CN102952751A - 多种细胞共培养支架 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种多种细胞共培养支架，该支架包括支架面和与所述支架面连接的支撑架，所述的支架面上开设有固定孔。所述的支架面边缘处连接有支撑架。本发明可根据需要进行3到5种细胞的共同培养，可适用于多种贴壁细胞、悬浮或半悬浮细胞的共同培养。各种细胞分别生长于不同的培养小室或培养皿内，不会造成不同细胞之间的污染与混杂，易于收获细胞。
Description
技术领域
本发明涉及一种培养支架，特别是涉及一种多种细胞共培养支架。
背景技术
细胞培养是将细胞置于体外条件下进行生长和繁殖，具有可直接观察活细胞的形态结构和生命活动、直接观察细胞的变化、易于提供大量生物性状相似的实验对象以及耗资少等优点。细胞的体外培养可以是一种细胞单独培养和多种细胞共同培养。
一种细胞的单独培养，这是目前在基础医学及基础与临床相结合的研究中应用最为广泛的方式，主要用于研究某一种细胞的形态学、基因及蛋白的表达以及在不同处理因素作用下发生的变化及其机制。虽然培养过程中细胞独立生存于人工模拟的体内环境，但该环境与真实的体内环境相比仍有很大差异。为了能够建立更类似于体内环境的培养体系，尽可能使体外环境与体内环境相吻合，从而使细胞间能相互沟通信息，相互支撑生长增殖，20世纪80年代后期，人们在原有细胞培养的基础上发展出了细胞共培养技术。细胞共培养技术是将2种或2种以上的细胞共同培养于同一环境中的技术，由于其具有更好反映体内环境的优点，所以这种方法被越来越广泛地应用于现代细胞研究中。
多种细胞共同培养，主要通过两种方法建立：直接共培养体系和间接共培养体系。直接共培养体系，是将2种或2种以上的细胞同时接种于同一培养容器内，不同类型的细胞之间直接接触，不可否认，这种方式较一种细胞单独培养能够更好的反映体内的环境，但是由于不同的细胞生长在同一细胞容器内，无法分离各种细胞用于下一步的研究，限制了其应用。间接共培养体系，即将2种或2种以上的细胞分别接种于不同的载体上，然后将不同载体置于同一培养环境中，使不同种类的细胞共处于同一种培养体系中而不直接接触，可以分别收取不同种类的细胞用于下一步的研究，弥补了直接共培养体系的不足。目前已经商品化的是可用于2种细胞共培养的体系，如美国康宁（corning）公司有商品化的各种规格的共培养体系（又称transwell培养皿），而美国millipore公司则生产可适用于国内外各家培养器皿生产公司的悬挂式小室，组装成为共培养体系，这些商品化的共培养体系操作简单，目前在研究中得到广泛应用。但是，由于在不同疾病的发生发展过程中，参与其中的细胞类型可能是许多种，而多种细胞之间复杂的相互作用是疾病产生的主要原因，国内外研究者迫切需要能够将更多细胞纳入到同一种培养环境中，并且能够分别对各种细胞类型进行进一步研究的共培养体系。另外，为适应新化学物或产品快速增长的需求，迫切需要发展快速、高通量的毒性评价方法。常用的体外方法培养的细胞种类有限，研究者需要同时评价毒物对多种器官细胞的易感性和毒性作用，为满足这一要求，美国的Li AP等用美国康宁公司的六孔板进行了改进，可以同时培养来自不同器官的6种细胞，称为integrated discrete multiple organ co-culture(IdMOCTM) plate，中文名称为整体非连续性多器官共培养体系，此产品已申请专利（US 7186548B2，CHINA 626030）。但这一产品存在以下不足：1）在培养板的一个大共培养孔中有6个小孔，每个小孔的高度只有0.8毫米，且各个小孔之间距离太近，因此在操作时如果有轻微的晃动，一个小孔中的细胞可能会移动至另一小孔中，造成不同细胞之间的污染与混杂；而由于不能晃动，会导致细胞贴壁不均匀，出现中心细胞多，周围细胞少的情况，影响细胞的生长；并且在收获细胞时操作也有一定的难度；2）因为小孔的生长面积有限（每个小孔中最多只能容纳300微升的液体），不适合需要大量细胞的实验；3）只适合贴壁细胞，不适合悬浮及半悬浮细胞的培养。
综上所述，目前已有的可多种细胞共同培养的体系IdMOCTM有如下不足：1）易造成不同细胞之间的污染与混杂；2）细胞贴壁不均匀；3）不适合需要大量细胞的实验；4）只适合贴壁细胞，不适合悬浮及半悬浮细胞的培养；5）收获细胞有一定难度。另外，IdMOCTM体系主要用于评价毒物对多种器官细胞的易感性和毒性作用，难以满足广大研究者对于多种细胞共培养的不同需求。例如，在肝纤维化的发生过程中有三种细胞共同发挥着关键的作用：肝细胞损伤、坏死，刺激和激活肝脏巨噬细胞（Kupffer细胞），后者活化分泌细胞因子再激活肝脏星状细胞并产生过量的细胞外基质，细胞外基质的过量堆积则引起肝纤维化的发生；另外，粘附分子在肝纤维化过程中也显著上调，而其上调则与肝细胞和血窦内皮细胞诱导表达Integrin家族中的层连蛋白受体相关。在其他疾病的发病机制中，也常有3种或3种以上（常为3到5种）关键细胞的相互作用参与其中，并且有多种细胞属于悬浮或半悬浮生长细胞。因此，设计出易于操作、同时适用于贴壁细胞和悬浮细胞共同培养、适用于研究者多种不同需要的培养体系是十分必要的。
发明内容
为避免以上现有技术的不足，本发明提供一种多种细胞共培养支架，以解决一个可进行多种细胞共同培养的培养体系。
本发明的技术方案为：
多种细胞共培养支架，该支架包括支架面和与所述支架面连接的支撑架，所述的支架面上开设有固定孔。
所述的支架面边缘处连接有支撑架。
所述的固定孔的边缘处设有开口槽。
所述的固定孔至少为2个。
所述的开口槽为3个。
所述的支撑架的高度为为17-20mm。
多种细胞共培养装置，该装置包括培养皿和放置于培养皿中的多细胞共培养支架，该多细胞共培养支架包括支架面和与所述支架面连接的支撑架，所述的支架面上开设有固定孔。
该装置的固定孔的边缘处设有开口槽。
该装置还包括有培养小室。
所述的多细胞共培养支架的高度大于所述培养小室的高度，而小于所述的培养皿的高度。
在进行多种细胞共同培养时，将培养小室放到多细胞共培养支架上的固定孔上，培养小室的高度小于培养皿的高度，在培养支架的支撑下，培养小室的底部与培养皿容器的底部之间保持有一定的空间，各培养小室中的细胞能处于独立培养环境的同时，又能置于一个大的培养体系中，且各种细胞彼此又不会直接接触。
另一方面，当进行多细胞培养时，对培养小室进行晃动操作时，由于培养小室带有固定装置，该固定装置与固定孔的开口槽匹配衔接，培养小室的位置能易于被固定而不至于滑动，以影响实验结果。
本发明具有如下优点：
1）可根据需要进行3到5种细胞的共同培养；
2）可适用于多种贴壁细胞的共同培养；
3）适用于多种悬浮或半悬浮细胞的共同培养；
4）适用于贴壁细胞与悬浮或半悬浮细胞的共同培养；
5）各种细胞分别生长于不同的培养小室或培养皿内，不会造成不同细胞之间的污染与混杂，易于收获细胞；
6）可以通过轻微振荡培养小室混匀细胞，使细胞贴壁均匀。
附图说明
图1: 3孔共培养支架正面俯视图；
图2: 带开口槽的3孔共培养支架正面俯视图；
图3：多细胞共培养装置中的培养皿正视图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步详述。
实施例1
以3孔共培养支架对3种细胞的共培养为例：
如图1所示，一种多种细胞共培养支架，该支架包括支架面1和与所述支架面1连接的支撑架2，所述的支架面1上开设有固定孔3，所述的支架面1可以在边缘处与所述的支撑架2连接。所述的固定孔为3个。所述的支撑架的高度为选17mm。
如图3所示为多细胞共培养装置中的培养皿正视图。一种多种细胞共培养装置，该装置包括培养皿4和放置于培养皿中的共培养支架，该共培养支架包括支架面和与所述支架面连接的支撑架，所述的支架面上开设有固定孔。该装置还包括有培养小室。所述的培养小室为一小盒，且小盒的边缘处设有与所述开口槽匹配的固定装置。
上述的培养皿可采用美国corning公司直径10厘米，高度为2厘米或同等规格的培养皿；培养小室采用millipore公司悬挂式培养小室。由于本发明培养支架的支撑架的高度设计为17mm，因此将载有培养小室的培养支架放入培养皿中，该培养小室底部与培养皿底部留有一定距离，彼此之间不会直接接触。所述的培养皿、共培养支架和悬挂式培养小室则成为一个可进行多种细胞共同培养的共培养体系，每个悬挂式培养小室内可分别加入不同种类的细胞（可为贴壁细胞或悬浮细胞）。以下对3种细胞共同培养进行说明。
首先，将3种不同种类的细胞（可为贴壁细胞或悬浮细胞），如肝细胞、巨噬细胞和星状细胞各放入共培养支架的培养小室中，再将该支架放入培养皿中，将整个共培养体系置于细胞培养箱中培养一段时间（6个小时或过夜培养），使贴壁细胞充分贴壁（每种细胞的生长特性不同导致贴壁时间有一定差异）。培养小室内可加入2到3毫升的液体，以密度为1×107/毫升的细胞为例，可加入2至3×107个细胞，适于需要大量细胞的实验。此时各培养小室之间细胞独立生长，培养液也不互相连通。
其次，待贴壁细胞贴壁后，移除多余的培养液，在培养皿中加入新鲜培养液，高度使其能够没过悬挂式培养小室的底部。由于悬挂式培养小室的底部有不同大小的小孔，可允许液体自由通过，而细胞不能通过，因此，3种细胞即可通过培养液互相连通，处于同一生长环境中。此时定义为3种细胞共培养开始的时间，根据不同研究者的需求，在培养液中加入外源性干预因子。
实验结束后，根据研究者要求，可以收取共培养体系的上清，观察共培养体系中分泌性蛋白的变化；将不同的悬挂式培养皿取出，分别收取3种不同细胞，用于下一步的实验。
实施例2
以3孔共培养支架对3种细胞的共培养为例：
如图2所示，一种多种细胞共培养支架，该支架包括支架面1和与所述支架面1连接的支撑架2，所述的支架面1上开设有固定孔3，所述的支架面1可以在边缘处与所述的支撑架2连接。所述的固定孔3的边缘处设有开口槽31。所述的固定孔3为3个。所述的开口槽31为3个。所述的支撑架的高度为为18mm。
如图3所示，一种多种细胞共培养装置，该装置包括培养皿4和放置于培养皿中的共培养支架，该共培养支架包括支架面和与所述支架面连接的支撑架，所述的支架面上开设有固定孔。所述的固定孔的边缘处设有开口槽。该装置还包括有培养小室。所述的培养小室为一小盒，且小盒的边缘处设有与所述开口槽匹配的固定装置。
上述的培养皿可采用美国corning公司直径10厘米，高度为2厘米或同等规格的培养皿；培养小室采用millipore公司悬挂式培养小室。由于本发明培养支架的支撑架的高度设计为18mm，因此将载有培养小室的培养支架放入培养皿中，该培养小室底部与培养皿底部留有一定距离，彼此之间不会直接接触。所述的培养皿、共培养支架和悬挂式培养小室则成为一个可进行多种细胞共同培养的共培养体系，每个悬挂式培养小室内可分别加入不同种类的细胞（可为贴壁细胞或悬浮细胞）。以下对3种细胞共同培养进行说明。
首先，将3种不同种类的细胞（可为贴壁细胞或悬浮细胞），如肝细胞、巨噬细胞和星状细胞各放入共培养支架的培养小室中，再将该支架放入培养皿中，将整个共培养体系置于细胞培养箱中培养一段时间（6个小时或过夜培养），使贴壁细胞充分贴壁（每种细胞的生长特性不同导致贴壁时间有一定差异）。培养小室内可加入2到3毫升的液体，以密度为1×107/毫升的细胞为例，可加入2至3×107个细胞，适于需要大量细胞的实验。此时各培养小室之间细胞独立生长，培养液也不互相连通。
其次，待贴壁细胞贴壁后，移除多余的培养液，在培养皿中加入新鲜培养液，高度使其能够没过悬挂式培养小室的底部。由于悬挂式培养小室的底部有不同大小的小孔，可允许液体自由通过，而细胞不能通过，因此，3种细胞即可通过培养液互相连通，处于同一生长环境中。此时定义为3种细胞共培养开始的时间，根据不同研究者的需求，在培养液中加入外源性干预因子。
实验结束后，根据研究者要求，可以收取共培养体系的上清，观察共培养体系中分泌性蛋白的变化；将不同的悬挂式培养皿取出，分别收取3种不同细胞，用于下一步的实验。
实施例3
以3孔共培养支架对4种细胞的共培养为例：
如图1所示，一种多种细胞共培养支架，该支架包括支架面1和与所述支架面1连接的支撑架2，所述的支架面1上开设有固定孔3，所述的支架面1可以在边缘处与所述的支撑架2连接。所述的固定孔为3个。所述的支撑架2的高度为为19mm。
如图3所示，一种多种细胞共培养装置，该装置包括培养皿4和放置于培养皿中的共培养支架，该共培养支架包括支架面和与所述支架面连接的支撑架，所述的支架面上开设有固定孔。该装置还包括有培养小室，所述的培养小室为一小盒，且小盒的边缘处设有与所述开口槽匹配的固定装置。
上述的培养皿可采用美国corning公司直径10厘米，高度为2厘米或同等规格的培养皿；培养小室采用millipore公司悬挂式培养小室。由于本发明培养支架的支撑架的高度设计为19mm，因此将载有培养小室的培养支架放入培养皿中，该培养小室底部与培养皿底部留有一定距离，彼此之间不会直接接触。所述的培养皿、共培养支架和悬挂式培养小室则成为一个可进行多种细胞共同培养的共培养体系，每个悬挂式培养小室内可分别加入不同种类的细胞（可为贴壁细胞或悬浮细胞）。以下对4种细胞共同培养进行说明。
首先，将3种不同种类的细胞（可为贴壁细胞或悬浮细胞），如肝细胞、巨噬细胞和星状细胞各放入共培养支架的培养小室中，再将该支架放入培养皿中，将整个共培养体系置于细胞培养箱中培养一段时间（6个小时或过夜培养），使贴壁细胞充分贴壁（每种细胞的生长特性不同导致贴壁时间有一定差异）。培养小室内可加入2到3毫升的液体，以密度为1×107/毫升的细胞为例，可加入2至3×107个细胞，适于需要大量细胞的实验。此时各培养小室之间细胞独立生长，培养液也不互相连通。
其次，将第4种细胞血窦内皮细胞（可为贴壁细胞或悬浮细胞）置于另一培养皿内生长，使贴壁细胞充分贴壁（每种细胞的生长特性不同导致贴壁时间有一定差异）。
再次，待贴壁细胞贴壁后，移除多余的培养液，将3孔共培养支架和生长有3种细胞的悬挂式培养小室组装在生长有第4种细胞培养皿中，加入新鲜培养液，高度使其能够没过悬挂式培养小室的底部。由于悬挂式培养小室的底部有不同大小的小孔，可允许液体自由通过，而细胞不能通过，因此，4种细胞即可通过培养液互相连通，处于同一生长环境中。此时定义为4种细胞共培养开始的时间，根据不同研究者的需求，在培养液中加入外源性干预因子。
实验结束后，根据研究者要求，可以收取共培养体系的上清，观察共培养体系中分泌性蛋白的变化；将不同的悬挂式培养皿取出，分别收取4种不同细胞，用于下一步的实验。
实施例4
以3孔共培养支架对4种细胞的共培养的为例：
如图2所示，一种多种细胞共培养支架，该支架包括支架面1和与所述支架面1连接的支撑架2，所述的支架面1上开设有固定孔3，所述的支架面1可以在边缘处与所述的支撑架2连接。所述的固定孔3的边缘处设有开口槽31。所述的固定孔为3个。所述的开口槽31为3个。所述的支撑架2的高度为为19mm。
如图3所示，一种多种细胞共培养装置，该装置包括培养皿4和放置于培养皿中的共培养支架，该共培养支架包括支架面和与所述支架面连接的支撑架，所述的支架面上开设有固定孔。所述的固定孔的边缘处设有开口槽。该装置还包括有培养小室。所述的培养小室为一小盒，且小盒的边缘处设有与所述开口槽匹配的固定装置。
