JP6954121B2 - 培養細胞の分化促進方法及び培養細胞分化促進剤 - Google Patents
培養細胞の分化促進方法及び培養細胞分化促進剤 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6954121B2 JP6954121B2 JP2017559157A JP2017559157A JP6954121B2 JP 6954121 B2 JP6954121 B2 JP 6954121B2 JP 2017559157 A JP2017559157 A JP 2017559157A JP 2017559157 A JP2017559157 A JP 2017559157A JP 6954121 B2 JP6954121 B2 JP 6954121B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- differentiation
- norbornene
- cultured
- cultured cells
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0653—Adipocytes; Adipose tissue
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0662—Stem cells
- C12N5/0667—Adipose-derived stem cells [ADSC]; Adipose stromal stem cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
- C12M1/22—Petri dishes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/50—Soluble polymers, e.g. polyethyleneglycol [PEG]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
- C12N2533/30—Synthetic polymers
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Description
また、上記の分化誘導操作において、培養容器としては、一般に、親水化処理が施されたポリスチレン製のディッシュやフラスコ等が汎用されている。
(1)培養されている細胞に、ノルボルネン系付加重合体成形体を接触させることを特徴とする培養細胞の分化促進方法。
(2)培養されている細胞が幹細胞である(1)に記載の培養細胞の分化促進方法。
(3)ノルボルネン系付加重合体成形体からなる培養細胞分化促進剤。
液体培地としては、通常、pH緩衝作用があり、浸透圧が細胞に好適なものであり、細胞の栄養成分を含み、かつ、細胞に対して毒性がないものが用いられる。
液体培地にpH緩衝作用を付与する成分としては、トリス塩酸塩、各種リン酸塩、各種炭酸塩等が挙げられる。
液体培地の浸透圧調整は、通常、細胞の浸透圧とほぼ同じになるように、カリウムイオン、ナトリウムイオン、カルシウムイオン、グルコース等の濃度を調整した水溶液を用いて行われる。
かかる水溶液としては、リン酸緩衝生理食塩水、トリス緩衝生理食塩水、HEPES緩衝生理食塩水等の生理食塩水;乳酸リンゲル液、酢酸リンゲル液、重炭酸リンゲル液等のリンゲル液;等が挙げられる。
細胞の栄養成分としては、アミノ酸、核酸、ビタミン類、ミネラル類等が挙げられる。
液体培地としては、RPMI−1640、HAM、α−MEM、DMEM、EMEM、F−12、F−10、M−199等の各種市販品を利用することができる。
分化誘導するための添加剤としては、細胞表面の受容体に作用する、リガンド、アゴニスト、アンタゴニスト;核内受容体の、リガンド、アゴニスト、アンタゴニスト;コラーゲンやファイブロネクチンなどの細胞外マトリックス;細胞外マトリックスの一部分あるいは、細胞外マトリックスを模擬した化合物;細胞内の情報伝達経路に関わるタンパク質に作用する成分;細胞内の1次代謝又は2次代謝の酵素に作用する成分;細胞内の核内又はミトコンドリア内の遺伝子の発現に影響を与える成分;ウィルスベクターなどと組み合わせて細胞内に導入することができるDNAやRNA;等が挙げられる。
これらの添加剤は、一種単独で、あるいは二種以上を組み合わせて用いることができる。
もちろん、これらの添加剤が含まれている市販の幹細胞用の各種分化培地を用いてもよい。
これらの単量体は、置換基を1種又は2種以上有していてもよい。置換基としては、アルキル基、アルキレン基、アリール基、シリル基、アルコキシカルボニル基、アルキリデン基等が挙げられる。
付加重合触媒としては、例えば、チタン、ジルコニウム又はバナジウム化合物と有機アルミニウム化合物とからなる従来公知の付加重合触媒を用いることができる。
本発明においてガラス転移温度は、JIS K 7121に基づいて測定されたものである。
また、ノルボルネン系付加重合体には、熱可塑性樹脂材料で通常用いられている配合剤、例えば、軟質重合体、酸化防止剤、紫外線吸収剤、光安定剤、近赤外線吸収剤、離型剤、染料や顔料などの着色剤、可塑剤、帯電防止剤、蛍光増白剤などの配合剤を、通常採用される量、添加することができる。
