CN111065727A - 细胞培养容器 - Google Patents

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Abstract

提供一种细胞培养容器。本发明一个实施例的细胞培养容器具备在内部容纳细胞培养支撑体的作为内部空间的容纳部，其中，所述细胞培养容器包括用于使所述细胞培养支撑体固定于所述容纳部的下部面所需的固定构件，所述固定构件包括：第一粘合层，所述第一粘合层附着于所述容纳部的下部面；第二粘合层，所述第二粘合层与所述细胞培养支撑体的下部面附着；及支撑膜，所述支撑膜介于所述第一粘合层及第二粘合层之间，执行支撑功能；所述第二粘合层与细胞培养支撑体之间的粘合力体现得大于所述第一粘合层与容纳部的下部面之间的粘合力。据此可以防止在细胞培养过程中，因支撑体晃动导致培养溶液不均一的分散及因培养的细胞移动而导致的偏斜等，向各细胞赋予相同的机械、物理、化学刺激，从而可以有助于细胞的均一增殖。另外，可以将细胞培养支撑体从细胞培养容器容易地分离，可以防止因生化机制导致的细胞变质或脱离等，可以防止培养的细胞因超出需要的刺激导致的损伤。而且，就形成群落进行增殖的聚落细胞而言，可以防止因在回收细胞培养支撑体的过程中按各群落体施加的物理、化学刺激的差异而导致群落体形状的均一性低下。

Description

细胞培养容器
技术领域
本发明涉及细胞培养容器，更详细而言，涉及一种在对培养的各个细胞提供均一微环境的同时，可以不对培养的细胞造成损伤地容易地回收的细胞培养容器。
背景技术
最近，随着培养细胞在疾病治疗中使用的扩大，对细胞培养的关注及研究正在增加。细胞培养是从生物体采集细胞后在生物体外培养的技术，使培养的细胞分化成皮肤、脏器、神经等身体的多样组织并移植到人体，或以分化前状态移植到人体，同时实现存活及分化，可以应用于多样的疾病治疗。
这种细胞培养衔接的领域是组织工程学(tissue engineering)，作为融合了细胞学、生命科学、工程学、医学等原有科学领域的多学科交叉学问，是旨在理解生物体组织的结构与功能之间的相关关系，研究利用正常组织替代损伤的组织或脏器或使之再生的新型融合技术。
另一方面，在再生医疗领域正在进行一项研究，制作细胞培养支撑体和细胞培养容器，以便能够在体外培养从患者采集的细胞，将在细胞培养支撑体中培养的细胞重新移植到生物体内，从而提高医疗效果。
但是，迄今开发的细胞培养支撑体和细胞培养容器，由于细胞培养支撑体坚固地附着于细胞培养容器，因而在不对细胞培养支撑体的细胞-细胞间结合造成损伤的情况下，将细胞培养支撑体从细胞培养容器剥离并不容易。另外，为了解决这种问题而使细胞培养支撑体松散地固定于细胞培养容器时，由于无法对培养的细胞提供均一环境，存在因各细胞的物理、化学刺激的差异而导致均一性低下的问题。
另外，一般而言，细胞对生物化学的其他外在影响非常敏感，因而为了将细胞培养支撑体从细胞培养容器剥离而施加化学机制，这并不适合作为用于获得均一地培养的细胞所需的方法。
进而，就构成群落的聚落细胞而言，即使在细胞群落体增殖的情况下，不仅是使细胞增殖的细胞培养支撑体的形状，而且根据从细胞培养支撑体剥离的物理、化学方法，细胞群落体的形状也会各异。在细胞群落体的形状不统一的情况下，每个培养的细胞群落体会出现不同反应，在这种情况下，无法导出可再现结果，因而存在极不适合将增殖的细胞群落体用作检查、实验用途的问题。
因此迫切需要开发一种技术，能够在不对在细胞培养支撑体中培养的细胞造成损伤的情况下使细胞培养支撑体从细胞培养容器容易地分离，并且在培养细胞的过程中，对各细胞提供相同的微环境。
发明内容
解决的技术问题
本发明目的在于提供一种能够防止支撑体晃动，向培养的各细胞赋予相同的机械、物理、化学刺激，从而可以使细胞均一地增殖的细胞培养容器。
另外，本发明另一目的在于提供一种能够将培养了细胞的细胞培养支撑体从细胞培养容器容易地回收的细胞培养容器。
另外，本发明又一目的在于提供一种细胞培养容器，在细胞培养支撑体的分离过程中不对细胞造成损伤，能够培养具有符合所希望的检查及实验的形状的细胞。
另外，本发明又一目的在于提供一种既定地培养细胞群落体的形状而不破坏细胞-细胞间结合的细胞培养支撑体及包括其的细胞培养容器。
技术方案
本发明正是鉴于如上所述内容而研发的，本发明提供一种细胞培养容器，所述细胞培养容器具备在内部容纳细胞培养支撑体的作为内部空间的容纳部，其中，所述细胞培养容器包括用于使所述细胞培养支撑体固定于所述容纳部的下部面所需的固定构件，所述固定构件包括：第一粘合层，所述第一粘合层附着于所述容纳部的下部面；第二粘合层，所述第二粘合层与所述细胞培养支撑体的下部面附着；及支撑膜，所述支撑膜介于所述第一粘合层及第二粘合层之间，执行支撑功能；所述第二粘合层与细胞培养支撑体之间的粘合力大于所述第一粘合层与容纳部的下部面之间的粘合力。
根据本发明的一个实施例，所述第一粘合层与容纳部的下部面之间的粘合力及所述第二粘合层与细胞培养支撑体之间的粘合力，其粘合力之比可以为1：1.3～4。
另外，所述第一粘合层与容纳部的下部面之间的粘合力及所述第二粘合层与细胞培养支撑体之间的粘合力，其粘合力之比可以为1：1.5～3。
另外，所述第一粘合层与容纳部的下部面之间的粘合力可以为3～30gf/英寸。
另外，所述第二粘合层与细胞培养支撑体之间的粘合力可以为7～60gf/英寸。
另外，所述第一粘合层及第二粘合层可以分别独立地包括选自由硅类粘合剂及聚氨酯类粘合剂构成的组的1种以上。
另外，所述第一粘合层的厚度可以为7～55μm。
另外，所述第二粘合层的厚度可以为3～25μm。
另外，所述支撑膜的厚度可以为30～220μm。
另外，所述支撑膜可以包含选自由聚乙烯、聚丙烯、聚酰亚胺、交联聚丙烯、尼龙、聚氨酯类树脂、醋酸纤维、聚苯并咪唑、聚酰亚胺酰胺、聚醚酰亚胺、聚苯硫醚、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚对苯二甲酸丙二醇酯(PTT)、聚对苯二甲酸丁二醇酯(PBT)、聚偏氟乙烯(PVDF)、聚四氟乙烯(PTFE)、聚三氟氯乙烯(PCTFE)、乙烯-四氟乙烯共聚物(ETFE)构成的组的1种以上。
另外，所述细胞培养支撑体可以为包括编织物、纺织物及无纺布中任意一种以上的面料。
另外，所述面料可以包含细胞培养提升物质。
另外，所述细胞培养提升物质可以包含诱导细胞的附着、移动、成长、增殖(proliferation)及分化(differentiation)中任意一种以上的生理活性成分。
本发明中使用的氨基酸序列，根据IUPAC-IUB命名法，如下表1所示记载为缩略语。
【表1】
Figure BDA0002364930770000031
发明效果
根据本发明，可以防止在细胞培养过程中，因支撑体晃动而导致培养溶液不均一的分散及因培养的细胞移动而导致的偏斜等，向各细胞赋予相同的机械、物理、化学刺激，从而可以有助于细胞的均一增殖。
另外，可以将细胞培养支撑体从细胞培养容器容易地分离，可以防止因生化机制导致的细胞变质或脱离等，可以防止因超出培养的细胞需要的刺激导致的损伤。
进而，就形成群落进行增殖的聚落细胞而言，可以防止因在回收细胞培养支撑体的过程中按各群落体施加的物理、化学刺激的差异而导致群落体形状的均一性低下。
附图说明
图1是显示本发明一个实施例的细胞培养容器的立体图。
图2是显示构成本发明一个实施例的细胞培养容器的多个容纳部之一的容纳部的立体图，而且，
图3是图1所示的I-I'的剖面图。
最佳具体实施方式
下面以附图为参考，对本发明的实施例进行详细说明，以便本发明所属技术领域的普通技术人员能够容易地实施。本发明可以以多种相异的形态体现，不限于在此说明的实施例。为了在附图中明确说明本发明，省略与说明无关的部分，在通篇说明书中，对相同或类似的构成要素赋予相同的附图标记。
图1至如图3所示，本发明的细胞培养容器100、100’作为具备在内部容纳细胞培养支撑体130的作为内部空间的容纳部110的的细胞培养容器100，所述细胞培养容器100包括用于使所述细胞培养支撑体130固定于所述容纳部的下部面111所需的固定构件120，所述固定构件120包括：第一粘合层125，所述第一粘合层125附着于所述容纳部的下部面111；第二粘合层121，所述第二粘合层121与所述细胞培养支撑体130的下部面附着；及支撑膜123，所述支撑膜123介于所述第一粘合层125及第二粘合层121之间，执行支撑功能。
首先，在对本发明的细胞培养容器100、100’的各构成进行说明之前，对所述第二粘合层121与细胞培养支撑体130之间的粘合力应大于所述第一粘合层125与容纳部的下部面111之间的粘合力的理由进行说明。
在细胞培养容器配备的固定构件中，当第二粘合层121与细胞培养支撑体130之间的粘合力小时，由于粘合力低下而会发生细胞培养支撑体的晃动等，难以实现均一的细胞培养，因而会不容易实现所希望水平的细胞培养及增殖，当第一粘合层125与容纳部的下部面111之间的粘合力大时，在从细胞培养容器100分离固定构件120的过程中，会对细胞造成损伤。
因此，在本发明的细胞培养容器配备的固定构件中，所述第二粘合层121与细胞培养支撑体130之间的粘合力体现得大于所述第一粘合层125与容纳部的下部面111之间的粘合力，优选地，所述第一粘合层与容纳部的下部面之间的粘合力及所述第二粘合层与细胞培养支撑体之间的粘合力，其粘合力之比可以为1：1.3～4，更优选地，所述第一粘合层与容纳部的下部面之间的粘合力及所述第二粘合层与细胞培养支撑体之间的粘合力，其粘合力之比可以为1：1.5～3。
如果所述第二粘合层与细胞培养支撑体之间的粘合力小于所述第一粘合层与容纳部的下部面之间的粘合力，则会因粘合力低下而发生细胞培养支撑体的晃动等，难以实现均一的细胞培养，因而会不容易实现所希望水平的细胞培养及增殖。
另外，如果所述第一粘合层与容纳部的下部面之间的粘合力及所述第二粘合层与细胞培养支撑体之间的粘合力间的粘合力之比不足1：1.3，则会因粘合力低下而发生细胞培养支撑体的晃动等，难以实现均一的细胞培养，因而会不容易实现所希望水平的细胞培养及增殖，在从细胞培养容器100分离固定构件120的过程中，会对细胞造成损伤，如果粘合力之比超过1：4，则会因细胞培养容器100与固定构件120的附着力低下而发生细胞培养支撑体的晃动等，难以实现均一的细胞培养，因而会不容易实现所希望水平的细胞培养及增殖，在分离细胞培养支撑体130的过程中，过度的机械应力进行作用，会对细胞培养支撑体130中培养的细胞造成损伤。
下面对本发明的细胞培养容器100的各构成进行说明。
容纳部110作为在内部容纳细胞培养支撑体130的内部空间，只要是可以容纳细胞培养支撑体的形状，任何形状均可。即，虽然在图中图示了所述容纳部110具有圆筒形的均一形状的情形，但不限定于此，例如，可以为烧杯、孔板、瓶、管等形状，可以考虑培养的细胞的大小和种类，由形状和大小各异的容纳部构成。
另外，形成细胞培养容器100的材料不特别限制，可以使用细胞培养一般使用的材料。例如，可以利用聚苯乙烯树脂、聚酯树脂、聚乙烯树脂、聚对苯二甲酸乙二醇酯树脂、聚丙烯树脂、ABS树脂、尼龙、丙烯酸树脂、氟树脂、聚碳酸酯树脂、聚氨酯树脂、甲基戊烯树脂、酚醛树脂、三聚氰胺树脂、环氧树脂、氯化乙烯树脂等树脂材料；包括实施表面亲水处理的所述至少1种的树脂材料；玻璃或石英等无机材料。
另外，如果参照图2及图3，本发明一个实施例的容纳部110具备容纳部的下部面111和从容纳部的下部面延长的容纳部的侧面113，具有向上部方向开放的形状。虽然图中未图示，但在所述容纳部的下部面111及容纳部的侧面113可以形成有可供培养溶液流入或流出的开口部。另外，以能拆卸的方式追加配备有对开放的上部进行覆盖的盖子，可以使容纳部110密封或开放。
所述容纳部110的直径可以考虑所希望的细胞种类和大小及是否形成群落体而设计，在一个细胞培养容器100中，也可以形成有直径大小相异的多个容纳部110。
在所述容纳部110，固定有具有与容纳部的下部面111相同形状和大小的固定构件120和细胞培养支撑体130。根据本发明的一个实施例，所述固定构件120和细胞培养支撑体130形成得具有圆形形状，可以容纳于所述容纳部110。
另一方面，可以实施工业细胞培养的细胞，大致可以分为原代培养细胞进行代继而获得的细胞系(cell line)细胞和可分化为胚胎或生物体中各个种类细胞的作为未分化细胞的干细胞(stem cell)。据最近报告，干细胞需要远比细胞系细胞的培养更严格的操作。即，对机械应力或其他生化影响非常敏感，即使是简单损伤，细胞也可能凋亡，因而不适合在以机械、化学方式使培养的细胞分离的普通细胞培养器中增殖。
另外，就公知的细胞培养容器而言，在培养细胞的过程中，由于细胞培养支撑体不固定于细胞培养容器，因而会阻碍细胞均一成长，所以无法按所希望的水平使细胞增殖，进而，就构成群落的聚落细胞而言，即使在细胞群落体增殖的情况下，不仅是使细胞增殖的细胞培养支撑体的形状，而且根据从细胞培养支撑体剥离的物理、化学方法，细胞群落体的形状也会各异。如上所述，当细胞群落体的形状不统一时，每个培养的细胞群落体会表现出不同反应，在这种情况下，无法导出可再现结果，因而存在极不适合将增殖的细胞群落体用作检查、实验用途的问题。
因此，在本发明中，如上所述，体现得满足所述第二粘合层121与细胞培养支撑体130之间的粘合力同所述第一粘合层125与容纳部的下部面111之间的粘合力间的关系，对于像前述干细胞一样对细胞损伤非常敏感的细胞，不造成细胞损伤，可以从细胞培养容器容易地分离。另外，使培养细胞的细胞培养支撑体130固定于细胞培养容器，可以提供物理、化学、机械方式的相同环境，以便各细胞均一地增殖为所希望的水平，就构成群落的聚落细胞而言，不施加细胞-细胞间冲击，使群落体的形状和大小既定地分离，从而可以有望提高培养的群落体的利用率。
更具体而言，满足上述的所述第二粘合层121与细胞培养支撑体130之间的粘合力同所述第一粘合层125与容纳部的下部面111之间的粘合力间的关系，具备对细胞培养支撑体130执行支撑功能的支撑膜123，从而可以无晃动地固定细胞培养支撑体，因此，可以向细胞培养支撑体中培养的细胞提供相同的微环境。即，在细胞在细胞培养支撑体中培养的过程中，可以防止因支撑体晃动导致培养溶液不均一的分散及因培养的细胞的移动导致的偏斜等，对各细胞赋予相同的机械、物理、化学刺激，从而可以有助于细胞的均一增殖及实现所希望水平的细胞增殖。
因此，所述第一粘合层125与容纳部的下部面111之间的粘合力可以为3～30gf/英寸，优选地，可以为5～25gf/英寸。如果所述第一粘合层125与容纳部的下部面111之间的粘合力不足3gf/英寸，则会因细胞培养容器100与固定构件120的附着力低下而发生细胞培养支撑体的晃动等，在均一的细胞培养方面存在问题，因而会不容易实现所希望水平的细胞培养及增殖，如果粘合力超过30gf/英寸，则在从细胞培养容器100分离固定构件120的过程中，会对细胞造成损伤。
另外，所述第二粘合层121与细胞培养支撑体130之间的粘合力可以为7～60gf/英寸，优选地，可以为10～50gf/英寸。如果所述第二粘合层121与细胞培养支撑体130之间的粘合力不足7gf/英寸，则会因粘合力低下而发生细胞培养支撑体的晃动等，会难以实现均一的细胞培养，因而会不容易实现所希望水平的细胞培养及增殖，如果粘合力超过60gf/英寸，则在分离细胞培养支撑体130的过程中，过度的机械应力进行作用，存在会对在细胞培养支撑体130中培养的细胞造成损伤的忧虑。
另一方面，所述第一粘合层125与容纳部的下部面111之间的粘合力同所述第二粘合层121与细胞培养支撑体130之间的粘合力的范围即使一部分重叠，也体现得满足所述的第一粘合层125与容纳部的下部面111之间的粘合力同所述第二粘合层121与细胞培养支撑体130之间的粘合力的范围间的关系，这是不言而喻的。
所述第一粘合层125及第二粘合层121可以包括含有通常对细胞培养无害的物质的成分而形成，优选地，可以分别独立地包含选自由硅类粘合剂及聚氨酯类粘合剂构成的组的1种以上，更优选地，可以包含硅类粘合剂。
另外，所述第一粘合层125的厚度可以为7～55μm，优选地，厚度可以为10～50μm。如果所述第一粘合层125的粘合力不足7μm，则会无法固定于容纳部的下部面111，因此，在细胞培养过程中，固定构件120会借助于冲洗液(PBS、乙醇(ethanol)及介质(media)等)而剥离，如果厚度超过55μm，则固定构件120从容纳部的下部面111剥离时，会存在不容易剥离的问题。
而且，所述第二粘合层121的厚度可以为3～25μm，优选地，厚度可以为5～20μm。如果所述第二粘合层121的厚度不足3μm，则在细胞培养时，隔膜会剥离，如果厚度超过25μm，则在细胞培养支撑体130剥离时，培养的细胞会受到损伤。
介于所述第一粘合层125及第二粘合层121之间并执行支撑功能的支撑膜123，只要是具有本行业通常的既定水平的机械强度并可以执行支撑功能的材料，则可以无限制地使用，优选地，可以包括选自由聚乙烯、聚丙烯、聚酰亚胺、交联聚丙烯、尼龙、聚氨酯类树脂、醋酸纤维、聚苯并咪唑、聚酰亚胺酰胺、聚醚酰亚胺、聚苯硫醚、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚对苯二甲酸丙二醇酯(PTT)、聚对苯二甲酸丁二醇酯(PBT)、聚偏氟乙烯(PVDF)、聚四氟乙烯(PTFE)、聚三氟氯乙烯(PCTFE)、乙烯-四氟乙烯共聚物(ETFE)构成的组的1种以上。
另外，所述支撑膜123的厚度可以为30～220μm，优选地，厚度可以为50～200μm。如果所述支撑膜123的厚度不足30μm，则会难以获得充分的机械强度，如果厚度超过220μm，则在细胞回收时，会不容易去除支撑体。
下面对本发明的细胞培养容器100、100’配备的细胞培养支撑体130进行说明。
所述细胞培养支撑体130可以为包括纺织物、编织物及无纺布中任意一种以上的面料。
例如当所述细胞培养支撑体130由纺织物构成时，纺织物包含的纤维存在纵横的方向性，具体的组织可以有平纹、斜纹等，经纱与纬纱的密度不特别限定。
另外，例如当所述细胞培养支撑体130由编织物构成时，构成编织物的组织可以由公知的针织组织构成。作为一个示例，可以为纬编织物、经编织物等，但对此不特别限定。
但是，例如当所述细胞培养支撑体130由无纺布构成时，无纺布意味着包含的纤维没有纵横的方向性，可以使用诸如化学粘合无纺布、热粘合无纺布、气流成网无纺布等干法无纺布或湿法无纺布、水刺无纺布、针刺无纺布或熔喷无纺布的公知的无纺布，作为一个示例，所述无纺布可以为以静电纺丝的纳米纤维形成的纳米纤维网。
如上所述构成本发明的细胞培养支撑体的面料，可以考虑细胞的大小及种类而以多样形态的面料构成，在图2中图示了以无纺布构成的情形。
如果参照图2所示的对细胞培养支撑体130的局部放大图，构成本发明细胞培养支撑体130的面料可以为由短纤纱、长纤纱或纵切纱(slitting yarn)、电纺纳米纤维构成的原纱。
在所述原纱为短纤纱或长纤纱的情况下，直径可以为10nm～100μm，优选地可以为50nm～90μm。不过，并非限定于此，可以变更以便符合要培养的细胞的种类、大小、细胞集合体的形状及大小。
另外，所述短纤纱可以是通过基于公知方法的原棉而制造的。另外，所述长纤纱可以是根据公知方法而纺丝制造的，所述纺丝可以是化学纺丝或静电纺丝等公知的纺丝方法。
另外，所述纵切纱可以是将片状的纤维集合体、面料等截断得具有既定宽度而制造的。优选地，所述纵切纱可以是将具有三维网络结构的片状的纤维网截断得具有既定宽度而制造的原纱。此时，所述纤维网可以以既定压力压附，提高纵切工序的容易性，增加纵切纱的强度。作为一个示例，所述纵切纱可以是将定量为0.1～100g/㎡的纤维网截断成宽度0.1～30㎜的原纱。在将宽度纵切成不足0.1㎜的情况下，不容易截断，存在会因假捻时施加的张力和旋转力而容易断裂的问题。另外，在将宽度纵切成超过30㎜的情况下，存在会在捻纱时发生不均一缠绕的问题。
另外，所述电纺的纳米纤维可以通过无方向性的多次折叠、排列/层叠而形成三维网络结构。或者，包括多个纳米纤维在内，可以通过各个纳米纤维独立地折叠和/或无纤维长度方向性地分别排列/层叠而形成三维网络结构。此时，会在一股纳米纤维内的互不相同的表面间和/或互不相同的纳米纤维的表面间发生粘着或熔接，由此，三维网络结构在结构上更复杂，加载于支撑体的细胞可以在以三维网络结构形成的气孔内部移动/增殖，可以有利于将细胞培养成具有立体形状/结构的细胞群落体。另外，为了增加在支撑体内部/外部培养的细胞的增殖率及生存率，供应细胞增殖所需的营养成分等很重要，而三维网络结构的纳米纤维的包含营养成分的培养溶液流路非常复杂、多样地形成，从而营养成分可以容易地供应至位于支撑体内部的细胞，防止细胞凋亡，提高细胞增殖。
然后，上述原纱可以以能够制造成纤维状的公知的纤维形成成分体现，可以根据原纱的种类而选择适合的材质来体现，可以根据要求降解性等特殊目的而不同地选择材质，因此，本发明对此不特别限定。所述纤维形成成分可以包括棉、麻等的纤维素成分，羊毛、丝绸等的蛋白质成分或矿物性成分等天然纤维成分。或者，所述纤维形成成分可以为公知的人造纤维成分。
另一方面，所述纤维形成成分可以根据目的而包括选自由聚苯乙烯(PS)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚醚砜(PES)、聚偏氟乙烯(PVDF)、聚丙烯腈(PAN)、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚酰胺、聚亚烷、聚环氧烷(poly(alkylene oxide))、聚氨基酸(poly(aminoacids))、聚丙烯胺(poly(allylamines)、聚磷腈(polyphosphazene)及聚环氧乙烷-聚环氧丙烷嵌段共聚物构成的组的任意一种以上的非生物降解性成分，或可以包括选自由聚己酸内酯、聚对二氧环己酮(polydioxanone)、聚乙醇酸(polyglycolic acid)、PLLA(poly(L-lactide)：聚(L-丙交酯))、PLGA(poly(DL-lactide-co-glycolide):聚(DL-丙交酯-乙交酯))、聚乳酸(Polylactic acid)及聚乙烯醇(polyvinyl alcohol)构成的组的一种以上生物降解性成分。
另一方面，上述的原纱除纤维形成成分之外，可以包括细胞培养性提升物质，作为所述细胞培养性提升物质，可以还包括粘结成分或生理活性成分中任意一种以上。此时，在所述原纱的内部不具备粘结成分或生理活性成分，通过固定于外部面一个区域的粘结成分，生理活性成分可以固定于原纱外部面一部分。或者，粘结成分也可以全部被覆原纱外部面配备，而生理活性成分以全部被覆粘结成分的方式配备。
最近正在研究的细胞培养技术，正在向在体外(in vitro)体现实际体内细胞间环境的方向进行研究，现在的趋势是为了与体内细胞环境类似地营造细胞培养环境，在体外(in vitro)培养时，在培养溶液中包含应用体内细胞外基质(ECM)中具备的各种成分。但是，在培养溶液中包含能够使细胞培养增殖的物质的情况下，在使所述物质持续暴露于培养的细胞方面存在界限，为了持续暴露，应增加培养溶液中所述物质含量，但这导致费用增加，在增殖效率方面存在问题。
因此，在本发明一个实施例的原纱表面，粘结成分及生理活性成分以固定的状态配备于支撑体，向位于原纱上或被原纱环绕的空间内的培养细胞，通过生理活性成分持续提供细胞刺激，并持续和放大基于此的细胞内信号传递，具有可以使细胞增殖进一步加速的优点。
所述粘结成分在初期可以使培养细胞固定于细胞支撑体上，执行防止载入培养溶液的细胞悬浮的功能，和/或使生理活性成分固定于原纱上，执行防止在原纱上培养细胞的过程中，生理活性成分从支撑纤维脱离的功能。就所述粘结成分而言，只要是通常的具有生物适合性而不发生细胞毒性的公知的粘结成分，则可以无限制地使用，但优选地，可以包括由序列号1至序列号7的氨基酸序列反复1次至20次构成的蛋白质及选自由这些蛋白质中至少2个融合的蛋白质构成的组的1种以上，由此，细胞毒性显著低下，生理活性成分的粘合力优秀，同时，具有可以防止细胞培养中粘结成分溶解于培养溶液而发生的生理活性成分脱离或细胞分离的优点。
下面对原纱可具备的生理活性成分进行更具体说明。所述生理活性成分可以是直接/间接诱导细胞的附着、移动、成长、增殖(proliferation)及分化(differentiation)中任意一种以上的物质，以便能够增进细胞培养，只要是已知能够实现这种功能的公知物质，则可以无限制地包括。作为一个示例，所述生理活性成分可以包括选自由单胺、氨基酸、肽、糖类(saccharide)、脂质(lipid)、蛋白质、糖蛋白(glucoprotein)、糖脂(glucolipid)、蛋白聚糖、黏多醣(mucopolysaccharide)及核酸(nucleic acid)构成的组的任意一种以上化合物及细胞中任意一种以上。此时，单胺包括例如含有儿茶酚胺、吲哚胺等一级胺的化合物。另外，所述肽包括寡肽，所述蛋白质包括多肽，作为一个示例，可以为纤连蛋白等。所述糖类可以包括单糖类、多糖类、寡糖及碳水化合物，所述脂质例如可以为类固醇激素。
另一方面，所述生理活性成分可以包含基序。所述基序可以为包含既定氨基酸序列的天然肽或重组肽，所述既定氨基酸序列是在生长因子(growth factor)或细胞外基质(extracellular matrix)包含的蛋白质、糖蛋白及蛋白聚糖中选择的任意一种以上所具备的氨基酸序列。具体而言，所述基序可以包括选自由肾上腺髓质素(Adrenomedullin)、血管生成素(Angiopoietin)、成骨蛋白质(BMP)、脑源性神经营养因子(BDNF)、表皮生长因子(EGF)、红细胞生成素(Erythropoietin)、成纤维细胞生长因子(Fibroblast growthfactor)、神经胶质细胞源性的神经营养因子(GDNF)、粒细胞集落刺激因子(Granulocytecolony-stimulating factor，G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(Granulocytemacrophage colony-stimulating factor，GM-CSF)、生长分化因子-9(Growthdifferentiation factor-9，GDF9)、肝细胞生长因子(HGF)、肝癌衍生生长因子(Hepatoma-derived growth factor，HDGF)、胰岛素生长因子(Insulin-like growth factor，IGF)、角质细胞生长因子(Keratinocyte growth factor，KGF)、移动刺激因子(Migration-stimulating factor，MSF)、肌生成抑制蛋白(Myostatin，GDF-8)、神经生长因子(Nervegrowth factor，NGF)、血小板源生长因子(Platelet-derived growth factor，PDGF)、促血小板生成素(Thrombopoietin，TPO)、T-细胞生长因子(T-cell growth factor，TCGF)、神经纤维黏蛋白、转化生长因子-α(TGF-α)、转化生长因子-β(TGF-β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、血管内皮生长因子(VEGF)、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6及IL-7构成的组的任意一种以上生长因子(GF)包含的既定氨基酸序列。或者，可以包含选自由透明质酸、硫酸肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素、藻朊酸盐、纤维蛋白、纤维蛋白原、胶原蛋白、弹性蛋白、纤连蛋白、玻连蛋白、钙粘蛋白及层粘连蛋白构成的组的任意一种以上细胞外基质(extracellular matrix)包含的既定氨基酸序列。另外，所述基序也可以全部包括生长因子包含的既定氨基酸序列及所述细胞外基质包含的既定氨基酸序列。更优选地，所述基序可以包括包含序列号8至序列号28的氨基酸序列而构成的蛋白质及选自由这些蛋白质中至少2个融合的蛋白质构成的组的一种以上，但并非限定于此。
另一方面，所述基序也可以共价结合于上述粘结成分而一体体现。作为一个示例，在所述粘结成分为蛋白质的情况下，可以在多肽的N-末端和/或C-末端，使所述基序直接共价结合，或嵌入异种肽或多肽而共价结合，此时，可以使生理活性成分更坚固地附着于原纱，可以使生理活性成分在细胞培养中的脱离实现最小化。
另外，在所述生理活性成分为基序的情况下，所述基序为了增进细胞附着性，可以还包含公知的贻贝蛋白质或者贻贝蛋白质中特定的结构域或基序来体现。
另一方面，本发明使培养细胞移植至本发明一个实施例的细胞培养容器具备的作为细胞培养支撑体的面料，可以体现包括所培养细胞在内的组织工程学用移植体。此时，所述培养细胞移动到包括原纱外部面及原纱间隔开空间在内的部分，由于细胞移动到所述空间并培养，因而培养的细胞可以位于原纱的内部。此时，隔开的原纱可以位于所培养的细胞中邻接的细胞之间，此时，可以直接防止邻接细胞间的接触，对细胞培养更有利。
另外，所述细胞可以包括选自由全能干细胞、万能干细胞、多能干细胞、寡能(oligopotent)干细胞及单一干细胞构成的组的任意一种以上干细胞，及选自由造血母细胞、肝细胞、纤维细胞、上皮细胞、间皮细胞、内皮细胞、肌细胞、神经细胞、免疫细胞、脂肪细胞、软骨细胞、骨细胞、血细胞及皮肤细胞构成的组的分化细胞中的一种以上。作为一个示例，所述细胞可以是具有比球形向一个方向稍长的形状的细胞或移动性强的细胞。
另外，在以对人体无害的纤维形成成分体现所述原纱材质的情况下，可以将附着有所培养的细胞的支撑体直接移植到人体内部，由此具有可以使所培养的细胞在组织内更容易、更稳定地存活的优点。
下表2是关于显示出本发明中说明的序列号的氨基酸序列的序列目录的表。
【表2】
Figure BDA0002364930770000091
Figure BDA0002364930770000101
Figure BDA0002364930770000111
具体实施方式
通过下述实施例，更具体地说明本发明，但下述实施例并非限定本发明的范围，应解释为其用于帮助理解本发明。
<实施例1>
首先，在作为支撑膜的、厚度75μm的聚酯膜(Poyester，世界转换技术公司)的下部面，利用硅类粘合剂形成厚度30μm的第一粘合层，在上部面，利用硅类粘合剂形成厚度15μm的第二粘合层，从而制造固定构件。
而且，将包含0.3mg/ml纤连蛋白(fibronectin，RGD based)作为粘合物质及包含0.3mg/ml层粘连蛋白(laminin)作为生理活性物质、包含13重量％PLGA作为纤维形成成分及THF与DMF为3：7重量比的溶剂共87重量％的第一纺纱溶液，使用静电纺丝装置，在施加电压25KV、集电体与纺丝口距离25cm、吐出量0.05ml/孔的条件下，在RH 60％30的环境下，实施静电纺丝，收得以平均直径600nm的纳米纤维形成的纳米纤维网。将收得的纳米纤维网，以温度130℃、压力4kPa实施压延2次，以此方法制造了面料为定量15.1g/㎡、厚度25μm、平均孔径0.8μm、空气透过度5cfm的细胞培养支撑体，以与上述制造的固定构件的第二粘合层相接的方式附着。
然后，在以聚对苯二甲酸乙二醇酯树脂形成并具备容纳部的细胞培养用容器的容纳部下部面，以与第一粘合层相接的方式，对附着细胞培养支撑体的固定构件进行附着，制造了细胞培养容器。
此时，第一粘合层与容纳部的下部面之间的粘合力为25gf/英寸，第二粘合层与细胞培养支撑体之间的粘合力为50gf/英寸。
<实施例2～11及比较例1>
与实施例1相同地实施而制造，但变更第一粘合层与容纳部的下部面之间的粘合力、第二粘合层与细胞培养支撑体之间的粘合力、第一粘合层的厚度、第二粘合层的厚度及支撑膜的厚度等，制造了表3及表4所示的细胞培养容器。
<实验例>
使成纤维细胞(HS27)加载于实施例及比较例制造的各个细胞培养容器后，在10％完全培养基中增殖4天时间。此时，10％完全培养基是在杜尔贝科改良伊格尔培养基(DMEM)中按1：1.5的体积比混合Ham's F12培养基后，添加胎牛血清(fetal bovine serum)7vol％、青霉素65U/mL及链霉素65μg/mL而制造。然后，评价下述物性，显示于下表3及表4。
1.细胞培养的均一性评价
从包含增殖的成纤维细胞的各个细胞培养容器中，分离细胞培养支撑体与固定构件层叠体，从层叠体分离细胞培养支撑体后，利用细胞计数器(cell counter)测量细胞数后，以实施例1中测量的细胞数为100％，按此基准，相对地显示其他实施例及比较例的细胞数。
此时，细胞数少，代表因支撑体晃动导致的培养溶液不均一分散及因所培养细胞的移动导致的偏斜等，难以实现均一的细胞培养，因而细胞培养及增殖低下。
2.细胞损伤评价
从包含增殖的成纤维细胞的各个细胞培养容器，分离细胞培养支撑体与固定构件层叠体，从层叠体分离细胞培养支撑体后，利用细胞计数器(cell counter)，通过细胞数测量及细胞生死差别试验，测量存活的细胞相对于全体细胞的比率，评价细胞损伤。
【表3】
Figure BDA0002364930770000131
【表4】
Figure BDA0002364930770000132
正如从上表3及表4可知的，可以确认：本发明的全部满足第一粘合层与容纳部的下部面之间的粘合力、第二粘合层与细胞培养支撑体之间的粘合力、第一粘合层的厚度、第二粘合层的厚度及支撑膜厚度等的实施例1、2、4及5，相比遗落其中一项的实施例3、6～11及比较例1，细胞培养的均一性优秀，同时不发生细胞损伤。
以上对本发明的一个实施例进行了说明，但本发明的思想不限定于本说明中提示的实施例，理解本发明思想的从业人员可以在相同的思想范围内，借助于构成要素的附加、变更、删除、追加等，容易地提出其他实施例，这也属于本发明的思想范围内。
<110> 阿莫生命科学有限公司
<120> 细胞培养容器（CELL CULTURE CONTAINER）
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Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala
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Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro
35 40 45
Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ser Ser Glu
50 55 60
Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Thr Tyr His Tyr His Ser
65 70 75 80
Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr Lys Gly Lys
85 90 95
Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asn Ser Gly
100 105 110
Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly Tyr
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Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly Ser Ser Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr
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Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser
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Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys
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Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro
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Pro Thr Tyr Lys
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Pro His Ser Arg Asn Arg Gly Asp Ser Pro
1 5 10
<210> 27
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 细胞培养支架基序（Motif for cell culture scaffold）
<400> 27
Asn Arg Trp His Ser Ile Tyr Ile Thr Arg Phe Gly
1 5 10
<210> 28
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 细胞培养支架基序（Motif for cell culture scaffold）
<400> 28
Thr Trp Tyr Lys Ile Ala Phe Gln Arg Asn Arg Lys
1 5 10

Claims (13)

1.一种细胞培养容器，所述细胞培养容器具备在内部容纳细胞培养支撑体的作为内部空间的容纳部，其中，
所述细胞培养容器包括用于使所述细胞培养支撑体固定于所述容纳部的下部面所需的固定构件，
所述固定构件包括：
第一粘合层，所述第一粘合层附着于所述容纳部的下部面；
第二粘合层，所述第二粘合层与所述细胞培养支撑体的下部面附着；及
支撑膜，所述支撑膜介于所述第一粘合层及第二粘合层之间，执行支撑功能；
所述第二粘合层与细胞培养支撑体之间的粘合力大于所述第一粘合层与容纳部的下部面之间的粘合力。
2.根据权利要求1所述的细胞培养容器，其中，
所述第一粘合层与容纳部的下部面之间的粘合力及所述第二粘合层与细胞培养支撑体之间的粘合力，其粘合力之比为1：1.3～4。
3.根据权利要求1所述的细胞培养容器，其中，
所述第一粘合层与容纳部的下部面之间的粘合力及所述第二粘合层与细胞培养支撑体之间的粘合力，其粘合力之比为1：1.5～3。
4.根据权利要求1所述的细胞培养容器，其中，
所述第一粘合层与容纳部的下部面之间的粘合力为3～30gf/英寸。
5.根据权利要求1所述的细胞培养容器，其中，
所述第二粘合层与细胞培养支撑体之间的粘合力为7～60gf/英寸。
6.根据权利要求1所述的细胞培养容器，其中，
所述第一粘合层及第二粘合层分别独立地包括选自由硅类粘合剂及聚氨酯类粘合剂构成的组的1种以上。
7.根据权利要求1所述的细胞培养容器，其中，
所述第一粘合层的厚度为7～55μm。
8.根据权利要求1所述的细胞培养容器，其中，
所述第二粘合层的厚度为3～25μm。
9.根据权利要求1所述的细胞培养容器，其中，
所述支撑膜的厚度为30～220μm。
10.根据权利要求1所述的细胞培养容器，其中，
所述支撑膜包含选自由聚乙烯、聚丙烯、聚酰亚胺、交联聚丙烯、尼龙、聚氨酯类树脂、醋酸纤维、聚苯并咪唑、聚酰亚胺酰胺、聚醚酰亚胺、聚苯硫醚、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚对苯二甲酸丙二醇酯(PTT)、聚对苯二甲酸丁二醇酯(PBT)、聚偏氟乙烯(PVDF)、聚四氟乙烯(PTFE)、聚三氟氯乙烯(PCTFE)、乙烯-四氟乙烯共聚物(ETFE)构成的组的1种以上。
11.根据权利要求1所述的细胞培养容器，其中，
所述细胞培养支撑体为包括编织物、纺织物及无纺布中任意一种以上的面料。
12.根据权利要求11所述的细胞培养容器，其中，
所述面料包含细胞培养提升物质。
13.根据权利要求12所述的细胞培养容器，其中，
所述细胞培养提升物质包含诱导细胞的附着、移动、成长、增殖(proliferation)及分化(differentiation)中任意一种以上的生理活性成分。
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