KR20110135211A - 세포 배양용 용기 및 그 제조 방법 - Google Patents

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조동우
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이봉기
박광숙
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차경제
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Abstract

본 발명은 줄기세포를 비롯한 각종 세포의 증식 및 분화 효율을 높이는 세포 배양용 용기에 관한 것이다. 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 배양용 용기는 성체 줄기세포를 점착하여 증식 및 분화시키기 위한 세포 배양면을 포함하고, 상기 세포 배양면은 상기 세포 배양면 상에 배치되는 연잎 표면 복제 구조의 돌기를 포함한다.

Description

세포 배양용 용기 및 그 제조 방법{CELL CULTURE CONTAINER AND METHOD OF FABRICATING THE SAME}
본 발명은 세포 배양용 용기 및 그 제조 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 소수성 배양면을 포함하는 세포 배양용 용기 및 그 제조 방법에 관한 것이다.
현재 질병의 치료에 배양 세포들을 이용하는 세포 치료가 확대됨에 따라 세포 배양에 대한 관심이 높아지고 있다. 배양계(culture system)에는 다양한 기기들이 관계하고 있으며, 이에 있어서 중요한 요소 중의 하나가 세포 배양용 용기이다. 일반적으로 많은 수의 세포를 얻기 위하여, 배양 세포의 특성에 따라 인공적으로 만들어진 배양 접시, 배양 플라스크, 롤러 병 등의 세포 배양용 용기에서 세포를 배양하게 된다.
인공적으로 배양하는 세포들은 주로 세포 배양용 용기의 바닥에 부착되어 성장, 증식 및 분화의 과정을 거치면서 생존한다. 그러나 일부 세포는 여러 층을 형성하면서 다른 세포 위에 겹쳐 증식하기도 하고, 또 다른 일부 세포는 세포 배양액 내에서 부유 상태를 유지하면서 성장, 증식 및 분화하기도 한다.
이와 같이, 인공적으로 만들어진 세포 배양용 용기는 원래 세포가 안주하고 있는 세포외 기질과는 다른 표면 특성을 갖고 있어, 세포 증식 및 분화 효율이 저하될 수 있다. 실제로, 다양한 세포들이 인공적으로 증식한 후 임상 치료에 이용되고 있으나, 환자 치료를 위한 줄기세포 등을 포함하는 각종 세포의 분화 유도가 쉽게 성공하지 못하고 있는 문제가 있다.
본 발명은 상술한 배경기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 줄기세포를 비롯한 각종 세포의 증식 및 분화 효율을 높이는 세포 배양용 용기를 제공하는 데 그 목적이 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 세포의 증식 및 분화를 유도하는 데 필요한 비용을 저감시키는 세포 배양용 용기의 제조 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 세포 배양용 용기는 성체 줄기세포를 점착하여 증식 및 분화시키기 위한 세포 배양면을 포함하고, 상기 세포 배양면은 상기 세포 배양면 상에 배치되는 연잎 표면 복제 구조의 돌기를 포함한다.
상기 세포 배양면은 상기 세포 배양용 용기와 일체로 형성될 수 있다.
상기 세포 배양면은 생체적합성 고분자(biocompatible polymer) 로 형성될 수 있다.
상기 생체적합성 고분자는 폴리스티렌(polysterene, PS), 폴리메틸 메타크릴레이트(polymethyl methacrylate, PMMA), 싸이클릭 올레핀 코폴리머(cyclic olefin copolymer, COC), 폴리카보네이트(polycarbonate, PC), 폴리테트라플루오르에틸렌(polytetrafluoroethylene, PTFE), 폴리디메틸실록산(polydimethylsiloxane, PDMS), 폴리비닐클로라이드(polyvinylchloride, PVC), 폴리우레탄(polyurethanes, PU) 및 폴리에틸렌 테레프탈레이트(polyethylene terephthalate, PET) 중 어느 하나일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 세포 배양용 용기의 제조 방법은 기판 상에 제1 도전층 및 접착층을 순차적으로 적층하고, 상기 접착층 상에 연잎을 적층하는 단계, 상기 연잎 상에 제2 도전층 및 금속 도금층을 순차적으로 적층하는 단계, 및 상기 기판 및 상기 연잎을 순차적으로 분리하여 상기 금속 도금층 일면에 연잎 표면 복제 구조의 돌기가 형성된 몰드를 형성하는 단계를 포함한다.
상기 실시예에 따른 세포 배양용 용기의 제조 방법은 상기 몰드를 이용하여 핫 엠보싱 공정으로 세포 배양면을 형성하는 단계 및 세포 배양용 용기의 일면에 상기 세포 배양면을 부착하는 단계를 더 포함할 수 있다.
또한, 상기 실시예에 따른 세포 배양용 용기의 형상을 갖는 캐비티(cavity)를 포함하고, 상기 캐비티의 일면에 상기 몰드가 부착된 금형을 배치하는 단계, 상기 캐비티 내에 열가소성 수지를 주입하는 단계, 및 상기 열가소성 수지가 경화되어 형성된 세포 배양용 용기를 인출하는 단계를 더 포함할 수도 있다.
본 발명의 다른 실시예에 따른 세포 배양용 용기는 성체 줄기세포를 점착하여 증식 및 분화시키기 위한 세포 배양면을 포함하고, 상기 세포 배양면은 10㎛ 내지 15㎛의 지름 및 10㎛ 내지 20㎛의 높이로 형성되고, 10㎛ 내지 20㎛의 간격을 두고 배치되는 제1 돌기, 및 상기 마이크로 돌기 상에 형성되고, 0.1㎛ 내지 1㎛의 크기로 형성되는 제2 돌기를 포함한다.
상기 제1 돌기는 원뿔 또는 원기둥 형상일 수 있다.
본 발명의 실시예에 따르면, 세포의 증식 및 분화에 영향을 주어 특정 세포로의 분화를 유도하거나 그 효율을 높일 수 있다.
또한, 연잎 표면 구조의 돌기를 포함하는 세포 배양용 용기의 대량 생산이 가능하여 세포 배양을 위한 비용과 시간을 저감시킬 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 배양용 용기를 나타내는 개략도이다.
도 2a 및 도 2b는 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 배양용 용기의 세포 배양면을 확대하여 나타낸 사진이다.
도 3a 내지 도 3e는 본 발명의 일 실시예에 따른 연잎 구조 표면의 제작 공정을 순차적으로 나타내는 도면이다.
도 4는 본 발명의 다른 실시예에 따른 연잎 구조 표면의 제작 공정을 나타내는 도면이다.
도 5는 지방기질유래 줄기세포의 부착력을 비교하여 나타낸 사진이다.
도 6는 지방기질유래 줄기세포의 형태를 형광현미경을 통해 관찰한 사진이다.
도 7은 부착된 지방기질유래 줄기세포의 크기를 비교한 그래프이다.
도 8은 지방유래 줄기세포의 지방세포 분화와 관련된 염색 및 유전자 발현을 나타내는 사진이다.
이하, 첨부한 도면들을 참고로 하여 본 발명의 실시예에 대하여 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있을 정도로 상세하게 설명한다. 도면에서 나타난 각 구성의 크기 및 두께 등은 설명의 편의를 위하여 임의로 나타내었으므로, 본 발명이 반드시 도시된 바에 한정되지 않는다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 배양용 용기를 나타내는 개략도이고, 도 2a 및 도 2b는 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 배양용 용기의 세포 배양면을 확대하여 나타낸 사진이다.
도 1을 참조하면, 본 실시예에 따른 세포 배양용 용기(100)는 세포 배양면(110)을 포함한다. 세포 배양면(110)은 인공적으로 세포를 증식 및 분화시키기 위한 것으로, 배양하고자 하는 세포를 세포 배양면(110) 상에 점착시켜 원하는 방향으로 분화를 유도하게 된다. 성체 줄기세포에는 골수유래 줄기세포, 태반유래 줄기세포, 지방유래 줄기세포 등이 있는데, 이 중 지방유래 줄기세포의 경우 상대적으로 많은 양의 세포를 얻을 수 있고, 다분화능을 가지고 있어 재생의학 및 조직공학 등에 다양하게 활용할 수 있다. 본 실시예에 따른 세포 배양용 용기(100)는 이러한 성체 줄기세포, 특히 지방유래 줄기세포의 부착, 증식 및 분화 효율을 향상시키기 위한 것이다.
도 2a 및 도 2b를 참조하면, 본 실시예에 따른 세포 배양용 용기(100)의 세포 배양면(110)은 세포가 접착하는 일면이 연잎 표면 복제구조로 형성된다. 즉, 세포 배양면(110)의 일면은 연잎 표면과 동일한 형태로 돌기들이 불규칙하게 배치된 형태로 형성되고, 각 돌기들은 마이크로 사이즈로 미세하게 형성된다.
구체적으로, 세포 배양면(110) 상의 연잎 표면 복제구조의 돌기는 약 10㎛ 내지 약 15㎛의 지름을 갖고 약 10㎛ 내지 약 20㎛의 높이로 형성되는 마이크로 돌기일 수 있다. 그리고, 이들 마이크로 돌기들은 세포 배양면(110) 상에서 약 10㎛ 내지 약 20㎛의 간격을 두고 배치될 수 있다. 이 때, 마이크로 돌기는 원뿔 또는 원기둥 형상으로 형성될 수 있다. 한편, 마이크로 돌기 상에는 약 0.1㎛ 내지 약 1㎛의 크기를 갖는 나노 돌기가 더 형성될 수 있다.
본 실시예에서 세포 배양면(110)은 폴리스티렌(polystyrene, PS)으로 형성되는데, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니고, 세포 배양면(110)의 재질은 당업자에 의하여 다양하게 변경될 수 있다. 구체적으로, 세포 배양면(110)은 생체적합성 고분자(biocompatible polymer)로 형성되면 충분한 것으로, 폴리스티렌 이외에도 폴리메틸 메타크릴레이트(polymethyl methacrylate, PMMA), 싸이클릭 올레핀 코폴리머(cyclic olefin copolymer, COC), 폴리카보네이트(polycarbonate, PC), 폴리테트라플루오르에틸렌(polytetrafluoroethylene, PTFE), 폴리디메틸실록산(polydimethylsiloxane, PDMS), 폴리비닐클로라이드(polyvinylchloride, PVC), 폴리우레탄(polyurethanes, PU) 또는 폴리에틸렌 테레프탈레이트(polyethylene terephthalate, PET)로 형성될 수 있다.
도 3a 내지 도 3e 및 도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 배양용 용기를 제조하는 공정을 순차적으로 나타낸 도면으로, 이들을 참조하여 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 배양용 용기의 제조 방법을 설명한다.
도 3a를 참조하면, 기판(210) 상에 접착 강화층(220)을 적층하고, 접착 강화층(220) 상에 제1 도전층(230)을 적층한다. 접착 강화층(220)은 기판(210)과 제1 도전층 사이의 접착력을 향상시키기 위한 것으로서, 크롬 또는 티타늄 등의 접착 강화 물질을 포함하여 형성된다. 한편, 기판(210)으로는 실리콘 웨이퍼와 같은 실리콘 기판을 사용하고, 제1 도전층(230)은 금, 구리 또는 니켈 등 전도성 물질을 포함하여 형성된다.
도 3b 및 도 3c를 참조하면, 제1 도전층(230) 상에 접착층(240)을 형성한 후 연잎(250)을 부착하고, 연잎(250)과 제1 도전층(230)을 덮도록 제2 도전층(260)을 적층한다. 이 때 접착층(240)은 에폭시 계열의 접착제를 사용할 수 있고, 제2 도전층(260)은 금 또는 탄소 이온 코팅 공정으로 형성한다.
도 3d 및 도 3e를 참조하면, 제2 도전층(260) 상에 도금 공정을 통하여 도금층(270)을 형성한다. 본 실시예에서는 도금 공정에 사용하는 금속은 니켈, 구리, 은, 금 및 아연 주석-납 합금 중 어느 하나를 포함한다. 도금층(270)을 형성한 후 기판(210)을 제거하고, 도금층(270)과 접착되어 있는 접착 강화층(220), 제1 도전층(230), 제2 도전층(260) 및 연잎(250)을 제거함으로써, 연잎 표면 구조의 세포 배양면을 형성하기 위한 몰드(200)를 형성하게 된다. 몰드(200)의 일면에는 연잎 표면의 역 패턴이 복제 형성됨으로써 이를 통해 연잎 표면 구조의 돌기를 갖는 세포 배양면을 형성할 수 있게 된다. 한편, 본 실시예에서는 기판(210), 접착 강화층(220), 제1 도전층(230), 접착층(240), 제2 도전층(260) 및 도금층(270)의 재질을 한정하여 설명하였으나, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니고, 이들의 재질은 당업자에 의하여 다양하게 변경이 가능할 것이다.
상기의 공정을 통하여 몰드(200)를 형성한 후 핫 엠보싱(Hot Embossing) 공정을 통해 세포 배양면을 형성하여, 이를 세포 배양용 용기의 일면에 부착함으로써 세포 배양용 용기를 제조하게 된다. 핫 엠보싱 공정은 열가소성 수지를 이용하여 마이크로 사이즈 내지 나노 사이즈의 작은 크기의 구조물을 제조하기 위한 공정으로, 본 실시예에서는 폴리스티렌(polystyrene, PS)을 가열한 후 폴리스티렌 상에서 몰드(200)를 가압(press)하여 세포 배양면을 형성한다. 전술한 바와 같이, 몰드(200)의 일면에는 연잎 표면의 역 패턴이 형성되어 있어, 몰드(200)를 이용하여 핫 엠보싱 공정으로 형성된 세포 배양면의 일면은 연잎 표면과 동일한 표면을 갖는다. 한편, 본 실시예에 있어서도 세포 배양면을 형성하는 물질로서 폴리스티렌 이외에도 폴리메틸 메타크릴레이트 등의 다양한 생체적합성 고분자를 사용할 수 있다.
이상에서는 몰드(200)를 이용하여 세포 배양면을 별도로 형성한 후 세포 배양용 용기의 일면에 부착하는 방식으로 세포 배양용 용기를 제조하는 방법을 설명하였지만, 도 4와 같이 세포 배양면을 세포 배양용 용기와 일체로 형성할 수도 잇다.
도 4를 참조하면, 세포 배양용 용기 형상의 캐비티(320)를 포함하는 금형(300)이 배치되고, 세포 배양면이 형성되는 위치에 도 3a 내지 도 3e에서의 방식으로 제조된 연잎 표면과 역 패턴을 포함하는 몰드(310)를 배치시킨다. 몰드(310)의 배치함에 있어서 세포 배양용 용기의 일면에 연잎 표면 구조가 형성되어야 함을 고려한다. 이어서, 호퍼(350)로부터 세포 배양용 용기의 성형 재료인 열가소성 수지, 즉 폴리스티렌이 실린더(360) 내부로 공급되고, 열가소성 수지는 실린더(360) 내에서 히터(미도시)를 통해 가열되어 유동 상태가 된다. 스크루(370) 및 노즐을 거쳐 주입구(330)를 통해 유동 상태의 열가소성 수지가 금형(300)의 캐비티(320) 내로 주입되고, 주입이 완료된 후 폴리스티렌을 냉각하여 세포 배양용 용기를 완성하게 된다.
이와 같은 방식에 의하여 세포 배양용 용기를 제작할 때, 연잎 표면 구조로 형성된 세포 배양면을 일체로 형성할 수 있어 공정이 단순해지고 시간 및 비용을 절감할 수 있게 된다.
이하에서는 본 실시예에 따른 연잎 표면 구조를 갖는 세포 배양면을 포함하는 세포 배양용 용기로 줄기세포를 배양하는 경우의 효과를 실험예를 통하여 구체적으로 설명한다.
(실험예 1)
우선 도 3a 내지 도 3e의 실시예를 통하여 설명한 방법과 같이 연잎 표면 구조를 갖는 세포 배양면을 제조하였다.
우선, 실리콘 웨이퍼 상에 접촉 강화층 및 제1 도전층으로 크롬 및 금을 증착하고, 그 위에 연잎을 부착한다. 이 후, 제2 도전층으로 금을 증착하고, 도금 공정을 통해 1mm 이상의 두께의 니켈을 형성시키고, 니켈층과 웨이퍼를 분리시킨 다음 연잎을 제거하여 몰드를 제조하였다. 제작된 연잎 표면의 역 패턴의 니켈 몰드와 폴리스티렌을 이용하여, 핫 엠보싱 공정을 통해 연잎 표면 형상이 모사된 세포 배양면을 형성하였다. 구체적으로, 니켈 몰드 표면에 트리클로로실란(trichlorosilane)을 진공 증착법을 이용하여 증착시키고, 니켈 몰드 상에 폴리스티렌을 올려놓고 온도를 약 110℃로 증가시킨 후, 약 3.2MPa의 압력을 10분 동안 인가하고, 끝으로 이를 45℃까지 냉각시켰다. 이러한 과정을 통하여 도 2a 및 도 2b에서와 같이, 10㎛ 내지 15㎛의 돌기 형상과 서브-마이크로 사이즈의 형상이 성형된 연잎 표면 구조를 갖는 세포 배양면을 제조하였고, 이를 세포 배양용 용기의 일면에 부착하여 세포 배양용 용기를 제작하였다.
이와 같이 제작된 세포 배양용 용기에 지방유래 줄기세포의 부착 효율을 증가시키기 위하여 산소 플라즈마 처리를 한 후, 지방유래 줄기세포를 부착, 배양하였다. 한편, 부착 효율에 미치는 영향을 평가하기 위한 비교예로 편평한 세포 배양면을 포함하는 세포 배양용 용기에 지방유래 줄기세포를 부착, 배양하였다.
도 5 및 도 6은 각각 본 실시예와 비교예에서 지방유래 줄기세포를 3일 동안 배양한 후의 국부 점착(focal adhesion) 및 지방유래 줄기세포의 형태를 나타낸 사진이고, 도 7은 지방유래 줄기세포의 크기를 비교한 그래프이다. 이들을 참조하면, 세포 미세골격은 약 10㎛ 크기의 돌기 사이로 형성되었고, 국부 점착에 연관된 단백질인 빈쿨린(vinculin)은 약 10㎛ 크기의 돌기의 가장자리나 서브-마이크로 사이즈의 돌기에 위치함을 확인할 수 있다. 또한, 비교예에서는 지방유래 줄기세포가 넓게 퍼진 모습을 보이는 세포의 비율이 높은 반면, 본 실시예에서는 상대적으로 작은 크기로 덜 뻗은 형태를 보이는 세포의 비율이 높은 결과를 보임을 확인할 수 있다.
도 8은 본 실시예 및 비교예에서 각각 지방유래 줄기세포를 2주 내지 3주간 배양시켰을 때, 지방유래 줄기세포의 염색 및 유전자 발현을 나타내는 사진이다. 구체적으로, 지방세포 분화(adipogenic), 연골세포 분화(chondrogenic) 및 골세포 분화(osteogenic) 유도 배지(induction media)를 이용하여 본 실시예와 비교예에서의 분화능에 미치는 영향을 조사한 사진이다. 이를 참조하면, 비교예와 비교할 때 본 실시예의 화에 있어서 유전자들의 발현이 크게 증가됨을 확인할 수 있다. 특히, 지방 세포 분화에 있어서 관련된 유전자들의 발현이 크게 증가됨을 확인할 수 있다.
이상에서와 같이, 본 실시예에 따라 연잎 표면 구조의 세포 배양면을 포함하는 세포 배양용 용기에 지방유래 줄기세포를 배양하는 경우, 안정적으로 세포 점착, 증식 및 분화가 유도되는 효과를 얻을 수 있다. 또한, 이러한 구조를 통하여 지방유래 줄기세포를 배양하는 경우, 세포 분화, 특히 지방세포 분화에 있어 그 효율을 증가시키고, 많은 수의 세포를 얻을 수 있을 것이다.