また、ノルボルネン系付加重合体には、軟質重合体以外のその他の重合体(以下、単に「その他の重合体」という)を混合しても良い。ノルボルネン系付加重合体に混合されるその他の重合体の量は、ノルボルネン系付加重合体100重量部に対して、通常200重量部以下、好ましくは150重量部以下、より好ましくは100重量部以下である。
ノルボルネン系付加重合体に対して配合する各種配合剤やその他の重合体の割合が多すぎると、細胞の分化促進性が低下するため、いずれもノルボルネン系付加重合体の性質を損なわない範囲で配合することが好ましい。
二軸混練機を用いる場合、混練後は、通常は溶融状態で棒状に押出し、ストランドカッターで適当な長さに切り、ペレット化して用いられることが多い。
こうして得られる成形体が、本発明の培養細胞分化促進剤である。
また、細胞と接触することができる限りにおいて、ディッシュ、プレート、バッグ、チューブ、スキャホールド、カップ、ジャー・ファーメンターなどの培養容器;攪拌翼、攪拌子、バッフル、連結チューブなど培養装置の部品;ピペット、攪拌素子、フィルタ、セルスクレイパーなどの培養操作に用いる培養器具;等の一部又は全部を構成する部材であってもよい。
また、これらの成形体表面は、プラズマ処理、コロナ放電処理、オゾン処理、紫外線照射処理など培養容器に対して一般的に施す、滅菌目的以外の処理を行うこともできる。
なお、細胞には、情報伝達能があるため、培養中の全ての培養細胞がノルボルネン系付加重合体成形体に接触する必要はなく、また、培養期間全体に渡って両者が接触している必要もない。但し、接触による効果は経時的に低下するため、接触時間は長い方が好ましい。
培養細胞と、ノルボルネン系付加重合体成形体との接触温度は、細胞が増殖できる温度であれば特に制限されない。
〔製造例1〕
ノルボルネン系付加重合体として、三井化学社製「アペル(登録商標)APL6013T」及びポリプラスチックス社製「トパス(登録商標)6013」を用い、射出成形により、底面直径が3cmの培養用ディッシュを成形(以下、それぞれ「トパス製ディッシュ」、及び「アペル製ディッシュ」という)した後、EOG(エチレンオキサイドガス)を用いたガス法により、トパス製ディッシュ、及び、アペル製ディッシュの滅菌処理を行った。
DMEM/Ham’s F−12(1:1、v/v)、緩衝剤(HEPES;4−(2−hydroxyethyl)−1−piperazineethanesulfonic acid)、Fetal bovine serum、Penicillin、Streptomycin、及びAmphotericin Bを含有する脂肪幹細胞用の培養培地(pH7.4)を用いて、脂肪幹細胞(ZENBIO社製)を1×104cells/cm2の細胞密度で、トパス製ディッシュ及びアペル製ディッシュにそれぞれ蒔種して、CO2インキュベータ内で10日間培養を行った。以下、このトパス製ディッシュで培養した試料を「トパス製ディッシュ前培養試料」及び、アペル製ディッシュで培養した試料を「アペル製ディッシュ前培養試料」という。
実施例1において、トパス製ディッシュ又はアペル製ディッシュに代えて、コーニング社製の細胞培養用ディッシュ〔ファルコン(登録商標)(型番353001〕)(以下、「ポリスチレン製ディッシュ」という)を用いたことを除き、実施例1と同様にして、細胞培養を10日間行った。以下、この試料を、「ポリスチレン製ディッシュ培養試料」という。
比較例1と同じ培地を用いて、ポリスチレン製ディッシュに、脂肪幹細胞(ZENBIO社製)1×104cells/cm2の細胞密度で播種し、CO2インキュベータ内で3日間培養を行った後、培地を全部除去して、代わりに、DMEM/Ham’s F−12(1:1、v/v)、緩衝剤(HEPES)、Fetal bovine serum、Penicillin、Streptomycin)、Amphotericin B、Biotin、Pantothenate、Human insulin、Dexamethasone、Isobutylmethylxanthine、PPARγ agonistを含有する脂肪細胞への分化培養培地を添加し、CO2インキュベータ内で、さらに、7日間培養を行った。以下、この試料を、「ポリスチレン製ディッシュ分化培養試料」という。
実施例1及び比較例1において、細胞の分化状態を評価するために、細胞内に発現している分化マーカーの分析を以下のように行った。分化マーカーとしては、脂肪細胞の分化レギュレーター遺伝子であるPPARγを指標とした。
細胞からのRNA抽出は、CellAmp Direct Prep Kit for RT−PCR(Real Time)(タカラバイオ社製)を用いて行い、その抽出試料を鋳型試料として、Real TimePCR反応試薬として、CellAmp Direct RNA Prep Kit for One Step RT−PCR(Real Time)(タカラバイオ社製)を用いて、PCR−CFX96(BioRad社製)システムでPCR反応を行った。
脂肪細胞への分化マーカーであるPPARγは、ポリスチレン製の培養容器での発現に比較して、トパス製ディッシュ培養試料、及び、アペル製ディッシュ培養試料で増加しており(実施例1、比較例1)、アペル製ディッシュでは分化用の培地を用いなくとも、ポリスチレン製ディッシュで分化用の培地を用いた場合と同程度に分化マーカーが検出されていることがわかる(実施例1、比較例2)。
このことから、ノルボルネン系付加重合体を接触させることにより、細胞の分化が促進されることが示された。
また、比較例1のポリスチレン製ディッシュ培養試料(培養10日目)を位相差顕微鏡で観察した。その結果を図3に示した。
