CN106119108A - 双层流动腔系统力学微环境下HSCs与EPCs分层共培养工具和方法 - Google Patents

双层流动腔系统力学微环境下HSCs与EPCs分层共培养工具和方法 Download PDF

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Abstract

本发明通过独特双层流动腔系统力学微环境下HSCs与EPCs分层共培养工具，构建了Epc(内皮祖细胞)和Hsc(肝形状细胞)共培养用细胞培养小室以及与之配合的孵育盒，公开了一种双层流动腔系统力学微环境下HSCs与EPCs分层共培养方法，解决了两种细胞分层培育的难题，分层共培养方法使不同处理因素的细胞，在相同实验条件下同时进行实验，最大程度地保证了实验结果的准确性和稳定性。

Description

双层流动腔系统力学微环境下HSCs与EPCs分层共培养工具和 方法
技术领域
本发明涉及一种细胞培养的工具和方法，具体地说，是基于模拟体内力学微环境的双层流动腔系统力学微环境下HSCs与EPCs分层共培养工具和方法。
背景技术
在生物学研究领域，通常利用生物力学、细胞生物学和分子生物学等学科的方法和技术培养细胞，研究细胞的各种生长变化及凋亡等过程，以探究生物细胞的演变。但是在现在的细胞培养存在一些缺陷，主要是体外实验中细胞培养与体内细胞生存环境具有很大差异，导致实验结果与实际人体表现差异巨大。比如，在肝纤维化的发生和转归过程中起重要作用的两种细胞HSCs和EPCs，两者在体内环境中是紧密接触、相互影响的，两者间的相互作用不仅是分子水平的各种物质相互影响，体内力学微环境也对其具有重要影响。
目前的细胞培养方法不能模拟这种独特的体内力学微环境，也没有与这种体内力学微环境相符的细胞培养工具，细胞不在这种独特环境中生长也就无法得出符合实际的实验结果。本发明要解决的正是利用生物力学、细胞生物学和分子生物学等学科的方法和技术，对HSCs及骨髓来源EPCs共培养模型行切应力处理，以模拟体内力学微环境，研究流体切应力条件下，肝纤维化的发生和转归过程中起重要作用的两种细胞HSCs及EPCs间的相互作用，使研究人员能够以符合实际的生物力学角度的细胞培养结果研究、揭示肝纤维化、门脉高压症的发病与转归机制，进而为临床治疗提供一种崭新的思路。
发明内容
本发明的目的在于克服上述传统技术的不足之处，提供一种基于模拟体内力学微环境的双层流动腔系统力学微环境下HSCs与EPCs的培养方法。
本发明的目的是通过以下技术措施来达到的：
双层流动腔系统力学微环境下HSCs与EPCs分层共培养工具，其特征在于：包括孵育盒、盒盖和细胞培养小室，所述细胞培养小室包括桶形的体部，所述体部的底部设有Biopore膜，所述体部的顶部设有伸向外周的悬挂齿，所述孵育盒上设有正置凹洞和倒置凹洞，所述正置凹洞的半径大于细胞培养小室的体部半径且小于悬挂齿最外端至体部中心的半径；所述倒置凹洞半径大于悬挂齿最外端至体部中心的半径。细胞培养小室采用透明的Biopore膜，Biopore膜即聚碳酸酯通透膜，可直接透过膜观察细胞；Biopore膜与细胞和荧光染色相容，方便用于SEM和TEM技术；Biopore膜经过组织培养基处理有助于细胞的贴壁。与塑料培养板上的细胞相比较，生长在插入式细胞培养小室中Biopore膜上的细胞更能代表其体内状态。细胞培养小室可以正置于正置凹洞中，或者将小室反转，倒置于倒置凹洞内，实现小室上Biopore膜的双面两种细胞分层共同种植培养。
