JP4507686B2 - 観察用容器及び培養用容器，培養細胞 - Google Patents
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Description
本発明は細胞や、蛋白質などの生体由来物質の観察に適した観察用容器及び培養用容器と、その容器で培養した培養細胞に関する。
近年、医療目的に使われる細胞培養の技術が進歩し、実際に皮膚の移植などに用いられている。また、少量の細胞から皮膚などの組織にとどまらず角膜，歯，骨，臓器など複雑な器官へと自家移植や他家移植に向けた培養技術の進歩が見られる。
細胞の培養にはガラス製や樹脂製のペトリシャーレなどの容器が用いられる。例えば、以下のようなペトリシャーレが開示されている。所定の濃度のコラーゲン溶液を培養容器にピペットで表面が一様になるよう分注して塗布した後、１５分〜７２時間乾燥する、あるいは、所定の濃度のコラーゲン溶液を、シリコーン膜等の伸縮性を有する培養基材上に塗布し、１５〜４２℃のインキュベーター内で２０〜１２０分間重合させた後、このシリコーン膜等の伸縮性を有する培養基材をＵＶ灯下で１５分〜７２時間放置し、コラーゲンが乾燥した後、リン酸緩衝液で再び湿らせ、その後、１０〜４０％伸展させて固定するなどの手法によって細胞培養用シャーレを作成する方法がある（特許文献１参照）。
また、別の容器として以下のような培養容器が開示されている。培養容器の底面に温度によって親水性，疎水性の入れ替わるポリマーを塗布し、紫外線照射などで定着させることによって培養後の細胞の剥離に適した培養容器を作ることが出来る（特許文献２参照）。
また、生体試料の観察に適した容器の例として以下のようなスライドガラスが開示されている。ガラス表面に反射防止膜を形成することでガラス表面からの光の反射を減らし、良好な信号強度／背景ノイズ光比を得ることができる（特許文献３参照）。
上記第１の方法によれば、細胞をその細胞と親和性のあるコラーゲンの上において培養することが出来るが、反面、細胞と培養容器の密着力が強い為に細胞の剥離が困難であった。この密着力に対して、機械的に細胞を剥がすと細胞に物理的な損傷を与え、トリプシンなどの酵素によって化学的な処理を行うと細胞表面の膜タンパク質が分解されて移植後の細胞の組織への定着率が低下するという問題があった。
上記第２の方法は培養容器表面の親水性を調整することによって細胞表面の密着力を減少させることで剥離の問題を解決することが出来る。しかし、培養容器表面が特定の分子に限定される、培養容器を作るのにかかる時間が長い、シート状の細胞の中央部への培養液の運搬を促進する必要がある、等の課題が残っていた。
以上２つの実施例においては、培養に関する課題の他に、観察する際の像が容器表面における反射光によって顕微鏡観察時においてコントラストが減少すると言う問題があった。この課題は上記第３の方法における反射防止膜の形成によって解決することができる。しかし、容器表面の材質が一般的な反射防止膜の材質に限定されるため、細胞など被観察物の密着力を制御することができず、全ての種類の細胞培養には適さないと言う課題があった。
本発明の目的は簡便に簡単な構造で剥離時の細胞への損傷を防ぎ、培養液の運搬を促進し、同時に観察時の像コントラストの優れた観察用容器及び培養用容器を提供することである。
上記課題を解決するために、本発明は容器の底面に相当直径が１０ｎｍ以上１０μｍ以下であり、高さが１０ｎｍ以上１mm以下である突起物集合体を形成し、容器表面に必要な機能に応じて機能性表面構造を形成した観察用容器及び培養用容器を提供する。これによって、培養液を細胞の下部に行き渡らせて運搬を促進するとともに、細胞と容器の接触を点接触にすることによって細胞の剥離時に生じる細胞の損傷を防ぐことのできる容器を提供するものである。また、培養液の運搬をより促進するために、突起物集合体が培養液の流れる隙間を有していることが好ましい。なお、相当直径という語を用いたのは、突起の断面が必ずしも円形ではなく、楕円，多角形，非対称形などの場合があるためで、本発明ではこれらを全て包含するために相当直径を用いている。本発明で相当直径は、突起物底面の断面の直径とする。
容器表面に形成する機能性表面構造は用途に応じて反射防止構造，細胞などの付着防止構造，表面保護構造，細胞の剥離促進構造などから選択することができる。反射防止構造としては容器表面の突起物と屈折率の異なる１種類以上の物質からなる反射防止膜，観察に用いる光の波長よりも短い相当直径を有する微小突起物の形成がある。細胞などの付着防止構造としては、同様の微小突起物の他に突起物よりも親水性の高い物質からなる付着防止層がある。表面保護構造としては容器表面の突起物よりも強度の高い物質による被覆がある。細胞の剥離促進構造としては電位調整層の被覆がある。容器表面に形成する機能性表面構造はこれらの機能のいずれか一つのみを有するものではなく、適切な材質・形状を選択することによって複数の機能を付与することができる。また、これらの機能性表面構造が細胞などの観察，培養対象に適用できない場合は容器表面の突起物先端部のみ機能性表面構造を除くことによって観察，培養対象に影響を与えることなく機能を付与することができる。
本発明を適用することによって、簡便に簡単な構造で剥離時の細胞への損傷を防ぎ、培養液の運搬を促進する観察用容器及び培養用容器を提供できる。突起物集合体を用いた形状効果で上記の効果を出しているため、形成プロセスを簡便にすることができ、従来に比べて新たな薬品や処理装置の導入も無いことから新しく廃棄方法を考慮する必要がないという効果を得ることもできた。また、機能性表面構造の付与によって、反射防止，突起物先端以外への細胞の付着の防止，表面保護，細胞の剥離促進効果を付与することができた。
また、以上の機能性表面構造による効果は細胞培養時にのみ生じるものではなく、細胞以外の観察対象、例えばタンパク質，核酸，糖鎖などを用いた観察にも適用できた。機能性表面構造による反射防止，突起物先端以外への観察対象の付着の防止と言う効果によって、特定の箇所に固定した観察対象のコントラストの高い観察像を得ることができた。