이상에서, 본 발명을 바람직한 실시예를 통하여 설명하였지만, 본 발명이 이 실시예에 한정되지는 않는다. 본 발명의 범위는 다음에 기재하는 특허청구범위의 기재에 의하여 결정되는 것으로, 특허청구범위의 개념과 범위를 벗어나지 않는 한 다양한 수정 및 변형이 가능하다는 것을 본 발명이 속하는 기술 분야에 종사하는 자들은 쉽게 이해할 것이다.
100: 세포 배양용 용기 110: 세포 배양면
200: 몰드 210: 기판
220: 접착 강화층 230: 제1 도전층
240: 접착층 250: 연잎
260: 제2 도전층 270: 도금층
300: 금형 310: 몰드
320: 캐비티 330: 주입구
350: 호퍼 360: 실린더
370: 스크루

Claims (9)

  1. 성체 줄기세포를 점착하여 증식 및 분화시키기 위한 세포 배양면을 포함하는 세포 배양용 용기에 있어서,
    상기 세포 배양면은 상기 세포 배양면 상에 배치되는 연잎 표면 복제 구조의 돌기를 포함하는, 세포 배양용 용기.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 세포 배양면은 상기 세포 배양용 용기와 일체로 형성되는, 세포 배양용 용기.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 세포 배양면은 생체적합성 고분자(biocompatible polymer) 로 형성되는, 세포 배양용 용기.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 생체적합성 고분자는 폴리스티렌(polysterene, PS), 폴리메틸 메타크릴레이트(polymethyl methacrylate, PMMA), 싸이클릭 올레핀 코폴리머(cyclic olefin copolymer, COC), 폴리카보네이트(polycarbonate, PC), 폴리테트라플루오르에틸렌(polytetrafluoroethylene, PTFE), 폴리디메틸실록산(polydimethylsiloxane, PDMS), 폴리비닐클로라이드(polyvinylchloride, PVC), 폴리우레탄(polyurethanes, PU) 및 폴리에틸렌 테레프탈레이트(polyethylene terephthalate, PET) 중 어느 하나인, 세포 배양용 용기.
  5. 기판 상에 제1 도전층 및 접착층을 순차적으로 적층하고, 상기 접착층 상에 연잎을 적층하는 단계;
    상기 연잎 상에 제2 도전층 및 금속 도금층을 순차적으로 적층하는 단계; 및
    상기 기판 및 상기 연잎을 순차적으로 분리하여 상기 금속 도금층 일면에 연잎 표면 복제 구조의 돌기가 형성된 몰드를 형성하는 단계를 포함하는 세포배양용 용기의 제조 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 몰드를 이용하여 핫 엠보싱 공정으로 세포 배양면을 형성하는 단계; 및
    세포 배양용 용기의 일면에 상기 세포 배양면을 부착하는 단계를 더 포함하는 세포 배양용 용기의 제조 방법.
  7. 제5항에 있어서,
    세포 배양용 용기의 형상을 갖는 캐비티(cavity)를 포함하고, 상기 캐비티의 일면에 상기 몰드가 부착된 금형을 배치하는 단계;
    상기 캐비티 내에 열가소성 수지를 주입하는 단계; 및
    상기 열가소성 수지가 경화되어 형성된 세포 배양용 용기를 인출하는 단계를 더 포함하는 세포 배양용 용기의 제조 방법.
  8. 성체 줄기세포를 점착하여 증식 및 분화시키기 위한 세포 배양면을 포함하는 세포 배양용 용기에 있어서,
    상기 세포 배양면은,
    10㎛ 내지 15㎛의 지름 및 10㎛ 내지 20㎛의 높이로 형성되고, 10㎛ 내지 20㎛의 간격을 두고 배치되는 제1 돌기; 및
    상기 마이크로 돌기 상에 형성되고, 0.1㎛ 내지 1㎛의 크기로 형성되는 제2 돌기
    를 포함하는, 세포 배양용 용기.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 제1 돌기는 원뿔 또는 원기둥 형상인, 세포 배양용 용기.
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