作为一种优选方案，所述孵育盒上的正置凹洞和倒置凹洞分别设有若干个。一个正置凹洞和一个倒置凹洞组成一组，孵育盒内同时设置多组。一个孵育盒内设置多组凹洞，方便同时进行多组细胞培育，并使多组培育的细胞处于完全相同的培育环境中，方便观察与比较细胞生长状况及两组细胞间相互影响。
双层流动腔系统力学微环境下HSCs与EPCs分层共培养方法，该方法包括以下步骤：
A.EPCs的单独培养；
B.HSCs的单独培养；
C.孵育盒预处理；
D.种植EPCs：将EGM-2完全培养液、0.25％胰蛋白酶和1×PBS置于37℃水浴槽预热，预热后用酒精消毒转移至超净台；将预处理好后的孵育盒置于超净台中，孵育盒中加入适量EGM-2完全培养液；吸取0.25％胰蛋白酶加入EPCs培养瓶中进行消化，30秒后倒掉胰蛋白酶，显微镜下观察细胞呈单个分离状态时转移至超净台，加EGM-2完全培养液终止消化，吹打至镜下观察细胞全部与培养瓶分离后，将EPCs细胞均匀接种到细胞培养小室的Biopore膜的底面；
E.在超净台中，将种植好EPCs的细胞培养小室倒置于孵育盒的倒置凹洞中，封闭孵育盒，静置30分钟；
F.种植HSCs：将细胞培养小室取出，将其正置于孵育盒的正置凹洞中；用DMEM高糖和EGM-2完全培养液吹打HSCs培养瓶中的HSCs细胞，将悬浮的HSCs细胞接种在细胞培养小室的Biopore膜的正面，盖上盒盖封闭孵育盒，静置30分钟；
G.将共培养EPCs和HSCs细胞的孵育盒作通气处理后，置于培养箱培养；每天观察细胞生长状况，2-3天后换液；
F.换液后，显微镜下观察共培养细胞的生长状况，达到细胞集落相对密集，形态典型，细胞生长良好的要求时，将共培养细胞的细胞培养小室取出，固定于流槽上，置于双层流动腔系统力学微环境下流6-24小时。
进一步地说，该方法中步骤A.EPCs的单独培养包括以下步骤：
A1.EPCs原代培养；
A2.EPCs细胞传代。
5.根据权利要求4所述的双层流动腔系统力学微环境下HSCs与EPCs分层共培养方法，该方法中步骤A1.EPCs原代培养包括以下步骤：
A1.1.SD大鼠颈椎脱臼处死，置入1000ml大烧杯内，以75％的酒精浸泡15分钟；
A1.2.将大鼠从酒精中取出置于托盘上，用高压消毒处理好的剪刀、止血钳无菌条件下取大鼠四肢，将取下的大鼠四肢置于含75％酒精的玻璃平皿内浸泡后将其转移入超净台内；
A1.3.将用锡纸包裹的蛙板于超净台内打开，大鼠四肢置于蛙板上；用剪刀、手术刀将大鼠四肢肌肉组织剔除，将剔出的大鼠四肢长骨放入含1×PBS的玻璃平皿内；
A1.4.去除长骨两端骨骺，置于另一玻璃平皿内；
A1.5.用刻度吸管吸取PBS冲洗长骨，后用注射器插入长骨骨髓腔反复冲洗，至长骨骨髓腔变白；
A1.6.将冲洗出的液体用胶头滴管吹打混匀，置离心机1100rpm/min离心5分钟；
A1.7.弃上清，加PBS吹打均匀，置离心机1100rpm/min离心5分钟；
A1.8.弃上清，加3mlPBS吹打均匀，吹打成单个细胞制成细胞悬液；
A1.9.取15ml离心管，底层加入梯度离心液4ml；将细胞悬液3ml加在梯度离心液上层，形成双层液，两层液体不能混合；置离心机梯度离心700g 23℃,离心25分钟；
A1.10.取培养瓶，以Fn液打底后放于含5％CO2的37℃培养箱内；
A1.11.梯度离心结束后，吸取中间云雾状乳白色层液体，置于离心管内，加入PBS吹打均匀清洗两次，第一次吹打清洗后置离心机1300rpm/min，离心5分钟，第二次1100rpm/min，离心5分钟；
A1.12.从培养箱中取出培养瓶吸走Fn液；在培养瓶侧壁上标明细胞名称、传代时间及操作者；
A1.13.将上述清洗离心结束后所得EPCs细胞用EGM-2培养液重悬后置入培养瓶，每瓶约4ml重悬液，放于培养箱内孵育；
A1.14.培养4天后观察换液。
进一步地说，该方法中步骤A2.EPCs细胞传代包括以下步骤：
观察EPCs细胞铺满至细胞培养瓶底面积的90％时进行传代：
A2.1.将EGM-2完全培养液、0.25％胰蛋白酶和1×PBS置于37℃水浴槽预热，预热后用酒精消毒，然后转移至超净台；
A2.2.取出EPCs培养瓶，拧紧瓶盖转移至超净工作台内，弃培养液，用胶头滴管吸取1×PBS入培养瓶，轻晃培养瓶后倒掉，重复两次；
A2.3.吸取0.25％胰蛋白酶进行消化，30秒后倒掉胰蛋白酶，显微镜下观察EPCs细胞呈单个分离状态时，转移至超净台，加EGM-2完全培养液终止消化；
A2.4.吹打直至镜下观察EPCs细胞全部与培养瓶分离；
A2.5.将EPCs细胞均匀接种到另一培养瓶里；
A2.6.在培养瓶侧壁上标明细胞名称、传代时间及操作者；
A2.7.拧松瓶盖放入含5％CO2的37℃培养箱内培养；
A2.8.待EPCs细胞铺满至细胞培养瓶底面积的90％时再次传代。
进一步地说，该方法中步骤B.HSCs的单独培养包括以下步骤：
B1.从液氮中复苏的HSC-T6细胞株，将其取出后立即放置在37摄氏度水中待其融化；
B2.置离心机1000rpm/min，离心5分钟，离心细胞取沉淀，加1×PBS洗1-2次；
B3.用DMEM高糖轻柔吹打细胞；
B4.将悬浮的细胞放置在HSCs培养瓶，置于培养箱培养；2-3天后换液或传代。
进一步地说，该方法中步骤C.孵育盒预处理包括以下步骤：
用流动的水将孵育盒洗净，泡酸，按常规清洗步骤清洗后，置于75％酒精中，使用前取出，紫外线照1-2小时，备用。
泡酸时，如果是新配制的酸泡2到3个小时，旧酸则须多泡2-3个小时。
本发明中涉及材料说明如下。
EGM-2完全培养液：将生长因子依次加入500ml EBM培养液中，注意装生长因子的小管最好也用培养液清洗2次，最大程度的获得生长因子，加入25ml原装胎牛血清后，再加入30ml hyclone胎牛血清，吹打混匀，分装，存于-20℃。
Fn液：Fn即人纤维连接蛋白，Fn液配制方法取5mg人纤维连接蛋白粉末，即FN，加入100ml高压处理过的三蒸水，培养箱内温育20分钟后，分装存于-20℃。
PBS是磷酸缓冲盐溶液的简称，一般的有活性的生物制剂都要用它来稀释。1×PBS是1倍量的PBS。
0.25％胰蛋白酶即0.25％浓度胰蛋白酶溶液。
DMEM高糖是指高糖型DMEM培养基。DMEM是一种含各种氨基酸和葡萄糖的培养基，是在MEM培养基的基础上研制的。DMEM与MEM比较增加了各种成分用量，同时又分为高糖型和低糖型。高糖型DMEM有利于细胞停泊于一个位置生长，适于生长较快、附着较困难肿瘤细胞等。
SD大鼠为大鼠的一个品系，其毛色白化，广泛用于药理、毒理、药效及GLP实验。
本发明公开的HSCs与EPCs分层共培养方法是采用特别设计的双层流动腔系统力学微环境下HSCs与EPCs分层共培养工具才能实现的，以分层共培养工具的Biopore膜正反面接种不同的细胞，放置于相同的环境中，使两种细胞在接近于正常组织环境中发生相互作用，从而观察其生长转归，对于揭示肝纤维化、门脉高压症的发病与转归机制有重要启示。
由于采用了上述技术方案，与现有技术相比，本发明的优点是：
本发明通过独特双层流动腔系统力学微环境下HSCs与EPCs分层共培养工具，构建了Epc(内皮祖细胞)和Hsc(肝形状细胞)共培养用细胞培养小室以及与之配合的孵育盒，通过双层流动腔系统力学微环境下HSCs与EPCs分层共培养方法解决了两种细胞分层培育的难题。
1.孵育盒既能合适放置正置和倒置的细胞培养小室，避免了细胞污染；
2.分层共培养工具和分层共培养方法保证了细胞正常生长所需的微环境；
3.孵育盒能同时放置多个小室进行细胞培养，最大程度的节约使用细胞和培养液；
4.分层共培养方法使不同处理因素的细胞，在相同实验条件下同时进行实验，最大程度地保证了实验结果的准确性和稳定性。
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步说明。
附图说明
附图1是本发明双层流动腔系统力学微环境下HSCs与EPCs分层共培养工具的结构示意图。
具体实施方式
实施例1：如附图1所示，双层流动腔系统力学微环境下HSCs与EPCs分层共培养工具，包括孵育盒1、盒盖和细胞培养小室7，所述细胞培养小室7包括桶形的体部5，所述体部5的底部设有Biopore膜4，所述体部5的顶部设有伸向外周的悬挂齿6，所述孵育盒1上设有正置凹洞2和倒置凹洞3，所述正置凹洞2的半径大于细胞培养小室7的体部5半径且小于悬挂齿6最外端至体部5中心的半径；所述倒置凹洞3半径大于悬挂齿6最外端至体部5中心的半径。细胞培养小室7采用透明的Biopore膜4，可直接透过膜观察细胞；Biopore膜4与细胞和荧光染色相容，方便用于SEM和TEM技术；Biopore膜经过组织培养基处理有助于细胞的贴壁。与塑料培养板上的细胞相比较，生长在插入式细胞培养小室7中Biopore膜4上的细胞更能代表其体内状态。细胞培养小室7可以正置于正置凹洞2中，或者将小室反转，倒置于倒置凹洞3内，实现小室上Biopore膜的双面两种细胞分层共同种植培养。附图中未示出盒盖。
如附图1所示，所述孵育盒1上的正置凹洞2和倒置凹洞3分别设有若干个。一个正置凹洞2和一个倒置凹洞3组成一组，孵育盒1内同时设置多组。一个孵育盒1内设置多组凹洞，方便同时进行多组细胞培育，并使多组培育的细胞处于完全相同的培育环境中，方便观察与比较细胞生长状况及两组细胞间相互影响。
实施例2：双层流动腔系统力学微环境下HSCs与EPCs分层共培养方法，该方法包括以下步骤：
A.EPCs的单独培养，包括A1.EPCs原代培养和A2.EPCs细胞传代，
其中，步骤A1.EPCs原代培养包括：
A1.1.SD大鼠颈椎脱臼处死，置入1000ml大烧杯内，以75％的酒精浸泡15分钟；
A1.2.将大鼠从酒精中取出置于托盘上，用高压消毒处理好的剪刀、止血钳无菌条件下取大鼠四肢，将取下的大鼠四肢置于含75％酒精的玻璃平皿内浸泡后将其转移入超净台内；
A1.3.将用锡纸包裹的蛙板于超净台内打开，大鼠四肢置于蛙板上；用剪刀、手术刀将大鼠四肢肌肉组织剔除，将剔出的大鼠四肢长骨放入含1×PBS的玻璃平皿内；
A1.4.去除长骨两端骨骺，置于另一玻璃平皿内；
A1.5.用刻度吸管吸取PBS冲洗长骨，后用注射器插入长骨骨髓腔反复冲洗，至长骨骨髓腔变白；
A1.6.将冲洗出的液体用胶头滴管吹打混匀，置离心机1100rpm/min离心5分钟；
A1.7.弃上清，加PBS吹打均匀，置离心机1100rpm/min离心5分钟；
A1.8.弃上清，加3mlPBS吹打均匀，吹打成单个细胞制成细胞悬液；
A1.9.取15ml离心管，底层加入梯度离心液4ml；将细胞悬液3ml加在梯度离心液上层，形成双层液，两层液体不能混合；置离心机梯度离心700g 23℃,离心25分钟；
A1.10.取培养瓶，以Fn液打底后放于含5％CO2的37℃培养箱内；
A1.11.梯度离心结束后，吸取中间云雾状乳白色层液体，置于离心管内，加入PBS吹打均匀清洗两次，第一次吹打清洗后置离心机1300rpm/min，离心5分钟，第二次1100rpm/min，离心5分钟；
A1.12.从培养箱中取出培养瓶吸走Fn液；在培养瓶侧壁上标明细胞名称、传代时间及操作者；
A1.13.将上述清洗离心结束后所得EPCs细胞用EGM-2培养液重悬后置入培养瓶，每瓶约4ml重悬液，放于培养箱内孵育；
A1.14.培养4天后观察换液。
步骤A2.EPCs细胞传代包括：
观察EPCs细胞铺满至细胞培养瓶底面积的90％时进行传代：
A2.1.将EGM-2完全培养液、0.25％胰蛋白酶和1×PBS置于37℃水浴槽预热，预热后用酒精消毒，然后转移至超净台；
A2.2.取出EPCs培养瓶，拧紧瓶盖转移至超净工作台内，弃培养液，用胶头滴管吸取1×PBS入培养瓶，轻晃培养瓶后倒掉，重复两次；
A2.3.吸取0.25％胰蛋白酶进行消化，30秒后倒掉胰蛋白酶，显微镜下观察EPCs细胞呈单个分离状态时，转移至超净台，加EGM-2完全培养液终止消化；
A2.4.吹打直至镜下观察EPCs细胞全部与培养瓶分离；
A2.5.将EPCs细胞均匀接种到另一培养瓶里；
A2.6.在培养瓶侧壁上标明细胞名称、传代时间及操作者；
A2.7.拧松瓶盖放入含5％CO2的37℃培养箱内培养；
A2.8.待EPCs细胞铺满至细胞培养瓶底面积的90％时再次传代。
B.HSCs的单独培养，包括以下步骤：
B1.从液氮中复苏的HSC-T6细胞株，将其取出后立即放置在37摄氏度水中待其融化；HSC-T6细胞株可以购自湘雅医学院中心实验室。
B2.置离心机1000rpm/min，离心5分钟，离心细胞取沉淀，加1×PBS洗1-2次；
B3.用DMEM高糖轻柔吹打细胞；
B4.将悬浮的细胞放置在HSCs培养瓶，置于培养箱培养；2-3天后换液或传代。
C.孵育盒预处理，包括以下步骤：
用流动的水将孵育盒洗净，泡酸，按常规清洗步骤清洗后，置于75％酒精中，使用前取出，紫外线照1-2小时，备用。泡酸时，如果是新配制的酸泡2到3个小时，旧酸则须多泡2-3个小时。
D.种植EPCs：将EGM-2完全培养液、0.25％胰蛋白酶和1×PBS置于37℃水浴槽预热，预热后用酒精消毒转移至超净台；将预处理好后的孵育盒置于超净台中，孵育盒中加入适量EGM-2完全培养液；吸取0.25％胰蛋白酶加入EPCs培养瓶中进行消化，30秒后倒掉胰蛋白酶，显微镜下观察细胞呈单个分离状态时转移至超净台，加EGM-2完全培养液终止消化，吹打至镜下观察细胞全部与培养瓶分离后，将EPCs细胞均匀接种到细胞培养小室的Biopore膜的底面；
E.在超净台中，将种植好EPCs的细胞培养小室倒置于孵育盒的倒置凹洞中，封闭孵育盒，静置30分钟；
F.种植HSCs：将细胞培养小室取出，将其正置于孵育盒的正置凹洞中；用DMEM高糖和EGM-2完全培养液吹打HSCs培养瓶中的HSCs细胞，将悬浮的HSCs细胞接种在细胞培养小室的Biopore膜的正面，盖上盒盖封闭孵育盒，静置30分钟；
G.将共培养EPCs和HSCs细胞的孵育盒作通气处理后，置于培养箱培养；每天观察细胞生长状况，2-3天后换液；
F.换液后，显微镜下观察共培养细胞的生长状况，达到细胞集落相对密集，形态典型，细胞生长良好的要求时，将共培养细胞的细胞培养小室取出，固定于流槽上，置于双层流动腔系统力学微环境下流6-24小时。
按照不同的实验要求，置于双层流动腔系统力学微环境下流6-24小时后，就可以检测相关指标。本发明公开的试验方法能够实现模拟体内力学微环境，研究流体切应力条件下，肝纤维化的发生和转归过程中起重要作用的两种细胞HSCs及EPCs间的相互作用，使研究人员能够以符合实际的生物力学角度的细胞培养结果研究、揭示肝纤维化、门脉高压症的发病与转归机制，进而为临床治疗提供一种崭新的思路。

Claims (8)

1.双层流动腔系统力学微环境下HSCs与EPCs分层共培养工具，其特征在于：包括孵育盒、盒盖和细胞培养小室，所述细胞培养小室包括桶形的体部，所述体部的底部设有Biopore膜，所述体部的顶部设有伸向外周的悬挂齿，所述孵育盒上设有正置凹洞和倒置凹洞，所述正置凹洞的半径大于细胞培养小室的体部半径且小于悬挂齿最外端至体部中心的半径；所述倒置凹洞半径大于悬挂齿最外端至体部中心的半径。
2.根据权利要求1所述的双层流动腔系统力学微环境下HSCs与EPCs分层共培养工具，其特征在于：所述孵育盒上的正置凹洞和倒置凹洞分别设有若干个。
3.双层流动腔系统力学微环境下HSCs与EPCs分层共培养方法，该方法包括以下步骤：
A.EPCs的培养；
B.HSCs的培养；
C.孵育盒预处理；
D.种植EPCs：将EGM-2完全培养液、0.25％胰蛋白酶和1×PBS置于37℃水浴槽预热，预热后用酒精消毒转移至超净台；将预处理好后的孵育盒置于超净台中，孵育盒中加入适量EGM-2完全培养液；吸取0.25％胰蛋白酶加入EPCs培养瓶中进行消化，30秒后倒掉胰蛋白酶，显微镜下观察细胞呈单个分离状态时转移至超净台，加EGM-2完全培养液终止消化，吹打至镜下观察细胞全部与培养瓶分离后，将EPCs细胞均匀接种到细胞培养小室的Biopore膜的底面；
E.在超净台中，将种植好EPCs的细胞培养小室倒置于孵育盒的倒置凹洞中，封闭孵育盒，静置30分钟；
F.种植HSCs：将细胞培养小室取出，将其正置于孵育盒的正置凹洞中；用DMEM高糖和EGM-2完全培养液吹打HSCs培养瓶中的HSCs细胞，将悬浮的HSCs细胞接种在细胞培养小室的Biopore膜的正面，盖上盒盖封闭孵育盒，静置30分钟；
G.将共培养EPCs和HSCs细胞的孵育盒作通气处理后，置于培养箱培养；每天观察细胞生长状况，2-3天后换液；
F.换液后，显微镜下观察共培养细胞的生长状况，达到细胞集落相对密集，形态典型，细胞生长良好的要求时，将共培养细胞的细胞培养小室取出，固定于流槽上，置于双层流动腔系统力学微环境下流6-24小时。
4.根据权利要求3所述的双层流动腔系统力学微环境下HSCs与EPCs分层共培养方法，该方法中步骤A.EPCs的培养包括以下步骤：
A1.EPCs原代培养；
A2.EPCs细胞传代。
5.根据权利要求4所述的双层流动腔系统力学微环境下HSCs与EPCs分层共培养方法，该方法中步骤A1.EPCs原代培养包括以下步骤：
A1.1.SD大鼠颈椎脱臼处死，置入1000ml大烧杯内，以75％的酒精浸泡15分钟；
A1.2.将大鼠从酒精中取出置于托盘上，用高压消毒处理好的剪刀、止血钳无菌条件下取大鼠四肢，将取下的大鼠四肢置于含75％酒精的玻璃平皿内浸泡后将其转移入超净台内；
A1.3.将用锡纸包裹的蛙板于超净台内打开，大鼠四肢置于蛙板上；用剪刀、手术刀将大鼠四肢肌肉组织剔除，将四肢长骨放入含1×PBS的玻璃平皿内；
A1.4.去除四肢长骨两端骨骺，置于另一玻璃平皿内；
A1.5.用刻度吸管吸取PBS冲洗骨头，后用注射器插入骨髓腔反复冲洗，直至骨髓腔变白；
A1.6.将冲洗出的液体用胶头滴管吹打混匀，置离心机1100rpm/min离心5分钟；
A1.7.弃上清，加PBS吹打均匀，置离心机1100rpm/min离心5分钟；
A1.8.弃上清，加3mlPBS吹打均匀，吹打成单个细胞制成细胞悬液；
A1.9.取15ml离心管，底层加入梯度离心液4ml；将细胞悬液3ml加在梯度离心液上层，形成双层液，两层液体不能混合；置离心机梯度离心700g 23℃,离心25分钟；
A1.10.取培养瓶，以Fn液打底后放于含5％CO2的37℃培养箱内；
A1.11.梯度离心结束后，吸取中间云雾状乳白色层液体，置于离心管内，加入PBS吹打均匀清洗两次，第一次吹打清洗后置离心机1300rpm/min，离心5分钟，第二次1100rpm/min，离心5分钟；
A1.12.从培养箱中取出培养瓶吸走Fn；在培养瓶侧壁上标明细胞名称、传代时间及操作者；
A1.13.将上述清洗离心结束后所得EPCs细胞用EGM-2培养液重悬后置入培养瓶，每瓶约4ml重悬液，放于培养箱内孵育；
A1.14.培养4天后观察换液。
6.根据权利要求5所述的双层流动腔系统力学微环境下HSCs与EPCs分层共培养方法，该方法中步骤A2.EPCs细胞传代包括以下步骤：
观察EPCs细胞铺满至细胞培养瓶底面积的90％时进行传代：
A2.1.将EGM-2完全培养液、0.25％胰蛋白酶和1×PBS置于37℃水浴槽预热，预热后用酒精消毒，然后转移至超净台；
A2.2.取出EPCs培养瓶，拧紧瓶盖转移至超净工作台内，弃培养液，用胶头滴管吸取1×PBS入培养瓶，轻晃培养瓶后倒掉，重复两次；
A2.3.吸取0.25％胰蛋白酶进行消化，30秒后倒掉胰蛋白酶，显微镜下观察EPCs细胞呈单个分离状态时，转移至超净台，加EGM-2完全培养液终止消化；
A2.4.吹打直至镜下观察EPCs细胞全部与培养瓶分离；
A2.5.将EPCs细胞均匀接种到培养瓶里；
A2.6.在培养瓶侧壁上标明细胞名称、传代时间及操作者；
A2.7.拧松瓶盖放入含5％CO2的37℃培养箱内培养；
A2.8.待EPCs细胞铺满至细胞培养瓶底面积的90％时再次传代。
7.根据权利要求3所述的双层流动腔系统力学微环境下HSCs与EPCs分层共培养方法，该方法中步骤B.HSCs的培养包括以下步骤：
B1.从液氮中复苏的HSC-T6细胞株，将其取出后立即放置在37摄氏度水中待其融化；
B2.置离心机1000rpm/min，离心5分钟，离心细胞取沉淀，加1×PBS洗1-2次；
B3.用DMEM高糖轻柔吹打细胞；
B4.将悬浮的细胞放置在HSCs培养瓶，置于培养箱培养；2-3天后换液或传代。
8.根据权利要求3所述的双层流动腔系统力学微环境下HSCs与EPCs分层共培养方法，该方法中步骤C.孵育盒预处理包括以下步骤：
用流动的水将孵育盒洗净，泡酸，按常规清洗步骤清洗后，置于75％酒精中，使用前取出，紫外线照1-2小时，备用。
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