以下、図面を参照しながら本発明の観察用容器及び培養用容器について詳細に説明する。
図１は本発明における観察用容器及び培養用容器１００を示す鳥瞰図である。観察対象を入れる容器１０１の底面に相当直径が１０ｎｍ以上１０μｍ以下であり、高さが１０
ｎｍ以上１mm以下である突起物集合体１０２が形成されている。突起物集合体１０２の表面には機能性表面構造１０３が形成されている。また、突起物集合体１０２の中には液体を流れやすくするための隙間１０４が形成されている。
ｎｍ以上１mm以下である突起物集合体１０２が形成されている。突起物集合体１０２の表面には機能性表面構造１０３が形成されている。また、突起物集合体１０２の中には液体を流れやすくするための隙間１０４が形成されている。
図１の突起物集合体１０２の相当直径は、細胞との接触面積を減らすために細胞の直径よりも十分に小さく、例えば細胞の直径の５分の１以下に設定される。また、突起物の下部に十分に培養液を浸透させる必要があるためこれらの突起物の高さは十分に、例えば相当直径以上、より好ましくは相当直径の５倍以上であることが好まれる。しかし、構造強度的な観点からは１００倍以下が好まれる。
本発明における容器１０１の材質は特に限定されないが、所望する加工精度，表面特性，光学特性，強度などに応じて選択される。具体的には、ポリエチレン，ポリプロピレン，ポリビニルアルコール，ポリ塩化ビニリデン，ポリエチレンテレフタレート，ポリ塩化ビニール，ポリスチレン，ＡＢＳ樹脂，ＡＳ樹脂，アクリル樹脂，ポリアミド，ポリアセタール，ポリブチレンテレフタレート，ガラス強化ポリエチレンテレフタレート，ポリカーボネート，変性ポリフェニレンエーテル，ポリフェニレンスルフィド，ポリエーテルエーテルケトン，液晶性ポリマー，フッ素樹脂，ポリアレート，ポリスルホン，ポリエーテルスルホン，ポリアミドイミド，ポリエーテルイミド，熱可塑性ポリイミド等の熱可塑性樹脂や、フェノール樹脂，メラミン樹脂，ユリア樹脂，エポキシ樹脂，不飽和ポリエステル樹脂，アルキド樹脂，シリコーン樹脂，ジアリルフタレート樹脂，ポリアミドビスマレイミド，ポリビスアミドトリアゾール等の熱硬化性樹脂、及びこれらを２種以上ブレンドした材料を用いることが可能である。また、この他に石英，ガラス類などの無機物も使用することが可能である。
本発明における突起物集合体１０２の材質は特に限定されないが、やはり所望する加工精度，表面特性，光学特性，強度などに応じて前述の樹脂組成物、若しくは石英，ガラス類など無機物からなる。突起物集合体１０２の強度が問題となる場合はこれらの突起物集合体１０２が容器１０１と同じ材料でできており、一体化されていることが好まれる。
図１の機能性表面構造１０３は観察用容器及び培養用容器１００に付与する機能に応じて異なる構造を形成する。例えば、反射防止構造，細胞などの付着防止構造，表面保護構造，細胞などの剥離促進構造などから選択することができる。機能性表面構造１０３は薄膜形状、若しくは微小凹凸形状からなる。
以下、薄膜形状の機能性表面構造１０３について記述する。反射防止構造として機能性表面構造１０３を用いる場合には、その屈折率や光透過率，厚みは、所定波長の光に対して反射率が小さくなるように適切に設計される。その厚みは突起物集合体１０２の高さ以下、及び突起物集合体１０２の相当直径の１／２以下であることが好ましい。細胞などの付着防止構造としては観察、及び培養対象によって個々に設計されるが、一般には突起物集合体１０２よりも親水性の高い物質、もしくは正に帯電しやすい物質が好まれる。表面保護構造としては突起物集合体１０２よりも強度の高い物質，細胞などの剥離促進構造としては送風や摩擦による帯電，観察用容器及び培養用容器１００に配する培養液の交換，光の照射，温度変化，圧力負荷による圧電効果などによって電位，疎水性などが変化する物質が好まれる。これらの構造に関してもその厚みは突起物集合体１０２の高さ以下、及び突起物集合体１０２の相当直径の１／２以下であることが好ましい。
以下、微小突起物形状の機能性表面構造１０３について記述する。微小突起物で生じる屈折率分布によって反射防止構造を付与する時には微小突起物の相当直径は観察に用いる光の波長以下である必要がある。このため、微小突起物の相当直径は可視光の波長である４００ｎｍ〜７００ｎｍよりも小さい必要がある。微小突起物の高さは微小突起物の相当直径より大きいことが好まれる。しかし、微小突起物の強度の保持、及び突起物集合体
１０２の機能のため、微小突起物の高さは微小突起物の直径の１００倍以下、若しくは突起物集合体１０２の高さ以下であることが望ましい。また、このような微小突起物が反射防止特性を十分に機能するには微小突起物が観察用容器及び培養用容器１００中の被観察領域の９５％以上を占めていることが望ましい。微小突起物による細胞などの付着防止構造としては観察、及び培養対象によって個々に設計されるが、一般には突起物集合体102より小さい相当直径を有する微小突起物が好まれる。微小突起物の高さは微小突起物の相当直径より大きいことが好まれる。しかし、微小突起物の強度の保持、及び突起物集合体１０２の機能のため、微小突起物の高さは微小突起物の直径の１００倍、若しくは突起物集合体１０２の高さ以下であることが望ましい。表面保護構造としても同様に突起物集合体１０２より小さい相当直径が好まれ、高さは微小突起物の直径の以下、若しくは突起物集合体１０２の高さ以下であることが望ましい。微小突起物形状の材質は用途に応じて突起物集合体１０２と同じ材質、若しくは前述の薄膜形状の機能性表面構造１０３において示した材質から選択することができる。