図3で示されたポリスチレン製ディッシュ培養試料に比較して、図2のアペル製ディッシュ培養試料では、細胞塊が形成されるとともに、油滴蓄積も進んでいることが示された。
Claims (4)
- 培養されている細胞に、平らな表面を有する、ノルボルネン系単量体の付加重合体成形体、又は、平らな表面を有する、ノルボルネン系単量体とこれと共重合可能なその他の単量体との付加重合体の成形体の、前記平らな表面を接触させることを特徴とする培養細胞の分化促進方法。
- 培養されている細胞が幹細胞である請求項1記載の培養細胞の分化促進方法。
- 培養されている細胞が脂肪幹細胞であること請求項2記載の培養細胞の分化促進方法。
- 請求項1に記載の分化促進方法を実施するための培養細胞分化促進剤であって、平らな表面を有する、ノルボルネン系単量体の付加重合体成形体、又は、平らな表面を有する、ノルボルネン系単量体とこれと共重合可能なその他の単量体との付加重合体の成形体からなる培養細胞分化促進剤。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2015256336 | 2015-12-28 | ||
JP2015256336 | 2015-12-28 | ||
PCT/JP2016/088207 WO2017115706A1 (ja) | 2015-12-28 | 2016-12-21 | 培養細胞の分化促進方法及び培養細胞分化促進剤 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2017115706A1 JPWO2017115706A1 (ja) | 2018-10-18 |
JP6954121B2 true JP6954121B2 (ja) | 2021-10-27 |
Family
ID=59225054
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2017559157A Active JP6954121B2 (ja) | 2015-12-28 | 2016-12-21 | 培養細胞の分化促進方法及び培養細胞分化促進剤 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20190002830A1 (ja) |
EP (1) | EP3399023A4 (ja) |
JP (1) | JP6954121B2 (ja) |
CN (1) | CN108368481A (ja) |
WO (1) | WO2017115706A1 (ja) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP7035616B2 (ja) * | 2018-02-26 | 2022-03-15 | 日本ゼオン株式会社 | 人工多能性幹細胞の分化誘導方法 |
JP7384167B2 (ja) * | 2018-09-28 | 2023-11-21 | 日本ゼオン株式会社 | 心毒性評価方法 |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP5659448B2 (ja) * | 2006-08-23 | 2015-01-28 | 株式会社フコク | 培養容器及び同容器を用いた細胞培養方法 |
KR20110135211A (ko) * | 2010-06-10 | 2011-12-16 | 포항공과대학교 산학협력단 | 세포 배양용 용기 및 그 제조 방법 |
EP2985782A4 (en) * | 2013-03-04 | 2016-10-05 | Lintec Corp | SUBSTRATE FILM FOR A CUTTING SHEET AND SHEET FILM WITH THIS SUBSTRATE |
US10195313B2 (en) * | 2014-04-10 | 2019-02-05 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Method for forming hydrogel arrays using surfaces with differential wettability |
US20170130203A1 (en) * | 2014-06-26 | 2017-05-11 | Zeon Corporation | Method for culturing adhesive cells, culture vessel, and method for producing protein |
CN106661546B (zh) * | 2014-06-26 | 2020-03-03 | 日本瑞翁株式会社 | 培养细胞的分化促进方法以及培养细胞分化促进剂 |
WO2015199118A1 (ja) * | 2014-06-26 | 2015-12-30 | 日本ゼオン株式会社 | 培養細胞内のerkまたはaktのリン酸化亢進方法、細胞の培養方法、およびリン酸化亢進剤 |
-
2016
- 2016-12-21 JP JP2017559157A patent/JP6954121B2/ja active Active
- 2016-12-21 WO PCT/JP2016/088207 patent/WO2017115706A1/ja active Application Filing
