CN106987557A - 一种人皮肤多能干细胞(SKPs)培养的改良方法 - Google Patents
一种人皮肤多能干细胞(SKPs)培养的改良方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种皮肤多能干细胞的培养方法及其应用,步骤如下:(1)取皮肤的真皮层组织,剪碎,胶原酶消化,解离,离心去上清,得细胞;(2)取步骤(1)得到的细胞,采用贴壁培养基进行贴壁培养细胞,获得成纤维细胞;(3)取步骤(2)得到的成纤维细胞,悬浮培养基重悬,接种至Poly‑HEMA包被的培养瓶中培养,即可。采用本发明方法可以有效培养得到皮肤多能干细胞,而且获得细胞数量多,培养周期短,成本较传统方法低廉,应用前景良好。
Description
技术领域
本发明属于细胞培养领域,具体是一种人皮肤多能干细胞(SKPs)培养的改良方法。
背景技术
皮肤多能干细胞(skin-derived precursors,SKPs),它有类似胚胎神经干细胞特性,能够分化成各种神经和中胚层细胞表现型,包括周围神经元、神经胶质细胞、平滑肌细胞、骨、软骨和脂细胞等。
SKPs经过连续长期传代细胞培养仍具有高度增殖活性和多向分化潜能,提示其性能稳定,可望成为细胞替代治疗较为理想的种子细胞。另皮肤是人体最大的器官,而且也是机体内自我更新和再生修复速度最快的组织之一,取材简单方便,来源充足,对供者无明显不利影响,便于自体移植治疗且无伦理问题的限制。因此,这种SKPs越来越受到的科学家的关注,被认为有望在脊髓及神经系统疾病治疗发面发挥重要作用。
但是采用现有目前的方法分离培养皮肤多能干细胞,由于其数量少,培养周期长,费用高,研究及应用受限,需要进行改进。如,Jeffrey A Biernaskie1等,Isolation ofskin-derived precursors(SKPs)and differentiation and enrichment of theirSchwann cell progeny,NATURE PROTOCOLS VOL.1,NO.6,2006,2803公开了一种皮肤多能干细胞的培养方法,采用该文献公开的方法培养,需要2-4周时间才能培养得到皮肤多能干细胞,且获得细胞数量较少。
发明内容
为了解决上述问题,本发明提供了一种新的、培养周期短的SKPs培养方法。
本发明皮肤多能干细胞的培养方法,步骤如下:
(1)取皮肤的真皮层组织,剪碎,胶原酶消化,解离,离心去上清,得细胞;
(2)取步骤(1)得到的细胞,采用贴壁培养基进行贴壁培养细胞,获得成纤维细胞;
(3)取步骤(2)得到的成纤维细胞,悬浮培养基重悬,接种至Poly-HEMA包被的培养瓶中培养,即可。
步骤(1)中,所述取皮肤真皮层组织的方法是:取皮肤,消毒,冲洗,剔除皮下脂肪层,保留真皮及表皮层;剪成小块,用0.25%胰酶在4℃冰箱中过夜;用等体积含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基终止消化,冲洗,表皮在冲洗的过程中被脱离、洗去,未分离的表皮使用镊子分离去除,得真皮组织。
步骤(1)中,剪碎是剪为2-3mm2/片;
步骤(1)中,所述胶原酶消化采用的是浓度1mg/ml的胶原酶溶液,消化的条件是37℃孵箱中2-3h;所述胶原酶为I型胶原酶。
步骤(2)中,所述获得成纤维细胞的方式是:
培养至细胞融合至80-90%时,胰酶消化,离心去上清,收集细胞,即为成纤维细胞;
或者是,培养至细胞融合至80-90%时,胰酶消化,离心去上清,收集细胞,传代培养,传代次数为2-10次,得细胞悬液,离心去上清,收集细胞,即可。
步骤(2)中,所述获得成纤维细胞的方式是:取前述方法获得的成纤维细胞,冻存,解冻,培养,即可;
所述冻存保存液是含有10%DMSO和20%FBS的DMEM溶液;
所述解冻是放入37℃水槽,使其在1分钟内全部融化;
所述培养的方式是:取出解冻之细胞悬浮液,加入9倍量的贴壁培养基进行贴壁培养,直至细胞融合至80-90%,胰酶消化。
所述贴壁培养基是添加有1%的青/链霉素双抗和10%胎牛血清的DMEM高糖培养基;培养的方法是:置于7℃,5%CO2,95%O2条件下培养,每3天换液一次。
胰酶消化是加入0.1%胰酶消化2min,消化的温度37℃;采用10%FBS的DMEM培养基终止消化。
步骤(3)中,所述悬浮培养基是DMEM高糖培养基+F12营养添加物(3:1)+40ng/mlFGF2+20ng/ml EGF+2%B27+1%双抗;
步骤(3)中,每3-4天加一次液,每次加1-2ml DMEM/F12培养基及所有生长因子添加物,保持培养基中含有40ng/ml bFGF、20ng/ml EGF及2%B27。
本发明还提供了前述方法制备得到的皮肤多能干细胞。
本发明还提供了前述皮肤多能干细胞在制备预防光老化的药物、化妆品或者日化用品中的用途。
本方法先扩增真皮中成纤维细胞(Fibroblasts,FBs)的数量,再转化培养SKPs,获得的细胞与传统方法培养的SKPs有相同形态,表达相同的蛋白标记,且具有多向分化能力,提高了细胞的获得量,缩短了培养周期,降低了费用,有利于SKPs研究的进一步展开,应用前景广阔。
显然,根据本发明的上述内容,按照本领域的普通技术知识和惯用手段,在不脱离本发明上述基本技术思想前提下,还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式,对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1本方法培养的FBs细胞
图2本方法培养的SKPs细胞
图3现有方法培养的SKPs细胞
图4本方法培养的SKPs表达传统方法培养的SKPs相关标记物
图5SKPs成骨诱导分化
图6SKPs成脂诱导分化
图7传统方法培养的SKPs相关标记物
图8本发明方法与传统方法不同时间培养的SKPs的比较
图9本方法SKPs长期保存
图10不同组别裸鼠皮肤外观及、VC98局部成像、HE及Masson染色
具体实施方式
主要仪器及试剂:
实施例1本发明皮肤多能干细胞的培养方法
1皮肤真皮贴壁细胞培养及扩增,即FBs的培养和扩增
1.1取新鲜人包皮标本,75%酒精消毒,用PBS冲洗3次后剔除皮下脂肪层,保留真皮及表皮层。
1.2将皮肤剪成5×5mm2/片,用0.25%胰酶在4℃冰箱中过夜。
1.3用等体积含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培养基终止消化,用PBS冲洗两遍。表皮在冲洗的过程中被脱离、洗去,未分离的表皮使用镊子手工分离去除。
1.4将真皮组织剪为2-3mm2/片,加入1mg/mL的I型胶原酶,置于37℃孵箱中2-3h,致组织几乎完全消化,加入5倍体积的DMEM高糖培养基终止消化。
1.5用1000μl枪头反复吹打,机械解离细胞。收集上清液,用40μm的滤网滤过。滤过液以2000rpm的速度离心8分钟。
1.6弃上清,用贴壁培养基(DMEM高糖培养基+10%胎牛血清+1%双抗)重悬细胞,按50000个/ml的密度接种细胞于培养板上,置于孵育箱中(37℃,5%CO2,95%O2)。
1.7 24-48小时观察细胞是否贴壁,每3天换液,培养1周左右至细胞融合至80-90%。
1.8弃培养基,用PBS清洗两遍,加入0.1%胰酶消化2min(37℃),后用等体积含10%FBS的DMEM培养基终止消化,收集细胞悬液,以2000rpm的速度离心8分钟,收集沉淀(此处得到的细胞为成纤维细胞[FBs细胞],其形态如图1所示);可传代培养,按50000个/ml的密度接种传代,约2-3天细胞融合再传代,可至少传致第10代,传代后得到的细胞悬液,以2000rpm的速度离心8分钟,收集沉淀(得到的细胞为成纤维细胞)。
2贴壁细胞转为悬浮生长细胞,即FBs转化为SKPs
将步骤1得到的成纤维细胞的细胞沉淀以悬浮培养基(DMEM高糖培养基+F12营养添加物(3:1)+40ng/ml FGF2+20ng/ml EGF+2%B27+1%P/S)重悬,按20000-40000个/ml的密度接种细胞于Poly-HEMA包被的培养瓶中,每3-4天加一次液,每次加1-2mlDMEM/F12培养基及所有生长因子添加物,保持培养基中含有40ng/ml bFGF、20ng/ml EGF及2%B27。
连续培养1-2周。收集得到皮肤多能干细胞(SKPs细胞),其镜下形态如图2所示。
实施例2本发明长期保存
本发明实施例1步骤1中得到的成纤维细胞FBs可以冻存起来,在实际需要的时候解冻,再转化为皮肤多能干细胞(SKPs细胞),冻存以及解冻的方法如下:
1将扩增的皮肤贴壁细胞离心后,收集细胞沉淀,加入冻存保存液(10%DMSO+20%FBS+70%DMEM)中,混合均匀,然后进行冻存。
2取出冷冻管,立即放入37℃水槽中快速解冻,轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化,以70%酒精擦拭保存管外部,移入无菌操作台内。
3取出解冻之细胞悬浮液,缓缓加入有贴壁培养基之培养皿内(稀释比例为1:9),混合均匀,放入CO2培养箱培养,每3天换液,直至细胞融合至80-90%。后用PBS清洗两遍,加入0.1%胰酶消化2min(37℃),后用等体积含10%FBS的DMEM培养基终止消化,收集细胞悬液,以2000rpm的速度离心8分钟,收集继一代细胞沉淀(得到的细胞为成纤维细胞)。
4将继一代的细胞沉淀以悬浮培养基(DMEM/F12培养基(3:1),含40ng/ml bFGF、20ng/ml EGF及2%B27。)重悬,按20000-40000/ml的密度接种细胞于Poly-HEMA包被的培养瓶中,每3-4天加一次液,每次加1-2mlDMEM/F12培养基及所有生长因子添加物,保持培养基中含有40ng/ml bFGF、20ng/ml EGF及2%B27。
5连续培养1周,收集SKPs细胞。
以下用实验例的方式来说明本发明的有益效果:
实验例1本发明方法与现有方法的比较
1、实验方法
(1)本发明方法:按照本发明实施例1的方法得到的培养多能干细胞,培养时间为1周。
(2)现有方法:按照Jeffrey A Biernaskie1等,Isolation of skin-derivedprecursors(SKPs)and differentiation and enrichment of their Schwanncell progeny,NATURE PROTOCOLS VOL.1,NO.6,2006,2803公开的方法培养多能干细胞(将从真皮中分离的原代细胞直接于悬浮培养基中培养),培养时间2-4周。
2、检测方法
取两种方法培养得到的细胞分别细胞观察,并进行成脂成骨结果检测。
取本发明方法培养的皮肤多能干细胞,与现有方法培养的细胞进行比较检测,包括使用Coultercounter粒子计数器计数获得的细胞数、倒置显微镜下观察细胞的形态。
3、检测结果
结果如图2~图8所示:
首先,本发明方法培养得到的多能干细胞SKPs的形状图如图2所示,现有方法得到的多能干细胞SKPs的形状图如图3所示,比较可以看出,二者无差异。
第二,本发明培养的SKPs也可以分化成脂成骨(图4、5),本发明配方的SKPs也具有各种干细胞特异性标志物(图6),与现有方法培养的SKPs基本一致(图7)。
第三,如图8所示,现有方法培养方法1周无法得到成熟的SKPs,本发明方法培养1周与现有方法培养2周的效果相同。现有方法培养4周SKPs出现贴壁等分化现象,而本发明方法培养未出现贴壁现象。
实验结果说明,本发明方法可以培养得到性质优良的多能干细胞SKPs,而且培养时间短。
实验例2本发明冻存的效果
1、实验方法
取本发明实施例1方法种培养的第一代FBs(P1)及其转化成的SKPs,以及本发明实施例2方法培养的第八代冻存后解冻的FBs(P8)及其转化成的SKPs。检测生存状态,包括使用Coultercounter粒子计数器计数获得的细胞数、倒置显微镜下观察细胞的形态。
2、实验结果
如图9所示。现有方法培养的第一代FBs(P1)及其转化成的SKPs(图9上排),现有方法培养的第八代冻存后解冻的FBs(P8)及其转化成的SKPs,生存状态基本一致。
实验例3本发明皮肤多能干细胞对光老化的预防作用
1、实验方法
(1)本发明方法:本发明方法培养的SKPs对光老化有预防作用。
1小鼠分组:将18只BALB/c裸鼠随机分为3组,即空白对照组、照射组、10SKPs组。1组不做任何处理,2组仅照射紫外光,3组于照射前及之后每隔两周臀部分别注射SKPs。
2UVB照射:用紫外线光疗仪先后对裸鼠背部皮肤进行照射,光源距离背部皮肤垂直距离30cm,每周照射5次,共8周,10J/cm2/1h。
3SKPs注射:将实施例2所培养的皮肤多能干细胞悬液于3组裸鼠臀部皮肤注射,注射细胞数为1*106/ml,细胞悬液体积为200ul。同时,空白对照组和照射组未进行细胞注射处理。
4活性皮肤表面分析系统评价:在实验终点时,采集小鼠皮肤背侧影像行活性皮肤表面分析系统评价SELS皱纹参数中的平滑度参数SEsm,SEr,Sew,SEsc。
5组织病理切片:在实验终点时,颈椎脱臼法处死动物,将取下的皮肤组织切成小块,标本大小约为4mm×4mm×2mm,立即投入4%多聚甲醛中固定24小时以上,做成石蜡切片,同时行HE染色、Masson染色。
2、检测
在实验终点时行,对小鼠背部皮肤行活性皮肤表面分析系统评价;取小鼠背部皮肤做成石蜡切片,同时行HE染色测量表皮厚度、Masson染色测真皮厚度和胶原含量百分比。
如图10所示,不同组别裸鼠皮肤外观及、VC98局部成像、HE及Masson染色(a.UV-,b.UV+,c.Hanks+UV,d.104SKPs+UV,e.105SKPs+UV),成功构建光老化小鼠模型,将不同浓度SKPs注入光老化小鼠背部皮肤,以未注射小鼠及Hanks液作为阴性对照,临床可见紫外线辐射后,注射高浓度SKPs的皮肤明显更光滑(图10第1、2、3排),HE染色可见真皮层明显增厚,Masson染色可见胶原纤维增多(图10第4、5、6排)。
综上,采用本发明方法可以有效培养得到皮肤多能干细胞,细胞培养周期短,而且细胞取材方便,可长期保存,成本低廉。此外,本发明培养的皮肤多能干细胞对光老化有预防作用,前景良好。
Claims (10)
1.一种皮肤多能干细胞的培养方法,其特征在于:步骤如下:
(1)取皮肤的真皮层组织,剪碎,胶原酶消化,解离,离心去上清,得细胞;
(2)取步骤(1)得到的细胞,采用贴壁培养基进行贴壁培养细胞,获得成纤维细胞;
(3)取步骤(2)得到的成纤维细胞,悬浮培养基重悬,接种至Poly-HEMA包被的培养瓶中培养,即可。
2.根据权利要求1所述的培养方法,其特征在于:步骤(1)中,所述取皮肤真皮层组织的方法是:取皮肤,消毒,冲洗,剔除皮下脂肪层,保留真皮及表皮层;剪成小块,用0.25%胰酶在4℃冰箱中过夜;用等体积含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基终止消化,冲洗,表皮在冲洗的过程中被脱离、洗去,未分离的表皮使用镊子分离去除,得真皮组织。
3.根据权利要求1所述的培养方法,其特征在于:步骤(1)中,剪碎是剪为2-3mm2/片;
步骤(1)中,所述胶原酶消化采用的是浓度1mg/ml的胶原酶溶液,消化的条件是37℃孵箱中2-3h;所述胶原酶为I型胶原酶。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:步骤(2)中,所述获得成纤维细胞的方式是:
培养至细胞融合至80-90%时,胰酶消化,离心去上清,收集细胞,即为成纤维细胞;
或者是,培养至细胞融合至80-90%时,胰酶消化,离心去上清,收集细胞,传代培养,传代次数为2-10次,得细胞悬液,离心去上清,收集细胞,即可。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:步骤(2)中,所述获得成纤维细胞的方式是:取权利要求4获得的成纤维细胞,冻存,解冻,培养,即可;
所述冻存是将成纤维细胞加入冻存保存液中,混匀,冻存;所述冻存保存液是含有10%DMSO和20%FBS的DMEM溶液;
所述解冻是放入37℃水槽,使其在1分钟内全部融化;
所述培养的方式是:取出解冻之细胞悬浮液,加入9倍量的贴壁培养基进行贴壁培养,直至细胞融合至80-90%,胰酶消化。
6.根据权利要求1或5所述的培养方法,其特征在于:所述贴壁培养基是添加有1%的青/链霉素双抗和10%胎牛血清的DMEM高糖培养基;培养的方法是:置于7℃,5%CO2条件下培养,每3天换液一次。
7.根据权利要求1或5所述的培养方法,其特征在于:胰酶消化是加入0.1%胰酶消化2min,消化的温度37℃;采用10%FBS的DMEM培养基终止消化。
8.根据权利要求1所述的培养方法,其特征在于:步骤(3)中,所述悬浮培养基是DMEM高糖培养基+F12营养添加物(3:1)+40ng/ml FGF2+20ng/ml EGF+2%B27+1%双抗;
步骤(3)中,每3-4天加一次液,每次加1-2ml DMEM/F12培养基及所有生长因子添加物,保持培养基中含有40ng/ml bFGF、20ng/ml EGF及2%B27。
9.权利要求1~8任意一项所述方法制备得到的皮肤多能干细胞。
10.权利要求9所述皮肤多能干细胞在制备预防光老化的药物、化妆品或者日化用品中的用途。
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