１０２の機能のため、微小突起物の高さは微小突起物の直径の１００倍以下、若しくは突起物集合体１０２の高さ以下であることが望ましい。また、このような微小突起物が反射防止特性を十分に機能するには微小突起物が観察用容器及び培養用容器１００中の被観察領域の９５％以上を占めていることが望ましい。微小突起物による細胞などの付着防止構造としては観察、及び培養対象によって個々に設計されるが、一般には突起物集合体102より小さい相当直径を有する微小突起物が好まれる。微小突起物の高さは微小突起物の相当直径より大きいことが好まれる。しかし、微小突起物の強度の保持、及び突起物集合体１０２の機能のため、微小突起物の高さは微小突起物の直径の１００倍、若しくは突起物集合体１０２の高さ以下であることが望ましい。表面保護構造としても同様に突起物集合体１０２より小さい相当直径が好まれ、高さは微小突起物の直径の以下、若しくは突起物集合体１０２の高さ以下であることが望ましい。微小突起物形状の材質は用途に応じて突起物集合体１０２と同じ材質、若しくは前述の薄膜形状の機能性表面構造１０３において示した材質から選択することができる。
機能性表面構造１０３は図２に示すように、観察及び培養対象の接する突起物集合体の先端部１０５のみ除去することができる。突起物集合体の先端部１０５にのみ周囲とは異なる性質を与え、例えば突起物集合体の先端部１０５に限定して観察、及び培養対象を吸着することができる。
本発明における観察用容器及び培養用容器１００を形成する手法の第一を図３に示す。容器１０１の上に配された突起物原料１０７を軟化し、凹凸１０８が形成された金型106を押し付けることによって、金型１０６の凹凸１０８の形状を突起物原料１０７に転写し、突起物集合体１０２を形成した観察用容器及び培養用容器１００を得ることができる。このプロセスにおいて、機能性表面構造１０３を図３に示すように突起物原料１０７の表面に形成して突起物原料１０７を成型すること、若しくは機能性表面構造１０３を金型
１０６表面に形成して成型時に突起物原料１０７側に転写することによって観察用容器及び培養用容器１００表面に機能性表面構造１０３を形成することができる。機能性表面構造１０３の形成には、スピンコート法，キャスト法，蒸着法，プラズマ重合法，インクジェット法，スクリーン印刷法のように新たに層を付加する手法の他に、加熱，光照射，電子線照射，プラズマ処理などによって、突起物集合体１０２、及び観察用容器及び培養用容器１００を表面改質する手法などを用いることもできる。本手法では機能性表面構造
１０３は突起物集合体１０２と同時に成型したが、突起物集合体１０２の強度が十分にある場合は成型後の突起物集合体１０２への被覆によっても同様の構造を得ることができる。
１０６表面に形成して成型時に突起物原料１０７側に転写することによって観察用容器及び培養用容器１００表面に機能性表面構造１０３を形成することができる。機能性表面構造１０３の形成には、スピンコート法，キャスト法，蒸着法，プラズマ重合法，インクジェット法，スクリーン印刷法のように新たに層を付加する手法の他に、加熱，光照射，電子線照射，プラズマ処理などによって、突起物集合体１０２、及び観察用容器及び培養用容器１００を表面改質する手法などを用いることもできる。本手法では機能性表面構造
１０３は突起物集合体１０２と同時に成型したが、突起物集合体１０２の強度が十分にある場合は成型後の突起物集合体１０２への被覆によっても同様の構造を得ることができる。
本発明における観察用容器及び培養用容器１００を形成する手法の第二を図４に示す。容器１０１の上に配された突起物原料１０７を軟化し、凹凸１０８が形成された金型106を押し付けることによって、金型１０６の凹凸１０８の形状を突起物原料１０７に転写し、突起物集合体１０２を形成した観察用容器及び培養用容器１００を得ることができる。このプロセスにおいて、金型１０６表面に形成された微小凹凸１０９の形状を突起物原料１０７に転写することによって微小突起群１１０からなる機能性表面構造１０３を形成することができる。このときの機能性表面構造１０３、つまり微小突起群１１０は突起物集合体１０２と同じ材質からなる。微小突起群１１０の材質が突起物集合体１０２と異なる場合は、前述の第一の手法で用いる金型１０６表面に微小凹凸１０９を形成すれば良い。
金型１０６上の凹凸１０８は観察用容器及び培養用容器１００上の突起物集合体１０２に対応する大きさが求められる。また、前述の第二の手法を用いる場合には与える機能に応じて微小突起群１１０の形状を先に示した形状にするため、微小凹凸１０９はその形状に応じて決められる。このような微小な形状を表面に形成するため、金型１０６は金属，カーボンやシリコンなどの無機物、及び樹脂組成物の少なくとも１つを含み、その表面形状は光リソグラフィ法，電子線直接描画法，粒子線ビーム加工法，走査プローブ加工法などの微細加工法や微粒子の自己組織化、又はこれらの手法によって形成されたマスタからナノインプリント法，射出成型法，無電解めっき法などで形状転写することによって形成される。また、図３，図４では突起物集合体１０２，微小突起群１１０を形成する手法として軟化した突起物原料１０７に金型１０６を押し付けるいわゆるナノインプリント法を用いたが、これ以外の射出成型法を代表とする樹脂の成型法や、金型１０６を用いずレーザ加工法などで直接加工することも可能であるのは明らかである。
本発明における突起物集合体の先端部１０５のみ表面処理を除去したい場合には、図５の手法を用いる。突起物集合体１０２を形成し、機能性表面構造１０３が施された観察用容器及び培養用容器１００の突起物集合体１０２を形成した側を所定の精度を有するバフ１１１によって研磨することによって突起物集合体の先端部１０５に付着した機能性表面構造１０３を除去する。この除去手段には図５に示したバフ研磨の他、機能性表面構造
１０３の種類に応じて、化学機械研磨（ＣＭＰ），異方性ドライエッチング，光照射，電子線照射、若しくは弾性を有するシリコーンゴム，樹脂フィルム，金属薄膜などの弾性体を用いた突起物集合体の先端部１０５のみへの処理液の塗付、若しくは加熱などの手法を用いることができる。ここで、機能性表面構造１０３の除去を観察用容器及び培養用容器１００の一部に対してのみ行うことによって、機能性表面構造１０３が部分的に残存した構造を作ることもできる。
１０３の種類に応じて、化学機械研磨（ＣＭＰ），異方性ドライエッチング，光照射，電子線照射、若しくは弾性を有するシリコーンゴム，樹脂フィルム，金属薄膜などの弾性体を用いた突起物集合体の先端部１０５のみへの処理液の塗付、若しくは加熱などの手法を用いることができる。ここで、機能性表面構造１０３の除去を観察用容器及び培養用容器１００の一部に対してのみ行うことによって、機能性表面構造１０３が部分的に残存した構造を作ることもできる。
図６に本発明における観察用容器及び培養用容器１００の使用法の一例を示す。観察用容器及び培養用容器１００内部を液体１１２で満たし、突起物集合体１０２の上に細胞などの観察及び培養対象１１３を配置する。本発明の観察用容器及び培養用容器１００では、観察及び培養対象１１３と観察用容器及び培養用容器１００との接触が点接触となるため、長時間保持した観察及び培養対象１１３を観察用容器及び培養用容器１００から剥離する時に生じる損傷を防ぐことができる。また、突起物集合体１０２の形状や機能性表面構造１０３の材質及び形状を、観察及び培養対象１１３によって変化させることによって、観察及び培養対象１１３を剥離する時に生じる損傷をさらに低減できる。また、機能性表面構造１０３を反射防止構造，細胞などの付着防止構造，表面保護構造，細胞などの剥離促進構造等とすることによってそれぞれ、観察時の像コントラストの改善，予期しない位置への観察及び培養対象１１３の付着の防止，突起物集合体１０２の保護，観察及び培養対象１１３の剥離促進などの効果を付与することができる。
以下、実施例によって本発明をさらに詳述する。
以下、本発明の一実施例を説明する。図１（ａ）は本実施例で作製した観察用容器及び培養用容器１００表面に形成した突起物集合体１０２の走査型電子顕微鏡写真の模式図である。突起物集合体１０２は複数の柱状突起物から成る。柱状突起物の材質はポリスチレンで分子量は３０００から４００万である。
図７は突起物集合体１０２を拡大した走査型電子顕微鏡写真の模式図である。突起物集合体１０２の高さは３μｍ、一辺の長さは根元で３００ｎｍである。突起物集合体１０２は上部約１μｍの部分は平滑な表面状態であり、根元から約２μｍの部分の表面は縞模様である。突起物集合体１０２表面は機能性表面構造１０３によって被覆されている。
また、突起物集合体１０２は底面の一辺が３００ｎｍで高さが３μｍなので高さと一辺の比は１０となり、１より大きいことが分かる。
また、突起物集合体１０２は先端部が底面部より小さくなっており、末広がり状であることが分かる。本実施例では、柱状突起物の形状は根元から先端にかけて細くなっていく形状であるが、例えば、根元から先端にかけて細くなり先端部に太い部分を有するきのこのような形状でもよい。本発明の柱状突起物は、根元から先端部にかけて細くなる部分を有することを特徴の一つとしている。
また、突起物集合体１０２は下地に接続されており、一体化していることが分かる。
また、突起物集合体１０２の先端部が突起物の底面部より小さく末広がり状であるため、突起物が基板から取れにくい効果を得られる。また、突起物集合体１０２が下地を含む構造であるため突起物集合体１０２が容器１０１から取れにくい効果を得られる。
なお、本実施例では、突起物集合体１０２の材料はポリスチレンを用いたが、容器101の材質として先に例示した材料を突起物集合体１０２の材料として用いてもよい。
上述の観察用容器及び培養用容器１００は以下に述べる方法で作製した。図３は観察用容器及び培養用容器１００の製造工程である。機能性表面構造１０３，突起物原料１０７を表面に形成した低蛍光ガラス製の容器１０１を１００℃に加熱し、表面に凹凸１０８を形成した金型１０６をプレス圧力４ＭＰａでプレスした。金型１０６は結晶方位(１００)、直径２５mmのシリコンウエハである。金型１０６を垂直に引き上げ機能性表面構造103に被覆された突起物集合体１０２を形成した。突起物集合体１０２のアスペクト比は凹凸１０８のアスペクト比の約３倍である。すなわち、アスペクト比の大きい凹凸１０８を金型１０６に形成することは一般に困難であるが本実施例の手法を用いれば高いアスペクト比の突起物集合体１０２を形成できる効果を得られる。
なお、本実施例では、低蛍光ガラスを容器１０１に用いたが、容器１０１は低蛍光ガラスに限らず例えばポリカーボネートなどの有機物，石英などの無機物、あるいはこれらの積層構造体でもよい。観察を良好にするには容器１０１は透明であることが好ましい。また、本実施例では突起物集合体１０２の材料に容器１０１と異なるポリスチレンを用いているが、例えば容器１０１を突起物集合体１０２と同じ材質とし、容器１０１表面に直接、突起物集合体１０２を形成することで容器１０１から突起物集合体１０２を取れにくくする効果を与えると同時に、突起物集合体１０２と容器１０１界面での光の反射を防ぐことができ、観察時の像のコントラストを改善する効果がある。
また、本実施例では、金型１０６に結晶方位（１００）、直径２５mmのシリコンウエハを用いたが、特に結晶方位が（１００）であったり、材質が単結晶シリコンである必要はなく、ニッケルなどの金属薄膜やＰＤＭＳなどの有機物でもよい。また、突起物集合体
１０２の形成後に金型１０６を離型する際の容器１０１や突起物集合体１０２，機能性表面構造１０３への損傷を防ぐため金型１０６にはフッ素系、若しくはシリコーン系などの離型剤によってコートされていることが望ましい。
１０２の形成後に金型１０６を離型する際の容器１０１や突起物集合体１０２，機能性表面構造１０３への損傷を防ぐため金型１０６にはフッ素系、若しくはシリコーン系などの離型剤によってコートされていることが望ましい。
また、金型１０６の凹凸１０８の相当直径や深さ、突起物原料１０７の材質を調整することで突起物集合体１０２の相当直径や高さを制御できる。さらに、金型１０６の凹凸
１０８の位置を制御することで突起物集合体１０２を形成する位置を制御できる。
１０８の位置を制御することで突起物集合体１０２を形成する位置を制御できる。
また、突起物集合体１０２の材料を熱可塑性にすることで、突起物集合体１０２の形成時の温度を調整することで突起物集合体１０２の形状を容易に制御できる効果を得られることは明らかである。
また、突起物集合体１０２の材料を光硬化性にすることで、突起物集合体１０２の形成時に光を入射させることで突起物集合体１０２の形状を容易に制御できる効果を得られることは明らかである。
本実施例では機能性表面構造１０３として突起物原料１０７と同時に成型可能な機能性薄膜を用いることができる。このときの機能性薄膜には付与する機能、及び突起物原料
１０７によって、ポリエチレン，ポリプロピレン，ポリビニルアルコール，ポリ塩化ビニリデン，ポリエチレンテレフタレート，ポリ塩化ビニール，ポリスチレン，ＡＢＳ樹脂，ＡＳ樹脂，アクリル樹脂，ポリアミド，ポリアセタール，ポリブチレンテレフタレート，ガラス強化ポリエチレンテレフタレート，ポリカーボネート，変性ポリフェニレンエーテル，ポリフェニレンスルフィド，ポリエーテルエーテルケトン，液晶性ポリマー，フッ素樹脂，ポリアレート，ポリスルホン，ポリエーテルスルホン，ポリアミドイミド，ポリエーテルイミド，熱可塑性ポリイミド等の熱可塑性樹脂や、フェノール樹脂，メラミン樹脂，ユリア樹脂，エポキシ樹脂，不飽和ポリエステル樹脂，アルキド樹脂，シリコーン樹脂，ジアリルフタレート樹脂，ポリアミドビスマレイミド，ポリビスアミドトリアゾール等の熱硬化性樹脂，水ガラスなどの無機物などから１種類以上を選択できる。このときに付与する機能に応じて機能性表面構造１０３の材質や構造は異なる。反射防止構造として機能性表面構造１０３を用いる場合には、屈折率，光透過率と厚みを突起物集合体１０２、及び観察及び培養対象に応じて設計できる。細胞などの付着防止構造としては観察、及び培養対象によって個々に設計されるが、一般には突起物集合体１０２よりも親水性の高い物質、もしくは正に帯電しやすい物質が好まれる。表面保護構造としては突起物集合体の原料よりも強度の高い物質が好まれる。細胞などの剥離促進構造としては送風や摩擦による帯電，観察用容器及び培養用容器１００に配する液体の交換，光の照射，外部からの電圧の印加，温度変化，圧力負荷による圧電効果などによって電位，疎水性などが変化する物質からなることが好まれる。また、機能性表面構造１０３は必ずしも一様な構造である必要は無く、分布を持つ構造や、実施例２に示すような微小突起群１１０を有する形状であっても良い。また、機能性表面構造１０３は必ずしも観察及び培養対象を配する側に限定して処理されるものではなく、他の面にも形成することによって、例えば反射防止効果によって観察時の像のコントラストをさらに改善することもできる。
１０７によって、ポリエチレン，ポリプロピレン，ポリビニルアルコール，ポリ塩化ビニリデン，ポリエチレンテレフタレート，ポリ塩化ビニール，ポリスチレン，ＡＢＳ樹脂，ＡＳ樹脂，アクリル樹脂，ポリアミド，ポリアセタール，ポリブチレンテレフタレート，ガラス強化ポリエチレンテレフタレート，ポリカーボネート，変性ポリフェニレンエーテル，ポリフェニレンスルフィド，ポリエーテルエーテルケトン，液晶性ポリマー，フッ素樹脂，ポリアレート，ポリスルホン，ポリエーテルスルホン，ポリアミドイミド，ポリエーテルイミド，熱可塑性ポリイミド等の熱可塑性樹脂や、フェノール樹脂，メラミン樹脂，ユリア樹脂，エポキシ樹脂，不飽和ポリエステル樹脂，アルキド樹脂，シリコーン樹脂，ジアリルフタレート樹脂，ポリアミドビスマレイミド，ポリビスアミドトリアゾール等の熱硬化性樹脂，水ガラスなどの無機物などから１種類以上を選択できる。このときに付与する機能に応じて機能性表面構造１０３の材質や構造は異なる。反射防止構造として機能性表面構造１０３を用いる場合には、屈折率，光透過率と厚みを突起物集合体１０２、及び観察及び培養対象に応じて設計できる。細胞などの付着防止構造としては観察、及び培養対象によって個々に設計されるが、一般には突起物集合体１０２よりも親水性の高い物質、もしくは正に帯電しやすい物質が好まれる。表面保護構造としては突起物集合体の原料よりも強度の高い物質が好まれる。細胞などの剥離促進構造としては送風や摩擦による帯電，観察用容器及び培養用容器１００に配する液体の交換，光の照射，外部からの電圧の印加，温度変化，圧力負荷による圧電効果などによって電位，疎水性などが変化する物質からなることが好まれる。また、機能性表面構造１０３は必ずしも一様な構造である必要は無く、分布を持つ構造や、実施例２に示すような微小突起群１１０を有する形状であっても良い。また、機能性表面構造１０３は必ずしも観察及び培養対象を配する側に限定して処理されるものではなく、他の面にも形成することによって、例えば反射防止効果によって観察時の像のコントラストをさらに改善することもできる。
以下、本発明の別の一実施例を説明する。本実施例では機能性表面構造１０３として微小突起群１１０を用いる場合について示す。なお、突起物集合体１０２の材質や形状については実施例１と同一となる。
図８は本実施例で形成した突起物集合体１０２を拡大した走査型電子顕微鏡写真の模式図である。突起物集合体１０２の高さは３μｍ、一辺の長さは根元で３００ｎｍである。突起物集合体１０２は上部約１μｍの部分は平滑な表面状態であり、根元から約２μｍの部分の表面は縞模様である。微小突起群１１０は突起物集合体１０２と同じ材質からなる。微小突起群１１０は突起物集合体１０２の間を敷き詰めるように形成されている。その形状は正四角錐状であり、高さは２００ｎｍ、一辺の長さは２００ｎｍ、各四角錐の頂点間の間隔は２００ｎｍである。
上述の観察用容器及び培養用容器１００は以下に述べる方法で作製した。図４は観察用容器及び培養用容器１００の製造工程である。機能性表面構造１０３，突起物原料１０７を表面に形成した低蛍光ガラス製の容器１０１を１００℃に加熱し、表面に凹凸１０８、及び微小凹凸１０９を形成した金型１０６をプレス圧力４ＭＰａでプレスした。金型106は結晶方位（１００）、直径２５mmのシリコンウエハである。金型１０６を垂直に引き上げ突起物集合体１０２を形成した。突起物集合体１０２のアスペクト比は凹凸１０８のアスペクト比の約３倍である。すなわち、アスペクト比の大きい凹凸１０８を金型１０６に形成することは一般に困難であるが本実施例の手法を用いれば高いアスペクト比の突起物集合体１０２を形成できる効果を得られる。これに対し、本実施例の手法では微小突起群１１０の形状は微小凹凸１０９と同一とできる。
なお、本実施例では、低蛍光ガラスを容器１０１に用いたが、容器１０１は低蛍光ガラスに限らず例えばポリカーボネートなどの有機物，石英などの無機物、あるいはこれらの積層構造体でもよい。観察を良好にするには容器１０１は透明であることが好ましい。また、本実施例では突起物集合体１０２の材料に容器１０１と異なるポリスチレンを用いているが、例えば容器１０１を突起物集合体１０２と同じ材質とし、容器１０１表面に直接、突起物集合体１０２を形成することで容器１０１から突起物集合体１０２を取れにくくする効果を与えると同時に、突起物集合体１０２と容器１０１界面での光の反射を防ぐことができ、観察時の像のコントラストを改善する効果がある。
また、本実施例では、金型１０６に結晶方位（１００）、直径２５mmのシリコンウエハを用いたが、特に結晶方位が（１００）であったり、材質が単結晶シリコンである必要はなく、ニッケルなどの金属薄膜やＰＤＭＳなどの有機物でもよい。また、突起物集合体
１０２の形成後に金型１０６を離型する際の容器１０１や突起物集合体１０２，機能性表面構造１０３への損傷を防ぐため金型１０６にはフッ素系、若しくはシリコーン系などの離型剤によってコートされていることが望ましい。
１０２の形成後に金型１０６を離型する際の容器１０１や突起物集合体１０２，機能性表面構造１０３への損傷を防ぐため金型１０６にはフッ素系、若しくはシリコーン系などの離型剤によってコートされていることが望ましい。
また、金型１０６の凹凸１０８の相当直径や深さ、突起物原料１０７の材質を調整することで突起物集合体１０２の相当直径や高さを制御できる。さらに、金型１０６の凹凸
１０８の位置を制御することで突起物集合体１０２を形成する位置を制御できる。同様に微小突起群１１０の形状，位置も制御可能である。
１０８の位置を制御することで突起物集合体１０２を形成する位置を制御できる。同様に微小突起群１１０の形状，位置も制御可能である。
また、突起物集合体１０２の材料を熱可塑性にすることで、突起物集合体１０２の形成時の温度を調整することで突起物集合体１０２の形状を容易に制御できる効果を得られることは明らかである。
また、突起物集合体１０２の材料を光硬化性にすることで、突起物集合体１０２の形成時に光を入射させることで突起物集合体１０２の形状を容易に制御できる効果を得られることは明らかである。
本実施例では機能性表面構造１０３として突起物原料１０７によって形成した微小突起群１１０を用いている。このときに付与する機能に応じて、微小突起群１１０の形状は適宜設計される。
反射防止構造として微小突起群１１０を用いる場合には、図９に示す微小突起群１１０の形状によって生じる見かけの屈折率分布を利用する。光の反射は屈折率の非連続点で起こるが、光の波長よりも短い周期で形成された微小突起群１１０によって屈折率は連続して変化すると見なすことができる。この見かけの屈折率分布によって界面での反射率を低減でき、観察時の像コントラストを改善することができる。この効果を微小突起群１１０に持たせるには、金型１０６上の微小凹凸１０９の相当直径が可視光の波長である４００ｎｍ〜７００ｎｍよりも小さい必要がある。微小凹凸１０９の高さは微小凹凸１０９の相当直径より大きいことが好まれる。しかし、微小凹凸１０９の強度の保持、及び突起物集合体１０２の機能のため、微小凹凸１０９の高さは微小凹凸の直径の１００倍以下、若しくは突起物集合体１０２の高さ以下であることが望ましい。また、微小凹凸１０９は容器１０１側から他端に向かって連続して断面積が減少する形状が好ましい。また、このような微小凹凸が反射防止特性を十分に機能するには微小凹凸が観察用容器及び培養用容器
１００中の被観察領域の９５％以上を占めていることが望ましい。細胞などの付着防止構造として微小突起群１１０を用いる場合は観察及び培養対象によって個々に設計されるが、一般には観察及び培養対象に対する接触部位の少ない形状が好まれる。このような形状の例としては突起物集合体１０２よりも突起物間の間隔が狭く、先端部の面積、若しくは曲率半径が小さい構造が挙げられる。
１００中の被観察領域の９５％以上を占めていることが望ましい。細胞などの付着防止構造として微小突起群１１０を用いる場合は観察及び培養対象によって個々に設計されるが、一般には観察及び培養対象に対する接触部位の少ない形状が好まれる。このような形状の例としては突起物集合体１０２よりも突起物間の間隔が狭く、先端部の面積、若しくは曲率半径が小さい構造が挙げられる。
また、微小突起群１１０は必ずしも一様な構造である必要は無く、分布を持つ構造でも良い。また、微小突起群１１０は必ずしも観察及び培養対象を配する側に限定して形成されるものではなく、他の面にも形成することによって、例えば反射防止効果によって観察時の像のコントラストをさらに改善することもできる。また、金型１０６の形状を変えることによって、突起物集合体１０２表面にも微小突起群１１０を形成することができる。
以下、本発明の別の一実施例を説明する。本実施例では実施例１，２において形成した観察用容器及び培養用容器１００について、突起物集合体の先端部１０５のみ機能性表面構造１０３を除去した例を示す。
図２は本実施例で作成した観察用容器及び培養用容器１００である。容器１０１、及び突起物集合体１０２はポリスチレンから、機能性表面構造１０３は同じくポリスチレンからなる微小突起群１１０からなり、反射防止効果を有する。突起物集合体の先端部１０５のみ機能性表面構造１０３は除去されている。
図５は本実施例で用いた機能性表面構造１０３の除去法である。実施例１、若しくは実施例２に示す手法で形成した観察用容器及び培養用容器１００表面を高精度なバフ１１１（ウレタン製，シリコンウエハ仕上げ研磨加工用）で１分間磨くことによって機能性表面構造１０３のうち、突起物集合体の先端部１０５のみ除去した。