- 2016-12-21 EP EP16881681.7A patent/EP3399023A4/en active Pending
- 2016-12-21 US US16/063,376 patent/US20190002830A1/en not_active Abandoned
- 2016-12-21 CN CN201680072778.0A patent/CN108368481A/zh not_active Withdrawn
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP3399023A1 (en) | 2018-11-07 |
US20190002830A1 (en) | 2019-01-03 |
JPWO2017115706A1 (ja) | 2018-10-18 |
CN108368481A (zh) | 2018-08-03 |
EP3399023A4 (en) | 2019-06-05 |
WO2017115706A1 (ja) | 2017-07-06 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6720867B2 (ja) | 培養表皮細胞の分化促進方法および培養表皮細胞分化促進剤 | |
Tsai et al. | Enhancement of human adipose-derived stem cell spheroid differentiation in an in situ enzyme-crosslinked gelatin hydrogel | |
KR102470046B1 (ko) | 접착형 세포의 배양 방법, 배양 용기 및 단백질의 생산 방법 | |
JP6954121B2 (ja) | 培養細胞の分化促進方法及び培養細胞分化促進剤 | |
JP2018201403A (ja) | 幹細胞の培養方法 | |
JP5958658B2 (ja) | 培養細胞内のerkまたはaktのリン酸化亢進方法、細胞の培養方法、およびリン酸化亢進剤 | |
WO2018066512A1 (ja) | 幹細胞の分離方法、分化誘導方法及び細胞培養容器の使用 | |
JP2018201394A (ja) | 細胞シートの製造方法 | |
WO2017188061A1 (ja) | 細胞用保存容器、及び細胞の保存方法 | |
JP6806058B2 (ja) | 細胞外マトリックス産生促進方法、細胞の培養方法、及び細胞外マトリックス産生促進剤 | |
JP6988480B2 (ja) | 浮遊培養馴化接着型細胞の調製方法、接着型上皮細胞の上皮間葉転換誘導方法、及びそれらの利用 | |
JP6716887B2 (ja) | 接着型細胞の培養方法、及びタンパク質の産生方法 | |
JP7268439B2 (ja) | 多能性幹細胞の分化誘導方法 | |
TWI727925B (zh) | 貼附型細胞的培養方法、培養容器及蛋白質的產生方法 | |
Gilchrist et al. | Mesenchymal stromal cell remodeling of a gelatin hydrogel microenvironment defines an artificial hematopoietic stem cell niche | |
Feng | Effect of Topography, Stiffness and Biochemicals on Neuronal Differentiation | |
Plant et al. | Schwann cell transplantation methods using biomaterials | |
WO2018097189A1 (ja) | 幹細胞の分離方法及びノルボルネン系重合体で構成される不織布の使用 | |
Shivaprakash et al. | Delivery Vehicle and Mechanism for Human Mesenchymal Stem Cells | |
Bray | Delivery Vehicle and Mechanism for Human Mesenchymal Stem Cells |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20191202 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20210112 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20210226 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20210706 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20210806 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20210831 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20210913 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6954121 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |