水素化した樹脂であるＡＲＴＯＮ（登録商標）（ＪＳＲ社製）などを挙げることができる。シクロオレフィン コポリマーとしては、例えば、エチレンと複素環モノオレフィンとを共重合した樹脂であるアペル（登録商標）（三井化学（株）製）、ＴＯＰＡＳ（登録商標）（ＴＩＣＯＮＡ社製）などを挙げることができる。

なお、細胞は重力により落下して、容器の底面で増殖する傾向にあるので、シクロオレフィン樹脂面が設けられた第一の壁部を、細胞培養時には下側、すなわち、底面になるよう設置して使用する。
また、第二の壁部が柔軟性を有するので、第二の壁部の変形により容器の容積を変化させることができる。そのため、空気の出入り無しに、ポートから容器内への内容液の封入及び容器内からの内容液の排出が可能である。これにより、内容液を充填又は排出する作業時に内容液を外気に触れさせないシステム化が容易で、培養作業のクローズドシステム化が容易である。
したがって、レベルの高くない無菌環境下においても、また、培養の熟練者でなくても、作業が容易で、操作ミスを少なくでき、また、操作ミスが大事に至らず、内容液が容易に汚染され難い培養容器を提供することができる。
ここでいう、クローズドシステムとは、無菌的な閉鎖系をいい、内容物が、無菌的に製造された容器内間を、汚染された外気に晒されることなく移動し、必要な処理が行われることを可能なシステムを言う。
ことを特徴とする。

第二の壁部は、気体透過性を有する。
細胞は、培養時に、酸素を消費し二酸化炭素を産生するが、培養環境を維持するためには、消費された酸素を容器外から取り込み、産生した二酸化炭素を容器外へ排出する機構が必要になる。
スチレン樹脂製のフラスコ等、一般の培養容器ではベントと呼ばれる通気口を設けて、酸素及び二酸化炭素の外部との交換を行っているが、通気口から培養液がこぼれ出たり、通気口が微生物汚染の原因になったり、フィルター付き通気口が培地で塞がったりする危険性がある。本発明では、容器壁自体に気体透過性、特に、酸素及び二酸化炭素の透過性を持たせるために、容器壁、特に、第二の壁部を気体透過性のよい材料で形成し、容器を開口させることなく酸素及び二酸化炭素の外部との交換を行うことを可能にしている。

なお、第一の壁部が気体透過性の少ない材料で形成されている場合であっても、プラスチックシートは、肉厚が薄ければ、若干の気体透過性は期待できるので、容器壁全体で実質的には酸素及び二酸化炭素の交換が期待できる。本発明の容器においても、第一の壁部のシクロオレフィン樹脂層が設けられている面では通気性が大きくは期待できないものの、第一の壁部は若干の酸素透過性が期待できる場合が多い。

シクロオレフィン樹脂は、スチレン樹脂に比べて高価であるので、その使用量は極力少なくするのが好ましい。容器本体の少なくとも細胞と接触する面だけをシクロオレフィン樹脂で形成すれば、良好な培養性能を確保することができる。そのため、第一の壁部を構成する低密度ポリエチレンの容器内側に位置する表面に膜状にシクロオレフィン樹脂層を設けることにより、シクロオレフィン樹脂の使用量を抑制して、得易くて安価な基材と複合させることにより、良好な培養性能を有する安価な培養容器を容易に提供することができる。

請求項２に記載の発明は、請求項１に記載する構成に加えて、シクロオレフィン樹脂層が、コーティング法、貼り合わせ法、多層押出し成形法の何れかにより形成されたものであることを特徴とする。
すなわち、本発明では、シクロオレフィン面が細胞と接触する面にあれば良いので、その樹脂層または皮膜を形成する手段に特段の制限はないが、コーティング法、貼り合わせ法、多層押出し成形法等が好ましい。

なお、コーティング法には、溶剤にシクロオレフィンを溶解したものを、スプレー等により霧状に噴霧してコーティングする方法、刷毛等により一定の厚さに塗布する方法、印刷する方法等があるが何れの方法でも構わない。なお、印刷する方法には印刷機の形態により、さらに、凸版印刷、凹版印刷、スクリーン印刷、インクジェットプリント等が挙げられる。
ここで使用される溶剤としては、シクロヘキサン、トルエン等、ＳＰ値がシクロオレフィン樹脂のＳＰ値に近い溶剤が選択される。

また、貼り合わせ法には、プレス成形法、押出し成形法、または、インフレーション成形法により成形したシートまたはフィルムを貼り合わせる方法等があるが何れの方法でもよい。貼り合わせる方法では、接着剤を用いる方法と、接着剤を用いない方法があるが、一般に、接着剤には、細胞を不活性にする成分が含まれていたり、生体に対して安全でない成分が含まれていたりする可能性が高いので、接着剤を使用せずに、熱またはプレス等で密着させて形成するほうが好ましい。
また、多層押出し成形法には、シート押出し成形法とインフレーション成形法があるが、何れの方法でも構わない。

請求項３に記載の発明は、請求項１又は請求項２に記載する構成に加えて、第一の壁部が、柔軟性を有することを特徴とする。
すなわち、シクロオレフィン樹脂は硬質の樹脂なので、柔軟性に乏しく、そのままでは、柔軟性が要求される用途には採用できないが、柔軟性を有する低密度ポリエチレンとの複合化により、シクロオレフィン樹脂層が形成された第一の壁部に柔軟性を付与することが可能になる。そのため、容器壁全体が広い範囲で柔軟性を有することにより、空気の出入り無しに、容器内への液体の封入及び容器内からの内溶液の排出が容易になり、クローズドシステム化の確実性が向上し、作業性も向上する。

ここで、柔軟性のある樹脂としては、低密度ポリエチレン樹脂、エチレン−酢酸ビニル共重合体、ポリプロピレン樹脂、エチレン−プロピレン共重合樹脂、ポリブタジエン樹脂、スチレン−ブタジエン共重合樹脂及びそれらの水素添加樹脂、ポリウレタン樹脂等、及び、それらの樹脂の混合物が挙げられる。

なお、低密度ポリエチレンとしては、一般の低密度ポリエチレンはもちろんのこと直鎖状低密度ポリエチレン樹脂、メタロセン触媒系低密度ポリエチレン樹脂が含まれる。
また、ポリプロピレン樹脂には、ステレオブロックポリプロピレン樹脂及びポリプロピレン樹脂とステレオブロックポリプロピレン樹脂の混合物も含まれる。

なお、ここで柔軟性とは、空気の出入り無しに内容液が容器内に流入または流出できる程度に変形して容積を確保する容器壁の追従性である。この追従性は、単に、容器壁を形成する材料の物理的数値によって決まるのではなく、容器形態、容器内に存在する空気量等によっても変わるので、一概に、容器壁を形成する材料の物理的数値で制限することは適切ではない。

本発明の用途を考慮すれば、本発明の容器の柔軟性は、内溶液が落差程度の圧力、例えば、５０ｃｍ水柱程度の圧力で、必要量の内容液が、ほぼ全て流入または流出する程度の柔軟性を有すれば良い。
さらに、具体的に言えば、例えば、５０００Ｐａで容器内を吸引した時に対面する容器壁が密着するような容器においては、５０００Ｐａの圧力をかけた時に、対面する容器壁間が、対面する周縁シール間の２分の１以上になる程度に柔軟性を有すれば良い。

請求項４に記載の発明は、請求項１ないし請求項３の何れかに記載する構成に加えて、容器本体の一部または全部が、透明性を有することを特徴とする。

すなわち、容器本体の一部又は全部が透明性を有するので、請求項１ないし請求項３の何れかに記載の発明によって得られる効果に加え、次の効果が得られる。すなわち、培養においては、顕微鏡下で、細胞の形、色等を観察して、培養の進み具合、細胞の状態を観察して、次の処置を施すことが一般に行われている。
本発明の容器の少なくとも顕微鏡観察側の容器壁は、顕微鏡で細胞が観察できる程度に透明であることが好ましい。一般に、培養細胞等の顕微鏡観察は、倒立顕微鏡によって観察する場合が多いので、その場合に、下側に位置する容器壁を透明にするのが好ましい。

請求項５に記載の発明は、請求項１ないし請求項４の何れか一つに記載する構成に加えて、２５℃における第一の壁部の実効面積あたりの酸素透過性と第二の壁部の実効面積あたりの酸素透過性の和を、内容液の液量で割った数値が、０．２ｃｃ／ａｔｍ・ｄａｙ・ｍｌ以上であることを特徴とする。

本発明の容器の容器壁に必要とされる酸素透過性は、培養される細胞量と酸素が透過する容器壁の面積により変化する。すなわち、容器壁に必要とされる酸素透過性は、培養される細胞量に比例し、酸素が透過する容器壁の面積に反比例する。

本発明の容器は、２つの異なる酸素透過性を有する容器壁で形成されていること、また、最も効率良く培養された場合の細胞量は培地の量に比例することを考慮すると、２５℃における第一の壁部の実効面積あたりの酸素透過性と第二の壁部の実効面積あたりの酸素透過性の和を、内容液の液量で割った数値が０．２ｃｃ／ａｔｍ・ｄａｙ・ｍｌ以上になるようにすれば、培養時に、細胞を効率的に増殖できるだけの酸素量を容器内に供給できる。

ここで、酸素透過率は、２５℃において、容器壁に差圧１ａｔｍの酸素圧を２４時間かけ続けたときに、容器壁を透過する酸素量を容器壁１ｍ²あたりで表した数値である。
また、容器壁の実効面積あたりの酸素透過性は、前記容器壁の酸素透過率に容器壁の面積をかけた数値であって、容器壁が容器内に酸素を供給する能力を表し、一つの容器の持つ全ての容器壁の実効面積あたりの酸素透過性の総和は、その容器が容器内に酸素を供給する性能を表すことになる。

さらに、前記実効面積あたりの酸素透過性の総和を、内溶液量、すなわち、細胞を培養する培地の量で割ることによって、容器が、培地に１ｍｌあたりに供給できる酸素量を表すことができる。

請求項６に記載の発明は、請求項１ないし請求項５の何れかに記載する構成に加えて、少なくとも、シクロオレフィン樹脂層の面に、細胞を刺激、分化、誘導、または、増殖させるタンパク質をコートまたは固相化したことを特徴とする。

少なくとも、シクロオレフィン樹脂層の面に、細胞を刺激、分化、誘導、または、増殖させるタンパク質をコートまたは固相化したので、請求項１ないし請求項５の何れかに記載の発明によって得られる効果に加えて、次の効果が得られる。
すなわち、シクロオレフィン樹脂は、その表面がスチレン樹脂と同様に疎水性で硬質という特徴を持っているので、親水性部分と疎水性部分を併せ持つ蛋白質を、その疎水性部分をシクロオレフィン樹脂表面に接着または密着させてシクロオレフィン樹脂表面を覆うことにより、細胞に対する前記各種の効果を発揮させることができる。
例えば、細胞の足場となる親水性部分を液側に向けるタンパク質がシクロオレフィン樹脂表面を覆えば、細胞と接触する容器表面に細胞が増殖するための足場が形成されることになり、細胞の分化、誘導、または、増殖を効率的に行うことができる。
また、細胞を刺激する疎水性部分を液側に向けるタンパク質がシクロオレフィン樹脂表面を覆った場合も、例えば、その疎水性部分が細胞を刺激しうる能力を有するものであれば、固相化されたタンパク質によって細胞の刺激を効率的に行うことができる。
なお、コートまたは固相化される蛋白質を培地等に溶解または分散させ、培養する細胞と同時に投入し、培養と同時にコートまたは固相化してもよい。

請求項７に記載の発明は、請求項６に記載する構成に加えて、コートされるタンパク質が、細胞外マトリックスを構成する成分、その誘導体、または、そのフラグメントであることを特徴とする。
ここで、前記のタンパク質は天然の供給源から精製されたものでもよく、遺伝子工学的に製造された組換え（リコンビナント）タンパク質であってもよい。

タンパク質が、細胞外マトリックスを構成する成分、その誘導体、または、そのフラグメントであるので、請求項６に記載の発明から得られる効果に加えて、 次の効果が得られる。すなわち、細胞外マトリックスを構成するタンパク質は、体内で細胞が足場としている環境のタンパク質であり、培養容器内でも細胞の足場となるタンパク質であり、これらのタンパク質には、基底膜を構成するタンパク質としてラミニン、ＩＶ型コラーゲン、ニドゲン、パールカン等があり、結合組織を構成するタンパク質としてＩないしＩＩＩ型コラーゲン、フィブロネクチン、エラスチン等がある。
これらのタンパク質は、単独でコートしても良いが、複数のタンパク質を同時にコートしても構わない。

請求項８に記載の発明は、請求項７に記載する構成に加えて、細胞外マトリックスを構成する成分がフィブロネクチン、ラミニン、コラーゲン、プロテオグリカン、またはそれらのフラグメントであることを特徴とする。

細胞外マトリックスを構成する成分がフィブロネクチン、ラミニン、コラーゲン、プロテオグリカン、またはそれらのフラグメントであるので、請求項８に記載の発明から得られる効果に加えて、次の効果が得られる。すなわち、これらの蛋白質は、他の細胞外マトリックスの成分に比べて、量的に多くを入手可能なであり、容器にコートするのに適している。
例えば、フィブロネクチンのフラグメントとして、細胞結合ドメイン（ＶＬＡ−４結合ドメイン、ＶＬＡ−５結合ドメイン等）やヘパリン結合ドメインを有するフラグメントが多数知られている［例えば、ジャーナル オブ バイオケミストリー（Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、第１１０巻、２８４−２９１頁（１９９１）］。さらに、細胞接着ドメインとヘパリン接着ドメインを有するフィブロネクチンフラグメントとして、レトロネクチン（商標）（タカラバイオ株式会社製）が挙げられる。レトロネクチンは前出のジャーナル オブ バイオケミストリーにＣＨ−２９６として記載されている。

請求項９に記載の発明は、請求項８に記載する構成に加えて、細胞外マトリックスを構成する成分のフラグメントが、フィブロネクチンフラグメントＣＨ−２９６であることを特徴とする。
細胞外マトリックスを構成する成分のフラグメントが、フィブロネクチンフラグメントＣＨ−２９６であるので、請求項８に記載の発明によって得られる効果に加えて、次の効果が得られる。すなわち、レトロネクチンは、容易にシクロオレフィン面にコートが可能で、レトロウイルスベクターによる細胞への、例えば、造血系細胞への遺伝子導入効率を上げるだけでなく、浮遊系細胞、例えば、白血球の細胞増殖性が良好な培養容器を提供することができる。

請求項１０に記載の発明は、請求項６に記載する構成に加えて、コートされるタンパク質が、抗体、その誘導体、または、そのフラグメントであることを特徴とする。
タンパク質が、抗体、その誘導体、または、そのフラグメントであるので、請求項６に記載の発明から得られる効果に加えて、次の効果が得られる。すなわち、抗体は、Ｈ鎖のＣ末端側に疎水性部分を有するために、疎水性部分がシクロオレフィン樹脂面に接着または密着する形で、抗原結合部位を液側に向けてコートまたは固層化されるので、シクロオレフィン樹脂面は抗体の抗原結合部位で覆われることになり、細胞を効率良く抗原結合部位に接触させることが可能で、ひいては、細胞に効率よく刺激を与えることができる。
さらに、特定の細胞種のみを単離する目的に前記の発明の培養容器を使用することもできる。
前記の抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれでもよい。抗体の誘導体としては、例えば、化学的に修飾された抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、双特異性抗体が例示される。抗体のフラグメントとしては、例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント、ｓｃＦｖフラグメントが例示される。前記の抗体等は、単独でコートしても良いが、複数の抗体等を混合してコートしてもよく、他のタンパク質を同時にコートしても構わない。
ここで、前記のタンパク質は天然の供給源から精製されたものでもよく、遺伝子工学的に製造された組換え（リコンビナント）タンパク質であってもよい。

請求項１１に記載の発明は、請求項１０に記載する構成に加えて、抗体が抗ＣＤ３抗体であることを特徴とする。
抗体が抗ＣＤ３抗体であるので、請求項１０に記載の発明により得られる効果に加えて、次の効果が得られる。すなわち、抗ＣＤ３抗体は、一般に、スチレン樹脂製シャーレまたはフラスコ等にコートされ、白血球のうちＴ細胞を刺激する用途で用いられるが、本発明のシクロオレフィン樹脂表面にコートすれば、それを上回る細胞刺激性が得られる。

請求項１２に記載の発明は、請求項１ないし請求項１１の何れかに記載する構成に加えて、培養される細胞が人体内に注入または埋設され、あるいは、人体の損傷部に貼付される細胞であることを特徴とする。
培養される細胞が人体内に注入または埋設され、あるいは、人体の損傷部に貼付される細胞であるので、請求項１ないし請求項１１の何れかに記載の発明によって得られる効果に加えて、次の効果が得られる。すなわち、シクロオレフィン樹脂は、オレフィン系樹脂であって、且つ、環状構造を有するので、熱安定性が良好であり、また、溶出物も少なく、生体に対して安全性が高い樹脂であるため、医療用の培養容器に適している。

請求項１３に記載の発明は、請求項６ないし請求項１１の何れかに記載する構成に加えて、少なくとも標的細胞と、遺伝子導入用ベクターとを前記容器本体内に共存させて、前記遺伝子導入用ベクターに組み込まれた遺伝子を前記標的細胞に導入するのに用いられることを特徴とする。

請求項１４に記載の発明は、請求項１ないし請求項１１の何れかに記載する構成の培養容器を用い、前記培養容器の容器本体内において、細胞への遺伝子導入と当該遺伝子導入後の前記細胞を培養することを特徴とする。

請求項１５に記載の発明は、請求項７ないし請求項１２の何れかに記載する構成の培養容器を用い、前記培養容器の容器本体内において、少なくとも標的細胞と、遺伝子導入用ベクターとを共存させ、前記遺伝子導入用ベクターに組み込まれた遺伝子を前記標的細胞に導入し、前記容器本体内において、遺伝子導入後の前記細胞を培養することを特徴とする。

すなわち、シクロオレフィン樹脂面にタンパク質がコートされた本発明のシクロオレフィン樹脂製容器の中では、または、培地にタンパク質が分散されている場合のように、タンパク質がコートされる条件下にある本発明のシクロオレフィン樹脂製容器の中では、細胞を安定した状態に維持したまま生存させておくことができるので、遺伝子導入も効果的に行うことができる。
さらに、前記のタンパク質が遺伝子導入用ベクターに対する親和性を有している場合には、シクロオレフィン樹脂面において標的細胞と遺伝子導入用ベクターとが共配置されることにより、遺伝子導入効率が向上する。前記の遺伝子導入用ベクターとしては、特に限定されるものではないが、ウイルスベクター、例えばレトロウイルスベクター（レンチウイルスベクター、シュードタイプベクターを包含する）、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターを例示することができる。フィブロネクチンのヘパリン結合ドメインはレトロウイルス結合活性を有しているので、ヘパリン結合ドメインを有するフィブロネクチンのフラグメントとレトロウイルスベクターとを組み合わせた遺伝子導入が本発明には好適である。フィブロネクチンのフラグメントのような機能性物質とレトロウイルスとを使用する遺伝子導入方法は、例えばＷＯ９５／２６２００号国際公開公報やＷＯ００／０１８３６号国際公開公報に記載されている。

更に、一般に、細胞培養にあたって、細胞を維持、刺激、分化、誘導、変異、または、増殖するために、各種のサイトカインや血清成分等が培養液に添加されるが、本発明の容器はこれを制限するものではない。

以上のとおり本発明によれば、スチレン樹脂製のシャーレ、フラスコ等と同等またはそれ以上の培養性能を有し、安全性が高い、医療目的の培養に使用するのに相応しい培養容器を提供することができる。

すなわち、本発明では、前記培養目的に対して、スチレン樹脂製のシャーレ、フラスコの培養性能と同等またはそれを上回る性能を有し、日本薬局方のプラスチック製医薬品容器試験法に適合するレベルの安全性を有する培養容器を提供することができる。

さらには、微生物汚染の危険性が少なく、操作性が良い培養容器を提供することができる。すなわち、レベルの高くない無菌環境下においても、また、培養の熟練者でなくても、操作が容易であって、操作ミスが少なく、その操作ミスが大事に至らず、さらには、容器内が容易には汚染されないような培養容器を提供することができる。

以下、本発明に係る培養容器の実施例を示した添付図面を参照して、本発明について詳細に説明する。
［参考例１］
図１を参照すると、参考例１の培養容器１は、シクロオレフィンポリマー（ゼオノア１０２０、日本ゼオン社製）であるシクロオレフィン樹脂により形成され、周壁部２と底面壁部４とを有するシャーレ様の本体を有している。この容器の底面壁部の内径は５５ｍｍで、容器１の深さは１３ｍｍである。
シクロオレフィン樹脂を０．１ｍｍの４フッ化エチレンシート間に挟み、さらに、２ｍｍのステンレス板の間に挟み、これを、上下の熱盤温度が１５０℃の熱プレス機の熱盤間に挟んで、最終表示圧力が８０ｋｇ／ｃｍ^３になるまで徐々に圧力を上げてプレスし、厚さ１５０μｍのシクロオレフィン樹脂からなるシートを形成し、次いで、このシートを、真空成形によりシャーレ様に形成することによって、参考例１の培養容器１を得た。

［参考例２］
参考例２の培養容器１は、上記シクロオレフィン樹脂としてシクロオレフィンコポリマー（アペル６５０９Ｔ（商標）、三井化学社製）を用いて成形した点を除いては、参考例１と同様にして作製されたシャーレ様の容器である。

［参考例３］
図２に示したように、参考例３の培養容器１は、細胞と接触する内側面がシクロオレフィン樹脂により形成され、周壁部２と底面壁部４とを有するシャーレ状に形成されている。この容器１の底面壁部の内径は５５ｍｍで、容器１の深さは１３ｍｍである。
より詳述すると、周壁部２及び底面壁部４は、夫々、基材となる外層２ａ，４ａと内層２ｂ，４ｂの二層構造に形成されていて、細胞と接触する内層２ｂ，４ｂがシクロオレフィン樹脂から形成されている。
ここで、内層２ｂ，４ｂは、シクロオレフィンポリマー（ゼオノア１０２０、日本ゼオン社製）から４０μｍの厚さを有するものとして形成され、他方、基材となる外層２ａ，４ａは、エチレン酢酸ビニル共重合体（ウルトラセン６３１、東ソー株式会社）から１６０μｍの厚さを有するものとして形成されている。

参考例３の容器は、以下のようにして形成した。
押出し成形により形成した厚さ４０μｍのシクロオレフィン樹脂シートと、インフレーション成形により形成した厚さ１６０μｍのエチレン酢酸ビニル重合体シートを、それらの間に空気が入らないように重ね合わせた後、０．１ｍｍの４フッ化エチレンシート間に挟み、さらに、１ｍｍのステンレス板の間に挟み、これを、上下の熱盤温度が１５０℃の熱プレス機の熱盤間に挟んで、最終圧力が８０ｋｇ／ｃｍ^３になるまで徐々に圧力を上げてプレスすることにより、シクロオレフィン樹脂４０μｍとエチレン酢酸ビニル重合体１６０μｍとからなる二層シートを形成する。

次いで、この二層シートを、シクロオレフィン樹脂が内側になるように、すなわち、細胞と接触する側の面になるように、真空成形によりシャーレ様に形成することによって、参考例３の培養容器１を得た。

［実施例４］
図３及び図４に示したように、本実施例４の培養容器１は、互いに対面位置して、周縁が接合封止される一対の第一及び第二の容器壁部２１，２２にから略袋状に形成されている。この容器１においては、細胞培養時に底面となる第一の容器壁部２１の細胞と接触する側の面がシクロオレフィン樹脂により形成され、細胞培養時に上面となる第二の容器壁部２２が柔軟性を有するエチレン酢酸ビニル共重合体により形成されている。細胞培養時に底面となる第一の容器壁部２１は、２１５ｃｍ²の面積を有するように形成されている。
これら第一の容器壁部２１と第二の容器壁部２２の周縁は周縁シール５により密封され、その周縁の適宜部位には、タンパク質コーティング時のタンパク質溶解液，洗浄液，培養する細胞および培養用培地を注入乃至排出させるためのポート６が設けられている。なお、ポート６にはそれらの物質を充填および密封し易いようにチューブ７が連結されている。

また、第一の容器壁部２１は、基材となる外層２１ａと内層２１ｂの二重構造に形成されていて、第一の容器壁部２１の内面、すなわち、細胞と接触する側の面に位置する内層２１ｂは、シクロオレフィン樹脂にて構成されている。
ここで、第一の容器壁部２１の内層２１ｂは、シクロオレフィンポリマー（ゼオノア１４２０、ゼオン社製）から４０μｍの厚さを有するものとして形成され、他方、第一の容器壁部２１の外層２１ａは、低密度ポリエチレン（カスタマーグレード、東ソー株式会社）から１７０μｍの厚さを有するものとして形成されている。また、第二の容器壁部２２は、酢酸ビニル含量が１０重量％のエチレン酢酸ビニル共重合体（ウルトラセンＵＥ５４０、東ソー株式会社）から１１０μｍの厚さを有するものとして形成されている。

実施例４の容器は、例えば、以下のようにして、形成することができる。
多層押出し成形により、厚さが４０μｍのシクロオレフィン樹脂層と厚さが１７０μｍの低密度ポリエチレン樹脂層とから成る二層構造の第一のシートを成形するとともに、インフレーション成形により、厚さ１１０μｍのエチレン酢酸ビニル重合体の第二のシートを成形し、次いで、前記第一のシートのシクロオレフィン樹脂面が前記第二のシートと対面するように前記第二のシートに重ね合わせ、それらシートの周縁を、ニトフロンシートを介して熱盤でシールすると共に、ポートを溶着することによって、本実施例４の培養容器１を得ることができる。

［参考例５］
図５に示した参考例５の培養容器１は、後述する点を除いては、上述した実施例４の培養容器１と同様に構成されている。即ち、この培養容器１においては、第一の容器壁部２１のみならず、第二の容器壁部２２も二層構造に構成され、且つ両者が同じ材質にて構成されている。より詳述すると、第一の容器壁部２１が、基材となる外層２１ａと内層２１ｂの二重構造に形成され、また、第二の容器壁部２２も、外層２２ａと内層２２ｂの二重構造に形成されている。これら容器壁部２１，２２の内面、すなわち、細胞と接触する側に位置する内層２１ｂ，２２ｂは、シクロオレフィン樹脂にて構成されている。

ここで、内層２１ｂ，２２ｂは、シクロオレフィンポリマー（ゼオノア１０２０、ゼオン社製）から２μｍの厚さを有するものとして形成され、基材となる外層２１ａ，２２ｂは、エチレン酢酸ビニル共重合体（ウルトラセン６３１、東ソー株式会社）から１６０μｍの厚さを有するものとして形成されている。
この容器は、例えば、以下のようにして、形成することができる。
インフレーション成形により形成された厚さ１６０μｍのエチレン酢酸ビニル重合体シートに、シクロオレフィン樹脂をシクロヘキサンに０．５％の割合で溶解させた溶液を、２流体スプレーで均一に吹き付けて乾燥させることにより、エチレン酢酸ビニル重合体シートの表面にシクロオレフィン樹脂の皮膜を形成する。

次いで、そのようにシクロオレフィン樹脂の皮膜が形成された２枚のシートをシクロオレフィン樹脂面が対面するように重ね合わせ、それらの周縁をニトフロンシートを介して熱盤でシールすると共に、ポートを溶着することによって、本参考例５の培養容器１を得ることができる。
なお、前記周縁シール部にシクロオレフィン樹脂皮膜が形成されると、シール強度が低下するので、シクロオレフィン樹脂溶液吹き付け時に、前記周縁シール部近傍をマスクして、前記周縁シール部にシクロオレフィン樹脂皮膜が形成されないようにすることができる。

［参考例６］
参考例６の培養容器１は、実施例４の第一の容器壁部２１のシクロオレフィン樹脂層２１ｂをシクロオレフィンコポリマー（アペル６５０９Ｔ、三井化学社製）から４０μｍの厚さを有するものとして形成した点以外は実施例４と同じ構成の袋状の容器である。

［実施例７］
本実施例の培養容器１は、底面になる第一の容器壁部２１の面積が６４ｃｍ²である点以外は、実施例４と同様に形成した袋状の容器である。

［参考例８］
参考例８の培養容器１は、細胞培養時に上面になる第二の容器壁部２２が柔軟性を有する低密度ポリエチレン（カスタマーグレード、東ソー株式会社）により形成されている点以外は、実施例７と同様に形成した袋状の容器である。

［参考例９］
参考例９の培養容器１は、底面になる第一の容器壁部２１の面積が６４ｃｍ²である点以外は、参考例５と同様に形成した袋状の容器である。

［参考例１０］
参考例１０の培養容器１は、底面になる第一の容器壁部２１の面積が２１５ｃｍ²である点以外は、参考例８と同様に形成した袋状の容器である。
なお、実施例４及び実施例７、参考例１ないし参考例３、参考例５及び参考例６、参考例８ないし参考例１０の容器は、何れも、日本薬局方のプラスチック製医薬品容器試験法プラスチック製水性注射剤容器の各試験項目に適合するものであることが別途確認されている。

［比較例１Ａ］
市販のφ６０のシャーレ（ｃｏｄｅ４３０１６６、コーニング社製）を比較例１Ａとしてそのまま用いた。

［比較例１Ｂ］
市販の２４穴プレート（ｃｏｄｅ１１４７、ベクトン・デッキンソン社製）を比較例１Ｂとしてそのまま用いた。

［比較例２］
真空成形によりシャーレ様に形成されるシートとして、厚さが１６０μｍのエチレン酢酸ビニル共重合体シートを用いた点以外は、参考例１と同じ形態の比較例２を得た。

［比較例３］
真空成形によりシャーレ様に形成されるシートとして、厚さが１２５μｍの市販のＰＭＭＡ樹脂シートを用いた点以外は、参考例１と同じ形態の比較例３を得た。

［比較例４］
真空成形によりシャーレ様に形成されるシートとして、厚さが２００μｍの市販のポリエステル樹脂シートを用いた点以外は、参考例１と同じ形態の比較例４を得た。

［比較例５］
真空成形によりシャーレ様に形成されるシートとして、厚さが４００μｍの市販のポリスチレン樹脂シートを用いた点以外は、参考例１と同じ形態の比較例５を得た。

［比較例６］
真空成形によりシャーレ様に形成されるシートとして、注射剤容器用ポリプロピレン樹脂からなる厚さ２５０μｍのシートを用いた点以外は、参考例１と同じ形態の比較例６を得た。

［比較例７］
真空成形によりシャーレ様に形成されるシートとして、注射剤容器用ポリエチレン樹脂からなる厚さが２５０μｍのシートを用いた点以外は、参考例１と同じ形態の比較例７を得た。

［比較例８］
市販の２２５ｃｍ²のフラスコ（ＭＳ２１８０Ｒ、住友ベークライト社製）を比較例８としてそのまま用いた。

［比較例９］
容器を形成するのに用いられるシートとして、シクロオレフィン樹脂がコーティングされていない注射剤容器用ポリプロピレン樹脂からなる厚さ２５０μｍのシートを用いた点以外は、参考例５と同じ形態の比較例９を得た。

［比較例１０］
内面がポリプロピレン樹脂製の市販の樹状細胞調整用のバッグを比較例１０としてそのまま用いた。

［比較例１１］
容器壁を形成するのに用いられるシートとして、シクロオレフィン樹脂がコーティングされていない注射剤容器用エチレン樹脂からなる厚さ２５０μｍのシートを用いた点以外は、参考例５と同じ形態の比較例１１を得た。

［比較例１２］
容器を形成するのに用いられるシートとして、エチレン-酢酸ビニル共重合体からなる厚さ１６０μｍのシートを用いた点以外は、参考例６と同じ形態の比較例１２を得た。

［比較例１３］
市販の７５ｃｍ²のフラスコ（ＭＳ２１２５Ｒ、住友ベークライト社製）を比較例１３としてそのまま用いた。

［比較例１４］
底面になる容器壁の面積が６４ｃｍ²である点以外は、比較例１２と同じ形態の比較例１４を得た。

［比較例１５］
細胞培養時に底面になる容器壁を柔軟性を有する低密度ポリエチレン（カスタマーグレード、東ソー株式会社）により形成した以外は、参考例１１と同様に形成した袋状の容器である。
上記実施例、参考例及び比較例について、以下のような評価試験を実施し、比較確認を行ったところ、本発明に係る実施例が優れた機能を発揮するものであることを確認した。

［評価試験１］
参考例１ないし参考例３並びに比較例１Ａ及び比較例２乃至比較例４について、抗ＣＤ３抗体コ―ト後、Ｔリンパ球細胞の増殖性試験を行い、表１に示す結果を得た。すなわち、下掲表１から明らかなように細胞と接触する側の面がシクロオレフィン樹脂により形成された容器である参考例１ないし参考例３が、細胞と接触する面が他の樹脂で形成された容器である比較例１Ａ及び比較例２乃至比較例４に比べて細胞の増殖性が同等またはそれ以上であった。

なお、本評価試験は、次の手順にて実施した。
始めに、参考例１ないし参考例３並びに比較例１Ａ及び比較例２乃至比較例４のそれぞれの容器の内側底面に、以下の手順で抗ＣＤ３抗体を固相化させた。
１．抗ＣＤ３抗体溶解液（ＯＫＴ−３、ヤンセンファーマ社製）５０μｌを５０ｍｌの容器に採り、これにダルベッコリン酸緩衝生理食塩液（以下、ＤＰＢＳ（−））を２２．５ｍｌ加えて希釈した。
２．希釈した抗ＣＤ３抗体溶解液を上記実施例、参考例及び比較例に係る培養容器に２．２５ｍｌ入れ、容器の底面全面が濡れるまで、それら培養容器内の希釈液を培養容器の底面全面にまんべんなく接触するように培養容器を水平に振とうさせた。
３．容器の底面全面が希釈液で濡れるようになったら、すなわち、容器の底面が希釈液を撥じかなくなったら、培養容器の底面に抗ＣＤ３抗体が吸着するのに十分な時間、すなわち、１時間程、そのまま放置した。
４．１時間程度経過後に、培養容器の内容液を廃棄し、ＤＰＢＳ（−）を５ｍｌ注入して培養容器を洗浄し、洗浄液を廃棄する。この作業をもう１回繰り返し、抗ＣＤ３抗体の固相化作業を終了した。

評価に使用した細胞は、以下のようにして調整した。
１．ヒトより採取した末梢静脈血より単核球画分を分離し、それを培地（ＫＢＭ５４０、コージンバイオ社製）にて懸濁した。
２．その一部を採取し、顕微鏡にて１ｍｌ当りの細胞数を測定し、残りを１ｍｌ当りの細胞数が２×１０^５個になるように培地を用いて希釈した。
３．ヒト自己血漿を１％になるように添加し、培養用細胞液とした。

細胞の培養及び細胞数の測定は、以下のように実施した。
１．前記抗ＣＤ３抗体が底面に固相化された培養容器に、前記培養用細胞液を４ｍｌ入れ、インキュベーター内（温度３７℃、湿度９５％、炭酸ガス濃度５％の雰囲気下）で培養した。
２．３日後に２ｍｌの培地（ＫＢＭ５４０、コージンバイオ社製、ＩＬ−２
１７５ＪＲＵ／ｍｌ含有）を追加した。
３．６日後、細胞数を測定し、比較例と比較した。なお、そのデータは、比較し易いように下掲表１にまとめた。

［評価試験２］
実施例４、参考例５及び参考例６並びに比較例８ないし比較例１２について、抗ＣＤ３抗体コ―ト後、Ｔリンパ球細胞の増殖性試験を行い、下掲表２に示す結果を得た。
表２から明らかなように細胞と接触する側の面がシクロオレフィン樹脂により形成された袋状容器である実施例４、参考例５及び参考例６が、細胞と接触する側の面が他の樹脂にて形成された容器である比較例８ないし比較例１２に比べて細胞の増殖性が同等またはそれ以上であった。

なお、本評価試験は、次の手順にて実施した。
始めに、実施例４、参考例５及び参考例６及び比較例８ないし比較例１２のそれぞれの容器の内側底面に、以下の手順で抗ＣＤ３抗体を固相化させた。
ここで、本発明に係る実施例４、参考例５及び参考例６に係る容器における内側底面とは、第一及び第二の容器壁の一方だけがシクロオレフィン樹脂面を有する場合は、その容器壁のシクロオレフィン樹脂面を言い、両方の容器壁がシクロオレフィン樹脂面を有する場合は、何れの容器壁面を内側底面としても構わない。