本実施例ではバフ研磨によって機能性表面構造１０３を部分的に除去したが、この除去法は機能性表面構造１０３が機械的に強い場合や、突起物集合体１０２が機械的に弱い構造である時には適用できない。そのような場合は機能性表面構造１０３の種類に応じて、化学機械研磨（ＣＭＰ），異方性ドライエッチング，光照射，電子線照射，弾性を有するシリコーンゴム，樹脂フィルム，金属薄膜などの弾性体を用いた突起物集合体の先端部
１０５のみへの処理液の塗付または加熱などの手法を用いることができる。ここで、表面処理の除去を観察用容器及び培養用容器１００の一部に対してのみ行うことによって、機能性表面構造１０３が部分的に残存した構造を作ることもできる。
１０５のみへの処理液の塗付または加熱などの手法を用いることができる。ここで、表面処理の除去を観察用容器及び培養用容器１００の一部に対してのみ行うことによって、機能性表面構造１０３が部分的に残存した構造を作ることもできる。
以下、本発明を細胞培養に適用した例を説明する。図１０は本実施例で作製した観察用容器及び培養用容器１００を示している。観察用容器及び培養用容器１００は、厚さ２mmのポリスチレンを主成分とした直径３５mmのシャーレ状の形状を有している。観察用容器及び培養用容器１００の底面には、実施例２で示した手法を用いて、ポリスチレン製容器１０１の底面の直径３０mmの領域に直接、底面の一辺が３００ｎｍで高さが３μｍである突起物集合体１０２、及び正四角錐状であり、高さ２００ｎｍ，一辺の長さ２００ｎｍ，各角錐の頂点間の間隔２００ｎｍの微小突起群１１０からなる機能性表面構造１０３を形成している。突起物集合体１０２の先端部は実施例３に示した手法によって、機能性表面構造１０３が除去されている。
本実施例では、ポリスチレンを観察用容器及び培養用容器１００の材質として用いたが、ポリスチレンに限らず、施される表面処理との親和性があれば例えばポリカーボネートなどの有機物、ガラスなどの無機物、あるいはこれらの積層構造体でもよい。また、観察用容器及び培養用容器１００の大きさを直径３５mm、突起物集合体１０２の形成領域を直径３０mmとしたが、これは培養する細胞の大きさに応じて変えられる。また、突起物集合体１０２は隙間１０４を設けて配置することが好ましく、本実施例では図１０に示したよう十字形状に隙間１０４を設けている。このように隙間１０４を形成することで培養液が流れやすくなり細胞に対して効率良く栄養素を供給することができる。また、細胞培養時の細胞の老廃物を効率良く排出することができる。
また、本実施例では突起物集合体１０２の形成後にコラーゲンによる修飾を行ったが、この手法に限られず、培養を行う細胞の種類、及び観察用容器及び培養用容器１００，突起物集合体１０２，機能性表面構造１０３の材質，形状に応じて酸素プラズマ処理（例えば１００Ｗ，３０ｓ）、紫外線照射，過酸化水素水，オゾン水への浸漬などによる親水化処理など、適宜異なる表面処理を施すこともできる。また、この表面処理を突起物集合体１０２の一部にのみ施すことによって培養する細胞の形状を制御することができる。
以下、本実施例の観察用容器及び培養用容器１００を用いて細胞を培養した例を示す。観察用容器及び培養用容器１００に培養液を浸した状態で入れ、観察用容器及び培養用容器１００にて、常法によって正常ヒト表皮角化細胞を培養した（使用培地：HuMedia−KB2
（クラボウ(株)製）,３７℃，５％ＣＯ2下）。その結果、細胞培養シート上において表皮角化細胞は正常に付着し、シート形状に増殖した。増殖している様子の観察には共焦点レーザ顕微鏡を用いたが、その際に機能性表面構造１０３による反射防止効果のために像のコントラストを増すことができた。
（クラボウ(株)製）,３７℃，５％ＣＯ2下）。その結果、細胞培養シート上において表皮角化細胞は正常に付着し、シート形状に増殖した。増殖している様子の観察には共焦点レーザ顕微鏡を用いたが、その際に機能性表面構造１０３による反射防止効果のために像のコントラストを増すことができた。
培養開始の１４日後、培養した細胞の上に直径２０mmのポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）膜をかぶせて、培地を吸引することによって、ナノピラーシート上に成長したシート状の表皮角化細胞を、ＰＶＤＦ膜と共に細胞培養シートから剥離した。このシート状の表皮角化細胞はかぶせたＰＶＤＦ膜から容易に剥がすことができた。細胞培養シートからの剥離によるこのシート状の表皮角化細胞への損傷は通常のガラスシャーレなどを使用した場合に比べて大幅に軽減することができた。
以下、本発明を細胞培養に適用した別の例を説明する。図１１は本実施例で作製した観察用容器及び培養用容器１００を示している。観察用容器及び培養用容器１００は、厚さ２mmのポリスチレンを主成分とした直径３５mmのシャーレ状の形状を有している。観察用容器及び培養用容器１００の底面には、実施例１で示した手法を用いて直径３０mmの領域からなる、容器１０１と同じポリスチレンからなる突起物集合体１０２、及び導電性プラスチック薄膜からなる機能性表面構造１０３を形成している。機能性表面構造１０３は電気的接続１１４によって電源１１５と接続され、同じく接続されている観察用容器及び培養用容器１００の側面下部に対する電位を変えられるようになっている。このため、機能性表面構造１０３は、細胞培養時には観察用容器及び培養用容器１００側面下部に接触する培地に対する電位を変化させることができる。細胞培養時と細胞剥離時に培地に対する機能性表面構造１０３の電位を調整することで、細胞剥離時には細胞を自発的に剥離させ、損傷が少ない培養細胞を得ることができる。
本実施例では、ポリスチレンを観察用容器及び培養用容器１００に用いたが、ポリスチレンに限らず、施される表面処理との親和性があれば例えばポリカーボネートなどの有機物、ガラスなどの無機物、あるいはこれらの積層構造体でもよい。また、観察用容器及び培養用容器１００の大きさを直径３５mm、突起物集合体１０２の形成領域を直径３０mmとしたが、これは培養する細胞の大きさに応じて変えられる。また、突起物集合体１０２は隙間１０４を設けて配置することが好ましく、本実施例では図１１に示したよう十字形状に隙間１０４を設けている。このように隙間１０４を形成することで培養液が流れやすくなり細胞に対して効率良く栄養素を供給することができる。また、細胞培養時の細胞の老廃物を効率良く排出することができる。
また、本実施例では突起物集合体１０２の形成後にコラーゲンによる修飾を行ったが、この手法に限られず、培養を行う細胞の種類、及び観察用容器及び培養用容器１００、及び突起物集合体１０２，機能性表面構造１０３の材質，形状に応じて酸素プラズマ処理
（例えば１００Ｗ，３０ｓ）、紫外線照射，過酸化水素水，オゾン水への浸漬などによる親水化処理など、適宜異なる表面処理を施すこともできる。また、この表面処理を突起物集合体１０２の一部にのみ施すことによって培養する細胞の形状を制御することができる。
（例えば１００Ｗ，３０ｓ）、紫外線照射，過酸化水素水，オゾン水への浸漬などによる親水化処理など、適宜異なる表面処理を施すこともできる。また、この表面処理を突起物集合体１０２の一部にのみ施すことによって培養する細胞の形状を制御することができる。
本実施例では細胞剥離性を改善する為に機能性表面構造１０３を導電性プラスチックとして電位を制御したが、電位の制御法は図１１のように電源を接続すること以外に、送風や摩擦による帯電が適用できる。また、機能性表面構造１０３の材質によっては観察用容器及び培養用容器１００に配する培養液の交換，光の照射，温度変化，圧力負荷による圧電効果による電位の変化も使用できる。また、本実施例においては機能性表面構造１０３と突起物集合体１０２は同一材料であっても良い。また、突起物集合体１０２の一部のみ異なる電位とすることで細胞を部分的に剥離することができる。
以下、本実施例の観察用容器及び培養用容器１００を用いて細胞を培養した例を示す。観察用容器及び培養用容器１００に培養液を浸した状態で入れ、観察用容器及び培養用容器１００にて、常法によって正常ヒト表皮角化細胞を培養した(使用培地：HuMedia−ＫＢ２.３７℃，５％ＣＯ2下) 。この時、電源１１５によって機能性表面構造１０３の培養液に対する電位を負とした。その結果、細胞培養シート上において表皮角化細胞は正常に付着し、シート形状に増殖した。
培養開始の１３日後、電源１１５によって機能性表面構造１０３の電位を正に変えて１日後に、培養した細胞の上に直径２０mmのＰＶＤＦ膜をかぶせて、培養液を吸引することによって、ナノピラーシート上に成長したシート状の表皮角化細胞を、ＰＶＤＦ膜と共に細胞培養シートから剥離した。このシート状の表皮角化細胞はかぶせたＰＶＤＦ膜から容易に剥がすことができた。細胞培養シートからの剥離によるこのシート状の表皮角化細胞への損傷は通常のガラスシャーレなどを使用した場合に比べて大幅に軽減することができた。
以下、本実施例は、本発明を抗体などの分子プローブを用いた特定分子，細胞の選択吸着及び観察に用いる例を示す。なお、本実施例に示す分子プローブは抗体以外の蛋白質，核酸，糖鎖などを使用することもできる。また、分子プローブを用いずに、突起物先端に吸着した蛋白質，核酸，糖鎖，細胞などを直接観察する用途に用いても良い。
図１２は観察用容器及び培養用容器１００上に固定した分子プローブ１１６を示している。観察用容器及び培養用容器１００は実施例１、及び３に示した手法で形成され、突起物集合体の先端部１０５を除いて分子プローブ１１６の吸着し難いＭＰＣ（２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）ポリマーからなる機能性表面構造１０３で覆われている。このような構造を用いれば分子プローブ１１６が突起物集合体の先端部１０５にのみ吸着した観察用容器及び培養用容器１００を形成することができる。分子プローブ
１１６の種類に応じて、特定の生体分子や、特定の蛋白を有する細胞からなる捕捉対象
１１７を突起物集合体の先端部１０５に捕捉できる観察用容器及び培養用容器１００を形成できる。
１１６の種類に応じて、特定の生体分子や、特定の蛋白を有する細胞からなる捕捉対象
１１７を突起物集合体の先端部１０５に捕捉できる観察用容器及び培養用容器１００を形成できる。
本実施例において、機能性表面構造１０３は分子プローブ１１６の吸着防止に用いる他に、形状，材質の変更によって、反射防止構造として用いることもできる。この時には前述の分子プローブ１１６に吸着した捕捉対象１１７を観察する時の像コントラストの改善を図ることができる。
１００…観察用容器及び培養用容器、１０１…容器、１０２…突起物集合体、１０３…機能性表面構造、１０４…隙間、１０５…突起物集合体の先端部、１０６…金型、１０７…突起物原料、１０８…凹凸、１０９…微小凹凸、１１０…微小突起群、１１１…バフ、１１２…液体、１１３…観察及び培養対象、１１４…電気的接続、１１５…電源、１１６…分子プローブ、１１７…捕捉対象。
Claims (4)
- 観察用容器及び培養用容器において、該容器の底面に相当直径が１０ｎｍ以上１０μｍ以下であり、高さが１０ｎｍ以上１mm以下である突起物集合体と、該突起物集合体の間を敷き詰めるように該容器の底面に形成された機能性表面構造を有し、
該機能性表面構造が該突起物集合体の材質と同一であり、該突起物集合体よりも高さの低い、相当直径が１ｎｍ以上，４００ｎｍ以下である突起で構築される微小突起群からなることを特徴とする培養用容器。 - 請求項１に記載の観察用容器及び培養用容器において、液体を配する部位と該容器の底面に形成された突起物集合体とを有することを特徴とする培養用容器。
- 請求項１に記載の観察用容器及び培養用容器における機能性表面構造が該突起物集合体の材質と同一であり、該突起物集合体よりも高さの低い、相当直径が１ｎｍ以上，４００ｎｍ以下である微小突起群からなり、機能性表面構造を配する領域の表面積の９５％以上を該微小突起群が占めることを特徴とする培養用容器。
- 請求項１に記載の培養用容器において、該容器に配する液体に対する該突起物集合体の電位を調整できることを特徴とする培養用容器。
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