上述的培养皿可采用美国corning公司直径10厘米，高度为2厘米或同等规格的培养皿；培养小室采用millipore公司悬挂式培养小室。由于本发明培养支架的支撑架的高度设计为19mm，因此将载有培养小室的培养支架放入培养皿中，该培养小室底部与培养皿底部留有一定距离，彼此之间不会直接接触。所述的培养皿、共培养支架和悬挂式培养小室则成为一个可进行多种细胞共同培养的共培养体系，每个悬挂式培养小室内可分别加入不同种类的细胞（可为贴壁细胞或悬浮细胞）。以下对4种细胞共同培养进行说明。
首先，将3种不同种类的细胞（可为贴壁细胞或悬浮细胞），如肝细胞、巨噬细胞和星状细胞各放入共培养支架的培养小室中，再将该支架放入培养皿中，将整个共培养体系置于细胞培养箱中培养一段时间（6个小时或过夜培养），使贴壁细胞充分贴壁（每种细胞的生长特性不同导致贴壁时间有一定差异）。培养小室内可加入2到3毫升的液体，以密度为1×107/毫升的细胞为例，可加入2至3×107个细胞，适于需要大量细胞的实验。此时各培养小室之间细胞独立生长，培养液也不互相连通。
其次，将第4种细胞血窦内皮细胞（可为贴壁细胞或悬浮细胞）置于另一培养皿内生长，使贴壁细胞充分贴壁（每种细胞的生长特性不同导致贴壁时间有一定差异）。
再次，待贴壁细胞贴壁后，移除多余的培养液，将3孔共培养支架和生长有3种细胞的悬挂式培养小室组装在生长有第4种细胞培养皿中，加入新鲜培养液，高度使其能够没过悬挂式培养小室的底部。由于悬挂式培养小室的底部有不同大小的小孔，可允许液体自由通过，而细胞不能通过，因此，4种细胞即可通过培养液互相连通，处于同一生长环境中。此时定义为4种细胞共培养开始的时间，根据不同研究者的需求，在培养液中加入外源性干预因子。
实验结束后，根据研究者要求，可以收取共培养体系的上清，观察共培养体系中分泌性蛋白的变化；将不同的悬挂式培养皿取出，分别收取4种不同细胞，用于下一步的实验。
与上述三孔共培养支架及共培养装置类似，四孔共培养支架可应用于4种或5种细胞的共同培养，本发明共培养支架与共培养装置可拓展应用于5种以上细胞的共同培养。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
Claims (10)
1.多种细胞共培养支架，其特征在于，该支架包括支架面和与所述支架面连接的支撑架，所述的支架面上开设有固定孔。
2.根据权利要求1所述的多种细胞共培养支架，其特征在于，所述的支架面边缘处连接有支撑架。
3.根据权利要求1或2所述的多种细胞共培养支架，其特征在于，所述的固定孔的边缘处设有开口槽。
4.根据权利要求1所述的多种细胞共培养支架，其特征在于，所述的固定孔至少为2个。
5.根据权利要求3所述的多种细胞共培养支架，其特征在于，所述的开口槽为3个。
6.根据权利要求1所述的多种细胞共培养支架，其特征在于，所述的支撑架的高度为为17-20mm。
7.多种细胞共培养装置，其特征在于，该装置包括培养皿和放置于培养皿中的多细胞共培养支架，该多细胞共培养支架包括支架面和与所述支架面连接的支撑架，所述的支架面上开设有固定孔。
8.根据权利要求7所述的多种细胞共培养装置，其特征在于，所述的固定孔的边缘处设有开口槽。
9.根据权利要求8所述的多种细胞共培养装置，其特征在于，该装置还包括有培养小室。
10.根据权利要求8所述的多种细胞共培养装置，其特征在于，所述的多细胞共培养支架的高度大于所述培养小室的高度，而小于所述的培养皿的高度。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20130306 |