１．５０μｌの抗ＣＤ３抗体溶解液（ＯＫＴ−３ ヤンセンファーマ社製）を５０ｍｌの容器に採り、これにダルベッコリン酸緩衝生理食塩液（以下、ＤＰＢＳ（−））を１０ｍｌ加えて希釈した。
２．希釈した抗ＣＤ３抗体溶解液を上記実施例、参考例及び比較例に係る各培養容器に１０ｍｌ入れた。実施例４、参考例５及び参考例６並びに比較例９ないし比較例１２については容器内に入った空気をなるべく除き、容器の全面に希釈液が行き渡るようにした。比較例８については容器の底面全面が濡れるまで、容器内の希釈液を容器の底面全面にまんべんなく接触するように容器を水平に振とうさせた。
３．容器の内側底面に抗ＣＤ３抗体が吸着するのに十分な時間、すなわち、１時間程、そのまま放置する。
４．１時間程度経過後に、容器内の希釈液を廃棄し、ＤＰＢＳ（−）１０ｍｌを注入して容器を洗浄し、洗浄液を廃棄する。この作業をもう１回繰り返し、抗ＣＤ３抗体の固相化作業を終了した。

評価に使用した細胞は、以下のようにして調整した。
１．ヒトより採取した末梢静脈血より単核球画分を分離し、培地（ＫＢＭ５４０、コージンバイオ社製）にて懸濁した。
２．その一部を採取し、顕微鏡にて1ｍｌ当りの細胞数を測定し、残りを１ｍｌ当りの細胞数が１．５×１０^５個になるように培地を用いて希釈した。
３．ヒト自己血漿を１％になるように添加し、培養用細胞液とした。

次に、細胞の培養及び細胞数の測定を以下のように行った。
１．前記抗ＣＤ３抗体が内側底面に固相化された培養容器１に、前記培養用細胞液を５０ｍｌ入れ、インキュベーター内（温度３７℃、湿度９５％、炭酸ガス濃度５％の雰囲気下）で培養した。
２．５日後に５０ｍｌの培地（ＫＢＭ５４０ コージンバイオ社製、ＩＬ−２
１７５ＪＲＵ／ｍｌ含有）を追加した。
３．培養７日後に、細胞数を測定し、実施例を参考例及び比較例と比較した。なお、そのデータは、比較し易いように下掲表２にまとめた。

［評価試験３］
参考例１及び参考例２並びに比較例１Ｂ及び比較例２ないし比較例７について、これらの容器を細胞外マトリックスの一つであるフィブロネクチン由来の組換えフラグメントであるレトロネクチン（ＣＨ−２９６、タカラバイオ社製）でコ―トした後、レトロウイルスベクターによるリンパ球細胞株への遺伝子導入試験に供し、導入効率に関して、下掲表３に示す結果を得た。すなわち、表３から明らかなように細胞と接触する側の面がシクロオレフィン樹脂により形成された容器である参考例１及び参考例２が、細胞と接触する側の面が他の樹脂で形成された容器である比較例１Ｂ及び比較例２ないし比較例７に比べて遺伝子の導入効率が同等またはそれ以上であった。

なお、ＣＨ−２９６コート容器の作製，レトロウイルスベクターの調製及び本評価試験は、次の手順にて行った。
１．ＣＨ‐２９６コート容器の作製
フィブロネクチンフラグメントであるＣＨ‐２９６（商品名レトロネクチン；タカラバイオ社製）を、２５ｍＭクエン酸ナトリウム水溶液（ｐＨ６．０）で２０μｇ／ｍｌになるように希釈した。参考例１及び参考例２並びに比較例１Ｂ及び比較例２ないし比較例７に係る容器に、希釈したＣＨ‐２９６水溶液を０．２５ｍｌ/ｃｍ^２加え、それら容器を、室温２時間静置してコーティングした後、０．２５ｍｌ/ｃｍ^２のＰＢＳで３回洗浄し、溶液を除いて使用した。

２．レトロウイルスベクターの調製
レトロウイルスベクタープラスミドｐＤＯＧ‐ｐｏｌＩＩを、以下の手順で作製した。まず、ｒｓＧＦＰ発現ベクターｐＱＢＩ２５（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ社製）を制限酵素ＮｈｅＩ及びＮｏｔＩで切断し、７７５ｂｐのＧＦＰ遺伝子断片を得た。次にｐＱＢＩ ｐｏｌＩＩ（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ社製）を制限酵素ＮｈｅＩ及びＮｏｔＩで切断してｒｓＧＦＰ‐ＮｅｏＲ融合遺伝子を除去し、先に得た７７５ｂｐのｒｓＧＦＰ遺伝子断片を挿入し、ｐｏｌＩＩプロモーター制御下でｒｓＧＦＰ遺伝子が発現するベクターｐＱＢＩ ｐｏｌＩＩ（ｎｅｏ−）を得た。ｐＱＢＩ ｐｏｌＩＩ（ｎｅｏ−）を制限酵素ＸｈｏＩで消化し、ｐｏｌＩＩプロモーター制御下、ＧＦＰ発現ユニットを含むＤＮＡ断片を得て、その末端をＤＮＡｂｌｕｎｔｉｎｇ ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて平滑化した。レトロウイルスベクタープラスミドｐＤＯＮ‐ＡＩ（タカラバイオ社製）を制限酵素ＸｈｏＩとＳｐｈＩで消化して得られたベクター断片４．５８ｋｂｐの末端をＤＮＡｂｌｕｎｔｉｎｇ ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて平滑化した後、アルカリフォスファターゼ（タカラバイオ社製）を用いて脱リン酸化した。この平滑化したベクターに先の平滑化したｐｏｌＩＩプロモーター制御下ｒｓＧＦＰ発現ユニットを含むＤＮＡ断片をＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて挿入し、ｒｓＧＦＰ発現組換えレトロウイルスベクターｐＤＯＧ‐ｐｏｌＩＩを得た。

ｐＤＯＧ‐ｐｏｌＩＩベクターとＲｅｔｒｏｖｉｒｕｓ ＰａｃｋａｇｉｎｇＫｉｔ Ｅｃｏ（タカラバイオ社製）を用い、２９３Ｔ細胞での一過性のウイルス産生を行い、エコトロピックＤＯＧ‐ｐｏｌＩＩウイルスを獲得した。こうして得られたエコトロピックＤＯＧ‐ｐｏｌＩＩウイルスを、ＧａＬＶレトロウイルスパッケージング細胞ＰＧ１３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ‐１０６８６）にレトロネクチン（タカラバイオ社製）存在下に感染させ、遺伝子導入細胞ＰＧ１３／ＤＯＧ‐ｐｏｌＩＩを獲得した。ＰＧ１３／ＤＯＧ‐ｐｏｌＩＩは、１０％ウシ胎仔血清（ＧＩＢＣＯ社製）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、シグマ社製）で培養し、セミコンフルエントに生育したところで０．１ｍｌ／ｃｍ^２の新鮮な１０％ウシ胎仔血清含有ＤＭＥＭと交換した。さらに２４時間経過した後に回収した培地上清を０．４５μｍフィルター（ミリポア社製）でろ過してＧＡＬＶ／ＤＯＧ‐ｐｏｌＩＩウイルス液を得た。得られたウイルス液は小分けして分注し、−８０℃フリーザーで保存し、以下の保存ならびに遺伝子導入実験に供した。

３．ウイルス液の力価の測定
ウイルス液の力価の測定は、ＨＴ‐１０８０細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ‐１２１）を使用して標準的な方法［Ｍａｒｋｏｗｉｔｚ Ｄ．等、ジャーナル オブ ヴィロロジー（Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．）、第６２巻、第４号、第１１２０〜１１２４頁（１９８８年）］に従って測定した。すなわち、６ウェルの組織培養用プレートに、１ウェルあたり５×１０^４個のＨＴ‐１０８０細胞を含む１０％ウシ胎仔血清を含有するＤＭＥＭを２ｍｌ添加し、３７℃、５％ＣＯ_２にて一晩培養した後、培地を吸引除去し、各ウェルに系列希釈したウイルス液を１ｍｌ加え、更にヘキサジメトリン・ブロミド（ポリブレン：アルドリッチ社製）を終濃度８μｇ／ｍｌとなるように加えた。これを３７℃、５％ＣＯ_２で４〜６時間培養し、更に１０％ウシ血清を含有するＤＭＥＭを１ｍｌ添加して７２時間培養した。このプレートより回収した細胞をフローサイトメーター ＦＡＣＳ Ｖａｎｔａｇｅ（ベクトン・ディッキンソン社製）による解析に供し、ｒｓＧＦＰ発現ＨＴ‐１０８０細胞の割合を測定した。ウェルあたりの仕込み細胞数にｒｓＧＦＰ発現細胞の割合とウイルス上清液の希釈倍率を乗じた値より、上清１ｍｌあたりの感染性粒子数（Ｉ．Ｖ．Ｐ．／ｍｌ）を算出し、ウイルス力価とした。調製されたウイルス液の力価は１〜４×１０^５Ｉ．Ｖ．Ｐ．／ｍｌであった。

４．ＣＨ‐２９６コート容器のレトロウイルス結合活性の測定
参考例１及び参考例２並びに比較例１Ｂ及び比較例２ないし比較例７に記載の容器におけるレトロウイルス結合活性は、ＧａＬＶ／ＤＯＧ‐ｐｏｌＩＩウイルス液を用い、Ｋ５６２細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ‐２４３）への遺伝子導入効率を指標に評価した。Ｋ‐５６２細胞は１０％ウシ胎仔血清を含むＲＰＭＩ‐１６４０培地（シグマ社製）で培養した。ＧＡＬＶ／ＤＯＧ‐ｐｏｌＩＩウイルス液は１０％ウシ胎仔血清を含むＲＰＭＩ‐１６４０培地で２倍希釈して試験に供した。各容器にＧＡＬＶ／ＤＯＧ‐ｐｏｌＩＩウイルス液を加え（２５０μｌ／ｃｍ^２）、５％ＣＯ_２インキュベーター内に置いて、３７℃の温度で４時間インキュベーションし、レトロウイルスベクターを結合させた。次に、各容器をインキュベーターから取り出して、２５０μｌ／ｃｍ^２のＰＢＳで１回洗浄し、８×１０^４個／ｍｌになるように調製したＫ‐５６２細胞懸濁液を２５０μｌ／ｃｍ^２加え、３７℃の温度の５％ＣＯ_２インキュベーター内に再び入れて培養し、遺伝子導入を実施した（２×１０^４個／ｃｍ^２）。３日間培養後、ピペッティングで細胞を剥離して回収し、遺伝子導入効率を、フローサイトメーターを用いて測定した。比較例１Ｂの容器を使用した場合の遺伝子導入効率に対する各容器での遺伝子導入効率の相対値を算出した結果を下掲表３に示す。

［評価試験４］
参考例１及び参考例２並びに比較例１Ｂ及び比較例２ないし比較例７について、評価試験３と同じ操作で遺伝子導入を実施した細胞について、遺伝子導入の３日後に細胞の一部をトリパンブルーで染色し、生存細胞を計測した。この細胞数より３日間での細胞増殖率を算出し、下掲表４に示す結果を得た。すなわち、表４から明らかなように、細胞と接触する側の面がシクロオレフィン樹脂により形成された容器である参考例１及び参考例２が、細胞と接触する側の面が他の樹脂にて形成された容器である比較例１Ｂ及び比較例２ないし比較例７に比べて増殖性が同等またはそれ以上であった。

［評価試験５］
実施例７、参考例８及び参考例９並びに比較例１Ｂ及び比較例１４について、評価試験３と同様にレトロネクチンコ―ト後、レトロウイルスベクターによるリンパ球細胞株への遺伝子導入試験を行い、導入効率に関して、表５に示す結果を得た。すなわち、下掲表５から明らかなように細胞と接触する側の面がシクロオレフィン樹脂により形成された袋状容器である実施例７、参考例８及び参考例９が、細胞と接触する面が他の樹脂で形成された容器である比較例１Ｂ及び比較例１４に比べて遺伝子の導入効率が同等またはそれ以上であった。

なお、ＣＨ‐２９６コート容器の作製及び本評価試験は、次の手順にて行われた。
１．ＣＨ‐２９６コート容器の作製
フィブロネクチンフラグメントであるＣＨ‐２９６（商品名レトロネクチン；タカラバイオ社製）を、２５ｍＭクエン酸ナトリウム水溶液（ｐＨ６．０）で２０μｇ／ｍｌになるように希釈した。比較例１Ｂの容器に、希釈したＣＨ‐２９６水溶液を０．２５ｍｌ/ｃｍ^２加え、室温で２時間静置してコーティング後、０．２５ｍｌ/ｃｍ^２のＰＢＳで３回洗浄し溶液を除いて使用した。実施例７、参考例８及び参考例９並びに比較例１Ｂ及び比較例１４には、希釈したＣＨ‐２９６水溶液を０．１１ｍｌ/ｃｍ^２加え、室温で２時間静置してコーティング後、０．３５ｍｌ/ｃｍ^２のＰＢＳで３回洗浄し、溶液を除いて使用した。

２．ＣＨ‐２９６コート容器のレトロウイルス結合活性の測定
実施例７、参考例８及び参考例９並びに比較例１Ｂ及び比較例１４に係る容器でのレトロウイルス結合活性は、評価試験３において採用した方法で実施した。実施例４の容器については、その容器を構成するエチレン酢酸ビニル重合体シートの厚さを１１０μｍとしたものも作製し、他の容器と同様に試験に供した。ただし、ＧＡＬＶ／ＤＯＧ‐ｐｏｌＩＩウイルス液は１０％ウシ胎仔血清を含むＲＰＭＩ‐１６４０培地で４倍希釈して試験に供した。遺伝子導入操作の後、さらに３日間培養後、ピペッティングで細胞を剥離して回収し、遺伝子導入効率を、フローサイトメーターを用いて測定した。比較例１Ｂの容器でレトロウイルスを結合した場合の遺伝子導入効率に対する各容器での遺伝子導入効率の相対値を算出した結果を表５に示す。

［評価試験６］
評価試験５で実施した遺伝子導入３日後、細胞の一部をトリパンブルーで染色し、生存細胞を計測した。この細胞数より３日間での細胞増殖率を算出し、下掲表６に示す結果を得た。すなわち、表６から明らかなように細胞と接触する側の面がシクロオレフィン樹脂により形成された袋状容器である実施例７、参考例８及び参考例９は、細胞と接触する側の面のガス透過性が悪いにもかかわらず、細胞と接触しない側の容器壁をガス透過性のフィルムにて構成することによって密封された容器に封入された細胞の増殖を促進させることができた。また、ガス透過性の良い参考例６の容器に関しては、比較例１２の増殖性と同等であった。

［評価試験７］
参考例１及び比較例１Ａについて、評価試験３と同様にレトロネクチンコ―ト後、接着性細胞であるヒト間葉系幹細胞（Ｃａｍｂｒｅｘ社製）の増殖試験を行った。使用した培地は高グルコースＤＭＥＭ（１０％ＦＣＳ，抗生物質添加）である。この試験の結果、細胞と接触する側の面がシクロオレフィン樹脂により形成されたシャーレ状容器である参考例１が、一般的に接着細胞の培養に使用されているポリスチレン樹脂を表面に有する容器である比較例１Ａに比べて、細胞の十分な進展、接着が見られ、同等の増殖性を示した。

［評価試験８］
参考例３及び比較例１、実施例７及び参考例８並びに比較例１３について、評価試験３と同様にレトロネクチンコ―ト後、接着性細胞であるヒト前駆脂肪細胞（Ｃａｍｂｒｅｘ社製、ＨＰＲＡＤ−ＳＱ）を用いて増殖に関して試験した。使用した培地はＰＧＭ培地（Ｃａｍｂｒｅｘ社製；１０％ ＦＢＳ，２ｍＭグルタミン、抗生物質添加）である。この試験の結果、細胞と接触する側の面がシクロオレフィン樹脂により形成された容器である参考例３、実施例７及び参考例８は、細胞と接触する側の面がポリスチレン樹脂により形成された容器である比較例１及び比較例１３と同等の増殖性を発揮するものであることが判った。

［評価試験９］
参考例３及び比較例１について、評価試験３と同様にレトロネクチンをコ―トし、続いて評価試験１と同様に抗ＣＤ３抗体をコートした後、Ｔリンパ球細胞の増殖性試験に用いて増殖に関して試験した。ヒト血清アルブミンを０．２％となるように添加したＧＴ−Ｔ５０３倍地（商標）（タカラバイオ（株）製）に適当量のインターロイキン２を添加してＴリンパ球細胞を培養した。その結果、細胞と接触する側の面がシクロオレフィン樹脂により形成されている容器である参考例３は、細胞と接触する側の面が他の樹脂で形成された容器である比較例１に比べて増殖性が同等またはそれ以上であった。

［評価試験１０］
参考例１０及び比較例１５について、抗ＣＤ３抗体コ―ト後、Ｔ細胞の増殖性試験を行い、下掲表７に示す結果を得た。なお、表７には各容器が有する培地１ｍｌ当りの酸素供給能力を示した。
表７から明らかなように、細胞と接触する側の面がシクロオレフィン樹脂により形成された袋状容器であっても、培地への酸素供給能力が少ないと、すなわち、培地１ｍｌ当りの酸素供給能力が、０．２ｃｃ／容器／ｄａｙ／ａｔｍ以下であると、細胞の増殖性が著しく低下することが分かる。
なお、本評価試験は、評価試験２と同じ手順で行ない、さらに、培養７日目に培養液を１００ｍｌ追加して培養液の総量を２００ｍｌとし、十分に細胞を増殖させるため、３日間続けて培養した。データは、比較し易いように表７にまとめた。

シャーレ様培養容器の一例を示す、一部切欠き斜視図である。 シャーレ様培養容器の別の一例を示す、一部切欠き斜視図である。 本発明の袋状培養容器の一例を示す平面図である。 図３に示した袋状培養容器の部分断面図である。 本発明の袋状培養容器の他の一例を示す部分断面図である。

１ 培養容器
２，４ 容器壁部
２１ 第一の容器壁部
２２ 第二の容器壁部
２ａ，４ａ，２１ａ，２２ａ 基材となる外層
２ｂ，４ｂ，２１ｂ，２２ｂ シクロオレフィン樹脂から成る内層
５ 周縁シール
６ ポート
７ チューブ

Claims (15)

1. 細胞への遺伝子導入と当該遺伝子導入後の細胞を培養するための袋状の培養容器であって、互いに対面位置して周縁が封止された一対の第一及び第二の壁部にて形成された容器本体と、その容器本体内に内容液を充填し又は前記本体から前記内容液を排出させるためのポートとを備え、細胞培養時に底面となる前記第一の壁部が低密度ポリエチレンとその容器内側に位置する表面に膜状に形成されたシクロオレフィン樹脂層とから形成され、細胞培養時に上面となる前記第二の壁部が柔軟性ならびに気体透過性を有するエチレン酢酸ビニルで形成されていることを特徴とする培養容器。
2. 前記シクロオレフィン樹脂層が、コーティング法、貼り合わせ法、多層押出し成形法の何れかにより形成されたものであることを特徴とする請求項１に記載の培養容器。
3. 前記第一の壁部が、柔軟性を有することを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の培養容器。
4. 前記容器本体の一部または全部が、透明性を有することを特徴とする請求項１ないし請求項３の何れか一つに記載の培養容器。
5. ２５℃における前記第一の壁部の実効面積あたりの酸素透過性と前記第二の壁部の実効面積あたりの酸素透過性の和を、内容液の液量で割った数値が、０．２ｃｃ／ａｔｍ・ｄａｙ・ｍｌ以上であることを特徴とする請求項１ないし請求項４の何れか一つに記載の培養容器。
6. 少なくとも、前記シクロオレフィン樹脂層の面に、前記細胞を刺激、分化、誘導、または、増殖させるタンパク質をコートまたは固相化したことを特徴とする請求項１ないし請求項５の何れか一つに記載の培養容器。
7. 前記タンパク質が、細胞外マトリックスを構成する成分、その誘導体、または、そのフラグメントであることを特徴とする請求項６に記載の培養容器。
8. 前記細胞外マトリックスを構成する成分がフィブロネクチン、ラミニン、コラーゲン、プロテオグリカン、またはそれらのフラグメントであることを特徴とする請求項７に記載の培養容器。
9. 前記細胞外マトリックスを構成する成分のフラグメントが、フィブロネクチンフラグメントＣＨ−２９６であることを特徴とする請求項８に記載の培養容器。
10. 前記タンパク質が、抗体、その誘導体、または、そのフラグメントであることを特徴とする請求項６に記載の培養容器。
11. 前記抗体が抗ＣＤ３抗体であることを特徴とする請求項１０に記載の培養容器。
12. 前記細胞が、人体内に注入または埋設され、あるいは、人体の損傷部に貼付される細胞であることを特徴とする請求項１ないし請求項１１の何れか一つに記載の培養容器。
13. 少なくとも標的細胞と、遺伝子導入用ベクターとを容器内に共存させて、前記遺伝子導入用ベクターに組み込まれた遺伝子を前記標的細胞に導入するのに用いられることを特徴とする請求項６ないし請求項１１の何れか一つに記載の培養容器。
14. 請求項１ないし請求項１１の何れか一つに記載の培養容器を用い、前記培養容器の容器本体内において、細胞への遺伝子導入と当該遺伝子導入後の前記細胞を培養することを特徴とする細胞培養方法。
15. 請求項７ないし請求項１２の何れか一つに記載の培養容器を用い、前記培養容器の容器本体内において、少なくとも標的細胞と、遺伝子導入用ベクターとを共存させ、前記遺伝子導入用ベクターに組み込まれた遺伝子を前記標的細胞に導入し、遺伝子導入後の前記細胞を培養することを特徴とする細胞培養方法。

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